Spettrofotometria di fluorescenza molecolare UV-Visibile

All’analita viene fornita energia pari a E1 (E1=h 1)

[fase di assorbimento della radiazione].
La maggior parte delle molecole trasferisce l'eccesso di energia
all'intorno con un processo non radiativo: l'energia emessa,
sotto forma di calore, permette alle molecole circostanti di
compiere vibrazioni, rotazioni e traslazioni.
Il ritorno allo stato fondamentale avviene tramite un
meccanismo misto di cessione dell’energia come energia
cinetica e come emissione di un fotone di energia E2 (E1=h 2),
con E2 minore di E1 meccanismo di fluorescenza
La radiazione emessa, corrispondente ad un salto energetico inferiore, avrà
un valore della frequenza (2) minore al valore 1 e quindi lunghezza d’onda
maggiore di quella incidente.
La maggior parte delle molecole, nello stato elettronico
fondamentale, si trova in uno stato di singoletto,S0.
L'assorbimento di radiazione più probabile è quello che
avviene con conservazione della molteplicità di spin, che porta
ad uno stato di singoletto eccitato → in FLUORESCENZA lo
spin dell’elettrone eccitato non cambia durante la transizione
Quando viene emessa fluorescenza, alcune molecole perdono per
collisione l'energia acquistata prima che possano emettere un
fotone. Per questa ragione il numero di fotoni emessi è sempre
minore del numero di fotoni assorbiti.
Il rapporto tra numero di fotoni emessi e numero di fotoni assorbiti
è il rendimento quantico del processo di fluorescenza.
MOLECOLE FLUORESCENTI
Solo quelle in cui il rilassamento non
radiativo ha velocità paragonabili a
quelle del processo fluorescente

I composti fluorescenti sono

generalmente composti aromatici
ɸf aumenta con il numero di anelli ed
il grado di condensazione

La rigidità della molecola influenza

significativamente ɸf

Molecole più rigide emettono con

efficienza maggiore.
ɸf aumenta con il numero di anelli ed
il grado di condensazione
Sostituenti alchilici
Aumento dell’intensità di emissione per
fluorescenza per effetto della iperconiugazione:
gli elettroni σ dei legami C–H alchilici
partecipano alla risonanza dell’anello,
delocalizzando ulteriormente il sistema
aromatico.
Atomi pesanti (F, Cl, Br, I) sull’anello aromatico stabile il primo stato eccitato, con aumento
diminuiscono l’intensità dell’emissione a causa
della frequenti conversioni intersistema
Effetto del pH sulla fluorescenza
La fluorescenza di un composto aromatico
con sostituenti acidi o basici sull’anello
dipende dal pH. Sia la lunghezza d’onda che
l’intensità dell’emissione sono diverse per le
forme ionizzata e non ionizzata del composto.
Forme non ionizzate: la possibilità che si
abbiano più forme di risonanza rende più
della fluorescenza.
Spettrofotometria di fluorescenza molecolare
 ɸ

Deviazione dalla linearità per concentrazioni maggiori

(2,3 ecd>0,005)
Spettrofotometria di Fluorescenza vs. Assorbimento

Selettività

Elevata sensibilità
Lampada a xenon
(ad alta efficienza)