http://www.progeriaitalia.org/ita/index.

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https://www.youtube.com/watch?v=1fpnnn3gSkk

Sindrome di Hutchinson-Gilford o Progeria: invecchiamento veloce e progressivo

Progeria: cambia la struttura della lamina nucleare, i cambiamenti a livello cellulare/molecolare non sono noti

La lamina nucleare fornisce:

✓la struttura che definisce la dimensione, la

forma e le caratteristiche fisiche del nucleo

✓l’impalcatura per l’attacco della cromatina ed

è coinvolta nella regolazione dell’espressione
genica

✓l’impalcatura per l’organizzazione dei

complessi dei pori nucleari NPC.
Progeria: cambia la struttura della lamina nucleare, i cambiamenti a livello cellulare/molecolare non sono noti

La lamina nucleare fornisce:

✓la struttura che definisce la dimensione, la

forma e le caratteristiche fisiche del nucleo

✓l’impalcatura per l’attacco della cromatina

ed è coinvolta nella regolazione
dell’espressione genica

✓l’impalcatura per l’organizzazione dei

complessi dei pori nucleari NPC.
Progeria: cambia la struttura della lamina nucleare, i cambiamenti a livello cellulare/molecolare non sono noti

La lamina nucleare fornisce:

✓la struttura che definisce la dimensione, la

forma e le caratteristiche fisiche del nucleo

✓l’impalcatura per l’attacco della cromatina ed

è coinvolta nella regolazione dell’espressione
genica

✓l’impalcatura per l’organizzazione dei

complessi dei pori nucleari NPC.
Principali componenti della lamina nucleare:

lamìna A e lamìna B.

Più di 300 mutazioni del gene LMNA sono coinvolte

in 12 malattie definite laminopatie.

La mutazione puntiforme C →T nel gene della lamìna A,
comporta una delezione di 50 aa, viene perso il sito di taglio
dell’endoproteasi Zmpste24 la proteina rimane legata
alla membrana: “Progerina” provoca la Progeria
Utilizzando fibroblasti dei pazienti e una varietà di test basati su colture cellulari (tra cui
trasfezioni) è stato scoperto che l’espressione della progerina inibisce il trasporto
nucleo/citoplasmatico di diversi fattori con ruoli importanti nelle funzioni del nucleo
L’espressione della progerina:
Distrugge il gradiente di Ran
Condizioni che si devono verificare
Questo fenotipo indotto dalla progerina è ripristinato dalla localizzazione per un trasporto nucleo/citosol perfettamente
funzionante:
nucleare «forzata» di Ubc9 e suggerisce un ruolo importante per la
“sumoilazione”.
✓ Gradiente Ran:
2 gradienti: RanGTP= 500:1 N/C
Ran proteina = 3:1 N/C

✓ Compartimentazione e attività di RanGAP e di

RanGEF (RCC1), importo di Ran mediato da NTF2
I pazienti HGPS hanno livelli ridotti di eterocromatina (H3K9me3)

Dato che RanGEF (RCC1) è associato prevalentemente alla eterocromatina

La distribuzione di Ran è correlata allo stato della cromatina?

 Figura 1
Il gradiente N/C di
Ran è distrutto

L’espressione
non cambia

Cambiano i livelli
di metilazione

Questa correlazione può significare:

1. lo stato della cromatina regola la distribuzione di
Ran
2. Trasporto Ran-dipendente di enzimi che
Il gradiente di Ran proteina dipende dalla modificano la cromatina
lamina nucleare ed è correlato ai markers
dell’eterocromatina 3. entrambi

Primo esempio di malattia umana in cui si verifica la

distruzione del gradiente Ran
 Figura 1
Il gradiente N/C di
Ran è distrutto

cellule HeLa trasfettate:

Distribuzione di Ran endogena

L’espressione ectopica della progerina è sufficiente per

distruggere il gradiente di Ran

HA: hemagglutinin
 La distruzione del gradiente di Ran compromette il trasporto nucleocitoplasmatico?

È stato misurato l’importo dipendente da importina β di una proteina cargo fluorescente

Risultato inatteso:

Soltanto una lieve riduzione dell’importo nei fibroblasti HGPS

Difetti nella permeabilità dei NPC?

NO!
(Misurata la diffusione di una proteina citoplasmatica)

Mancano importanti componenti strutturali dei NPC??

 Organizzazione dei complessi NPC

Il “nuclear basket” contiene 16 copie della proteina TPR

Nel suo insieme è una impalcatura multifunzione che fornisce siti di legame per i
recettori di importo ed esporto, per la cromatina, una piattaforma per l’assemblaggio di
RNP e il sito per l’ancoraggio degli enzimi che regolano la sumoilazione
 Figura 3 inibizione dell’importo di TPR

A) nei pazienti, TPR si accumula nel citosol

 Figura 3 inibizione dell’importo di TPR

A) nei pazienti, TPR si accumula nel citosol

B) Nelle HeLa, l’espressione della
progerina provoca la perdita di
localizzazione di TPR all’involucro nucleare
 Figura 3 inibizione dell’importo di TPR

A) nei pazienti, TPR si accumula nel citosol

B) La progerina induce la perdita di
localizzazione all’involucro nucleare

C) l’espressione della progerina determina

il mancato importo della proteina PK fusa
con NLS di TPR.

Dipende dalla perdita del gradiente di Ran?

 Figura 3 inibizione dell’importo di TPR

A) nei pazienti, TPR si accumula nel citosol

B) La progerina induce la perdita di
localizzazione all’involucro nucleare

C) l’espressione della progerina determina

il mancato importo della proteina PK fusa
con NLS di TPR.

Dipende dalla perdita del gradiente di Ran?

D) La distruzione del gradiente di Ran

mediante RNAi di NTF2 determina la
distribuzione citoplasmatica di TPR, il
mancato importo

La perdita di TPR influenza la distribuzione

N/C di Ran?

E) …
 Figura 3 inibizione dell’importo di TPR

A) nei pazienti TPR si accumula nel citosol

B) La progerina induce la perdita di
localizzazione all’involucro nucleare

C) l’espressione della progerina determina

il mancato importo della proteina PK fusa
con NLS di TPR.

Dipende dalla perdita del gradiente di Ran?

D) La distruzione del gradiente di Ran

mediante RNAi di NTF2 determina la
distribuzione citoplasmatica di TPR, il
mancato importo

La perdita di TPR influenza la distribuzione

N/C di Ran?

E) … TPR nel nucleo non è necessario per

il gradiente di Ran
perché la progerina riduce il
gradiente di Ran??
 Organizzazione dei complessi NPC

Le Nups dei due lati del NPC legano l’enzima Ubc9 (SUMO-conjugating) .
La sumoilazione nel nucleo potrebbe essere alterata dalla modificazione della struttura
della lamina nucleare o dall’inibizione dell’importo di TPR, entrambi indotti dalla
progerina
 Organizzazione dei complessi NPC

Nei mammiferi sono espressi 3 geni SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier):

SUMO1, SUMO2 e SUMO3 (SUMO2 e 3 96% omologia e funzionalmente identici)

La sumoilazione richiede gli enzimi E1 (attivatore) ed E2 (coniugante): Ubc9

I complessi NPC forniscono siti di legame anche per gli enzimi che tagliano SUMO dalle
proteine modificate (SENPs)

I complessi NPC organizzano la localizzazione e l’attività del macchinario per la

sumoilazione
 Figura 4
La progerina riduce i livelli nucleari di sumoilazione

I livelli di SUMO1
non cambiano

SUMO in rosso
Anti HA in verde

Nel nucleo, i livelli di SUMO 2/3 sono ridotti dall’espressione di progerina.

Purtroppo esiste “cell-to-cell variation” … per questo l’immunoblotting su estratti HGPS non
ha indicato una riduzione inequivocabile
Due approcci differenti per confermare i risultati della IF ….
 …… Figura 5
La progerina riduce i livelli nucleari di sumoilazione
First: SUMO2 fluorescente per valutare direttamente gli effetti della progerina

SUMO2

Second: no trasfezione ma uso di inibitore di proteasi che processa la lamìna A

(produce gli stessi difetti nella morfologia del nucleo della progerina)
 Figura 6
L’inibizione della sumoilazione
distrugge il gradiente di Ran
(condizione sufficiente)

RanGAP rimane localizzata agli

NPC (intorno al nucleo)
 Figura 7
Ridotta localizzazione nucleare di Ubc9 nelle cellule dei pazienti

Ratio N/C di Ubc9 in cellule HeLa

trasfettate con lamìna A WT o progerina

Ubc9 prevalentemente nel

nucleo nelle cellule normali,
non in quelle del paziente

Correla con il gradiente di Ran

 Figura 8

La fusione con segnali di trasporto + progerina

per «forzare» la localizzazione
nucleare o citosolica di Ubc9

Trasfezioni con HA-lamìna A, o HA-progerina

insieme a Ubc9 fuso con diversi segnali di NLS di SV40 mantiene Ubc9
trasporto (NLS o NES)
nel nucleo nonostante la
presenza della progerina

In verde: FLAG-NLS o NES

In rosso HA- progerina
 Figura 9

Forzando la localizzazione nucleare di Ubc9 si

recupera il gradiente di Ran nelle cellule che
esprimono progerina
Trasfezioni con HA-lamìna A, o HA-progerina insieme a Ubc9
fuso con diversi segnali di trasporto (NLS o NES)

Solo con Ubc9 attivo e NLS di SV40

Livelli nucleari di sumoilazione Gradiente di Ran

 Figura 10
la localizzazione nucleare di Ubc9 ripristina l’importo di TPR in cellule
che esprimono la progerina
 Figura 11
la localizzazione nucleare di Ubc9 ripristina i livelli di H3K9me3 in cellule che
esprimono la progerina
 Figura 12
prevenendo la localizzazione sulla membrana nucleare della progerina (inibendo
la prenilazione) si ripristina il fenotipo normale (Ran, TPR, SUMO2/3, H3K9me3)

cellule di paziente HGPS trattate per 3 giorni

 Il gradiente di Ran dipende da Ran-GAP e da Ran-GEF (RCC1).

Ran-GAP non è coinvolto (vedi Fig. 6) Caratteristiche di RCC1:

I. RCC1 è necessario per il gradiente di

Ran
II. RCC1 si associa e dissocia dalla
cromatina durante lo scambio del
nucleotide
III. RCC1 Si lega preferenzialmente alla
eterocromatina
IV. La progerina riduce i livelli dei
marcatori dell’eterocromatina
H3K9me3 e H3K27me3
Gli effetti della progerina sul gradiente di Ran dipendono dalla modulazione dell’attività di RCC1?

Caratteristiche di RCC1:

I. RCC1 è necessario per il gradiente di

Ran
II. RCC1 si associa e dissocia dalla
cromatina durante lo scambio del
nucleotide
III. RCC1 Si lega preferenzialmente alla
eterocromatina
IV. La progerina riduce i livelli dei
marcatori dell’eterocromatina
H3K9me3 e H3K27me3
Crystal structure of RCC1–nucleosome core particle complex.
 Figura 13
L’espressione della progerina e la sumoilazione alterano le interazioni RCC1-cromatina in
cellule vitali

SUMO2 è nel nucleo

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP
solo con lamin.
È invece localizzato
anche nel citosol
negli altri due casi
FRAP - Fluorescence recovery after photobleaching

FRAP method represents a classical technique for the

detection protein mobility in biological systems on single cell
level. The FRAP protocol is composed of three basic phases:
(1) Pre-bleach phase—fluorescence of cell is simply
monitored by low intensity laser power, a small region of
interest (ROI) has an initial value of fluorescence (Fi); (2)
Photobleaching phase—a high-powered laser beam is
applied to the ROI for a short period and fluorescence in the
ROI is reduced to its minimal value (F0); (3) Post-bleach
phase is represented by recovery in fluorescence intensity in
the ROI, the final value (F?) is a raw estimate of mobile
protein fraction. For an optimal experimental set-up,
fluorescence recovery during the post-bleach period reflects
the movement of the surrounding non-bleached proteins
into the bleached area and requires irreversible
photobleaching of protein chromophores.

Schematic figure of typical fluorescence recovery after

photobleaching (FRAP) measurements. (A) Shows three
phases of experimental routine and kinetic behavior of cell
fluorescence in the area of interest (ROI) after application of
bleach, circular bleach (see upper cells), or stripe bleach
(bottom cells).
 Figura 13
La sumoilazione promuove il rilascio di RCC1 dalla cromatina in vitro

Lo scambio del nucleotide implica la formazione di un complesso Ran-RCC1-cromatina

che si dissocia quando si lega GTP

Lane9: Sumo2-G: forma non coniugabile di sumo Modo ulteriore per valutare se il rilascio di Ran è necessario
Lane 7: senza GTP per la dissociazione di RCC1 dalla cromatina. Utilizzo di
Lane 8: massimo rilascio mutante T24N Ran (che non lega il nucleotide) blocca RCC1 alla
cromatina. Vedi Lane 6 - 12
 Modello proposto per spiegare come la progerina distrugge il gradiente Ran

Lo scambio del nucleotide implica la formazione di un complesso Ran-RCC1-cromatina

che si dissocia quando si lega GTP

Il legame di GTP a Ran e la dissociazione da RCC1 potrebbe essere regolata dal rilascio
(indotto dalla sumoilazione) di queste proteine dalla cromatina.