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Introduzione

Microbiologia

Metabolismo

Stechiometria
e cinetica

Tecniche
fermentative

Fermentatori

LE FERMENTAZIONI:
Colture Continue e
Colture Fed-batch

Fasi e Controlli
di processo

Fermentazioni
Industriali

Introduzione

Microbiologia

Metabolismo

Stechiometria
e cinetica

Colture Continue

Tecniche
fermentative

Fermentatori

Fasi e Controlli
di processo

Fermentazioni
Industriali

Il concetto di coltura continua nato agli inizio del 19 secolo quando venne
sviluppato un processo per la produzione di aceto a partire dai prodotti di
scarto della vinificazione e birrificazione. Questa produzione prevedeva
luso di un reattore dove, la popolazione batterica naturale responsabile
della produzione di acido acetico era immobilizzata su trucioli di legno e il
substrato era lasciato percolare dallalto verso il basso. Laceto era infine
raccolto alla base del reattore.

Comunque, la prima analisi dettagliata del proceso continuo fu intrapresa


da Jaques Monod. Da allora numerose ricerche hanno affinato la
comprensione del processo portando alla attuale conoscenza delle
fermentazioni in continuo. Questo tipo di fermentazioni trovano oggi
notevole applicazione soprattutto nel trattamento delle acqua reflue da
impianti civili ed industriali. Purtroppo, le colture continue anche rispetto
ai molti vantaggi, hanno dei forti problemi che rendono la loro
applicazione problematica in molte aree
2 della tecnologia fermentativa.

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Colture Continue

Stechiometria
e cinetica

Tecniche
fermentative

Fermentatori

Fasi e Controlli
di processo

In un fermentatore in continuo, un terreno fresco (eluente) continuamente


aggiunto nel bioreattore mentre contemporaneamente il brodo di
fermentazione viene rimosso (effluente). I due processi avvengono alla stessa
velocit per cui il volume del fermentatore rimane invariato (Figura 11).

Dove:
X is the concentration of biomass in the fermenter and effluent
S is the concentration of substrate in the fermenter and effluent
P is the concentration of product in the fermenter and effluent
F is the feed and effluent flow rate
V is the liquid volume in the fermenter

Fermentazioni
Industriali

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Colture Continue

Stechiometria
e cinetica

Tecniche
fermentative

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Fasi e Controlli
di processo

Fermentazioni
Industriali

Come abbiamo gi visto nel caso della produzione di aceto, un fermentatore


continuo pu anche essere utilizzato con cellule immobilizzate su supporti
inerti. In alternativa pu essere in qualche modo (filtri, sistemi acustici)
impedito alle cellule di uscire dal fermentatore permettendo il reupero del
solo supernatante.

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Stechiometria
e cinetica

Tecniche
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Fermentatori

Modalit operative di colture


continue

Fasi e Controlli
di processo

Fermentazioni
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Il pi importante obiettivo della coltivazione continua quello di ottenere e


controllare la crescita ad un livello predefinito in cui la produttivit massima. Ci
sono diversi metodi con cui questo obiettivo pu essere ottenuto.
Uno di questi quello di mantenere costante il volume del fermentatore e di
utilizzare un flusso che permetta di ottenere una adeguata produttivit del
sistema. Questo modo di operare, in cui le concentrazioni dei diversi componenti
del sistema non varia definito CHEMOSTATO. Il volume del chemostato pu
essere mantenuto costante o con un sistema di overflow o con un sistema di
pompe.
Unaltro tipo di utilizzo di mantenere costante la concentrazione della
biomassa ed ottenuto mediante lutilizzo di un bioreattore con adeguato sistema
di misura in continuo della biomassa (torbidit). Per tale motivo definito
Turbidostato

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Tecniche
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Coltura continue e Chemostati

Fasi e Controlli
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Fermentazioni
Industriali

Il Chemostato il modo pi semplice di effettuare fermentazioni


continue. Uno dei maggiori problemi deriva dalla lunghezza del
processo che pu durare anche molte settimane. A questo si
associa un alto rischio di contaminazione del bioreattore.
Per questo motivo pi indicata lutilizzo di un sistema chiuso con
pompe di dosaggio e di aspirazioni. Questo daltro canto
permette di determinare precisamente la velocit di diluizione
del sistema, parametro importante per le finalit delle colture
continue.

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Tecniche
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Fermentatori

Coltura continue e Chemostati

Fasi e Controlli
di processo

Daltra parte il sistema a sfioramento, che utilizza una velocit


di flusso determinata dalla gravit flusso, largamente
utilizzato nei fermentatori per il trattamento delle acque
reflue civili ed industriali dove non esiste un problema di
inquinamento e la massa batterica comprende differenti tipi di
organismi.

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Fermentazioni
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Colture continue versus colture batch


Vantaggi delle colture continue

Le colture continue hanno molti vantaggi rispetto alle colture in


batch. :
In un chemostato, le cellule possono essere mantenute in uno stato
fisiologico e con una velocit di crescita e di produzione costanti.
Inoltre sia la fisiologia del microrganismo che la velocit di crescita
pu essere modificata variando, entro certi limiti, la velocit di
flusso. Conseguentemente pi semplice trovare le condizioni per
ottimizzare la produttivit e soprattutto per studiare i
comportamenti metabolici in relazione a variazioni di condizioni
ambientali.

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Inoltre, non necesario terminare la fermentazione cosi frequentemente rispetto


a quelle batch. Terminare una fermentazione ed effettuare tutte le procedure
per ripartire con una nuova produzione (turnaround time) implica grosse spese in
termini di operativit del personale e periodi di inattivit produttiva.
Teoreticamente un fermentaore in continuo pu operare indefinitivamente. In
pratica questo non possibile

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Il fenomeno biologico che si osserva in colture batch, la fase di latenza, che un


momento di adattamento fisiologico della coltura al medium rappresenta unaltro
limite delle colture in batch dal punto di vista produttivo.Poich le colture continue
non hanno frequenti shut down in un processo continuo questi tempi morti sono
ridotti con guadagno nella produttivit del sistema.
Very Very Important
Quando ci si riferisce ai sistemi di coltura in continuo, I termini lag
phase, exponential phase, stationary phase and death phase non
hanno significato. Questo perch il sistema lavora in continuo in uno
stato stazionario e la crescita non pu essere segregata in fasi
differenti.
Molti procesi di downstream risultano essere pi produttivi se operanti in continuo.
Utilizzando colture in continuo la parte downstream pu essere on-line con la velocit
di diluizione della coltura ed il materiale rimosso dal bioreattore potr essere
continuamente avviato alle altre fasi del processo produttivo. In questo modo non solo la
produttivat del reparto di fermentazione (up-stream) ma di tutto limpianto produttivo
viene ottimizzata.
Infine, potendo incrementare la produttivit di tutto il sistema, risult pi conveniente
acquistare apparecchiature capaci di operare su volumi minori abbassando il capitale da
investire per un impianto produttivo. Tutto questo dovrebbe concretizzarsi con profitti
maggiori.
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Colture continue versus colture batch


Svantaggi delle colture continue

Nonostante I potenziali aspetti positivi lapplicazione della coltura continua a


colture pure non ancora uno standard industriale. Ci sono alcune ragioni per
questo:
Il rischio uno dei fattori maggiori. Le colture batch sono pi semplici da
capire e molto meglio caratterizzate in ambito industriale. Il passaggio da
un processo di fermentazione batch ad uno continuo rappresenta un grande
rischio che difficilmente i manager industriali vogliono prendersi.

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Tecniche
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Colture continue versus colture batch

Fermentazioni
Industriali

Svantaggi delle colture continue

Inoltre, non tutti i prodotti sono ottenibili in un sistema in continuo.


Per alcune tipologie di fermentazioni lo sviluppo dei sapori e degli aromi
deriva da differenti molecole prodotte in differenti fasi del processo
di crescita. Poich la fase continua non ha in se tutte le fasi di crescita
alcuni di queste molecole potrebbero non essere prodotte. Ad esempio
il vino, la birra e la soia non possono essere prodotti con questa
metodologia.
Molti altri prodotti vengono ottenuti solo a velocit di crescita
prossime allo zero (fase stazionaria). In una coltura continua le cellule
non avrebbero, a utilizzando colture immobilizzate di cellule non in
crescita. queste velocit, il tempo di crescere e sostituire quelle che
sono state rimosse nelleffluente. Come risultato, nel giro di poco
tempo nel fermentatore la biomassa diminuir. Comunque, questo
problema potrebbe essere superato
Infine, la contaminazione in un fermentatore pu avere effetti
disastrosi. Infatti, la popolazione contaminante pu nel tempo prendere
il sopravvento rispetto alla popolazione produttiva.
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Fermentazioni
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Applicazioni dei reattori per la


Coltivazione continua.
La pi comune applicazione su larga scala dei reattori continui il
trattamento delle acque reflue civili ed industriali.
Impianti a fanghi attivati, Filtri percolatori, digestori anaerobici tutti
operano secondo un sistema in continuo. Anche limmobilizzazione di
cellule spesso impiegata per aumentare lefficacia del processo.

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Applicazioni dei reattori per la


Coltivazione continua.

Nel caso delluso per il trattamento delle acque reflue luso delle
colture continue rappresenta un vantaggio in quanto:
Dissimilmente dalle colture pure di batteri e cellule di
mammifero, in questi casi la contaminazione non un problema
in quanto il feed che alimenta il reattore contiene esso stesso
batteri (patogeni e non).
I reattori continui sono da sempre utilizzati per questa attivit
e la loro implementazione non considerata un rischio dal punto
di vista industriale.
Infine, in questo caso, usare colture batch semplicemente
impossibile ed economicamente non sostenibile Infatti, il flusso
dei reflui spesso misurato in miliardi di litri/ora, un carico che
reattori batch semplicemente non potrebbero gestire.
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Idraulica dei reattori in continuo


Velocit di Diluizione e tempo di residenza

Il flusso di un liquido in un reattore pu essere espresso


in correlazione con il volume presente nel bioreattore.
Due termini sono generalmente utilizzati a questo scopo:
la velocit di diluizione (D) ed il tempo di residenza o di
ritenzione (t). Questi possono matematicamente essere
definiti come:

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Idraulica dei reattori in continuo

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Velocit di Diluizione e tempo di residenza


La velocit di diluizione ha una importante influenza sulla
produttivit di un fermentatore. La figura 13 mostra come la
biomassa e la concentrazione di substrato variano con la velocit
di diluizione.

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Modello matematico per un chemostato.

Il modello matematico per un rattore batch pu essere modificato nel caso


delle fermentazioni in continuo per descrivere il comportamento della
biomassa e del substrato e del prodotto
Modello coltura continua

Modello Batch

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Assunzioni del Modello

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di processo

Alcune assunti devono essere tenuti a mente per questo modello:


Lalimentazione (FEED) del fermentatore deve essere sterile.
Il reattore deve essere perfettamente ed omogeneamente
miscelato in maniera che la composizione delleffluente sia la
stessa del medium nel reattore.
Inoltre, nelle equazioni descritte si assume che:
La formazione del prodotto sia associata alla crescita
(Equazione 44).
La crescita deve seguire il modello di Monod.
Come per la crescita batch le equazioni possono essere modificate
per considerare prodotti non associati alla crescita e variazioni del
modello di Monod come ad esempio eventuali inibizioni.

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Tecniche
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Componenti del modello

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Poich sia la biomassa che il prodotto sono continuamente aggiunti


(formati) e rimossi dal sistema lequazione contiene sia il termine
di accumulo che quello di rimozione :

Al contrario, il Substrato ha bisogno di tre termini in quanto esso sia


aggiunto che rimosso ma anche consumato dal sistema :

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Analisi della condizione di stato


stazionario di un chemostato.

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Condizioni di stato stazionario

Le equazioni 42 44 predicono che in condizioni di stato costante (senza variazione


dei parametri dx/dt=0) ) la biomassa, la concentrazionee di substrato nel
fermentatore , e quella di prodotto diventano costanti (Figure 16).

Le equazioni 42 44 predicono anche che, rispetto alle condizioni iniziali, in tempi


diversi verr raggiunto lo stesso equilibrio (steady state) (Figure 17).
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Analisi della condizione di stato


stazionario di un chemostato.

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Condizioni di stato stazionario

La condizione a cui si arriva quando tutte le variabili rimangono costanti viene definita
come steady state. Se vengono graficati i valori di concentrazione di X, S e P allo
steady state are in funzione della velocit di diluizione allora si otterra una curva simile
a quella in figura.

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Analisi della condizione di stato


stazionario di un chemostato.

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Condizioni di stato stazionario

Poich allo steady state, la concentrazione della biomassa, del substrato ed


del prodotto non variano allora:

Queste equazioni possono essere utilizzate per ottenere relazioni matematiche


che predicono le concentrazioni allo stato stazionario di X, S e P ad ogni velocit
di diluizione impostata.
In pratica, le condizioni di vero steady state sono pressoch impossibili da
raggiungere a causa della complessit della fisiologia cellulare. Per queste ragioni
in genere si parla di condizioni di "pseudo-steady state".
Quindi, nelle condizioni di pseudo-steady state, le concentrazioni di X, S e P
varieranno entro strettissimi valori medi.
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Analisi allo stato stazionario della


Equazione della biomassa

allo steady state


X = DX
=D

Allora, in un chemostato allo stato stazionario la velocit specifica di crescita


della biomassa uguale alla velocit di diluizione impostata.

At steady state

= D

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At steady state
= D
Limportanza di questa equazione spiega la importanza di questa
tecnologia fermentativa nonostante il suo SCARSO USO
INDUSTRIALE.
Infatti, utilizzando sistemi di coltura continua possono essere
ottimizzate condizioni sperimentali utilizzabili anche in
fermentazioni industriali (fed-batch) o, in alternativa, possono
essere risolti problemi che si incontrano in fermentazioni
industriali.

In definitiva, la tecnologia della coltura continua


permette di indagare e studiare la fisiologia batterica
in diverse condizioni ambientali e produttive.
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Limiti nellapplicazione della coltura


continua: il fenomeno del Washout
Se la velocit della rimozione della biomassa eccede quella della crescita
della biomassa,
DX > X
Allora:

D>

Di conseguenza
La concentrazione dell abiomassa diminuisce.
La concentrazione di Substrato aumenta
La velocit specifica della crescita dellorganismo aumenta
Il fermentatore raggiunger un nuovo steady state

XS New steady state = D


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Limiti nellapplicazione della coltura


continua: il fenomeno del Washout

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MA...

Cosa succede se la velocit di rimozione dela biomassa eccede quella di crescita della
biomassa? .... man mano diminuir la concentrazione della biomassa nel fermentatore

DX > mX
D > m
XS =m, < D WASHOUT

Fin quando tutta la biomassa sar washed out dal fermentatore


La velocit di diluizione a cui avviene questo fenomeno un valore critico chiamato velocit
critica di diluizione (Dc).
In altri termini la velocit critica di diluizione equivalente alla m
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Limiti nellapplicazione della coltura


continua: il fenomeno del Washout

Quindi, la velocit di diluizione in un chemostato deve


essere compresa tra 0 e la diluizione critica o max del
sistema
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Ricapitolando
Fermentazione
Batch

Fi = flusso ingresso
Fu = flusso uscita

Fi

Fu

Fermentazione
Continua

SubstratoOD 600
; Prodotto

< max

Tempo

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Fi = Fu

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Fermentazioni Fed batch

Le fermetazioni fed-batch sono un ibrido tra quelle batch e


quelle continue.
In un fermentatore fed batch, un feed (alimentazione)
continuamente aggiunta ad un fermentatore fin quando il
limite volumetrico del fermentatore lo permette.

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Perch la fermentazione Fed-batch?

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Molti prodotti commercialmente importanti sono ottenuti in


maniera non associata alla crescita e ad alte rese quando le
concentrazioni dei substrati sono basse. Basse concentrazioni
di nutrienti e substrati possono essere ottenute:
1.

nelle colture batch solo nelle fasi finali di rallentamento delle


colture e con poca possibilit di controllo

2. Possono essere mantenute anche nelle colture continue ma con


grossi problemi da risolvere circa la sterilit del sistema i
grandi volumi in giuoco e ed i problemi regolatori (definizione
di batch size).
3. Oppure possibile ipotizzare un sistema misto dove
allaggiunta di una alimentazione non corrisponda un relativo
prelievo di biomassa. In tal modo si uniscono le caratteristiche
positive
delle
due
tecnologie
eliminandone
contemporaneamente le caratteristiche negative.
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Ipotizzando di poter da un certo punto di una fermentazione batch


immettere un substrato a limitante la crescita potremmo
realizzare un sistema in cui possibile:
1.

Mantenere la definizione volumetrica della produzione

2. Matenere tempi non lunghissimi di processo


3. Realizzare condizioni fisiologiche tali da permettere una
produzione pi elevata del nostro prodotto.
Queste condizioni sono quelle che vengono a
prodursi in un sistema fed-batch.
Per
questo
motivo
questa
tecnologia
fermentativa quella di scelta per la produzione
di tutti quei prodotti che hanno necessit di
basse concentrazioni di nutrienti o substrati e
quindi di basse velocit di crescita della
biomassa.
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Esempio di fermentazione Fed-Batch


Fine fase batch

Fase Fed-batch

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Fine fase Fed-batch

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Modello matematico di una fermentazione


fed batch
Come al solito, questo modello pu essere derivato dalle eqiuazioni di bilancio della
biomassa, dei substrati e dei prodotti in questo tipo di fermentatori.

Modello Fed-Batch

Modello Batch

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Componenti del modello

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La fermentazione Fed-batch composta da una crescita e da una diluizione


Assunzioni del modello: Stessa densit del liquido di feedeing e di quello del
fermentatore.
Il concetto di steady state non pu essere semplicemente applicato ad un
rfermentatore fed-batch. Non quindi possibile determinare determinandoi il
solo flusso del feeding nel fermentatore.
Lequazione deve essere quindi risolta matematicamente.

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Fermentazioni fed-batch Vs continue


Sia con le fermentazione continue che con
quelle Fed-batch possibile impostare e
mantenere la velocit specifica di crescita
della biomassa e le concentrazioni dei
substrati entro valori ottimali.
La maggiore differenza tra le due che nel
caso della Fed-batch la biomassa rimane
confinata nel bioreattore e no si hanno
fenomeni di Wash-out.

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Confronto tra fermentazioni fed-batch


e continue
Inoltre, diversamente dalla fermentazione continua,
lalimentazione (FEED) non necesariamente deve
contenere tutti i componenti del terreno come nella
fermentazione continua. Infatti in questo caso
necesario aggiungere solo una fonte di carbonio (S) o di
azoto per sostenere la cresita e la produzione in quanto
gli altri elementai sono presenti nel terreno.

Potendo controllare mediante tali aggiunte la crescita


della biomassa, possibile rendere il sistema
indipendente dalla quantit di ossigeno disciolto.
Anche la contaminazione ha effetti meno drammatici
rispetto alla fermentazione continua e difficilmente
avvienne se non nelle prime fasi della crescita.
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Modalit di fermentazioni fed-batch:


feed costante, a step, esponenziale, pH-stat, DO-stat

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