…Riassumendo, le due forme e funzioni del complesso TIM 23: proteine con sequenza N-terminale++

…Riassumendo, le proteine a barile β della membrana esterna seguono il percorso:

Mdm, mitochondrial distribution and morphology; Mim1, mitchondrial import 1;

Mmm1, maintenance of mitochondrial morphology 1;
…Riassumendo, le proteine con sequenza N-terminale++ o sequenze interne seguono i percorsi:

a b
c
 … le proteine con sequenze interne ricche di cisteine seguono il percorso:

Hot13, Helper of TIM13

… le proteine con sequenze interne ricche di cisteine seguono il percorso:
 Precursor Oxidation by Mia40 and Erv1 Promotes Vectorial Transport of
Proteins into the Mitochondrial Intermembrane Space

Nello spazio intermembrana i complessi etero-oligomerici Tim guidano le proteine idrofobiche

Le Tim hanno cisteine conservate, sono sintetizzate nel citosol

Il loro importo richiede Mia40 ed Erv1, possibili mediatori della formazione di legami disolfuro
necessari per la loro oligomerizzazione

Mancano evidenze sperimentali

Stabilito un sistema per monitorare direttamente l’ossidazione delle Tim durante l’importo,
utilizzando mitocondri isolati per distinguere le diverse fasi del processo

MIA: Mitochondrial IMS import and Assembly machinery

 Fig.1
Tim 13 viene ossidato durante il trasporto nei mitocondri

Il precursore marcato e ridotto di Tim 13 viene incubato

liberi Nei mitocondri con mitocondri isolati, migra come doppia banda: due stati
redox?
L’aggiunta di AMS a ogni singola Cys provoca uno “shift”
di 500 Da. AMS reagisce solo con i tioli liberi. Lo shift in 7
e 8 corrisponde alla modifica di 4 cys.
Solo la forma ossidata è protetta dalla Prot K, in 9 e 10

IA, iodoacetamide: blocca i tioli nello stato ridotto

AMS: agente alchilante, aggiunge 500 Da ai tioli ridotti

Nessuno dei mutanti forma la banda ossidata

tutte le 4 Cys sono necessarie per la
forma ossidata

La forma ossidata non presenta una resistenza

intrinseca alla digestione
 Fig.2
Tim 8 viene ossidato durante il trasporto nei mitocondri

A) La forma ridotta è sensibile alla prot. K

Gel nativo su mitocondri lisati:

B) La forma intermedia è sensibile al DTT

Il complesso maturo è resistente
Il monomero ridotto aumenta con DTT

* La mobilità di questa banda non cambia dopo

* bollitura in SDS indicando che si tratta veramente
del monomero ridotto

C) Tutte le cys sono necessarie per formare il

complesso maturo Tim8-Tim13 e per il monomero
ossidato
 Fig.3
La proteinasi K per testare la localizzazione delle due forme monomeriche di Tim8
Il monomero ossidato di Tim 8 si trova nei mitocondri e viene rilasciato dopo riduzione da parte di DTT

La forma ridotta è
digerita dalla prot.K

Complessivamente le 4 forme sono presenti in quantità minore nei pellets

trattati con DTT (vedi anche fig. 2B)!

C’è una dispersione ovvero un ritorno nel sopranatante dopo la riduzione mediata da DTT
La membrana esterna rimane intatta… i complessi maturi non li troviamo nel sopranatante
 Fig.4
La funzionalità di MIA 40 è necessaria per ossidare le proteine Tim

L’analisi dei tempi (Fig 2) aveva

mostrato che il monomero ossidato si
formava più lentamente
dell’intermedio Tim8-Mia40.

MIA40 è necessaria sia per la

formazione dei complessi eteromerici
sia per l’ossidazione dei monomeri.

Dimostrato con due diversi mutanti

(mia40-3 e mia40-4)
 Conclusioni

Sono state individuate 4 fasi:

1) precursore Tim entra ridotto

2) forma intermedia legata a MIA40
3) monomero ossidato
4) complesso eteromerico assemblato

Entrambe le proteine MIA40 ed Erv1 sono necessarie per la formazione dei

monomeri ossidati e per il conseguente assemblaggio dei complessi
eteromerici. I precursori ridotti possono diffondere indietro nel cytosol, le
forme ossidate sono ritenute nello spazio intermembrana. Quindi
l’ossidazione mediata da MIA40 ed Erv1 è responsabile del TRASPORTO
DIREZIONALE dei precursori
… le proteine con sequenze interne ricche di cisteine seguono il percorso:
Patologie legate a difetti dei sistemi di importazione
delle proteine nel mitocondrio.

Il caso meglio caratterizzato è quello della sindrome di

Mohr-Tranebjaerg (Sordità-distonia-atrofia ottica legata al
cromosoma X), dovuta a una mutazione del gene che
codifica per la proteina DDP1 deafness dystonia peptide 1,
implicata nell’importazione di proteine della membrana
mitocondriale interna.
omologo di TIM8 (del lievito)

La malattia è caratterizzata da sordità, cecità, distonia,

disfagia e paranoia progressive.
The role of the TIM8–13 complex in the import of Tim23 into mitochondria

Proposed role of the TIM8–13 complex in the import pathway of Tim23. Cytosolic Tim23 precursor (stage I) binds to
receptors on the surface of the outer membrane (stage II). It is then translocated across the TOM complex and
trapped by the TIM8–13 complex in the intermembrane space (stage IIIa). The TIM22 complex interacts with the
accumulated precursor (stage IIIb) and mediates in a Δψ-dependent manner its release from the TOM complex and
insertion into the inner membrane (stage IV). IM, inner membrane; OM, outer membrane.
 Seminars in Cell & Developmental Biology
Available online 29 September 2017
Review
Integrative functions of the mitochondrial contact site and cristae organizing system
Stefan Schorr Martinvan der Laan

The Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System (MICOS)

promotes protein import and sorting

MICOS è necessario per

✓ la formazione e stabilità delle

giunzioni delle creste

Mic60 e Mic10: attività di induzione

delle curvature

✓ la biogenesi delle proteine

Mic60 interagisce con:

• TOM,
• SAM
• MIA40
 Seminars in Cell & Developmental Biology
Review Available online 29 September 2017
Integrative functions of the mitochondrial contact site and cristae organizing system
Stefan Schorr Martinvan der Laan
1. Calcio 2. fosfolipidi
Relazione tra MICOS e il mantenimento dell’omeostasi

1. La stretta vicinanza delle tre

membrane è necessaria per
un’efficiente trasmissione del calcio

2. Network tra ER e mitocondri

VDAC (voltage-dependent anion channel)

MFN1/2, mitofusin 1 and 2
MCU, mitochondrial calcium uniporter
MICU1/2, mitochondrial calcium uptake proteins 1 and 2
ERMES, ER-mitochondria encounter structure
Psd1, PS decarbossilasi
 Seminars in Cell & Developmental Biology
Available online 29 September 2017

Review
Integrative functions of the mitochondrial contact site and cristae organizing system
Stefan Schorr Martinvan der Laan

The mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) as a central hub of membrane architecture and
organelle function. Left: Network of mitochondrial protein machineries centered around MICOS. Right: Functional modules
of mitochondrial biology connected to MICOS. Solid lines indicate a direct link to MICOS, whereas dashed lines refer to
hypothetical long-range connections via MICOS.