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BIOCHIMICA CLINICA

Corso integrato di
Medicina di Laboratorio e Diagnostica per Immagini

Prof.ssa Valeria RUGGIERO


Policlinico Universitario
070 / 5109 6498
328 4774883
ruggiero@pacs.unica.it

Universit degli Studi di Cagliari Facolt di Medicina e Chirurgia

Corso integrato di :

Medicina di Laboratorio e
Diagnostica per Immagini

BIOCHIMICA CLINICA
PATOLOGIA CLINICA
FISICA SANITARIA
RADIOBIOLOGIA
ANATOMIA RADIOLOGICA

Corso Integrato di Medicina di Laboratorio e Diagnostica per Immagini

Universit degli Studi di Cagliari Facolt di Medicina e Chirurgia

FINALIT DEL CORSO


Il corso intende fornire :

Le basi per la comprensione ed interpretazione dei


fenomeni biochimici che stanno alla base dei
meccanismi metabolici, sia da un punto di vista
generale che per quanto riguarda le loro eventuali
modifiche indotte da alcune delle patologie piu
comuni
Le conoscenze relative alle principali metodologie
biochimiche applicate alle analisi cliniche
La consapevolezza della potenzialit e dei limiti delle
informazioni fornite dagli esami di laboratorio
La capacit di richiedere correttamente le indagini di
laboratorio

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LEZIONI
La frequenza obbligatoria (circa 75% presenze su tutto il CI)
Vanno firmati i fogli delle presenze
La firma di frequenza verr apposta dal Prof. Atzori (Patologia
Clinica) previo accertamento di segreteria

TIROCINI PROFESSIONALIZZANTI
Sono obbligatori e vanno certificati
Senza tale certificazione non si ammessi a sostenere lesame
Iscrizione ad uno dei gruppi entro la penultima lezione
Per ciascun gruppo, nei giorni indicati, appuntamento alle ore 8.30
presso la Reumatologia I Livello 1 Policlinico UNIVERSITARIO
(con il camice)

ESAMI
Iscrizioni on line fino a 2 giorni prima

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Testi consigliati

WIDMAN et Al.

Interpretazione clinica degli esami di laboratorio


Ed. McGraw_Hill

FEDERICI et Al.

Medicina di laboratorio
Ed. McGraw_Hill

KELLERMAN G.

Valori anormali di laboratorio


Ed. McGraw_Hill

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LEZIONI
Generalit
I LEZIONE

II LEZIONE

Tipologia e modalit di richiesta degli esami di


laboratorio
Tecniche di prelievo, conservazione e trattamento
dei materiali biologici
Fattori interferenti

III LEZIONE

Attendibilit analitica
Specificit e sensibilit cliniche

IV LEZIONE

Spettrofotometria e fluorimetria

V LEZIONE

immunochimica

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LEZIONI

VI LEZIONE

Elettroforesi sieroproteine

VII LEZIONE

Elettroforesi sieroproteine

VIII LEZIONE

Diagnosi e monitoraggio diabete mellito

IX LEZIONE

Esame delle urine

X LEZIONE

Esame liquido cerebrospinale (cenni)


Indici di flogosi

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Cenni storici

Risale ai primi decenni del 800 lidea che indagini chimiche sui
materiali biologici prelevati dal paziente potessero essere di
grande aiuto per la pratica clinica
Nella met del XIX sec. vennero introdotte alcune
determinazioni ematochimiche ed urinarie usate fino a non
moltissimi anni fa (reaz. Di Trommer e Fehling per la ricerca
del glucosio - proteinuria di Bence Jones)
CHI ESEGUIVA LE ANALISI?
allinizio chimici e farmacisti
poi dalla seconda met dell800 i medici stessi
nei primi decenni del 900,
in seguito allaumentare del
numero di indagini e della loro complessit, lattivit clinica e
quella di laboratorio si iniziano a separare
nasce nel 1941 nellOspedale Niguarda di Milano il primo
laboratorio italiano di Chimica Clinica

BIOCHIMICA CLINICA

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Cos la BIOCHIMICA CLINICA

La BIOCHIMICA CLINICA pu essere definita


come una disciplina a carattere prettamente
applicativo
che
utilizza
metodologie
(bio)
chimiche
per
analizzare
materiali
biologici
ottenuti da soggetti umani al fine di ottenere
informazioni utili a scopo clinico, cio diagnostico,
prognostico e terapeutico.

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BIOCHIMICA CLINICA DI BASE


Si occupa in maniera generale delle
linee essenziali che portano alla
produzione
di
un
risultato
di
laboratorio, valutando il valore ed i
limiti dellesame stesso

BIOCHIMICA CLINICA SPECIALISTICA


Si
occupa
dei
diversi
analiti
considerati
singolarmente
o
in
gruppi
omogenei,
esaminando
tecniche di misura e la collocazione
in un quadro pi generale

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ESAME DI LABORATORIO

procedimento
qualitativo, semiquantitativo o quantitativo
che serve
1) ad evidenziare la presenza o a misurare la quantit, di
un costituente biochimico in un materiale biologico
2) a misurare le propriet di alcuni costituenti biologici
3) a riscontrare cellule o altri elementi

Tutti gli esami di laboratorio hanno in comune :


a) il materiale esaminato
b) le finalit del risultato
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FINALITA DELLA RICHIESTA DEGLI ESAMI DI LABORATORIO


SCREENING - Medicina preventiva e sociale
a)

Evidenziare :
Malattie metaboliche e neonatali (genetiche e non)
Malattie latenti

b)

Valutare fattori di rischio

c)

Controllare lo stato di salute

d)

Prevenire il danno iatrogeno

e)

Diagnosticare malattie professionali

DIAGNOSI - Diagnostica iniziale e di approfondimento

MONITORAGGIO
Decorso malattia
Efficacia terapia

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DATI CLINICI
(storia clinica, esame obiettivo)

IPOTESI INIZIALI
TESTS DIAGNOSTICI INIZIALI
RIDUZIONE DELLE IPOTESI
TESTS DIAGNOSTICI DI APPROFONDIMENTO

CONFERMA DIAGNOSTICA DELLE IPOTESI


TERAPIA

TESTS DIAGNOSTICI DI MONITORAGGIO

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MONITORAGGIO DEI FARMACI


Scopo :
a.
verificare la compliance del paziente nei confronti
della terapia
b.
controllo dei possibili effetti tossici
c.
aggiustamento terapia
E possibile dosare direttamente o indirettamente le
concentrazioni plasmatiche dei farmaci

Diretta
Antiepilettici
Antiaritmici
Antidepressivi
Antibiotici ......

Indiretta
Anticoagulanti
Antiflogistici ......

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TIPI DI ESAMI
La maggior parte delle analisi viene eseguita sotto forma di :
ANALISI SINGOLE
servono a fornire risposte ad una domanda precisa
(diagnosi, monitoraggio)
RAGGRUPPAMENTI DI ANALISI
emocromo
esame urine
elettroliti
sieroproteine
PROFILI BIOCHIMICI
metabolici (glucidi, lipidi)
dorgano (funzionalit epatica, pancreatica, gonadica)
funzionali (fegato, tiroide..)
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TIPI DI ESAMI

PROVE FUNZIONALI
studiano la perdita o lalterazione della capacit dellorganismo a
reagire a determinati stimoli (es. OGTT)

ESAMI DI SCREENING

ESAMI URGENTI
esami di elevato contenuto diagnostico
riguardanti analiti di possibile rapida modificazione nel tempo
il cui referto indispensabile per trattare pazienti acuti e gravi
affetti da malattie terapeuticamente modificabili

accettato ed eseguito dal laboratorio in qualunque momento


consegna immediata del referto al medico

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BIOCHIMICA CLINICA
Oggetto delle indagini :
SANGUE (intero, plasma,siero)
URINA (prima minzione,raccolta 24 ore)
Liquido cerebro-spinale

Liquido amniotico
Liquido sinoviale
Liquido seminale
Feci
Escreato
Calcoli
TUTTI SI DEFINISCONO CAMPIONI

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TAPPE DEL PROCESSO ANALITICO

Sono identificabili 4 momenti:


Fase pre-analitica

Fase analitica
Refertazione risultati
Interpretazione risultati

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Fase preanalitica : primo requisito per assicurare


lattendibilit di un risultato
lesecuzione corretta del prelievo:
a.

Porre particolare attenzione al paziente, al


procedimento, al volume

b.

Controllare interferenze farmacologiche o dietetiche

c.

Evitare processi di contaminazione (materiale


monouso, norme igieniche)

d.

Utilizzare anticoagulanti appropriati e ben miscelati

e.

Identificare correttamente il paziente e gli esami


richiesti

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Fase analitica
a. Esecuzione dellanalisi in tempi brevi (per evitare modificazioni
nella morfologia del materiale o nella costituzione dei suoi
elementi biochimici)
b. Metodi accurati, strumenti precisi, tecnici competenti
c. Registrazione sistematica e precisa dei risultati (gestione
computerizzata degli esami di laboratorio)
Refertazione
Chiara, completa, tempestiva, con unit di misura e valori di
riferimento

Interpretazione
a. Confronto con i valori di riferimento
b. Valutazione variazioni cronobiologiche, alimentari,
farmacologiche, fisiche, psicologiche (stress).

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PRELIEVO EMATICO
VENOSO
Vene sottocutanee della fossa antecubitale : mediana, cefalica,
basilica.
Il prelievo va eseguito evitando una stasi prolungata che
provocherebbe una diminuzione del volume plasmatico per
aumento della pressione idrostatica a valle della compressione
CAPILLARE
Adulto: faccia volare delle falangi distali delle dita della mano
Bambino : area periferica tallone
Il prelievo va eseguito evitando una eccessiva spremitura del
punto prescelto per
possibile passaggio
del liquido
interstiziale nel campione di sangue capillare
ARTERIOSO
emogasanalisi (O2/CO2) equilibrio acido/base (pH)
arteria radiale, brachiale, femorale

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SANGUE
La scelta dellutilizzazione di sangue venoso intero, del suo
plasma o del suo siero legata alle caratteristiche della
ricerca da eseguire
In genere la maggior parte delle analisi viene eseguita su
siero piuttosto che su plasma, in quanto il siero piu
limpido dal punto di vista ottico

Si utilizza sangue venoso intero per tutti i dosaggi di


sostanze presenti esclusivamente o prevalentemente negli
eritrociti (ad es. Hb, HbA1c, G6PD)
Il plasma presenta meno fenomeni emolitici, richiede meno
tempo per essere separato (basta centrifugare),
essenziale per lesecuzione dei test di coagulazione

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Campioni di sangue
SIERO
Prelievo con provetta senza anticoagulanti
30 minuti di tempo per far completare la coagulazione
Centrifugazione e conseguente separazione del supernatante
liquido dal coagulo (fondo)
Aspirazione del supernatante (= SIERO) e suo utilizzo

PLASMA
Prelievo con provetta CON anticoagulanti
Centrifugazione e conseguente separazione del supernatante
liquido dagli elementi corpuscolati (fondo)
Aspirazione del supernatante (= PLASMA) e suo utilizzo

SANGUE VENOSO INTERO


Prelievo con provetta CON anticoagulanti
Accurata miscelazione ed utilizzo di tutto il campione

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ANTICOAGULANTI

EPARINA
E un mucopolisaccaride naturalmente presente nel sangue che
esplica la sua azione come cofattore dellantitrombina III
plasmatica, in combinazione con la quale inattiva la trombina
ed il fattore X attivato, bloccando la formazione della trombina
e di conseguenza anche la trasformazione del fibrinogeno in
fibrina
Si trova in commercio come sale di sodio, di potassio, di
ammonio e di litio
CITRATO TRISODICO
Chelante che complessa gli ioni Calcio
Si utilizza per la determinazione della VES

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ANTICOAGULANTI

EDTA (acido etilendiaminotetracetico)

Sale bi- o tri- sodico o bipotassico che chela gli ioni calcio non
rendendoli piu disponibili per consentire la coagulazione
E lanticoagulante di elezione per lemocromocitometria in
quanto conserva inalterati i componenti cellulari del sangue

MISCELE DI ANTICOAGULANTI
ACD : acido citrico, citrato, destrosio
Viene utilizzato per emotrasfusioni,
ricerche immunoematologiche, enzimopatie eritrocitarie

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Sistema vacutainer per leffettuazione dei


prelievi ematochimici

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FATTORI INTERFERENTI
LA QUALITA DEI RISULTATI ANALITICI DIPENDE ALMENO IN PARTE DA
FATTORI CHE INTERVENGONO NELLA FASE PRE ANALITICA
Fase pre-analitica : prelievo, raccolta , conservazione campioni biologici

FATTORI INTERFERENTI

Biologici

Chimico fisici

Farmacologici

Et

diretti

dirette sulla reaz.

Sesso

indiretti

indirette sulla
funz.metab

Ritmi circadiani

Momenti fisiologicici
Stati psicologicici
Assunzione cibi o
bevande
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INTERFERENZA BIOLOGICA
ASSUNZIONE CIBI E BEVANDE (glicemia, lipemia, cristalli nelle urine)

POSTURA
In posizione eretta la distribuzione dei liquidi
fra il settore vascolare e quello interstiziale si modifica
ed il volume plasmatico diminuisce del 10% mentre quello interstiziale aumenta.
Per questo motivo nei pazienti ambulatoriali rispetto a quelli ospedalizzati
si osserva un aumento della concentrazione delle proteine e di tutte le sostanze che
circolano legate alle proteine come il calcio, il colesterolo, la bilirubina

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INTERFERENZA BIOLOGICA
ATTIVITA FISICA

Limmobilizzazione completa comporta una


demineralizzazione ossea con aumento nelle
urine di calcio, fosforo e idrossiprolina

Un esercizio fisico di un certo impegno pu


determinare variazioni nei livelli degli enzimi
muscolari

ETA - SESSO
RITMI BIOLOGICI (soprattutto
circadiani)Variazioni ritmiche nel tempo
di alcuni costituenti

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INTERFERENZA CHIMICO FISICA


Fisicamente:
Vit.A : sulla reazione per la bilirubina con metodo
diretto
Chimicamente:
es. glucosio o elettroliti endovena e prelievo
contestuale
es. aggiunta di EDTA a un campione su cui si deve
dosare il calcio
es. somministrazione di penicillina che interferisce
ossidando alcuni reattivi
INTERFERENZA FARMACOLOGICA
ad es.
diuretici (riduzione elettroliti),
antidepressivi (aumento prolattina),
allopurinolo (riduzione uricemia)

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EMOLISI
Causa pi frequente di interferenza.
Passaggio nel siero o nel plasma dellHb e di tutte le
sostanze contenute allinterno degli eritrociti.

Cause:
Osmotica (o chimica): presenza di acqua o sost. chimiche nelle
provette
Meccanica :

rottura meccanica della membrana


eritrocitaria (prelievo o trasporto)

Fisica :

sbalzi termici eccessivi

Patologica :

(riduzione resistenza eritrocitaria :


sferocitosi, carenze G6PD)

Conseguenze:
Interferenze fisiche nei dosaggi con tecniche colorimetriche
(assorbimento dellHb a 405 nm) o chimiche (inibizione delle
reazioni di diazotazione da parte dellHb - es,. dosaggio
bilirubina)
Passaggio nel siero o plasma di sostanze la cui concentrazione
negli eritrociti superiore a quella nel siero (es. K, LDH,
transaminasi)
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Trovare un risultato di laboratorio anormale del


tutto inatteso abbastanza frequente, in modo
particolare con gli attuali approcci di screening e i
monitoraggi dove spesso molti test sono richiesti
contemporaneamente e spesso sotto forma di profili
dorgano o di patologia
Prima di prendere uniniziativa clinica occorre
considerare tutte le possibili ragioni che possono
spiegare la presenza di risultati anormali
Con la pubblicazione delle linee guida proposte
dallInternational Federation of Clinical Chemistry
and Laboratory Medicine, il termine di intervallo
normale stato sostituito da
intervallo di riferimento o range di riferimento
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VALORI DI RIFERIMENTO
Lutilizzazione clinica dei test di laboratorio presuppone
il confronto dei valori ottenuti con i cos detti
INTERVALLI (RANGES) o VALORI
DI RIFERIMENTO
Gli intervalli di riferimento sono specifici per ciascun
metodo e per ciascun laboratorio.
NB : alcuni intervalli dipendono da et, sesso, peso,
dieta, attivit fisica

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Intervalli di riferimento
Spesso rappresentano i risultati del test nel 95% di
una piccola popolazione presumibilmente sana (=
non affetta dalla patologia che quel test potrebbe
identificare)
di conseguenza:
- il 5% delle persone sane avr un test non
normale
- questi individui non sono necessariemente malati ma sono
semplicemente diversi dalla maggioranza della popolazione

e
- valori che rientrano nei ranges non necessariamente
escludono la malattia.

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Ciascuna grandezza di un sistema ha un certo valore - VALORE


VERO - che di solito ignoto
Scopo della misura ottenere un valore VALORE ANALITICO
che rappresenti una stima quanto pi esatta possibile del valore
vero.
ATTENDIBILITA ANALITICA

Indicazione di quanto il valore vero oggetto della misura


concorda con il valore ottenuto dalla misura stessa.
E diretta conseguenza del metodo utilizzato per la misurazione
cio dellinsieme di tecniche, strumentazioni e reattivi utilizzati

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ATTENDIBILITA ANALITICA

Perch un metodo risulti attendibile deve possedere le seguenti


caratteristiche :
PRECISIONE
ACCURATEZZA

esecuzione
metodo (esecuzione)

SPECIFICITA
SENSIBILITA

metodo
metodo

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PRECISIONE
La PRECISIONE il grado di concordanza tra misure
replicate effettuate sullo stesso paziente.
Rappresenta la misura della riproducibilit del test
quando ripetuto sullo stesso campione.
Numericamente si esprime il suo contrario,
lIMPRECISIONE, che indica quanto le diverse
osservazioni si discostano luna dallaltra, e che viene
espressa come deviazione standard relativa o
coefficiente di variazione (CV)

CV = (DS / media)

x 100

ACCETTABILE UN CV < 3%

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Il concetto di precisione implica altre due


definizioni :
RIPETIBILITA : misura della deviazione dei dati
dal valore medio (ottenuta dalloperatore in
ununica serie analitica senza cambiare reattivi o
strumenti)
RIPRODUCIBILITA :misura della deviazione dei
dati dal valore medio (ottenuta in tempi pi
lunghi, da tecnici diversi, con lotti, soluzioni
standard e reagenti diversi)

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ACCURATEZZA
Si riferisce in genere ad una serie di risultati ottenuti in

condizioni stabilite :
il grado di concordanza fra la media trovata in una serie di
ripetizioni della stessa analisi sullo stesso campione ed il
valore vero della misurazione stessa.
Anche in questo caso si valuta l INACCURATEZZA che ci dice
quanto si discosta la migliore stima dal valore stesso
PRECISIONE ed ACCURATEZZA sono tra loro dipendenti per cui
un certo metodo pu essere :
Preciso ed accurato
Impreciso ed accurato
Preciso ed inaccurato
Impreciso ed inaccurato.

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PRECISIONE ed ACCURATEZZA
sono tra loro dipendenti
per cui un certo metodo pu essere :

Preciso ed accurato
Impreciso ed accurato
Preciso ed inaccurato
Impreciso ed inaccurato.

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PRECISIONE ED ACCURATEZZA

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La SPECIFICITA intesa come la capacit di un metodo di


misurare solo ed interamente la sostanza ricercata, senza
subire interferenze positive o negative da altro materiale
NON HA UN VALORE NUMERICO

La SENSIBILITA la pi piccola quantit di sostanza che il


metodo riesce a misurare cio a distinguere dallo zero
NON HA UN VALORE NUMERICO

Il LIMITE DI RILEVABILITA la pi piccola quantit di


sostanza che il metodo riesce a dosare.

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SPECIFICITA E SENSIBILITA CLINICHE


Si utilizzano per descrivere il comportamento di
un test di laboratorio utilizzato per individuare
una certa patologia.
La SENSIBILITA CLINICA di un test indica
lincidenza di risposte positive che si ottengono
effettuando il test a pazienti affetti dalla malattia
evidenziabile con quel test.
E la positivit in caso di malattia.
SENSIBILITA DEL 100% SIGNIFICA 100 RISPOSTE
POSITIVE IN 100 PAZIENTI AFFETTI DALLA MALATTIA.

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SPECIFICITA E SENSIBILITA CLINICHE

La SPECIFICITA CLINICA di un test indica


lincidenza di risposte negative che si ottengono
effettuando il test a soggetti non affetti dalla
malattia evidenziabile con quel test.
E la negativit in condizione di salute
SPECIFICITA
DEL
100%
SIGNIFICA
100
RISPOSTE NEGATIVE IN 100 PERSONE SANE.

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La SENSIBILITA CLINICA E la positivit in caso di malattia.


SENSIBILITA DEL 100% SIGNIFICA 100 RISPOSTE POSITIVE IN 100 PAZIENTI AFFETTI
DALLA MALATTIA.
La SPECIFICITA CLINICA E la negativit in condizione di salute
SPECIFICITA DEL 100% SIGNIFICA 100 RISPOSTE NEGATIVE IN 100 PERSONE SANE.

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TEST

Sono stati esaminati 80 soggetti, 40 non affetti da alcuna


patologia e 40 affetti dalla patologia in esame

Tutti i soggetti sono stati sottoposti a due test, A e B, entrambi


miranti ad identificare la patologia in oggetto

Sono risultati positivi al test A 25 dei pazienti affetti dalla


patologia e 10 dei soggetti non affetti dalla patologia

Sono risultati positivi al test B 22 dei pazienti affetti dalla


patologia e 20 dei soggetti non affetti dalla patologia
QUALE IL TEST PIU ADATTO PER LO SCREENING DELLA
PATOLOGIA OGGETTO DELLO STUDIO?

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TECNICHE ANALITICHE
Nellesecuzione delle analisi di chimica clinica hanno trovato larga
applicazione diverse metodiche strumentali:

FOTOMETRIA e SPETTROFOTOMETRIA

FLUORIMETRIA

CROMATOGRAFIA

ELETTROFORESI

TURBIDIMETRIA e NEFELOMETRIA

MICROSCOPIA

RADIOIMMUNOMETRIA

BIOLOGIA MOLECOLARE

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Moltissime reazioni utilizzate in Chimica Clinica vengono valutate


mediante mezzi che misurano le interazioni tra la materia ed unenergia
radiante emessa da una sorgente luminosa.

Le diverse sostanze hanno la possibilit di assorbire radiazioni luminose


(ed questo il motivo per cui appaiono colorate).

Dal punto di vista chimico il colore di una sostanza dipende dalla


presenza in essa di alcuni gruppi chimici, detti cromofori, costituiti da
legami insaturi tipo C=C, N=N,C=O, N=O caratterizzati dalla presenza di
elettroni che richiedono solo una modesta quantit di energia per
eccitarsi.

Quando latomo assorbe energia


energetico (transizione elettronica)

Poich la quantit di energia utile per una transizione elettronica varia


da sostanza a sostanza. Potranno essere assorbite solo le radiazioni la
cui frequenza tale da originare una quantit di energia sufficiente a
provocare una variazione di livello energetico

viene

alterato

il

suo

equilibrio

LO STUDIO DELLE RADIAZIONI ASSORBITE


SPETTRO DI ASSORBIMENTO
PERMETTE DI CARATTERIZZARE ED IDENTIFICARE MOLTISSIMI COMPOSTI

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Lassorbimento delle radiazioni da parte delle soluzioni


dipende dal numero e dal tipo di sostanze che in essa sono
disciolte.
La legge che regola tale assorbimento la LEGGE DI
LAMBERT e BEER
D.O. = k * l * c
k = costante caratteristica della sostanza in esame
l = lunghezza cammino ottico
c = concentrazione della sostanza
l * c = numero di molecole che il raggio incontra cio la
CONCENTRAZIONE DELLA SOLUZIONE

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Tutte le volte che abbiamo una soluzione in grado di assorbire


radiazioni luminose ne possiamo stabilire la concentrazione
valutando la differenza

I - I = ASSORBANZA
Per motivi strumentali pi pratico calcolare il rapporto
I / I

TRASMITTANZA (T)

la trasmittanza legata alla concentrazione della soluzione


dalla relazione

T = 10

-klc

dato che per la Legge di Lambert e Beer D.O. = klc si avr


DO = -logT
Fra la concentrazione delle soluzioni e la loro densit ottica
esiste una proporzionalit diretta , fra la trasmissione e la
concentrazione esiste una proporzionalit inversa.
Gli strumenti calcolano direttamente il log della percentuale di
trasmissione che viene definito
DENSITA OTTICA DELLA SOLUZIONE

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Per lo studio degli spettri di assorbimento si usano gli SPETTROFOTOMETRI
- Permettono misurazioni quantitative dellintensit luminosa in quanto
lelemento fotosensibile non locchio ma un fotomoltiplicatore
- Si utilizzano per misure nellU.V., Visibile ed Infrarosso
- Permettono di selezionare lunghezze donda monocromatiche

Di fondamentale importanza la
costruzione di una curva di taratura
dello strumento per lanalita
ricercato : CURVA STANDARD

D.O.

Si sottopongono ad un procedimento
analitico uguale a quello usato per i
campioni delle soluzioni a titolo noto
ed a concentrazioni scalari
dellanalita in esame (standards)
Si costruisce quindi una curva che
mette a confronto le concentrazioni
degli standard con le D:O: misurate
Si confronta la D.O. dei campioni con
quella della curva standard

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Concentrazione

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TURBIDIMETRIA e NEFELOMETRIA
ANALISI DEI SISTEMI DISPERSI
Quando un raggio di luce si propaga in un mezzo omogeneo, percorre un
cammino rettilineo
Quando invece attraversa un mezzo contenente una fase dispersa (colloidi o
precipitati) una parte viene assorbita ed una parte diffusa per fenomeni di
riflessione, rifrazione, diffrazione
I due fenomeni coesistono sempre ma il prevalere delluno o dellaltro dipende
da
omogeneit

dimensione
delle particelle disperse

concentrazione

disomogenee, grandi
molto concentrate

omogenee,piccole
poco concentrate

TURBIDIMETRIA
prevale lassorbimento

NEFELOMETRIA
prevale la diffusione

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NEFELOMETRIA
Si basa sulla propriet delle
soluzioni disperse fini a
diffondere in tutte le direzioni
un raggio incidente
Si misura la luce diffusa ad una
angolazione diversa da quella
della luce incidente

E una metodica molto precisa,


sensibile ed accurata
Le sue applicazioni sono
sempre piu numerose
soprattutto sotto forma di
reazioni immunochimiche

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IMMUNOCHIMICA

COMPRENDE TUTTE QUELLE METODICHE ANALITICHE CHE UTILIZZANO REAZIONI


ANTIGENE-ANTICORPO PER IDENTIFICARE O QUANTIFICARE DETERMINATE SOSTANZE
CHIMICHE

Gli ANTICORPI sono le sostanze prodotte in seguito alla stimolazione da


parte dellantigene.
Tutte le molecole dotate di attivit anticorpale vengono raggruppate sotto
il termine di IMMUNOGLOBULINE

La loro struttura fondamentalmente simile :


4 catene polipeptidiche unite da ponti disolfuro
(catene pesanti e catene leggere)
Si dividono in 5 classi, (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)diverse per PM e
composizione in catene pesanti

BIOCHIMICA CLINICA

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IMMUNOCHIMICA

E possibile marcare antigeni o anticorpi con traccianti che ne


rendano possibile il loro dosaggio nei liquidi biologici.
METODI IMMUNOCHIMICI CON TRACCIANTI
RADIOATTIVI
RIA
(Ag*)
IRMA
(Ac*)

NON RADIOATTIVI
ENZIMI (EIA- ELISA)
FLUOROCROMI
SOST. LUMINESCENTI
METALLI
VIRUS

BIOCHIMICA CLINICA

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Attualmente i metodi immunoenzimatici sono i piu utilizzati


E possibile fissare un antigene od un anticorpo su una fase
solida (per es. micropozzetti) e semplificare cos la fase di
allontanamento dei composti non legati.
Lattivit del marcatore enzimatico adeso allantigene o
allanticorpo viene per lo piu misurata con metodi
colorimetrici
Gli enzimi vengono fatti reagire con substrati cromogenici
molto stabili che, sottoposti a catalisi enzimatica, si
trasformano in prodotti colorati cio ad alto coefficiente di
assorbimento
molecolare
e
quindi
valutabili
spettrofotometricamente
Si possono marcare :
gli antigeni (EIA : Enzyme Immuno Assay) o
gli anticorpi (IRMA).
La tecnica pi utilizzata prevede un sistema che utilizza un
anticorpo legato covalentemenete ad una matrice insolubile
(ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).

BIOCHIMICA CLINICA

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IMMUNOCHIMICA
Fra gli enzimi pi utilizzati ricordiamo :
la perossidasi da rafano,
la fosfatasi alcalina,
la glucosio ossidasi
la glucosio 6 fosfato deidrogenasi

Essi reagiscono con il loro substrato


determinando la formazione di un composto
colorato e quindi rivelabile
spettrofotometricamente.

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E.I.A.
Substrato con
antigene coattato

30 Minuti
Incubazione

Siero Diluito
1:80 con PBS
30 Minuti
Incubazione

PEROSSIDASI
Coniugato
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E.I.A.

15 Minuti
Incubazione

CROMOGENO
INCOLORE

ACIDO SOLFORICO
(STOP)
BIOCHIMICA CLINICA

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ANALISI QUANTITATIVA
A B C D E

1
2
3
4
5
6
7
8

Calibratore 1
Calibratore 2
Calibratore 3
Positivo
Negativo

Campione n1
Campione n2
Campione n3
Piastra

BIOCHIMICA CLINICA

2
20

RU/mL

200
RU/mL

200

20

x
Cut-off

2
D.O.

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ANALISI QUALITATIVA
A B C D E

1
2
3
4
5
6
7
8

Cut-off
Positivo
Negativo
Campione n1
Campione n2
Campione n3

Piastra
BIOCHIMICA CLINICA

20

RU/mL

RU/mL

x
20
x

Pos
Cut-off
Neg

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BIOCHIMICA CLINICA

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IMMUNOCHIMICA
Una singola molecola di antigene contiene diversi
determinanti antigenici detti EPITOPI
La stimolazione antigenica determina la produzione di
anticorpi da parte dei linfociti B, ma ciascuna cellula B
pu formare anticorpi solo contro un epitopo antigenico

ANTICORPI MONOCLONALI
Sono anticorpi specifici per un singolo epitopo, cio
prodotti da una singola linea cellulare B = CLONE

BIOCHIMICA CLINICA

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Tali anticorpi sono di un solo tipo in quanto derivanti da


un solo clone di cellule e per le loro caratteristiche di
omogeneit chimico fisica o immunochimica. Possono
venire impiegati al posto degli anticorpi tradizionali per
realizzare tecniche analitiche sensibili , specifiche e,
soprattutto, assolutamente standardizzabili.
Attualmente gli anticorpi monoclonali vengono usati per :
dosaggio di antigeni, ormoni, farmaci
tipizzazione e separazione citologica
tipizzazione tissutale
diagnostica malattie infettive e virali

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Nella figura A,B,C,D rappresentano 4 differenti antigeni.


A uguale a B tranne che per le tendine alle finestre e per il
cespuglio(2)
C diverso da A e B per buona parte delle sue caratteristiche
D completamente diverso da B e da C ed ha solo un particolare
(1) in comune con A.
BIOCHIMICA CLINICA

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Qual la differenza in termini di specificit di risposta tra gli


anticorpi mono e poli clonali ?
Lanticorpo policlonale anti C riconosce A,B. e C; non riconosce solo D.
Lanticorpo monoclonale anti-(1) distingue A da B e C ma riconosce anche D
Lanticorpo monoclonale anti-(2) riconosce solo A

BIOCHIMICA CLINICA

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FLUORIMETRIA

Tecnica che si utilizza per determinare sostanze presenti nei


fluidi biologici in concentrazioni particolarmente basse
Si misura la fluorescenza che determinate sostanze
presentano naturalmente o dopo opportuna reazione chimica
Sono sostanze che contengono sistemi di doppi legami
coniugati, molecole planari rigide e sostituenti chimici tipo

OH. NH2,
-OR, -NHR

La fluorescenza quindi una propriet caratteristica di alcune


sostanze che quando eccitate dcon radiazioni di unopportuna
lunghezza donda sono in grado di riemettere lenergia con una
lunghezza donda maggiore di quella che hanno assorbita
Le migliori sorgenti di eccitazione sono le radiazioni luminose
ad alta energia e pertanto le radiazioni UV si prestano bene
per eccitare la fluorescnza nel campo del visibile

BIOCHIMICA CLINICA

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FLUORIMETRIA

Gli elettroni di una molecola non eccitata si trovano normalmente


nel livello a pi basso contenuto energetico (Eo)
Un fotone assorbito dalla molecola provoca la transizione (A) di
un elettrone ad uno dei livelli vibrazionali del 1 stato eccitato
La molecola pu restare allo stato eccitato per un tempo
brevissimo (10-8 sec) ed in questo tempo tende a perdere
lenergia assorbita tornando allo stato fondamentale (D)
Molecole particolari , con struttura grande e piuttosto rigida,
perdono solo una parte dellenergia assorbita (D1 e D2) e
riportano lelettrone al pi basso livello vibrazionale del 1
stato eccitato.
Il successivo assestamento energetico porta alla discesa
dellelettrone fino al livello fondamentale (PROCESSO F) con
conseguente
emissione
di
un
fotone
con
energia
evidentemente minore di quello di eccitazione

BIOCHIMICA CLINICA

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Livelli vibrazionali

D1

D2

E1
F

PRIMO STATO
ECCITATO

D (10-8 sec)
Livelli vibrazionali

STATO
FONDAMENTALE

E0

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FLUORIMETRIA

Si definisce FLUORESCENZA lemissione di energia che avviene


in un tempo compreso fra 10 -9 e 10 -3 sec. dopo leccitazione

Si definisce FOSFORESCENZA se il tempo supera i 10 -3


secondi
La sensibilit dei metodi fluorimetrici circa 1000 10000
volte superiore a quella dei metodi fotometrici.
I procedimenti applicabili in chimica clinica sono
DI TIPO DIRETTO se la sostanza da dosare naturalmemte
fluorescente (barbiturici, porfirine)
DI TIPO INDIRETTO se la sostanza da dosare diventa
fluorescente in seguito a reazioni con altre sostanze

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FLUORIMETRI e SPETTROFLUORIMETRI

Sono strumenti analoghi a fotometri e spettrofotometri ma


costruiti in modo che il fotorivelatore venga colpito solo dalle
rdaiazioni emesse dal campione fluorescente
La SORGENTE LUMINOSA in genere una lampada ai vapori di
mercurio o allo Xenon
Il SISTEMA OTTICO formato da :
filtro primario (eccitazione)
cella di reazione
filtro secondario (sbarramento)
fotorivelatore

BIOCHIMICA CLINICA

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30 Minuti
Incubazione

I.F.I
Substrato
Crithidiae l.

Siero Diluito
1:80 con PBS

FITC
BIOCHIMICA CLINICA

30 Minuti
Incubazione

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I.F.I.

495 nm

500 nm

FITC

525 nm

10-9/10-3
FILTRO DI ECCITAZIONE

FILTRO DI SBARRAMENTO

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PROTEINE

Le proteine plasmatiche sono un insieme molto eterogeneo di composti


diversi
Per la maggior parte vengono sintetizzate nel fegato
eccetto
Ig: plasmacellule,
alcune frazioni del complemento:macrofagi,
alcune Lp:cellule intestinali
Anche il catabolismo avviene principalmente nel fegato
pu avvenire anche a livello renale e gastrointestinale (albumina)
TURNOVER METABOLICO
AUMENTO SINTESI
orm. somatotropo
androgeni
estrogeni
insulina
orm. tiroidei a conc. fisiol.

AUMENTO CATABOLISMO
glucocorticoidi
glucagone
orm. tiroidei ad alte conc.

BIOCHIMICA CLINICA

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Funzioni delle proteine


A)

NUTRIZIONALI : fonte di aA
sintesi proteica
scopo energetico
sintesi di lipidi e glucidi (dopo deaminazione)

B)

REGOLAZIONE EQUILIBRIO ACIDO BASE : al pH del sangue (arterioso7.35-7.45


venoso 7.32-7.42) funzionano da sistema tampone (1/5 del potere tampone del
sangue) comportandosi da ac. deboli che si possono combinare con una base per
dare il sale corrispondente

C)

MANTENIMENTO PRESSIONE COLLOIDO OSMOTICA : le proteine non possono


diffondere attraverso la membrana semipermeabile della parete vasale dei
capillari per cui esercitano una pressione colloido osmotica diretta verso
linterno del vaso che tende a richiamare liquidi e bilancia la pressione
idrostatica del plasma che ha direzione opposta.
(responsabile principale : albumina)

D)

TRASPORTO :
veicolano molti composti che altrimenti risulterebbero insolubili nel plasma
(lipidi, ormoni steroidei e tiroidei)
rendono atossiche legandole diverse sostanze
(farmaci, ferro, calcio, rame)

E)

COAGULAZIONE : sono proteine quasi tutte le sostanze interessate


meccanismo a cascata della coagulazione, compreso il fibrinogeno

E)

IMMUNITARIA : anticorpi, componenti del complemento

F)

ENZIMATICA : sono enzimi circa il 4% delle proteine plasmatiche

BIOCHIMICA CLINICA

al

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Distribuzione delle proteine negli spazi extravascolari

Le plasmaproteine presenti nel torrente circolatorio


distribuiscono variamente negli spazi extravascolari

si

nel liquido interstiziale,


nel liquido sinoviale
nel liquido cerebrospinale,
nelle cavit sierose
nel liquido intraoculare

comunque in equilibrio con il pool plasmatico.

Il contenuto proteico dei liquidi extravascolari pertanto


variabile ed legato fondamentalmente

alla composizione proteica del plasma,


al peso molecolare delle proteine e al loro volume idrodinamico
al grado di permeabilit della parete capillare.

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DOSAGGIO PROTEINE
PROTEINE TOTALI
RIFRATTOMETRO
Ricava la concentrazione delle proteine misurando il cambiamento dellindice di
rifrazione del campione causato dalla presenza in soluzione delle proteine
interferenze : elevati livelli bilirubina, lipidi, emolisi
COLORIMETRIA
Utilizza coloranti che in seguito al legame con le proteine variano la loro
assorbanza (biureto e solfato di rame alcalino con misurazione a 545 nm per la
valutazione delle proteine totali)
PROTEINE SPECIFICHE
TURBIDIMETRO NEFELOMETRO
ELETTROFORESI
IMMUNOENZIMATICA - RADIOIMMUNOLOGIA

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v.r. PROTEINE TOTALI

6 8 g/dl

RIDUZIONE P.T.

AUMENTO P.T.

apporto insufficiente

(anche se con riduz. ALB)


epatiti croniche
cirrosi
malattie iperplastiche

dieta neopl. dig. malassorb

Perdita
proteinuria ustioni emorragie

Eccessivo catabolismo
febbre persistente

Difetto sintesi proteica


epatopatie croniche

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..ricordiamo che..
le proteine sono molecole dotate di carica
devono la loro carica elettrica alla ionizzazione dei loro gruppi
aminici (+) carbossilici ed imidazolici (-).
a seconda del pH del mezzo in cui si trova disciolta la proteina,
la ionizzazione pu portare ad una prevalenza di cariche
positive o negative oppure ad un equivalenza dei due tipi di
cariche.
il valore di pH che corrisponde a questa condizione si definisce
punto isoelettrico (pI)
le proteine sono quindi sostanze anfotere in quanto possono
dissociare sia in ioni positivi che negativi.
pH > pI
prevalgono cariche negative
pH < pI
prevalgono cariche positive

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ELETTROFORESI

Lelettroforesi un metodo di
separazione basato sulla diversa
velocit di migrazione di particelle
elettricamente cariche attraverso
una soluzione sotto linfluenza di un
campo elettrico applicato.

La migrazione legata a diversi


fattori :
*natura del mezzo
*campo elettrico applicato
* massa, dimensioni, carica e forma
delle particelle
MOBILITA ELETTROFORETICA

Tecnica difficilmente applicabile alla


separazione di particelle piccole (che
arriverebbero agli elettrodi in tempi
brevissimi) ma mezzo di separazione
eccellente per le macromolecole, in
particolare proteine.

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ELETTROFORESI SIEROPROTEINE

La migrazione viene fatta avvenire su di un supporto solido


per cui possibile, al termine della migrazione, fissare e
colorare le bande proteiche e , mediante luso di un
DENSITOMETRO, calcolare in modo semiquantitativo la
quantit percentuale delle singole frazioni.
I supporti sono di due tipi :
1) quelli che separano le proteine in base alla loro densit di
carica elettrica - rapporto fra dimensioni della molecola e
carica elettrica totale (acetato di cellulosa e gel di agarosio)
2) quelli che separano sia in base alla densit di carica che
alla forma e dimensione delle singole proteine in quanto
formano dei gel porosi in cui il diametro dei pori uguale a
quello delle molecole proteiche per cui si ottiene un setaccio
molecolare che separa anche molecole con uguale densit di
carica ma diverso PM (es. il gel di poliacrilammide)

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ELETTROFORESI SIEROPROTEINE

ANALISI DELLA STRISCIA


Dopo la migrazione, lanalisi della striscia viene effettuata
mediante
un
densitometro,
apparecchio
che
misura
lassorbanza delle varie bande colorate .
Se il densitometro collegato ad un registratore si pu
ottenere il cosidetto tracciato elettroforetico (in ordinata
lassorbanza ed in ascissa la posizione delle bande)
Lelaborazione dei dati relativi a ciascuna area corrispondente
alle singole bande rispetto allarea totale consente di
esprimere i risultati in concentrazioni percentuali.

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Acetato di cellulosa

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ELETTROFORESI DELLE SIEROPROTEINE


ALBUMINA

BIOCHIMICA CLINICA

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ELETTROFORESI SIEROPROTEINE
Le sieroproteine sottoposte ad elettroforesi su acetato di cellulosa si
dividono in 5 frazioni fondamentali :

ALBUMINA

1
2

GLOBULINE (1 glicoproteina acida - 1 antitripsina)

GLOBULINE (2 macroglobulina aptoglobina)


GLOBULINE (transferrina - lipoproteina - fraz.C3 complemento)
GLOBULINE (immunoglobuline)

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BIOCHIMICA CLINICA

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ALBUMINA

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Albumina

1.
2.

Sintetizzata dal fegato


Un soggetto adulto normale
sintetizza circa 14 gr di
albumina al giorno
Non viene degradata da un
organo specifico
Il 30-40% dellalbumina si
trova nel plasma, la parte
rimanente nei liquidi
interstiziali dei vari tessuti,
nei muscoli e nella cute
Funzioni principali:
Influenza sulla pressione
colloido-osmotica o oncotica
Trasporto di numerose
sostanze

Lalbumina rappresenta la
frazione proteica pi cospicua
(3.6-4.9 g/dl) pari al 60% del
contenuto proteico totale

1.
2.

Aumento dellalbumina:
Disidratazione
Malattie caratterizzate da
diarrea e vomito
Coma diabetico
Morbo di Addison

3.
4.

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Diminuzione dellalbumina
Edema
Sindromi nefrosiche (0.5-0.3
g/dl)
Insufficiente apporto proteico
Rallentato o ostacolata sintesi
Eccessivo catabolismo proteico
Gravidanza
Difetto genetico
IPOALBUMINEMIA VERA
albumina < 3.20 g/dl

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ALFA1GLICOPROTEINA ACIDA
ALFA1ANTITRIPSINA inibisce la tripsina e altri enz. proteol. proteina fase acuta

ALFA 1

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ALFA2 MACROGLOBULINA

APTOGLOBINA
sintetizzata nel fegato
catabolismo Hb
Proteina fase acuta

tra le pi grosse prot.plasm.


inibitore non specifico degli enz.prot.
AUMENTI
Estrogeni
Gravidanza
Sindrome nefr.
Diabete
Epatopat. croniche

DIMINUZIONI
Artrite Reumatoide
Eclampsia

Diminuzioni
epatopatie parenchimali
emolisi intravascolare

ALFA 2

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SINDROME NEFROSICA

Diminuzione dellalbumina
Aumento alfa2-macroglobulina
Leggera diminuzione gamma

Albumina 1

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BETA GLOBULINE

Transferrina
Compl. C3

lipoproteine

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TRANSFERRINA (TRF)

Concentrazione 200-300 mg/dl

Sintetizzata dal fegato e in minor


misura dal sistema RE e da
ghiandole endocrine

Principale proteina plasmatica di


trasporto del ferro
Il ferro rilasciato dal catabolismo
dellemoglobina si lega al TRF e
viene trasportato al reticolo
endoteliale

I dosaggi di TRF sono utili nella


diagnostica differenziale delle
anemie

Aumenti:
gravidanza,
iposideremia,
epatite acuta

Diminuzioni:
flogosi cronica
atransferrinemia congenita

FRAZIONE C3 del COMPLEMENTO

Concentrazione: 80-140 mg/dl

Aumenti (per blocco del


catabolismo)
nella cirrosi biliare primitiva
nella colestasi gravi

Diminuzioni
nel lupus eritematoso
malattie emolitiche autoimmuni

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GAMMA GLOBULINE

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Gammopatie

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GAMMAPATIE

MONOCLONALI
Affezioni
caratterizzate
da
iperproliferazione di un clone di
cellule della linea linfocitaria B

1. Gammopatie monoclonali maligne


a. Discrasie plasmacellulari:
mieloma multiplo e forme
particolari di mieloma (leucemia
plasmacellulare)
b. Sindromi linfoproliferative:
Malattie di Waldenstrom
Malattia delle catene pesanti
Leucemia linfatica cronica e
alcuni linfomi
2. Gammopatie monoclonali di incerto
significato
a. Forme asintomatiche o benigne
b. Forme associate ad affezioni
neoplastiche non linfoidi, a
processi flogistici cronici, a
sarcoma di Kaposi e AIDS, ecc.

POLICLONALI
Epatopatie: cirrosi macronodulare
post-necrotica, cirrosi micronodulare
di Laennec, cirrosi biliare primitiva,
epatite cronica aggressiva
Malattie del collagene: lupus
eritematoso, artrite reumatoide,
sclerodermia, sindrome di Sjorden
Infezioni: tubercolosi, endocardite
batterica subacuta, mononucleosi
infettiva, osteomielite, pielonefrite,
sifilide, toxoplasmosi, istoplasmosi,
malaria;
Altre malattie: fibrosi cistica,
sarcoidosi

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Gammopatia monoclonale
Diminuzione albumina
Aumento a BASE STRETTA in regione gamma

Albumina 1

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Cirrosi epatica
Diminuzione dellalbumina (sintesi)
Aumento gamma globuline (gammopatia policlonale)
fusione -

Albumina 1

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RAPPORTO ALBUMINA/GLOBULINE
A/G 1.2 1.7
Se inferiore a 1 = rapporto invertito
RIDUZIONE RAPPORTO A/G
1.DIMINUZIONE ALB
2.AUMENTO GLOBULINE
(vedi riduzione P.T.)
malattie flogistiche o
degenerative

3.ENTRAMBE
LE CAUSE

F.ATTIVA
F.CRONICA
aumento

FRAZIONI

FRAZIONI

RAPIDE

LENTE

1 2

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Anomalie del tracciato dovute ad artefatti

Emolisi:
nei campioni modestamente emolizzati lemoglobina viene legata
dallaptoglobina con la formazione di un complesso Hb-Hp dotato di
minore mobilit elettroforetica rispetto allaptoglobina
nei campioni vistosamente emolizzati lemoglobina, presente in eccesso
rispetto alla capacit di legare dellHp, migra allelettroforesi nella zona
inter 2-1, sovrapponendosi in parte alla transferrina

Invecchiamento:
interessa soprattutto le -globuline e pu portare allattenuazione o alla
completa scomparsa della banda 2

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REGOLAZIONE GLICEMIA
Nei soggetti normali il mantenimento di livelli di glucosio entro
un range di valori ben definito deriva dal mantenimento di un
equilibrio dinamico fra
a) Assunzione e neoformazione di glucosio
b) Consumo di glucosio

Sintesi di glicogeno
Insulina

Assorb. Intest.
Glicogenolisi
Gluconeogenesi

GLUCOSIO

Glicolisi
Adrenalina Glucagone
Tiroxina Cortic.Glucoatt

Glicogenolisi
Gluconeogenesi
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DOSAGGIO GLUCOSIO
I livelli di glucosio nel sangue sono la risultante dei
processi metabolici a carico dei carboidrati
(glicogenogenesi glicogenolisi glicolisi..)
Variazioni di glucosio nel sangue sono espressione di
alterazioni nel metabolismo glucidico:
IPOGLICEMIA

GLICEMIA NORMALE
70 110 mg/dl

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IPERGLICEMIA

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DOSAGGIO GLUCOSIO

La determinazione viene eseguita su plasma o su siero.


Se la determinazione non viene eseguita subito
necessario bloccare la glicolisi (NB : le cellule del sangue
consumano ogni ora circa il 7% del glucosio presente)
Si pu utilizzare come anticoagulante il floruro di sodio

METODI
A. Tradizionali si basavano sul potere riducente del
glucosio
B. Colorimetrici (condensazione del glucosio con amine
aromatiche e formazione di composti colorati)
C. Enzimatici

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METODI ENZIMATICI DOSAGGIO GLUCOSIO


A. GLUCOSIO OSSIDASI

Glucosio + O2 + H2O

H2O2 + o-Dianisidina
GIALLA

GOD

POD

ac gluconico + H2O2

o-dianisidina
INCOLORE

Interferenze : sost. riducenti come ac. ascorbico, bilirubina,


alcuni antibiotici

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METODI ENZIMATICI DOSAGGIO GLUCOSIO


A. ESOCHINASI

Esochinasi
Glucosio + ATP

Glucosio6P +

NADP+

Glucosio6P + ADP
G6PDH

6P Gluconato + NADPH + H+

Non assorbe

Assorbe

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AUTOCONTROLLO GLICEMIA
Esistono diversi sistemi per lautocontrollo domiciliare
della glicemia
In genere utilizzano sistemi potenziometrici che
sfruttano reazioni di riduzione e successiva
ossidazione di ioni ferricianuro ad opera del glucosio
con produzione di elettroni e quindi di una corrente
elettrica che viene misurata

BIOCHIMICA CLINICA

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CURVA DA CARICO ORALE DI GLUCOSIO


OGTT
oral glucose tollerance test

Basale (a digiuno) ..prelievo


CARICO = 75 g glucosio in 200-250 acqua
30 min..prelievo
60 min..prelievo
90 min..prelievo
120 min..prelievo

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CRITERI DIAGNOSTICI DIABETE


SINTOMI
+
GLICEMIA A DIGIUNO (mg/dl)

<110 NORMALE

>126
DIABETE
confermare dopo un paio di giorni
nello stesso laboratorio
senza dire nulla al paziente di modo che non metta in atto strategie alimentari

111 e 125.9

ALTERATA GLICEMIA A DIGIUNO (IFG)


OGTT + : DIABETE
OGTT - : ripetere ogni anno

GLICEMIA OCCASIONALE >200 DIABETE

Valore a 120

BIOCHIMICA CLINICA

<140

NORMALE

140 199

IGT

> 200

DIABETE

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CRITERI DIAGNOSTICI
Si possono quindi definire 4 stati :

1.
2.
3.
4.

Normale
Alterata glicemia a digiuno (IFG)
Ridotta tolleranza al glucosio (IGT)
Diabete
UNA DIAGNOSI DI IFG O DI IGT NON INDICA NECESSARIAMENTE
UNA PROGRESSIONE A DIABETE (dal 2 al 12% dei soggetti con
IGT sviluppa il diabete)

BIOCHIMICA CLINICA

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RACCOMANDAZIONI PER LESECUZIONE DELLA OGTTT


(NON IN GRAVIDANZA)

INDICAZIONI

SOGGETTI CON GLICEMIA A DIGIUNO TRA 110 E 125 MG/DL


SOGGETTI CON GLICEMIA TRA 100 E 109 MG/DL SOLO SE
AL DI SOPRA DEI 45 ANNI
IN PRESENZA DI FAMILIARITA PER DIABETE TIPO II
BMI>25 kg/m2

CONTROINDICAZIONI - il test NON va eseguito in

SOGGETTI CON DOCUMENTATA PREGRESSA DIAGNOSI DI DIABETE


IN CORSO DI PATOLOGIE ACUTE, INFEZIONI RECENTI, CONVALESCENZA PER
INTERVENTI CHIRURGICI

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RACCOMANDAZIONI PER LESECUZIONE DELLA OGTTT


(NON IN GRAVIDANZA)

IL TEST VA EFFETTUATO A DIGIUNO

NEI 3 GIORNI PRECEDENTI IL TEST E BENE CHE

IL TEST VA RIMANDATO

LALIMENTAZIONE NON SUBISCA RESTRIZIONI


SIA MANTENUTA LA CONSUETA ATTIVITA FISICA

NEL CORSO DI PATOLOGIE ACUTE,


NEL PERIODO DI CONVALESCENZA DOPO INTERVENTI CHIRURGICI,
DOPO LUTILIZZO TEMPORANEO DI FARMACI CHE POSSONO INTERFERIRE
ANTIARITMICI
ANTIBIOTICI,
ANTICONVULSIVANTI,
ANTIDEPRESSIVI
ANTIINFIAMMATORI NON STEROIDEI
ANTISTAMINICI
ANTIVIRALI
BETABLOCCANTI
GLICOCORTICOIDI

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EFFETTI SULLINSULINORESISTENZA DI FARMACI CHE INTERFERISCONO CON LA


TOLLERANZA GLUCIDICA (ESCLUSI GLI IPOGLICEMIZZANTI)

ANTIARITMICI (amiodarone,chinidina, disopramide)


ANTIDEPRESSIVI (clozapina, fluoxetina, litio)
DIURETICI (spironolattone)
VITAMINE (biotina, niacina, piridossina, vit E)

ANTIBIOTICI (ciprofloxacina, levofloxacina,nitrofurantoina..)


ANTICONVULSIVANTI (carbamazepina, fenitoina)
FANS (acido acetilsalicilico, paracetamolo)
ANTIVIRALI (indinavir, stavutidina..)
BETABLOCCANTI (acebutololo, celiprololo..)
CALCIOANTAGONISTI (ditiazem, nifepidina..)
DIURETICI TIAZIDICI (ciclopentiazide, idroclorotiazide, metazolone..)
GLICOCORTICOIDI (betametasone,metilprednisolone..)
NEUROLETTICI (clorpromazina)
ORMONI TIROIDEI (calcitonina, tiroxina)
STUPEFACENTI (cocaina, morfina)

ANTISTAMINICI (difenidramina, idrossizina)


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RACCOMANDAZIONI PER LESECUZIONE DELLA OGTTT


(NON IN GRAVIDANZA)

MODALITA DI ATTESA DOPO IL CARICO

SOGGETTO A RIPOSO
SENZA MANGIARE E FUMARE
A TEMPERATURA COSTANTE
SENZA BERE PER ALMENO 15 MINUTI DALLASSUNZIONE DEL CARICO E DOPO SOLO
ACQUA A T AMBIENTE

TEST DA RIPETERE SE SI MANIFESTA VOMITO

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NB

Sebbene sia attualmente il miglior test disponibile, lOGTT un


test relativamente impreciso poich ai possibili errori analitici si
aggiunge la variazione biologica allingestione del glucosio.
Per es. un inopportuna diminuzione dellassunzione di carboidrati
nei giorni precedenti il test pu portare ad una alterazione della
tolleranza al glucosio
Uno stato di forte stress o la presenza di una malattia possono
provocare moderati aumenti della glicemia che non devono essere
considerati diagnostici di diabete fino a quando il test non viene
ripetuto in condizioni pi normali.

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Esempi di richieste INUTILI di OGTT


1. Pazienti che si presentano per la prima volta con
sintomi di iperglicemia o glicosuria (in genere
bambini)
1. In questo caso si deve effettuare una glicemia a digiuno o
casuale, non lOGTT che potrebbe ritardare la terapia

2. Per monitorizzare o scegliere una terapia

3. In un periodo di stress , o in concomitanza con altre


malattie, o in corso di terapie (per es con
corticosteroidi) che possono far aumentare i livelli di
glucosio nel sangue

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TEST PER IL DIABETE GESTAZIONALE


Anche in gravidanza : <126 mg/dl a digiuno e >200 mg/dl random

minicarico : OGCT (oral glucose challenge test)da 50 g


glucosio e determinazioni a digiuno e dopo 1 ora
Test positivo per valori a 1 ora > 140 mg/dl da
confermare con OGTT da 75g

CONFERMATA LA NON NECESSARIETA DEL DIGIUNO


(riduzione cut off proposta a 130 mg/dl per aumentare la sensibilit)
MA SI PREFEISCE ATTENERSI AL DIGIUNO

OGTT da 75 g in qualunque momento della


gravidanza
ove ci sia il sospetto diagnostico
Ripetizione OGTT da 75 se la prima normale, alla 2628 sett

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DIABETE GESTAZIONALE
1. SCREENING alle donne in gravidanza in presenza di
fattori di rischio quali:
1.
2.
3.
4.

Et >30
Obesit
Familiarit
Precedenti di diabete gestazionale

2. FOLLOW UP con una OGTT a 75g


1. 6-8 settimane dopo il parto
2. Ogni 1-2 anni durante let fertile

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MONITORAGGIO DIABETE
GLICEMIA A DIGIUNO
GLICEMIA 2 ORE DOPO IL PASTO
EMOGLOBINA GLICOSILATA - HbA1C

v.r. < 7%

(si sta valutando di portarlo a 6.5%)

per controllare landamento della malattia negli ultimi 3 mesi (emivita globulo
rosso)
per controllare la compliance del paziente
MICROALBUMINURIA
Nel DIABETE TIPO I serve a prevenire il danno renale
Nel DIABETE TIPO II serve a prevenire il danno cardiovascolare
FRUTTOSAMMINA (ALBUMINA GLICOSILATA) per controllare landamento
della malattia nelle ultime 3 settimane (emivita albumina)
In Sardegna (alta incidenza di talassemici politrasfusi) si pu utilizzare al
posto dellHb glicosilata

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BAS

30

60

90

120

106

187

212

216

176

102

168

185

180

130

87

182

200

208

163

114

206

267

288

244

56

90

130

138

128

90

228

258

210

131

113

166

213

276

274

110

132

168

165

147

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BAS

30

60

90

120

IGT

106

187

212

216

176

102

168

185

180

130

IGT

87

182

200

208

163

DM

114

206

267

288

244

56

90

130

138

128

90

228

258

210

131

DM

113

166

213

276

274

IGT

110

132

168

165

147

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ESAME DELLE URINE


CAMPIONE
Prime urine del mattino

il pz. urina la notte prima di andare a


dormire e butta queste urine

immediatamente dopo il risveglio


raccoglie il campione, eliminando il
primo mitto
queste
urine,
essendo
state
trattenute in vescica per circa 8 ore,
sono le pi concentrate ed anche le
pi acide, pertanto gli elementi
corpuscolati sono pi stabili
Urine 24 ore

il pz. urina appena sveglio e butta


queste urine

Raccoglie dalle urine successive e per


tutta la giornata fino alla prima urina
del mattino successivo conservando
il contenitore in frigorifero

Annotare volume

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ESAME DELLE URINE

NORME GENERALI
Paziente
Accurata igiene genitali esterni
Contenitori
puliti, asciutti, sterili
con etichette sul contenitore e non
sul coperchio
eventuale aggiunta di conservanti
(urine 24 ore)

Campioni
refrigerazione fino allesecuzione
dellanalisi

ERRATA CONSERVAZIONE

CRESCITA BATTERICA
Alcalinizzazione del pH in seguito alla
degradazione dellurea da parte dei batteri
con formazione di ammoniaca
Aumento dei nitriti per riduzione batterica
dei nitrati
Aumento di torbidit con precipitazione di
materiale amorfo
Lisi di cellule e cilindri in ambiente alcalino

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume
Peso specifico
Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina
Urobilinogeno
Pigmenti biliari
Esame microscopico

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico

Colore

Trasparenza
Volume
Peso specifico

Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina
Pigmenti biliari
Nitriti

GIALLO PAGLIERINO

urina normale

MARRONE

bilirubina farmaci

ROSSO LIMPIDO

emoglobina farmaci

ROSSO TORBIDO

sangue

INCOLORE

glomerulonefr. cr
diabete

Esame microscopico

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico
Colore

Trasparenza

Volume
Peso specifico

Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina
Pigmenti biliari
Nitriti

LIMPIDE
proteine
TORBIDE

cellule
batteri

cristalli
LATTESCENTI

Esame microscopico

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piuria
cellule vaginali

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico
Colore
Trasparenza

Volume

<500
oliguria

Peso specifico

Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina
Pigmenti biliari
Nitriti

Nelle 24 ore 1200-1500 ml


>2000
poliuria

Esame microscopico

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume

Peso specifico

Quantificano la concentrazioe di soluti nelle urine

PESO SPECIFICO

(rapporto)

1.010 -1.030

Osmolarit

mosmoli/Kg H2O

Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina
Pigmenti biliari
Nitriti

rapporto fra la massa di una


soluzione e una massa di un
ugual volume di acqua pura

OSMOLARITA

numero di particelle sciolte in


soluzione
850-1400 mosmoli/Kg H2O

Losmolarit corrisponde bene al PS in stati non


patologici
Nelle nefropatie la correlazione meno affidabile
perch le sostanze ad alto PM (es proteine)
contribuiscono pi al valore del Peso Specifico che
dellosmolarit

Esame microscopico

BIOCHIMICA CLINICA

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume
Peso specifico
Osmolarit
Esame chimico

pH

Glucosio
Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina
Pigmenti biliari
Nitriti

v.r. 5- 8
(ricca di carne

alimentazione
(in genere 5-6)

vegetariana)

Come sottoprodotti del metabolismo vengono prodotti


diversi acidi (cloridrico,solforico, fosforico, lattico,
carbonico)
Vengono escreti dal rene insieme a cationi (Na)
Le cellule tubulari riassorbono il Na e lo scambiano con lH
per cui lurina diventa acida

Esame microscopico

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume
Peso specifico
Osmolarit
Esame chimico
pH

Glucosio

glicemia >180 mg/dl


GLICOSURIA
glicemia normale

v.n. assente
< 15 mg/dl

Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina
Pigmenti biliari
Nitriti

diminuzione soglia
renale
tubulopatie (mancato
riassorbimento glu)

falsi positivi

candeggianti, perossidi (microbi)

falsi negativi

sost riducenti (ac. ascorbico) tempi


prolungati (consumo di glucosio ad
opera degli el. cellulari)

Esame microscopico

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume
Peso specifico
Osmolarit
Esame chimico
pH
Glucosio

Corpi chetonici

v.n. assenti
Proteine
Emoglobina
Pigmenti biliari
Nitriti

Esame microscopico

Metabolismo lipidi incompleto


Chetonemia
Chetonuria acetone

- ac. acetacetico - ac. idrossibutirrico

DIABETE MELLITO NON COMPENSATO


DIETE (ipocaloriche, ipoglucidiche)
STATI TOSSICI
FEBBRE (bambini)
VOMITO (bambini)

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE

PROTEINURIA
Funzionale (lieve)

Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume
Peso specifico
Osmolarit
Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici

Proteine

vn: tracce <10 mg/dl

Emoglobina
Pigmenti biliari
Nitriti

Esame microscopico

Dopo intenso esercizio fisico

Disidratazione
Febbre
ORTOSTATISMO

1 test : al mattino NEG


2 test dopo 2 ore camm POS)

Da rigurgito
Proteine aumentate a livello ematico (Hb, Miogl, Ig) vengono
filtrate dai glomeruli e passano nelle urine

Glomerulare
Selettiva : si perdono proteine a basso PM (ALB, TRANSF)
Non selettiva : si perdono tutte le frazioni proteiche
Monoclonale : con lelettroforesi si evidenzia una banda stretta
fra e (proteina di Bence Jones- cat. leggere Ig- mieloma)

Tubulare
Si perdono proteine a basso PM (alfa1 e beta2 microglobuline)

MICROALBUMINURIA :albumina a concentrazioni


comprese fra 2 e 20 mg/dl monitoraggio diabete

BIOCHIMICA CLINICA

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE

EMATURIA = EMAZIE INTEGRE NELLE URINE

Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume
Peso specifico
Osmolarit

Cause

Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici
Proteine

Emoglobina

vn:tracce

Pigmenti biliari
Nitriti

renali

pelvi/uret

vescicali

uretrali

extra renali

glomerulonefriti

calcolosi

neoplasie

uretriti

affezioni
prost

TBC

neoplasie

calcolosi

calc.incun

K colon
retto

neoplasie

stenosi

cistiti

calcolosi

pieliti

TBC

infezioni acute
traumi

Esame microscopico

BIOCHIMICA CLINICA

emopatie

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE Emoglobina
Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume
Peso specifico
Osmolarit
Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina

Pigmenti biliari

Nitriti

Esame microscopico

Bilirubina B.INDIRETTA
+ Albumina

Valori aumentati :
CALCOLOSI BILIARE
K TESTA PANCREAS
EPATITI
IPERBILIRUBINEMIA CONGENITA

SRE

FEGATO
Distacco dallalbumina
CONIUGAZ con AC.GLUCURONICO B.DIRETTA

95%
Circolo
enteroepatico

INT. TENUE

Urobilinogeno
DIABETE MELLITO NON CO

5%
vn:<1 mg/dl
SANGUE
URINE

BIOCHIMICA CLINICA

BILE

URINE
Tracce

DIETE (ipocaloriche, ipoglu


STATI TOSSICI
FEBBRE (bambini)
VOMITO (bambini)

FECI
80%

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ESAME DELLE URINE


LESAME COMPRENDE
Esame fisico
Colore
Trasparenza
Volume
Peso specifico
Osmolarit
Esame chimico
pH
Glucosio
Corpi chetonici
Proteine
Emoglobina
Pigmenti biliari

Nitriti

MEZZO INDIRETTO PER EVIDENZIARE


INFEZIONI URINARIE
Normalmente nelle urine sono presenti nitrati
di provenienza alimentare.
Alcuni batteri gram-negativi in possesso di
reduttasi specifiche, riducono i nitrati a nitriti
se:
lurina rimane in vescica per almeno 4 ore
nella dieta sono presenti quantit adeguate
di nitrati

Esame microscopico

BIOCHIMICA CLINICA

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ESAME DELLE URINE : esame microscopico


Campione di urine:

biopsia tissutale liquida delle vie urinarie


ottenuta in maniera indolore
(Mahon 1990, Manfredini 1995)

TEST :
Prima minzione del mattino
Esame entro le 2 ore (altrimenti refrigerazione)
Letto al microscopio con in mano il referto delles.
chimico
Centrifugazione per 5 (circa 12 ml)
Vetrini con camere a volume determinato
esame di 20 campi micr (40X) : n medio
RARI IN MODICO N NUMEROSI TAPPETO

(+)

(++)

(+++)

(++++)

senza colorazione/contrasto fase:


cilindri, cristalli, muco
con colorazione sopravitale : el. cellulari
luce polarizzata : cristalli

BIOCHIMICA CLINICA

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ESAME DELLE URINE : esame microscopico


ELEMENTI FIGURATI
globuli rossi
globuli bianchi
in ammassi : proc. infiamm. acuto

cellule epiteliali :

basse vie urinarie (larghe, a forma di foglia)


alte vie urinarie (piccole, nucleo centrale)

cilindri
ialini (pi frequenti)
epiteliali
granulosi
ematici

microorganismi

1
2

flora batterica
parassiti

Muco
spermatozoi

BIOCHIMICA CLINICA

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ESAME DELLE URINE : esame microscopico


ELEMENTI FIGURATI
globuli rossi
globuli bianchi
in ammassi : proc. infiamm. acuto

cellule epiteliali:
basse vie urinarie (larghe, a forma di foglia)
alte vie urinarie (piccole, nucleo centrale)

cilindri
ialini (pi frequenti)
epiteliali
granulosi

ematici

microorganismi
flora batterica

parassiti

Muco
spermatozoi

BIOCHIMICA CLINICA

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ESAME DELLE URINE : esame microscopico


ELEMENTI FIGURATI
globuli rossi
globuli bianchi
in ammassi : proc. infiamm. acuto

cellule epiteliali :
basse vie urinarie (larghe, a forma di foglia)
alte vie urinarie (piccole, nucleo centrale)

cilindri
ialini (pi frequenti)
epiteliali
granulosi
ematici

microorganismi
flora batterica
parassiti

muco

BIOCHIMICA CLINICA

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ESAME DELLE URINE : esame microscopico

ELEMENTI NON FIGURATI


Sali
amorfi

URINE ACIDE : urati (precipitato bianco)


URINE ALCALINE : fosfati (precipitato rosa)
carbonati
cristallini
URINE ACIDE : acido urico
URINE ALCALINE : fosfati
ossalati

Calcoli
sali di calcio
Fosfati tripli

acido urico
cistina

Fosfati amorfi

fosfato ammonio magnesiaco

ossalati

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LIQUIDO CEFALORACHIDIANO
Si definisce LIQUOR il liquido che riempie tutti gli spazi lasciati liberi
dallencefalo e dal midollo spinale allinterno della dura madre.
VOLUME : adulto 160 ml, neonato 40 60 ml
ASPETTO : incolore e limpido ad acqua di rocca, sterile
PRELIEVO (puntura lombare) :
Spazio intervertebrale fra la IV e la V vertebra lombare
(RARO) spazio fra latlante e losso occipitale

Posizione del paziente :


Seduto con il busto flesso in avanti (pressione liquorale pi alta)
Decubito laterale con testa flessa sul torace ed arti inferiori flessi
sulladdome

BIOCHIMICA CLINICA

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LIQUIDO CEFALORACHIDIANO
CONTAMINAZIONI
(FREQUENTE)
sangue
derivante
da
lesioni
di
vasi
sanguigni
nellattraversamento di cute, sottocute, fascia muscolare e dura madre
->Far defluire il liquido in diverse provette graduate ed opportunamente
numerate. In questo modo :
Si pu capire se il sangue deriva da lesioni accidentali duante il
prelievo o da emorragia subaracnoidea
Si pu distribuire il campione in pi contenitori da mandare ognuno ad
un settore del laboratorio
ANALISI : entro un ora, conservazione campione a t ambiente
INDAGINI BIOCHIMICHE PIU COMUNI :
Glucosio :(glicorrachia) Si valuta lipoglicorrachia : meningiti, ipoglicemie
Proteine :(protidorrachia) (proteine totali, albumina, Ig)
INDAGINI NON BIOCHIMICHE
Aspetto macroscopico
Conta cellulare e differenziale
Identificazione microrganismi

BIOCHIMICA CLINICA

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INDICI di FLOGOSI
La FLOGOSI (infiammazione) una fisiologica reazione di
difesa dellorganismo nei confronti di alcuni agenti lesivi:
Traumatici
Microbici
termici
Immunitari
tumorali
che serve a ripristinare lintegrit anatomica e funzionale della
parte colpita
Per restare fisiologica la reazione deve essere proporzionata
allevento lesivo :
se linfiammazione insufficiente lagente nocivo provoca un
danno tissutale
se linfiammazione eccessiva per intensit e durata provoca
una
MALATTIA INFIAMMATORIA

BIOCHIMICA CLINICA

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INDICI di FLOGOSI
Levoluzione del processo infiammatorio pu essere
sintetizzata in alcune fasi :

vasodilatazione del microcircolo

con aumento permeabilit vascolare

essudazione di liquidi e proteine plasmatiche

migrazione leucocitaria nel sito dellinfiammazione

restitutio ad integrum

oppure cronicizzazione dello stato flogistico


In genere la reazione infiammatoria si limita ad espressioni
locali, ma talvolta pu provocare ripercussioni sistemiche
che vengono indicate come
FASE ACUTA
Durante tale fase si ha aumento della produzione di un
gruppo di proteine definite PROTEINE DELLA FASE ACUTA
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PRINCIPALI INDICI di FLOGOSI


ESAME EMOCROMOCITOMETRICO

leucocitosi
piastrinosi
anemia

VELOCITA DI ERITROSEDIMENTAZIONE (VES)

PROTEINE FASE ACUTA


ipercupremia
ipozinchemia
iposideremia

OLIGOELEMENTI

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Velocit di eritrosedimentazione VES


ESR (erythrocyte sedimentation rate)
Il test determina la velocit a cui gli eritrociti sedimentano
quando il sangue, reso incoagulabile, viene posto in una pipetta
di piccolo calibro in posizione verticale

Fenomeno riconducibile allinterazione di forze fisiche diverse:


Tendenza dei GR ad aggregarsi (rouleaux = ammassi di GR
legati non da legami anticorpali o covalenti ma
semplicemente dallattrazione superficiale) e quindi a
sedimentare
NB : la capacit di aggregazione dei GR influenzata dalla
presenza di elevate concentrazioni di macromolecole
(globuline, fibrinogeno) che riducono le forze repulsive che
tengono lontani i GR per cui aumenta la loro tendenza ad
aggregarsi
Capacit del plasma di mantenere in sospensione i GR
stessi (la viscosit del plasma) :

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Velocit di eritrosedimentazione VES


ESR (erythrocyte sedimentation rate)

IN CONDIZIONI NORMALI la risultante fra forze di coesione e


repulsione rende scarsa laggregazione delle emazie

IN CONDIZIONI PATOLOGICHE le alterazioni a livello


plasmatico (aumento di fibrinogeno e delle altre proteine
asimmetriche come Ig CER HPT) determinano un attenuarsi
delle cariche negative delle emazie che tendono cos ad
aggregarsi

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ves
u d m : mm/h

v.r. < 15 mm alla prima ora

Tecnica di Westergreen :
Pipetta graduata lunga 200 mm
Sangue reso incoagulabile per diluizione con citrato di sodio

Si misura la distanza fra il livello iniziale del sangue e la parte


superiore della colonna di eritrociti sedimentati dopo 1 ora.

ALTERAZIONI DELLA VES


Problemi tecnici :
Alterato rapporto volumetrico fra sangue ed anticoagulante
Miscelazione imperfetta
Esecuzione oltre le 4 ore dal prelievo
Influenze :
AUMENTI : anemie-iperlipemie gravi
gravidanza contraccettivi orali
DIMINUZIONI : farmaci - poliglobulie
crioglobulinemia
anomalie eritrocitarie
Test non specifico
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BIOCHIMICA CLINICA

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VES
NUOVA TECNICA

Una ridottissima quantit di sangue (150 ml) trattato con EDTA


viene aspirato in un tubo lungo 300 mm ad alta velocit di modo
che i globuli rossi si dispongano in maniera ordinata
Il flusso viene bruscamente fermato di modo che i globuli rossi si
ridispongano in maniera casuale e si inizino a formare i rouleaux
Il campione viene letto in un fotometro capillare che valuta la
differenza di assorbanza nei diversi momenti
a) allinizio (DO intermedia)
b) durante la brusca accellerazione (DO in aumento)
c) allo stop (DO in diminuzione perch passa pi luce fra gli
spazi vuoti creati dalla formazione dei rolueaux)
Viene costruita una curva cinetica che proporzionale alla curva
di sedimentazione a 1 ora di Westergreen
Tutto il procedimento viene effettuato in 20 secondi
(circa 1000 letture)

BIOCHIMICA CLINICA

Universit degli Studi di Cagliari Facolt di Medicina e Chirurgia

VES
NUOVA TECNICA
Vengono superati i problemi che
si avevano con la tecnica di
Westergreen in quanto la
misurazione:
a)Non influenzata dalla t
Il fotometro termostatato
b) Non dipende dalla forza di gravit
non influenzata dall Hct
quindi dal n di globuli rossi
La misurazione dipende solo
dalleffetto delle proteine di fase
acuta che facilitano la formazione
dei rouleaux.

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AUMENTI DELLA VES


(in azzurro solo per la tecnica di Westergreen)

Problemi tecnici :
Alterato rapporto volumetrico fra sangue ed anticoagulante
Miscelazione imperfetta
Esecuzione oltre le 4 ore dal prelievo
Influenze :
FATTORI PLASMATICI : fibrinogeno, gamma globuline,
colesterolo
FATTORI ERITROCITARI : numero, dimensioni
rapporto superficie/volume (i microciti sedimentano pi
lentamente)
alteraz. Morfologiche (le cell. falciformi non sono in grado di
formare rouleaux)
CONDIZIONI
Iperglobulinemia
Iperfibrinogenemia
Anemia (Hct 30-40%)
Macrocitosi
Gravidanza
Et > 50 aa
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SCOPI MISURAZIONE VES


1.

Segnalare la presenza di processi infiammatori

2.

Controllare il decorso o lo stato di attivit di una malattia

3.

Individuare patologie infiammatorie o neoplastiche occulte

TEST SCARSAMENTE SENSIBILE e SCARSAMENTE SPECIFICO

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PROTEINE FASE ACUTA


In corso di infiammazione , grazie allintervento di alcune citochine (IL6
TNF) il fegato (in larga parte) produce una serie di proteine dette
proteine della fase acuta.
Il fegato, mentre aumenta la produzione delle proteine della fase acuta,
riduce la produzione di altre proteine, la pi nota delle quali lalbumina.
PROTEINE DELLA COAGULAZIONE

Fibrinogeno Protrombina - Fattore VIII- Plasminogeno


INIBITORI DELLE PROTEASI

1 antitripsina - 1 antichimotripsina
PROTEINE DI TRASPORTO

Aptoglobina- Emopessina -Ceruloplasmina


PROTEINE DEL COMPLEMENTO
ALFA 1 GLICOPROTEINA ACIDA

PROTEINA C REATTIVA
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PROTEINE

MOBILITA
ELETTROFORETICA

VALORI RIFERIMENTO
(mg/dl)

PCR

< 0.8

1antitripsina
AAT

88 - 174

2 volte

1glicoproteina acida
AAG

51 - 117

4 volte

Aptoglobina
HPT

36 - 195

3 volte

Ceruloplasmina
CER

22 - 58

1/2 volta

Fraz C3 del complento


C3

79 - 152

1/2 volta

Fibrinogeno
FIB

200 - 450

3 volte

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INCREMENTO RISPETTO
ALLA NORMA
1000 volte

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PCR v.r. < 0.8 mg/dl

Proteina formata da 5 subunit identiche legate con legami non covalenti


Reagisce in vitro con il polisaccaride C dello Pneumococco
Reagisce con i gruppi fosforilcolinici di molte strutture ed in grado di
fissarsi a diversi substrati a livello delle lesioni tissutali con attivazione del
sistema del complemento e dei conseguenti effetti flogistici
Il suo aumento nel siero indice attendibile e precoce di un processo
flogistico o necrotico in atto qualunque sia la causa
E un test sensibile ma non specifico
La sintesi inizia gi nelle prime ore seguenti linstaurarsi del processo
flogistico
La produzione resta elevata fino a che persiste la reazione
infiammatoria, poi si riduce precocemente e si normalizza prima del
ritorno alla normalit della VES
La precocit della sua comparsa e la brevissima emivita (1 gg) rendono
le variazioni nella sua concentrazione molto pi aderenti alla realt di
altri indici di flogosi.

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FIBRINOGENO v.r. 200-450 mg/dl

I livelli di fibrinogeno aumentano in corso di flogosi


Gli aumenti sono pi tardivi e non correlano tanto con il
livello di infiammazione quanto con lentit della lesione
tissutale

La concentrazione di fibrinogeno influenza la VES in quanto


i GR ricoperti di fibrinogeno sedimentano pi velocemente

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ELETTROFORESI SIEROPROTEINE

Pu fornire molte informazioni sullo stato del paziente.

1.
2.
3.

IN CASO DI FLOGOSI si riscontra


una diminuzione dellalbumina
un aumento delle alfa 1 e alfa 2 globuline
un aumento a base larga del picco delle gamma globuline
(in presenza di disordini immunologici, es AR)

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