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Dinamica Molecolare Classica per Sistemi Biologici

Giovanni Chillemi
g.chillemi@caspur.it

Alessandro Grottesi
a.grottesi@caspur.it

Giordano Mancini
g.mancini@caspur.it

Dinamica Molecolare Classica per Sistemi Biologici

Studio di acidi nucleici: costruzione della topologia e simulazione di un oligomero di B-DNA

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Dinamica Molecolare Classica

Generazione della struttura iniziale - 1

Altre possibilit: Nucgen (AMBER), NAB (AmberTools, Chimera)


corsihpc@caspur.it Dinamica Molecolare Classica

Generazione della struttura iniziale - 2


$> pdb2gmx -f my_duplex -p -n -o duplex.gro Fatal error: Atom O2 in residue DT5 1 not found in rtp entry with 30 atoms Fatal error: Atom O2 in residue DT 2 not found in rtp entry with 32 atoms Atom O2 in residue DC 6 not found in rtp entry with 30 atoms while sorting atoms while sorting atoms while sorting atoms

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Dinamica Molecolare Classica

Generazione della struttura iniziale - 3


$>awk -v nres=14 -f rename.awk > renamed.pdb $>pdb2gmx -f renamed.pdb -n -p -o renamed.gro $>editconf -f renamed.gro -bt cubic -d 1.3 -c -o box $>editconf -f renamed.gro -bt cubic -d 1.3 -c -o box_rot -rotate 0 45 0 $>genbox -cp box.gro -cs ffamber_tip3p -p topol.top -o water $>make_ndx -f water $>grompp -c out.gro -n index.ndx -f em.mdp $>genion -s topol.tpr -np 12 -n index.ndx -o neutral $>make_ndx -f neutral $>grompp -c neutral.gro -n index.ndx -f em.mdp WARNING 1 [file topol.top, line 33]: For proper thermostat integration tau_t (0.01) should be more than an order of magnitude larger than delta_t (0.001)

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Dinamica Molecolare Classica

Termalizzazione (o equilibratura)
Il sistema ora nella configurazione di minima energia trovata in 10000 passi e a 0 K Dobbiamo portarlo senza far esplodere il box e senza denaturare la struttura a 300 K Usiamo una procedura non ottimale (da non usare su sistemi realmente studiati!) in sei passi:

200 ps a 300 K con DNA bloccato (position restrain), dt=0.001 minimizzazione 200 ps a 50K, dt=0.0001, tau_t = 0.001; non genero le velocit iniziali! 200 ps a 50K, dt=0.001, tau_t = 0.001 200 ps a 50K, dt=0.002, tau_t = 0.01 200 ps a 150K, dt=0.002, tau_t=0.1 200 ps a 300K, dt=0.002, tau_t=0.1

Durante la termalizzazione non siamo interessati a riprodurre con precisione un ensemble NVT usiamo il termostato di Berendsen N.B: Anche usando un po' di brutalit questa fase ha richiesto 1.2 ns di simulazione

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Dinamica Molecolare Classica

Campionamento - 2
Tre simulazioni di (massimo) 12 ns dello stesso sistema partendo dalle stesse coordinate iniziali e con gli stessi parametri: 1 senza vincoli 2 utilizzando LINCS come nella termalizzazione 3 - come 2 ma aggiungendo dei termini di legame nella topologia I legami idrogeno tra le coppie di basi alle estremit della doppia elica sono soggette alle perturbazioni maggiori; I nucleotidi potrebbero allontanarsi troppo, dando luogo ad una reazione di denaturazione (reazione?) Posso aggiungere dei legami aggiuntivi alle estremit delle catene per tenere bloccato il DNA

Modifico renamed.pdb creando una sola catena e genero una nuova topologia:

#include "ffamber03.itp" #include "alldna.itp" #include "ffamber_tip3p.itp" #include "na.itp"

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Campionamento - 2
Coppia AT Aggiungo dei legami type 6 ai legami idrogeno delle coppie terminali: controllo l'indice degli atomi con VMD o dal .gro e modifico la sezione bonds del .itp:

[ bonds ] ; additional bonds for dna terminal residues 208 235 209 237 211 240 20 430 22 431 ; ai 6 2.0000e-01 5.0000e+04 6 2.0000e-01 5.0000e+04 6 2.0000e-01 5.0000e+04 6 2.0000e-01 5.0000e+04 6 2.0000e-01 5.0000e+04 c0 c1 c2 c3

aj funct

Coppia GC

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Dinamica Molecolare Classica

Analisi delle traiettorie - 1


La simulazione senza vincoli non arrivata molto lontano :

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Analisi delle traiettorie - 2


Configurazioni finali dopo 11500 ps delle simulazioni 2 e 3

Simulazione 2

Simulazione 3 legami type 6

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Analisi delle traiettorie - 3


Proviamo ad utilizzare gli strumenti di GROMACS per calcolare lo stretch ed il propeller angle delle coppie di basi terminali e di quelle immediatamente sopra Aggiungiamo all'index file del soluto 6 gruppi contenenti gli atomi frontali degli anelli delle basi azotate: Utilizziamo g_sgangle per calcolare la distanza tra I centri di massa delle triplette e l'angolo formato dai piani che defiscon o

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Analisi delle traiettorie - 4

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Analisi delle traiettorie - 5

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Dinamica Molecolare Classica per Sistemi Biologici

Simulazione di complessi DNA Proteina: Esempi di risultati Inibizione dell'enzima Topoisomerasi 1B causata da farmaci o mutazioni

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La Topoisomerasi IB umana
E composta da 765 residui suddivisibile in 4 domini distinti: - dominio N-terminale (Met1-Lys214) - dominio core (Ile215-Ala635) - dominio linker (Pro636-Lys712) - dominio C-terminale (Gln713Phe765) Il sito attivo composto da 4 residui presenti nel dominio core, Arg488, Lys532, Arg590 e His632 e da una tirosina catalitica presente nel dominio C-terminale, Tyr723. Riconosce sia DNA superavvolto negativamente che positivamente. Il legame al DNA non sito specifico. e

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La Topoisomerasi IB umana

La proteina ha una forma bilobata che avvolge strettamente il DNA con contatti tra la molecola e lo scheletro zucchero-fosfato che si estendono per pi di 14 paia di basi. Il legame covalente, ed il conseguente taglio, avviene su un solo filamento. Il sito di taglio posto per convezione tra le basi +1 e -1. Il legame covalente avviene allestremit 3 del filamento tagliato.

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Complesso DNA hTop IB - topotecano


Struttura cristallografica del complesso ternario. Il farmaco si inserisce nel sito attivo tra le coppie di basi +1 e -1 downstream rispetto al legame tra Tyr723 e la base in posizione -1, stabilizzando il cleavablecomplex. Queste rotture stabilizzate sono completamente reversibili e non letali. Tuttavia, quando la forca di replicazione collide con il cleavable-complex, le rotture su un singolo filamento si convertono in rotture irreversibili sul duplex.

Nota linguistica: in Italiano, anche se desueto, esiste il termine clivaggio. Non esiste invece il verbo clivare.

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Complesso DNA hTop IB - topotecano


Interazione del topotecano con i residui enzimatici e nucleotidici presenti nel sito di taglio. Il farmaco interagisce via legami H con residui importanti come K532 e T718 e tramite interazioni di stacking con le coppie di basi +1 e -1.

Strumenti disponibili: g_hbond, g_dist, g_mindist


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Simulazione complesso binario vs ternario - RMSF


Complesso binario Complesso ternario

La presenza del farmaco altera la mobilit dei residui nei pressi del sito attivo (R364) ed in zone lontane. Particolarmente sono le differenze nella regione iniziale e centrali del linker domain.

Arg364

Linker domain: residui 635-645

g_rmsf
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Binario vs. ternario - Mappa di correlazione


Complesso binario

Le correlazioni linerari tra i C risultano alterate dal legame del topotecano nel sito attivo. Molte zone di correlazione inter-dominio scompaiono nella mappa del complesso ternario. In altri termini TPT inibisce la comunicazione tra i dominii della proteina

Complesso ternario

g_covar
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Binario vs. ternario Analisi dei cluster

Dall'analisi dei cluster si vede come nel complesso ternario il linker domain visiti un numero pi ridotto di bacini conformazionali anche se la deviazione rispetto alla struttura di partenza simile

g_cluster
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Binario vs. ternario Fluttuazioni del DNA


Complesso binario Complesso ternario

Nel complesso binario il filamento scissile downstream (che deve ruotare) risulta meno trattenuto da legami idrogeno e pi mobile. La presenza di TPT fa aumentare il numero di legami DNA-hTop1 e stabilizza anche il filamento scissile

g_rmsf

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Dinamica Molecolare Classica

Mutazione letale Lys681Ala

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Dinamica Molecolare Classica

Conservazione residuo Lys681

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Dinamica Molecolare Classica

La mutazione K681A rende l'enzimaLys681Ala Topoisomerasi IB: mutazione letale inattivo

L'effetto della mutazione sulla velocit di religation maggiore di quello dovuto alla presenza di un inibitore

Wild type Wild type + CPT K681A K681A + CPT

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K681A Analisi delle componenti principali


g_rms, g_rmsf

Dall'analisi delle fluttuazioni non si rilevano grandi cambiamenti. Tuttavia, proiettando le fluttuazioni dei C lungo le prime due componenti principali si vede come la mutazione congeli completamente il moto lungo una c.p.

g_covar, g_anaeig

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