Un acido dicarbossilico P lega reversibilmente 2 protoni L (= •) secondo lo schema:

PL C O-

k1 k1
k2 C OH k2
O O O
C O- C OH
P PL2
C O- C OH
O
k2 O O
k1 C OH k2
k1

C O-
LP
O

dove k1 e k2 sono le costanti di dissociazione intrinseche (o microscopiche, definite dalla direzione

delle frecce piccole blu).
a) scrivete la funzione di saturazione YL per il legante.
"
b) dimostrate che se k1 = k2 = k, la funzione di saturazione è 𝑌" =
$% "
c) dimostrate che se k1 < k2 (ad es. k1 = 10-5 M < k2 = 10-3 M), il sistema presenta cooperatività
negativa
d) dimostrate che scambiando i valori di k1 e k2 di cui al punto c), il sistema presenta cooperatività
positiva

E’ nota una emoproteina omodimerica con cooperatività positiva: la emoglobina dal mollusco
bivalve marino Scapharca inaequivalis di cui mostro la struttura.

pdb: 4SDH
Soluzione

a) La funzione di saturazione YL è data da:

𝑃𝐿 + 𝐿𝑃 + 2 𝑃𝐿*
𝑌" = (1)
2 𝑃 + 𝑃𝐿 + 𝐿𝑃 + 𝑃𝐿*

Dato che:

1 " 1 " 1" "

𝑘0 = , 𝑘0 = , 𝑘* = si ha:
1" "1 1"3

" " "3

𝑃𝐿 = 𝑃 = 𝐿𝑃 e 𝑃𝐿* = 𝑃𝐿 = 𝑃 per sostituzione di queste nella (1):
$4 $3 $4 $3

𝐿 𝐿* 𝐿 𝐿*
2 𝑃 +2 𝑃 + 𝑘* 𝐿 + 𝐿 *
𝑘0 𝑘0 𝑘* 𝑘0 𝑘0 𝑘*
𝑌" = = = (2)
𝐿 𝐿* 𝐿 𝐿* 𝑘0 𝑘* + 2𝑘* 𝐿 + 𝐿 *
2 𝑃 +2 𝑃 + 𝑃 1+2 +
𝑘0 𝑘0 𝑘* 𝑘0 𝑘0 𝑘*

Vedi Figura 1

b) Se k1 = k2 = k la (2) diventa:

𝑘𝐿 + 𝐿* 𝐿 𝑘+ 𝐿 𝐿
𝑌" = * *
= =
𝑘 + 2𝑘 𝐿 + 𝐿 𝑘+ 𝐿 * 𝑘+ 𝐿

Conseguenza importante: in un sistema non cooperativo che lega n > 1 leganti, la funzione di
saturazione sarà sempre iperbolica.

c e d) Con semplici manipolazioni algebriche dalla (2) si ottiene il rapporto YL /(1-YL):

𝑌" 𝑘* 𝐿 + 𝐿 *
=
1 − 𝑌" 𝑘0 𝑘* + 𝑘* 𝐿

L’equazione di Hill è dunque (dove log = logaritmo in base 10):

𝑌" 𝑘* 𝐿 + 𝐿 *
log = log (3)
1 − 𝑌" 𝑘0 𝑘* + 𝑘* 𝐿

Per stabilire il regime di cooperatività è necessario determinare il coefficiente di Hill definito come
la pendenza della curva (3):

BC
> ?@A $4 "
4DBC
𝑛;<== = = + (4) vedi nota 1 alla fine del documento
> ?@A " $4 % " $3 % "

Vedi Figura 2.
nHill, contrariamente al caso della mioglobina non è una funzione lineare di [L]:
nHill ® 1 per [L] ® 0 e [L] ® ¥ e passa per un minimo o massimo quando

[𝐿] = 𝑘0 𝑘* (vedi Nota 2). Sostituendo questa espressione nella (4) si ottiene:

∗ * $4
𝑛;<== = (5)
$4 % $4 $3

Questa equazione esprime il valore massimo o minimo che nHill può assumere. Si può facilmente
verificare che: 1) n*Hill < 1 quando k1 < k2 (cooperatività negativa); 2) n*Hill > 1 quando k1 > k2
(cooperatività positiva) e 3) n*Hill = 1 quando k1 = k2 (sistema non cooperativo).

0.9 eq. (2) con k 1 = 10 -5 M & k2 = 10 -3 M

0.8

0.7

0.6

0.5
Y

0.4

0.3

0.2

0.1

0
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0
log [L] Figura 1
4

cooperatività negativa k = 10 -5 M < k = 10 -3 M

3 1 2

2
Hill
log (Y / (1-Y)) or n

eq. (4) n Hill

1

-1

-2 eq. (3) log (Y / (1-Y))

-3
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0
log [L] (M)
Figura 2
Nota 1

Calcolo del coefficiente di Hill: è necessario determinare la derivata dell’eq. (3) rispetto log[L].

𝑌"
𝑑 log
1 − 𝑌"
𝑛;<== = =?
𝑑 log 𝐿

𝑌" 𝑘* 𝐿 + 𝐿 * *
log = log = log 𝑘* 𝐿 + 𝐿 − log 𝑘0 𝑘* + 𝑘* 𝐿
1 − 𝑌" 𝑘0 𝑘* + 𝑘* 𝐿

Facciamo la seguente sostituzione log[L] = x ® L = 10x

𝑌"
log = log 𝑘* 10L + 10*L − log 𝑘0 𝑘* + 𝑘* 10L
1 − 𝑌"
= 𝑥 + log 𝑘* + 10L − log 𝑘0 𝑘* + 𝑘* 10L

ln 𝑘* + 10L − ln 𝑘0 𝑘* + 𝑘* 10L
=𝑥+
ln 10

dove ln = logaritmo naturale

𝑌"
𝑑 log 1 10L ln 10 𝑘* 10L ln 10
1 − 𝑌"
𝑛;<== = =1+ −
𝑑𝑥 ln 10 𝑘* + 10L 𝑘0 𝑘* + 𝑘* 10L

Semplicando

10L 10L
𝑛;<== = 1 + −
𝑘* + 10L 𝑘0 + 10L

Da cui si ricava la (4).

Nota 2

Il massimo minimo di nHill è dato dalla soluzione dell’equazione:

𝑑𝑛;<== −𝑘0 𝑘*
= *
+ *
=0
𝑑𝐿 𝑘0 + [𝐿] 𝑘* + [𝐿]

Ovvero

𝐿 = 𝑘0 𝑘*

che introdotta nella (4) dà la (5).