APPLICAZIONI DEL CRISPR-CAS9 E POTENZIALI EFFETTI COLLATERALI

Come spesso accade nella ricerca scientifica, la comprensione nel dettaglio di un processo naturali porta ad
immaginarne delle applicazioni biotecnologiche. La prima è stata di modificare liberamente geni all’interno
di organismi viventi. La modificazione di geni in laboratorio si sa fare sin dagli anni’80, ma non era così
precisa e veniva fatta principalmente in provetta. Oggi invece, poiché è possibile programmare in laboratorio
contro quale porzione di gene la forbice molecolare Cas9 può agire, abbiamo imparato per esempio a
DANNEGGIARE GENI PER INATTIVARLI. La capacità di capire come funziona un gene molto spesso dipende
dall’analisi di un organismo in laboratorio in cui quel gene è stato inattivato. Se non so a che cosa serve il gene
“pneumatico” dell’organismo “automobile”, lo posso dedurre chiaramente provando a fare il giro dell’isolato
quando gli pneumatici non sono presenti. Questo utilizzo di CRISPR sta velocizzando la ricerca di base nei
laboratori di tutto il mondo, in particolare per quel che riguarda la nostra comprensione di come la vita si è
evoluta e funziona. (di qui in poi in questo paragrafo aggiunto dopo) Consente dunque di creare popolazioni di
cellule ognuna delle quali ha un solo gene mutato: in questo modo, per esempio, si può studiare il
comportamento delle cellule in risposta ad un farmaco per stabilire connessioni tra uno o più geni e una certa
risposta biologica.

Altri esempi un po’ più pratici sono la CREAZIONE DI ALIMENTI MIGLIORATI SOTTO QUALCHE APETTO.
Anche questa antica pratica, basata sulle selezioni agronomiche e più recentemente sulla faticosa creazione di
organismi geneticamente modificati (OGM), sta accelerando molto nell’era di CRISPR. In un’applicazione tra le
tante, con CRISPR si sono inattivati i geni che producono un composto tossico definito acrilamide che
danneggia la produzione delle patate. Molti altri alimenti di nuova generazione basati su CRISPR non sono
ancora commercialmente disponibili, ma si stanno facendo strada in campo in sperimentazioni milionarie.
Con CRISPR si intravede all’orizzonte anche una NUOVA TIPOLOGIA DI MEDICINA. Le prime applicazioni
vengono dalle malattie del sangue dove è relativamente facile isolare le cellule malate, per correggerle e
restituirle al paziente. Sono della fine del 2019 le notizie della sperimentazione clinica per la correzione di
cellule del sangue di pazienti con la beta-talassemia e anemia falciforme. In questo caso si è inattivato un gene
che blocca la produzione di emoglobina fetale a compensazione del gene dell’emoglobina difettivo nei pazienti.
Inoltre, si sono costruite versioni del sistema CRISPR che permettono di inattivare non il DNA ma l’RNA, l’acido
nucleico che funge da tramite tra il nostro codice genetico e la produzione di proteine. In questo modo si può
inattivare una proteina senza cambiare il genoma dell’organismo che la produce. Una modifica reversibile, per
così dire. Altre versioni permettono di disabilitare del tutto le forbici molecolari e di usarle per veicolare verso i
geni di nostro interesse una serie di funzioni. Nei “base editors” si acquisisce la funzione di riscrivere il DNA
sostituendo a piacere la basi A, T, G, C di cui è composto. In analogia con una tastiera di un computer sarebbe
come trovare una lettera e correggerla. Coi “prime editors” si procede a cancellare e riscrivere un pezzo di DNA.
Infine, con CRISPR-a e CRISPR-i si accende o si spegne un gene a piacere. Indirizzare in modo preciso il sistema
CRISPR verso una sequenza specifica nel DNA può essere molto complicato, specie se tale sequenza è nascosta
in un genoma composto da migliaia di geni: si rischia, a volte, di generare modifiche non desiderate. Anche qui
si è intervenuto con ottimizzazioni, rendendo il sistema più flessibile e veloce.
Inoltre, si sono costruite versioni del sistema CRISPR che permettono di inattivare non il DNA ma l’RNA, l’acido
nucleico che funge da tramite tra il nostro codice genetico e la produzione di proteine. In questo modo si può
inattivare una proteina senza cambiare il genoma dell’organismo che la produce. Una modifica reversibile,
dunque. Altre versioni permettono di disabilitare del tutto le forbici molecolari e di usarle per veicolare verso i
geni di nostro interesse una serie di nuove funzioni. Nei “base editors” si acquisisce la funzione di riscrivere il
DNA sostituendo a piacere le basi A, T, G, C di cui è composto. In analogia con una tastiera di un computer
sarebbe come trovare una lettera e correggerla. Coi “prime editors” si procede a cancellare e riscrivere un
pezzo di DNA. Infine, con CRISPR-a e CRISPR-i si accende o spegne un gene a piacere. Indirizzare in modo
preciso il sistema CRISPR verso una sequenza specifica nel DNA può essere un affare parecchio complicato,
specie se tale sequenza è nascosta in un genoma composto da migliaia di geni. Quindi a volte si rischia di
generare modifiche non desiderate. Anche qui si è intervenuto con ottimizzazioni, ma anche rendendo il
sistema più flessibile e veloce.
Un altro aspetto molto studiato è quello della possibilità di FAR FUNZIONARE CRISPR PER MODIFICARE
MOLTEPLICI GENI IN UNA VOLTA SOLA. Questo tipo di strategia è utile laddove ci sia il bisogno di un
intervento radicale sul genoma di un organismo. È stata per esempio usata per generare dei maiali da cui
prelevare tessuti da utilizzare per xenotrapianti. In questo caso si sono inattivate porzioni estese del loro
corredo genetico che potrebbero essere dannose per l’uomo quando parti del maiale, come le valvole cardiache,
verranno trapiantate in pazienti cardiopatici. Una strategia simile è stata adottata da Craig Venter, pioniere
della biologia sintetica per scopi biotecnologici. Usando CRISPR, il gruppo di Venter ha inattivato un grande
numero di geni presenti nel genoma di alghe utilizzate per la produzione di biodiesel. Poiché l’energia
dei biocarburanti dipende dalla quantità di grassi da parte delle alghe, la ragione delle modifiche era quella di
identificare e inattivare i geni che limitassero la produzione di grassi.
Un’altra applicazione interessante che vede coinvolti anche laboratori italiani è quella di PRODURRE GRANO
TOLLERABILE DAI CELIACI disattivando tutti i geni che portano alla produzione di glutine. Altri approcci
permettono invece di inserire interi geni per ricostruire in modo più preciso quanto fatto con tecniche
precedenti. È il caso del golden rice, il riso OGM fortificato per produrre beta-carotene, un precursore della
vitamina A di cui molte diete sono deficienti. Nella nuova versione fatta con CRISPR il gene per la produzione di
beta-carotene è stato veicolato in una zona del genoma dove non rischia di disturbare l’attività di altri geni e
l’operazione è stata eseguita senza lasciare cicatrici molecolari.
Un altro filone in rapida espansione, grazie alle tecnologie basate su CRISPR, è quello della DIAGNOSTICA
MEDICA. Siccome il sistema riconosce sequenze specifiche di DNA o RNA, è stato modificato per rilevare la
presenza di tali sequenze in campioni biologici. L’utilità di ciò è la possibilità di riconoscere per esempio DNA o
RNA virale dovuto a infezioni. Da ciò a creare un test per identificare SARS-CoV2, il coronavirus che causa
COVID-19, usando CRISPR il passo è stato relativamente breve. Il vantaggio di questi tipi di test è che sono
rapidi, economici e velocemente programmabili per adattarsi a nuovi patogeni.
Come accennato precedentemente, mediante la tecnica alla base del CRISPR Cas9, oggi è possibile intervenire
all’interno del genoma di organismi vegetali, animali e umani. In ambito vegetale, le modificazioni di parti della
sequenza del DNA rendono molto più preciso e rapido lo sviluppo di varietà di piante agricole più resistenti agli
agenti patogeni ed alle diverse condizioni ambientali e climatiche, più produttive, più ricche di principi nutritivi
e, dunque, in grado di nutrire una popolazione sempre più in crescita. Servendosi del nuovo editing genomico,
ad esempio, è stato possibile creare un particolare tipo di seme di cotone, privo di aldeide – sostanza tossica
per l’uomo, che ha sempre impedito la commestibilità della pianta – e ricco di proteine e di fibre. E continuano
le sperimentazioni per rendere la vite sempre più resistente alle infezioni fungine.
Relativamente agli organismi animali, al momento le principali applicazioni della proteina Cas9 sembrano
essere quelle per l’introduzione di resistenze a malattie di origine virale attraverso la modificazione mirata
di geni dell’animale.
Un’altra applicazione del metodo CRISPR lo vede al centro della generazione di fenomeni di “gene drive”, un
meccanismo che tende a favorire la trasmissione di una determinata variante genetica all’interno di una specie
vegetale o animale, in modo da rendere in poche generazioni una popolazione omogenea per la variante
genetica selezionata. Un esempio di gene drive viene da uno studio per il controllo della malaria, di cui si è
parlato a maggio del 2020 in un articolo sulla rivista Nature Biotechnology: modificando il genoma delle
zanzare che trasmettono il plasmodio della malaria è possibile fare nascere solo gli esemplari del sesso che non
punge, facendo così collassare la riproduzione di popolazioni di insetti vettori della malattia.
Sin dall’anno della sua scoperta, nel 2012, la comunità scientifica mondiale ha iniziato a studiare le potenziali
applicazioni del CRISPR Cas9 in ambito medico, a cominciare dalle malattie genetiche quali distrofia
muscolare e fibrosi cistica, dalle malattie neurologiche come Alzheimer e Parkinson, fino ad arrivare, anno dopo
anno, alle malattie infettive come l’AIDS ed a particolari tipologie di tumori: agendo infatti sulle cellule, ed
in particolare inattivando determinati geni, è possibile bloccare il processo di trasformazione tumorale della
cellula, bloccando quindi la progressione della malattia. Il vantaggio dato dal Cas9, combinato con l’RNA guida,
è quello di poter intervenire con il knock-out genetico (inattivazione di un gene) in modo estremamente preciso
sul gene che causa la trasformazione tumorale, laddove finora ciò non è stato possibile. Inoltre, questa tecnica è
molto più economica e veloce rispetto a tutte le tecniche utilizzate finora per isolare il gene responsabile della
mutazione. A differenza delle applicazioni sugli organismi animali e vegetali, le pratiche dell’editing genomico
sull’organismo umano sono ancora agli albori e per la maggior parte si svolgono sul piano della ricerca e dello
studio in laboratorio.
Per quanto concerne, invece, l’AIDS, l’editing genico promette risultati importanti anche per la cura dell’HIV. Il
primo caso di terapia HIV era già , in sostanza, una forma di terapia genica: una paziente fu curata per la
leucemia mieloide acuta per l’infezione da HIV con un trapianto di midollo osseo da un donatore. Con il
trapianto, la paziente ricevette un sistema immunitario che era impenetrabile alla variante più comune
dell’HIV. Questo caso generò un enorme interesse negli approcci di terapia genica per la cura dell’HIV : uno dei
metodi più promettenti per raggiungere questo obiettivo è l’uso di ZFN, nucleasi ingegnerizzate che colpiscono
e tagliano sequenze specifiche di DNA cellulare mediante un sistema di consegna con vettore adenovirale.
Importantissimo è poi notare che il CRISPR-Cas9 non ha mai dato prove di effetti collaterali a lungo termine.
L’intervento sulle sequenze genetiche potrebbe portare infatti a mutazioni indesiderate, letali tanto quanto
quelle eliminate grazie alla tecnica. Un articolo pubblicato su Nature Methods avverte, però , che l’uso di questa
tecnica di editing genetico nota come CRISPR-Cas9 potrebbe portare a mutazioni indesiderate: essa potrebbe
infatti provocare nell’intero organismo un numero indefinito di variazioni impreviste “su scala nucleotidica”.
Alcuni ricercatori sono arrivati a questa conclusione dopo aver effettuato uno studio di sequenziamento del
genoma intero su un topo sottoposto proprio ad editing tramite CRISPR-Cas9; l’analisi del genoma aveva
identificato un numero superiore di varianti a singolo nucleotide rispetto a quelle prospettate dall’assunzione
iniziale secondo cui il CRISPR agisce esclusivamente nelle regioni omologhe al sgRNA (una singola molecola di
RNA). Sebbene gli esperimenti effettuati sui topi non abbiano dimostrato particolari fenotipi extra oculari, i
risultati ottenuti rivelano come la generazione di varianti sia imprevedibile e, per questo, necessiti di una
opportuna riflessione; l’impatto per alcune di queste mutazioni sull’RNA non codificante o su altre regioni
intrageniche potrebbe avere delle ripercussioni sui processi cellulari importanti. Perciò i ricercatori ritengono
necessari ulteriori studi sull’efficacia e specificità della piattaforma CRISPR prima di poterne prospettare
un’applicazione clinica.
Quello che è chiaro è che, oggi, grazie alle tecniche del più recente sistema di editing genomico, si possono
ricreare in vitro sistemi cellulari in grado di “mimare” alcune patologie, con l’obiettivo di identificare in
modo più accurato e meticoloso nuove terapie. Possiamo inoltre affermare che allo stato attuale CRISPR Cas9,
permettendo di modificare il genoma di una cellula intervenendo direttamente sulla sequenza di DNA “malata”,
rappresenta l’approccio più avanzato di terapia genica, senza comunque sia provocare alterazioni o inserire
sequenze di DNA estraneo: le nuove sequenze di DNA che vengono inserite – lo ricordiamo – sono date da copie
corrette del gene prodotte in laboratorio.
In particolare, nella ricerca sul cancro, CRISPR Cas9 rappresenta uno strumento rivoluzionario. Innanzitutto,
esso ha permesso di velocizzare l’intero processo attraverso il quale vengono studiate in laboratorio su cellule
animali le mutazioni che portano alla malattia. Ma la scelta di usare questo strumento nella ricerca sul cancro è
legata anche a questioni di precisione e di puntualità , che consentono di ricreare – in laboratorio e con buona
approssimazione – le dinamiche proprie della patologia.
A luglio del 2022, un’azienda biotech americana (Verve Therapeutics) ha avviato la sperimentazione clinica
sull’uomo di una terapia basata sul CRISPR Cas9, in grado di MODIFICARE IL CODICE GENETICO DEL
PAZIENTE PER GIUNGERE A STABILIZZARE IN MODO PERMANENTE I SUOI LIVELLI DI COLESTEROLO
NEL SANGUE. Questo studio – tuttora in corso – sposta per la prima volta il focus della terapia genica,
concentrandosi su un’area di intervento che va oltre le malattie genetiche, le malattie rare e le patologie gravi,
per aprire alla cura di disturbi comuni tra la popolazione, non necessariamente cronici, invalidanti o rischiosi
per la vita del paziente come lo è, appunto, ipercolesterolemia.
CRISPR Cas9 potrebbe dunque divenire una terapia per tutti, con incidenze sulla popolazione mondiale e
raggiungere un numero altissimo di persone in tutto il mondo. In particolare, la tecnica utilizzata è CRISPR 2.0,
basata sulla modifica di una singola lettera di DNA (in questo caso presente nelle cellule epatiche dei pazienti).
LA sperimentazione si sta svolgendo in Nuova Zelanda, su un gruppo di quaranta pazienti affetti da una forma
ereditaria di ipercolesterolemia, che porta ad avere valori di colesterolo doppi rispetto alla media – anche
durante l’infanzia - con elevato rischio di infarto in giovane età .
Il gene che il team di studio sta cercando di disattivare per mezzo di CRISPR 2.0 si chiama PCSK9, responsabile
del mantenimento del colesterolo definito “cattivo”, perché nel tempo tende a depositarsi sulle pareti delle
arterie. Se i risultati finali dei test di sperimentazione daranno esito positivo, in futuro la stessa metodologia
potrebbe essere applicata anche a studi per la riduzione dell’ipertensione o per la cura delle patologie
metaboliche, tra cui il diabete. Ma a questo punto si pone un interrogativo importante riguardo alle prospettive
aperte da questa nuova tipologia di applicazioni del sistema di editing genomico CRISPR Cas9. Probabilmente
dopo la cura definitiva dell’ipercolesterolemia, dell’ipertensione e del diabete, si passerà a ipotizzare terapie
geniche a puro titolo preventivo, per persone del tutto sane, ad esempio per ridurre il rischio di future
patologie.