Universita di Bari

Conferenza di Denver

1-3 gruppo A

4-5 gruppo B

1966

X-6-12 gruppo C 13-15 gruppo D 16-18 gruppo E

19-20 gruppo F

Y-21-22 gruppo G

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Cariotipi a confronto

1-3 gruppo A

4-5 gruppo B

X-6-12 gruppo C 13-15 gruppo D 19-20 gruppo F 16-18 gruppo E Y-21-22 gruppo G

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Metodi colorazione differenziale

 Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi

C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili dei cromosomi 1,9,16,Y

Creano unalternanza di bande chiare e scure lungo lasse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi.
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utilizzando la mostarda di quinacrina......

QM-banding pattern

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DAPI e QM

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G-bande

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R-bande

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Diagramma

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46,XX - cariotipo normale Femminile 46,XY - cariotipo normale Maschile

Terminologia

Questo modo di scrivere ci da due informazioni: - numero totale dei cromosomi (46) - sesso dellorganismo 47,XY,+21 Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu (sindrome di Down)

46,XX,del(14)(q23) 46,XY,dup(14)(q22q25) 46,XX,r(7)(p22q36)

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del=delezione dup= duplicazione r=ring (cromosoma ad anello)

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cromosoma sul vetrino

FISH

sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo

denaturazione

AT C GGTATC C TA TAGG C ATAG G AT

doppia elica di DNA

AT C GGTATC C TA TAGG C ATAG G AT

AT C GGTATC C TA TAGG C ATAG G AT

denaturazione
AT C GGTATC C TA TAGG C ATAG G AT

G TC G

A TC CT

ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino

TAGG C ATAG G AT

AT C GGTATC C TA TAGG C ATAG G AT

osservazione del vetrino

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FISH : microscopio a fluorescenza

Osservazione al microscopio

filtro di emissione CCD camera

sp ec ch i o di cr oi co

Lampada a vapori di mercurio

fotografi a

filtro di eccitazione

Elaborazione al computer obiettivo/ condensatore

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FISH: metafase in DAPI

Cromosomi 1. denaturati 2. colorati con DAPI

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FISH: segnali

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FISH: merge

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Analisi del cariotipo

1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
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Allestimento del preparato

fitoemoagglutinina
(stimola la crescita)

colchicina
(ultimi 30)

Ipotonica (20)

sangue periferico
proliferazione centrifugazione centrifugazione

48-96h terreno di coltura

pellet risospeso

fissativo
pellet risospeso
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fissativo

risospensione in poco fissativo

allestimento del preparato

centrifugazioni (2-3)

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Analisi del cariotipo

1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
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Colorazione QM
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

Fluorocromi: QM, DAPI. Necessario un microscopio a flurescenza

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Colorazione Giemsa

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

G-banding con Giemsa dopo trattamento con tripsina

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Analisi del cariotipo

1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

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Selezione delle metafasi

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Ottima ma..

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Puo essere anche cosi..

Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche da contare. Scartare! (potendo)
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Selezione delle metafasi

.. O cosi
Troppo contratti pero si puo usare per contarli. Scartare! (potendo)

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Selezione delle metafasi

Sufficiente
Si possono contare Puo essere utile per analizzare i cromosomi non sovrapposti

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Discreta
Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, si possono analizzare

Selezione delle metafasi

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Selezione delle metafasi

Buona
Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, la morfologia dei cromosomi e buona

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Come si fa il cariotipo?
1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO

2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA

3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE

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Fare il cariotipo

46
9

10

11

16

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Cariotipo ordinato
CARIOTIPO IN QM (specifico il bandeggio)

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