Lezione del 25/09/20

CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI

La più recente classificazione → proposta da Carl Woese riconosce tre regni: Bacteria, Archea ed Eukarya
(comprendente tutti gli eucarioti sia unicellulari che multicellulari che hanno una compartimentalizzazione
cellulare). I procarioti si distinguono in tre gruppi principali: archeobatteri ed eubatteri.
Gli Archea sono molto meno rappresentati rispetto a quella degli eubatteri → sono microrganismi che si sono
specializzati per colonizzare nicchie strane (ad esempio i metanogeni, che si sono specializzati nella produzione
di metano; termoacidofili che sono in grado di vivere in condizioni idi pH estremamente basse; alofili estremi
che sono in grado di vivere in ambienti con concentrazioni saline elevate).

La “vita microbica” sulla Terra ha dominato per più di 3-5 miliardi di anni.
Ancora oggi, i microrganismi sono i più numerosi tra tutti i gruppi di viventi, sono ubiquitari, e colonizzano tutti
gli ambienti, compresi quelli più estremi (dalle profondità oceaniche ai ghiacciai artici…), che ricordano la Terra ai
primordi della sua formazione.
Si ritiene contengano il 50% d C ed il 90% di N biologico presente sulla Terra  sono intuitivamente alla base della
catena alimentare ed essenziali per il riciclo degli elementi.
I microrganismi fotosintetici competono con le piante per organicare CO2 e produrre O2. I patogeni sono una
minoranza. Sono per lo più innocui o benefici (Vitamine K e B).

Microbiota → insieme dei microorganismi che popolano una determinata nicchia ecologica
Microbioma → è riferito al genoma, al DNA, della comunità microbica che risiede in un determinato ambiente

I batteri si sono adatti a qualsiasi ambiente durante la loro evoluzione sulla terra ed attualmente isolati da:
• Sorgenti termali (Yellowstone Park)
• Ghiacciaio marino (Antartide) → ad esempio i psicrofiri riescono a vivere a temperature basse
• Saline (Thailandia)
• Area desertica rocciosa dell’Antartide (sono presenti solamente come licheni)

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 LA CELLULA
Le differenze principali sono:

• Nucleo con un nucleolo (nella cellula eucariotica) → nei procarioti abbiamo il nucleoide
• Gli organuli negli eucarioti separano le funzioni della cellula
• La cellula eucariotica è avvolta da una parete cellulare che ritroviamo in alcuni procarioti, come i funghi, che
si perde nelle cellule procariotiche superiori

Batteri ed archea in media hanno una dimensione di 1 micron → 10−6

I microrganismi eucariotici, ad esempio un lievito, hanno una dimensione più grande → circa 10-20 micron (μm).
La membrana nucleare è assente negli archea e negli eubatteri, mentre è presente negli eucarioti in cui abbiamo
la presenza di un nucleo propriamente detto.
Archea e Batteri sono in grado di fissare l’azoto elementare, mentre invece gli organismi eucarioti non sono in
grado di farlo.
La crescita a temperature maggiori di 100° è possibile nel caso solo degli archea che si sono evoluti per colonizzare
ambienti estremi.

Come possono presentarsi i batteri nello spazio?

Solitamente i batteri Gram positivi si distinguono in base alla loro morfologia in:
• Cocchi → hanno la caratteristica di essere cellule sferiche che possono disporsi nello spazio con diverse
modalità. Generalmente sono immobili, cioè privi di quelle strutture superficiali (come i flagelli) che
garantiscono la motilità
o La divisione secondo un solo asse porta ad i diplococchi (cellule disposte in coppie che si si separano
dopo la divisione cellulare) e agli streptococchi (cellule disposte in catene in quanto tendono a
rimanere unite dopo la divisione cellulare)
o La divisione secondo due assi perpendicolari può generare le tetradi (4 cellule che rimangono disposte
su un unico piano) ed i fogli monostratificati (cioè cellule disposte su un piano a formare “fogli”
monostratificati)
o La divisione secondo tre assi perpendicolari porta alla formazione delle sarcine (dei cubi di 8 cellule)
→ se i piani di divisione sono regolari e orientati, altrimenti se i piani di divisione sono irregolari si
originano degli ammassi che prendono il nome di stafilococchi (grappoli). Le sarcine non sono
dannose per l’uomo.

• Bastoncelli o bacilli → cellule cilindriche a forma di “bastoncello” che possono essere sia immobili che mobili
(quando sono mobili hanno dei flagelli). I caratteri morfologici assunti come criteri tassonomici sono: sono
caratteristiche tintoriali, dimensioni, lunghezza, spessore, presenza e disposizione della spora nello sporangio,
e la motilità-flagello mediata.

Le cellule si dispongono nello spazio con una modalità che dipende dai piani della loro divisione → la divisione
cellulare e la disposizione sono criterio fenotipici tassonomici. La divisione dei batteri avviene per scissione binaria
→ da una cellula madre si ottengono due cellule figlie, che sono geneticamente uguali alla madre, quindi si ha
una modalità di riproduzione clonale (sia per i cocchi che per i bastoncelli). I batteri non prostecati → sono batteri
che non hanno peduncoli.

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 TASSONOMIA BATTERICCA “CONVENZIONALE”

L’unità tassonomica fondamentale è la specie, una categoria, sistematica naturalmente delimitata in base a:
• Interfecondità parentale
• Fertilità della progenie

La propagazione dei batteri è CLONALE, per cui la definizione di specie batterica è arbitraria, ma ragionevole:
“Una specie batterica è definita come un insieme di CEPPI (i singoli isolati) che condividono un
determinato fenotipo (determinato dal loro genotipo), che si mantiene stabile ed è diverso da quello che
caratterizza altri insiemi di ceppi.”

La validità di questa definizione si basa sul concetto di GENOMA EQUILIBRATO, che favorisce il mantenimento di
specie stabili e ben adattate a determinati ambienti, tramite:

• Selezione stabilizzante (negativa) che elimina deviazioni eccessive dovute a mutazioni

• Selezione divergente (positiva) che può costituire la base di ulteriore speciazione → si verifica quando
una specie si trova in un ambiente che non gli è più ottimale perché magari c’è carenza di nutrienti la
pressione selettiva fa in modo che la specie si adatti attraverso mutazioni, attraverso l’acquisizione di
materiale genetico dall’esterno → può condurre alla morte dell’individuo e quindi alla selezione
stabilizzante o alternativamente all’acquisizione di quel carattere

La definizione di specie batterica è, oggi, integrata con criteri genomici e genotipici GENOSPECIE.

SCELTA DEI CRITERI FENOTIPICI

Scelta di quei caratteri fenotipici che sono altamente conservativi e che possono permettere di stabilire SE un
DETERMINATO MICRORGANISMO (un isolato clinico od ambientale) APPARTIENE ad una specie già descritta o ad
una NON ancora descritta (specie di nuova identificazione?).

IDENTIFICAZIONE DI SPECIE: basata su criteri discriminativi STABILI, evidenziabili tramite saggi che siano
ALTAMENTE RIPRODUCIBILI, di FACILE ESECUZIONE ed UNIVOCA INTERPRESTAZIONE
➢ Morfologia cellulare, compresa la presenza di spore
➢ Caratteristiche tintoriali
➢ Motilità
➢ Forma della colonia
➢ Tipo di metabolismo
➢ Suscettibilità ad antibatterici
➢ Habitat
➢ Sequenze geno-specifiche*

IDENTIFICAZIONE DI TIPO: individuazione di cluster nell’ambito della specie (differenze intra-specifiche),

tramite:
➢ sierotipizzazione (sierotipo)
➢ biotipizzazione (biotipo)
➢ tipo della colonia (morfotipo)
➢ genotipizzazione sequenze geno-tipiche**

* e **: utilizzate nella diagnostica molecolare e per tracciare linee di discendenza evolutiva

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La morfologia normalmente è mantenuta e propagata, ma sono noti casi di differenziamento morfologico in
risposta al variare delle condizioni ambientali.

• vibrione → agente eziologico del colera, che è dovuto dalla secrezione di una tossina colerica che comporta
una diarrea talmente profusa (10 l al giorno) che può portare il paziente alla morte, non tanto per
l’infezione, ma per lo shock ipovolemico
 Lo shock ipovolemico è lo stato di shock causato dalla diminuzione acuta della massa sanguigna
circolante, causata da emorragia o da perdita di liquidi (ipovolemia).

• spirochete → ha una forma a cavaturacciolo (una spirocheta è il treponema pallidum → l’agente

eziologico della sifilide, una tra le più comuni malattie sessualmente trasmissibili)

• spirillo

• Clostridium → tossina tetanica e botulinica

• C. perifringens → agente eziologico della gangrena gassosa
 La gangrena gassosa è una sindrome infettiva acuta a rapida diffusione, spesso mortale, in cui
dei batteri producono gas e tossine.
• Neisseria meningitidis → sono diplococchi Gram – (ci sono polimorfonucleati)
• Staphylococcus aureus → cocchi gram + (cristal violetto)
• Streptococcus spp. → forma a catenella (spp. sta ad indicare che non si sa qual è la specie)
• Streptococcus pneumoniae → diplococchi Gram +
• Escherichia coli → coccobacillo gram – (si replica ogni 20 minuti)

Perché Mycobacterium tuberculosis (→ agente eziologico della tubercolosi) non può essere colorato con la
colorazione di Gram? Perché questo microrganismo ha una struttura della parete che è quasi del tutto impossibile
da penetrare. Questo microrganismo si replica ogni 24 h. La difficoltà nell’assumere sostanze esogene, nutrienti
e quindi antibiotici rende il trattamento molto complesso, infatti un trattamento antibiotico per un’infezione
normale è di 7 giorni (è pericoloso interrompere un trattamento antibiotico prima del tempo perché la pressione
selettiva dell’antibiotico potrebbe agire selezionando un ceppo resistente), mentre invece il tempo necessario per
fare un trattamento antibiotico per la tubercolosi è di circa 6 mesi con un pool di almeno 4 antibiotici diversi, con
una serie di piccoli effetti collaterali (fegato e organi deputati alla detossificazione del corpo)
Mycobacterium leprae → è l’agente eziologico della lebbra.

Preparazioni “a fresco” per mettere in evidenza strutture molto rifrangenti: LE SPORE BATTERICHE.

CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI

I batteri sono microrganismi unicellulari, procarioti, di dimensioni di solito nell’ordine di pochi micrometri, ma
possono variare
dai 0.2 μm circa dei micoplasmi (sono microrganismi privi di parete), fino a 30 micron di alcune spirochete.

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Lezione del 29/09/20

Per procedere all’identificazione di un microrganismo è indispensabile avere una coltura pura

1. Crescita in terreno liquido: partendo da una popolazione batterica mista non possono essere isolare le singole
specie presenti, se non procedendo alla loro semina su terreno solido.
2. Crescita su terreno solido: cellule depositate sulla superficie di un terreno solido nutriente iniziano a dividersi
e dopo che migliaia (fino a bilioni) di cellule si sono formate (24 h), si osservano masse cellulari ad occhio
nudo: LE COLONIE. Queste risulteranno ben separate dove le cellule, depositate sul terreno, erano altrettanto
ben separate. Le cellule della colonia derivano tutte da quella originariamente depositata sul terreno, quindi
UNA COLONIA È UNA COLTURA PURA.

La morfologia della colonia può fornire informazioni utili che aiutano nell’identificazione del microrganismo isolato.
Quali:

1. Forma e dimensioni: tonda, irregolare, puntiforme...;

2. Margini: netti, ondulati, lobati, frastagliati...
3. Colore: pigmentata, più o meno opaca, traslucida, ...
4. Elevazione: convessa, umbonata, piatta, sopraelevata...
5. Struttura: rugosa, secca, mucosa

Proteus mirabilis → è l’agente eziologico di infezioni urinarie che tendono a risalire verso il rene. La colonia
dopo essere stata inoculata al centro della piastra, essendo un microrganismo mobile (grazie alla presenza dei
flagelli), si allontana dal centro dove è stato depositato l’inoculo per cercare i nutrienti. Quindi, si diche che con
la motilità swarming sciama sulla piastra dando vita a questi fronti.
Klebsiella pneumoniae → veicola un’informazione genetica particolare che porta ad esprimere un fenotipo
resiste ai farmaci. Le colonie hanno un aspetto quasi mucoide, traslucido, lisce (→ queste sono le caratteristiche
che contraddistinguono i batteri dotatati di capsula).
Bacillus subtilis → hanno un aspetto umbonato (tendono a rilassarsi nella porzione centrale e ad essere
sopraelevate ai margini).

Alcune delle caratteristiche possono essere così particolari da suggerire una “identificazione presuntiva”.

Corynebacterium diphtheriae → è l’agente eziologico della difterite. Con la colorazione semplice del Blu di
metilene mostra i bacilli colarti di blu, ma mostra anche la presenza di granuli all’interno del citoplasma che
prendono il nome di granuli metacromatici, perché assumono il Blu di metilene e restituiscono una colorazione
rossastra. Una semplice colorazione che non consente di distinguere i batteri Gram +/- permette però di mettere
in evidenza delle caratteristiche distintive, come i granuli metacromatici.

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 LA PARETE BATTERICA

Le pareti dei batteri GRAM POSITIVI e dei GRAM NEGATIVI hanno delle affinità tintoriali differenti.

La parete batterica, anche chiamata sacculo, si trova esternamente rispetto alla membrana citoplasmatica. Ci
sono dei batteri che ne sono privi, e sono chiamati Mollicutes → micoplasmi.
La parete ha come compito principale la protezione del batterio da insulti, che possono essere di natura fisica e/o
chimica. La parete protegge dalla lisi osmotica perché se poniamo la cellula batterica all’interno di una soluzione
ipotonica, quindi con uno squilibrio rispetto alla concentrazione che si trova all’interno del citoplasma, ed
aggiungiamo del lisozima (enzima che ha una blanda azione batterica perché è in grado di idrolizzare dei legami
importanti della parete), questo inizia a digerire la struttura della parete. Se la parete viene attaccata la cellula
va in contro ad uno squilibrio osmotico talmente elevato che la porta a morte con lisi cellulare.

Se facciamo lo stesso esperimento utilizzando una soluzione isotonica, cioè che ha la stessa concentrazione del
soluto cellulare, allora nel mezzo isotonico possiamo usare il lisozima ma in questo caso la digestione della parete
non porta alla morte, perché le cellule private della parete sono all’interno di una soluzione che ha la stessa
concentrazione esterno-interno  vengono liberati quelli che vengono chiamati proteoplasti.

Si chiamano PROTOPLASTI le cellule che si ottengono dai GRAM-POSITIVI dopo digestione della mureina con
lisozima.
Si chiamano SFEROPLASTI le cellule che si ottengono dai GRAM-NEGATIVI dopo idrolisi della mureina con
lisozima, che lascia la cellula rivestita dalla membrana esterna.

La parete, quindi, protegge dalla lisi osmotica quando l’ambiente extracellulare non è in equilibrio con il contenuto
cellulare.
Determina la forma del batterio → se priviamo il batterio della propria parete assume una forma sferica.

Alcuni componenti chimici sono unici ed è importante perché si lega al concetto di tossicità selettiva, quindi
numerosi agenti antibatterici (come il lisozima) sono rivolti contro la biosintesi della parete perché sono
caratteristiche peculiari dei batteri e non trovano corrispondenti nella cellula eucariotica superiore → danneggiano
la cellula batterica, ma non sono tossiche per le cellule eucariotiche superiori.

Peptidoglicano suggerisce la natura chimica di questa parete che è costituita da una componente di natura
glucidica e una componente di natura proteica. La porzione del peptidoglicano è estremamente rappresentata
nella parete di GRAM +, mentre è ridotta nella parte dei batteri GRAM – che al di fuori troveranno una ulteriore
membrana, la membrana esterna. Il peptidoglicano è inserito all’interno di uno spazio che, non è semplicemente
un cuscinetto di aria o di acqua, si chiama spazio periplasmatico è un’ambiente tutto fuorché inerte (ci sono
molte strutture coinvolte nel trasporto di soluti all’interno e all’esterno della cellula, nella sintesi della parete).

Il SACCULO conferisce rigidità e forma, protegge l’integrità cellulare contrastando la pressione osmotica interna.
È costituita prevalentemente da PEPTIDOGLICANO o MUREINA.

L’involucro dei batteri Gram + è costituito da uno spesso strato di peptidoglicano (90%), mentre quella dei Gram-
presenta una struttura pluristratificata e più complessa, che comprende un sottile strato di peptidoglicano.

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 PEPTIDOGLICANO

È uno strato rigido presente sia nei batteri Gram-positivi che Gram-negativi
L’unità base, quindi, è costituita da catene glicaniche (→ 2 zuccheri), legati mediante un legame glucosidico,
che si ripetono e formano delle lunghissime catene. Le catene sovrapposte sono invece legate dalla componente
peptidica → da ponti amminoacidici.

I due zuccheri del peptidoglicano che si alternano destrogiro e levogiro sono:

N-acetilglucosamina (NAG)
Acido N-acetilmuramico (NAM) → è presente solo nella parete batterica

Questi due zuccheri sono tenuti insieme da un legame  1,4 glicosidico (che è il legame che viene scisso dal
lisozima).

Attaccata all’acido N-acetilmuramico c’è una catena di 4 amminoacidi (legame carbo-aminico), in realtà gli
amminoacidi sono 5 ma nella composizione finale saranno solo 4.
o L-alanina
o Acido D-glutammico
o L-lisina (o acido diaminopimelico nei GRAM -)
o D-alanina è un dimero (necessita una conversione dalla L-alanina da parte di un enzima → RACEMASI) ed
uno dei monomeri successivamente, con la formazione dei legami crociati viene perso
Gli amminoacidi sono responsabili della formazione di legami crociati, o ponti interpeptidici, che creano una maglia
fitta nella parete dei batteri. Questi ponti interpeptidici legano le catene parallele di NAM e NAG.

Il NAM si differenzia dal NAG per la presenza di un residuo di acido D-lattico legato con legame etere al C3 del
glucosio, cui è legato un tetrapeptide formato da aminoacidi D e L alternati.

La composizione del tetrapeptide è variabile, ma quella più frequentemente osservata è:

1) L-alanina
2) Acido D- glutammico
3) Acido meso-diamino pimelico (DAP)
4) D-alanina

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Alcuni aminoacidi non sono utilizzati nella sintesi proteica ribosomale (D-aminoacidi e DAP) e sono quindi
esclusivamente sintetizzati per la costruzione della mureina. (RICORDARE LA FORMULA DI STRUTTURA DELLA
MUREINA)

Gli amminoacidi D, assenti nelle proteine e presenti invece nella parete (e capsula) batterica, conferiscono alcune
proprietà importanti, quali la resistenza alle proteasi.
Alcuni amminoacidi sono sintetizzati per essere inseriti all’interno della parete, questo fa sì che abbiano delle
caratteristiche particolari.

Le unità monomeriche glican-tetrapeptidiche sono unite da legami  1-4 glicosidici, formando catene lineari di
diversa lunghezza (Da poche decine fino a qualche centinaio di unità)
Bacillus: 50-250 unità disaccaridiche
S. aureus: 18 unità
[Link]: 20-40 unità

I filamenti di glicano adiacenti sono interconnessi da legami tra i tetrapeptidi. Nella maggior parte dei casi questi
legami si formano tra il gruppo carbossilico della D- alanina in posizione 4 di un tetrapeptide ed il gruppo aminico
di un DAP in posizione 3 di un tetrapeptide del filamento adiacente.
LEGAME CROCIATO 3-4 DIRETTO → comune tra i batteri GRAM NEGATIVI avviene tra il quarto amminoacido
di una delle due catene peptidiche (D-alanina) e il terzo amminoacido (DAP).

Nei batteri GRAM + in genere il legame tra le catene amminoacidiche, legate al NAM, non avviene direttamente,
ma INDIRETTAMENTE tramite l’interposizione di un ponte, chiamato PONTE INTERPEPTIDICO (perché sta
tra i peptidi): in S. aureus, ad esempio, il ponte è costituito da 5 molecole di glicina.

LEGAME CROCIATO 3-4 INDIRETTO → comune tra i

GRAM POSITIVI avviene sempre tra il quarto
amminoacido di una delle due catene peptidiche (D-alanina)
ed il terzo amminoacido (che in questo caso è la L-lisina). Il
legame non è diretto ma si forma grazie all’interposizione di
un ponte pentaglicinico, costituito da un ponte
interpeptidico di 5 glicine.
L’insieme dei legami glicosidici e dei legami crociati tra i
tetrapeptidi garantisce la caratteristica rigidità e resistenza
alla parete, unita a una certa flessibilità ed elasticità.

I residui di D-alanina sono legati ai gruppi aminici di una L-

lisina (o acido diaminopimelico) di un peptide adiacente
DIRETTAMENTE o INDIRETTAMENTE (interposizione di un
altro ponte peptidico; es. ponte di 5 glicine in S. aureus;
ponti di glicina, serina o treonina in altri batteri Gram-
positivi).

L’architettura della parete di mureina non è ancora stata

delucidata con certezza, secondo un recente modello i
filamenti di glicano sono associati a fibre che, avvolgendosi
ad elica, formano dei cavi di peptidoglicano che, a loro volta
avvolgono tutta la cellula.

Il modello temporale con cui la parete viene depositata non è chiarito ma secondo modelli recenti si avvolgono
ad elica e formano die cavi che a loro volta si arrotolano intorno alla struttura cellulare.

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 BIOSINTESI DEL PEPTIDOGLICANO

La biosintesi della mureina è un processo complesso che si svolge in tre diversi compartimenti:

Citoplasma: dove avviene la sintesi dei precursori

Si svolgono le quattro tappe che portano alla formazione dell’unità glican peptidica.
I precursori sono i due amminozuccheri NAM e NAG legati all’UDP a formare UDP-NAM e UDP-NAG e il
pentapeptide che verrà legato al residuo lattico del NAM

Gli aa L del pentapeptide derivano dalle normali vie metaboliche, compreso l’acido DAP, che è l’ultimo step della
biosintesi della L lisina.
Il peptide nasce come pentapeptide perché gli ultimi amminoacidi sono aggiunti come dimero di D-alanina.

Tappa finale: prevede l’assemblaggio del pentapeptide con formazione di UDP NAM pentapeptide L’UDP NAM
pentapeptide è il precursore del glican tetrapeptide, che vedremo essere l’elemento finale nella parete batterica
perché durante la reazione di transpeptidazione, quando si forma il legame crociato, l’ultima alanina del
pentapeptide viene persa → la quarta alanina è quella che gioca il ruolo cruciale nella formazione del legame
crociato con il terzo amminoacido dell’altra catena.
La transpeptidazione è una reazione che avviene all'interno della parete batterica grazie
all'enzima transpeptidasi.

Nel citoplasma la sintesi dell’UDP-NAG avviene a partire dal Fruttosio 6P e dall’UTP.

La sintesi dell’UDP-NAM è catalizzata dagli enzimi Mur A e Mur B, in presenza di fosfoenolpiruvato (PEP). Il
primo enzima che interviene in presenza del fosfoenolpiruvato è l’enzima MurA che trasforma l’UDP-NAG in un
primo intermedio → UDP-NAG enolpiruvato, che è a sua volta substrato dell’enzima MurB che porta alla
formazione dell’UDP-NAM.
Questo è l’altro elemento che ci serve per completare la porzione glucidica.

Gli enzimi responsabili della sintesi del pentapeptide sono noti come ligasi Mur (Mur C-F) hanno la funzione
di aggiungere all’UDP-NAM gli amminoacidi.

Una volta sintetizzati i precursori devono essere consegnati alla membrana citoplasmatica.

Membrana citoplasmatica: dove ha luogo la sintesi dell’unità monomerica del peptidoglicano legata ad un
trasportatore lipidico e suo ribaltamento sulla faccia esterna della membrana → è una sede molto importante.

L’attore principale che entra in gioco al livello della membrana plasmatica è un traporatatore lipidico → un
bactoprenolo. La traslocazione dei monomeri di mureina avviene ad opera di un trasportatore lipidico il
bactoprenolo (undecaprenil fosfato C-55P) → ha il compito di prendersi in carico questi monomeri per
traslocarli nell’altra faccia della membrana citoplasmatica, dove si comincerà ad assemblare la struttura della
parete cellulare.

Durante il trasferimento dell’UDP-NAM al bactoprenolo avviene la liberazione dell’DP  il NAM pentapeptide si

lega al bactoprenolo formando il lipide I.
Grazie alla presenza dell’UDP, si ha il legame del NAG al NAM formando il lipide II. Quindi, al lipide I si lega una
molecola di NAG a formare il lipide II (→ altro non è che il bactoprenolo munito di NAM e NAG →
undecaprenil- difosfo NAGNAM-pentapetide).

Il bactoprenolo è difosfato in questa fase.

In seguito alla formazione del lipide II il bactoprenolo, così strutturato, opera la traslocazione sulla faccia esterna
o periplasmatica, dove avviene la polimerizzazione tramite transglicosilasi (catalizzano i legami glicosidici,  1,4
tra NAM-NAG, del glicano nascente).

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A questo punto il bactoprenolo, che non è più utile all’esterno della membrana, subisce una defosforilazione, che
gli consente di ritornare sul versante interno come monofosfato, fosfato che riacquisirà successivamente quando
caricherà il NAM → e così via.

Struttura del bactoprenolo: un alcool a 55 atomi di carbonio fortemente idrofobo, coinvolto nel trasporto
dei precursori del peptidoglicano attraverso la membrana citoplasmatica.

Il bactoprenolo che ha donato il monomero di glicano viene defosforilato e ribaltato sulla faccia interna, dove
verrà utilizzato nuovamente. Infine, si forma il legame peptidico tra il pentapeptide del nuovo monomero ed il
tetrapeptide di una catena adiacente, catalizzato dalle transpeptidasi.

Transpeptidazione: il legame peptidico tra le due D-alanine

terminali del pentapeptide viene trasferito al gruppo aminico
libero della lisina o dell’acido diaminopimelico (3° aa del
tetrapeptide), creando un legame CROCIATO e rilasciando la D-
alanina terminale.

Quindi, da avere un pentapeptide otteniamo un

tetrapeptide.

Spazio esterno alla membrana: dove avvengono le reazioni di polimerizzazione e transpeptidazione (con
ad ultimo la formazione dei legami crociati)
Sulla faccia esterna o periplasmatica avviene la polimerizzazione tramite transglicosilasi (catalizzano i legami
glicosidici del glicano nascente).

Transpeptidazione: il legame peptidico tra le due D-alanine terminali del pentapeptide viene trasferito al
gruppo aminico libero della lisina o dell’acido diaminopimelico (3° aa del tetrapeptide), creando un legame
CROCIATO e rilasciando la D-alanina terminale.
o Sintesi dei monomeri di mureina
o Traslocazione dei monomeri di mureina
o Formazione di polimeri lineari di mureina (transglicosilazione)
o Transpeptidazione (formazione di legami crociati tra polimeri lineari)

Nei batteri Gram-positivi il peptidoglicano è molto spesso (50% del peso del microrganismo; circa 40 strati; 20-
80 nm). Nei batteri Gram-negativi è molto più sottile e possiede minori legami peptidici (15-20% della parete;
anche un singolo strato).
 questo spiega il motivo per cui il cristal violetto venga maggiormente
trattenuto nei batteri GRAM POSITIVI, rispetto ai GRAM NEGATIVI.

Il peptidoglicano costituisce una rete tridimensionale che avvolge la cellula come un sacco chiuso su tutti i lati.
Durante l’accrescimento della cellula anche la parete deve aumentare e ciò può avvenire solo rompendo dei
legami esistenti ed inserendo nuovi filamenti. La rottura dei legami avviene grazie ad enzimi idrolitici, le
autolisine:

▪ muramidasi e transglicosidasi litiche tagliano il legame  1,4;

▪ amidasi tagliano legame tra NAM e L-alanima
▪ endopeptidasi tagliano il legame peptidici
▪ carbossipeptidasi rimuovono l’ultimo aa (D-alanina)

Questi enzimi sono anche coinvolti nella separazione tra cellula madre e figlia, e nel creare spazi per l’inserimento,
ad esempio, dei flagelli.

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Biogenesi della mureina, coordinamento temporale ancora poco noto. I modelli di accrescimento fino ad ora
proposti concordano nell’ipotizzare che l’inserzione di neo-peptidoglicano avvenga a livello di siti specifici e che la
lisi dei filamenti vecchi sia coordinata con l’inserimento dei nuovi.

12
Lezione del 2/10/20
SINTESI DELLA MUREINA

Si verifica in TRE fasi sequenziali che si svolgono nel:

Citoplasma, fino alla formazione del derivato uridilico di NAM-pentapeptide (formazione di UDP-NAM-
pentapeptide) Membrana, fino alla formazione del dimero di NAG- NAM-pentapeptide (+ pentaglicina (nei Gram-
positivi)
Periplasma: consolidamento parete, legami crociati

La sintesi di mureina richiede DUE carrier:

1. Uridina difosfato (UDP) per l’attivazione degli zuccheri da incorporare nella mureina
2. Bactoprenolo-P presente nella membrana (lato citoplasmatico) che trasporta nel periplasma le subunità
neosintetizzate di mureina

SINTESI DELLA MUREINA: fase citoplasmatica (formazione di UDP-NAM-pentapeptide)

1. I derivati uridilici di NAG e NAM sono presenti nel citoplasma

2. Solamente al derivato uridilico di NAM, vengono aggiunti in

sequenza (L-Ala, DGlu, L-Lis (o DAP nei Gram-negativi).
I vari amino acidi vengono uniti tramite legami peptidici
catalizzati da enzimi specifici con consumo di ATP. Non
intervengono tRNA e ribosomi.

3. La formazione di D-Ala è catalizzata da alanina-racemasi,

che catalizza anche la formazione del dimero D-Ala-D-Ala,
che viene inserito come tale con formazione di UDP-NAM-
pentapeptide. La D-cicloserina → è un’antibiotica inibisce
l’alanina-racemasi, bloccando la biosintesi della mureina.

4. Il complesso UDP-NAM-pentapeptide viene trasferito al

Bactoprenolo-P, tramite un legame pirofosforico, e rilascio
nel solubile cellulare di UMP. Inizia, così, la fase di
membrana della biosintesi della mureina

SINTESI DELLA MUREINA: fase di membrana (formazione di N-AG-N-AM-pentapeptide + pentaglicina)

4. La fase di membrana inizia con il legame del complesso UDP-

NAMpentapeptide al Bactoprenolo-P 5

5. Si forma un legame pirofosforico con rilascio di UMP nel

solubile cellulare. Il complesso, viene denominato LIPIDE I

6. Il derivato uridilico di NAG viene trasferito al complesso

(Lipide I), con formazione del complesso LIPIDE II e rilascio
di UDP

7. Il Lipide II trasferisce il complesso NAGNAM-pentapeptide,

che rappresenta l’unità di ripetizione della mureina, nel
periplasma. Il Bactoprenolo rimane nella membrana, viene
defosforilato e ritorna sulla faccia interna della stessa.
7. Nei Gram-positivi,viene aggiunta una pentaglicina,
sintetizzata nello spessore della membrana,con il
concorso di particolari glicil-t-RNA in assenza di
ribosomi.
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14
 LA PARETE NEI BATTERI GRAM-POSITIVI

Costituita da uno spesso strato di peptidoglicano, che arriva a costituire fino al 40% del peso secco della cellula.
Si estende per uno spessore di circa 50 nm intorno al plasmalemma ed è separata da quest’ultimo dallo spazio
periplasmico (20 nm). La parete cellulare batterica è separata dalla membrana citoplasmatica grazie alla presenza
dello spazio periplasmatico o periplasmico (→ è una sede attiva dove si trovano proteine importanti per la fisiologia
cellulare).

∙ Presenza di ACIDI TEICOICI (polisaccaridi acidi; polimeri di ribitolo-fosfato o glicerolofosfato attaccati a

zuccheri o D-ala) o TEICURONICI (→ contengono derivati dell’acido uronico)
∙ L’ACIDO LIPOTEICOICO è un acido teicoico, come struttura, attaccato ad un lipide localizzato nella
membrana citoplasmatica.
∙ Rappresentano i principali antigeni (una molecola che è riconosciuta dal nostro sistema immunitario e che
induce ad una risposta) superficiali dei batteri Gram-positivi;
∙ Avendo una natura acida, determinano una carica negativa alla superficie batterica e possono facilitare
l’assorbimento di ioni (es. Mg++; repulsione elettrostatica quando si avvicina una cellula macrofagica perché
anch’esse cariche negativamente)
∙ Talvolta sono associati a proteine (es. proteina M di S. pyogenes)

Acidi teicoci: polimeri anionici costituiti da unità ripetute 1,3 glicerol fosfato o 1,5 ribitol-fosfato legati da legami
fosfodiesterici.
Possono prendere contatto direttamente con il NAM o prendere contatto con la membrana citoplasmatica
(lipoteicoci). Conferiscono una carica negativa. Controllano il movimento degli ioni (cationi metallici).

Acidi teicuronici: polimeri privi di fosforo contenenti N-acetil-galattosammina e acido D- glucoronico in uguale
proporzioni

PARETE E COMPORTAMENTO ALLA COLORAZIONE DI GRAM

1. La caratteristica tintoriale dipende dalla struttura della parete → se prendessimo un micoplasma, che è un
mollicutes privo di parete, sembrerebbe un batterio Gram negativo. Questo perché non avrebbe nessun posto
in cui conservare il cristal violetto legato al mordensante, che è il colorante primario, che verrebbe lavato via
della cellula e si colorerebbe con il colorante di contrasto (la safranina).
2. Batteri geneticamente privi di parete risultano Gram-negativi
3. Gram-positivi privati di parete, si comportano come batteri Gram-negativi.

1. Il cristal violetto non si lega alla mureina, ma piuttosto viene internalizzato all’interno della fitta rete del
peptidoglicano. Entra nella rete e complessandosi con la soluzione mordensante rete crea un cristallo più
grande che rimane incastrato nelle maglie della parete.
2. Si suppone che l’alcool usato per la decolorazione, riduca il lume dei pori della mureina tanto che il complesso
colorante/mordenzante non possa più essere estratto dalla cellula.
3. Nei Gram-negativi, invece, la decolorazione avrebbe un effetto trascurabile sulla dimensione dei pori della
mureina e non sufficiente a trattenere il complesso cristal violetto/ioduro di potassio.

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Quando si parla di GRAM POSITIVI la parete → lo strato di peptidoglicano + gli acidi sopra descritti. Nei GRAM
NEGATIVI, in cui abbiamo 2 membrane ed il periplasma nel mezzo → la parte è il periplasma + la membrana
esterna, e la parete cellulare deve essere considerata come una cosa a parete.

Parete Gram-positivi: quasi esclusivamente costituita da peptidoglicano (mureina). Polimero costituito da

subunità identiche e pluristratificate. Comprende fino a 40 strati sovrapposti (altre componenti acidi
teicoici/teicuronici/lipotecoici)

Parete Gram-negativi: il peptidoglicano (mureina) è costituito da uno o due strati sovrapposti (5-10% del peso
della parete); il resto della parete (fino al 90%) è costituito dalla “MEMBRANA ESTERNA”.

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 LA PARETE NEI BATTERI GRAM-NEGATIVI

I batteri Gram - possiedono particolari strutture all’esterno della membrana cellulare che rendono la loro parete
molto più complessa di quella dei Gram +

Lo spazio compreso tra membrana esterna ed interna è detto periplasma

Lo spazio periplasmatico è un compartimento acquoso che costituisce dal 20 al 40% del volume totale
Presenza di proteine periplasmatiche coinvolte in varie funzioni:

o Acquisizione di nutrienti
o Generazione di energia
o Sintesi del peptidoglicano
o Biogenesi della membrana esterna e di altre strutture associate alla parete (→ inserzione di flagelli all’interno
della parete dei batteri GRAM -)
o Degradazione di antibiotici o di sostanze tossiche
o Corretto ripiegamento delle proteine (chaperonine periplasmatiche → hanno il compito di verificare che la
proteina sia ripiegata tridimensionalmente nel modo corretto)

LA MEMBRANA ESTERNA

È una membrana asimmetrica, costituita da fosfolipidi nel foglietto più interno e da lipopolisaccaride (LPS)
nel foglietto esterno, in cui sono immerse proteine transmembrana.

Struttura dell’LPS:

1. Saccarolipide detto LIPIDE A → è la sede della tossicità associata al lipopolisaccaride. La LPS è la

porzione tossica ed è anche chiamata endotossina per essere contrapposta al concetto di esotossine
(quelle tossine che vengono prodotte per essere riversate al di fuori della cellula). Queste endotossine non
risultano essere dannose per le cellule batteriche stesse. Provoca danno quando la cellula batterica viene
rotta, perché si rompone delle porzioni della parete che consentono lipopolisaccaride di fuoriuscire →
nell’atto in cui si instaura una risposta immunitaria che cerca di contrastare l’infezione, alcune delle nostre
cellule che sono deputate alla difesa del nostro organismo riescono ad uccidere la cellula batterica,
processarla, romperla → ed il LPS viene liberato. Un altro caso in cui si può liberare il LPS senza che la
cellula scelga deliberatamente di secernere una proteina come un’esotossina avviene quando la membrana
esterna è prodotta in quantità tali che la portano a ripiegarsi, fino tanto che due pieghe si staccano facendo
staccare una piccola vescicola fatta di membrana esterna → è una mina vagante che è costituita di LPS che
potrà andare ad esercitare una serie di funzioni.
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 2. Regione polisaccaridica detta CORE → ha una funzione strutturale che serve a connettere il lipide A
con l’altra porzione (quella dell’antigene O).

3. Lunga catena polisaccaridica detta ANTIGENE O è una struttura proiettata verso l’ambiente extracellulare
ed ha una funzione antigenica.

Lipide A: dimero di N-acetil glucosamina esterificato con due residui fosfato e un numero variabile di molecole
di acidi grassi.
Al lipide A è legato il core polisaccaridico, suddiviso in core interno e core esterno.

Core interno: la composizione è conservata e contiene invariabilmente da una a tre molecole di 2-cheto 3-deossi
ottonato (KDO) e un eptosio (zucchero a 7 atomi di carbonio). È la porzione in cui sono ripetuti KDO ed eptosio.

Core esterno: la composizione è più variabile e contiene zuccheri a 6 (come glucosio e galattosio) e 7 atomi di
carbonio. È la porzione in cui sono ripetuti glucosio e galattosio.
Al core saccaridico è legata la catena laterale O, costituita da unità tetra o penta saccaridiche ripetute che si
estendono sul versante extracellulare.
La composizione dell’antigene O è estremamente variabile non solo tra i diversi generi, ma anche nell’ambito di
una specie. Carica superficiale negativa, associazione con cationi bivalenti. Importante fattore di virulenza,
coinvolto nella produzione di anticorpi.

Lipide A riconosciuto da cellule del sistema immunitario, induzione di eventi a cascata → citochine pro-
infiammatorie.

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EFFETTI BIOLOGICI DELL’ENDOTOSSINA

La distinzione tra endotossina ed esotossina si basa sulla secrezione attiva, da parte della cellula, nel lume di una
sostanza tossica.
o Le endotossine, inoculate in un animale a loro sensibile, danno luogo ad una vasta gamma di sintomi in
conseguenza del loro effetto su diversi organi e sistemi
o Qualsiasi apparato o cellula dell’organismo sembra rispondere sia in vitro che in vivo allo stimolo
endotossico

I bersagli delle piccole quantità di endotossine sono elementi cellulari che troviamo nel nostro repertorio
immunologico:
o monociti-macrofagi → ha la funzione fagocitaria → sintesi di IL-1 e TNF → febbre
o neutrofili → rilascio amine vasoattive → vasodilatazione
o linfociti B (cellule deputate alla produzione di anticorpi) →attivazione → produzione di anticorpi
o complemento (prevede l’intervento a cascata di più proteine che scatenano l’intervento infiammatorio)
→ attivazione → infiammazione

In caso di alte dosi di endotossina si ha lo shock dell’organismo del paziente, coagulazione travasale, e
l’alterazione delle funzioni di molti organi.

1) Effetto pirogeno (capacità di indurre febbre anche a basse dosi)

2) Attiva vari tipi cellulari

o Macrofagi → aumento della fagocitosi e capacità battericida, produzione di monochine che agiscono su
vari altri tipi cellulari e tessuti
o Linfociti B
o Cellule endoteliali
o Piastrine
o Granulociti

3) Induce infiammazione
4) Induce vasodilatazione con conseguente ipotensione e shock
5) Attiva il complemento
6) Stimola la coagulazione del sangue CID (coagulazione intravasale disseminata)

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Lezione del 06/10/20

Partendo dalla membrana citoplasmatica, che non fa parte della struttura della parete, troviamo il periplasma all’interno del
quale è immerso un sottile strato di peptidoglicano, al di fuori del peptidoglicano si trova nuovamente il periplasma e quindi
una membrana esterna (è asimmetrica). Il foglietto più esterno composto dal lipopolisaccaride, noto anche come endotossina,
è una struttura composita che proiettata verso l'esterno interagisce con il sistema immunitario dell’ospite. La porzione del
lipopolisaccaride alla quale viene attribuita la tossicità dei batteri Gram negativi è quella del lipide A → che interagisce con i
macrofagi portando alla liberazione di citochine, che a loro volta scatenano una reazione che ha il compito di cercare di
confinare/isolare il microrganismo ed ucciderlo. Questa reazione se esacerbata porta dei danni all’ospite con un eccessivo
stato infiammatorio → che può portare nei casi più gravi anche il paziente a shock e a morte.

Esternamente al lipide A si trova il core, che a sua volta è suddiviso in core interno e core esterno (ha una funzione
strutturale con i suoi zuccheri a 6-7 atomi di C). Ad interagire col sistema immunitario dell’ospite è invece l'antigene O, la
porzione polisaccaridica che vede unità di 4-5 zuccheri ripetuto n volte, nonostante sia la porzione determinate antigenico del
lipopolisaccaride non rappresenta un antigene ideale. L’antigene ideale è una proteina perché permette il posizionamento
dell’antigene da parte del macrofago che è riuscito a processare il batterio, nel contesto del complesso maggiore di
istocompatibilità di classe II, di presentare così il linfocita T-Helper che si occupa di aiutare nella risposta immunitaria →
l’informazione viene passata a una serie di cellule effettrici. La porzione dell’antigene O del lipopolisaccaride è un attivatore
non ideale perché bypassa il ruolo dei linfociti e va direttamente ad attivare i linfociti B causando una massiccia attivazione
dei linfociti B che si trasformano tutti in plasmacellule, quindi in piccole fattorie di anticorpi che una volta espletata questa
funzione muoio, non rimanendo cellule di memoria.

Componenti parietali dei batteri Gram negativi

PORINE

La diffusione nel periplasma di ioni e piccole molecole è assicurata dalla presenza di proteine canale dette PORINE,
omotrimeriche (ogni monomero è una proteina transmembrana con struttura a botte). Alcune porine consentono la
diffusione di nutrienti (diffusione facilitata). Complessi multiproteici favoriscono il passaggio di molecole più grandi, quali ad
es. la vitamina B12 Altre proteine associate alla M.E. sono le lipoproteine, che partecipano a varie funzioni, stabilizzazione
superficie, resistenza antibiotici… (E. coli, 90 tipi diversi).

Le porine sono delle proteine canale, omotrimeriche → quindi ogni monomero ha una sua struttura a canale che permette di
attraversare la membrana esterna. OMP → sta per outer membrane protein, quindi proteina localizzata nella membrana
esterna. Le strutture amminoacidiche si conformano in modo da creare una sorta di botte. A cosa servono queste proteine?
La membrana esterna rappresenta un altro setaccio/filtro che deve comunque consentire il passaggio di nutrienti. Complessi
multiproteici, per esempio, presenti nella membrana esterna dei batteri Gram negativi consentono il passaggio di molecole
più grandi, che non riuscirebbero a passare nello stretto lume del canale della porina, come ad esempio la vitamina B12 (è un
nutriente importante per la cellula batterica). Oltre alle porine sono presenti delle altre proteine, le lipoproteine, che hanno
una funzione strutturale (→ che stabilizzano per esempio la superficie), ma sono anche coinvolte nella resistenza agli
antibiotici.

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Perché le proteine presenti sulla membrana esterna possono essere correlate alla farmacoresistenza della cellula batterica?

Se le porine sono deputate a far transitare molecole all’interno della membrana, qualora dovesse avvenire una mutazione che
comporta una sostituzione amminoacidica, quindi una sostituzione non sinonima.

Come può avvenire una mutazione che comporti la sostituzione di un amminoacido? Quando abbiamo una mutazione che
assicura che l’amminoacido purificato non sia più lo stesso? Se viene modificata la prima e/o la seconda base perché se la
modificazione/mutazione è sulla terza base del codone molto probabilmente (considerando che il codice genetico è degenerato,
considerato quindi che non ci sono più triplette per un amminoacido) l’amminoacido non venga sostituito. Quando invece la
mutazione avviene sulla prima o sulla seconda base allora è molto probabile che la sostituzione dell’amminoacido avvenga,
se l’amminoacido che viene sostituito era un amminoacido neutro e invece abbiamo un amminoacido carico/ingombrante che
si proietta all'interno del lume. Tale proiezione potrebbe causare un ingombro sferico che porterebbe ad una diminuzione del
diametro del lume e quindi questo potrebbe impedire il passaggio di una molecola in generale, e in questo caso di un
antibiotico.

Quello che accade nella pratica clinica quando un microrganismo è sottoposto alla pressione
selettiva, che deriva dalla presenza di antibiotici, è quella di rispondere con delle
modificazioni. Una modificazione molto rapida potrebbe essere quella di ridurre
drasticamente l’espressione delle porine e quindi le cellule che si riproducono, in un intervallo
di tempo di 20 minuti, produrranno delle cellule figlie in cui non vengono più sintetizzate
molte porine sulla superficie. Una mancanza di porine → comporta una diminuzione di punti
d'ingresso che non consentono all’antibiotico di passare.
Le porine posizionate nella sede deputata all’interazione con l'ambiente extracellulare
possono anche avere la funzione di recettori per fagi, batteriocine, componenti del
complemento, per gli anticorpi (per molecole prodotte dal nostro sistema immunitario).

Le porine possono contribuire a promuovere la patogenicità del microrganismo perché magari hanno una struttura
amminoacidica tale da mediare l’adesività, possono avere attività citotossica (vengono liberate in piccole vescicole che si
fondono con la membrana delle cellule eucariotiche).

L’esempio di un microrganismo che è caratterizzato da una intrinseca ridotta suscettibilità ai farmaci è Pseudomonas
aeruginoosa, è un microrganismo Gram negativo considerato un patogeno ospedaliero (si dice un patogeno
nosocomiale perché la sua distribuzione è molto frequente nel nosocomio, cioè nell’ospedale). È un microrganismo molto
noioso per l'eradicazione anche perché riesce a replicarsi anche nei disinfettanti. A cosa è dovuta questa sua resistenza
intrinseca? Questa sua resistenza è dovuta da una sua caratteristica genotipica e fenotipica.

Pseudomonas aeruginosa acquisisce la sua resistenza attraverso delle mutazioni, che per alcuni ceppi si ritrovano già nel
genoma.

Ci sono molti ceppi che circolano nell’ambiente ospedaliero che sono mutanti perché hanno perso la capacità di sintetizzare le
porine → se la porina è assente l'antibiotico non riesce a passare nelle maglie della membrana e quindi rimane all'esterno.
Oppure, la proteina porina è presente, all'interno della struttura della membrana esterna, ma ha subito una mutazione (magari
di un solo amminoacido) che protrude all'interno del canale creando un ingombro sferico tale da non riuscire a far passare
l'antibiotico, che quindi come risultato rimanere fuori.
Potrebbe anche accadere che il numero di porine viene ridotto, si lavora quindi su una riduzione dell’espressione genica, e
quindi sulla membrana esterna di quel batterio saranno riportate molte meno porine e quindi ci saranno molti meno punti
d'ingresso per quell’antibiotico.

21
 BIOSINTESI DELLA MEMBRANA ESTERNA

I componenti LPS, PL, proteine e lipoproteine sono assemblate nel citoplasma o sul versante interno del plasmalemma
e devono attraversare 2 diversi compartimenti. Periplasma e membrana esterna sono privi di fonti energetiche e ATP (→
l’ultima stazione in cui si può sfruttare l’idrolisi dell’ATP per un trasporto attivo e la membrana citoplasmatica, da lì in poi è
necessario l’intervento delle proteine periplasmatiche)
Le proteine che vengono sintetizzate e vengono indirizzate alla ME portano un segnale all’N-Terminale che le indirizza alla
traslocazione attraverso due sistemi (che sono ubicati al livello di plasmalemma cioè al livello di membrana citoplasmatica):
o Il traslocone SEC, che trasporta proteine unfolded → cioè delle proteine che ancora non sono organizzate nella loro
struttura tridimensionale finale
o Il sistema Tat, che trasporta proteine folded → trasporta quindi proteine che sono già organizzate nella loro
conformazione tridimensionale finale

Immaginiamo una proteina (OMP) che deve essere traslocata sulla

membrana esterna. La proteina è sintetizzata a livello citoplasmatico e
nello spazio periplasmatico è rappresentata in giallo con una porzione
rossa, che è il peptide segnale, che l'ha guidata verso il traslocone SEC.
La proteina unfolded non rimane libera, ma viene subito presa in
consegna da una chaperonina che la lega perché potrebbe esserci il
rischio che più proteine destinate alla membrana esterna si aggreghino.
La chaperonina Skp, che è la prima che incontra la proteina appena
esce dal traslocone SEC, la prende in consegna e la trasferisce ad
un'altra proteina, che è la proteina Sur A. La seconda proteina che
interviene la ripiega in modo corretto e la rigira in modo tale che possa
prendere contatto con la macchina proteica BamA (che in realtà è un
complesso pluriproteico) che è responsabile del corretto
posizionamento della eventuale oligomerizzazione della proteina nella
membrana esterna.

Un'altra rappresentazione del posizionamento di un'altra lipoproteina che è

rappresentata da delle specie di propaggini in basso che rappresentano la
porzione lipidica → le lipoproteine possiedono un segnale alla loro estremità
ammino terminale che le guida al trasloco SEC, perché devono essere presa
in carico da una serie di proteine periplasmatiche per arrivare al corretto
posizionamento nella membrana esterna.

Proteine periplasmatiche, indicate con la sigla LoL (LoL → lipoprotein outer

membrane localization) sono quelle proteine che prendono in consegna la
proteina appena uscita dal traslocone SEC. Il primo livello è quello della
membrana citoplasmatica del plasmalemma (quindi al di fuori della parete) →
la proteina uscita dal traslocone è presa in consegna dal complesso Lol CDE
che, a spese di ATP, la indirizza verso la chaperonina LolA (che è in posizione
periplasmatica).

La chaperonina LolA ha una tasca idrofobica che permette un’interazione con la porzione lipidica della lipoproteina che fa sì
che la proteina chaperonina LolA, attraversando tutto il periplasma, consegni in ultima analisi alla chaperonina LolB, in
prossimità della membrana esterna, che è responsabile del corretto inserimento della proteina nella membrana esterna.

Il trasporto del lipopolisaccaride avviene in modo separato, per poi

essere riassemblato, al livello membrana esterna. Partendo dallo
starto del plasmalemma → il precursore dell’antigene O viene preso
in consegna dal bactoprenolo e piano piano assemblato e trasportato
nel periplasma. Il primo trasportatore ABC (trasportatore di unità
polisaccaridiche precursori dell’antigene O, che polimerizzano nel
periplasma), a livello del bactoprenolo, polimerizza e poi trasloca al
di là della membrana l'antigene O e piano piano si assembla.
Un trasportatore di membrana, che si chiama ABC MsbA, a spese di
ATP trasloca il complesso lipide A-core nel periplasma, dove si ha
l’assemblamento del lipopolisaccaride. Il LPS viene unito al lipide A,
al core e anche la porzione dell’antigene somatico e viene preso in
consegna da un sistema di chaperonine, che sono la LptA e la LptE,
che grazie alla LptD lo inseriscono nella membrana.

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Parete di Mycobacterium tuberculosis

1. Strato basale o core: peptidoglicano e arabinogalattano

2. Struttura esterna bistratificata: un fitto strato acidi micolici ed uno di cere (glicolipidi fenolici), con formazione di una
membrana esterna simile per struttura ai batteri Gram- (ma molto diversa è la composizione!)

Mycobacterium tuberculosis → l'agente eziologico della tubercolosi nell'uomo. Impiega circa 24 ore per potersi replicare,
assume i nutrienti con estrema lentezza perché la sua superficie è così complessa e permeabile che rende difficile l'assunzione
di nutrienti, la penetrazione dei coloranti e anche degli antibiotici. La parete da un punto di vista strutturale ricorda la parete
dei Gram negativi, ma dal punto di vista della composizione chimica non è possibile parlare di batteri Gram negativi quando
parliamo dei micobatteri. Questo non può essere fatto perché la struttura è differente dal punto di vista chimico e perché i
micobatteri non si colorano con la colorazione di Gram.

Strutturalmente ricordano l’organizzazione architettonica della parete dei Gram negativi perché riconosciamo uno strato
basale, chiamato core, in cui troviamo peptidoglicano e arabinogalattano e poi troviamo una struttura esterna
bistratificata che non è composta da fosfolipidi. Sono eubatteri che non sono né Gram positivi né Gram negativi, ma sono
organismi che si colorano con la colorazione di Ziehl-Neelsen.
Questa struttura esterna bistratificata è costituita da uno strato molto fitto di acidi micolici (→ sono degli acidi grassi
complessi a catena lunga, che danno una scarsa fluidità e danno in parte la resistenza che questa parete offre) ed uno di cere
(→ chimicamente sono dei glicolipidi fenolici che risultano essere impermeabili, rendono difficile la penetrazioni di nutrienti ed
antibiotici) → è come se i micobatteri avessero una struttura esterna che, solo dal punto di vista strutturale è simile a quella
dei batteri Gram negativi ma è totalmente differente per quanto riguarda la sua composizione perché non c'è lipopolisaccaride.
Quando si parla di micobatteri NON si parla di batteri Gram negativi!

Confronto tra Gram negativi e actinobacteria → laddove la

struttura presenta analogie, quindi peptidoglicano, oltre allo
spazio periplasmatico abbiamo un’analogia prettamente
strutturale ma abbiamo chimicamente delle strutture che sono
diverse: lipopolisaccaride nello strato più esterno della
membrana esterna, i fosfolipidi più internamente e dall'altra
parte abbiamo l’arabinogalattano, gli acidi micolici e le cere.

Una domanda all’esame potrebbe essere struttura della

parete oppure colorazione di Neelsen.

23
 CHLAMYDIA TRACHOMATIS

Chlamydia trachomatis è un batterio patogeno per l'uomo, appartenente alla famiglia delle Chlamydiaceae, insieme ad altre
specie quali Chlamydophyla psittaci e Chlamydophyla pneumoniae, anch'esse patogene per l'uomo.

C. trachomatis è responsabile della più comune infezione sessualmente trasmessa su scala globale → sono state
stimate circa 2.86 milioni di infezioni l’anno.

Parete cellulare rigida con peptidoglicano sostituito da proteine ricche di cisteina. Involucro esterno costituito da una
componente lipopolisaccaridica (LPS) e da una proteina denominata MOMP con probabile funzione di “porina”. Rigidità della
parete (ponti disolfuro tra le molecole MOMP (→ major outer membrane protein) e residui di cisteina nella molecola proteica).

A lungo è stato confuso con un virus perché la Chlamydia ha un ciclo vitale molto particolare che è composto da due fasi, una
costituita da una forma che si dice corpo elementare molto piccolo, che è l'elemento infettivo. È stato a lungo scambiato per
un virus perché non si coltiva sui terreni di coltura, ma solo nelle cellule come fanno i virus. Riesce a replicarsi solo nelle
cellule perché è un patogeno intracellulare obbligato dal fatto che è un parassita metabolico, non è in grado di produrre ATP,
ma ha bisogno di sfruttare l’apparato cellulare per poter sintetizzare tutti i componenti e replicarsi. Chlamydia sotto forma di
corpo elementare contagia una cellula eucariotica, penetra all’interno della cellula e una volta all'interno della cellula si
organizza in una struttura molto più grande → che è il corpo reticolato.

Sfrutta l'apparato metabolico della cellula per la replicazione, dal corpo elementare poi si liberano nuovamente corpi elementari
che rompono la cellula, escono e vengono inseminati in altre cellule. Questo microrganismo ha una parete cellulare molto
particolare, potrebbe essere considerata Gram negativo, ma non presenta la mureina (il peptidoglicano). Il peptidoglicano è
sostituito da uno strato proteico composto da proteine ricche in cisteina che formano legami disolfuro e che quindi garantiscono
una base strutturale alla presenza della membrana esterna.

24
 LE PARETI CELLULARI DEGLI ARCHAEA

Anche negli Archea la parete cellulare, quando è presente, svolge la medesima funzione → conferire resistenza alla lisi osmotica
e consentire il mantenimento della morfologia cellulare (due funzioni che sono analoghe con gli eubatteri).
In nessuno parete degli Archea troviamo il peptidoglicano (la mureina), ma sono state descritte divere tipologie di parete in
base alla composizione e struttura:

Pareti di PSEUDOMUREINA

Questo vorrà dire che la struttura parietale ricorda molto quella della mureina,
seppure con qualche differenza. Ritroviamo la N-acetilglucosamina, mentre il
secondo zucchero del dimero classico non è più l’acido N-acetilmuramico, ma
è il NAT. Un altro elemento di differenza è rappresentato dal legame glicosidico
β 1,3 (NAM e NAG negli eubatteri sono tenuti insieme da un legame glicosidico
β 1,4).
È l’unica tra le pareti degli Archea costituita da uno spesso polimero omogeneo
con struttura simile alla mureina. Gli Archea con pareti di pseudomureina si
comportano al Gram come i Gram-positivi.

Tre caratteristiche che distinguono le pareti di pseudomureina dalla classica

parete di un batterio Gram positivo → il dimero con gli aminoacidi che si
ripetono, ma il legame glucosidico è diverso, non è presente acido N-
acetilmuramico e non sono presenti gli amminoacidi destrogiri.
Caratteristiche della pseudomureina: non sono presenti acido muramico
e D-aminoacidi. Le catene glicaniche sono costituite da NAG e N-
acetiltalosaminuronico, uniti da legami glicosidici β (1,3). La pseudomureina
non viene idrolizzata da lisozima.

Pareti PROTEICHE o S-layer

Pareti GLICOPROTICHE

Sono le pareti più comuni. Sono presenti nei Metanogeni, negli Alofili estremi ed Ipertermofili. Strutture paracristalline
costituite da proteine o glicoproteine generalmente a simmetria esagonale. Possono essere composte da più strati sovrapposti
(20-40 nm). In Sulfolobus (Ipertermofilo), con parete glicoproteica, le pareti purificate non perdono la forma cellulare
e non vengono deformate a 100°C in presenza di SDS.

Pareti POLISACCARIDICHE

Sono le pareti più complesse, pluristratificate e compatte.

25
Lezione del 9/10/20
ANTIBIOTICI ATTIVI CONTRO LA PARETE BATTERICA

Ci sono degli antibiotici che interferiscono nelle varie fasi del processo biosintetico della parete → che consta di tre fasi
principali: la biosintesi dei precursori (che avviene a livello citoplasmatico), una fase che avviene a livello di membrana dove
è presente il traslocone e la fase di assemblaggio, che avviene nella porzione periplasmatica (quindi nell’ambiente
extracellulare).

26
 INIBITORI REAZIONI DELLA PRIMA FASE (CITOPLASMATICA) DI BIOSINTESI

Fosfomicina

La fosfomicina interviene e blocca la biosintesi della parete sul nascere perché previene di fatto la sintesi di UDPN-
acetilglucosammina, che è precursore che poi consentirà il trasferimento della N-acetilglucosammina al versante
extracellulare.

Perché blocca questa fase? La fosfomicina è un analogo strutturale del fosfoenolpiruvato (che è l’elemento fondamentale per
poter arrivare al composto di piena UDPN-acetilglucosammina) e si lega all’enzima piruvil transferasi che ha il compito di
staccare il gruppo fosfato e trasferirlo alla UDPN-acetilglucosammina nascente.

Lo spettro d'azione è la capacità dell'antibiotico di colpire ed inibire la replicazione di più bancari possibili, quanto più ampio
è lo spettro di azione maggiore è il numero di microrganismi che possono essere inibiti somministrando questo tipo di
antibiotico. Lo spettro d'azione della fosfomicina comprende sia batteri Gram positivi che batteri Gram negativi, inclusi quei
ceppi che sviluppano dei meccanismi di resistenza a dei farmaci che sono storicamente e convenzionalmente utilizzati nel
trattamento dell'infezione (le penicilline, per esempio, perché producono gli enzimi che sono in grado di rompere la struttura
di questo farmaco).

Agendo con un meccanismo d'azione, che è totalmente indipendente, la fosfomicina posta vicina consente di essere attiva
anche su quei microrganismi che sono spesso associati a infezioni urinarie come Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas ed altri.

La fosfomicina per entrare sfrutta un trasportatore, che si trova a livello della membrana citoplasmatica (anche il plasmalemma
ha un ruolo importante nella permeabilità selettiva delle membrane che consentono l'ingresso nella cellula di vari componenti),
per il glucosio-6-fosfato oppure il trasportatore del fruttosio-6-fosfato. Questi trasportatori vengono usati dalla
fosfomicina per entrare all'interno del citoplasma della cellula, dove svolgono un’azione di competizione con il fosfoenolpiruvato
per legarsi all’enzima piruvil transferasi.

Antibiotico che viene spesso prescritto nei casi di infezione delle vie urinarie → il monuril. Questo farmaco ha una dinamica
particolare perché per la sua capacità di permanere e di raggiungere concentrazioni può essere assunto anche per soli due
giorni, senza il rischio di incorrere nell’insorgenza della resistenza.

Con l'iter diagnostico è fondamentale verificare la suscettibilità del genere che è responsabile di una determinata infezione
agli antibiotici e verificare che il gene sia sensibile alla fosfomicina prima di somministrare il monuril.

Come può divenire suscettibile a questo farmaco il germe?

a. Il meccanismo di resistenza può essere ricercato nelle mutazioni che possono sopraggiungere nel gene che codifica per il
trasportatore di membrana. Sotto pressione selettiva quello che potrebbe succedere è una mutazione del gene che
modifica, per esempio, il canale del trasportatore di membrana non rendendolo più percorribile da questo farmaco.

b. Potrebbero incorrere delle mutazioni che si verificano nel gene che codifica per l’enzima target della fosfomicina (che
abbiamo detto essere la piruvil transferasi = enzima target della fosfomicina) per cui questa mutazione non permette
più di riconoscere il substrato, in questo caso la fosfomicina.

c. La produzione di enzimi come la gliossalasi, che sono prodotti sia da batteri Gram positivi (FosB) sia da batteri Gram
negativi (FosA e FosX), che sono in grado di degradare l'anello epossidico della fosfomicina, quindi tagliando/inattivando il
farmaco viene meno l'azione dell' antibiotico, che o non si lega più al trasportatore (⇒ non entra nella cellula) o entra
nella cellula ma l’enzima essendosi modificato non è in grado di legarsi (⇒ continua ad effettuare la biosintesi della parete)
oppure vengono prodotti degli enzimi che degradano la struttura dell'anello epossidico dell’antibiotico.

Come si possono acquisire le mutazioni? I meccanismi con cui un batterio acquisisce i tratti genotipici di resistenza possono
essere diversi, ma nel caso di questo farmaco il contributo di plasmidi che sono elementi di DNA mobili, che possono passare
da una cellula all’altra è poco frequente. Questo tipo di resistenza è solitamente cromosomica, cioè il batterio presenta già
questo tipo di informazione (per esempio per la sintesi di enzimi).

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Cicloserina

La cicloserina interviene nell'ultima parte della fase di sintesi, a livello citoplasmatico, quando deve essere sintetizzato il
dimero D-ala D-ala, che è l'ultima porzione che viene inserita alla catena pentapeptica crescente del peptidoglicano attaccato
al NAM. La cicloserina è un analogo strutturale della B alanina ⇒ interferisce con la sintesi del dimero D-alanina e inibisce
l’enzima alanil racemasi e anche l’enzima D-alanil-D-alanina sintetasi. Se somministriamo cicloserina, anche qui ci
troviamo di fronte ad un ampio spettro d'azione perché di nuovo non si tratta di una caratteristica propria solo dei batteri
Gram positivi, ma si tratta di un intervento che avviene su una fase di biosintesi della parte che riguarda sia Gram positivi che
Gram negativi → che porta ad un’incapacità di assemblare la parete perché, mancando il dimero D-ala D-ala, non si formano
i legami crociati e ⇒ la parete risulta molto più instabile (la parete quindi non risulta essere complessato è organizzata
tridimensionalmente).

INIBITORI DEL SECONDO STADIO (MEMBRANA)

Bacitracina

Gli inibitori del secondo stadio sono rappresentati dalla bacitracina, un antibiotico polipeptidico prodotto da organismo
Bacillus licheniformis. Si Lega al carrier lipidico (al bactoprenolo) quando è sul versante extracellulare. Il farmaco blocca il
bactoprenolo se ne impedisce la sua defosforilazione (la fosforilazione-defosforilazione lo strumento attraverso il quale poteva
traslocare da una parte all'altra della membrana citoplasmatica portando con sé le unità disaccaridiche che erano legate al
peptide nel lipide II).
Questo farmaco è prevalentemente attivo nei confronti dei batteri Gram positivi ⇒ è un farmaco che viene utilizzato nel
trattamento dei batteri Gram positivi perché è una molecola piuttosto grande, e la presenza nei batteri Gram negativi nella
membrana esterna di un ulteriore filtro rende difficile la penetrazione all'interno della cellula.

I meccanismi con i quali si stabilisce la resistenza alla bacitracina sono coinvolti:

a. Con l’internalizzazione del farmaco oppure con un sistema di estrusione dell'antibiotico → ammesso che la molecola riesca
a penetrare all'interno della cellula batterica, la cellula batterica è in grado di estruderla attraverso dei sistemi che vedono
però un dispendio energetico, attraverso quindi un trasporto attivo.
b. Bypass metabolico → mentre il la bacitracina che è riuscita a penetrare, che ha superato la membrana esterna, si lega al
bactoprenolo, impedendo la traslocazione avanti indietro nella membrana plasmatica, la cellula batterica reagisce con un
decaprenolo chinasi (che è codificato da un gene BacA) che genera di nuovo un undecaprenolo, che in quel momento
rimane bloccato dall’azione della bacitracina. La bacitracina riesce a bloccare quello che è già formato ma la cellula risponde
sintetizzando de novo molto di più di quello monofosfato, che è quello che è carente in quel momento perché è la sua
defosforilazione che viene bloccata ⇒ non c'è più una quantità di undecaprenolo monofosfato disponibile per trasportare
al di fuori.

Il bactoprenolo viene inibito nella sua defosforilazione → quando si trovava nell’ambiente extracellulare ⇒ quindi rimane
bloccato e non è più disponibile per assumere NAM e NAG. La cellula reagisce facendo sì che venga improvvisamente messo
a disposizione un nuovo undecaprenolo monofosfato ⇒ anche se da fuori viene bloccato ne viene prodotto in quantità maggiori
in modo da poter continuare il ciclo, che poi si ferma nel versante extracellulare perché non riesce più a tornare indietro.

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 INIBITORI DEL TERZO STADIO

Inibitori β-lattamici

I β-lattamici includono: penicilline, cefalosporine, monobattami, carbapenemi e inibitori delle β-lattamasi (noti come antibiotici
suicidi).

Sono tutti farmaci β-lattamici perché sono accomunati dalla presenza di un anello β-lattamico, la cui presenza inibisce le
penicillin binding proteins (PBPs), che sono degli enzimi che catalizzano:

a) Reazioni mediate da transglicosilazione: le PBPs sono quelle proteine che troviamo nello spazio periplasmatico a
mediare la transglicosilazione (elemento fondamentale per la formazione del legame β1→4 che consolida i dimeri NAM-
NAG-NAM-NAG
b) Reazioni mediate da D-alanina: l'azione delle carbossipeptidasi, che sono fondamentali per staccare l'ultimo
amminoacido (D-ala) dal pentapartito per poter far avvenire i legami crociati.
c) Reazione di peptidoglicano-endopeptidasi: sono inibitori di proteine che vengono chiamate peptidoglicano
endopeptidasi, cioè che idrolizzano i legami transpeptidici → anche questi enzimi sono importanti nel rimodellamento della
parete.
d) Reazione di transpeptidazione: la formazione dei legami crociati altro elemento strutturale fondamentale.

Le PBPs sono degli enzimi periplasmatici che svolgono un ruolo fondamentale nel consolidamento delle ultime fasi di biosintesi
della parete.
Perché sono inibitori competitivi? Sono inibitori competitivi perché la loro struttura, la presenza dell’analogo dell’anello β-
lattamico presenta un'analogia strutturale con quello che è il substrato naturale delle PBPs.

Pennicilline

La penicillina fu scoperta da Alexander Fleming per caso.

L'acido 6-aminopenicillanico è la porzione della struttura che rimane costante ⇒ è quella che rimane conservata in
tutte le penicilline, mentre invece in posizione 6 dell'anello β-lattamico è presente una catena laterale ed è su sostituzioni di
questa catena laterale che si ottengono le varie tipologie di penicilline.
L'evoluzione delle penicilline si ha a partire dalla prima penicillina, la penicillina G, con le conseguenti sostituzioni del gruppo
N-acile. Partiamo da una prima penicillina, la penicillina G → ha uno spettro d’ospite piuttosto limitato perché agisce quasi
esclusivamente sui batteri Gram positivi. Sostituendo questa porzione del gruppo N-acile passiamo dalla penicillina G a
composti che vanno nella direzione di ampliare il più possibile lo spettro di azione ⇒ le strutture diventano via via più ramificate
e più complesse.

Passiamo alla meticillina, che è stata la prima penicillina utilizzata nelle infezioni da stafilococchi che producevano penicillasi,
cioè degli enzimi in grado di degradare la penicillina. Ebbene la meticillina, con questa struttura ramificata, presentava un
ingombro sterico tale da impedire alla penicillasi di rompere l'anello ⇒ di alterare e degradare l’antibiotico.

L’oxacillina → ha uno spettro d’azione che comprende molti cocchi Gram positivi, tra questi si ha stafilococchi (come
Staphylococcus aureus), streptococchi (come Streptoccocus pneumoniae, che è l'agente eziologico della polmonite lobare)
oppure di streptococchi beta-emolitici (come Streptoccocus piogenes che è l'agente eziologico dell’angina, del mal di gola che
si presenta con le placche).

Ampicillina → qui passiamo ad un antibiotico che non solo è attivo su un numero discreto di germi Gram positivi, come
Staphylococcus aureus, come Streptoccocus pneumoniae, come il genere Clostridium (Clostridium tetani e Clostridium
botulinum). Accanto ai batteri Gram positivi si inizia ad avere un farmaco che è attivo anche su germi Gram negativi come
Neisseria meningitis oppure Bordetella pertussis (l'agente eziologico della pertosse o tosse canina/tosse cattiva proprio su
Proteus mirabilis (responsabile di infezioni urinarie).

La modificazione della catena laterale ha consentito via via di ampliare e modificare lo spettro d'azione di questi antibiotici.

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Cefalosporine

Giuseppe Brotzu è il padre della cefalosporina che di fatto era prodotta da un fungo, cephalosporium acremonium. La
struttura dell'anello β-lattamico è immutato rispetto alle penicilline, ciò che cambia è l'altro elemento del core del farmaco che
è un anello diidrotiazinico, inoltre abbiamo, in posizione 7, il posizionamento di una catena laterale. È di nuovo a livello di
sostituzioni a livello della catena laterale che si osserva la nascita di cefalosporine sempre più differenti tra loro che vengono
chiamate ⇒ cefalosporine di prima generazione, di seconda generazione e di terza generazione. Man mano che
aumentano le generazioni delle cefalosporine si amplia lo spettro d'azione di questi farmaci ad includere sempre un numero
maggiore di microrganismi.
Adesso siamo all’introduzione nella pratica clinica di una cefalosporina di quinta generazione che ha uno spettro d’azione
rivolto ai batteri Gram positivi, ma che va a mostrare un’attività nei confronti dii ceppi di Staphylococcus aureus che vengono
chiamati MRSA (→ Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus) → perché sono ceppi meticillino-resistenti (la meticillina
è una penicillina → uno dei farmaci più utilizzati nelle infezioni da Staphylococcus aureus).

Monobattami

L’Azetronam è un esempio di monobattame, ha un anello β-lattamico ciclico che ha in questo caso un target ben preciso
nelle PBPs, andando ad inibire le PBPs di tipo tre, che sono quelle che esplicano l'attività transpeptidasica e trasgliocolasica ⇒
l’azetronam colpisce al cuore questa fase cellulare di parete andando ad inibire la transpeptidazione, quindi la formazione dei
legami crociati e la formazione del legame β1 → 4. È un antibiotico battericida ⇒ a seguito della somministrazione
dell’azetronam, il batterio non riuscirà più a sintetizzare una parte funzionale (attivo sui Gram negativi).

Carbapenemi

I carbapenemi fanno parte dei batteri β-lattamici perché hanno un’azione antibatterica ad ampio spettro, che è attiva
sia su batteri Gram positivi che su batteri Gram negativi; è resistente anche all’azione idrolitica delle β-lattamasi, sono degli
enzimi che vengono prodotti dal batterio ed andranno direttamente a degradare l'anello β-lattamico, che è il fulcro dell'azione
di questa tipologia di farmaco per analogia strutturale con il substrato. Un esempio di un farmaco carbapenemico è
l’imipenem e il meropenem.

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I batteri in risposta alla pressione selettiva di un antibiotico rispondono sviluppando dei meccanismi di resistenza.

I meccanismi di resistenza sono:

1. Impermeabilità della superficie batterica: rendendo la superficie batterica impermeabile laddove possibile all’azione
dei farmaci. Modificano la loro permeabilità andando ad agire su quegli elementi che sono responsabili dell'ingresso di
molecole ⇒ tipicamente per i batteri Gram negativi questo significa, come nel caso di pseudomonas aeruginosa, magari
mutare le proteine della membrana esterna, mutare in generale quelli che sono i canali che garantiscono un accesso al
periplasma e secondariamente alla membrana citoplasmatica.

2. Alterazione del bersaglio: in questo caso ci troviamo di fronte a mutazioni che vanno a cadere in quei geni che codificano
le penicillin binding proteins, che divengono improvvisamente delle proteine che hanno una bassissima affinità per il
farmaco ⇒ la loro normale funzionalità non viene intaccata se diventano improvvisamente meno affini a legare il farmaco
oppure, come succede in Staphylococcus aureus, acquisiscono nuove PBPs, come quella codificata dal gene mecA che
sono diverse e non sono sensibili all’azione del farmaco β-lattamico.

3. Inattivazione del farmaco: produzione di β-lattamasi → hanno il compito di scendere l'anello β-lattamico degradando di
fatto il farmaco e rendendolo inattivo. Le β-lattamasi si trovano dei batteri Gram negativi normalmente le troviamo
localizzate nello spazio periplasmatico ed agiscono su penicilline e cefalosporine, invece le β-lattamasi nei batteri Gram
positivi sono esocellulari ⇒ vengono liberate nell’ambiente extracellulare e sono generalmente attive principalmente sulle
penicillina, si parla infatti di penicillinasi, quindi rompono l’anello β-lattamico che si trova all'interno della formula di
struttura della penicillina, mentre sono meno attive sull’anello β-lattamico che si trova all'interno dei carbapenemi, piuttosto
che sulle cefalosporine. Quando le β-lattamasi che si distinguono in base al loro sito catalitico, quindi anche questi enzimi
che vengono prodotti dai batteri possono avere un sito catalitico capace di riconoscere tipologie di farmaci diversi oppure
possono avere uno spettro più stretto agiscono solo sull’anello β-lattamico delle penicilline. Quando le β-lattamasi hanno
uno spettro molto ampio diventano molto pericolose perché significa che hanno il potenziale per inattivare qualsiasi tipo di
farmaco β-lattamico.

Una categoria di questa β-lattamasi, ma esistono dei ceppi che vengono chiamati New Delhi → si tratta di microrganismi
enterobatteri, che sono la specie Klebsiella pneumoniae, in grado di produrre una metallo-beta-lattamasi che è ad ampio
spettro ed è capace di scendere la quasi totalità dei farmaci β-lattamici. Il primo paziente al quale è stato isolato questo ceppo
di Klebsiella pneumoniae resistente a quasi tutti i farmaci β-lattamici.

In Toscana gli enterobatteri New Delhi, soprattutto negli ospedali Pisani, hanno visto negli ultimi anni un incremento →
Klebsiella pneumoniae che veicola questa β-lattamasi ad ampio spettro codificata dal gene NDMI.

Incremento di casi tra il novembre 2018 e il 2020 nell’ultima stima dello studio effettuato dalla Regione Toscana sono stati
evidenziati batteri New Delhi ⇒ caratterizzati da questo profilo di farmaco-resistenza nel sangue di 238 pazienti, con casi con
sviluppo di patologie molto gravi che sono risultate letali nel 25% di questi pazienti che avevano sepsi, ciò infezione
disseminata. Questi batteri non sono tanto più virulenti rispetto a Klebsiella pneumoniae, però il problema è che per questi
meccanismi c'è una difficoltà nel poter riscontrare dei farmaci utilizzabili per il loro trattamento ⇒ c'è un’attenzione particolare
nel monitoraggio di questi microrganismi e delle infezioni che comportano nell’ambito ospedaliero.

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 INIBITORI DELLE β-LATTAMASI

Oltre a somministrare si potrebbe pensare di formulare un’antibiotica in modo tale da somministrare contestualmente al
farmaco β-lattamico un inibitore delle β-lattamasi, come per esempio l'acido clavulanico, sulbactam, tazobactam che
viene complessato nella formulazione di antibiotico ⇒ abbiamo un antibiotico che è composto da due porzioni il farmaco β-
lattamico, che è quello che va ad agire sulle penicillin binding proteins, impedendo la formazione del legale crociato, del
legame glucosidico oppure la rimodulazione della parete e l’inibitore della β-lattamasi che con un meccanismo, che viene
definito suicida, si immola alla causa e va a legare la β-lattamasi in modo tale che → se il batterio produce la β-lattamasi
l’inibitore della β-lattamasi si complessa con la β-lattamasi, la toglie di mezzo e la rende in quel modo impegnata in un'altra
interazione e libera il farmaco β-lattamico per andare ad agire sul suo effettivo meccanismo d'azione.

Una strategia per controbattere alla resistenza ai farmaci β-lattamici, derivata dalla produzione di β-lattamasi, è quella di
utilizzare contestualmente all’antibiotico un antibiotico suicida (come l'acido clavulanico) che, quando viene assunto, ha il
compito di attirare su di sé con un meccanismo suicida l'azione della β-lattamasi lasciando libero di agire il farmaco β-lattamico
⇒ l'acido clavulanico lega la β-lattamasi, entrambi perdono la loro funzionalità (ecco perché il meccanismo suicida) mentre il
farmaco β-lattamico è libero di agire.

Come potrebbe controbattere a questo il batterio? Potrebbe iper produrre la β-lattamasi ⇒ una parte legherà l’antibiotico
suicida ed una parte alla fine legherà comunque l’antibiotico β-lattamico oppure potrebbe mutare la sua β-lattamasi e non
renderla più affine con l’antibiotico suicida, e quindi concentrare tutta la sua azione sul farmaco β-lattamico.
L'acido clavulanico è quello che è più comunemente utilizzato e di solito viene associato alle penicilline di solito ed è
impiegato quando si sospetta il coinvolgimento di batteri in grado di produrre β-lattamasi → viene utilizzato normalmente con
l’amoxocellina, utilizzato come sale di potassio, cioè clavulanato di potassio in combinazione con l’amoxocillina.
È l’Angumentin.

Che cos'è un antibiotico suicida? spiegare a che cosa serve, perché, quando viene utilizzato e qual è il meccanismo di azione.

GLICOPEPTIDI

I glicopeptidi sono anch'essi impegnati nella fase di polimerizzazione del peptidoglicano, cioè nella fase quindi in cui avviene
il legame di transpeptidazione, perché i glicopeptidi come la vancomicina o teicoplanina si legano al dimero D-alanina D-
alanina. Nel pentapeptide che è legato al bactoprenolo ed impediscono la reazione di transpeptidazione.
I batteri Gram negativi generalmente risultano intrinsecamente resistenti a questa categoria di farmaci perché la molecola dei
glicopeptidi è molto grande e la membrana esterna non riesce a far passare queste molecole molto grandi ⇒ normalmente
vancomicina e teicoplanina sono utilizzate nel trattamento delle infezioni da batteri Gram positivi, in particolare vengono
considerati come farmaci salvavita nelle infezioni gravi da Staphylococcus aureus meticillino-resistente.

La resistenza si sviluppa acquisendo dei geni, quindi questo ci suggerisce che potrebbe essere mediata da plasmidi ⇒
trasmissione orizzontale informazioni genetiche che sintetizzano i precursori a bassa affinità.

Meccanismo d'azione della vancomicina: la vancomicina lega il dimero D-alanina D-alanina e non si ha più il distacco
della D-alanina terminare e non si possono più fermare i legami crociati.

Si ha la resistenza alla vancomicina quando il microrganismo reagisce sintetizzando un precursore che porta alla sostituzione
dell’ultima D-alanina con un D-lattato, che ha una minore affinità rispetto alla D-alanina con la vancomicina che quindi non si
lega più. Questo ultimo elemento (il D-lattato) non è fondamentale perché viene eliminato con la formazione del legame
crociato, quindi la suscettibilità di stafilococchi ed enterococchi, per esempio, all’azione della vancomicina sale enormemente.
Un ceppo resistente alla vancomicina ha un valore di MIC (indica la minima concentrazione inibente di un antibiotico) di 1
μg/ml o 1 μg/l contro 32 ⇒ ha una suscettibilità 32 volte più alta dei ceppi che presentano questa sostituzione.

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 LA MEMBRANA CITOPLASMATICA

La membrana citoplasmatica segue, anche nei batteri, il modello del mosaico fluido, quello per il quale la membrana si
organizza in un doppio strato all'interno del quale troviamo delle proteine.
Si possono trovare una serie di proteine che, in base alla loro estraibilità, possono essere divise in:
o Proteine periferiche-citoplasmatiche → sono quelle in prossimità della membrana, solubili generalmente in acqua,
facilmente estraibili perché debolmente ancorate al doppio strato fosfolipidico e rappresentano circa il 20-30%.
o Proteine integrali transmembrana → queste proteine attraversano integralmente lo spessore del bilayer lipidico,
generalmente non sono solubili in acqua, sono poco estraibili e rappresentano il 70-80%. Le proteine transmembrana
per essere inserite all'interno del doppio strato fosfolipidico lipidico devono avere una struttura anfipatica, cioè una
porzione idrofobica che è quella inserita del bilayer lipidico, mentre quella idrofilica è quella che si proietta sia verso il
citoplasma che verso l'ambiente extracellulare. Nei batteri non sono frequenti i movimenti a flip-flop o di rotazione,
piuttosto le proteine diffondono lateralmente.

I lipidi sono fosfolipidi anfipatici, hanno delle estremità polari (idrofiliche), che interagiscono con l'acqua, e poi hanno invece
una porzione terminale non parlare (idrofobica), che è insolubile d'acqua e tendono ad associarsi con questa tipica formazione
del bilayer idrofobico.
Diversamente dagli acidi grassi, che generalmente sono molto flessibili, gli steroli e gli opanoidi sono delle molecole planari e
rigide che conferiscono alla membrana una certa struttura ed una certa rigidità, pur essendo una struttura plastica.

Gli steroli che troviamo nella membrana degli eucarioti, e che ritroveremo nella membrana dei microrganismi degli eucarioti,
ad esempio quando studieremo i fughi, è generalmente assente dalla membrana dei procarioti con alcune eccezioni (che sono
per esempio trovare rappresentate da Archea come i metanogeni e alcuni eubatteri, come i micoplasmi). Nei procarioti gli
steroli vengono sostituiti, nella loro funzionalità dagli opanoidi, che sono sintetizzate a partire dagli stessi precursori degli
steroli. In molti archea gli opanoidi sono assenti.
Gli opanoidi sono presenti in molti eubatteri e la loro massa nei sedimenti viene stimata nell’ordine di 1011-12 tonnellate e
hanno fornito un contributo molto vasto nella formazione del petrolio. I lipidi possono essere molto diversi e questo può essere
sfruttato dalla tassonomia batterica perché ci permettono di discriminare alcuni batteri da altri facendo quello che si chiama
un lipidogramma → cioè un tipo di studio che consente di stabilire la composizione lipidica di una determinata microrganismo.
La composizione lipidica presente a livello di membrana di un determinato batterio è un'entità dinamica, non rimane fissa,
perché può cambiare in risposta al cambiamento di parametri ambientali importanti, come può essere ad esempio la
temperatura perché la composizione chimica deve adattarsi in modo tale da far sì che la membrana rimanga sempre un
mosaico fluido (→ quindi se le temperature si spingo verso temperature più alte la composizione chimica deve cambiare per
evitare che la cellula vada incontro alla fusione).

Se nella membrana degli eubatteri si possono troviamo tutte caratteristiche riconducibili, con l'eccezione dello sterolo che è
sostituito dall’opanoide, negli Archea abbiamo una caratteristica distintiva. Nella membrana sono presenti caratteristiche
distintive, sia per il tipo di lipidi che troviamo, sia per il legame con cui i lipidi vengono uniti al glicerolo.

Negli eubatteri/eucarioti gli acidi grassi sono legati al glicerolo con un legame esterico, negli Archea invece le catene
ramificate, che hanno una composizione molto particolare, sono legate al glicerolo con un legame etere. Di solito negli Archea
troviamo dieteri, cioè eteri che sono costituiti da catene ramificate di idrocarburi che di solito arrivano a 20 atomi di carbonio.
In alcuni Archea i due gruppi del glicerolo sono uniti sempre dal legame etero a degli idrocarburi lunghissimi che hanno anche
40 atomi di carbonio. Pur avendo 40 atomi di carbonio questa struttura dei tetraeteri a 40 atomi di carbonio fa sì che si formino
degli anelli pentaciclici, per cui di fatto l’anello pentaciclico fa sì che lo spessore del bilayer lipidico non aumenti → è come
se si arrotolasse la struttura degli idrocarburi e quindi rimanesse nello spessore che è consentito per la formazione bilayer
lipidico.

Le classi più rappresentative sono i dietri (per esempio il fitanile che ha 20 atomi di C). Nel caso del fitanile è possibile
osservare che presenta una struttura che ricorda il doppio strato fosfolipidico, quando invece abbiamo il bifitanile, quindi
quando sono preseti catene composte da 40 atomi di C, la conseguenza è la perdita della struttura di bilayer → e si ha piuttosto
un monolayer.
La struttura più plastica tra le due è quella del bifitanile, in quanto si tratta di una struttura meno plastica che si oppone a
variazioni ambientali che possono essere estremamente destabilizzante.

Nonostante le notevoli differenze nella componente lipidica, la membrana degli Archea presenta due facce idrofiliche, con una
regione idrofobica interna come gli Eubacteria; però:

a) Nel “dietere”: la membrana che si forma ha la struttura di un regolare bilayer

b) Nel “tetraetere”: la membrana che si forma ha la struttura di un monolayer ed è molto più rigida → tale rigidità consente
di rispondere a stimoli che possono essere devastanti per batteri che hanno un normale bilayer lipidico, come accade
negli Archea ipertermofili.

33
Negli Archea Ipertermofili (temperature ottimali di crescita superiori ad 85° C) sono presenti solamente tetraeteri, stabili e
non deformabili.
Gli Archea ipertermofili sono adattati a vivere a temperature molto elevate, e non in ambienti con temperature basse.
Più spesso, gli Archea hanno membrane miste composte da di- e tetra- eteri (non nel caso degli Archea ipertermofili) a
organizzare quindi un bilayer lipidico nella maggior parte della struttura e in alcuni punti invece, per rinforzare la struttura, è
possibile trovare dei tetraeteri.

MESOSOMI

Sono delle estrusioni della membrana cellulare all’interno della cellula. Nei mesosomi si svolgono funzioni cellulari differenziate,
in modo “compartimentalizzato”. Alcuni mesosomi possono variare di numero e di forma a seconda delle condizioni fisiologiche
della cellula.

Esempi di funzioni associate sono: il mesosoma settale → che diventa fondamentale quando la cellula deve diversi, perché
deve dare origine a due cellule figlie, e quindi comincerà con delle invaginazioni della porzione centrale (che porteranno dietro
anche la parete cellulare) e si avvicineranno sempre di più verso il centro della cellula per portare al completamento della
divisione cellulare.
Mesosoma laterale in Bacillus → si ha un tentativo di strozzatura della vescicola a cercare di creare un compartimento
isolato.
Mesosoma fotosintetico (clorosoma) → costituito da lamelle tilacoidi pluristratificate che occupano tutta la cellula in
Nitrocystis oceanus. Mesosoma sporale → è una invaginazione della membrana che, non avviene al centro della cellula, ma
in una posizione asimmetrica verso l’apice cellulare, questo processo porterà verso la formazione di un ambiente racchiuso
all’interno di questo mesosoma sporale, all’interno del quale si svilupperà la spora batterica.
La membrana, mancando veri e propri organi intracellulare, è più importante perché svolge tutta una serie di funzioni che
sono fondamentali per la fisiologia, la vitalità e la sopravvivenza. Il batterio sopperisce alla mancanza di funzioni di
compartimentalità del citoplasma diversificando quanto più possibile le proteine.
È la sede di funzioni essenziali per la sopravvivenza delle cellule procariotiche e possiede proteine più diversificate delle
cellule eucariotiche; inoltre, la formazione di sistemi di membrane interne (mesosomi) consente alla cellula procariotica, di
“compartimentalizzare” alcune attività cellulari e/o metaboliche.
Funzioni associate alla membrana nei procarioti:

Fotosintesi: associata a membrane tilacoidali organizzate (clorosomi);

Biosintesi fasi terminali della biosintesi di macromolecole che costituiscono gli involucri esterni della cellula (mureina,
componenti capsulari, molti lipidi, LPS);
Respirazione: sede di proteine citocromiche e non per il trasporto di elettroni;
Divisione cellulare: il mesosoma settale è sede dell’origine della replicazione del genoma ed innesca il processo di
separazione delle cellule figlie;
Differenziamento dell’endospora: il mesosoma sporale costituisce l’evento morfologico chiave per la produzione
dell’endospora.

Barriera selettiva: conseguenza della composizione lipidica e proteica. Permette lo scambio di acqua, gas e piccole molecole
idrosolubili scarsamente polari (es. ammoniaca, urea, glicerolo), ma è impermeabile a ioni, composti polari, grandi molecole
(per queste... sistemi di trasporto mediante proteine) → si aggiunge, nel caso dei batteri Gram negativi, la barriera selettiva
esercitata dalla membrana esterna.
Produzione di energia: sede principale per la trasformazione di energia in forme utilizzabili dalla cellula (respirazione e
fotosintesi). Generazione di un gradiente ionico trans-membrana (forza protonica motrice), utilizzato dalla cellula per produrre
ATP.
Trasduzione del segnale: percezione degli stimoli esterni, trasmissione del segnale all’interno della cellula e regolazione
dell’espressione genica in risposta allo stimolo. Le proteine responsabili della trasduzione del segnale sono associate alla
membrana con domini esposti nel comparto extracellulare (periplasma nei Gram -) e domini citoplasmatici
Biosintesi di componenti cellulari: biosintesi fosfolipidi, parte dell’LPS, e peptidoglicano. Presenza di dedicati sistemi di
trasporto

• Sede di ancoraggio di molte proteine recettoriali che fungono da sensori per parametri ambientali e sono coinvolte nei
processi di trasduzione del segnale (regolazione dell’espressione genica)
• Sede di proteine coinvolte nei processi di secrezione
• Sede di generazione, accumulo e conservazione di energia come forza protonmotrice tramite ripartizione di carica
ai due lati della membrana
• Sede del trasporto di soluti: funzione dominante, propria di tutte le membrane, è fondamentale per la sopravvivenza
batterica, la cui nutrizione dipende dalla capacità di “catturare” nutrienti nell’ambiente naturale, spesso, oligotrofico

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Lezione del 13/10/20
ANTIBIOTICI CHE AGISCONO SULLE MEMBRANE

Polimixine

Polipeptidi ciclici caratterizzati da un anello peptidico e coda lipofila → e questo è importante per il loro meccanismo d'azione.
Colistina (polimixina E). Antibiotici battericidi, meccanismo d’azione nei confronti di membrana citoplasmatica e membrana
esterna dei Gram - Detergenti cationici interagendo con i fosfolipidi della membrana plasmatica, aumento della permeabilità,
alterazione integrità osmotica, depolarizzazione Meccanismi di resistenza: alterazione membrana esterna Gram negativi.
Una modificazione del lipide A che riduce la carica negativa; presenza di pompe ad efflusso (Yersinia)
Con battericida si intende qualsiasi sostanza capace di distruggere i batteri (spec. Patogeni); e con batteriostatico si intende
che è relativo alla batteriostasi, cioè all’arresto dello sviluppo di un ceppo batterico.

Perché dovremmo somministrare un antibiotico batteriostatico? Il farmaco batteriostatico è molto utile perché evitando la
replicazione dei batteri, quindi che aumentino considerevolmente in numero, dà il tempo al nostro sistema immunitario di
eradicare l'infezione. Un farmaco batteriostatico può essere sufficiente ad eradicare l’infezione perché il nostro sistema
immunitario, essendo presenti solo un numero limitato di batteri, riesce ad avere la meglio.

Se invece l’antibiotico è battericida, come in questo caso, lisa la cellula batterica provocandone la morte → questo è
possibile perché possiedono dei target sulle membrane. Le polimixine, come la colistina, hanno un’azione sulla membrana
citoplasmatica, ma hanno anche un’azione disgregante sulla membrana esterna dei Gram negativi. La loro natura fa sì che si
comportino quasi da detergenti cationici, andando a interagire con i fosfolipidi degradandolì e causando un improvviso
aumento della permeabilità della membrana → che ha ricadute sull’integrità della membrana e quindi sulla protezione verso
la lisi osmotica insieme alla parete. Una depolarizzazione della membrana porta molto frequentemente a morte la cellula
batterica.

Un batterio per resistere potrebbe alterare la membrana esterna, siccome sono detergenti cationici (quindi vuol dire che sono
carichi positivamente), se si hanno delle modificazioni, per esempio, nella struttura del lipide A nei batteri Gram negativi, che
comportano una produzione di un nuovo lipopolisaccaride che è caratterizzato da una minore carica negativa in valore assoluto,
la polimixina sarà attratta con minore avidità della superficie batterica.
Un altro meccanismo prevede la presenza di pompe ad efflusso che sono delle proteine transmembrana che, a spese di ATP,
estrudono il farmaco eventualmente internalizzato → il farmaco una volta che è riuscito a passare e ad arrivare al livello di
membrana viene espulso attivamente. Questo, per esempio, in Yersinia pestis che è l'agente eziologico della peste.

Lipopeptidi (Daptomicina)

In presenza di ioni calcio, forma micelle inserendosi nella membrana con la coda lipofila e creando dei veri e propri pori che
causano depolarizzazione, perdita di ioni potassio e conseguente morte cellulare.
Meccanismi di resistenza: poco noti. Si pensa a mutazioni che risultano in una alterazione della carica elettrica superficiale
(da negativa a positiva).

I lipopeptidi, come la daptomicina vengono prodotti da Streptomyces roseosporus e sono utilizzati per esempio
nell’infezione da batteri multi-resistenti che prevedono una resistenza, per esempio alle penicilline, alle cefalosporine ecc.
Questo polipeptide per poter agire, in modo da disgregare la membrana cellulare, ha bisogno di complessarsi con il calcio
extracellulare. In presenza di calcio cambia struttura, complessandosi con lo ione calcio, e dà origine a dei canali che si
inseriscono all'interno del bilayer e che provoca una depolarizzazione, con perdita di ioni potassio → anche in questo caso la
depolarizzazione della membrana porta a morte la cellula batterica. In questo caso per la daptomicina i meccanismi di
resistenza non sono molto conosciuti, si pensa che abbiano a che fare con una riduzione della carica elettrica negativa
superficiale.

35
Polieni (anfotericina e nistatina)

Agiscono formando dei complessi con gli STEROLI di membrana → attivi su

cellule eucariotiche. Interazione con gli steroli di membrana causa aumento
della permeabilità della membrana stessa con alterazione del gradiente
protonico e fuoriuscita di ioni potassio Usati per il trattamento delle infezioni
fungine (batteri meno suscettibili). Elevata tossicità.

Uno dei farmaci che è utilizzato soprattutto per esempio per le infezioni
fungine è l’anfotericina è un farmaco polienico. Agisce soprattutto sui funghi
perché forma dei complessi con gli steroli di membrana, e noi abbiamo detto
che i batteri non hanno steroli ma generalmente hanno opanoidi, quindi nei
funghi si legano allo sterolo di membrana, l’ergosterolo, con un’affinità
maggiore rispetto al colesterolo che è presente nelle cellule eucariotiche
superiori.

L'interazione con lo sterolo di membrana comporta di nuovo la creazione di alterazioni della struttura, con formazione di
canali, che come fine ultimo comporta un’alterazione totale del gradiente protonico, la fuoriuscita di ioni che non è più
compatibile con la vita. Il down side di questo tipo di farmaco è che ha una elevata tossicità, è comunque compatibile con
il trattamento nell’uomo, è un farmaco nefrotossico e quindi deve essere inserito in apposite formulazioni per far sì che si
riduca il più possibile la tossicità.

Peptidi antimicrobici

Sono in grado di esercitare un effetto battericida nel giro di pochi minuti, in 5 minuti sono capaci, per esempio, di abbattere
completamente una carica batterica. L’effetto dibatteriocidiasi definisce quando si ha una riduzione di tre logaritmi rispetto a
un controllo non trattato con il peptide dello stesso microrganismo → se io ho una carica batterica di 106 cellule per ml ottengo
l'effetto battericida quando riduco la carica batterica di tre logaritmi, quindi se arrivo a 10 3 batteri per ml. Quel range di tre
logaritmi se si osserva contraddistingue la batteriocidia.

Questi piccoli peptidi sono prodotti da organismi che troviamo a tutti i livelli della scala evolutiva organismi, dai protozoi, negli
insetti, negli anfibi, nei rettili, nei mammiferi, nelle piante e anche nell’uomo → tutti questi organismi della scala evolutiva
svolgono un ruolo importante in quello che viene chiamato sistema immunitario innato.
I peptidi antimicrobici, che possono essere anche chiamati peptidi dell'immunità naturale, sono isolati da tantissime
categorie di organismi.

Dagli insetti:
o Drosofila → drosofila melanogaster
o cecropins,
o drosocin,
o diptericin,
o drosomycin

Dagli anfibi: → la cute degli anfibi è ricchissima di peptidi antimicrobici

o Esculentin,
o temporins,
o bombinins

Dei mammiferi:
o Protegrines → sono la categoria di peptidi dell’immunità naturale che si trovano nei suini
o Bactenecines → sono la categoria di peptidi dell’immunità naturale che si trovano nei bovini
o defensins, cathelicidines, histatins, and hepcidins → sono la categoria di peptidi dell’immunità naturale che si trovano
nell’uomo

Di fatto i peptidi antimicrobici altro non sono che piccole molecole (costituite da 12-100 aminoacidi) che hanno due
caratteristiche importanti che spiegano il loro meccanismo d'azione: il primo è quello di avere una carica netta positiva,
quindi in virtù della sua composizione amminoacidica, se è presente un eccesso di amminoacidi basici rispetto a quelli acidi
presenteranno una carica netta che può variare all'incirca tra +2 e +11; l’altra caratteristica fondamentale è il fatto di essere
molecole anfipatiche, cioè avere una struttura tridimensionale che espone una porzione idrofobica e una idrofilica che
consentiranno di intercalarsi perfettamente all'interno del bilayer della membrana.

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I peptidi cationici sono piccole catene amminoacidiche caratterizzate da una carica netta positiva, quindi interagiranno con
delle strutture che saranno cariche negativamente. Nei batteri Gram negativi tali strutture sono rappresentate da acidi teicoici,
teicuronici e lipoteicoici → oltre ad essere dei determinanti antigenici, essendo molecole acide risultano essere cariche
negativamente. Con queste strutture c’è un’interazione solamente elettrostatica, non ci sono legami covalenti, quindi è la
superficie che attrae, con la sua carica netta negativa, il peptide carico positivamente.

Nei batteri Gram negativi tali strutture sono rappresentate dal lipopolisaccaride e in particolar modo la porzione è il lipide A,
a questo punto attratti da queste interazioni elettrostatiche vanno verso la membrana cellulare che grazie alla presenza di
fosfatidilcolina ecc. ha comunque una carica negativa. Il peptide antimicrobico dopo aver attraversato la parete, attratto da
questa carica netta negativa, raggiunge la superficie della membrana, e qui entra in gioco la seconda caratteristica ovvero
l’anfipaticità, che fa sì che il peptide penetri all'interno della membrana polimerizzando e creando dei pori che possono essere
di diversa natura → possono essere ordinati come quello rappresentato in figura che si chiama struttura a botte inserito
all'interno della membrana con un lume che comporta la fuoriuscita. È come se la membrana cellulare venisse crivellata di
fuori dai quali si ha la perdita dell'integrità.

Questo modo di agire è un modo estremamente rapido perché non ci sono interazioni con target intracellulare → arriva sulla
superficie, viene attratta dalla parete, raggiunge la membrana si inserisce crea un poro e distrugge in questo modo la cella
batterica.

Ci sono anche altri tipi di peptidi antimicrobici, o peptidi cationici se si vuole appoggiare l'attenzione sulla carica positiva, che
agiscono con un target intracellulare, in questo caso la tempistica con cui agiscono è diversa perché ci vuole più tempo per
arrivare all'interno della cellula e poi modificare l'espressione genica → questi peptidi agiscono in un lasso temporale un po’
più lungo.

I peptidi che lisano direttamente la membrana agiscono in pochissimo tempo e sono interessanti perché:
o Prodotti da una varietà di organi e tessuti di organismi diversi appartenenti a vari livelli della scala evolutiva
o Rappresentano importanti componenti dei meccanismi di difesa dell’immunità naturale nei confronti degli agent infettivi
o Piccole molecole (da 12 a 50 amminoacidi), dotate di una carica netta positiva (da +2 a +11)
o BERSAGLI MOLECOLARI (interazioni elettrostatiche con la superficie microbica):
1. Membrana cellulare
2. Target intracellulare

37
Le caratteristiche dei peptidi antimicrobici
o Dotati di attività antimicrobica ad ampio spettro → colpisce indistintamente batteri Gram positivi e Gram negativi
perché entrambe le superfici si contraddistinguono per una carica netta negativa che attrae il peptide carico
positivamente
o Rapido meccanismo d’azione → soprattutto quando ha come target la lisi della membrana
o Attivi verso microrganismi multi-resistenti ai farmaci → perché qualsiasi sia il meccanismo di difesa del batterio, che
sia legato ad esempio all’estrusone del farmaco, essendo piccoli arrivano velocemente ed agiscono non consentono al
batterio di sviluppare resistenza
o Attività sinergica con farmaci convenzionali → può essere utilizzato in combinazione con un farmaco convenzionale
o Bassa frequenza nella selezione di mutanti resistenti → perché tutte le cellule vanno in contro a morte molto
rapidamente

Strutturalmente, in base alla natura degli aminoacidi che le compongono, possono avere una struttura ad α-elica, a foglietto
β, possono avere delle strutture allungate oppure possono avere delle strutture miste, quindi per esempio la β defensina
umana si contraddistingue per una preponderanza di struttura a foglietto β, la magaimmina per esempio un peptide che è
invece ad α-elica, la proterina-1 (che è isolata dai suini) ha una struttura mista.
L'attività di questi peptidi non si limita a perforare la struttura della membrana, se hanno target intracellulari possono
coinvolgere funzioni molto importanti per la fisiologia microbica, come la sintesi del DNA e degli acidi nucleici, la sintesi
proteica, interferire con la biosintesi della parete, con la divisione → possono interferire anche con target intracellulare.

Batteriocine

Le batteriocine, prodotti da batteri Gram positivi (ad ampio spettro) e da batteri Gram negativi (che hanno uno spettro più
ristretto), possono avere un’azione o batteriostatica o battericida, sono spesso associati a plasmidi.

Tali plasmidi associati alle batteriocine possono essere di III classi:

I. I cosiddetti lantibiotici → sono così chiamati perché presentano amminoacidi al loro interno, che non sono
tradizionalmente usati per la sintesi proteica, come lantionina e b-metil lantionina oltre a residui deidratati, quindi
esempi di questi lantibiotici sono la NISINA, la lattacina 481, la lattococcina S e la carnocina U149.
II. Altri peptidi, di piccole dimensioni (< 10 kDa), che sono stabili se si riscalda a trattamenti termici non eccessivi, sono
costituiti da amminoacidi non modificati.
III. Sono proteine termosensibili di dimensioni >30 kDa. Appartengono a questa classe di batteriocine le batteriolisine
(spesso azione idrolitica sulla mureina).

La nisina va a formare direttamente un complesso con il lipide II, che è un elemento

chiave a livello della biosintesi della parete localizzata nella fase di membrana (dove il
bactoprenolo prende in consegna i vari elementi, prima formando il lipide I e poi il
lipide II, che è l'ultimo step). La nisina legandosi al lipide II, non solo non consente la
traslocazione e la consegna del monomero alla parete in crescita, ma il complesso
lipide II-nisina si aggrega creando dei veri e propri fuori al livello della membrana.

Perché abbiamo pochi farmaci al bancone in farmacia da poter prendere ed utilizzare

in sostituzione agli antibiotici? Perché se sono promettenti in vitro, cioè quando
vengono testati in condizioni di laboratorio, quando pensiamo di poterli applicare in
vivo ci troviamo di fronte a degli ostacoli che riguardano la composizione dei nostri
fluidi biologici che hanno per esempio concentrazione di Sali. Se nel fluido biologico
fossero presenti dei Sali potrebbero mascherare la carica del peptide rendendolo così
meno efficace e meno capace di legarsi alle superfici target; nel siero, per esempio,
abbiamo delle proteine che sono cariche negativamente, come la sieroalbumina, che
potrebbe sottrarre per interazione elettrostatica il peptide e quindi non renderlo più
disponibile per andare a legarsi con il suo target batterico. Infine, la presenza di
proteasi nei nostri fluidi biologici, cioè la presenza di enzimi che hanno attività
proteolitica → scinde la struttura del peptide rendendolo ancora una volta indisponibile
per il legame con il suo target.

Alcune di queste problematiche si possono risolvere usando delle formulazioni, per esempio che cosa potremmo mettere
insieme ad un peptide antimicrobico che deve esser utilizzato per un trattamento topico, quindi per un trattamento localizzato,
in un ambiente che si sa essere presenti diverse concentrazioni di Sali?

Bisogna aggiungere qualcosa di cui assolutamente conosciamo la citotossicità, qualcosa che non sia tossico, ma che consenta
di bypassare il problema delle concentrazioni elevate di Sali. Potremmo aggiungere un chelante, cioè l’EDTA. Il chelante
sottrae ioni bivalenti, ioni positivi, togliendo uno dei problemi che interferiscono con questa interazione.

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 IL PROTOPLASTO (Gram+) / SFEROPLASTO (Gram-)

I principali componenti all’interno della membrana citoplasmatica sono il citoplasma, il nucleoide e i corpi di inclusione.
L’insieme della membrana citoplasmatica e di tutte le sue componenti interne viene definito PROTOPLASTO.

All'interno della membrana citoplasmatica troviamo, tra i componenti principali, il citoplasma all'interno del quale in varie
posizioni sono distribuiti ribosomi, il nucleoide (che è la sede dell’informazione genetica) e i corpi di inclusione, che sono uno
dei tentativi di quelle spinte evolutive verso la compartimentalizzazione cercando di creare, non veri e propri organuli, però
degli elementi che portino qualche vantaggio alla cellula batterica. L’insieme del citoplasma e di tutte le componenti, quindi
tutto ciò che è all'interno della membrana del plasmalemma, viene definito come protoplasto, generalmente per protoplasto
si intende il contenuto della membrana citoplasmatica in un batterio Gram positivo, mentre sferplasto viene chiamato quello
dei batteri Gram negativi.

I batteri hanno un citoscheletro? La presenza di un simil citoscheletro è stata dimostrata anche nei batteri grazie a studi
molecolari che hanno consentito di identificare dei geni omologhi, codificanti per proteine che non sono uguali ma, che
svolgono la stessa funzione, cioè quella di creare dei filamenti degli pseudo-microtubuli (microfilamenti, filamenti intermedi e
microtubuli) che hanno un compito all'interno della cellula procariotica, del tutto simile a quello che il citoscheletro
propriamente detto svolge nella cellula eucariotica → cioè divisione cellulare, contribuire al mantenimento della forma cellulare,
guidare il trasporto e localizzazione intracellulare di proteina.

Alla domanda: “esiste un citoscheletro nella cellula procariotica?” → la risposta è sì ed è un citoscheletro organizzato in modo
simile a quello delle cellule eucariotiche superiori, in cui ritroviamo dei corrispettivi della tubulina dell'actina o dei filamenti
proteici che consentono di svolgere le funzioni principali.

Nel citoplasma, all'interno del prontoplasto, troviamo i ribosomi. I ribosomi sono molto densamente imapacchettati nella
cellula si trovano localizzati nel citoplasma, ma anche in prossimità della membrana citoplasmatica. Sono costituiti da rRNA e
da proteine ribosomali, e sono formati da due subunità che sono un pochino diverse.
- Subunità 50S: rRNA 23S + rRNA 5S + 34 proteine ribosomali
- Subunità 30S: rRNA 16S + 21 proteine ribosomali

Per un coefficiente totale di sedimentazione di 70S, che non è dato dalla somma.

È stato utilizzato per uno dei primi studi sulla filogenesi, in particolare per la formulazione delle ipotesi dei tre domini →
costituisce quindi il cardine molecolare dei nuovi studi di tassonomia e di filogenesi.
È il gene che viene studiato quando, per esempio, che viene sequenziato quando bisogna definire il microbioma intestinale,
cioè sapere la composizione della flora intestinale della quale magari solamente l’1-2% dei microrganismi sono coltivabili. Con
gli studi di metagenomica oggi si sequenzia il gene per l’rRNA 16S, che ancora uno dei geni più utilizzati per gli studi di
tassonomia.

Sono la sede della traduzione dell’mRNA

Distinguiamo le funzioni in base alla localizzazione, quindi se sono ribosomi che troviamo immersi nella matrice è probabile
che le proteine che vengono sintetizzate saranno quelle a localizzazione citoplasmatica, se invece i ribosomi si ritrovano più a
ridosso della membrana le proteine potrebbero essere esportate oppure potrebbero essere coinvolte in ruoli importanti a
livello della membrana, rimanere nella sede della membrana.
Ribosomi della matrice: sede della sintesi di proteine destinate a rimanere residenti nel citoplasma.
Ribosomi di membrana: sede preferenziale della sintesi di proteine destinate ad essere esportate all’esterno.

Trascrizione e traduzione nei procarioti sono accoppiate e sono organizzate in catene polisomiche, perché l’mRNA si lega a
ribosomi liberi e forma più per lo stesso mRNA, cioè il messaggero non si lega ad un solo ribosoma e viene tradotto tutto.
Ogni 80 nucleotidi circa si lega un ribosoma, una subunità 70 totale, e ciascuno produce il suo polipeptide che successivamente
si conformerà nel modo corretto, grazie all’intervento di chaperonine. Nei batteri si assiste alla trascrizione di veri e propri
interi operoni → è un sistema che contiene più geni controllati da un unico promotore, quindi quando viene attivato questo
produttore si attiva la trascrizione di tutti quei geni che fanno parte dell'operone, quindi gli mRNA sono detti poli-cistronici.

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UNITA’ DI TRASCRIZIONE: nei procarioti, vengono trascritti interi operoni, contenenti più geni sotto il controllo di uno stesso
promotore: gli mRNA sono poli-cistronici.

L’organizzazione di geni in operoni è tipica dei Bacteria. Il numero di geni presente in un operone è variabile (2-15 geni).
Generalmente i geni di un operone codificano per proteine con funzioni correlate tra loro (es. enzimi di una stessa via
metabolica).
Non è strano che i geni di un operone che vengono trascritti codifichino per delle funzioni che sono correlate, per esempio un
operone potrebbe codificare una serie di enzimi che intervengono in una via metabolica ben precisa. Generalmente i geni di
un operone sono vicini fisicamente, controllati da un unico promotore, tale vicinanza è dovuta ad una selezione per rendere
più agevole l'attivazione di un determinato pacco metabolico.
Così come, per esempio, si trovano vicini i geni che codificano per fattori di virulenza in quelle che vengono chiamate isole di
patogenicità, spesso si ritiene che siano state acquisite per un trasferimento genico orizzontale.

INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA

Le categorie di farmaci che sono utilizzabili e che vanno ad interagire con la sintesi proteica.

→ Se non si forma il legame peptidico si ha un

arresto della catena polipeptidica in
accrescimento e di conseguenza la cellula che
non potrà più produrre le sue proteine andrà in
contro a morte.

→ Se non avviene la traslocazione sul ribosoma

si va a bloccare la sintesi proteica.
È uno di quei farmaci che non segue il consueto
schema dei 7 giorni, come avevamo visto per il
Monuril. L’azitromicina fa sì che, con una
assunzione giornaliera di 500 mg, si possa
controllare la replicazione utilizzando un
trattamento antibiotico più abbreviato, di soli 3
giorni rispetto ai 5-7 che si utilizzano con gli
altri antibiotici.

Streptomicina, e con essa gli amminoglicosidi (la categoria ai quali appartiene la streptomicina), che comportano una
modificazione strutturale della subunità → si arresta la sintesi proteica.

Le tetracicline, è difficile dire se agiscono sulla subunità 50 o 30 perché, interferiscono direttamente con l’attacco del tRNA
al complesso messaggero-ribosoma, quindi non c'è possibilità di lettura del messaggero e dell’inserimento del corretto
amminoacido corrispondente alla tripletta che viene bloccato.

40
 GRANULI CITOPLASMATICI o CORPI DI INCLUSIONE

o Costituiti da una grande varietà di composti in forma polimerica.

o Sono presenti in numero variabile nella matrice citoplasmatica in forma di granuli liberi o, in un tentativo di
compartimentalizzazione, delimitati da una membrana molto sottile NON unitaria, proteica o lipidica.
o Sono delle entità dinamiche perché la loro formazione dipende da condizioni fisiologiche della cellula e dalla disponibilità
di nutrienti. Le sostanze di riserva sono accumulate in presenza di nutrienti e utilizzate in carenza
o Tramite polimerizzazione/depolimerizzazione dei monomeri costitutivi, i granuli contribuiscono a mantenere
costante l’osmolarità intracellulare e/o acidità intra-citoplasmatica

In base alla loro natura chimica possono essere suddivisi in:

GRANULI ORGANICI: polisaccaridici (granuli di glicogeno), lipidici (granuli di poli-b-idrossibutirrato) proteici (granuli di
cianoficina)

Granuli di glicogeno → sono granuli molto frequenti fatti di glicogeno, quindi rappresentano una riserva energetica, ma
anche una fonte di carbonio. Catene lineari di glucosio [legami α(1-4)] unite da catene ramificate [legami α(1-6)].
Formano granuli dispersi colorabili con soluzioni iodurate (M/O)

Granuli lipidici → sono polimeri di acido poli-β-idrossibutirrico. Sono frequenti e visibili al M/E ma anche al M/O
se colorati con il Sudan nero. Hanno una piccola membrana, NON unitaria, di contenimento.

Granuli di azoto organico (granuli di riserva) → hanno una natura proteica, sono molto meno rappresentati, e sono
costituiti da copolimeri di amminoacidi, come l'acido aspartico e l’arginina. Si trovano solamente nei cianobatteri che si
trovano in ambienti poveri di azoto.

GRANULI INORGANICI: fosfato (granuli di volutina) e zolfo

Granuli di polifosfatoi (Volutina) → costituiti da polimeri di fosfati prodotti in condizioni di sbilanciamento di nutrienti o per
assunzione ridondante di fosfato. Non sempre presenti, possono essere una riserva di fosfato per la sintesi di ATP. Sono
METACROMATICI: NERI al Gram e ROSSI con Blu di Metilene. Ausilio diagnostico per Corynebacterium difteriae
(difterite): le cellule presentano granuli localizzati ai poli quando fatte crescere in terreni ricchi di fosfati.

Granuli di zolfo → granulazioni di S0 rivestite da membrana, transitorie. Prodotte da solfobatteri che ossidano H2S a S0,
e, talora, fino a solfato, con dissoluzione del granulo. L’ossidazione dei solfuri costituisce la fonte di elettroni per organicare
CO2 (solfo-batteri fotosintetici) o la fonte di protoni nei solfo-batteri chemiolitotrofi obbligati.

Magnetosomi → un corpo d’inclusione di composti inorganici che non serve come deposito o come riserva, ma per la
navigazione geomagnetica negli ambienti acquatici (il termine corretto per definire questo tipologia di motilità è
magnetotassi). I batteri acquatici magnetotattici non rispondono solamente a segnali chimici ma si orientano nel campo
magnetico terrestre grazie alla presenza di corpi di inclusione disposti in lunghe catene contenenti magnetite (Fe3O4).
Nell’emisfero boreale, i magnetobatteri si orientano verso il Nord ed in basso, verso sedimenti che potrebbero essere più ricchi
di nutrienti. Nell’emisfero australe l’orientamento è rivolto sempre verso il basso, ma a Sud, con simile risultato.

Vescicole gassose → sono state osservate solamente nei batteri. Sono piccoli corpi inclusi nel citoplasma e delimitati da
proteine che sono impermeabili all’acqua ma non ai gas atmosferici. La loro funzione è quella di conferire la capacità di
galleggiamento. Presenti in molti microrganismi acquatici (es. fototrofi raggiungono aree a maggiore luminosità).

La vescicola gassosa è costituita da una proteina, GvpA, molto conservata nei batteri; GvpA costituisce il rivestimento esterno
della vescicola disponendosi a zig-zag; è una proteina piccola (circa 7000 Da), eccezionalmente idrofobica e rigida.
Sono state descritte anche vescicole gassose costituite da due proteine, delle quali, GvpA costituisce il 97% della vescicola e
ne costituisce la parte esterna; la seconda proteina, GvpC, è interna alla vescicola e “lega” le molecole di GvpA.

41
Lezione del 16/10/20
GENOMA PROCARIOTE

L’informazione genica può essere contenuta o sul cromosoma o su unità di DNA extra cromosomiali, quindi indipendenti dal
cromosoma batterico, che sono i plasmidi. I giene che sono presenti sul cromosoma sono geni che codificano per componenti
strutturali del microrganismo, e quindi per esempio i componenti di parete, geni che codificano per enzimi che sono coinvolti
nelle tappe fondamentali del metabolismo batterico (che sia il metabolismo centrale, quindi l’utilizzazione dei nutrienti, sia la
biosintesi dei nucleotidi, sia tutte quelle proteine che servono per la replicazione del cromosoma batterico e in più tutta una
serie di proteine che codificano per funzioni essenziali per la vitalità del microrganismo).

Tutti questi geni localizzati sul cromosoma batterico vengono definiti geni fondamentali, o nocciolo genico. Ci sono anche
dei geni che non codificano per proteine essenziali per la vitalità del microrganismo, però danno al microrganismo delle
caratteristiche fenotipiche particolari. Possono essere geni che codificano per:
- fattori di virulenza (→ per tutti quei fattori che servono al microrganismo per replicarsi in un ospite);
- resistenza agli antibiotici
- enzimi coinvolti nella degradazione, nell’utilizzo di particolari substrati

Questi geni vengono nel loro insieme chiamati geni accessori e possono essere localizzati sia sul cromosoma batterico sia
su queste unità extra cromosomiche, che sono i plasmidi.
Sul cromosoma ci stanno i geni che costituiscono il nocciolo genico più eventuali geni accessori, nei plasmidi ci stanno solo i
geni accessori più dei geni che servono per la replicazione del plasmide stesso e non del cromosoma.

I batteri sono dei microrganismi aploidi, e questo vuol dire che ogni gene è presente in singola copia, e questo sta a
significare che qualunque cambiamento nella sequenza nucleotidica di un gene che comporti un cambiamento nella sequenza
amminoacidica della proteina che questo gene codifica viene comunque fenotipicamente espressa. Negli organismi diploidi la
mutazione in un allele di un determinato gene può anche non apparire, può risultare non evidente → questo perché se l'altro
allele non è mutato e la proteina, che questo allele non mutato codifica, è funzionale, la presenza di questa proteina funzionale
può eventualmente compensare le conseguenze della mutazione sull'altro allele.

Un altro elemento che è peculiare dei batteri (procarioti), oltre alla presenza di queste molecole accessorie, sono le sequenze
di DNA che vengono chiamate elementi trasponibili, sono delle sequenze di DNA che possono autotrasferirsi da una
porzione di DNA ad un'altra. Questo trasferimento può avvenire sia all'interno della stessa molecola, per cui se il trasposone
si trova sul cromosoma potrà trasportarsi in un altro punto del cromosoma oppure se si trova sul plasmide in un altro punto
del plasmide. Possono anche autotrasferirsi da una molecola all'altra (quindi se sono sul plasmide possono andare sul
cromosoma e viceversa). Il meccanismo delle trasposizioni avviene ad opera di enzimi che sono codificati da dei geni presenti
all'interno di queste sequenze, e può avere degli effetti importanti perché avviene in maniera del tutto casuale e quindi questo
può portare anche all’interruzione di particolari geni, può portare anche all'inserimento in particolari regioni regolatorie con
delle alterazioni nella funzionalità di queste regioni.

42
Solitamente è presente un unico cromosomi circolare, però ci sono delle eccezioni, perché ci sono alcuni microrganismi il cui
genoma risulta essere lineare (sempre di DNA). Ci sono anche dei casi particolari in cui il cromosoma non è uno solo, ma i
geni sono distribuiti su due o più molecole circolari → per esempio il genere Brucella.

L'elemento che contraddistingue i procarioti dagli eucarioti, riguardo le caratteristiche del

genoma/cromosoma, riguarda il fatto di non essere separato dal citoplasma da una membrana. La
porzione del citoplasma in cui ha sede il cromosoma batterico prende il nome di nucleoide, si tratta di
una zona che NON è separata perché non ci sono membrane intracellulari nei procarioti.
Per far entrare tutto il DNA, che risulta avere delle dimensioni maggiori rispetto a quelle della cellula
batterica, il batterio dovrebbe condensarlo → il cromosoma batterico è condensato in maniera tale
da poter essere contenuto all'interno del batterio.

Ciò che contribuisce alla condensazione del cromosoma batterico sono, sia forze entropiche (con questo termine si
intendono le forze che si instauranotra le varie porzioni di una molecola così grande che è comunque costituita da uno
scheletro, delle basi azotate e dei gruppi fosfato), ma anche delle proteine strutturali.
Queste proteine hanno effettivamente un ruolo più strutturale, e sono le proteine SMC (SMC → sta per mantenimento
strutturale del cromosoma), c'è un'altra categoria di proteine che si può associare al cromosoma, che contribuiscono anch’esse
alla condensazione del cromosoma, sebbene il ruolo che queste proteine svolgono, non sia un ruolo strutturale, ma piuttosto
funzionale (un ruolo di tipo regolatorio).

o Unico gene smc o, nei γ-Proteobacteria il gene muk

o Struttura conservata
o Ci sono delle proteine che si legano al DNA e servono per contribuire alla compattazione, quindi hanno un ruolo più
strutturale. Queste proteine, che si presentano sempre in forma di dimero, hanno una porzione amino-terminale che
interagisce, nella struttura del dimero con la porzione carbossi-terminale dell'altra proteina che compone il dimero. Questa
interazione forma un dominio globulare che ha attività ATPasica, perché l'attività di queste proteine richiede ATP. Nel
dimero le due regioni cerniera interagiscono tra di loro ed è questa porzione della proteina, e quindi poi del dimero, che
può cambiare conformazione.

L'altro gruppo di proteine è rappresentato dalle proteine NAP (NAP → proteine associate al nucleoide), che non contribuiscono
alla compattazione/condensazione, ma hanno un ruolo funzionale.
o polipeptidi a basso peso molecolare (sono proteine piccole), presenti in elevate concentrazioni nella cellula
batterica
o ruolo nella regolazione della segregazione del cromosoma e nella progressione del ciclo cellulare
o ruolo nella regolazione dell’espressione genica → in alcune particolari condizioni e in fasi particolari del ciclo di crescita
cellulare o in condizioni particolari di esposizione a specifici stress, l’espressione dei geni codificanti per queste proteine
viene indotta, e quindi aumenta la concentrazione di queste proteine all'interno della cellula batterica e in qualche modo
questo incremento di concentrazione o protegge il DNA oppure contribuisce alla regolazione di particolari set di geni che
possono essere coinvolti in quel particolare tipo di risposta a quel particolare tipo di stress
o aumento della concentrazione durante la fase stazionaria

La proteina Lrp → è un’attivatore trascrizionale ed è in grado di regolare l'espressione di un set molto consistente di geni,
per esempio in Escherichia coli il 10% dei geni è regolato, oltre ad altri fattori, anche da questa proteina Lrp. Questa proteina
è in grado di regolare l'espressione di determinati geni perché riconosce delle regioni specifiche localizzate al livello del
promotore di questi geni → i geni regolati da questa proteina presentano dei siti di riconoscimento e di legame per questa
proteina.

La proteina Dps → questa proteina si lega al DNA in maniera del tutto aspecifica ed è stato osservato che questa proteina
protegge il DNA dallo stress ossidativo o da altre tipologie di danneggiamento a cui il DNA può andare incontro quando la
cellula si trova in particolari fasi di crescita.

La proteina H-NS → questa proteina si comporta da repressore, nonostante ciò, è comunque coinvolta nella regolazione di
tantissimi processi che vanno dalla ricombinazione, alla resistenza ad alcuni tipi di stress, però è una proteina che riconosce
delle regioni ricche in AT.

Come è possibile che l'attività di queste proteine si traduca poi in una condensazione del DNA?
Grazie alla presenza di porzioni a α-elica queste proteine possono
associarsi al DNA. Quando la zona cerniera cambia conformazione, il
cambiamento conformazionale della zona cerniera si tradisce con un
avvicinamento delle quattro porzioni a α-elica della proteina.
Siccome la proteina interagisce con il DNA, questo avvicinamento
delle regioni a α-elica comporta anche un avvicinamento delle due
porzioni della doppia elica di DNA.

43
 Quello che succede è che grazie all'attività
di queste proteine il cromosoma dalla
forma rilassata passa ad una forma più
compatta in cui ci sono delle proteine SMC
legate in regioni diverse del cromosoma,
e questo legame con il meccanismo che
abbiamo descritto prima comporta la
formazione di anse, che in realtà vengono
chiamate domini.

Il legame, di diverse proteine SMC sulla molecola rilassata, ha come effetto quello di comportare la formazione di anse che
vengono chiamate domini.

Per la compattazione del DNA questo non sarebbe sufficiente perché esiste un ulteriore livello di compattazione che interessa
ciascuno di questi domini. Questo livello di compattazione è dato dal superavvolgimento della doppia elica del DNA. All'interno
di ogni dominio c'è una situazione di equilibrio tra la condizione superavvolta e la condizione rilassata, questo è dovuto
all'attività di proteine che non hanno un ruolo strutturale ma hanno un’attività enzimatica. Queste proteine si chiamano
topoisomerasi, la topoisomerasi I che rilassa la molecola e la topoisomerasi II, conosciuta anche con il nome di DNA
girasi, che invece avvolge il DNA.

*Il superavvolgimento è l’avvolgimento della molecola in direzione opposta a quella della doppia elica.

1) La molecola di DNA completamente rilassata presenta l’atteso numero di giri di elica in base alla lunghezza in numero
di basi; cioè sarebbe incompatibile con le dimensioni cellulari.
2) La molecola di DNA viene super-avvolta dalla DNA-girasi (enzima della famiglia delle topoisomerasi), topoisomerasi II,
che produce avvolgimenti negativi*.

Il processo si verifica in diverse tappe:

La molecola di DNA viene piegata (2); viene generata una rottura a doppio filamento nel punto in cui le due catene vengono
in contatto (3); la rottura nella doppia elica viene saldata dal lato opposto a quello dell’elica intatta (4) viene prodotto un giro
di superavvolgimento negativo (5). Il processo continua generando DOMINI DI SUPERAVVOLGIMENTO

3 4 5
1 2

1. IlLa molecola
taglio, prodottodi DNA
dalla completamente
topoisomerasi rilassata
I su un solo filamento,presenta l’atteso
viene effettuato numero
nel punto in cui le di
duegiri dieliche
doppie elicasonoinin
base alla lunghezza
contatto. A questo puntoinunnumero di basi;
enzima provvede ciò sarebbe
a risaldare incompatibile
il taglio, ma questa saldatura con le dimensioni
avviene cellulari
quando una parte di una delle
due eliche passa dal lato opposto rispetto a quello dell'elica intatta → si ha la saldatura.
2. La molecola di DNA viene super-avvolta dalla DNA-girasi (enzima della famiglia delle
Da una situazione a domini rilassati si ottiene una situazione in cui i domini sono superavvolti e una o più proteina SMC
topoisomerasi),
delimitano i confini tdiopoisomerasi
questi domini. I I , che produce avvolgiment i negat ivi* .
Questa struttura per come è stata descritta: le proteine che legano il nucleoide in associazione alle proteine SMC, con un
I l processo si verif ica in diverse t appe:
ruolo strutturale, in associazione con la formazione dei superavvolgimenti → determinano la condensazione del cromosoma
batterico. I confini dei vari domini non sono confini fissi, ma possono variare perché è necessario che a seconda delle
La molecola di DNA viene piegata (2); viene generata una rottura a doppio filamento nel
condizioni ambientali, in cui microrganismo si trova, vengano espressi dei geni piuttosto che altri.
punto in cui le due catene vengono in contatto (3); la rottura nella doppia elica viene
saldata dal lato opposto a quello dell’elica intatta (4) viene prodotto un giro di 44
Il rilassamento, che è funzionale per l'espressione genica, che si verifica
nel contesto dei vari domini è una condizione fondamentale perché
avvenga l'espressione genica, ma è funzionale al tipo di geni che devono
essere espressi in risposta a particolari condizioni ambientali, fisiologiche
o metaboliche.

Le proteine SMC non hanno solo il ruolo di condensare, ma anche quella di

impedire che il rilassamento di quella porzione di cromosoma, che viene
espressa dal batterio in risposta a determinati stimoli e a particolari
condizioni, venga automaticamente propagata a tutti i domini, rendendo
quindi la molecola completamente rilassata.
La presenza di queste proteine SMC e la ripartizione del cromosoma
batterico in domini fanno si che il rilassamento di uno o più, necessari per
rispondere alle nuove condizioni ambientali, a particolari condizioni
fisiologiche o a particolari stress interessi solo quella porzione di
cromosoma che contiene i geni che devono essere espressi, e non sia
propagata al resto della molecola perché provocherebbe la transizione
dell’intero cromosoma ad uno stato rilassato.

Organizzazione genetica del cromosoma batterico

o 500-10000 geni. I genomi più̀ grandi si ritrovano in batteri

ambientali (elevata versatilità̀ metabolica, quindi elevata
versatilità̀ adattativa); i genomi più̀ piccoli si trovano in
microrganismi intracelluari.
o La maggior parte del DNA è di tipo codificante
o Small RNA a funzione regolatoria

Hanno un genoma che di solito è ridotto tradizionalmente quei microrganismi che sono adattati per replicarsi in un contesto
intracellulare hanno dei genomi più piccoli, perché all’interno di una cellula c'è una disponibilità di nutrienti che può non
essere presente nell’ambiente, in più il contesto intracellulare è un contesto relativamente più costante rispetto a quello che
può essere un contesto ambientale. Gli altri due aspetti da tenere presenti è che è vero i genomi dei batteri hanno dimensioni
più piccole, ma la maggior parte del DNA è di tipo codificante. Questo sta a significare che non solo, nei batteri, i geni non
contengono introni ma vuole anche dire che la sequenza codificante di un gene può essere sovrapposta alla sequenza
codificante di un altro gene. Ci sono promotori diversi, anch’essi possono essere parzialmente sovrapposti a un'altra sequenza
codificante, ci sono diversi siti di legame al ribosoma per cui poi cambierà la cornice di lettura e cambiando la cornice di
lettura cambiano poi le proteine che ne derivano. Questa architettura dei geni procariotici, non prevede solo l'assenza di
introni, ma prevede anche il fatto che le regioni codificanti di un gene possono essere sovrapposte, con le regioni poi
parzialmente sovrapposte con le regioni codificanti di un altro gene. Anche nei procarioti ci sono comunque dei piccoli RNA
antisenso che svolgono una funzione regolatoria dell'espressione genica.

Il fatto che i batteri che vivono in particolari nicchie, rispetto a quelli liberi nell’ambiente, abbiano un DNA più è dovuto al
fatto che hanno perso una parte di DNA oppure sono gli altri che l'hanno aumentato rispetto a una condizione ancestrale?

Come cambia è il repertorio genico? Escherichia coli è un microrganismo, un commensale che è presente nella nostra flora
microbica intestinale. Ci sono dei ceppi che sono invece dei ceppi patogeni che possono causare diversi tipi di patologie, che
vanno da delle semplici diarree (nel primo caso determinano uno squilibrio degli scambi elettrolitici con la barriera intestinale
per cui si ha un rilascio massiccio di acqua) a delle forme di dissenteria più gravi.
Questi due ceppi appartengono alla stessa specie e quindi hanno una porzione di geni che è comune, però il ceppo non
patogeno (il ceppo commensale) ha delle sequenze che sono peculiari per questo ceppo, mentre l'altro patogeno ha anch’esso
altre sequenze peculiari che sono, in termini di paia basi, sono quasi 5 volte più grandi rispetto a quello del ceppo non
patogeno. Questo è dipeso dal fatto che questi batteri hanno acquisito, nel corso dell’evoluzione, del DNA proveniente da altri
microrganismi. L'acquisizione di geni presenti in altri microrganismi presente nell’ambiente va sotto il nome di trasferimento
genico orizzontale. In questo caso e si tratta di ceppi che sono divenuti patogeni per l'acquisizione di DNA, proveniente da
altri microrganismi, codificante per delle tossine o per dei fattori che determinano il riarrangiamento del citoscheletro delle
cellule dell’epitelio intestinale, per cui questi questi microrganismi sono divenuti patogeni. Un elemento evolutivo è
l’acquisizione di geni provenienti da altre specie microbiche o da DNA presente nell’ambiente.

45
In altri casi, quando il trasferimento genico orizzontale (quindi l'acquisizione di geni) è un meccanismo che può stare alla
base dell’acquisizione di caratteristiche di patogenicità.

In altri casi, nel contesto dell'evoluzione e nell’adattamento progressivo a un’ospite specifico quello che più frequentemente
si verifica è un'evoluzione di tipo riduttivo → questo vuol dire che nell’adattamento progressivo in un determinato ospite, o
ad un determinato ambiente, il microrganismo può perdere dei geni codificanti per proteine, la cui presenza non è
fondamentale per la sopravvivenza del microrganismo ad un particolare contesto ecologico o in un particolare ospite.

Quindi o si perdono i geni oppure si inattivano dei geni, per accumulo di mutazioni puntiformi, e quindi si originano quelli che
sono chiamati pseudogeni, cioè dei geni funzionali in un microrganismo affine, che può essere un microrganismo ancestrale
o un microrganismo appartenente ad un'altra specie, funzionali ma che sono diventati non funzionali per acquisizione di
mutazioni puntiformi.

Un esempio che può essere rappresentativo può essere costituito da diverse specie che appartengono al genere
mycobacterium → da un punto di vista evolutivo sappiamo che la maggior parte dei micobatteri sono microrganismi ambientali
che stanno nel suolo e che non sono patogeni per l'uomo.

Le specie patogene per l'uomo e per gli animali sono circa una ventina. Di solito l'analisi dei genomi di questi microrganismi
ambientali o patogeni per diversi tipi di ospite ha messo in evidenza, come quei microrganismi che sono ambientali, hanno
dei genomi più grandi di microrganismi che sono patogeni, tra questi per esempio Mycobacterium marinum (ha un genoma
molto più grande), che è un patogeno per i pesci, e il mycobacterium tuberculosis, che è un patogeno per l’uomo che è
responsabile della tubercolosi.

Tra le specie patogene per l'uomo importantissime sono due → Mycobacterium tuberculosis che è l'agente eziologico della
tubercolosi e Mycobacterium leprae che è il microrganismo che causa la lebbra.
Mycobacterius tuberculosis è un microrganismo che rispetto all’ipotetico progenitore ancestrale, che stava nell’ambiente, ha
perduto diversi geni e quindi ha un genoma più piccolo rispetto anche ai micobatteri ambientali. È un microrganismo che si
è evoluto per replicarsi e sopravvivere in una particolare nicchia ecologica che è il macrofago (quindi è un patogeno
intracellulare). È un microrganismo che nonostante si sia specializzato per adattarsi e sopravvivere dentro il macrofago, che
è una cellula del sistema immunitario deputata alla sua distruzione, possiamo coltivare in laboratorio. Mycobacterium leprae
si è talmente specializzato a sopravvivere nell'ospite, che ha perduto molti geni, ha inattivato per mutazione puntiforme
tantissimi geni, per cui è capace di replicarsi in un ospite ma non è più coltivabili in vitro.

Una variazione nucleotidica per potersi tradurre in una variazione dell'aminoacido deve avvenire in una particolare posizione
del codone. Quando si parla di pseudogeni le mutazioni puntiformi, che sono state accumulate, sono talmente tante per cui
è un gene che somiglia ma che o non è più funzionale, oppure se è funzionale non codifica più per qualcosa che avrebbe
dovuto codificare.

GENI OMOLOGHI

I geni omologhi erano quei geni che condividevano un certo grado di somiglianza nella sequenza nucleotidica, in realtà noi
possiamo distinguere in un'ottica evolutiva quelli che possiamo definire geni paraloghi, da quelli che possiamo definire i geni
ortologhi.

Geni paraloghi: sono i geni presenti in un determinato

organismo, evoluti in seguito a eventi di duplicazione di
un gene progenitore in un organismo ancestrale.
L’acquisizione di mutazioni puntiformi può comportare
l’assunzione di funzioni differenti da quelle del gene
originale.
Queste mutazioni che i geni duplicati acquistano,
comporti un’acquisizione di nuove funzioni e una
diversificazione delle funzioni rispetto al gene originale.

Geni ortologhi: geni presenti in specie differenti,

derivanti da un gene progenitore comune in conseguenza
di un evento di speciazione.

46
 Il core genome e il pangenome

Il pangenome è l’insieme complessivo di

tutti i geni presenti nei vari ceppi di una
stessa specie

Il core genome è l’insieme dei geni comuni

ai vari ceppi di una stessa specie

Le isole genomiche

Regioni più o meno estese di genoma di una determinata specie batterica con caratteristiche più simili a quelle di genomi di
altre specie batteriche:
• - contenuto di G+C
• - frequenza di codoni sinonimi
•

Isole ecologiche (ECI, ecological islands): codificano per enzimi degradativi; presenti nei batteri ambientali

Isole di saprofitismo (SAI, saprophytic islands): codificano per sistemi di cattura del rame

Isole di simbiosi (SYI, symbiosis islands): codificano per enzimi coinvolti nella fissazione dell’azoto

Isole di patogenicità (PAI, pathogenicity islands): codificano fattori di virulenza e/o patogenicità, quali tossine, adesine
etc; presenti nei batteri patogeni

Operoni: gruppi di geni parte di una unica unità trascrizionale

o I geni batterici spesso sono organizzati in unità

trascrizionali multicistroniche denominate "operoni” e
controllate dallo stesso promotore
o Il numero di geni presenti in un operone e variabile (2-15)
o I geni di un operone codificano per proteine con funzione
correlata (es. enzimi di
o una stessa via metabolica)
o colinearità dei geni con la sequenza aminoacidica delle
proteine codificate in conseguenza dell'assenza di introni
nei geni batterici

La trascrizione negli Archaea

L’apparato trascrizionale ha somiglianze con quello degli eucarioti

o Maggiore complessità dell’RNA polimerasi (circa 12 subunità assemblate in modi alternativi, implicate nella catalisi,
nell’assemblaggio e in funzioni ausiliarie)
o Introni presenti in alcuni geni
o Insensibilità a rifampicina e ad altri antibiotici che inibiscono la trascrizione dei batteri

I regolatori della trascrizione sono simili a quelli dei procarioti

o mRNA policistronico
o I repressori (regolatori negativi) si legano al DNA in siti presenti sul promotore impedendo l’accesso alla RNA polimerasi;
47
lezione del 30/10/20

Come possono percepire le variazioni che si verificano nell'ambiente e tradurre le variazioni in una risposta adattativa,
coordinata ed organica, che consenta al batterio di far fronte alla nuova situazione in cui si trova.

I batteri hanno evoluto due sistemi che consentono loro di percepire uno stimolo e mettere in atto una risposta adattativa
globale, e perché questa risposta adattativa sia globale è necessario che i geni che sono coinvolti siano espressi in maniera
coordinata. Uno dei meccanismi più utilizzati dai batteri va sotto il nome di sistema di trasduzione del segnale a due
componenti.

Sistema di trasduzione del segnale a due componenti

Gli elementi fondamentali di questo sistema sono due, uno dei due componenti è
deputato alla percezione del segnale e l'altro alla conversione e alla trasmissione del
segnale. I due componenti protagonisti di questo sistema sono la proteina sensore,
una proteina transmembrana inserita nella membrana del batterio e ha un dominio
proiettato verso l'esterno, che è quella parte della molecola che fa da recettore per un
determinato segnale ambientale. Questa stessa proteina sensore transmembrana ha
un dominio chinasico che protrude nel citoplasma del batterio. Dominio chiansico sta
a significare che presenta un dominio che a livelli di particolari residui di istidina può
essere fosforilato. L'altro componente è un componente citoplasmatico che ha come
funzione biologica quella di essere un fattore di trascrizione che è in grado di legarsi,
quando è in una forma particolare, agli operatori di un determinato gene/operone.
Solitamente questi fattori di trascrizione non sono specifici per un solo gene ma sono
capaci di legare l'operatore e regolare l'espressione di tanti geni, o operoni.

Una volta che è avvenuto il legame tra la molecola presente nell'ambiente, che
costituisce il segnale ambientale, e il dominio extracellulare della proteina sensore, si
autofosforila (è un autoistidina chinasi) in un residuo di istidina che si trova nel
dominio citoplasmatico. In questa forma fosforilata può cedere il gruppo fosfato al
fattore trascrizionale attivandolo. Il regolatore trascrizionale in forma attivata può
regolare l'espressione di molti geni.

QUORUM SENSING
Rappresenta un altro modo con cui i batteri possono modificare la propria espressione genica in modo tale da rispondere alle
modificate condizioni ambientali, è quello che va sotto il nome di quorum sensing. È un sistema in cui l'elemento fondamentale
per la regolazione dell'espressione genica è la densità cellulare, la quantità di batteri presenti in una determinata nicchia
ambientale/ecologica.
Si basa sul fatto che i batteri rilasciano continuamente, durante la loro crescita, delle molecole di natura diversa. Quando la
concentrazione batterica è bassa anche la concentrazione di queste molecole, che vengono prodotte e rilasciate, è bassa.
Queste piccole molecole, che costituiscono delle piccole molecole segnale, vengono prodotte dal batterio, rilasciate all'esterno,
ma possono anche rientrare all'interno del batterio per semplice diffusione. Quando la densità cellulare è elevata è elevata
anche la concentrazione di queste molecole, sarà elevata la concentrazione sia in ambiente extracellulare sia in ambiente
intracellulare. Si legano a dei fattori di trascrizione attivando l'espressione dei geni che sono controllati da quello stesso fattore
di trascrizione, quando la concentrazione cellulare è bassa l'attivatore trascrizionale è libero e non è in grado di legare il gene
bersaglio. Se la concentrazione degli autoinduttori è elevata si ha il legame con il fattore di trascrizione che è in grado di
attivare l'espressione dei geni che sono posti sotto il suo controllo.

Autoinduttori
• nei Gram negativi → acil omoseril-lattone (AHL)
• nei Gram positivi → solitamente si tratta di oligopeptidi (brevi sequenze costituite da pochi amminoacidi)

Sono sistemi in grado di regolare alcuni processi biologici che possono essere attivati in seguito ad un’alta densità cellulare.
Questi sistemi regolano i processi di:

• simbiosi,
• espressione geni di virulenza,
• competenza,
• coniugazione,
• produzione di antibiotici,
• sporulazione,
• produzione di biofilm.

48
Lezione del 20/10/20
ANTIBIOTICI ATTIVI SU ACIDI NUCLEICI

CHINOLONI

I chinoloni vengono indicati con il termine di chemioterapici perché sono agenti antibatterici che vengono ottenuti per
sintesi. Sono classificati in varie generazioni che sono basate a loro volta, come abbiamo visto per le cefalosporine, sullo
spettro d’ospite → man mano che si procede nelle generazioni si cerca di ampliare lo spettro d’ospite per consentire
all’antibiotico di agire su più microrganismi possibili.

Meccanismo d’azione: è dovuto al fatto che questi antibiotici legano la subunità GyrA della DNA-girasi e la subunità ParC
della topoisomerasi IV e quindi di fatto bloccano due enzimi fondamentali che hanno il compito di despiralizza il DNA per
renderlo disponibile alla sua replicazione. In questo caso l'impiego dei chinoloni comporta una mancata replicazione degli acidi
nucleici dovuti al blocco di questi enzimi chiave topoisomerasi IV e DNA-girasi lo spettro d’azione è ampio → coinvolge sia
cocchi Gram negativi/positivi che enterobatteri (la maggior parte sono responsabili di una serie di infezioni urinarie e infezioni
sitemiche).

RIFAMICINE

Le rifamicine non sono chemioterapiche ma dei veri e propri antibiotici, cioè prodotti da microrganismi (Nocardia
mediterranea).
La rifamicina è quella più utilizzata nella clinica, ma sono presenti altri antibiotici appartenenti a questa classe che sono la
rifabutina e la rifapentina.
Meccanismo d'azione: blocco della fase iniziale della trascrizione perché questi antibiotici si legano alla subunità β della
RNA-polimerasi, quindi si blocca la trascrizione. Vengono utilizzati anche per micobatteri (nel cocktail di farmaci che viene
utilizzato per un periodo di circa sei mesi), cocchi Gram positivi (endocarditi protesiche causate da streptococchi, S. aureus)
e cocchi Gram negativi (N. meningitidis → profilassi della meningite e H. influenzae).

INIBITORI DELLA SINTESI DELL’ACIDO FOLICO

49
I batteri sono in grado di sintetizzare l'acido folico partendo dal PABA (→ acido parabinobenzoico). L'acido folico è un precursore
che ha ruolo importante, sia nella biosintesi degli acidi nucleici che delle proteine.

I farmaci che inibiscono la sintesi dell'acido folico possono essere di due tipi: i sulfamidici che di sintesi dei chemioterapici che
interferiscono, in questo processo che portano alla sintesi dell'acido folico, perché si sostituiscono al PABA, un analogo
strutturale che blocca la sintesi dell'acido folico precocemente ( → non si va a contribuire, a causa della mancanza di questo
componente importante, alla sintesi di acidi nucleici e proteine).

Il Trimethoprim (di sintesi) sostituisce di fatto l'acido folico e nelle vie biosintetiche che seguono, che porteranno alla sintesi
degli acidi nucleici e delle proteine, si ha nuovamente l’arresto perché al posto dell'acido folico c'è il Trimethoprim che blocca
la sintesi.

Streptococcus pneumoniae (un diplococco o pneumococco) è un microrganismo capsulato con un’estremità lanceolata ed è
l'agente eziologico della polmonite.

Non tutti i batteri hanno questo elemento che quindi è considerato come un accessorio, perchè non è un elemento che è
fondamentale per la fisiologia batterica. Non tutti i batteri hanno nel loro genoma i geni necessari per produrre questo elemento
accessorio → quando è presente costituisce il rivestimento più esterno che si viene a stratificare sopra la parete cellulare. In
base alla sua composizione chimica e organizzativa può essere distinta, in una capsula propriamente detta, uno strato
mucoso (in cui questa struttura è molto più lassa e sfilacciata, e non così compatta intorno alla cellula) e uno strato S.

- Qui vedete un'immagine che è ottenuta al microscopio ottico utilizzando una colorazione con
l’inchiostro di china, quindi una colorazione scura, in cui è possibile mettere in evidenza la
presenza della CAPSULA intorno al corpo cellulare e la si identifica con quell’alone rifrangente
che si vede intorno al corpo della cellula batterica. È un preparato con inchiostro di china o di
nigrosina che mette in evidenza un tipo di capsula che è molto compatto intorno alla cellula
questo fa sì che ci sia un netto margine di separazione con l'ambiente extracellulare.

- Lo STRATO MUCOSO invece non è una struttura compatta, mai è più sfilacciata con delle propaggini per cui il margine
esterno non è ben visibile separato dal mezzo esterno. Per quanto riguarda la natura chimica la capsula propriamente
detta di norma, e questo fa capire che ci sono delle eccezioni, è di natura polisaccaridica e molto spesso anche lo strato
mucoso è formato da polisaccaridi. Spesso la capsula propriamente detta e lo strato mucoso sono indicati con il termine
glicocalice (il termine glicocalice si riferisce alla struttura polimerica polisaccaridica fatta di zuccheri).

- STRATO S è uno strato più sottile che si distingue dalle tipologie precedentemente elencate perché di solito è di natura
proteica e può essere presente anche quando la cellula ha una capsula propriamente detta, in questo caso si trova tra
la capsula propriamente detta e la parete. È uno strato proteico che nei batteri privi di una parete di mureina assolve
la funzione di parete.

Dal punto di vista della natura chimica la maggior parte delle capsule è di natura glucidica/polisaccaridica e queste possono
essere costituite da omopolimeri, cioè da unità identiche di polisaccaridi che derivano da polimeri del glucosio e del fruttosio,
oppure possono essere eteropolimeri, come nel caso per esempio di Streptococcus pyogenes, abbiamo acido ialuronico, N-
acetilglucosamina e acido glucoronico.

Ci sono le eccezioni: le capsule propriamente dette che non sono di natura glucidica e questa è tipica B. anthracis, che è
peculiare perché porta i geni che codifica per la capsula su un plasmide, quindi questo significa che non tutti i ceppi di Bacillus
anthracis sono ugualmente capaci di produrre questo fattore di virulenza. Solo quei ceppi che possiedono il plasmide, che
porta i geni per la violenza, saranno in grado di produrre la capsula che è molto particolare perché non è fatta di zuccheri, ma
è di natura proteica, è fatta da un polimero di acido glutammico. È una capsula che per natura è molto peculiare è fatta
da acido glutammico, anch'esso carico negativamente così come carica negativamente sono tutte le capsule polisaccaridi.

50
 CAPSULA
COMPOSIZIONE CHIMICA

Polisaccaridi: la stragrande maggioranza delle capsule batteriche è composta da polisaccaridi presenti come:
- OMOPOLIMERI (destrani: composti da glucosio; levani: composti da fruttosio)
- ETEROPOLIMERI ad es. acido ialuronico (acido glicuronico + N-acetilglucosamina)

Polipeptidi: nel genere Bacillus, ad es. in B. anthracis, la capsula è costituita da acido g-poli-D-glutamico, prodotto in
atmosfera arricchita in CO2 (microaerofilia).

È importante conoscere la natura della capsula perché, a seconda del tipo di capsula, molte sono le proprietà che possono
derivare.
Nei microrganismi capsulati sono i polisaccaridi capsulari che sono gli elementi utilizzati per la messa a punto dei vaccini, per
esempio la vaccinazione anti-pneumococcica è costituita da polisaccaridi capsulari.

In basso si trova un microrganismo che è cryptococco neoformans che è un lievito, è l’esempio classico di un fungo (una
cellula eucariotica) capsulato → è clinicamente rilevante perché è l’agente eziologico della meningite fungina ed è dotato di
una capsula costituita da zuccheri, che sono completamente diversi rispetto alle capsule degli altri batteri.

CARATTERISTICHE MORFO-FUNZIONALI

La capsula non è prodotta da tutte le specie batteriche e le specie che possono produrla non sempre la sintetizzano (controllo
genetico e fenotipico della capsula).
Se presente: conferisce importanti caratteristiche morfologiche e fisiologiche
o aumenta la resistenza all’essiccamento, favorendo la sopravvivenza ambientale della singola cellula e della comunità
batterica;
o i componenti capsulari favoriscono l’adesione cellula-cellula e cellula-superficie → questo è uno degli step che
consentono al batterio di colonizzare un ambiente e di formare delle microcolonie, che accrescendosi, possono dare
origine ai biofilm/pellicole biologiche (un ecosistema all’interno del quale i microrganismi da planctonici diventano
sessili e colonizzano la superficie producendo tra la matrice extracellulare che li proteggerà e gli imbriglierà);
o costituisce un fattore di virulenza nell’ospite infettato, inibendo la fagocitosi;
o conferisce un diverso aspetto alle colonie (S - R) → S = liscio ed R=rugoso. Le cellule che non hanno una capsula sono
più rugose, mentre le cellule che hanno prodotto nel formare la colonia una capsula hanno un aspetto
mucoide/traslucido
o può essere utilizzata come materiale di riserva, quando costituita da componenti che la cellula è in grado di degradare
e metabolizzare

REGOLAZIONE DELLA SINTESI DELLA CAPSULA

La sintesi della capsula è regolata da fattori:

GENETICI:
- nel genoma esistono dei geni che determinano e regolano la sintesi della capsula;
- può essere persa per mutazione S-R;
- un ceppo acapsulato può diventare capsulato dopo assunzione di DNA da un ceppo capsulato (esperimento di Griffith:
TRASFORMAZIONE BATTERICA)

FENOTIPICI:
- fattori ambientali possono influenzare la sintesi di capsula
- composizione del terreno (es: Bacillus anthracis sintetizza una capsula in presenza di CO2) → Bacillus anthracis se viene
coltivato su agar sangue, che è un terreno nutriente non selettivo, le colonie non appaiono particolarmente mucoidi e
traslucide (che sono le caratteristiche che denotano la formazione della capsula), ma se il microrganismo viene posto in
un’atmosfera in capnofmilia (cioè arricchita di un 5% di anidride carbonica) allora si avrà la produzione di un maggior
quantitativo di capsula.
- fase di crescita (es. Streptococcus pneumoniae produce ialuronidasi (è un enzima) che nelle fasi tardive di crescita
digerisce la capsula di acido ialuronico). La colonia in seguito alla digestione, da parte della ialuronidasi, della capsula
assume un aspetto a pedina di dama, che ha un bordo innalzato ed una depressione al centro. La ialuronidasi, che ha
il compito di degradare l’acido ialuronico, si può trovare nel tessuto connettivo del nostro organismo.

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IMPORTANTE FATTORE DI VIRULENZA

Una delle attività svolte dai macrofagi è fagocitare ed uccidere i batteri nel fagolisosoma. I batteri capsulati sono più
virulenti perché non sono fagocitati e dalla sede primaria d’infezione possono invadere i tessuti sani dell’ospite
infettato. Tutto questo avviene solo in assenza di anticorpi anti-capsulari perché, se il nostro organismo avesse già degli
anticorpi rivolti verso la capsula, la fagocitosi del batterio capsulato sarebbe facilitata → si parla di fagocitosi immune. In
presenza di Ab anti-capsulari la fagocitosi è, invece, facilitata (fagocitosi immune).

È rappresentata un’immunoglobulina di classe G. Una IgG può essere

divisa a grandi linee:
Porzione superiore → porzione Fab che è la porzione di legame, cioè
la tasca che riconosce specificatamente una componente cellulare del
batterio, in questo caso il polisaccaride capsulare.

Porzione inferiore → frammento Fc, cioè frammento cristallizzabile,

che è la porzione dell'anticorpo che viene riconosciuta da un recettore
presente sul macrofago.

Meccanismo di reazione: se sono presenti nei nostri fluidi biologici degli anticorpi, delle immunoglobuline, contro la capsula
con la porzione della Y che ha la tasca di legame andranno a legarsi alla superficie del batterio (porzione Fab) e lasceranno
protrudere verso l’ambiente extracellulare il frammento cristallizabile (la porzione Fc). La porzione Fc viene riconosciuta da
un recettore da un recettore presente sulla cellula macrofagica che avrà creato un ponte tra il batterio e il macrofago → la
creazione del ponte permette che la fagocitosi possa avvenire. Se sono presenti gli anticorpi la fagocitosi può avvenire, si
parla di opsonizzazione (preparazione del pasto).

Se non ci sono anticorpi il macrofago non riesce a raggiungere dei determinanti che sono presenti sulla parete superficiale
del batterio a causa dell’ingombro sferico di una struttura che avvolge completamente la cellula mascherandola, scherma le
molecole che potrebbero essere riconosciute dal macrofago.

La carica della capsula è negativa e la superficie batterica, sia

che sia un Gram positivo/negativo, è carica negativamente → è
come se la capsula aumentasse ulteriormente in valore assoluto
la carica netta negativa.

Le membrane delle nostre cellule sono cariche negativamente,

quindi anche il macrofago è carico negativamente. Oltre
all’ingombro sferico c’è una repulsione elettrostatica tra
macrofago e cellula batterica avvolta dalla capsula.

In assenza di anticorpi anti-capsulari non possiamo avere la

fagocitosi perché il macrofago, un po’ per la repulsione
elettrostatica, un po’ per i determinanti, che normalmente
riconoscerebbe, sono schermati dall’ingombro sferico che
avvolge la cellula batterica non è in grado di esplicare la sua
funzione. Tale incapacità nell’esplicazione della propria funzione
non è una caratteristica che denota solamente il macrofago, ma
anche i polimorfonucleati, i monociti (altre cellule della linea
bianca del sangue che sono deputate alle difese dell’organismo).

STRATO MUCOSO (slime)

La composizione chimica varia molto nei diversi microrganismi, potendo essere polisaccaridica, proteica e mista. I
componenti dello strato mucoso, una volta rilasciati all’esterno della cellula, rimangono poco aderenti ad essa e tra loro;
tendono a diffondere senza presentare un margine di separazione netto dal mezzo esterno. Alcuni agiscono come potenti
tensioattivi riducendo l’attrito cellula-cellula e cellula-superficie, favorendo, quindi, lo spostamento di cellule e microcolonie
per scivolamento (Mixobacteriales) → anche lo strato mucoso è coinvolto nel processo di adesione e di movimento di intere
micrcolonie sulle superfici.

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 STRATO “S” (S-layer)

Strato proteico sottile sempre localizzato al di sotto della capsula, quando tale struttura è presente. È evidenziabile nei
batteri di recente isolatamento e viene perduto dopo ripetuti passaggi in vitro.
EUBACTERIA: si trova stratificato al di sopra della mureina, prende contatto direttamente con il peptidoglicano, nei
Gram-positivi, sopra la membrana esterna, prende contatto in particolar modo con il lipopolisaccaride, nei Gram-
negativi.
FUNZIONI: filtro molecolare che conferisce resistenza a fluttuazioni di concentrazioni ioniche, di pH, stress osmotici ed
all’attività di enzimi idrolitici esterni, favorisce adesione e virulenza.

Alcuni batteri sintetizzano degli strati esterni di natura proteica. Negli Archea questi strati proteici possono costituire la
parete cellulare. Possono costituire il sito di attacco dei batteriofagi, che sono dei virus che hanno un target specifico nei
batteri. Gli S-layer si presentano come una struttura altamente organizzata, tipo una struttura cristallina, con varie
simmetrie (esagonale, tetragonale,) a seconda del numero e della struttura delle subunità glicoproteiche che li compongono.

Lo strato S negli eubatteri

Lo strato S è presente anche negli eubatteri → in molti Batteri Gram positivi e negativi è presente uno strato di rivestimento
esterno definito S-layer. S-Layer si ritrova come costituente della parete in molti Archea. S-layer si forma per
autoassemblaggio di subunità proteiche con simmetria esagonale, quadrata o obliqua come teste fagiche. Durante
l’assemblaggio si vengono a formare pori di dimensioni identiche.

Lo strato S negli Archea

Negli Archea lo strato S è molto diffuso. Negli Archea che non possiedono una
parete cellulare di mureina, o di pseudomureina, lo strato S costituisce l’unico
rivestimento esterno ed è associato alla membrana citoplasmatica.

In alcuni Archea che possiedono lo pseudopeptidoglicano (pseudomureina)

le subunità dello strato S (sempre costituito da glicoproteine) si organizzano
prendendo contatto con lo pseudopeptidoglicano → lo ritroviamo al di sopra
della pseudomureina.

Tendenzialmente la capsula, pur diversa, è più tipica degli eubatteri degli Archea?

La capsula propriamente detta è forse una

caratteristica più ritrovato negli eubatteri per le
proprietà che conferisce ma è altrettanto importante
negli archea perché va a sostituire in molti casi
addirittura la struttura parietale → in quel caso forse
negli archea ha un ruolo più essenziale di quanto non
lo abbia negli eubatteri perché si comporta come
difesa nei confronti di vari tipi di stress, mentre negli
eubatteri, che hanno comunque una parete sotto,
conferisce dei vantaggi nell’interazione con l'ospite
parassita e anche a livello ecologico nella
colonizzazione di ambienti.

Gli strati S sono associati mediante legami non

covalenti a diverse strutture cellulari. Nei batteri
Gram+ le subunità dello strato S sono legate al
peptidoglicano Nei Batteri Gram- sono legati al LPS
Gli Strati S sono composti da proteine insolubili in
acqua, debolmente acide con un alto contenuto di
Acido glutammico Acido aspartico Lisina aminoacidi
idrofobici.

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REAZIONE NEUFELD

Abbiamo una piastra su cui sono cresciute nelle colonie di S. pneumoniae, si tocca una porzione della colonia isolata che viene
inculata in un terreno → dopodiché quando è cresciuta si aggiunge una gocciolina, utilizzando un’ansa calibrata (che può avere
per esempio un diametro di 10 μm), che viene depositata su un vetrino porta oggetti.

Si aggiunge accanto alla goccia contenente il microrganismo cresciuto una goccia di antisiero, cioè una goccia di una soluzione
che contiene anticorpi rivolti verso la capsula di un particolare tipo capsulare dello pneumococco.

Si poggia un vetrino copri oggetti e in questo momento le due goccioline si compenetrano, quindi creano un’area di
sovrapposizione dove gli anticorpi vengono in contatto con le superfici del microrganismo.

Se andiamo ad osservare → se l'anticorpo riconosce il determinante capsulare del microrganismo allora avremo il
rigonfiamento capsulare e quindi si potrà dire che quel microrganismo, positivo alla reazione di Neufeld, è uno pneumococco
di gruppo X.

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 CELLULA FUNGINA

Si tratta di una cellula eucariotica, quindi ha all'interno la

compartimentalizzazione delle funzioni tipiche di una cellula eucariotica
superiore con un nucleo propriamente detto, con i mitocondri i vari vacuoli,
ecc. → poi troviamo una membrana al di sopra della quale si trova una
parete cellulare (che nelle cellule eucariotiche superiori non hanno, ma che
è completamente diversa per natura, organizzazione e struttura dalla parete
dei batteri).

Al di fuori della parete cellulare, che è l'ultimo elemento strutturale

importante non accessorio, possiamo trovare anche nei lieviti e nei funghi
una capsula. Sono pochi gli esempi dei microrganismi capsulati nella
micologia medica, che è quello di cryptococcus neoformans.

Perché studiamo nel corso di microbiologia anche i funghi che sono eucarioti? Perché sono microrganismi, quindi
sono eucarioti però di dimensioni che fanno sì che questi siano microrganismi e che sono patogeni per l'uomo. La capsula
fungina del cryptococcus neoformans provoca meningite nell'uomo, non negli animali.

La capsula è composta di natura polisaccaridica, ma si tratta di polisaccaridi ad alto peso molecolare. La struttura costituente
principale GXM (glucoronoxilomannano).

Anche per i funghi ed i lieviti valgono le stesse considerazioni fatte per i batteri → è una struttura accessoria che non necessita
di essere presente lungo tutto l'arco del ciclo vitale ma solo quando è necessario. Per esempio, nel criptococco, che è l’agente
eziologico di polmoniti e meningiti (perché ha un tropismo per il sistema nervoso centrale), la via d'ingresso è quella inalatoria.

Normalmente criptococcus si replica nell’intestino di alcuni animali, come i piccioni, viene eliminato con le feci che essiccate
possono essere portate in sospensione con il vento e quindi si potrebbe inalare il criptococco. Quando deve entrare nell’ospite
per via aerea generalmente non è capsulato, o è scarsamente capitolato, e questo favorisce il superamento delle barriere
naturali perché ha delle dimensioni molto piccole (quando il criptococco entra nel nostro tratto respiratorio ha un diametro
all'incirca di 4μm), riesce così a superare le barriere ad arrivare nell’alveolo polmonare. Quando arriva nell’alveolo polmonare
trova una condizione di umidità e lo reidrata e fa sì che immediatamente cominci a sintetizzare la capsula polisaccaridica. Il
criptococco giunto nell’alveolo polmonare produce la capsula e sfugge alla fagocitosi.

Nel momento in cui passa la barriera ematoencefalica si priva della capsula perché altrimenti sarebbe troppo grande e non
passerebbe. La capsula viene acquisisce una volta all'interno del polmone per fronteggiare questa prima difesa immunitaria,
quando poi è disseminato, pur essendo più grande dei batteri, riesce (privo della capsula) a superare la barriera
ematoencefalica e ad instaurare un’infezione delle meningi. Il tropismo per il sistema nervoso centrale è dovuto alla presenza
di alcuni aminoacidi.

Mettere in evidenza la capsula su un campione di liquor che arriva è fondamentale perché in pochi minuti, prendendo una
gocciolina del campione del liquor che è arrivato in laboratorio mescolando con il nostro di china, se si vede un criptococco
con l’alone rifrangente si distingue da un batterio → autorizza subito a chiamare il reparto e a dire che la meningite è fungina
e non batterica, quindi il paziente va trattato con antimicotici. Questo tipo di meningite non è contagiosa come la meningite
meningococcica, quindi il soggetto non va isolato.

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 NUTRIZIONE MICROBICA

In presenza di nutrienti ed acqua la cellula batterica comincia ad accrescere la sua

massa fino a quando arriva il momento della scissione binaria.

La cellula batterica comincia a replicare il suo DNA e ad effettuare la scissione

binaria, che lo porterà alla separazione di due cellule figlie che rappresentano di
fatto un clone della cellula batterica, quindi non c'è variabilità.

Quando parliamo di crescita microbica indichiamo sia l’accrescimento nelle

dimensioni, che precede poi la separazione nelle figlie, che l'incremento della
popolazione degli elementi.

Scissione binaria → Una cellula microbica replica il suo cromosoma e aumenta

la sua massa. Con la formazione del setto di divisione cellulare e la segregazione
dei due cromosomi si formano due cellule figlie identiche tra loro e alla cellula
madre da cui si sono formate. L’intero processo rappresenta una generazione
cellulare.

Disidratando la cellula è possibile capire quali sono gli elementi chimici fondamentali presenti, e in quali proporzioni.
Chiaramente questi elementi dovranno essere quelli che forniremo al microrganismo nei terreni di coltura per renderlo in
grado di replicarsi anche in vitro. Il nutriente è un composto che è usato dal microrganismo per la biosintesi, quindi per
sintetizzare tutti gli elementi e per produrre energia cellulare.

Nutriente: composto usato per la biosintesi e/o produzione di energia cellulare;

- è essenziale per la crescita microbica;
- è assunto dall’esterno;
- DEVE essere presente nell’ambiente o fornito in Laboratorio.

La composizione chimica della cellula microbica dimostra che gli elementi che ne costituiscono il peso secco sono
rappresentati per il 95% da pochi elementi presenti in grande quantità (macroelementi) mentre il rimanente 5% da molti
elementi presenti in tracce (microelementi).

Microelementi o micronutrienti

Manganese, Zinco, Cobalto, Molibdeno, Nickel e Rame. La loro presenza è sufficiente in tracce. Sono presenti
nell’ambiente e nei terreni di coltura come contaminanti e la loro concentrazione è più che sufficiente a non limitare la crescita
batterica sia in vitro che in condizioni naturali.

Quorum sensing → meccanismo attraverso il quale i batteri acquisiscono la percezione della popolazione che aumenta,
perché acquisiscano la percezione del contatto con gli altri membri della comunità.

Macroelementi o macrunutrienti

Carbonio, Ossigeno, Idrogeno, Azoto, Zolfo e Fosforo: costituenti di carboidrati, lipidi, proteine ed acidi nucleici
Potassio, Calcio, Magnesio e Ferro: presenti come cationi

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 I 6 elementi che costituiscono le macromolecole

1. CARBONIO

È il macronutriente più abbondante, costituisce insieme ad ossigeno e idrogeno la base di tutte le molecole organiche.

In funzione della fonte di carbonio utilizzata i microrganismi si dividono in:

o Autotrofi: utilizzano carbonio inorganico (CO2). Per poter essere utilizzato il C deve essere ridotto al livello di
carbonio organico → organicazione del carbonio o fissazione della CO2. Questo processo richiede grande energia
(ottenuta dalla luce o dall’ossidazione di composti inorganici).
o Eterotrofi: utilizzano come fonte di carbonio composti organici (livelli di ossidazione tra +3 e -4). Il composto
può essere trasformato nei componenti organici cellulari senza preventivo processo di assimilazione riduttiva, può
essere direttamente utilizzato come fonte di carbonio.
La maggior parte degli organismi utilizza composti organici anche come fonte di energia → chemiorganotrofia.

2. OSSIGENO e 3. IDROGENO

Elementi molto abbondanti, costituenti l’acqua e composti chimici organici e inorganici.

Per gli organismi eterotrofi, che utilizzano molecole organiche come fonte di C, la stessa molecola funge anche da fonte di
idrogeno e ossigeno.
Per gli organismi autotrofi, che utilizzano CO2 come fonte di Carbonio, contestualmente ottengono anche ossigeno, ma
devono utilizzare altre molecole come fonte di idrogeno.

L’ossigeno molecolare (O2) è utilizzato anche come accettore finale di elettroni durante la respirazione (respirazione aerobia)
– esistono anche altre modalità per ottenere energia, altri tipi di metabolismo in cui non è coinvolto l’O 2.
O2 atmosferico: essenziale per gli aerobi (aerobi obbligati, ad esempio Bacillus anthracis), non vincolante per gli anaerobi
facoltativi ed aero-tolleranti, tossico per gli anaerobi stretti od obbligati (Clostridium tetani e Clostridium botulinum).

4. AZOTO

L’azoto rappresenta il 14% del peso secco (in forma ridotta in proteine, acidi nucleici, fosfolipidi e polisaccaridi complessi come
la mureina).

Gli organismi che utilizzano altre forme devono poter effettuare una riduzione ad ammonio.

Alcuni batteri (es. cianobatteri) riducono l’N2, la forma presente nel’atmosfera e più diffusa in natura, attraverso una reazione
nota come fissazione dell’azoto.

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 5. FOSFORO

Si trova nelle cellule soprattutto come componente dei fosfolipidi, nucleotidi e acidi nucleici. Direttamente assimilabile, stesso
livello di ossidazione nelle molecole organiche.

Tutti i microrganismi utilizzano fosfato inorganico come fonte di fosforo. Nei terreni colturali deve essere disponibile in
forma di sali di fosfato facilmente assimilabili.

La limitazione della fonte di fosfato è frequente causa di limitazione della crescita dei microrganismi acquatici.
Alcuni microrganismi suppliscono alla carenza di fosfato nell’ambiente defosforilando composti organici fosforilati per
azione di fosfatasi alcaline periplasmatiche, la cui sintesi è indotta da carenza di fosfato.

6. ZOLFO

È facilmente assimilabile come sale di zolfo, in quanto tutti i microrganismi sono capaci di ridurre i solfati a solfuri
(SH), la forma presente nei composti cellulari, dove si trova in due aminoacidi (metionina e cisteina), in alcune vitamine
(biotina e tiamina) e nelle proteine ferro-zolfo, componenti essenziali delle catene di trasporto degli e -.

NB: il codone di inizio per tutte le proteine codifica

per METIONINA (o formil-metionina nei batteri).

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Lezione del 23/10/20
Flessibilità nutrizionale dei Procarioti

I procarioti sono organismi metabolicamente molto diversificati, capaci di utilizzare come nutrienti una straordinaria varietà
di composti. Sono gli organismi più numerosi della Biosfera, presenti in tutti gli ambienti terrestri ed acquatici, compresi quelli
estremi. Comparsi 4000-2500 milioni di anni fa, i microrganismi hanno colonizzato gli ambienti più vari, adattandosi, nel corso
della loro lunga evoluzione, a “caratteristiche” nutrizionali molto diverse.

PRINCIPALI TIPI NUTRIZIONALI

Gli organismi solitamente utilizzano due tipi di energia:

o Energia luminosa utilizzata per il metabolismo dei microrganismi → organismi fototrofi
o Energia derivante dall’ossidazione dei composti chimici organici o inorganici → organismi chemiotrofi

1) FOTOTROFI: la fonte di energia esogena è la luce solare (sono fototrofi dal punto di vista dello sfruttamento di energia);
sono distinti in → Fotoautotrofi e Fotoeterotrofi in base alla fonte di C utilizzata, che può essere inorganico (CO2) od
organico (zuccheri, lipidi, proteine) rispettivamente.

a) FOTOAUTOTROFI, i più numerosi

Fonte di C: CO2 e ricavano energia dalla luce mediante la fotosintesi
Fonte di e- e di H+: composti minerali ridotti (H2O, H2S, S, H2)
Gli e- ed i H+ vengono utilizzati per l’assimilazione riduttiva di CO2

I CIANOBATTERI sono gli unici ad usare H2O come donatore di e- e di H+ con rilascio di ossigeno
I SOLFOBATTERI ROSSI e VERDI ossidano solfuri (H2S) e zolfo elementare (S).
FOTOTROFI OBBLIGATI: i microrganismi che possono vivere solamente in presenza di luce, CO2 ed acqua o altra
fonte minerale di e- e H+.

b) FOTOETEROTROFI
Fonte di C: carbonio organico, ricavano energia dalla luce mediante la fotosintesi
Fonte di e- e di H+: composti organici ridotti (ma anche H2)
Microrganismi poco numerosi ma importanti ecologicamente, frequenti nelle acque dei laghi e fiumi eutrofizzati
(archea alofili).

2) CHEMIOTROFI: i composti chimici sono la fonte di energia esogena (non sfruttano la luce solare ma la rottura dei legami
dei composti chimici che fornisce energia); sono distinti in → Chemioautotrofi e Chemioeterotrofi in base alla fonte di
C utilizzata, che può essere inorganico (CO2) od organico (zuccheri, lipidi, proteine) rispettivamente.

a) CHEMIOAUTOTROFI:
Fonte di C: CO2 ricavano energia dall’ossidazione di molecole inorganiche
Fonte di energia esogena: composti minerali ridotti (H2S, H2, NH3, NO2, F2+) che vengono utilizzati per
l’assimilazione riduttiva di CO2
→ Sono microrganismi importanti ecologicamente perché contribuiscono alla trasformazione di ecosistemi
I chemioautotrofi contribuiscono alla trasformazione degli elementi negli ecosistemi; ne sono esempi la conversione
dell’ammoniaca a nitrato (batteri nitrificanti), dello zolfo a solfato (batteri sulfuricanti); in questo gruppo vanno
inclusi i metanogeni (Archea)

b) CHEMIOETEROTROFI:
Fonte di C: composti organici come fonte sia di carbonio, sia di energia
Fonte di energia esogena: gli stessi composti organici (la fonte di C)
→ Sono i microrganismi più studiati, comprendono tutti i patogeni noti (ad oggi) e sono facilmente coltivabili in
laboratorio

Questa suddivisione non tiene conto di diverse esigenze nutrizionali, quali ad esempio la richiesta di specifici fattori di crescita,
per cui a seconda della necessità o meno di avere fattori specifici per la loro crescita possiamo ulteriormente rivedere queste
classificazioni. Non è una divisione reale...una stessa specie può seguire comportamenti metabolici che rientrano in più di una
classe.

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Tutti gli organismi FOTOAUTOTROFI, in presenza di luce, ricavano energia dai fotoni e carbonio dalla CO2, MA, in assenza di
luce, seguono il comportamento dei CHEMIOETEROTROFI, utilizzando come fonti di energia e carbonio molecole organiche
prodotte in presenza di luce.
Esistono batteri che alternano i processi metabolici delle diverse classi nutrizionali → sono organismi definiti MIXOTROFI.

Altra suddivisione riguarda la modalità di assimilazione di azoto:

o Azoto-fissatori, in grado di ridurre l’azoto molecolare ad ammonio (gli azoto-fissatori noti: tutti procarioti)
o Azoto-non fissatori, che utilizzano fonti di azoto combinato

FATTORI DI CRESCITA: PROTOTROFIA E AUXOTROFIA

Composto organico richiesto dalla cellula per crescere (che non riesce a sintetizzare!)
I fattori di crescita possono essere rappresentati dagli aminoacidi, dalle basi azotate, dalle vitamine, cioè un composto organico
che la cellula deve necessariamente avere per poter attuare il suo metabolismo e che magari non è in grado di sintetizzare.
Se la cellula non è in grado di sintetizzare un fattore di crescita deve essere fornito dall’esterno.

PROTOTROFI: sono quei microrganismi capaci di sintetizzare tutte le molecole organiche di cui hanno bisogno a partire dai
nutrienti che hanno a disposizione (C e da sali minerali) → crescono in terreni di coltura che non devono essere addizionati da
particolari composti e vitamine.

AUXOTROFI: sono quei microrganismi incapaci di sintetizzare alcune molecole organiche di cui hanno bisogno, richiedono
pertanto dei fattori di crescita dall’esterno (micoplasmi)

Non è detto che un microrganismo prototrofo non si trasformi in un auxotrofo a causa ad esempio di una mutazione. Se si
verifica una mutazione spontanea, che interrompe un gene coinvolto nella biosintesi di un amminoacido, il microrganismo da
prototrofo diventa improvvisamente auxotrofo. In laboratorio i ceppi auxotrofi spesso vengono creati, quindi si creano dei
ceppi mutanti che presentano l’interruzione di alcuni geni, per studiare il comportamento metabolico.

È anche possibile che il microrganismo sia e prototrofo o auxotrofo in base alle condizioni in cui è posto? Questo
potrebbe succedere durante l'instaurarsi di un processo infettivo in cui una delle caratteristiche è per esempio il ferro che
viene sottratto all’ospite, il batterio ha bisogno del ferro, quindi, potrebbe non avere dei siderofori, cioè non ha la capacità
di aggredire il ferro e una volta nell’ospite produce delle proteine apposta per sottrarre il ferro, e come se diventasse auxotrofo
e dovesse necessariamente sottrarre a noi il ferro. Il comportamento di auxotrofia generalmente è legato a una mutazione o
alla completa assenza di un gene. In linea di massima può accadere che se in una condizione si trova particolarmente in
abbondanza degli altri nutrienti magari ha una crescita più rallentata ma non muore.

60
 LA SPORA BATTERICA
La spora batterica è dotata di un'elevata termoresistenza. Oggi sappiamo che per decontaminare dalle spore dobbiamo
utilizzare una temperatura di 120° a una pressione di 1 atm per almeno 30 minuti in autoclave.

Le endospore sono cellule specializzate a resistere nell’ambiente e non sono una forma di riproduzione; costituiscono,
invece, un modello per lo studio del differenziamento nei procarioti, con più di 200 geni sporulazione-specifici fino ad oggi
identificati. Si conoscono più di 20 generi batterici sporigeni, tra cui i più studiati sono Clostridium e Bacillus.

Le spore, che possono essere indicato anche come endospore, sono forme di differenziazione (non è una forma di
riproduzione, ma è una forma di differenziamento) e quindi questo differenziamento è un espediente che una cellula batterica,
se dotata delle informazioni genetiche per poterlo fare, attua quando le condizioni ambientali diventano insostenibili. La
sporulazione porterà alla formazione di una struttura che è completamente diversa dalla forma vegetativa.

Questo percorso di differenziamento che è studiato per i microrganismi, in particolare del genere Bacillus e Clostridium, è
mediata da più di 200 geni che sono dedicati alla sporulazione. Oltre al genere Bacillus e Clostridium, che sono bacilli Gram
positivi che hanno un comportamento metabolico diametralmente opposto per quanto riguarda l’ossigeno: Clostridium è un
anaerobio obbligato e Bacillus è un genere di microrganismi che vive tranquillamente in presenza di ossigeno.

Forma vegetativa (come la cellula batterica che abbiamo

studiato), quando le condizioni ambientali diventano avverse
intraprendono il processo di differenziamento che le porterà
verso la sporulazione → la crescita vegetativa si interrompe
quando siamo di fronte a una concentrazione limite dei nutrienti
e questo stimolo viene percepito, trasdotto all’interno della
cellula con l’attivazione di geni coinvolti nella sporulazione, che
portano a questa forma di differenziamento.
La spora rimanere come tale fino a quando non si trova più in
condizioni sfavorevoli, ma non basta semplicemente la
ricomparsa di nutrienti in concentrazione adeguata, perché la
spora necessita di un processo di attivazione → si deve intaccare
la sua struttura superficiale oppure uno shock termico per
andare incontro al un processo di germinazione della spora
germinata che porterà di nuovo, in presenza disponibilità di
nutrienti alla forma vegetativa.

La spora rimane per decenni in questa forma termoresistente e quiescente dal punto di vista metabolico, nel momento in cui
qualcosa attiva la spora, quindi → germina, trova i nutrienti → cresce (quindi da origine al processo che viene definito
esocrescita) → ritorna delle dimensioni e nella struttura che troviamo nella forma vegetativa. Un microrganismo che è dotato
dell’informazione genetica per andare in contrasto alla sporulazione, viene detto microrganismo sporigeno, quindi Bacillus
e Clostridium sono microrganismi sporigeni.
Anche gli sporigeni non necessariamente devono andare in contro, durante il loro ciclo fisiologico alla formazione della spora.
Se le condizioni ambientali sono favorevoli non c'è la necessità di attivare questo complesso macchinario che porterà a
trasformazioni così radicali.

Questo differenziamento comporta un elevato consumo di energia per i batteri che possono trasformarsi? Non è un processo
molto dispendioso, è un processo che tende ad economizzare il tutto perché il batterio lo attua in un momento in cui non ha
grosse disponibilità ambientale, quindi prima tenta di resistere come un può. Non è tanto un dispendio energetico ma sono
più dei cambiamenti conformazionali.

CARATTERISTICHE DELLE ENDOSPORE BATTERICHE

Le spore batteriche sono:

1. DISIDRATATE: il contenuto di H2O è il 20% di quello delle forme vegetative; non sono permeabili ai coloranti e si
evidenziano come corpi RIFRANGENTI (al M/O)
2. TERMORESISTENTI E RESISTENTI: a composti antibatterici, acidi e basi forti, radiazioni ionizzanti, radiazioni
ultraviolette ed a molte altre condizioni incompatibili con la vita...
3. AMETABOLICHE: riduzione progressiva dell’attività metabolica fino ad arrivare ad una condizione di dormienza e/o
quiescenza
4. LONGEVE: praticamente capaci di sopravvivenza illimitata

→ SPORE VITALI di un microrganismo alofilo sono state ritrovate in cristalli di sale risalenti a circa 250 milioni di anni

61
Data la loro eccezionale resistenza ed ubiquitarietà, le spore hanno notevole rilevanza nella microbiologia alimentare,
industriale e medica, anche perché alcuni sporigeni sono patogeni.

È la spora che entra a contatto con una ferita che potrà poi comportare l’insorgenza del tetano, non è la forma vegetativa,
perché la forma vegetativa del Clostridium tetani se vede l’ossigeno muore, ecco perché le ferite a margini netti che sgorgano
sangue non sono a rischio di tetano, perché anche se finisse la spora in un taglio aperto e sanguinante non potrebbe germinare
perché l’ossigeno ne previene la germinazione.

Lo sporangio altro non è che la cellula vegetativa che ha iniziato il processo di sporulazione.
Spora terminale perché si ritrova a formarsi in una porzione apicale del bacillo, in questo caso per esempio la spora terminale
deforma un pochino la struttura dello sporangio. Nell’immagine è possibile vedere che la spora è come se allargasse lo
sporangio fino a fargli assumere la forma di una racchetta da tennis, quella posizione slargata è la porzione in cui la spora si
è formata all'interno dello porangio che molto probabilmente terminerà con la rottura dello sporangio e la liberazione della
spora nell’ambiente esterno. Altri microrganismi invece hanno la spora in una posizione sub-terminale, quindi non proprio
all’apice ma un po’ prima, altri microrganismi hanno la spora in una posizione centrale. Queste sono tutte caratteristiche
distintive che ci conducono verso una tipologia di microrganismo sporigeno piuttosto che un'altra.

Possiamo classificare le spore in base alla posizione (centrale, sub-terminale, terminale), alla forma (sferica oppure ovale),
“bulging” (se deforma lo sporangio) e “non bulging” (se rimane contenuta all’intero dello sporangio senza deformare la
struttura dello stesso). Quando avviene la rottura dello sporangio, la spora può trovarsi libera nell’ambiente, e la forma
vegetativa sarà morta trasformata nella spora.

Solo i primi stadi del processo di sporificazione sono reversibili, ciò vuol dire che entro un certo limite, se le condizioni
ambientali cambiano allora, il processo di sporificazione/sporulazione che è iniziato può far ritornare la cellula nella forma
vegetativa.
Oltre ad un certo stadio però, che è lo stadio di 3, questo processo diventa irreversibile. Lo sporangio nello schema riportato
è rappresentato da tutti gli stadi.

62
 EVENTI MORFOLOGICI DELLA SPORIFICAZIONE (STADIO 0-VII)

Partiamo da una condizione in cui la cellula inizia a percepire che la situazione sta cambiando, il DNA si addensa, c’è la parete,
la membrana citoplasmatica → c'è una condizione ancora fisiologicamente vicina alla norma. Quando arrivano stimoli
dall’esterno che inducono la cellula a partire con il programma di sporificazione. Il primo cambiamento che si può apprezzare
è la distribuzione dell’acido nucleico → il DNA si allinea in un unico filamento, che viene chiamato filamento assiale.

Quindi l'acido nucleico batterico si comincia ad addensare e nello stadio 1 e assume questa conformazione che viene definita
filamento assiale.

Nello stadio 2 la cellula cambia morfologicamente perché inizia a produrre una strozzatura/un setto. Si forma il mesosoma
sporale, che è un setto che si trova in una posizione asimmetrica, che comincia ad isolare un compartimento cellulare molto
piccolo, che è il compartimento dove avremo la spora in futuro, quindi è il compartimento che delimita la struttura della
prespora.

Il setto continua a crescere, e cresce così tanto nello stadio 3, che è come se andasse ad inglobare la prespora, fino a
richiudersi.
Quando questo compartimento si richiude ci troviamo ad uno stadio irreversibile → lo stadio 3 in cui abbiamo la formazione
della prespora è il punto dal quale la cellula non può più tornare alla forma vegetativa, ma il programma porterà
necessariamente alla formazione della spora. Se osserviamo la struttura, sempre nello stadio 3, troviamo un ambiente cellulare
che è avvolto da due membrane, perché una prima era quella che derivava dal primo mesosoma che poi viene inglobato dal
secondo, quindi abbiamo due membrane che avvolgono la prespora, che saranno importantissime perché all’interno di queste
due membrane verranno deposti degli strati che fortificheranno la spora.

La cellula è irreversibilmente votata ora a

produrre la spora.
Inizia in questa fase dello stadio 4 un duplice
fenomeno, che è la disidratazione, l’inizio della
deposizione della corteccia, che è una struttura
che viene sintetizzata tra le due membrane, con
un diverso contributo della membrana più interna
e della membrana più esterna.

Il core/il nucleo della spora comincia a

desiderarsi, la prima membrana comincia a
sintetizzare la corteccia, che vedremo sarà molto
simile alla struttura della mureina per la prima
parte, la membrana più esterna della spora
anch’essa contribuisce in parte alla deposizione
della corteccia verso l'interno → stadio 4.

Nello stadio 5 il citoplasma che si sta disidratando, comporterebbe però dei gravissimi danni alle macromolecole (alle proteine,
all'acido nucleico) se continuasse a disidratarsi senza che non accada niente altro in questo ambiente, la spora non potrebbe
mai un domani andare incontro alla forma di esocrescita e di rigenerazione della forma vegetativa perché avrebbe gravemente
danneggiate le strutture macromolecolari che sono presenti nel citoplasma e hanno bisogno dell’acqua.

Nello stadio 4/5 la parte centrale del nucleo del core della spora comincia ad accumulare calcio, si spinge oltre la disidratazione
e quindi l'acqua della matrice citoplasmatica viene sostituita interamente da acido dipicolinico che così complessa con il
calcio creando una rete, sotto forma di un sale (dipicolinato di calcio) che imbriglia e blocca tutte le macromolecole. Le uniche
proteine che vengono prodotte sono le SASP (“Small Acid Soluble Proteins”) che hanno il compito di legarsi all’acido
nucleico per prevenirne la degradazione.

L'irreversibilità si acquisisce quando si ha la prespora circondata dalle due membrane → questo è un punto di non ritorno.
Nello stadio 5 cominciano ad essere aggiunti gli strati di rivestimento, oltre alla seconda membrana che chiude la formazione
della corteccia, ci sono le tuniche, che sono invece di natura proteica e sono ricche di aminoacidi come la cisteina, tanti ponti
disolfuro che stabilizzano la struttura, siamo nello stadio 6, fino ad arrivare all’acquisizione di una membrana, di un
esosporio (che non sempre è presente) che è l’ultima acquisizione.

Nello stadio 7 lo sporangio si rompe e si libera la spora matura.

63
0 stadio: la cellula è ancora nella sua totale forma vegetativa e acquisisce dall’esterno dei segnali, che grazie alla trasduzione
del segnale, avvertono la cellula che le condizioni ambientali sono cambiate e deve essere avviato il programma di
sporulazione.

I stadio: il DNA che ha subito un addensamento si distribuisce nella formazione del filamento assiale.

II stadio: formazione del mesosoma sporale, che è un setto asimmetrico, che ingloba un piccolo compartimento cellulare
dove si fermerà poi la spora.

III stadio: (quando inizia è ancora reversibile) si ha una crescita eccessiva del setto della spora che cresce intorno a questa
piccola struttura fino a richiuderla in un compartimento che presenta due membrane (una membrana più interna e una
membrana più esterna), racchiude quindi un core centrale che rappresenterà il citoplasma della spora → questo elemento è
quello che segna il passaggio verso l’irreversibilità del processo.

IV stadio: disidratazione dell'acqua del citoplasma della

spora a cui contribuisce la corteccia, che richiama acqua, con
la contestuale assunzione di ioni calcio e produzione di acido
dipicolinico. Si ha la produzione di proteine che consentono
che il DNA non subisca dei danneggiamenti. Si sostituisce nel
citoplasma la matrice acquosa con una matrice di dipicolinato
di calcio e nel frattempo le due membrane si occupano della
produzione della corteccia.

V stadio: cominciano ad essere aggiunti gli strati di

rivestimento.

VI stadio: si completa la formazione degli involucri degli

strati della spora che sono esterni alla seconda membrana,
sono esterni alla corteccia, e sono rappresentati dalle tuniche
sporali (questi strati corticali si chiamano tuniche sporali) e
sono di natura proteica, che contribuiscono allo sviluppo
della resistenza agli agenti atmosferici, chimici.

VII stadio: coincide con la liberazione della spora dallo sporangio, può o non può essere presente anche un esosporio (che
è una membrana
esterna che avvolge al di fuori delle tuniche sporali).

64
III STADIO

Corrisponde al completamento della spora primordiale provvista di DUE membrane. Il processo diviene irreversibile.
Inizia la sintesi della CORTECCIA, che viene stratificata nello spessore delle due membrane.

La membrana interna (QUELLA DELLA SPORA che si è formata) contribuisce alla sintesi della parte più profonda della
corteccia (20%; parete della spora), che ha la struttura uguale a quella della mureina delle cellule vegetative e non è
degradata durante la germinazione perché quella che serve alla spora, che sta germinando, per ricostituire la forma vegetativa,
che altrimenti sarebbe priva di parete.
La membrana esterna (QUELLA DELLO SPORANGIO che ha inglobato la spora) sostiene la sintesi della parte più esterna
della corteccia (80%; corteccia spora-specifica); è diversa dal peptidoglicano e sarà degradata durante la fase di
germinazione.

Questo è il complesso della matrice di dipicolinato di calcio. In alto si vede

SINTESI DELL’ACIDO DIPICOLINICO la formula dell'acido dipicolinico e in basso la rete che permette all'acido
- L’acido dipicolinico si trova nella
di complessarsi con ioni calcio e che va a sostituire di fatto la matrice
spora complessato con il calcio.
- Rappresenta il 15% del peso secco citoplasmatica.
della spora ed è localizzato all’interno
del protoplasto.
- Si ritiene che il complesso calcio-
dipicolinato sia un componente che
favorisce l’acquisizione della
TERMORESISTENZA della spora.

- Nella termoresistenza sono

sicuramente importanti questi fattori:
1) la disidratazione del
protoplasto,
2) la stabilizzazione esercitata dal
complesso calcio-
dipicolinato su componenti COSTITUENTI DELLA SPORA
sporali come il DNA e le Esosporio: strato lasso che circonda la spora
proteine. Tunica sporale: spessa struttura composta da strati proteici; rappresenta
- All’incremento della termoresistenza dal 30 al 60% del peso secco della spora ed è costituita da proteine che
e della presenza di dipicolinato di rappresentano l’80% delle proteine della spora; tali proteine sono molto
calcio si accompagna un incremento resistenti e hanno un contenuto moto alto di cisteina e aminoacidi
della RIFRANGENZA delle spore, idrofobici;
quindi questo evento è importante Corteccia: formata da peptidoglicano particolare un po’ più lasso di quello
sia per le caratteristiche cellulare. Può rimuovere, con un meccanismo di osmosi, l’acqua dal
morfologiche, che per le protoplasto, formando così una protezione nei confronti dei danni da
caratteristiche funzionali. calore e irradiazione;
Parete sporale: situata sulla faccia interna della corteccia, a circondare il
nucleo (protoplasto);
Core (protoplasto): contiene citoplasma, ribosomi, materiale nucleare e
materiale di riserva;
Acido dipicolinico: complessato con ioni calcio, costituisce il 15% del
peso secco della spora. Si ritiene che il complesso calcio-dipicolinato
stabilizzi le molecole presenti nel protoplasto.

65
SPOROPLASTO

Citoplasma anidro e, quindi, molto denso; il pH citoplasmatico è 5.5-6.0 (nelle forme vegetative è intorno a 7.0).

Mamacromolecole
• DNA: una copia del genoma in forma di nucleoide molto compatto e stabilizzato da proteine leganti il DNA (proteine
SASP), che si trovano solamente nelle spore;
• RNA: soprattutto rRNA, assente/ridotto mRNA
• Proteine: presenti in forma inattiva ma non denaturate, Piccole Proteine Acido-Solubili (SASP) che si legano
saldamente al DNA della spora, proteggendolo dalla denaturazione termica, radiazioni e sostanze tossiche; sono
proteine spora-specifiche che non vengono ritrovate altrove; vengono degradate durante la germinazione,
producendo un pool di vari aminoacidi, fonte di C ed N (che serviranno alla cellula per ripartire)

Piccole molecole
• Acido fosfoglicerico: rappresenta una fonte di C per la rapida produzione di ATP durante la germinazione
• Acido Dipicolinico (DPA): presente esclusivamente nelle spore batteriche (elemento spora-specifico)
• Pool di nucleotidi: soprattutto mono- e di-fosfati, assenti i tri-fosfati
• Calcio: in concentrazione equimolecolare con DPA, e altri cationi bivalenti, che viene complessato con l’acido
dipicolinico
• Vari aminoacidi

L’acido dipicolinico (DPA)

Il DPA è presente, in natura, solamente nelle spore batteriche (nella

forma di differenziamento sporale).
È il 15% del peso secco della spora ed è presente nel protoplasto come
chelati di DPA-Ca, che formano una “rete” estesa a tutto il citoplasma.

→ DPA e Ca vengono accumulati nel protoplasto durante la sua disidratazione.

→ I chelati di DPA-Ca potrebbero contribuire alla termoresistenza della spora, ma non direttamente, in quanto, spore
prive di DPA sono termoresistenti.

IPOTESI: Il DPA contribuisce a stabilizzare la conformazione quaternaria delle macromolecole (DNA, RNA e proteine),
sostituendosi “funzionalmente” all’acqua durante la disidratazione della spora.

66
 GERMINAZIONE DELLA SPORA BATTERICA

La germinazione è l’interruzione della condizione di dormienza e consiste nella perdita ordinata di tutte le caratteristiche
strutturali e fisiologiche della spora:

o perdita della termoresistenza

o rilascio di DPA e calcio
o idrolisi della corteccia
o idratazione del protoplasto e perdita della rifrangenza
o idrolisi delle proteine di riserva (SASP) e di acido fosfoglicerico
o attivazione del metabolismo

TRE FASI che si susseguono in ordine temporale:

1. Attivazione
DESTABILIZZAZIONE DELL’ASSETTO STRUTTURALE DELLA SPORA
Viene ottenuto per esposizione delle spore a temperature medio-alte (è reversibile) o per “invecchiamento” (processo
non reversibile).
Una spora attivata germina più rapidamente quando esposta a specifici induttori (piccole molecole, quali amino acidi
o zuccheri, usate a concentrazione micromolare).
2. Germinazione propriamente detta
3. Esocrescita

67
Bacillus thuringiensis (Bt)

Bacillus thuringiensis (Bt) è un batterio Gram positivvo, sporigeno, in grado di produrre

un vasto range di tossine insetticide.
Bt produce cristalli parasporali (proteine Cry) che conferiscono attività insetticida
contro lepidotteri, coleotteri, imenotteri, ditteri e porta l’insetto a morte → Bacillus
thuringiensis rientra nella categoria di biopesticidi.

Bt produce altre proteine Cry che sono prodotte durante la crescita vegetativa (VIPs)
e non hanno forma di cristalli parasporali e non sono secrete dalla cellula.

Le larve interagiscono i cristalli proteici di Bacillus thuringiensis a seguito della loro attività trofica.

1. Grazie al pH alcalino ( ≥ 9) presente nell’intestino medio delle larve dei

lepidotteri si ha la degradazione della delta-endotossina
2. Gli enzimi presenti nell’intestino attivano le tossine che a loro volta si legano
a recettori specifici
3. Gravi danni alle cellule dell’apparto intestinale, distruzione delle cellule
epiteliali con conseguente formazione di lesioni
4. Le spore del Bt invadono il resto della larva provocandone la morte per
setticemia emolinfatica e paralisi dell’apparato intestinale

68
Lezione del 27/10/20

ASSIMILAZIONE DI NUTRIENTI: TRASPORTO DI MOLEOCLE ALL’AMBIENTE

Per poter essere assimilati, i nutrienti devono poter superare delle barriere che sono di diversa complessità e seconda della
tipologia di microrganismo. La struttura della mureina, del peptidoglicano, è una struttura reticolare con maglie piuttosto
larghe, che non ostacolano particolarmente il passaggio di molecole per diffusione, si tratta di una maglia idrofilica e quindi le
molecole riescono a passare.
La membrana citoplasmatica rappresenta una barriera selettiva che permette il passaggio di nutrienti, la fuoriuscita di
cataboliti o di molecole che possano andare ad agire nell’ambiente extracellulare con una certa selettività.
La capacità delle cellule batteriche a sopravvivere in ambienti, dove sono in competizione con altre cellule per gli stessi
nutrienti, ha portato alla selezione di sistemi trasporto molto diversificati ed efficienti che consentono di portare all’interno
della cellula i vari nutrienti dei quali il batterio ha bisogno.

In E. coli (è un Gram negativo), si conoscono più di 100 sistemi di trasporto determinati geneticamente.
NEI GRAM-POSITIVI, la mureina non costituisce un ostacolo al transito di piccole molecole;
NEI GRAM-NEGATIVI, la presenza della membrana esterna, che si aggiunge alla presenza della membrana citoplasmatica,
costituirebbe un ostacolo al transito di soluti se non fossero presenti porine e proteine residenti nel periplasma, che facilitano
il transito dei soluti dall’esterno ai complessi di trasporto di membrana.
In E. coli, il 40% dei substrati che vengono internalizzati è trasportato nel solubile cellulare con meccanismi dipendenti da
proteine periplasmatiche.

Aspetti importanti relativi al trasporto:

1. la velocità di diffusione, cioè quanto velocemente la molecola riesce a passare attraverso il bilayer lipidico.
2. la direzionalità del trasporto descrive la modalità attraverso cui avviene, quindi se avviene seguendo o meno
un gradiente di concentrazione.

La capsula come incide sull’assimilazione dei nutrienti? Sostanzialmente non incide in modo rilevante perché, un po’
come il peptidoglicano, è una struttura polisaccaridica e quindi incide, per esempio, per quel che riguarda la carica (non ha
una struttura, non ci sono dei trasportatori sulla capsula, quindi, è più un ingombro sferico aggiuntivo oltre al peptidoglicano).
Potrebbe avere un impatto perché generalmente ha una carica netta negativa, quindi potrebbe causare una repulsione (o
attrazione) elettrostatica nei confronti di alcune molecole cariche. NON incide pesantemente come può fare la membrana
esterna per esempio dei batteri Gram negativi.

Modalità di assunzione di molecole esogene

Può essere effettuata con e senza spesa di energia cellulare

1. Senza spesa energetica → senza ricorrere all’idrolisi dell’ATP
A. TRASPORTO PASSIVO o DIFFUSIONE SEMPLICE: si attua anche in assenza di specifiche molecole che
effettuino il trasporto della molecola esogena nel comparto intracellulare, AVVIENE SECONDO GRADIENTE
DI CONCENTRAZIONE, no energia.

B. DIFFUSIONE FACILITATA: si avvale di PROTEINE INTEGRALI presenti nella membrana, trasportatori,

che hanno il compito di agevolare il trasporto delle molecole, ma non consente trasporto contro un gradiente
di concentrazione; Anche l’H2O viene trasportata attraverso canali (acquaporine). Trasporto
velocizzato, no accumulo contro-gradiente. Protein carriers (glicerolo), porine. UNIPORTO

DIFFUSIONE PASSIVA → si attua per piccole molecole non polari: O2, CO2 e liposolubili (glicerolo)

La diffusione PASSIVA di un soluto attraverso la membrana è facilitata dall’agitazione termica delle molecole ed è
dipendente:
(i) dal gradiente di concentrazione del soluto ai due lati della membrana; la differenza di concentrazione deve
essere molto alta → maggiore è il gradiente e più rapido sarà il transito;
(ii) dall’area della superficie di membrana attraverso cui il soluto diffonde.
69
DIFFUSIONE FACILITATA

Assunzione di piccole molecole, per lo più non polari, che non vengono concentrate nel
solubile cellulare (nel citoplasma) RICHIEDE:
a) permeasi transmembranali che alterino la loro conformazione una volta che
abbiano legato la molecola da trasportare (proteina canale);
b) gradiente di concentrazione. L’assunzione del composto si verifica fino a
saturazione del carrier, in “discesa” a meno che il nutriente non sia
polimerizzato o metabolizzato.

La diffusione passiva è più lenta, è molto più rapida quella facilitata però ad una certa
concentrazione le due curve si incontrano → quella che cambia è la velocità.

Nonostante la presenza di permeasi, la diffusione facilitata è una vera e propria diffusione in cui viene raggiunta più
velocemente la saturazione del gradiente di concentrazione “in-out”.

Alcune PERMEASI batteriche fanno parte della famiglia delle proteine MIP (Major Intrinsic Protein) che sono facilitatori
della diffusione di piccole molecole; sono presenti in tutti gli organismi. Esempi di proteine MIP sono le acquaporine e le
permeasi per il glicerolo.

Acquaporina di E. coli → è una proteina codificatadal gene AppZ.

La permeasi MIP per la diffusione facilitata del glicerolo di E. coli è codificata da un operone dicistronico → GlpF

In E. coli, GlpF è localizzata nella membrana.

Consente la diffusione del glicerolo fino all’equilibrio sui due lati della membrana, ma trasporta, con una Km più alta, anche
urea, glicina e piccole molecole cariche, come il 3-fosfo-glicerato.

La proteina GlpF è codificata dal gene glpF, il primo gene strutturale di un operone dicistronico → che è costituito da due
geni, sotto il controllo di un unico promotore. Il secondo gene dell’operone, glpK, codifica per GlpK, una glicerolo-chinasi.
Si tratta di un altro esempio della natura degli operoni, questi geni che sono raggruppati sotto il controllo di un unico promotore
spesso sono co-trascritti perché rappresentano enzimi o molecole che sono coinvolte in una funzione condivisa. Quindi in
questo caso la proteina GlpF trasporta il glicerolo e la proteina GlpK è un glicerolo chinasi, quindi ha la funzione di fosforilare
il substrato che è stato internalizzato (ha il compito di trasferire un gruppo fosfato).

Questo lo ritroviamo, non solo in Escherichia coli, ma anche in altri batteri Gram negativi (S. typhimurium e Pseudomonas
spp.) e Gram positivi (Bacillus spp.). In altri microrganismi, come Zymomonas mobilis e Streptococcus bovis, è utilizzato per
il trasporto del glucosio.

L’accumulo dei nutrienti nel citoplasma avviene grazie a meccanismi di trasporto ATTIVO, A SPESE ENERGETICHE (idrolisi
ATP, reazioni redox, energia fotochimica)
2. Con spesa energetica (TRASPORTO ATTIVO): consente trasporto contro gradiente e richiede componenti
proteiche presenti nella membrana, che possono essere trasportatori semplici (chemiosmotici), complessi di
trasporto (trasportatori ABC)
A. può avvalersi di proteine periplasmatiche (TRASPORTO PERIPLASMATICO DIPENDENTE), in aggiunta a quelle
di membrana

B. può coinvolgere un sistema complesso di proteine che cooperano (TRASLOCAZIONE DI GRUPPO) producendo
un trasporto attivo economico per l’assunzione degli zuccheri.

Nel trasporto PRIMARIO il passaggio del soluto è direttamente accoppiato al consumo di energia primaria-es. idrolisi ATP-
(tipica classe di trasportatori: sistema di trasporto ABC)

70
Modalità di trasporto di sostanze dall’esterno all’interno della cellula

Il trasportatore principale è una proteina transmembrana che è legata a un'altra proteina, all'interno della cellula (quindi nel
citoplasma), deputata specificatamente all’idrolisi dell’ATP.

Il saluto arriva percepito e legato da parte di una proteina periplasmatica che cattura la molecola da trasportare, la porta in
prossimità della proteina transmembrana deputata al trasporto.

La proteina canale percepisce che è arrivato il saluto, trasmette queste informazioni, idrolisi dell'ATP che provoca un
cambiamento conformazionale che consente l'internalizzazione all’interno della cellula.

TRASPORTO DI TIPO ABC. La proteina periplasmatica lega la molecola da trasportare e la porta alla proteina
trasportatrice. L’energia per il trasporto viene dall’idrolisi di ATP, che avviene grazie a una o più proteine citoplasmatiche
associate al trasportatore.

ABC (ATP-Binding Cassette): presenti negli Eubacteria, Archea, ed Eucarioti.

I trasportatori ABC sono costituiti da:

(i) un complesso di membrana composto da due proteine-canale formanti il poro, i cui domini idrofobici sono
transmembranali; essi sono associati, tramite i loro domini idrofilici citoplasmatici, a due proteine idrofiliche, che legano
ed idrolizzano ATP
(ii) proteine leganti il substrato nei Gram-negativi sono periplasmatiche e nei Gram-positivi sono ancorate a lipidi
di membrana ed esposte sulla faccia esterna della stessa, in prossimità del trasportatore

Il transito del substrato dall’esterno all’interno della cellula si attua tramite:

(1) legame del substrato alla proteina periplasmatica

(2) legame del complesso substrato-proteina al trasportatore
(3) la modificazione conformazionale nel trasportatore induce auto-
fosforilazione con idrolisi di ATP da parte delle proteine
citoplasmatiche ed infine transito del substrato nel solubile cellulare

71
Il trasporto attivo è essenziale per la sopravvivenza dei procarioti nell’ambiente naturale, solitamente oligotrofico (il batterio
può trovarsi in presenza di una scarsità di nutrienti).
Consente di trasportare e concentrare soluti non diffusibili attraverso la membrana contro un gradiente con spesa
di energia metabolica.

Richiede: PROTEINE transmembranali specifiche, i trasportatori, indicati, nei diversi sistemi di trasporto come permeasi o
carrier.

72
 I TRASPORTATORI PROCARIOTICI

1. Mostrano significative omologie nella struttura primaria e secondaria, a testimonianza di una comune
origine evolutiva.
2. Formano α-eliche (spesso 12) che scorrono nello spessore della membrana per formare un canale attraverso cui i
soluti sono veicolati nella cellula.
3. Vanno incontro a cambiamenti conformazionali, conseguenti al loro legame con il substrato
specifico.

Le due linee nere rappresentano più o meno la porzione che è occupata dal bilayer lipidico, quindi le due
strutture colorate di giallo e rosso rappresentano i due domini transmembrana, mentre le due strutture
in blu e in verde sono porzioni citoplasmatiche e idrofiliche, che mostrano il sito di legame con l’ATP.

Consentono quindi l’idrolisi dell’ATP e, consentono in questo caso per esempio, l’internalizzazione della vitamina B12.

Nel trasporto SECONDARIO LA CELLULA UTILIZZA L’ENERGIA POTENZIALE DI UN GRADIENTE ELETTROCHIMICO (H+, Na+)
generato dal trasporto primario, al fine di trasportare le molecole contro gradiente.

Anche in questo caso intervengono proteine specifiche di membrana.

A differenza della diffusione facilitata, il trasporto avviene anche contro

gradiente, consentendo l’accumulo citoplasmatico di sostanze poco
abbondanti nell’ambiente extracellulare

Sinporto: soluto co-trasportato con lo ione che fornisce energia

Es. lattosio/H+

Antiporto: soluto trasportato in direzione opposta allo ione che fornisce

energia

73
1-2 L’idrogenione, lo ione H+, normalmente viene pompato verso l'ambiente extracellulare durante il trasporto degli elettroni.
Abbiamo un movimento retrogrado dello ione H+ che ritorna verso l'interno della cellula, a questo punto mentre entra nella
cellula una proteina specifica antiporto si occupa di sfruttare questo movimento retrogrado per fare contestualmente uscire il
sodio carico positivamente. Entra uno ione carico positivamente e ne esce un altro carico positivamente, quindi la carica
rimane inalterata.

3-4 Il sodio ora lo ritroviamo al di fuori della cellula, questo sodio libero può essere sfruttato nei punti 3-4 per un ingresso di
un'altra molecola, che potrebbe essere ad esempio uno zucchero, che con un meccanismo di simporto entra nella cellula. Il
sodio che era stato sputato fuori quando entrava l’idrogenione si lega a un recettore (la grande molecola blu presente nel
punto 3) provocando un cambiamento conformazionale che rende una porzione di questo recettore improvvisamente
disponibile al legame con lo zucchero. Nel punto in cui si lega lo zucchero ora c'è un sito di legame che è compatibile con una
sfera, mentre prima finché il sodio non si era legato l'alloggiamento non era compatibile con il legame → quando il solito lega
modifica il sito di legame che diviene disponibile ad accogliere lo zucchero.

5 Sia sodio che il saluto, lo zucchero in questo caso, siano rilasciati all'interno della cellula con un meccanismo di simporto.

Trasporto di Gruppo (PTS proteine)

Sistema di trasporto (proprio dei batteri) economico che comporta modificazione del substrato, utilizzazione di PEP come
donatore di Pi, e recupero del Pi importato con il substrato fosforilato.
Il trasferimento di Pi da PEP al composto (zucchero) da trasportare è un esempio di “phosphorelay system”.

La traslocazione di gruppo è un fenomeno proprio dei batteri ed è meccanismo di trasporto che per la cellula batterica è
economico e consente, grazie alla idrolisi del fosfoenolpiruvato all'interno della cellula, una internalizzazione di zuccheri come
il glucosio che vengono modificati per entrare. Vengono semplicemente fosforilati da una catena di proteine ed enzimi che si
trasferiscono il gruppo fosfato fino a trasferirlo in ultima analisi allo zucchero che deve entrare. Il trasferimento del fosforo
che viene “donato” dal fosfoenolpiruvato, che si trasforma in piruvato, libera questo gruppo fosfato che viene trasportato in
un sistema che viene detto “phosphorelay system”.

74
 Sistema delle Fosfotransferasi (PTS) per il trasporto degli
zuccheri, ampiamente distribuito tra i batteri: non è presente in molti
batteri aerobi, con l’eccezione di Bacillus. Complessivamente è
composto da:

Enzima I + HPr: citoplasmatici, comuni per tutti gli zuccheri;

trasporta il Pi da PEP ad un residuo di istidina di HPr, che trasferisce
il Pi all’Enzima II (EII).

Enzima II: complesso composto da proteine citoplasmatiche

e di membrana: possono variare; EIIA è solubile ed è
citoplasmatica. EIIB, idrofilica ma spesso associata a EIIC,
idrofobica ed integrale di membrana. EIIA viene fosforilata in His e
EIIB in Cys o His. EIIC, è l’accettore finale di Pi; il Pi, trasferito allo
zucchero, rientra nella cellula.

TRASPORTO PER TRASLOCAZIONE DI GRUPPO. La parte in nero indica le reazioni comuni al trasporto di più molecole. Le parti
in colore indicano le reazioni specifiche per il trasporto di una determinata molecola. EII abc sono proteine diverse per ogni
molecola da trasportare e possono essere tre diverse proteine o tre domini della stessa proteina. Escherichia coli ha almeno
15 complessi EIIabc per il trasporto di altrettanti carboidrati.

Trasporto con traslocazione di gruppo

o Tipo di trasporto tipico di batteri

o Una molecola viene trasportata all’interno della cellula e contemporaneamente è modificata chimicamente durante il
trasporto
o Delle cinque proteine coinvolte, 4 sono citoplasmatiche e, di queste, le prime due sono proteine non specifiche (EI e
HPr → sono conservate indipendentemente da quale sia lo zucchero trasportato) ed hanno il compito di trasferire il
fosfato alle proteine EIIabc che sono invece specifiche per ogni tipo di zucchero da trasportare
o In fondo a questo processo si ottiene trasporto e fosoforilazione dello zucchero, sfruttando l’energia ottenuta dall’idrolisi
del PEP

Assunzione del Ferro

Nell’ambiente, il ferro è nella forma ossidata non solubile (Fe3+, ione

ferrico) mentre è solubile sotto forma di chelati. Molti batteri producono
agenti chelanti, i siderofori, che vengono secreti e chelano il ferro
rendendolo disponibile alla cellula.

ENTEROBACTINA di E. coli
Tre molecole di Enterobactina secretoria (secrete all’esterno
quando il ferro è limitante) si complessano a Fe3+, tramite sei legami
di coordinazione con l’ossigeno.
Il complesso, che ha chelato il ferro, può rilasciare il ferro quando viene
in contatto con la cellula oppure attraversare, così come è, la
membrana esterna mediante l’aiuto di porine recettoriali specifiche
(Ton-dipendenti) ed essere trasferito alle proteine Ton, che sono
trasportatori ABC presenti nella membrana citoplasmatica. Il ferro, una
volta rilasciato nella cellula, viene ridotto a ione ferroso (Fe2-).

L’iron uptake si distingue dal trasporto attivo classico perché abbiamo

un passaggio in più, perché è presente un sideroforo che nell’ambiente
extracellulare cattura il ferro, per portarlo a una proteina porina
particolare che lo rilascia, catturato di nuovo attraverso una proteina
periplasmatica che lo porta in prossimità dei classici trasportatori ABC.

75
 LA CRESCITA BATTERICA
1. Crescita della singola cellula, intesa come aumento ordinato di tutti i suoi componenti fino alla divisione cellulare

Aumento delle dimensioni cellulari

Scissione binaria

Formazione delle cellule figlie

2. Crescita della popolazione cellulare, intesa come aumento del numero delle cellule che costituiscono la popolazione
microbica

La crescita su TERRENO SOLIDO porta allo sviluppo di colonie che non permettono di valutare come varia il numero delle
cellule in funzione del tempo di crescita.
La cinetica della crescita deve essere studiata in TERRENO LIQUIDO, dove le cellule sono MONODISPERSE ed i nutrienti
sono omogeneamente distribuiti a tutta la popolazione. Nel terreno liquido è possibile misurare l’incremento della
concentrazione cellulare (numero di cellule/ml) nel tempo di crescita.

ESEMPI DI BATTERI CRESCIUTI SU TERRENO SOLIDO.

(a) Colonie batteriche purificate su terreno “agar-sangue” mediante la tecnica della semina per striscio. Ogni colonia,
visibile ad occhio nudo, deriva dalle molteplici divisioni cellulari a partire da una singola cellula iniziale.
(b) Colonie batteriche ottenute spatolando un campione di suolo su terreno ricco LB. La morfologia diversa indica che le
colonie derivano da batteri appartenenti a specie differenti.

Determinazione della biomassa: PESO SECCO

Le cellule vengono prima separate dal terreno per centrifugazione, poi lavate ed essiccate in forno e pesate.
Ho le cellule in cultura, a un tempo x di mio interesse le separo dal terreno centrifugando, quindi essendo pesanti le cellule
tendono a sedimentare, già per gravità, ma vogliamo accelerare il processo centrifughiamo con una centrifuga ed otteniamo
un netto margine di separazione tra un pellet che conterrà le cellule e un sovranatante che invece conterrà il terreno. Scartiamo
il sovranatante, prendiamo il pellet e lo centrifughiamo fino ad arrivare ad ottenere un pellet pulito. A questo punto viene
essiccato in forno e pesato, e così abbiamo una misura oggettiva della biomassa di quella brodocoltura.

Limitazioni:
1. Non consente di distinguere le cellule vive da quelle morte
2. Batteri hanno peso ridotto, è quindi necessario raccogliere diverse aliquote di brodocoltura per avere misure attendibili

Vantaggio: misura della quantità della biomassa indipendentemente da forma, dimensione o stato di aggregazione cellulare

76
Misurazione della torbidità di una coltura

Costituisce il metodo più comune e rapido per misurare la crescita batterica. Misura indiretta della massa, mediante
determinazione della torbidità.

La luce emessa dalla sorgente luminosa, passando attraverso un prisma e determinando una lunghezza d'onda ben precisata
(o con lo spettrofotometro o con il colorimetro), colpisce il campione e che la luce che non è riflessa dalle cellule venga
catturata da una fotocellula e misurata → questa misura della torbidità indirettamente dice quante cellule batteriche ci sono.
Si possono utilizzare come strumenti il nefelometro che misura la quantità di luce diffusa dalle particelle in sospensione
oppure lo spettrofotometro, che misura invece l’assorbanza del campione (cioè la quantità di luce che non viene dispersa
ma che attraversa il campione).
Per misurare la torbidità si utilizzano lunghezze d’onda nel visibile, tra 540 e 660 nm.

La trasmissione, che è il parametro che viene registrato, è il rapporto tra l'intensità del raggio emergente (che emerge dopo
aver attraversato il campione) dalla sospensione quella del raggio incidente (cioè il raggio che colpisce) → La trasmissione è
I
inversamente proporzionale all’assorbimento. Il valore utilizzato è la densità ottica che è: OD= - 𝐥𝐨𝐠 T ovvero OD= 𝐥𝐨𝐠 i .
Ie

La densità ottica (OD) è direttamente proporzionale alla concentrazione cellulare.

77
Conta totale

Le cellule vengono direttamente misurate al microscopio, utilizzando camere di conta (es. Camera di Burker). Per ogni
condizione sperimentale in laboratorio è necessario avere il medesimo numero di cellule, che quindi devono essere
standardizzate/uniformate.
Il vetrino portaoggetti presenta un alloggiamento in cui è inciso un reticolo su cui viene poggiato un vetrino copri-oggetto,
che è tenuto fermo da delle viti di metallo → si crea una piccola camera che può essere riempita con la soluzione che vogliamo
valutare. Solitamente si contano 5 quadrati grandi, per avere una migliore approssimazione della distribuzione del liquido
all’interno dell’intercapedine, che c’è tra vetrino copri-oggetti e vetrino portaoggetti. Dopodiché si effettua un calcolo per
valutare il numero medio di cellule contate nei 5 quadrati, che viene moltiplicato per il fattore della camera di Burker e per
l’eventuale diluizione utilizzata per contare le cellule.

Se si prende un’aliquota delle cellule dalla brodocoltura in fase esponenziale e la carico direttamente nella camera di
Burker potrei ottenere un numero di cellule alto ammassate, e questa non è una condizione che consente allo
sperimentatore di contare in modo adeguato gli elementi presenti. Se le cellule sono troppo concentrate è necessario
aumentare la diluizione della brodocoltura da cui partiamo, in modo tale da avere un numero di organismi nella camera
di Burker sufficiente da poter essere contati.

A meno che non vengono utilizzati coloranti, che mettono in evidenza particolari cellule, si contano tutti i microrganismi
presenti. Questa tecnica consente di contare fisicamente il numero di cellule presenti.

9 quadrati grandi (ciascun delimitato da tre linee), che a loro volta sono suddivisi in 16 quadratini (ciascun delimitato da due
linee). Per non sovrastimare la concentrazione, per convenzione si escludono i due lati, quello a destra ed in basso, perché
rappresenteranno rispettivamente il lato sinistro di un altro quadrato e il lato superiore di un altro quadrato, posto sotto quello
che noi stiamo prendendo in considerazione.

78
Lezione del 30/10/20
LA SECREZIONE NEI BATTERI

La secrezione è il meccanismo mediante il quale una proteina, che è sintetizzata nel citoplasma, viene trasportata
attivamente (implica l'utilizzo di energia) verso l’esterno.

Le molteplici funzioni della secrezione proteica:

• Trasporto di molecole componenti gli involucri esterni (membrana esterna) o strutture di superficie (flagelli, pili, fimbrie)
• Acquisizione di nutrienti (enzimi idrolitici → consentono di degradare substrati troppo complessi per essere
internalizzati come tali dal batterio, quindi si tratta di enzimi in grado di degradare nutrienti complessi in molecole più
semplici che possono essere più semplicemente internalizzate o per le quali sono disponibili dei sistemi di trasporto
dall’esterno verso l’esterno dedicati)
• Rilascio di fattori di virulenza, tossine o altre molecole coinvolte nell’interazione con l’ospite (quando si usa la parola
“ospite” si intendono organismi molto diversi tra loro)

La parete batterica e i sistemi di secrezione

Gli apparati deputati alla secrezione di queste proteine devono essere differenti tra i Gram positivi ed i Gram negativi, perché
nei Gram positivi la struttura da attraversare è il peptidoglicano, nei Gram negativi al di sopra della membrana citoplasmatica
c’è un sottile strato di peptidoglicano immerso nello spazio periplasmatico e in più è presente una seconda membrana da
attraversare, la membrana esterna.

Sistemi di secrezione: complessi multi-proteici inseriti nella membrana batterica (e talvolta, nei Gram negativi, nella
membrana esterna) deputati al trasporto di molecole dal citoplasma all’esterno della cellula batterica.

Questi sistemi assicurano nei Gram positivi l’attraversamento delle proteine dal citoplasma, attraverso il peptidoglicano,
direttamente verso l’esterno. Nei Gram negativi questi sistemi di secrezione garantiscono l’attraversamento delle proteine
della membrana citoplasmatica e il loro passaggio nel periplasma, ci saranno altre modalità per garantire il passaggio
attraverso la membrana esterna.

Entrambi, Gram positivi e Gram negativi, presentano il sistema Sec e TAT, mentre invece nel caso dei Gram negativi sappiamo
che hanno evoluto i sistemi d tipo I-IV per ovviare al problema della secrezione attraverso la membrana esterna.

Caratteristiche condivise

• Presenza di una sequenza segnale (specifica per ciascun sistema di secrezione) → indirizza una particolare proteina
verso un determinato sistema di secrezione
• L’idrolisi dell’ATP (o del GTP) o la forza proton-motrice (presenza di un gradiente protonico) forniscono l’energia per il
trasporto/secrezione delle molecole

79
Il sistema Sec

• Evolutivamente conservato
• Presente sia nei batteri Gram positivi (trasporto di proteine in ambiente extracellulare) che Gram negativi (trasporto
di proteine attraverso la membrana citoplasmatica)
• Costituito da tre componenti: 1) apparato citoplasmatico che riconosce le proteine da trasportare; 2) motore
citoplasmatico (ATPasi); 3) complesso trans-membrana “traslocone Sec”

Un componente citoplasmatico, SecB, che ha la funzione di legare solo quelle proteine che contengono la sequenza segnale
specifica per il sistema Sec. L’altro componente, che viene definito il motore citoplasmatico necessario per il trasporto è un
ATPasi, in particolar modo si tratta della proteina SecA che è associata alla membrana citoplasmatica che protrude nel
versante citoplasmatico.
Il traslocone Sec è un complesso proteico costituito da tre tipi di subunità diverse (SecYEG), che in particolari condizioni
cambia conformazione permettendo la formazione di un canale attraverso cui le proteine possono passare.

La proteina, sintetizzata e rilasciata dal ribosoma, è suddivisa in due porzioni, una delle quali rappresenta la sequenza segnale
all'estremità amino terminale, mentre l’altra costituisce la proteina funzionale. La compente SecB, grazie alla presenza della
sequenza segnale, lega la proteina e la trasporta verso SecA. SecA legata alla proteina da trasportare può associarsi al
traslocone SecYEG e idrolizzando una molecola di ATP fornisce l'energia necessaria per far cambiare conformazione al
traslocone, con la conseguente formazione di un canale, che permette il trasporto della proteina.
Una proteasi associata alla membrana taglia la sequenza segnale della proteina, che non è più necessaria,  nell’ambiente
viene rilasciata la proteina matura.
La sequenza segnale riconosciuta dal sistema Sec

Proteine diverse secrete dallo stesso sistema di secrezione hanno una sequenza segnale di lunghezza diversa, ma sono presenti
dei residui amminoacidici che sono conservati nella sequenza, che indirizzano le proteine alla secrezione di questo sistema.

Secrezione extracellulare Sec-dipendente: processo post-traduzionale  è un processo che avviene quando la traduzione
della proteina è completata.

80
Il sistema SRP (signal recognition praticle)

Come funziona il trasporto delle proteine che non devono attraversare la membrana, ma che devono rimanere nella
membrana? Tale processo è quello del sistema SRP che è coadiuvato nel processo anche da un elemento del sistema Sec.

• Responsabile del riconoscimento delle proteine della membrana citoplasmatica, conservato in procarioti ed eucarioti
• Le proteine hanno una sequenza segnale idrofobica (segnale necessario per la collocazione transmembrana della
proteina)

• Il sistema SRP è un complesso ribonucleoproteico formato falla proteina Fflh + RNA 4.5S. Questo complesso
riconosce le proteine durante la fase di sintesi, quando la proteina nascente è ancora associata con il ribosoma. Grazie
alla presenza dell'RNA il complesso può interagire con il ribosoma, quindi quando è ancora la sintesi della porzione
carbossi-terminale della proteina.
• SRP: complesso ribonucleoproteico formato dalla proteina Fflh+RNA 4.5S

• Il trasporto e la collocazione sulla membrana si realizzano in 3 fasi:

1) Riconoscimento e indirizzamento
2) Inserimento sulla membrana
3) Ripiegamento, assemblaggio

Il legame della proteina destinata a rimanere ancorata alla membrana, con il sistema SRP, determina la possibilità
dell’interazione con la proteina FtsY, che a sua volta consente l’interazione con una proteina transmembrana, che sia chiama
YidC.

La sequenza di interazioni ha come fine ultimo quello di trasportare la proteina nascente ed il ribosoma verso la membrana
ed inserire la sequenza idrofobica nella membrana.

Nell’inserimento contribuisce uno dei componenti del traslocone Sec, SecY, che insieme a YidC coordina l’inserimento e il
corretto ripiegamento della proteina.

Una volta completato l’inserimento e il ripiegamento corretto della porzione idrofobica della proteina nella membrana nello
stesso tempo si completa la sintesi della proteina, il ribosoma si stacca e la proteina rimane inserita nella membrana (che è
la sua destinazione finale).

SecY e YidC → assicurano l'inserimento della proteina nella membrana e il corretto ripiegamento della proteina.
Trasporto proteine di membrana Sec-dipendente via SRP: processo co-traduzionale  perché avviene in contemporanea
con la traduzione.

81
Il sistema TAT (twin-arginine translocation system)

• Conservato in Bacteria e Archea

• Trasporta proteine con struttura terziaria o quaternaria contenenti il segnale arginina- arginina (RR) attraverso la
membrana plasmatica

I componenti principali di questo sistema di secrezione sono tre proteine TatA, TatB e TatC → tutte hanno almeno un
dominio transmembrana. Nel caso specifico di TatA e TatB abbiamo la presenza di un dominio transmembrana ed il resto
protrude nel citoplasma.

1. La sequenza RR indirizza la proteina verso il sistema TAT (la presenza delle due arginine sulla proteina esclude
l'indirizzamento di quest'ultima al sistema Sec).

2. Proteine Tat-specifiche, con eventuale intervento di altri cofattori, riconoscono le due arginine della proteina e la indirizzano
verso la membrana ad interagire con il complesso TatBC.

3. La proteina ripiegata è indirizzata al complesso Tat-BC.

4. Il complesso Tat-BC-proteina si associa al canale TatA (tante subunità di proteina TatA si aggregano tra loro in modo tale
da formare un canale) permettendo il passaggio della proteina attraverso la membrana citoplasmatica. L’interazione della
proteina con il canale è posisbile solo qundo la protiena specifica associata con le proteine Tat-citoplasmatiche è in associazione
con TatBC. L’energia per il trasporto proviene dalla forza proton-motrice.

E. coli: 6% delle proteine

Halobacterium: 90% proteine
Mycobacterium: es. fospolipasi

82
I trasportatori ABC

• ATP-Binding Cassette transporters, presenti nei tre domini del mondo vivente

• Nei batteri Gram negativi: dominio ATP-asico

integrato nella membrana che si estende sul lato
citoplasmatico (ABC); proteina di fusione
citoplasmatica che attraversa il periplasma e che
connette il dominio ABC con un complesso di proteine
che si trovano associate alla membrana esterna
(MFP); complesso di proteine della membrana esterna
che sono associate al dominio ABC (OMP)

• Sequenza segnale per la secrezione localizzata

all’estremità carbossilica della proteina substrato

• Trasportano substrati (proteine, lipidi, composti

tossici, antibiotici) dal citoplasma verso l’esterno o
dall’esterno verso l’interno della cellula

α-emolisina → è una tossina in grado di perturbare la stabilità della membrana degli eritrociti determinandone la lisi.

I sistemi di tipo I-VI dei Gram negativi → guardare sbobine (pgg.34-36)

I sistemi di tipo II

• Elevata specificità di substrato

• Responsabili della secrezione di proteine già trasportate nel
periplasma, precedentemente processate e correttamente ripiegate
• L’apparato di secrezione (12-15 componenti Gsp) riconosce elementi
strutturali del substrato, originatisi dopo che la proteina è stata
secreta nel periplasma ed è correttamente ripiegata
• Responsabili della secrezione di tossine (es. tossina colerica di Vibrio
cholerae), lipasi, proteasi o coinvolti nell’assemblaggio di pili
(Neisseria)

83
I sistemi di tipo V

• Responsabili della secrezione di proteine definite AUTOTRASPORTATORI

Autotrasportatori:

- sequenza segnale (N-terminale) per la secrezione trans-membrana Sec- dipendente

- parte centrale che rappresenta la porzione funzionale della proteina
- domino C-terminale che forma il canale di trasporto

I sistemi di tipo III

• Sec-indipendenti
• Scoperto in Yersinia, diffuso tra i batteri Gram negativi patogeni di animali o piante
• Le proteine secrete sono trasportate DIRETTAMENTE dal citoplasma della cellula batterica al citoplasma
della cellula bersaglio
• Generalmente le proteine secrete sono capaci di interferire con varie vie di traduzione del segnale tipiche
della cellula eucariota
• Alcuni componenti strutturali sono conservati in tutti i sistemi di tipo III; altri (“ago”, proteine strutturali ed effettrici)
sono specifici
• La sequenza segnale è probabilmente costituita dalla particolare struttura secondaria della regione N-terminale

84
I sistemi di tipo IV

• Diffusi tra i batteri Gram negativi e Gram positivi

• Responsabili del trasporto di differenti tipi di macromolecole:
DNA o proteine, traslocati direttamente nel citoplasma della
cellula bersaglio
• Coinvolti in processi di:

-trasferimento genico orizzontale (coniugazione)

-infezione, trasferimento di molecole “dannose” per la
cellula ospite

• I componenti strutturali (circa 12) formano un complesso che

attraversa gli involucri superficiali dei batteri, formando un
canale tramite il quale i substrati vengono secreti protetti
dall’azione di endonucleasi o proteasi
• La sintesi dei componenti il sistema di secrezione è indotta
dal contatto batterio-cellula
• La sequenza segnale è localizzata all’estremità C-terminale
dei substrati

I sistemi di secrezione nei micobatteri

 Sistema Sec (SecA e SecA2)

 Sistema TAT
 Sistema ESX o sistema di tipo VII

La parete ha un’organizzazione spaziale che ricorda quella dei Gram negativi (i micobatteri NON sono Gram negativi), anche
se in realtà sono filogeneticamente Gram positivi  hanno sistema Sec e sistema TAT. Hanno evoluto dei sistemi specializzati
per il trasporto di particolari sostanza o proteine.

I sistemi di tipo VII (o ESX)

• Sec-indipendenti
• Specifici dei micobatteri e altri Actinobatteri
• Costituiti da complesso di proteine (transmembrana e ATPasi) responsabili della traslocazione dei substrati attraverso
la membrana citoplamatica. Il canale responsabile del passaggio dei substrati attraverso la micomembrana è ancora
sconosciuto.
• Vengono sintetizzati anche durante la crescita in vitro, indipendentemente dal contatto con la cellula ospite →
diversamente dai sistemi di tipo IV la sintesi dei componenti necessari per la secrezione vengono prodotti
indipendentemente dal contatto con la cellula ospite, che nel caso dei micobatteri sono i macrofagi
• Proteine secrete hanno specifica sequenza segnale C- terminale

85
Le funzioni dei sistemi ESX

5 sistemi ESX omologhi (ESX-1, ESX-2, ESX-3, ESX-4, ESX-5):

o alcuni presenti in tutte le specie micobatteriche (ESX-3)
o alcuni presenti solo in specie patogene (ESX-5)
o alcuni non funzionali in alcune specie attenuate (ESX-1)

ESX-3: coinvolto nell’acquisizione del ferro → ci sono delle specie micobatteriche che sono in grado di captare il ferro solo
attraverso questo sistema  mutare questo sistema in queste specie di micobatteri significa provocarne la morte (sono sistemi
essenziali per la crescita).

ESX-5: responsabile del trasporto di proteine di parete specifiche dei micobatteri patogeni, responsabili dell’interazione del
batterio con l’ospite → il 10% della capacità codificante dei micobatteri patogeni è dedicata a produrre queste proteine.

ESX-1: responsabile della secrezione di fattori di virulenza specifici dei micobatteri patogeni, coinvolti nella lisi della membrana
del fagosoma del macrofago infettato. Nei micobatteri ambientali coinvolto in processi di trasferimento genico orizzontale
(trasporto di DNA).

86
Lezione del 3/11/20
FLAGELLO
Il flagello è una struttura accessoria di natura proteica, ancorata alla membrana del batterio, che protrude all’esterno
attraversando gli involucri superficiali. Non tutti i batteri possiedono i flagelli tanto che quando viene identificato un
microrganismo le caratteristiche che vengono esse in luce sono la forma (bacillo, cocco, ecc.), le proprietà tintoriali (Gram +
o Gram -), la capacità di produrre spore o meno (sporigeno o non sporigeno), la capacità di muoversi o meno (se è mobile
possiede dei flagelli). I flagelli possono essere localizzati e presenti in numero diverso in diversi tipi di batteri.

→ quando è presente un unico flagello ancorato ad un polo della

cellula batterica

→ più flagelli che si dipartono da un poro della cellula batterica

→ caratterizzati da ciuffi di flagelli ai due poli della cellula

batterica

→ quando sono distribuiti su tutta la superficie del batterio

Struttura del flagello

I flagelli arrivano ad essere molto più lunghi della cellula batterica stessa.
Struttura complessa costituita da circa 20 proteine maggiori e 20-30 proteine necessarie per la costruzione ed il
movimento.
Il movimento che il flagello può fare è uno solo, la rotazione, ciò che cambia è la direzione in cui il flagello ruota (orario o
antiorario). A seconda del senso di rotazione il movimento che ne risulta è di un tipo piuttosto che di un altro. [spiegato dopo]

Principali strutture proteiche:

Filamento flagellare: struttura tubulare (diametro 20 nm; lunghezza 15-20 μm) formata da moltissime subunità (20000)
della flagellina (una proteina) → è la porzione che protrude verso l’esterno.

Uncino: struttura di natura proteica flessibile che connette il corpo basale al filamento flagellare.

Corpo basale:
o Ancora il flagello all’involucro cellulare
o Costituito da proteine che si organizzano a formare una serie di anelli (solitamente sono 2-4) attraversati da una
struttura cava. Il numero di anelli varia in base alla tipologia di microrganismo su cui il flagello è ancorato (se si tratta
di un microrganismo Gram negativi avremo la presenza di 4 anelli, mentre invece se si tratta di un microrganismo Gram
positivi si hanno due anelli).
o Costituisce il motore flagellare:
a) L’anello C è costituito da numerose subunità proteiche e le più importanti sono: FliG, FliM, FliN. Questa struttura
è molto importante perché costituisce il rotore del motore flagellare. Responsabile della rotazione e
inversione della rotazione.
b) L’anello MS è inserito nella membrana citoplasmatica, l’anello P associato al peptidoglicano, l’anello L associato
alla membrana esterna → tutti questi anelli sono attraversati da una struttura cava.
c) Le proteine MotA e MotB, che si trovano legate a fianco dell’anello C, costituiscono lo statore (componente non
ruotante del flagello che fa da raccordo tra la parte che ruota e quella che fa da ancoraggio)

Motore flagellare: attivato da un potenziale elettrochimico di protoni o ioni Na + attraverso la membrana che
determinano una modificazione della proteina MotA.

Nei Gram positivi l’anello C è associato alla membrana

e l’anello P è associato al peptidoglicano, entrambi
attraversati dalla struttura cava.
Continuano ad essere presenti le proteine MotA e
MotB.
Quello che cambia è il corpo basale, mentre il
filamento flagellare e l’uncino rimangono uguali
perché cambia la composizione e l’organizzazione
strutturale della parete.

87
88
La biosintesi del flagello

È presente un meccanismo di controllo die vari geni che codificano per questi componenti. La sintesi del flagello è un processo
che avviene in maniera coordinato, in cui le varie componenti proteiche del flagello vengono sintetizzate ed associate in
maniera sequenziale.

La biosintesi della dei vari componenti del flagello, così come il loro assemblaggio, sono dei processi COMPLESSI e REGOLATI
in quanto essendo formato da tanti componenti, bisogna fare in modo che ognuno venga sintetizzato al momento giusto e
assemblato correttamente.
Il filamento è la porzione che protrude dalla cellula, il corpo basale è la parte che ancora il tutto alla membrana  le molecole
di flagellina non possono essere sintetizzate prima del corpo basale, ecc.

I geni, che si attivano con un processo a cascata, codificano per le componenti sono divisi in 3 classi:

- Classe I: operone dicristronico flhDC, i prodotti (FlhD4C → costituito da 4 subunità D ed una subunità C) sono attivatori
trascrizionali che legandosi ai geni da esso controllati ne determina l’espressione, i geni che vengono controllati dal
promotore sono i 38 geni della Classe II.

- Classe II: i 38 geni che costituiscono questa classe sono organizzati in 9 diversi operoni e le proteine che codificano sono
quelle deputate alla formazione del corpo basale e dell’uncino. Corpo basale ed uncino= CBU + un fattore σ* alternativo
(σ28); Flik (anello C) impediscono che i geni di Classe II siano trascritti prima del completamento del sistema di esporto.

- Classe III: quando inizia la sintesi dei geni della classe III, che sono quelli che codificano per la sintesi del filamento
flagellare e la proteina cap, la RNApolimerasi si associa non al σ70, che è quello che normalmente si utilizza nei processi
di trascrizione e di sintesi, ma si associa al fattore σ28. I geni sono quindi attivati da σ28 (filamento, motore, proteine per
la trasduzione del segnale chemiotattico).

L’accrescimento del filamento flagellare è apicale. le molecole di flagellina neosintetizzate vengono trasportate attraverso il
filamento flagellare fino all’estremità apicale del filamento. Il processo è regolato dalla proteina Cap.

I geni di classe II codificano per i primi componenti strutturali (es. corpo basale e uncino) e per proteine attivatrici dei geni di
classe III. I geni di classe III, invece, codificano i geni del rotore (quindi si ha il completamento del corpo basale) e per i geni
del filamento (flagellina).

Anelli → corpo basale → FliK → uncino → filamento flagellare

dà il segnale che dà l’avvio
alla trascrizione dei geni che
codificano per l’uncino e per la
proteina che costituirà il
filamento flagellare

Il corpo basale più l’uncino, una volta assemblati nella membrana, rappresentano una specie di sistema di SECREZIONE
attraverso il quale le altre componenti del flagello e la flagellina possono passare fino a raggiungere l’esterno della cellula.

In questo processo ha un ruolo importante la proteina FliK, in quanto fa sì che traduzione e sintesi di rotore e flagellina
avvengono quando tutte le altre componenti sono state formate.

89
Una volta sintetizzata la flagellina, e dopo aver percorso il canale, deve essere ASSEMBLATA con altre subunità, all’esterno. A
regolare questo processo c’è la proteina cap che consente al flagello di accrescere per aggiunta apicale. La flagellina passa
dal corpo basale, dall’uncino, nel filamento in formazione e alla fine si deposita apicalmente.

Negli archea il meccanismo di assemblaggio è diverso, il flagello è una struttura più semplice e l’accrescimento del filamento
flagellare non è apicale, ma è basale (le subunità di flagellina di più recente sintesi vengono apposte alla base del filamento
flagellare). In questo caso l’accrescimento è apicale e le unità di più recente sintesi si assemblano nella porzione apicale del
flagello.

*Il fattore sigma σ è un fattore d'inizio della sintesi dell'RNA che si lega all'RNA polimerasi procariotica, permettendole di
legarsi in maniera specifica, solo ai promotori. Questo perché da sola, l'RNA polimerasi si legherebbe indistintamente, in
qualsiasi punto del gene, trascrivendone solo una parte. Il fattore σ, infatti, possiede due domini: uno che lega il DNA e l'altro
che si ancora all'RNA polimerasi, reclutandola sul promotore.

Nei procarioti sono stati individuati diversi fattori σ, che permettono di variare l'espressione genica a seconda delle condizioni
ambientali:
• σ70: usato in condizioni normali per trascrivere la maggior parte dei geni;

• σS: utilizzato quando la cellula è in condizioni di stress;

• σ32: utilizzato in condizioni di shock termico; permette la trascrizione di geni che codificano per proteine che proteggono

la cellula da alte e basse temperature;

• σE: utilizzato in condizioni di shock termico;

• σ54: utilizzato quando nella cellula si ha una carenza d'azoto;

• σ28 (σF): utilizzato per l'espressione dell'operone dei flagelli.

Il fattore principale è appunto il fattore σ70, che riconosce i promotori costituiti da due sequenze conservate poste a 10 e 35
paia di basi, a monte del sito d'inizio della trascrizione; è costituito da quattro regioni, di cui la 2 e la 4 riconoscono
rispettivamente gli elementi -10 e -35 e la regione 3 si lega all'elemento -10 esteso, qualora presente.
Il fattore sigma e l'RNA polimerasi (che da sola è chiamata apoenzima), costituiscono l'oloenzima, che interagisce con il DNA
fino ad incontrare il promotore, dove inizia la sintesi dell'RNA. Una volta che l'oloenzima ha trascritto 10 nucleotidi, si dice che
è evaso dal promotore; il fattore sigma, quindi, si stacca e può essere usato da un nuovo apoenzima, pronto per una nuova
trascrizione.

Si potrebbe immaginare che il flagello si sia evoluto da un sistema di trasporto del Gram negativo?
Il corpo basale e l’uncino costituiscono il FT3SS (flagellar type 3 secretion system) per l’esportazione dei
componenti flagellari.

Il fatto che corpo basale e l’uncino siano una sorta di sistema di secrezione è dimostrato dal fatto che nei microrganismi dotati
di flagelli la produzione del flagello è associata alla secrezione proteica.

Ci sono delle proteine che sono coinvolte nella biosintesi del corpo basale, e nella regolazione della sintesi del flagello, che
sono implicate nella regolazione dei processi di secrezione.

Quando sono microrganismi patogeni, sia per

uomo che per animali, la produzione del flagello è
associata con la secrezione di molecole ad attività
tossica o molecole che sono in grado di interferire
con l’attività metabolica delle cellule bersaglio.

90
Il movimento dei flagelli

Il flagello ruota ed è il batterio che compie determinati movimenti a seconda di come ruota il flagello.

 Rotazione in senso antiorario: “corsa”, movimento (nuoto) lineare: smooth swimming

 Rotazione in senso orario: ri-orientamento casuale del batterio nello spazio (“capriola”): tumbling

Nel caso dei microrganismi che hanno più di un flagello, si verifica il movimento simultaneo di tutti i flagelli, in maniera
coordinata ed uniforme. Quando ruotano in senso antiorario, si forma un fascio di flagelli che fanno percorrere al batterio un
tragitto lineare in una direzione casuale dello spazio. Se invece i flagelli iniziano a ruotare in senso orario il fascio di flagelli si
disgrega e il batterio smette di muoversi e si riorienta casualmente nello spazio.

Rappresentazione schematica del movimento batterico mediato da flagelli (in assenza di stimoli)

In assenza di stimoli il movimento del batterio è un’alternanza di percorsi lineari, più o meno
lunghi, conseguenti alla rotazione dei flagelli in senso antiorario, e di momenti in cui il batterio si
ferma e si riorienta nello spazio, conseguenti alla rotazione dei flagelli in senso orario.

91
La motilità batterica e le “TASSIE”

L’alternanza casuale di movimenti lineari e di movimenti volti al riorientamento si verifica quando i batteri si trovano in assenza
di stimoli. Quando i batteri si trovano in un terreno che contiene delle sostanze dannose (repellenti) o meno (attrattanti)
possono percepire come la concentrazione di tali sostanze varia nel tempo ed influenzare la frequenza con cui avviene il
cambio di direzione del senso di rotazione in modo tale che la risultante del movimento sia un avvicinamento all’attrattante o
un allontanamento dal repellente.
Molti microrganismi utilizzano complessi sistemi sensori per percepire momento per momento le condizioni ambientali e
reagire di conseguenza, mettendo in atto una serie di risposte che sono capaci di influenzare la direzione del movimento. Le
risposte che hanno il proprio effetto sulla direzione del movimento vengono definite “tassie”.

A seconda delle condizioni ambientali si possono avere tassie diverse:

→ Risposta ad un gradiente temporale di

concentrazione

Il flagello è quella struttura che permette

di rispondere a un gradiente temporale di concentrazione di una sostanza positiva, che chiamiamo attrattante, o di una
sostanza negativa, che chiamiamo repellente.

Il batterio può solamente monitorare come varia la concentrazione di una sostanza nel tempo. La percezione ella variazione
è un’informazione che il batterio trasmette, con un processo di regolazione a cascata, alle proteine che sono deputate al
controllo della direzionalità della rotazione del flagello → la percezione di uno stimolo, e in questo caso di un gradiente
temporale di concentrazione, si traduce in un messaggio che arriva al motore del flagello. Questo fa sì che il flagello continui
a ruotare nella stessa direzione o che cambi direzione di rotazione e questo di fatto si traduce nel movimento del batterio.

92
La chemiotassi

In assenza di stimoli chimici, il batterio si muove a caso, cambiando continuamente direzione. Il batterio si sposta lunga una
retta (tragitto) per alcuni secondi, quindi si ferma e cambia direzione (tumble=capriola).

Quando il batterio è esposto ad un gradiente di attrazione positivo (quando la concentrazione dell’attrattante diventa
sempre più alta nel tempo), viaggiando verso questo gradiente esegue meno “capriole” e quindi fa un tragitto più lungo.
 se il movimento del batterio è tale da avvicinarsi ad un attrattante si ha una riduzione della frequenza con cui avvengono
le rotazioni in senso orario (le capriole diminuiscono) e il prolungamento della durata della rotazione in senso antiorario
per poter prolungare il tragitto netto in direzione dell’attrattante.
 se il movimento del batterio è tale da portarlo verso il repellente allora aumenta la frequenza con avviene il cambiamento
di rotazione del flagello per sperare di riorientarsi e muoversi nella direzione che porterà all’allontanamento dal repellente
→ la frequenza delle rotazioni avviene a seconda di come il batterio si trova e in modo tale che ci sia al netto un
allontanamento dal repellente.

In assenza di gradiente, le cellule si muovono seguendo una modalità casuale, che comprende l'avanzamento e il
capovolgimento (a).

In seguito al capovolgimento, la direzione dell'avanzamento successivo è di nuovo casuale. Se è presente un gradiente chimico
di una sostanza attraente, i movimenti diventano meno casuali. Appena l'organismo rileva concentrazioni maggiori di un
composto attraente, gli avanzamenti (CCW) diventano molto più lunghi e le capriole (CW) meno frequenti. Il risultato
complessivo è che il microrganismo si muove verso il gradiente di concentrazione dell'attraente.

Se l'organismo rileva un repellente vale il meccanismo appena descritto, ma è il decremento della concentrazione del repellente
a promuovere l'avanzamento (CCW).
I riorientamenti sono sempre casuali quello che il batterio può variare è la frequenza con cui si alternano le rotazioni del
flagello in senso orario o antiorario. Al netto il sistema fa sì che il batterio compia un percorso che lo porta ad avvicinarsi
all’attrattante. Se non ci sono stimoli l’intervallo di tempo tra una rotazione e l’altra è di pochi secondi e le lunghezze percorse
sono in micrometri.

Se viene posto un batterio in una soluzione dove è presente un attrattante distribuito in modo omogeneo il movimento diventa
indipendente dalla concentrazione dell’attrattante, bisogna comunque tenere presente che questa situazione di concentrazione
omogenea può avvenire in condizioni di estrema ricchezza di nutrienti o in condizioni di laboratorio. Negli ambienti naturali la
distribuzione di attrattanti e repellenti non necessariamente è omogenea. Se non c’è una variazione nel tempo di fatto è come
se fosse una situazione di assenza di stimoli.

Il meccanismo molecolare della chemiotassi è molto complesso e coinvolge delle proteine (chemoreccettori) in grado di rivelare
un gradiente chimico nel tempo e interagisce con proteine citoplasmatiche che condizionano la direzione del motore del
flagello.

Le proteine leganti sono coinvolte nel legame con i composti attraenti o repellenti e trasmettono all’interno della cellula un
segnale che viene decodificato e trasmesso al flagello.

93
Il movimento dei flagelli

Il flusso di protoni causa un cambiamento conformazionale di MotA che muove FliG, determinando così la rotazione del flagello
in senso antiorario.

FliM interagisce con CheY, determinando la rotazione in senso orario.

È la conformazione in cui si trova MotA che determina o meno l’interazione con una delle proteine che costituiscono l’anello C
(la porzione del flagello che impartisce la rotazione).

Quando MotA è in un determinato assetto conformazionale che le permette di interagire con una proteina dell’anello C, FliG,
il flagello ruota in senso antiorario. Questo meccanismo viene “bloccato” dalla proteina FliM (che fa sempre parte della
struttura dell’anello C) che interagisce con una forma attivata di CheY → questo determina l’inversione della rotazione del
flagello.
CheY → è l’ultima delle proteine della risposta adattativa, che si chiama chemiotassi, deputata all’interazione con una proteina
che costituisce il motore del flagello.

94
La risposta chemiotattica

Le protagoniste della risposta chemiotattica sono le proteine MCP (proteine della chemiotasssi metil-accettrici):
chemiorecettori di membrana che percepiscono particolari stimoli chimici e sono deputate al legame con un particolare soluto.

La proteina MCP (una proteina transmembrana in grado di legare il recettore con un dominio citoplasmatico che protrude nel
citoplasma) è quella che percepisce la variazione della concentrazione di soluto nel tempo.

Le proteine MCP determinano la direzione del movimento mediante trasduzione del segnale attraverso complessi proteici
composti da:
• recettori trans-membrana
• proteina CheA (istidina auto-chinasi → una proteina in grado di fosforilarsi) → verrà fosforilata sulla base
dell’informazione che arriva dalla proteina MCP e con il trasferimento a cascata del gruppo fosfato si arriva alla
componente finale della componente finale delle Che-, CheY, che in forma attiva interagisce con FliG e questa interazione
comporta l’alterazione della direzionalità del movimento flagellare (rotazione in senso orario). Quando la proteina MCP
non è legata all’attrattante, perché sta diminuendo la concentrazione, la proteina CheA si autofosforila e da avvio ad
una serie di fosforilazioni a cascata che hanno come accettore finale CheY. CheY si trova in condizioni normali non
fosforilata, ma quando questo processo di fosforilazione a cascata verrà attivato risulterà attivata. Alla percezione della
riduione della concentrazione di attrattante la risposta chemiotattica che è arriva è quella di un’inversione della rotazione
del flagello, perché il batterio si sta muovendo nella direzione sbagliata e quindi deve cambiare direzione. Per fare
questo è necessario invertire il senso di rotazione del flagello, fermarsi e ripartire.
• proteina CheW

Il segnale viene poi trasdotto alle proteine CheY e CheB localizzate nel citoplasma.

95
 Meccanismi di controllo della risposta chemiotattica

CheB-P è una metil-esterasi che demetila residui di metil-glutammato

delle MCP diminuendone l’attività chinasica
CheZ: fosfatasi che idrolizza CheY-P rimuovendo il fosfato,
assicurando una breve durata della rotazione in senso orario
CheR: metil transferasi che compete con CheB per controllare lo stato
di metilazione di MCP. Metila MCP ed aumenta l’attività chinasica di
CheA.

Queste modificazioni avvengono più lentamente rispetto ai tempi di

legame con l’attraente o il repellente, il livello di metilazione del
recettore è una registrazione del passato chimico. Questo meccanismo
permette al batterio di rispondere alle variazioni di concentrazione di
attraente o repellente nel tempo.

▪ Fosforilazione di CheA (in base alle concentrazioni di attraente o

repellente)
▪ Rotazione del flagello dovuta a CheA fosforilata. Cascata di
fosforilazione.

▪ FliM interagisce con CheY-P, determinando la rotazione in

senso orario

▪ Circuito regolatorio mediato da CheB e CheR che determina

mutamenti nello stato di metilazione delle MCP

Endoflagelli delle spirochete: filamenti assiali o endoplasmatici

• Le spirochete sono dei microrganismi Gram negativi

• Il filamento flagellare è ancorato alla membrana

citoplasmatica associata al peptidoglicano, ma non
attraversa la membrana esterna. Il filamento flagellare,
quindi, non protrude verso l’esterno ma si estende nello
spazio periplasmatico

• Localizzati nello spazio periplasmatico, tra il peptidoglicano

e la membrana esterna

• Sono attaccati ad un polo della cellula e si estendono al

polo opposto

• Costituiti da: corpo basale, uncino, filamento flagellare. In

alcune spirochete il flagello è costituito da un filamento
interno (core, proteina FlaB omologa alla flagellina)
rivestito da guaina formata da subunità di proteina FlaA

• La rotazione dei filamenti determina rotazione e

deformazione della cellula batterica, determinandone lo
spostamento attraverso i fluidi

96
I flagelli degli Archea

Costituiti da un uncino ed un filamento, la cui rotazione è controllata dai sistemi di chemiotassi

Struttura:
- struttura discoidale inserita nella membrana citoplasmatica
- uncino
- flagello formato da diverse subunità
di flagellina

Le flagelline sono:
- processate da una peptidasi (FlaK)

- modificate per aggiunta di glicani

all’estremità aminica

- assemblate alla base del flagello

- il movimento flagellare richiede

energia che viene fornita per idrolisi
di ATP e non dal gradiente protonico

- la modalità di funzionamento è la
stessa, ma quella che non cambia è
la struttura

Pili o fimbrie

Sono organelli extracellulari più corti dei flagelli. Sono coinvolti in tanti processi importanti per il batterio e per le interazioni
di esso con le cellule ospiti.

Coinvolti in:
• Adesione (substrati cellulari e non)
• Formazione di biofilm
• Interazione cellulare
• Coniugazione
• Particolari tipi di movimento

Es. Neisseria meningitidis utilizza i pili come strutture per aderire alle strutture dell’ospite.

97
Pili di tipo IV

Sono strutture flessibili e sottili, che si estendono dai poli e raramente dalla superficie. Mediano funzioni come l’adesione e il
movimento e dono importanti per la formazione di aggregati o biofilm.

Ci sono le parti che ancorano il pilo alla membrana cellulare e le molecole di pilina che formano il pilo vero e proprio.
Le subunità di pilina vengono sintetizzate nel citoplasma in una forma immatura (sono più lunghe rispetto a come saranno
nel pilo), la pre-pilina. La proteina PilD è l’anello responsabile della modificazione della PILINA (rimuovendo sequenze leader
all’N-terminale della prepilina). Adesso la regione N-terminale della pilina forma una alfa-elica idrofoba, mentre la regione C-
termianle si estende nel periplasma.
La subunità di nuova sintesi interagisce con una subunità di pilina preesistente tramite interazioni non-covalenti. L’ATPasi di
assemblaggio, la proteina PilB, in seguito all’idrolisi di ATP subisce una modificazione conformazionale che determina una
spinta del pilo verso l’esterno causando la formazione di un vuoto che viene subito riempito dalla nuova subunità.

Nei Gram negativi un ulteriore elemento del pilo è dato dalla proteina PilQ che forma un canale nella membrana esterna per
permettere il passaggio del pilo. È presente un’altra parte ATP-asica, detta PilT con attività antagonista a PilB che causa la
rimozione dei monomeri di pilina alla base, causandone la retrazione.

L’estensione e la retrazione del pilo costituiscono il meccanismo del movimento contrattile e della motilità per scivolamento.
Si attacca il pilo al substrato tramite una proteina localizzata all’apice.
I pili sono strutture DINAMICHE che si possono accorciare ed allungare. Questi due fenomeni sono dovuti
sll’aggiunta/rimozine delle subunità di pilina.

Un particolare tipo di pilo è chiamato pilo sessuale.

Schema del movimento: il batterio in seguito all’aggiunta

di pilina ha un’estroflessione del pilo che può quindi attaccarsi
al substrato.
Con la rimozione delle subunità dal pilo (dalla base), si può la
depolimerizzazione e quindi lo spostamento del batterio sul
substrato fino al punto di adesione del pilo stesso.
Per aderire al substrato il pilo a una proteina di adesione
all’estremità.

98
Lezione del 10/11/20
MISURA DELLA CRESCITA TRAMITE “CONTA VITALE”

Permette di enumerare solo le cellule vive → le cellule sono effettivamente vive se sono in grado di originare una colonia,
ma è un metodo lento perché bisogna aspettare che le colonie crescano → metodo non rapido.

Viene eseguito seminando su terreno solido (piastre) aliquote della brodocoltura batterica originale opportunamente diluite
(di solito, diluizioni scalari in base 10).
Dopo incubazione delle piastre, viene contato il numero delle colonie che si sono sviluppate (Unità Formanti Colonia, CFU).
Le colonie si originano esclusivamente da cellule vive.

LIMITAZIONI: deve essere assunto che ciascuna Unità Formante Colonia sia originata da una singola cellula depositata in
una data posizione.

È opportuno che il conteggio venga eseguito su piastre petri che contengono circa 100-200 colonie.

DILUIZIONI SERIALI. A ogni passaggio il numero di cellule contenute nelle provette diminuisce di un fattore 10.
Un’aliquota (in genere 0,1 mL) è prelevata da ciascuna provetta e piastrata su terreno solido per poter contare il numero
di cellule vive presenti. Se viene seminato 0,1 ml (100μl) devo moltiplicare per un altro fattore 10.

Plating of triplicate 100 ul from 10-7 diluition of an active growing [Link] colture produced 37, 42 and 44 isolated colonies on
nutrient agar plates following overnight incubation at 37°C. calculate the number of the colony forming per milliliter of the
original colture.
37+42+44
Bisogna trovare il numero medio di colonie → numero medio di colonie= =41
3
Moltiplicare per la diluizione (in questo caso avevamo una diluizione di 10-7 e per poter tornare alla concentrazione normale
7
moltiplico per 107) → 41 ∙ 10 → 4,1 ∙ 108
Devo contare il fatto che in questo caso abbiamo seminato 100 μl, e non 1 ml, quindi per riportare la concentrazione in ml
9
devo moltiplicare per un altro fattore 10 → 4,1 ∙10 cfu/ml

99
I metodi per effettuare questo tipo di conta solo due:
o semina in superficie
• si prepara il terreno,
• si lascia solidificare
• si aggiunge la sospensione che abbiamo diluito opportunamente sulla superficie della piastra
• nello schema riportato il campione è distribuito nella parte superiore utilizzando una spatola sterile di vetro
• lasciamo trascorre il tempo necessario per la replicazione
• si possono contare le colonie sulla superficie

o semina per inclusione (potrebbe essere importante per valutare, ad esempio, la capacità degli organismi di crescere
sia in presenza che in assenza di ossigeno)
• il campione è distribuito sua una piastra Petri vuota
• si aggiunge un terreno che è ancora liquido ad una temperatura compatibile con la vitalità cellulare (la temperatura
è al livello melting)
• il terreno viene mescolato con le cellule e solidifica
• al termine del periodo di incubazione si potranno vedere delle colonie sia sulla superficie sia nello spessore della
piastra

La semina utilizzata per la conta delle CFU nella stragrande maggioranza dei casi è quella per semina in superficie, quella che
si vede nella parte alta dell’immagine.

Misura della crescita

Concentrazione cellulare totale: misura spettrofotometrica

Metodo preferito in laboratorio perché rapido.

Si basa sulla misura dell’aumento della DO (Densità Ottica) a lunghezze d’onda del visibile, comprese tra 500 e 600 nm.
Il metodo deve essere standardizzato per il microrganismo in studio.

I valori di DO ottenuti sperimentalmente debbono essere rapportati a curve di riferimento (curve di calibrazione), costruite
tramite diluizioni scalari di sospensioni del microrganismo, prelevato durante la fase di attiva crescita.
(2.8 x 108 cellule/ml di E. coli corrispondono ad una DO540 = 1.0) → alla densità ottica 540 nanometri di 1.0 ho un
valore di concentrazione che corrisponde, per esempio, a 2,8x108 cellule/ml E. coli

La misura spettrofotometrica consente di avere una brodocoltura che consente molto rapidamente di valutare come sta
crescendo il microrganismo in esame nel tempo. Quello che bisogna fare è prelevare un’aliquota della mia brodocoltura in
crescita e valutare l'aumento della densità ottica allo spettrofotometro, ad una lunghezza prefissata per il microrganismo.
Ogni metodo/curva di crescita/valutazione della cinetica della crescita batterica viene standardizzato per quel microrganismo,
quindi si sceglie l’opportuna densità ottica, le opportune condizioni sperimentali del terreno dopodiché si comincia a valutare
l’incremento di densità ottica che è proporzionale all’aumento del numero di cellule all’interno della brodocoltura.

100
Per poter comprendere come cambia la cineteca di crescita abbiamo bisogno di affiancare, almeno la prima volta che studiamo
la crescita di quel microrganismo, alla misura spettrofotometrica una curva di riferimento (curva di calibrazione). Tale curva
permette di capire con una certa precisione, mentre cambia la misura della densità ottica, come cambia il numero di cellule
vitali all'interno della brodocultura.

LIMITAZIONI: in pratica una sola

viene misurato il numero totale delle cellule ma non possono essere distinte le vive dalle morte
Inoltre: (i) è applicabile solamente a sospensioni batteriche monodisperse
(ii) DO e concentrazione cellulare devono incrementare linearmente

IMPORTANTE: Il limite inferiore della DO è 104 cellule/ml, quello superiore è 108 cellule/ml.
A valori superiori, per avere misure di DO attendibili, la sospensione batterica deve essere diluita, prelevando
aliquote omogenee dalla brodocoltura.

La limitazione è che se ci allontaniamo dalla curva di taratura, che conta quante CFU di cellule vitali sono presenti, e
misuriamo solo la densità ottica non possiamo distinguere cellule vive da cellule morte.
Un altro fattore limitata è l’attendibilità → il margine di errore è ampio quando siamo nei primi periodi di crescita, quindi
quando abbiamo un piccolo numero di cellule. Nella misura della densità ottica il limite inferiore è rappresentato da 104
cellule/ml, allo stesso modo quando la densità ottica supera il valore di 108 cellule/ml generalmente si assiste ad una
distorsione nella valutazione della densità ottica.
Mentre nelle prime fasi di crescita dobbiamo semplicemente attendere che i batteri arrivino a una densità ottica in cui sia
possibile valutare con maggiore precisione il numero di cellule, quindi quando sono sopra 104 si incomincia ad avere una
solidità, quando invece la densità ottica supera il valore di 1 è fortemente sconsigliato continuare a leggere la brodoltura come
tale, ma si consiglia sempre di effettuare delle diluizioni e misurare la diluizione (a questo punto viene riportato il valore della
densità ottica moltiplicato per il fattore di diluizione).

Riassumendo
Nella valutazione della crescita batterica quando ci rapportiamo agli organismi che si duplicano ogni volta possiamo avere dei
problemi all'inizio (le cellule sono troppo poco concentrate e in questo devo attendere il numero di microrganismi cresca e che
superi il limite all’incirca di 104) e alla fine (quando supera la densità ottica di 1, quindi cominciamo ad avere sopra 108
cellule/ml, si consiglia per avere misure attendibili di diluire la brodocoltura e continuare con la lettura) della valutazione.

La crescita batterica in terreno liquido

L’andamento della crescita viene valutato in un sistema chiuso (terreno liquido non
rinnovato).

Dopo una fase iniziale di adattamento, in cui il numero delle cellule non aumenta,
viene registrato un incremento regolare del numero di cellule, in particolare: il
numero delle cellule della popolazione raddoppia, ad intervalli regolari di
tempo.

L’andamento ESPONENZIALE è la caratterista peculiare della crescita

batterica. Fase esponenziale → possibilità di determinare il tempo di generazione.

Dobbiamo tenere di conto che in questo caso nella beuta abbiamo un sistema chiuso, perché i nutrienti che sono all'interno
della brodocoltura, non tenendo rinnovati andranno incontro ad esaurimento e aumenteranno invece, per esempio, i cataboliti
(prodotti del metabolismo). Questo altera nel tempo le condizioni in cui si trovano i microrganismi, che sono molto differenti
da quelle che sono nella fase iniziale.

Quando inseriamo il microrganismo nella beuta con il terreno fresco inizialmente le cellule non iniziano subito a diversi alla
massima velocità, perché inizialmente hanno di sintetizzare gli enzimi che serviranno per metabolizzare i nutrienti che sono
presenti nella brodocultura. Dopo aver superato questa fase di adattamento le cellule cominciano a raddoppiare nell'intervallo
regolare di tempo.

Quindi abbiamo un andamento esponenziale della crescita → la fase in cui i batteri si replicano alla massima velocità consentita
con questo andamento esponenziale è la fase caratteristica della crescita batterica.
È la fase più importante perché è la fase in cui possiamo determinare il tempo di generazione.

101
Relazione matematica

N= No×2n

N= numero cellule ottenute dopo n generazioni a partire da un numero No di cellule iniziali

Quindi se ho 10 cellule, dopo 5 generazioni: N= 10× 25= 10 × 32= 320

Rappresentazione grafica della crescita

Riportando in ordinata il numero di cellule e in ascissa il tempo, ottengo una curva la cui pendenza aumenta. Da questo tipo
di curva, che adotta una scala lineare, ottengo poche informazioni sulla velocità di crescita.

Si utilizza un grafico semilogaritmico, il tempo è in scala aritmetica, mentre il numero di cellule è in scala logaritmica, che
permette di stimare il tempo di generazione.

Le informazioni che invece ci consentono di caratterizzare meglio la cinetica della crescita batterica sono quelle che fanno
esprimere i valori di densità ottica che corrispondono al numero di cellule, grazie alla curva di taratura fatta, se utilizziamo un
grafico che viene definito semilogaritmico.

Il grafico semilogaritmico ha una parte lineare, che corrisponde all’asse delle ascisse dove il tempo viene linearmente riportato
in minuti, quello che invece è riportato in scala logaritmica è l’asse delle ordinate dove viene riportato il numero di cellule.
Nel grafico la curva, nella fase esponenziale di crescita, viene rappresentata come una linea retta e questo ci consente di
stimare il parametro peculiare di ogni microrganismo, che è il tempo di generazione.

Il tempo di generazione g è di 60 minuti

Velocità di crescita, R, sarà:

R = 1/g = 1/60 = 0,016 generazioni per minuto (oppure, considerando il tempo
in ore, R=1/1= 1
generazione per ora).

102
Figura 3.19 DETERMINAZIONE DEL TEMPO DI GENERAZIONE DALLA CURVA DI CRESCITA. Il tempo di generazione, g, è il
tempo necessario per una duplicazione cellulare, cioè per raddoppiare il numero di cellule. Per esempio, per passare da 2 ×
104 a 4 × 104 il tempo necessario è: 120 – 60 = 60 minuti.
La fase più caratteristica è quella in cui le cellule aumentano nella velocità massima consentita → fase esponenziale

CURVA DI CRESCITA “STANDARD” IN UN SISTEMA CHIUSO COSTRUITA MISURANDO L’INCREMENTO DEL NUMERO DI
CELLULE NEL TEMPO (GRAFICO SEMI-LOGARITMICO)

Identifichiamo 4 fasi:
La prima fase che incontriamo temporalmente è la fase di latenza (lag): è quel periodo di tempo che serve ai microrganismi
per adattarsi al nuovo terreno, quindi per sintetizzare gli enzimi necessari per metabolizzare gli elementi presenti nel terreno.

La seconda fase è la fase esponenziale di crescita (log) che ha l'andamento di una retta la cui pendenza è caratteristica per
ogni microrganismo e che consente di valutare il tempo di generazione. Replicandosi alla massima velocità consentita si ha
l’aumento della densità cellulare e, allo stesso tempo, la diminuzione dei nutrienti (quindi aumentano i cataboliti) → le
condizioni di crescita non solo più ideali, quindi a questo punto il microrganismo comincia a rallentare la sua crescita che
diventa bilanciata tra gli individui che ancora si replicano e gli individui che cominciano a morire.

Questa terza fase, che è la fase stazionaria, è rappresentata da una retta che corre parallelamente all'asse delle ascisse,
quindi non aumentano più i batteri ma rimangono costanti perché una parte di essi continua a replicarsi, ma una parte muore.
La fase stazionaria nel grafico è interrotta perché è in questa fase, per esempio, che nei microrganismi sporigeni parte lo
stimolo per la sporulazione. Non tutti i microrganismi proseguiranno con la quarta ed ultima fase, che è una fase di morte,
perché quelli che geneticamente sono programmati per andare incontro alla sporulazione daranno origine a delle forme di
differenziamento cellulare, le spore, e quindi non entreranno in fase di morte. Il grafico si presenta interrotto anche perché
costituisce la fase più lunga, che può protrarsi per un tempo anche molto lungo prima di far sì che le cellule entrino nella fase
di morte.

FASE di LATENZA: lag fase

Indica il tempo, misurato a partire dall’inoculo in terreno fresco, durante il quale non si registra aumento del numero delle
cellule della popolazione.
La fase di latenza è quindi quel periodo di tempo che misuriamo dal momento in cui i microrganismi vengono inseriti nella
beuta che contiene il terreno fresco fino a quando la popolazione numericamente comincia a crescere. Anche questa fase è
parallela all'asse delle ascisse perché il numero di cellule ancora non cambia.

Non è essenziale
Può essere eliminata solamente se, come inoculo, vengono adoperate cellule in fase di crescita logaritmica provenienti
da terreni identici (stessa composizione e temperatura) a quello in cui le cellule vengono trasferite.
Questa fase non è necessariamente presente in tutti gli esperimenti che si effettuano, la possiamo eliminare ad esempio se
preleviamo delle cellule batteriche da una brodocoltura, che è in crescita, e le trasformiamo in un terreno che ha esattamente
le stesse identiche condizioni rispetto al terreno da cui le cellule provengono.

La fase di latenza può essere più o meno lunga, e questo dipende dalla capacità del microrganismo ad adattarsi alle nuove
condizioni ambientali di crescita.

103
La sua lunghezza dipende:
• Condizioni fisiologiche delle cellule: cellule in attiva crescita o non
• Differenze nella composizione del terreno (ricco → povero)
• Dimensioni dell’inoculo (quantità di cellule): riduzione del tempo di lag si ottiene con inoculi da 103 a 107 cellule/ml;
inoculi > 107 cellule/ml non sono adoperati perché troppo densi (viene falsato il risultato)
• Modalità dell’inoculo (tipologia di aggregazione delle cellule): cellule monodisperse od aggregate e microambiente da
esse generato (secrezione di exoenzimi)

FASE di crescita ESPONENZIALE: log fase

È la fase più caratteristica della crescita batterica.

I microrganismi crescono alla massima velocità loro consentita dalle condizioni colturali imposte e la popolazione
raddoppia ad intervalli regolari di tempo.

Il tempo di generazione (g) rimane costante durante tutta la fase di crescita

esponenziale.
Se vengono variate le condizioni colturali, il tempo di generazione della
popolazione varia, ma l’andamento della crescita rimane esponenziale.

Tempo di generazione (g)

Si ricava direttamente dal grafico semi-logaritmico considerando l’intervallo di
tempo in cui la popolazione raddoppia; esso coincide con l’intervallo di tempo che
intercorre tra una generazione cellulare e la successiva.
Le singole cellule della popolazione si dividono in tempi diversi (divisioni non
sincronizzate) andamento continuo della crescita.

Le cellule della fase esponenziale: sono cellule in crescita BILANCIATA

Quando la velocità di crescita è costante, indipendentemente dal ritmo di crescita, TUTTE LE COMPONENTI
MACROMOLECOLARI DELLA CELLULA (DNA, RNA, PROTEINE) sono sintetizzate a tasso costante le une rispetto alle altre.
(1) il rapporto PROTEINE/DNA rimane SEMPRE costante;
(2) il rapporto RNA (rRNA)/DNA è proporzionale alla velocità di crescita.

E. coli: il massimo ritmo di crescita è 20-22 min; a tale velocità di crescita il contenuto medio di RIBOSOMI è
25.000/cellula con una distanza media tra due ribosomi uguale alla dimensione di un ribosoma.

Se i livelli dei nutrienti cambiano, la crescita NON È BILANCIATA: cioè il tasso di sintesi delle diverse componenti cellulari
CAMBIA FINO A CHE NON VIENE RAGGIUNTA UNA NUOVA CONDIZIONE DI EQUILIBRIO. Questo fenomeno viene osservato
regolarmente negli esperimenti di Shift-up o Shift-down (aumento o diminuzione dei nutrienti).

Shift-up (aumento dei nutrienti) e Shift-down (diminuzione dei nutrienti) dimostrano che la crescita batterica è soggetta ad
un controllo coordinato che permette una risposta adattativa a cambiamenti delle condizioni di crescita se rimane nei limiti
compensabili perché se la situazione prosegue verso uno sbilanciamento progressivo dei nutrienti si perde la capacità di
raggiungere uno stato di equilibrio e si entra in fase stazionaria.

FASE STAZIONARIA

È la fase più lunga. L’ingresso della popolazione nella fase stazionaria si stabilisce intorno a concentrazioni di 109 cellule/ml.
Il numero di microrganismi rimane costante (la curva si presenta parallela all’asse delle ascisse): alcuni possono essere
ancora in crescita, con ritmi di generazione rallentati rispetto alla fase log è molto variabili, molti non si dividono ulteriormente,
ed alcuni iniziano a morire.

104
Le cellule morte possono andare precocemente in lisi e la fase stazionaria diviene molto corta. L’inizio di questa fase
coincide con l’induzione alla sporificazione negli sporigeni.

Fattori che determinano l’inizio della fase stazionaria:

1. Esaurimento dei nutrienti, anche solamente di uno, arresta la crescita esponenziale (esaurimento del glucosio,
carenza di un aminoacido, limitata disponibilità di O2- per gli aerobi).
2. Accumulo di cataboliti rilasciati nel mezzo di coltura durante la crescita esponenziale; la stragrande maggioranza
degli Eubacteria utilizza gli zuccheri mediante glicolisi, con produzione di acidi organici (che comportano un
abbassamento del pH del mezzo di coltura e costituisce un segnale di allarme che porta al rallentamento della crescita).
Gli streptococchi producono acido lattico dall’utilizzazione del glucosio; tale composto acidifica il mezzo di coltura
interrompendo precocemente la crescita esponenziale.
3. Sovraffollamento cellulare; le cellule smettono di dividersi quando raggiungono un livello “critico” di densità cellulare
(Risposta: quorum sensing).

Caratteristiche della popolazione della fase stazionaria

È una tipica fase di crescita non bilanciata in quanto, nell’ambiente di crescita, si verificano molte variazioni colturali a cui la
popolazione batterica deve adattarsi.

La fase stazionaria è un modello per studiare in vitro i meccanismi con cui la cellula sopravvive nell’ambiente naturale, dove
le condizioni di crescita possono variare e non sono sempre prevedibili: esse non consentono, o quasi mai, una crescita
bilanciata.

MORFOLOGIA E FISIOLOGIA DELLA POPOLAZIONE

1. Morfologia: le cellule possono presentarsi più piccole con citoplasma e nucleoide più denso;
2. Fisiologia: le cellule sono poco attive metabolicamente, più resistenti al calore, radiazioni ionizzanti, variazioni di pH.
Alcune specie possono SOPRAVVIVERE PER ANNI sia in laboratorio che nell’ambiente naturale; ciò è determinante
per il comportamento delle comunità microbiche nel loro habitat naturale; possono essere più virulente → questa è una
conseguenza dell’induzione della percezione da parte del quorum sensing con rilevanti conseguenze che derivano
dall’attivazione di operoni che sono coinvolti nella virulenza e ciò comporta rilevanti conseguenze anche medico-cliniche
ed industriali.

La differenza più significativa è la RIDOTTA/DIFFERENZIATA ESPRESSIONE genica e di sintesi proteica.

3. Mentre è ridotta l’espressione di geni/operoni rispetto a cellule metabolicamente attive, vengono prodotte MOLTE NUOVE
PROTEINE, denominate genericamente starvation proteins, che contribuiscono a rendere le cellule più resistenti. Tra
queste:
- transglicosidasi e transpeptidasi, aumentano la formazione di legami crociati nella mureina, rendendola più
resistente;
- nuove Dps (DNA binding proteins from starved cells), che proteggono il DNA;
- nuove chaperonine, che proteggono le proteine dalla denaturazione, stress specifiche.

FASE DI MORTE

Definita come perdita irreversibile della capacità della cellula di riprodursi

Fase caratterizzata dalla perdita di vitalità delle cellule: le cellule non si dividono più anche se trasferite in terreno
fresco.
La perdita di vitalità della popolazione ha un andamento esponenziale, almeno nelle fasi iniziali.
→ misurazione mediante conta vitale: il dimezzamento del numero di cellule vitali viene registrato anche quando il numero
totale di cellule rimane costante, se le cellule morte non vanno incontro a lisi.

Anche la fase avviene, inizialmente, con un andamento esponenziale. Esaurimento di una componente essenziale e accumulo
di enzimi autolitici, che finiscono con il distruggere della cellula batterica che viene lisata.

L’andamento esponenziale della morte viene spiegato come:

(i) Esaurimento di un componente essenziale
(ii) Accumulo critico di enzimi autolitici e/o sostanze tossiche

105
DUE INTERPRETAZIONI DIVERSE DELLA “MORTE” BATTERICA:

1. Le cellule perdono vitalità perché geneticamente programmate a morire (suicidio di alcuni a favore di altri, seguito
da lisi cellulare)
2. Le cellule non sono capaci di dividersi ma non vanno incontro a lisi; possono entrare in una condizione di quiescenza,
rimanendo VITALI NON COLTIVABILI. Si instaurerebbe, cioè, un fenomeno di sopravvivenza cellulare di gran
parte o della totalità della popolazione, che in alcuni microrganismi inizierebbe precocemente a partire dalla fase
di transizione della crescita.

Le cellule che si trovano nello stato di vitalità ma non coltivabili sono virtualmente immortali? In teoria potrebbero
esserlo perché non torno a replicarsi fino a quando non incontra un ospite, non attivano il metabolismo (sono praticamente
inerti) a meno che dopo un certo periodo di tempo il turnover della membrana non porti al danneggiamento degli elementi
strutturali e quindi questo li porta a morte, ma in teoria potrebbero.

Esempio del vibrione colera

Nelle acque contaminate dal vibrione del colera i ricercatori filtravano le acque, le coltivavano ma non si riusciva ad isolare in
coltura il vibrione, ma test molecolari in PCR dimostravano la presenza del DNA. I ricercatori hanno preso una parte di questa
acqua filtrata, che stando alle coltivazioni classiche conteneva microrganismi morti, e l’hanno inoculato in un modello di
infezione sperimentale. L'animale si è ammalato di colera e dai campioni ottenuti dall’animale infetto, passati sul terreno, si
torna ad osservare colonie e quindi si ripristinava anche la capacità replicato, che era stata persa irreversibilmente nella fase
di morte. Lo stato di cellule vitali ma non coltivabili è uno stato che deve essere considerato con molta attenzione perché
potrebbe avere implicazioni non trascurabile sulla virulenza e patogenicità dei microrganismi.

Condizioni di crescita, tempo di divisione e replicazione del genoma

La replicazione del DNA, una volta iniziata a partire dall’origine della replicazione, va sempre a completamento. La velocità di
replicazione è costante ed è indipendente dal tempo di generazione cellulare.

Batteri a lenta crescita

Nei batteri a lenta crescita, il cromosoma inizia e completa la propria replicazione PRIMA che la sintesi del setto sia terminata.

E. coli
o La replicazione del genoma di E. coli (4.64 Mbp) procede incorporando 1000 nucleotidi al sec;
o Terreni poveri di nutrienti: il tempo di generazione (g) è superiore a quello impiegato per la replicazione del cromosoma
ed il ciclo cellulare evolve come quello di batteri a lenta crescita. Il tempo di generazione in terreno povero può essere >40
min, per cui la settazione e la divisione cellulare vanno a completamento DOPO che il DNA è stato replicato.
o Terreni ricchi di nutrienti: il tempo di generazione può essere inferiore a quello necessario per la replicazione del DNA.
Il g minimo registrato è 20-22 min. Quindi, le cellule figlie, non ancora separate, ricevono un genoma in replicazione.

13/11/20

RIASSUMENTO:

106
La curva di crescita in un sistema chiuso (grafico semilogaritmico)

Fase di latenza (lag) → una volta che il microrganismo è spostato

nel nuovo terreno di coltura impiegherà un certo periodo di tempo
per adattarsi e, avendo percepito i nutrienti presenti nel mezzo,
sintetizzare gli enzimi necessari alla loro metabolizzazione. Ha una
lunghezza variabile che dipende dalla dimensione dell’inoculo,
dalla composizione chimica del terreno che il microrganismo
incontra. La fase di latenza in alcuni casi può essere assente se
viene spostata la brodocoltura da un terreno ricco ad un altro con
la stessa composizione e temperatura.

Fase logaritmica (log) → le cellule, ormai vigorosamente attive

nel terreno, si riproducono alla massima velocità consentita,
quindi raddoppiano il loro numero nell’unità di tempo. È la fase
caratteristica perché è SOLO da questa fase che si può ottenere il
tempo di medio di generazione (è la caratteristica di un
microrganismo in quel determinato terreno ed in quelle determinate condizioni sperimentali).

Fasi stazionaria → in seguito alla minor presenza di nutrienti ed una maggior presenza di cataboliti acid (che possono spesso
arrestare la crescita). È una fase parallela all’asse delle ascisse, quindi questo ci dice che il numero dei microrganismi in quella
fase non varia, è un plateau. In questa fase per i microrganismi sporigeni si può avviare il processo di sporificazione che
porterà alla trasformazione dalla forma vegetativa alla forma di differenziamento cellulare che permette al microrganismo di
sopravvivere, in questo stato di quiescenza metabolica, per centinaia di anni nell’ambiente fino a quando le condizioni non
cambiano. Per i microrganismi che non sono sporigeni, nella fase stazionaria, caratterizzata da cambiamenti morfologici, si
arriva alla fase di morte.

Fase di declino/morte → ha un andamento esponenziale inverso rispetto alla fase logaritmica, nell’unità di tempo le cellule si
dimezzano. Questo si apprezza se le cellule vanno in contro ad autolisi ma se le cellule muoiono e rimangono tali la densità
ottica non riesce a misurarle, in questo caso il declino esponenziale viene misurato quando vengono contate (anche se sono
integre non essendo più vitali non formeranno delle colonie).

CRESCITA DIAUXICA. La curva in rosso rappresenta la crescita di un

microrganismo in un sistema chiuso in presenza di due fonti di carbonio ed
energia (glucosio e lattosio).

In presenza di due fonti di C, le cellule utilizzano per prima quella più facilmente
metabolizzabile.

Inizialmente è utilizzato solo il glucosio e, dopo un arresto della crescita, questa

riprende a spese del lattosio → l’uso del lattosio avviene quando il glucosio si
trova in concentrazioni limitanti.

La curva in blu indica l’attività dell’enzima β-galattosidasi, necessario alla

cellula per utilizzare il lattosio.

L’esaurimento del glucosio e l’ingresso nella fase stazionaria costituisce un

segnale, per tutti quei batteri che hanno la possibilità di sintetizzare l’enzima
che consentirà di usare il lattosio, cominciano in questo punto della curva, a
sintetizzare l’enzima β-galattosidasi.
I batteri che sono in grado di metabolizzare il lattosio, man mano che cresce la produzione di β-galattosidasi, riprendono una
certa crescita dovuta all’utilizzazione del lattosio. La pendenza di questa fase, che è minore di quella in cui viene utilizzato il
glucosio perché meno efficiente, cresce in funzione della disponibilità dell’enzima β-galattosidasi. L’ingresso nella fase
stazionaria e poi di morte si avrà anche in seguito all’uso del lattosio.

Il gene codificante per tale enzima si trova all’interno dell’operone lacZ, che è regolato dalla concentrazione di glucosio. Tale
gene non è espresso finché il glucosio è presente all’esterno della cellula in alta concentrazione, solo in assenza di glucosio
può iniziare la trascrizione dell’enzima, che consentirà alla cellula temporaneamente di riprendere la sua crescita (utilizzando
il secondo composto).

La crescita diauxica può essere osservata anche in microrganismi eucarioti (S. cerevisiae).

107
La crescita diauxica è stata una scoperta fondamentale. Jacques Monod ricevette il premio Nobel per la medicina, nel 1965,
grazie a questi studi della crescita diauxica che hanno portato infine alla definizione della “teoria dell’operone”.

Applicazione pratica della crescita BILANCIATA: IL CHEMOSTATO

IL CHEMOSTATO

Permette di ottenere cellule

(i) in crescita continua
(ii) a concentrazione costante

Nella beuta centrale, che è la camera di crescita, è presente un

rotore che fa sì che la brodocoltura sia mantenuta sempre in
agitazione. La camera di crescita è collegata ad un altro contenitore
che contiene terreno sterile, che ad intervalli di tempo regolari, viene
immesso all’interno della camera di crescita, ed un uguale volume di
terreno che è stato consumato viene scaricato in un recipiente della
raccolta. Il recipiente di raccolta scaricherà i cataboliti e parte delle
cellule che sono presenti e in questo modo si eviterà di arrivare ad una
densità cellulare talmente elevata che possa condurre all’ingresso nella
fase stazionaria. Con questo continuo rinnovamento del terreno e
dell’ossigeno (perché è presente anche un condotto per il
rifornimento dell’aria) è possibile mantenere le condizioni ottimali
necessarie per favorire una crescita continua a concentrazione
costante delle cellule, il tutto strutturato in modo che avvenga nella
massima sterilità. Se ponessimo i parametri ottenuti in seguito al
mantenimento di queste condizioni avremmo un retta con pendenza positiva.

Nella camera di crescita, viene mantenuto costante il volume del mezzo di coltura: un nutriente è somministrato a
concentrazione limitante allo scopo di imporre un determinato tempo di generazione alla popolazione cellulare.

Il terreno viene continuamente rinnovato, mediante ingresso di terreno fresco e rimozione di un eguale volume di terreno
dalla camera di crescita, insieme alle cellule che vengono raccolte.

La regolazione del flusso del terreno immesso nella camera d’incubazione viene stabilita in base al:
(i) volume del terreno nella camera di incubazione;
(ii) tempo di generazione delle cellule.

Volume, numero di cellule E CONCENTRAZIONE NUTRIENTI mantenuti COSTANTI.

I chemostati utilizzati in laboratorio permettono anche di

controllare temperatura, pH, ossigeno libero e consentono
il prelievo sterile dei campioni da analizzare.

Utilizzato per studi di fisiologia microbica, per

valutare l’insorgenza di mutazioni in una popolazione che
continua a replicarsi…

108
 INFLEUNZA DI FATTORI AMBIENTALI SULLA CRESCITA BATTERICA

Lo studio di questi fattori aiuta a meglio comprendere la distribuzione dei microrganismi in natura e a sviluppare metodologie
di controllo e prevenzione della crescita microbica.

TEMPERATURA

Generalmente, l’aumento di temperatura determina un aumento della velocità delle reazioni enzimatiche e, quindi, una
maggiore velocità di crescita.

L’intervallo di temperatura cui crescono i microrganismi riflette la temperatura dell’ambiente in cui vivono.

∙ temperature troppo basse: la membrana solidifica (alterazione della funzione, interruzione delle funzioni che si svolgono
al livello di membrana, ma non della struttura)

∙ incrementi di 10 °C: la velocità di crescita raddoppia (aumento della catalisi enzimatica, la T funziona da catalizzatore
delle reazioni enzimatiche)

∙ temperature troppo alte: liquefazione della membrana (alterazione della struttura e della funzione)

Possiamo dire che la temperatura influisce sulla curva di crescita batterica influenzandone la FORMA.

I valori di temperatura ottimali per la crescita (temperature ottimali) registrate più frequentemente in laboratorio variano tra
0 e 75 °C.

Sono stati isolati Archea che crescono a -20 °C ed a 120 °C

Gemmata barossii 121 °C: Ipertermofilo anaerobio marino

Il fattore più importante che determina il range di temperatura a cui un microrganismo può crescere è l’acqua: deve essere
mantenuta sempre liquida.

Effetto della temperatura sulla crescita batterica

109
Morte cellulare
La massima temperatura di crescita (temperatura cardinale massima) è più vicina all’ottimale di quanto non lo sia la
temperatura minima di crescita (temperatura cardinale minima).

I ritmi replicativi aumentano con l’aumentare della temperatura cardinale

minima fino alla temperatura cardinale ottimale. Decrescono rapidamente
ai valori compresi tra quello cardinale ottimale e cardinale massimo; ulteriori
aumenti non sono più compatibili con la crescita.

Una delle più comuni cause di infezioni associate all’ingestione degli alimenti è
dovuto ad un’impropria conservazione del cibo.
La principale causa di malattie di origine alimentare è l'abuso di tempo e
temperatura. L'abuso di temperatura del cibo si verifica quando il cibo viene
lasciato a temperature superiori a 4°C e inferiori a 60°C. Questo intervallo di
temperatura è comunemente chiamato “The danger zone”.

Tossinfezzione → si riferisce alla contestuale ingestione di tossine e

microrganismi che sono in grado di duplicarsi.

Intervalli di temperatura di crescita batterica

1. Psicrofili: isolati da mari artici ed antartici, dove la

temperatura media è 5°C. Hanno acidi grassi insaturi
nella membrana, che rimane fluida a basse
temperature mentre si disgrega a 20°C. Capaci di
crescere tra 0 e 20°C; ottimale 10-15°C.

2. Mesofili: sono la stragrande maggioranza di

microrganismi che hanno molta rilevanza in ambito
clinico. Ampio range di tolleranza alla temperatura e
comprendono anche psicrofili facoltativi (possono
crescere a 0-7 °C), con temperatura ottimale di
crescita di 20-35°C. Includono i patogeni umani (37°C); ottimale 20-45°C.

3. Termofili: crescono tra 45-80°C con temperature di crescita ottimali di 55°C. Differiscono per molti aspetti dai mesofili:
proteine enzimatiche termostabili ed attive a temperature alte; membrane ricche in lipidi ad alto peso molecolare, saturi e
ramificati. Comprendono Bacteria (un limitato numero) ed Archea.

4. Ipertermofili: crescono a temperature maggiori di 55°C. I microrganismi con temperatura ottimale di crescita superiore
od uguale ad 80°C vengono definiti Ipertermofili. Comprendono quasi esclusivamente Archea, di cui alcuni hanno
temperature ottimali di crescita superiori a 100°C (Ipertermofili estremi 4’).

pH

𝟏
𝒑𝑯 = − 𝐥𝐨𝐠[𝑯+ ] ∙ 𝐥𝐨𝐠
𝑯+

Il pH del solubile cellulare viene mantenuto intorno alla neutralità (H+=10-7M) per impedire la denaturazione acida di enzimi,
proteine di trasporto ed alterazioni di membrana.

Range di pH di ambienti colonizzati da batteri ed archea: da 0 a 10

110
 ACIDOFILI → pH 0-5.5, Ferroplasma (0-2) H. pylori (2)

NEUTROFILI → pH 5.5-8 la maggioranza dei batteri

ALCALOFILI → pH 8.5-11.5 B. alcalophilus

Comportamento dei batteri, come velocità di crescita, espresso in funzione del pH.

Helicobacter pylori

Riesce a sopravvivere in un pH che è estremamente inospitale (pH 2) che

trasforma e neutralizza grazie alla presenza di enzimi chiave come l’ureasi,
che è in grado di scindere l’urea e produrre ioni ammonio. Helicobacter pylori
nell’ecosistema nel quale si instaura riesce, aderendo saldamente alla cellula
epiteliale gastrica, a creare una nicchia in cui il pH non è così devastante per
la cellula batterica, perché l’affinità dell’enzima ureasi consente di scindere
l’urea e rilasciare ioni ammonio.

Ureasi: è considerato un determinate che mediante la neutralizzazione del pH

gastrico riesce a causare danno alla mucosa dello stomaco.

Oltre a creare vacuolizzazione porta all’insorgenza dell’ulcera peptica, che se

non trattata porterà allo sviluppo del cancro allo stomaco. Nello stomaco non
si concentra in una zona sola, ma la mucosa gastrica viene colonizzata con una
modalità che viene definita carta geografica (quindi aree diverse). Questa
diffusione complica la diagnosi perché la biopsia prevede il prelievo in almeno 3-4 punti dell’antro gastrico.

111
 Ogni qualvolta si sospetta la presenza di Helicobacter pylori nel distretto gastrico,
dover fare sempre una biopsia risulta essere una procedura piuttosto invasiva perché
la biopsia viene fatta attraverso la gastroscopia.

Per questo motivo viene utilizzato un test, molto più rapido, che può essere effettuato
in modo meno invasivo e che viene impiegato per primo come test di screening.

La positività all’urea breath test richiama indagini di conferma attraverso il metodo

classico colturale, e quindi con il prelevamento della biopsia. Il test si basa sulla
presenza dell’enzima ureasi da parte del batterio, che scinde l’urea.

L’urea viene fornita marcata radioattivamente, o con il C13 o con il C14, sotto forma di una pasticca o sotto forma di una
sospensione che viene bevuta. L’urea marcata ingerita nello stomaco arriva al livello della mucosa e se Helicobacter pylori è
presente si ha la liberazione dell’ureasi che fa sì che si scinda l’urea, che si liberi lo ione ammonio (che serve al batterio per
tamponare un po’ l’ambiente) ma si libera anche anidride carbonica marcata, che viene espulsa attraverso la respirazione e
quindi rilevata dall’operatore.

1. Effettuare un primo test a riposo, per avere un campione di controllo

2. Si assume la pasticca o la sospensione
3. Si rimane sdraiati per circa 5 minuti sul lato sinistro, per favorire il raggiungimento dello stomaco e la massima
diffusione al livello dell’antro gastrico
4. Si procede alla espirazione all’interno dell’urea bag

Il test completo si ottiene in circa 20 minuti e se si ottiene positività all’urea breath test implica la prescrizione del test della
biopsia per la conferma. La biopsia è importante per valutare la suscettibilità di Helicobacter pylori agli antibiotici per scegliere
l’opzione terapeutica più appropriata da seguire.

I microrganismi rispondono a variazioni di pH esterno in modo da mantenere valori compatibili di pH nel solubile cellulare;
l’omeostasi intracellulare, per piccole variazioni di pH è mantenuta da Proteine Antiporto
1. neutrofili: scambiano H+ con K+
2. alcalofili: scambiano Na+ con H+

Se il pH esterno diviene troppo acido non è bilanciabile da sistemi antiporto; viene indotta una “risposta alla tolleranza a
pH acidi”; in S. typhimurium ed E. coli
- se pH < 6-5.5: aumento di ATPasi, che pompa H+ dall’esterno ed aumenta sintesi di ATP
- se pH < 4.5: vengono sintetizzate chaperonine (da shock acido) che prevengono la denaturazione acida delle
proteine

I prodotti acidi della fermentazione possono portare a morte precocemente cellule in crescita.

Soluti ed attività dell’acqua nell’ambiente di crescita

Disponibilità di acqua espressa come attività dell’acqua aw

La protezione da variazioni di OSMOLARITA’ ambientali è essenziale per impedire la PLASMOLISI (ambienti ipertonici),
l’OSMOLISI (ambienti ipotonici) ed a garantire la possibilità di assumere acqua anche in ambienti in cui l’aw* è bassa.

*aw: viene espressa come % di umidità dell’aria sopra un campione di acqua pura mantenuto a temperatura
costante in un sistema chiuso.
Attività dell’acqua pur a = 1.0. Se l’acqua non è pura, la pressione osmotica della soluzione aumenta ed il corrispondente
valore di aw diminuisce (l’aw di una soluzione è pari a 0.95, quando la % di umidità della soluzione è 95).

112
La maggior parte dei batteri cresce bene a valori di aw intorno a 0.98 (acqua di mare), mentre non sopravvive a valori inferiori
a 0.55 per effetto della disidratazione, che danneggia la membrana ed arresta il metabolismo.

Se l’aw è bassa, le cellule compensano aumentando la concentrazione intracellulare di osmoprotettori e/o degranulando le
inclusioni citoplasmatiche (hanno il compito di mantenere la pressione osmotica intracellulare).
Ciò consente alle cellule di mantenere la pressione osmotica intracellulare di poco superiore a quella esterna, in modo
da assumere acqua per diffusione.
In condizioni fisiologiche, infatti, la membrana è “pressata” contro la parete, in quanto la concentrazione dei soluti è sempre
più alta di quella dell’ambiente esterno.

Meccanismi osmoprotettori

(i) PARETI RIGIDE E POCO DEFORMABILI, proteggono dalla lisi osmotica

(ii) CANALI MECCANO-SENSORI: presenti in Batteri ed Archea. Si aprono quando aumenta la pressione idrostatica
esercitata sulla membrana per effetto del rigonfiamento cellulare: vengono eliminati soluti intracellulari.
(iii) OSMOPROTETTORI: sintesi od assunzione di SOLUTI COMPATIBILI, che non interferiscono con il metabolismo e la
crescita: saccarosio, glicerolo, betaina (derivato metilato della glicina molto solubile), prolina, acido glutammico ed
altri aminoacidi.
(iv) CORPI DI INCLUSIONE di vari soluti, che vengono de- o poli-merizzati

OSMO- ALO-TOLLERANTI: crescono in ambienti con ampi

range di valori di aw e di pressione osmotica. S. aureus è
l’esempio più noto: riesce a crescere a 3 M NaCl

ALOFILI: RICHIEDONO concentrazioni superiori a

0.2 M di NaCl per crescere e la crescita ottimale si verifica a 2 M
NaCl

ALOFILI ESTREMI: RICHIEDONO elevate concentrazioni di

NaCl per crescere: da 2 M fino a saturazione (6.2 M);
controbilanciano la scarsa aw concentrando K+ (4-7 M) nel
solubile cellulare.

Ossigeno: tossicità

113
Oltre ad essere un costituente di molte molecole organiche, l’ossigeno è richiesto anche come accettore finale di elettroni nel
metabolismo energetico.
Per alcuni microrganismi, tuttavia l’ossigeno può essere anche tossico.

- Aerobi obbligati → crescono solo in presenza di O2 perché costituisce l’accettore finale della catena di elettroni nella
catena respiratoria. Sono microrganismi che possono essere obbligati, facoltativi e aerotolleranti.

- Microaerofili (< 0,2 atm) → cresce in ambiente

aerobio ma non deve essere ricca in O2

- Anaerobi obbligati → crescono solo in assenza di O2

(ad esempio Clostridium tetani/botulinum) perché non
costituisce l’accettore finale della catena di elettroni,
ma lo saranno altri composti. Possono essere anerobi
obbligati e facoltativi.

- Anaerobi facoltativi (aerobi facoltativi) → crescono

in entrambe le situazioni

- Anaerobi aerotolleranti → l’O2 non risulta essere

tossico, ma prediligono un metabolismo di tipo anaerobio

Batteri piezofili (barofili)

 batteri adattati a pressioni (idrostatiche) elevate

Oceani=70% biosfera, con profondità > 1000m:

• elevate pressioni (fino a 1000 atm) → si trovano anche batteri psicrofili
• bassa temperatura (1-2°C)
• no luce
• pochi nutrienti (C organico)

Grotte e cavità sommerse anossiche, blue holes:

• scarso scambio di acqua
• accumulo di H2S
• condizioni chimico-fisiche stabili

Sorgenti idrotermali abissali=condizioni ambientali completamente differenti:

• elevate pressioni
•
• elevate temperature (batteri ipertermofili: t ottimali 90-100°c)
• no luce
• no ossigeno (batteri anaerobi)
• no antropizzazione

114
 Batteri anaerobici della famiglia Colwellia
17/11/20
METABOLISMO BATTERICO

I PROCARIOTI sono stati i primi ORGANISMI comparsi sul pianeta “TERRA”.

Dopo il “Big-Bang”, con cui viene fatto iniziare l’Universo [18 Ga (1Ga = 109 anni)], si forma il Sistema Solare (4.5 Ga).

I primi batteri fossili risalgono a più di 3.5 Ga.

I procarioti compaiono nell’Archeano (meno di 1 miliardo di anni dopo la formazione della Terra). Costituiscono la forma di
vita dominante per i 3 miliardi di anni successivi (3.5-0.5 Ga) e colonizzano vaste aree del pianeta (dalle più ospitali a quelle
meno).

Ancora oggi, i microrganismi sono i più numerosi tra tutti i gruppi di viventi, sono ubiquitari, e colonizzano tutti gli
ambienti, compresi quelli più estremi, che ricordano la Terra ai primordi della sua formazione.

I batteriofagi sono dei virioni, delle particelle virali, che trovano la loro ragione d’essere solo quando parassitano una cellula,
perché sono parassiti cellulari obbligati. I batteriofagi sono virus che hanno come unico spettro d’ospite i batteri.

Si ritiene contengano il 50% del C ed il 90% di N biologico presente sulla Terra. Sono alla base della catena alimentare
ed essenziali per il riciclo degli elementi. I microrganismi fotosintetici competono con le piante per organicare CO 2 e produrre
O2.
I microrganismi patogeni sono una minoranza. Sono per lo più innocui o benefici.

L’evoluzione ha prodotto microrganismi molto diversificati metabolicamente capaci di utilizzare qualsiasi substrato,
compresi quelli più insoliti, quali metano, ammoniaca, idrogeno, zolfo, ferro ridotto...

I microrganismi sono stati gli artefici delle imponenti trasformazioni bio-geochimiche della biosfera primordiale. La loro lunga
evoluzione ha avuto un ruolo determinante nella formazione della BIOSFERA.

Basti pensare all’O2 che è di origine biogena. È comparso nella BIOSFERA intorno a 2.5 Ga, prodotto da cianobatteri
fotosintetici ossinogenici, che si sono evoluti tra i 3.0 ed i 2.4 Ga.

BATTERI ANAEROBI FOTOSINTETICI ANOSSIGENICI (che non sono in grado di generare ossigeno)

La capacità di compiere la fotosintesi, utilizzando molecole simili alla clorofilla, è comparsa subito dopo la separazione Archea-
Bacteria; infatti, a testimonianza della capacità di fare la fotosintesi senza generare ossigeno, non esistono Archea
fotosintetici, mentre procarioti fotosintetici sono numerosi tra gli Eubatteri.
La luce solare è la fonte di energia per compiere la fotosintesi, mentre l’idrogeno utilizzato per organicare la CO2
proviene dall’ossidazione di acido solfidrico (H2S) a S elementare: è una fotosintesi anossigenica (senza produzione
di O2), l’unica che poteva attuarsi in un ambiente anaerobico, ricco di CO2 e di H2S (idrogeno solforato).

CIANOBATTERI

La novità introdotta da questi microrganismi è stata la fotosintesi ossigenica, cioè la capacità di utilizzare l’H2O come
fonte di idrogeno con liberazione di ossigeno. Ciò è stato determinante per arricchire in O2 l’atmosfera primordiale.
Ancora oggi, i cianobatteri sono gli unici batteri capaci di una fotosintesi ossigenica. È interessante che alcuni di essi siano
capaci di utilizzare H2S come fonte di idrogeno. Ciò ha suggerito che sia avvenuta selezione di mutanti capaci di utilizzare
H2O anziché H2S e che tali mutanti siano stati favoriti solamente quando l’H2S atmosferico cominciava a scarseggiare.

115
Microrganismi che si adattano con estrema facilità ad ogni ambiente. Si trovano sia in acqua dolce che in acqua salata, a
temeperature di pochi gradi fino a oltre 70°C. Inoltre si adattano facilmente ad un ampio spettro di lunghezze d’onda che va
dai 500nm fino a 650nm. Possono essere di varie colorazioni (verdi, azzurri, rossi, bruni, neri) in base ai pigementi fotosintetici
in essi presenti.

Tutte le cellule richiedono un costante apporto di energia (ATP)

perché in caso contrario non avverrebbero la maggior parte delle
reazioni fisiologiche che mantengono una cellula vegetativa nella sua
forma vitale e replicativa. Il metabolismo consiste in una serie di
reazioni biochimiche che sono distinte in due classi:

- Catabolismo l’insieme delle reazioni che da un composto

porta alla riduzione nei monomeri. È definito un processo
esoergonico, cioè che libera energia perché la rottura dei
legami delle macromolecole, che via via arrivano a monomeri,
comportano la liberazione di energia. Esoergonico → che porta
alla produzione di energia.

- L’anabolismo è il processo mediante il quale dalle molecole

più semplici si ha la costruzione, la biosintesi, di
macromolecole. Questo è un processo endoergonico perché
la formazione dei legami richiede l’assunzione di energia.
Endoergonica → che porta alla sintesi di macromolecole complesse a partire da composti semplici.

ATP

L’energia è incamerata nei legami fosforici. Solitamente è il terzo gruppo fosfato che
viene rilasciato con rilascio di energia.

L’ATP è una molecola ad alta energia formata dalla base azotata adenina legata a
una molecola di ribosio a sua volta attaccata a tre gruppi fosfato. Nel legame P-
O fra il secondo e il terzo gruppo fosfato dell’ATP è immagazzinata un’elevata quantità
di energia, così come tra il primo e il secondo. Tuttavia, nelle reazioni cellulari si
stacca, in genere, solo il terzo gruppo fosfato.

Il metabolismo inizia con l’idrolisi di grosse macromolecole all’esterno della cellula (esoenzimi).
I prodotti ottenuti (monosaccaridi, peptidi, acidi grassi) vengono trasportati attraverso la membrana cellulare (trasporto
attivo/passivo).
I metaboliti sono convertiti in acido piruvico che è utilizzato per la produzione di energia o per la neosintesi di nuove
componenti.

116
Microrganismi ed energia

• microrganismi fototrofi: energia dalla luce solare (fotosintesi)

• microrganismi chemiotrofi: energia da ossidazione di composti chimici

Fotosintesi batterica

• fotosintesi anossigenica (batteri sulfurei rossi e verdi anaerobi obbligati): Batteri sulfurei rossi e verdi lungo un
gradiente di luce → fotosintesi che non porta alla produzione di ossigeno
• fotosintesi ossigenica (piante, alghe, cianobatteri) → questa tipologia di fotosintesi porta alla produzione di ossigeno

Chemiosintesi

ossidazione di sostanze chimiche per ottenere energia

“OSSIDAZIONE = rimozione di elettroni o sottrazione di atomi di idrogeno” -> H=H++e-
Produzione di energia cellulare

I principali meccanismi per produrre energia cellulare, a partire da una sorgente

esogena, sono le reazioni catalizzate da fotoni (fototrofia) e quelle di ossidazione di
composti ridotti, sia organici (chemiorganotrofia/chemio-eterotrofi) che inorganici
(chemiolitotrofia/chemio-autotrofi).

- Chemiorganotrofi (chemio-eterotrofi): ricavano energia da reazioni chimiche che

ossidano composti organici;
- Chemiolitotrofi (chemio-autotrofi): ricavano energia da composti minerali
inorganici;
- Fototrofi: ricavata da fotoni (Sole).

L’elemento unificante è dato dalla capacità di incanalare l’energia catturata in

energia chimica, l’ATP, che costituisce il principale mezzo per conservare/scambiare
energia cellulare.

Le 3 tappe fondamentali del METABOLISMO ENERGETICO (sottolineando che è la

produzione di ATP tramite catabolismo di polisaccaridi, proteine e lipidi, l’elemento
finale fondamentale):

Stadio 1: produzione di monomeri → catabolismo

Stadio 2: degradazione dei monomeri, tramite processi di fosforilazione del substrato

(Fermentazione)

Stadio 3: degradazione completa dei monomeri tramite la fosforilazione ossidativa,

cioè attraverso il meccanismo di respirazione, che sia essa anaerobica o aerobica

Ossidazione/riduzione

117
 Reazioni di ossidazione e riduzione sono sempre accoppiati.

Poiché un trasferimento di elettroni richiede sia un donatore che un

accettore di elettroni, l’ossidazione e la riduzione avvengano sempre
insieme.

Mentre il reagente A cede elettroni e si ossida, il reagente B acquista

elettroni e si riduce.

Ossidazione dei substrati

• Glucosio: viene ossidato

• L’idrogeno e gli elettroni rimossi dal substrato non possono restare liberi quindi vengono presi dagli accettori.

Quale accettore?

NAD, NADP e FAD “accettori temporanei”

NAD, NADP, FAD → “coenzimi trasportatori di idrogeno” (riduzione)


NADH, NADPH, FADH2 → potere riducente sotto forma di coenzimi ridotti

Sono definiti temporanei perché possono trasferire idrogeno / elettroni a un “accettore finale”
(quello che verrà coinvolto nella produzione di ATP)

NAD

Microrganismi: alternative metaboliche

Batteri: ampia varietà di sostanze in grado di funzionare come accettore finale di idrogeno o elettroni
alternative possibili:

» respirazione aerobia maggior resa energetica

» respirazione anaerobia (senza ossigeno  l’accettore finale non è l’ossigeno) resa energetica intermedia
» fermentazione minor resa energetica
La resa energetica aumenta procedendo dal basso verso l’alto.
118
Prendiamo come esempio il glucosio come “carboidrato modello” per la metabolizzazione e produzione di energia.

Degradazione di glucosio ad acido piruvico

Glicolisi o VIA DI EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS (EMP), principale via metabolica utilizzata da molti microrganismi,
eucarioti e procarioti.

VIA DI ENTNER-DOUDOROFF, utilizzata da molti BATTERI Gram negativi (unica via per Zymomnas mobilis) e in alcuni
Archea. In Pseudomonas aeruginosa questa via coesiste con la EMP (la glicolisi).

Ciclo ossidativo dei pentoso-fosfati, utilizzata da molti batteri, indipendentemente dalla via o di Entner Doudoroff per il
catabolismo del glucosio, per generare precursori metabolici essenziali per le biosintesi.

RESPIRAZIONE AEROBIA

FASI:

119
Il glucosio appena entra all’interno della cellula, a spese di ATP, viene fosforilato → glucosio 6-fosfato.
Trasformazione endoergonica, perché viene assunta energia, perché sia ha la formazione di legami → formazione del fruttosio
1,6-difosfato. Fase: lo zucchero è a 6C e si ha il consumo di 2 molecole di ATP.

Quando si forma il fruttosio-1,6-difosfato subentra l’enzima aldolasi che rompe la molecola a 6C in due molecole a 3C →
gliceraldeide-3-fosfato.
A questo punto sono presenti dei passaggi in cui interviene il NAD, che assume elettroni ed idrogeni trasformandosi in NADH.
Si ha adesso la generazione della prima molecola di ATP quando la 1,3-difosfoglicerato si trasforma in 3-fosfoglicerato, si ha
la cessione di uno dei fosfati per la genesi di ATP. Nell’ultimo passaggio si ha la formazione di un’altra molecola di ATP in
seguito alla cessione di un altro gruppo fosfato da parte del fosfoenolpiruvato che si trasforma in piruvato.

In questa fase si ha la produzione di 2 molecole di ATP, perché nella seconda parte si ha la produzione di 4 molecole di ATP
(due per ciascuna gliceraldeide-3-fosfato), ma per arrivare al fruttosio 1,6-difosfato se ne erano consumate due  per mole
di glucosio abbiamo 2 moli di ATP prodotte per ogni molecola di glucosio che è entrata nella glicolisi che ha portato a due
molecole di piruvato. Si ha anche la produzione di NADH.

Catena respiratoria

• tutti i coenzimi ridotti (glicolisi + ciclo di Krebs) sono inviati alla catena respiratoria
• per ogni NADH ri-ossidato (che cede elettroni ed idrogenioni) si producono 3 ATP
• per ogni FADH2 ri-ossidato (che cede elettroni ed idrogenioni) si producono 2 ATP
• l’ossigeno costituisce l’accettore finale (con produzione di acqua)

120
Catena di trasporto degli elettroni

Gli e- seguono il poro potenziale

redox passano attraverso queste
componenti inserite nella membrana
dei mitocondri (per le nostre cellule)
e nella membrana plasmatica dei
batteri (per i procarioti).

Alla fine di questa catena gli atomi di

H+ vengono fatti reagire con l’O2 con
la produzione di H2O.

NADH deidrogenasi → flavoproteine → proteine ferro zolfo (Fe-S) → citocromi

Catena di trasporto di E. coli

I componenti della catena di trasporto sono di natura proteica e non proteica.

I gruppi prostetici delle proteine includono gruppo eme (citocromi); Fe-S nelle proteine ferro-zolfo; flavinmononucleotidi
(FMN) nelle flavoproteine.

La riduzione di flavoproteine o chinoni (Q) richiede protoni (H) ed elettroni, mentre citocromi e proteine Fe-S richiedono solo
trasferimento di e-.
L’ordine con cui avvengono le reazioni non è casuale, ma dettato dai potenziali redox dei diversi componenti.

H+: sono trasportati attraverso la membrana (che sarebbe impermeabile agli H+). Il loro efflusso si attua quando FMN (1) ed
il complesso CoQ (2), che trasportano sia H+ che e-, trasferiscono gli e- a proteine FeS (3) ed ai Cyt (citocromi), che trasportano
solo e-. A livello della Cyta (4), si verifica influsso di H+, pompati nel solubile (contro gradiente), che a contatto con O2 formano
H2O.

e-: sono trasportati nello spessore della membrana, da donatori ridotti ad accettori sempre meno ridotti fino all’ O2, per
combinarsi con H+ e formare H2O.

121
Gli H+ che attraversano la membrana, a coppie, sono almeno 10 durante l’ossidazione di NADH: ciò genera la PMF utilizzata
per la sintesi di ATP, catalizzata da ATP sintetasi, che genera una molecola di ATP da ADP per l’influsso di 3H+.

Esempio di adattamento a condizioni di crescita diverse

NADH, deidrogenato da NADH-deidrogenasi, incanala gli H+ e gli e-

verso il complesso del coenzima Q (CoQ) che fa fluire i protoni verso
l’esterno e gli e- in due sistemi di citocromici a seconda della tensione
esterna di O2.

1. BASSA TENSIONE DI O2
Maggiore espressione citocromo bd. Fase stazionaria di crescita o
in condizioni di bassa tensione.
Ha elevata affinità per l’O2 ed opera anche a bassi livelli di O2 con
una resa minore in sintesi di ATP, perché non pompa attivamente H+.

2. ALTA TENSIONE DI O2
Espressione preferenziale di citocromo bo. Fase esponenziale.
Ha più bassa affinità per l’O2 ed opera a livelli di O2 più alti, con
maggiore resa in sintesi di ATP, poiché pompa più attivamente H+.

Bilancio energetico totale della respirazione aerobia

Glicolisi: 2 ATP
Ciclo di Krebs: 2 ATP
Catena respiratoria: 34 ATP
Totale 38 ATP

• Il metabolismo energetico di tipo respiratorio è tipico dei germi aerobi e anaerobi facoltativi.
• Nella respirazione aerobica l’ossidazione del substrato sia organico che inorganico è accoppiata alla riduzione
dell’ossigeno molecolare che funge da accettore finale di elettroni e protoni.
• Componenti della catena respiratoria sono: flavoproteine (FMN, FAD) e chinoni (benzochinone) come trasportatori di
idrogeno.

Il metabolismo energetico di tipo respiratorio è tipico e operato dagli aerobi e anaerobi facoltativi.

Gli anerobi facoltativi possono ricavare energia sia dalla fermentazione che dalla respirazione, base alle condizioni
ambientali. Prima usa la fermentazione quando il substrato è abbondante, poi quando comincia a scarseggiare inizia la
respirazione. Sono quindi aerobi, ma che possono adattarsi alla vita fermentativa (e quindi anaerobica).
Nella respirazione aerobica l’ossidazione del substrato (sia organico che inorganico) è accoppiata alla riduzione dell’O2 che
funge da accettore finale di e- e protoni con produzione di acqua.

RESPIRAZIONE ANAEROBIA

accettori finali:

- Solfato (SO42-) che viene ridotto fino all’acido solforico (H2S);

- Zolfo (S0) può essere ridotto a H2S;
- Carbonato (CO2) con la produzione di acido carbonico ma si può arrivare al metano (che è la forma più ridotta del C);
- nitrato (NO3-) con produzione di nitrato (NO2-);

122
 - ferro (Fe3+) ridotto a Fe2+;
- zinco;
- manganese.

utilizzati da:

- Solfatoriduttori (Desulfovibrio)
- Metanobatteri: (produzione CH4) sono anerobi e si trovano a una certa profondità nell’acqua; i metanotrofi stanno più
in superficie dove c’è più ossigeno e utilizzano i prodotti dei metanobatteri che stanno più in fondo)
- Batteri anaerobi facoltativi: enterobatteri che possono utilizzare come accettore di e- il nitrato riducendolo a nitrato
(batteri denitrificanti)

La respirazione anaerobia non è efficiente per quanto riguarda la sintesi di ATP, come la respirazione aerobia. In condizione
di anaerobiosi la respirazione anaerobia è più efficiente della fermentazione.

Le catene respiratorie procariotiche

Le catene respiratorie procariotiche, localizzate sulle

membrane plasmatiche, sono funzionalmente simili a quelle
dei mitocondri.

Ma possono:
1) Comprendere diversi trasportatori di e- e, talora,
essere costituite da pochi trasportatori e, produrre,
quindi, limitate quantità di ATP
2) Essere estesamente ramificate e comprendere
diverse ossidasi terminali
3) Presentare adattamenti in funzione della
crescita, in particolare in rapporto alla disponibilità
di O2, disponendo di catene di trasporto alternative
4) Molte specie possono effettuare sia una respirazione
aerobica che anaerobica

La respirazione anaerobica è molto diffusa tra

Eubacteri ed Archea, reminiscenza del lungo periodo di
evoluzione microbica in ambiente anossico: negli anaerobi,
l’accettore terminale di e-, che non è mai O2, può essere
molto diversificato. Può essere considerata una
reminiscenza del periodo in cui i batteri si trovavano in un
ambiente anossico.

Destino dell’acido piruvico

123
 Negli aerobi il piruvato viene ossidato completamente con la
formazione di H2O e CO2 e con la formazione di 38 ATP (per
molecole di glucosio).

Negli anaerobi l’ossidazione del piruvato è incompleta e deve

essere eliminato come prodotto di rifiuto riducendolo e
degradandolo (es. nella fermentazione lattica viene eliminato
come acido lattico, mentre nella fermentazione alcolica viene
prodotto etanolo). Qui la resa energetica netta è molto bassa: si
ha la formazione di 2 ATP.

Fermentazione

accettore finale:
acido piruvico (è un composto organico prodotto dalla glicolisi ed è l’accettore finale di idrogeno e di elettroni) ridotto e
trasformato nei vari prodotti di fermentazione (es: acido lattico)

Guadagno totale netto 2 ATP (glicolisi)

Acido piruvico → vari prodotti di fermentazione

- Incompleta ossidazione di carboidrati (glucosio), aminoacidi od acidi grassi in assenza di O 2 (anareobiosi):

o Donatore ed accettore organici di e-
• Donatore = glucosio principalmente, ma anche aminoacidi (Clostridium), purine, pirimidine, acidi organici.
• Accettore= acido piruvico ok suoi metaboliti

- Processo metabolico “primitivo”:

o 2 ATP/molecole di glucosio fermentata
o Veloce, ma poco efficiente (vs respirazione)

- Prodotti:
o alcool etilico (lieviti, da glucosio)
o gas, acidi (batteri, da piruvato)

• alcolica: alcol etilico, CO2 (lieviti) [C6H12O6 glucosio → CH3CH2OH alcol etilico + CO2 anidride carbonica + energia]
• lattica: acido lattico (batteri lattici) omolattica o eterolattica [C12H22O11 lattosio → CH3CHOHCOOH acido lattico + altre
sostanze]
• acido-mista: acido lattico, acetico, succinico,formico, alcol etilico, anidride carbonica, idrogeno (enterobatteri)

124
 • propionica: acido propionico, acido acetico, CO2 (Propionobacterium) [C6H12O6 zucchero semplice → CH3CH2COOH acido
propionico + CO2 anidride carbonica + altre sostanze]
• butandiolica: 2,3-butandiolo, acetoina, CO2, ecc. (enterobatteri)
• butirrica e isopropilica: acido acetico, butirrico, isopropilico, acetone, alcol butilico, CO2, H2 (Clostridium)
• acetica: [CH3CH2OH alcol etilico + O2 → CH3COOH acido acetico + H2O]

I prodotti delle fermentazioni batteriche sono straordinariamente numerosi e sono il risultato di vie metaboliche anche
molto complesse.

Fermentazione alcolica

Nei lieviti il metabolismo fermentativo produce etanolo dal piruvato.

Fermentazione alcolica più rara nei batteri, che più frequentemente convertono
acido piruvico in acido lattico.

Fermentazione lattica

Questo processo è responsabile della

trasformazione del latte in yoghurt e
delle verze in crauti.

Omolattica: quando l’unico prodotto

della fermentazione è l’acido lattico.

Eterolattica: quando si ha la produzione

di acido lattico ma contemporaneamente
si ha anche la produzione di altri
sottoprodotti del catabolismo tra cui
l’etanolo.

125
2-36 è il massimo ed il minimo in base alla tipologia di accettore.

Molti altri batteri utilizzano vie fermentative più complesse, che portano alla formazione di vari acidi e gas (odore sgradevole).
Questi prodotti conferiscono caratteristici aromi a vini e formaggi.

BATTERI ANAEROBI OBBLIGATI: possono vivere solo in assenza di ossigeno. Non riescono a produrre che riescono a
detossificare i prodotti dell’ossigeno. Traggono energia solo dalla fermentazione o attraverso la respirazione anaerobia
(Clostridium).

BATTERI AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI: possono vivere anche in assenza di ossigeno (ma si replicano più
rapidamente in sua presenza quindi con una fermentazione aerobia). Possono trarre energia dalla fermentazione o attraverso
la respirazione (Staphylococcus, Vibrio, Salmonella).

BATTERI MICROAEROFILI: non possono moltiplicarsi in presenza di ossigeno (20%), crescono più rapidamente a
concentrazioni di ossigeno tra il 2 e il 18%. Possono trarre energia dalla fermentazione o attraverso la respirazione
(Streptococcus).

BATTERI AEREOTOLLERANTI: non richiedono ossigeno e non lo utilizzano nelle loro tappe metaboliche, ma sopravvivono
se esposti all’aria, in quanto possono attivare processi solo fermentativi (Lactobacilli, che sopravvivono perché hanno uno o
più enzimi in grado di detossificare gli intermedi reattivi dati dall’ossigeno).

Per incubare i microrganismi in assenza di ossigeno prima si ponevano dentro un contenitore cilindrico di plastica, con una
chiusura ermetica, e si posizionava una candela che veniva accesa (chiuso ermeticamente) e la candela bruciando eliminava
tutto l’ossigeno residuo.

126
20/11/20

IL MATERIALE GENETICO NEI BATTERI

Cosa si intende per genoma batterico? Si intende l’insieme di tutti i geni di un determinato organismo che possono codificare
sia per funzioni essenziali, sia per non funzioni non essenziali alla vitalità del microrganismo.

Si tratterà quindi di geni che codificano per componenti strutturali del batterio, codificanti enzimi coinvolti in vie metaboliche
essenziali, per la replicazione del DNA, sintesi di acidi nucleici, o di geni che codificano per fattori di regolazione.

Questi geni sono tutti localizzati sul cromosoma. Accanto a questi, ci sono geni accessori, che invece codificano per funzioni
non essenziali alla vitalità del batterio, ma possono codificare per proteine che danno particolari caratteristiche come:
patogenicità, resistenza antibiotici, geni che codificano per particolari vie di secrezione, ecc. Questi geni accessori possono
essere localizzati o sul cromosoma o su plasmidi e trasposoni.

• Cromosoma
Singolo cromosoma circolare nella maggior parte dei batteri. In alcuni casi cromosomi lineari o più di un cromosoma (es.
Deinococcus radiodurans, 8 cromosomi; Archea methanococcus, 3-10 nucleoidi)

• Geni accessori

PLASMIDI

Elementi genetici extra-cromosomici a DNA a doppio filamento. Nella maggior parte dei casi si tratta di molecole circolari.
Nell’ultimo periodo sono stati mesi in evidenza dei plasmidi che non hanno una conformazione circolare ma lineare. Di questa
tipologia si possono distinguere due tipologie che presentano, una un’estremità 5’ di un filamento legata covalentemente
all’estremità 3’ del filamento complementare, mentre l’altra presentano una proteina legata alle estremità 5’.

I plasmidi sono capaci di replicazione AUTONOMA rispetto al cromosoma batterico, questo vuol dire che il plasmide può
replicarsi all’interno di una cellula batterica soprattutto quando il cromosoma NON si duplica.
Dal punto di vista temporale la replicazione dei plasmidi non è correlata a quella dei cromosomi batterici. La replicazione dei
plasmidi avviene all’interno di un batterio con dei meccanismi di controllo che sono completamente indipendenti dal
cromosoma batterico. Quando il cromosoma si replica e il batterio si divide i plasmidi vengono distribuiti e ripartiti tra le cellule
figlie in forma del tutto casuale.

• Dimensioni variabili (1-1000 kb) → ci sono dei plasmidi molto grandi, ma anche plasmidi molto piccoli.
• Numero di copie variabile (1- 500) → i plasmidi vengono definiti a basso numero di copie, ma anche plasmidi ad alto
numero di copie. Solitamente i plasmidi piccoli sono ad alto numero di copie, mentre i plasmidi grandi sono a basso
numero di copie.
o F: 1 copia
o P1 (profago): 1 copia
o RK2: 4-7 copie (in E. coli)
o pBR322: 16 copie
o pUC18: 30-50 copie
o pIJ101: 40-300 copie

Una caratteristica non esclude l’altra, infatti il plasmide F, che è molto grande ed è presente in singola copia, può
promuovere il trasferimento ad un altro batterio mediante il processo di coniugazione, ma può anche integrarsi nel
cromosoma batterico.

• Alcuni possono essere trasferiti ad un’altra cellula anche di altre specie (plasmidi coniugativi) → sono plasmidi che
promuovono il loro trasferimento da un batterio ad un altro, anche appartenente ad una specie differente, mediante un
processo di trasferimento genico orizzontale che si chiama coniugazione. Questi plasmidi vengono definiti coniugativi.

• Alcuni possono integrarsi nel cromosoma (episomi) → questi plasmidi possono trovarsi liberi nel citoplasma batterica
ma possono anche auto-integrarsi nel cromosoma batterico e nel momento in cui sono integrati nel cromosoma batterico
si comportano come se fossero una parte di quest’ultimo. Tale integrazione implica che la loro replicazione debba essere

127
 associata a quella del cromosoma batterica e che, in quanto porzioni di esso, vengano trasmessi alle cellule delle
generazioni successive.

• Numero di geni relativamente basso (<30), NON ESSENZIALI per la crescita, ma che possono conferire caratteri fenotipici
importanti e/o un vantaggio selettivo.
L’esempio lampante relativo ai geni che conferiscono caratteristiche fenotipiche importanti che possono conferire un
vantaggio selettivo è rappresentato dai geni per la resistenza ad antibiotici o ad altri farmaci.

Oltre a questo esempio possiamo indicare anche geni che codificano per:
o la sintesi di fattori di patogenicità dei batteri
o la sintesi di enzimi catabolici (sintesi di proteine coinvolte nella degradazione di composti)
o sintesi di antagonisti per lo sviluppo di altri microrganismi
o sintesi di prodotti che consentono l’interazione con altri organismi
o sintesi di enzimi della replicazione e riparazione del danno da UV sul DNA
o induzione della proliferazione tumorale, in simbionti di piante
PRINCIPALI TIPI DI PLASMIDI
(classificati in base all’informazione genetica che portano)

1. Plasmidi coniugativi. Il più comune è il fattore F di E. coli. Sono capaci di attivare e regolare il proprio trasferimento da
una cellula donatrice (F +) ad una ricevente (F -) attraverso il pilo sessuale. Questo processo è chiamato coniugazione.
Con questo trasferimento i plasmidi portano nuovi geni alla cellula, rendendo il batterio capace di nuove funzioni (il più
comune p il fattore F di E. coli).

La regione “fra” è quella che contiene tutti i geni che codificano tutte le proteine deputate alla formazione dell’apparato
di coniugazione e al trasferimento del DNA plasmidico.

2. Plasmidi R (R= resistenza). Sono i più diffusi ed i meglio studiati. Contengono geni R che conferiscono resistenza agli
antibiotici. Alcuni possono conferire resistenza a più di un antibiotico. Molti sono coniugativi con conseguente
aumento della diffusione della resistenza nella popolazione batterica.

3. Plasmidi batteriocinogeni. Contengono geni per la sintesi delle batteriocine.

Batteriocine
Peptidi/piccole proteine ad azione antibatterica dotate di un più ristretto spettro
d’azione e di una maggiore capacità battericidica rispetto agli antibiotici.
Alcuni agiscono mediante la formazione di fori nella membrana (perforine), taglio di
DNA o RNA (attività nucleasica).
In genere uccidono specie batteriche strettamente correlate o ceppi differenti della
stessa specie. I batteri produttori sono immuni all’attività della batteriocina prodotta.
I geni per le batteriocine si trovano sul plasmide.

128
4. Plasmidi di virulenza. Plasmidi (solitamente si trovano nei microrganismi patogeni) che esprimono geni che codificano
per fattori di virulenza. Nella maggior parte dei casi questi fattori vengono localizzati sulla membrana del patogeno
(adesine: molecole che favoriscono l’adesione del batterio all’ospite) o secreti (esotossine). Molti microrganismi
patogeni possiedono plasmidi di virulenza.

• B. anthracis: capsula e tossina carbonchiosa sono codificate rispettivamente sui plasmidi pOX2 e pOX1;

• B. thuringiensis: tossine insetticide

• Clostridium: tossine neurotossiche (Tossina tetanica)

• E. coli enteropatogeno: è capace di colonizzare il colon e provocare un’intensa diarrea. Possiede un plasmide che
codifica per una proteina (fattore di colonizzazione) che permette l’adesione alle cellule intestinali e due enterotossine

• S. aureus: possiede un plasmide che codifica per tossine ed enzimi extracellulari coinvolti nella virulenza (coagulasi,
emolisine, enterotossine)

L’acquisizione di un plasmide di virulenza può determinare la comparsa di ceppi patogeni stabili, se il plasmide acquisito
è propagato clonalmente.

LA REPLICAZIONE DEI PLASMIDI

I plasmidi sono “repliconi”, cioè molecole capaci di replicazione autonoma


Avviene indipendentemente da quella del cromosoma batterico, ma necessita sia di proteine codificate da geni plasmidici
che da proteine codificate da geni presenti sul cromosoma.
La trascrizione dei geni plasmidici avviene utilizzando proteine batteriche.
La traduzione avviene ad opera dell’apparato traduzionale del batterio.
Trascrizione e traduzione avvengono sfruttando le proteine e l’apparato traduzionale del batterio.

Ricapitolando: l’informazione genica per la replicazione e la sua regolazione si trova sul plasmide ma l’apparto di trascrizione
(che serve a convertire l’informazione, genica presente sul plasmide, in RNA e poi a sintetizzare proteine sulla base dell’RNA
ottenuto) avviene ad opera degli apparati e delle proteine del batterio.

È un esempio di plasmide R perché contiene due geni per la resistenza ad antibiotici, un gene per
la resistenza all’ampicillina e uno per la resistenza alla tetraciclina.

Regione Ori: sito specifico in cui inizia la replicazione del plasmide.

Proteine plasmidiche (RepA) e sequenze geniche vicine a Ori regolano la frequenza con cui Ori viene utilizzato

Ori controlla:
la specificità d’ospite
il numero di copie
i gruppi di incompatibilità

La replicazione avviene utilizzando sia proteine plasmidiche che proteine dell’ospite. L’oriV è essenziale per la replicazione del
plasmide ed anche perché controlla anche altri aspetti fondamentali.
Determina la specificità dell’ospite. Un plasmide che ha un oriV per E. coli non potrà replicarsi in una di stafilococco. In
ogni specie batterica l’oriV è differente. Permette anche di regolare il numero di copie plasmidiche presenti all’interno di una
cellula, e permette di determinare i gruppi di incompatibilità.

129
MODALITA’ DI REPLICAZIONE DIE PLASMIDI

CONTROLLO DEL NUMERO DI COPIE DEL PLASMIDE

I plasmidi all’interno di una cellula possono essere a basso o elevato numero di copie. Per ogni plasmide c’è un numero
massimo di copie che può essere contenuto all’interno di un batterio.

Es: quando il numero di copie di quel determinato plasmide in quel determinato batterio è basso (o è molto lontano dal valore
soglia max), il plasmide si replicherà, quando invece il numero di copie di quel determinato plasmide in quel determinato
batterio è alto (è molto vicino al limite max di copie specifiche di quel plasmide) la replicazione verrà inibita.

Ci sono dei meccanismi che permettono al plasmide stesso di regolare la replicazione in funzione del numero di copie.

Il controllo avviene mediante regolazione dell’attività dell’origine di replicazione, di fatto mediante regolazione della sintesi
o attività della proteina repA (il gene che codifica per la proteina repA si trova sul plasmide).
I meccanismi con cui un batterio regola il numero di copie di un plasmide consistono nella regolazione, o della sintesi della
proteina, o dell’attività della proteina.
In un caso si blocca la sintesi della proteina, e quindi se viene bloccata la trascrizione del gene repA non si avrà la produzione
della proteina, che non si legherà all’origine di replicazione e non ci sarà la replicazione del plasmide. → il meccanismo che si
basa sulla sintesi di repA: inhibitor-binding
In un altro caso se si blocca l’attività di repA (che viene comunque prodotta) anche se si lega all’origine di replicazione è
inattiva e non darà avvio a tutti quei meccanismi che stanno alla base della replicazione del plasmide. → il meccanismo che
si basa sulla regolazione di repA: iteron-binding

FUNZIONE: RepA si lega all’origine di replicazione Ori dando inizio alla replicazione del plasmide.

1. Meccanismo di inhibitor-binding: esempio del plasmide R1

L’inizio della replicazione richiede la proteina RepA, codificata dal gene repA presente sul plasmide.
Un mRNA antisenso (mRNAcopA), instabile ma prodotto continuamente, forma un appaiamento con copT, regione
iniziale del gene repA.

130
 Se il complesso mRNAcopA-copT è stabilizzato da CopB, viene impedita la trascrizione di repA e quindi anche l’innesco
della replicazione del plasmide.

A. Se il plasmide è presente a basso numero di copie (numero

di copie inferiori al limite massimo specifico per quel
determinato plasmide) anche CopB è poco concentrata e non
è in grado di legare e stabilizzare il complesso mRNA-copA-
copT, e questo permetta che la replicazione del plasmide
proceda.

B. Se il numero di copie di plasmide è ALTO (vicino al limite

massimo di copie specifico per il plasmide), anche CopB è
presente ad alti livelli, sufficienti a stabilizzare l’appaiamento
mRNA-copA-copT. La replicazione del plasmide è inibita.

La concentrazione di mRNA-copA e di CopB riflettono il numero di

copie di R1.

I pallini in figura rappresentano la quantità di copB presenti.

Perché la replicazione del plasmide possa avvenire è necessario che sia prodotta la proteina RepA, e quindi che il gene repA
che si trova sul plasmide sia trascritto. La trascrizione del gene repA può essere impedita da un RNA antisenso, che si chiama
copA (→ RNAcopA) e che si lega alla regione 5’ del gene repA, che si chiama copT. È un esempio in cui la regolazione
dell’espressione genica è regolata da un piccolo RNA antisenso.
Il fulcro della regolazione prevede un altro fattore, copB, una proteina che ha la funzione di stabilizzare il complesso che si
forma. Anche il gene che codifica per la proteina copB si trova sul plasmide e la sua funzione è quella di legare il complesso
che si forma quando l’RNA antisenso è legato alla regione 5’ del gene repA. Quando il complesso si forma ed è stabilizzato da
copB di fatto la trascrizione del gene repA viene bloccata, e quindi se viene bloccata la trascrizione del gene repA viene
bloccata la produzione di RepA e quindi viene bloccata la replicazione del plasmide.

2. Meccanismo di iteron-binding

Serie di ripetizioni dirette (Iteroni) di ~20 bp localizzate vicino all’origine di replicazione con sequenza simile ai siti di
legame di RepA.
Competono con i normali siti della proteina

La replicazione è permessa quando l’elemento di controllo negativo è diluito dalla crescita cellulare.

La proteina repA si lega all’origine di replicazione, ma questo vuol dire che è capace di riconoscere al livello dell’origine di
replicazione dei siti specifici. Questi siti specifici per repA, localizzati al livello dell’origine di replicazione, sono rappresentati
dai triangoli azzurri nell’immagine sopra.

131
Gli iteroni sono delle sequenze di DNA che si trovano anch’esse in prossimità dell’origine di replicazione Ori (triangoli rosa
nell’immagine sopra) e che hanno una sequenza simile, non identica, a quella dei siti presenti sull’origine di replicazione a cui
repA solitamente si lega. È importante sottolineare che la sequenza di questi iteroni è simile e non uguale perché la similarità
della sequenza fa sì che repA possa legare sia i siti specifici, che gli iteroni. Ciò che cambia è la differente affinità di repA per
le sequenze specifiche, che è più alta, e per gli iteroni, che è più bassa.

Questa differenza di affinità comporta che quando la concentrazione di rep A è BASSA si legherà solamente ai siti con cui ha
maggiore affinità, quando invece è presente un’ALTA concentrazione di proteine repA ci saranno delle molecole di repA che si
legano ai siti specifici, con cui ha alta affinità al livello dell’origine di replicazione, però al raggiungimento della saturazione di
tali siti specifici si ha il legame delle proteine repA disponibili agli iteroni, per cui presenta una bassa affinità.

L’attività è bloccata perché in queste condizioni, in cui si ha repA legata all’origine di replicazione e agli iteroni (che non si
verifica per un solo plasmide, ma per molti di essi) porta alla dimerizzazione delle proteine. Le proteine repA dimerizzano con
le altre proteine repA legate agli iteroni e all’origine di replicazione di un altro plasmide presente in un altro batterio  questa
dimerizzazione crea una condizione nella quale la replicazione del plasmide non può procedere. La struttura che si forma viene
chiamata ammanettamento del plasmide.

A) Il plasmide è presente in basso numero di copie

(numero di copie inferiore al limite massimo specifico per quel
determinato plasmide): RepA si lega ad ori con alta affinità e
non agli iteroni. La replicazione procede.

B) Il numero di copie di plasmide è ALTO (vicino al limite

massimo di copie specifico per il plasmide): anche la [RepA] è
alta e RepA può legarsi anche agli iteroni vicini ad oriV.

La DIMERIZZAZIONE di RepA “ammanetta” i plasmidi a livello di

oriV. La replicazione del plasmide è bloccata.

PLASMIDI: GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’

Persistenza intracellulare di plasmidi diversi

PLASMIDI COMPATIBILI
Plasmidi che hanno differenti meccanismi di controllo e si replicano indipendentemente l’uno dall’altro.
Possono coesistere nella stessa cellula ed hanno la stessa probabilità di essere trasmessi alla progenie.

132
PLASMIDI INCOMPATIBILI
Sono plasmidi che condividono lo stesso meccanismo di controllo. Sono definiti incompatibili perché ciascun plasmide
controlla la replicazione dell’altro.
Il rischio è che per effetto della ripartizione casuale uno dei due plasmidi, quello regolato a più basso numero di copie, potrà
essere perduto per effetto della ripartizione casuale nella progenie.

24/11/20

VARIABILITA’ GENETICA NEI BATTERI

133
I batteri possono variare la loro informazione genetica mediante:
• Mutazione genica: una volta che insorge in un gene (anche se con frequenze basse, cioè 10-6-10-9), viene trasmessa
a tutte le cellule delle generazioni successive.
• Ricombinazione: è un processo mediante il quale due molecole di DNA (DNA della cellula donatrice e DNA della cellula
ricevente) si ricombinano per creare delle nuove varianti geniche.

Elevata diversità genetica dei microrganismi

o L’elevata velocità di replicazione permette alle variazioni genetiche di essere rapidamente amplificate e trasmesse alla
progenie
o Elevata varietà di habitat, quindi pressioni selettive differenti ed in continuo cambiamento nel tempo
o Capacità di scambiare l’informazione genetica tra specie diverse (anche se con bassa frequenza)

LA RICOMBINAZIONE GENETICA

RICOMBINAZIONE OMOLOGA: implica la presenza di estese regioni di omologia nelle due molecole di DNA coinvolte nel
processo di ricombinazione. Questo processo è definito anche crossing-over. Le proteine RecA, RecB, RecC e RecD mediano il
processo di ricombinazione e riarrangiamento genico.

Le regioni di DNA interessate alla ricombinazione omologa possono risiedere su molecole diverse di DNA (cromosoma e
plasmide, cromosoma e DNA fagico) o trovarsi nella stessa molecola di DNA.

RICOMBINAZIONE SITO-SPECIFICA: richiede la presenza di regioni omologhe relativamente brevi nelle regioni
coinvolte nel meccanismo di ricombinazione. Non dipende da RecA (ma da altre proteine); es: inserimento di plasmidi, fagi,
trasposoni ecc. nel cromosoma batterico.

La ricombinazione sito-specifica porta all’integrazione di una molecola nell’altra e non alla sostituzione.

I quadrati indicano le brevi regioni omologhe. Quando il plasmide si integra sul cromosoma batterico si ha il gene X inalterato,
poi si inserisce il plasmide e quindi con i geni a e b integrati e poi il gene Y inalterato. Questa integrazione può avvenire anche
al contrario: escissione. Si riottiene quindi il cromosoma batterico intatto e il plasmide libero.

Solitamente la proteina che è coinvolta in questo processo è una integrasi → si forma un’altra variante in cui una molecola
diventa parte integrante della molecola di DNA ricevente in cui si è inserita.

RICOMBINAZIONE ILLEGITTIMA: avviene senza controllo ed in regioni dove non ci sono omologie di sequenza. Poco
frequente.

134
 IL TRASFERIMENTO GENICO NEI BATTERI

I processi di ricombinazione si associano frequentemente all’acquisizione da parte del microrganismo di DNA ETEROLOGO.
Nei batteri l’acquisizione di DNA eterologo e scambio di materiale genetico avvengono attraverso TRE MECCANISMI distinti:

Trasformazione: acquisizione da parte di un batterio ricevente di DNA libero nell’ambiente. Il DNA è libero nell’ambiente
perché è rilasciato da un altro batterio, presente nello stesso ambiente, che è andato in contro a lisi. Il rilascio del DNA
nell’ambiente è conseguente ad un fenomeno di lisi, quindi il DNA che il batterio ricevente acquisisce nella trasformazione è
un DNA frammentato.

Trasduzione: processo di trasferimento di DNA da una cellula all’altra mediato da batteriofagi. Soltanto in conseguenza di
un’infezione da parte di un fago è possibile avere questo processo di trasferimento di DNA.

Coniugazione: processo di trasferimento di DNA da una cellula all’altra mediato da plasmidi. Questi plasmidi sono chiamati
coniugativi, possono indurre questo processo sia quando sono circolari (liberi nella cellula batterica), ma anche quando sono
integrati nel cromosoma. I plasmidi coniugativi spesso sono anche plasmidi integrativi.

LA TRASFORMAZIONE

Processo mediante il quale il DNA, rilasciato nel mezzo ambiente da un batterio donatore che va incontro a lisi, viene assunto
da una cellula ricevente. Il DNA eterologo può essere lineare o circolare (plasmidico).

Nel processo di trasformazione il DNA che viene acquisito si trova

libero nell’ambiente e nella maggior parte dei casi, in natura, si tratta
di un DNA lineare che deriva dalla frammentazione del cromosoma
batterico o di un plasmide, di un batterio che è andato in contro a
lisi.

In casi meno frequenti si tratta di un intero plasmide, cioè si tratta

di un DNA circolare plasmidico.

Quando il DNA è entrato all’interno della cellula, ed ha superato tutta

una serie di controlli, SE sono presenti delle estese regioni di
omologia possono avvenire degli eventi di ricombinazione omologa
che portano alla creazione di una nuova variante in cui un gene/una
porzione di un gene presente sul genoma viene sostituita da una
porzione della molecola che è stata internalizzata.

Nel prodotto finale è possibile vedere che una porzione di gene del
frammento di DNA che è stato internalizzato, in particolar modo la
porzione B, è stata sostituita nel DNA cromosomale, in questo caso
ci si riferisce alla porzione b.

In seguito a tale trasformazione si ha come prodotto finale del processo una cellula geneticamente trasformata.

Questo evento è importante quando i frammenti di DNA incorporati contengono dei geni che sono omologhi a quelli presenti
sul cromosoma batterico ricevente. In questo caso si può avere un evento di ricombinazione, in seguito al quale il gene
introdotto con la trasformazione sostituisce il gene presene sul cromosoma batterico.

La restante parte di DNA introdotta con la trasformazione e il gene vengono degradati da delle nucleasi.

Si crea una nuova variante genetica: verrà un batterio che ha la stessa sequenza genomica del batterio da cui è originato, ma
si introduce un gene diverso che crea una variabilità. Il batterio può acquisire anche caratteristiche che prima non aveva.

135
LA SCOPERTA DELLA TRASFORMAZIONE
Processo scoperto casualmente durante studi condotti da Griffith nel 1928 sull’infezione dei topi con Streptococcus pneumoniae
e che più tardi (1944) ha portato alla dimostrazione da parte di O.T. Avery e coll. che il DNA è il depositario dell’informazione
genetica.

Griffith aveva osservato che c’erano di ceppi S (lisci, virulenti provvisti di capsula) che determinavano la morte della cavia e
potevano essere recuperati dagli organi dell’animale infettato. Mentre se usava l’altro ceppo chiamato di tipo R (Rugosi, non
virulenti senza capsula), le cavie non morivano e non venivano recuperate cellule batteriche dalla cavia.

La funzione della capsula è quella di eludere le difese immunitarie dell’ospite, perché inibisce la fagocitosi da parte dei
macrofagi, che sono in grado di fagocitare il microrganismo solo se è legata con degli anticorpi specifici. I macrofagi non sono
in grado di fagocitare microrganismi capsulati, lo diventano quando i microrganismi sono opsonizzati, cioè sono rivestiti da
anticorpi.

Provò quindi ad inattivare il ceppo S tramite il calore, ed aveva visto che nessuna cavia trattata con il ceppo S modificato,
moriva. Se invece utilizzava una miscela di batteri morti S (al calore) + ceppi tipo R, il topolino moriva e dagli organi si
recuperava dei batteri S vivi.

Dedusse che c’era un componente chimico che poteva essere trasferito da una cellula di tipo S a quelle di tipo R. dopo si è
capito che questa componente era il DNA liberato dalla lisi dei batteri di tipo S dopo il trattamento al calore e che veniva poi
incorporato dai batteri di tipo R (con un processo che era appunto la trasformazione).

I frammenti di DNA responsabili della conversione da S e R, erano i geni che codificavano per la capsula che è un fattore di
virulenza fondamentale, perché impedisce la fagocitosi del microrganismo (infatti i batteri S capsulati portano a morte la
cavia). Quindi questi geni che codificano per la capsula vengono assunti dai batteri di tipo R ed incorporati nel loro genoma,
facendoli così diventare capaci di sintetizzarla.

PRINCIPIO TRASFORMANTE → è il DNA → il DNA trasformate è quello che codifica per la sintesi della capsula.

Il processo di trasformazione, in questo esperimento, è consistito nell’acquisizione da parte del ceppo R di DNA proveniente
dal ceppo S, inattivato e lisato, e in particolare l’acquisizione del DNA che codifica per la capsula.

136
FASI PRINCIPALI DEL PROCESSO DI TRASFORMAZIONE

a: legame di una molecola di DNA a doppia

elica mediante una proteina di membrana
(DNA binding proteins);

b: passaggio di uno dei due filamenti

all’interno della cellula mentre l’attività
nucleasica degrada l’altro filamento;

c: il filamento singolo può avere due destini:

o viene degradato o viene legato da proteine
specifiche nella cellula (competence specific
single-stranded DNA binding proteins) e
quindi avviene la ricombinazione con regioni
omologhe del cromosoma batterico, mediata
dalla proteina RecA.

Il DNA trasformante si lega a delle proteine, che si chiamano DNA binding proteins, che si trovano esposte sulla superfice
del batterio ricevente.

A questo punto, quando il DNA è legato a queste proteine presenti sulla superficie del batterio ricevente, interviene una
proteina che ha attività nucleasica (pallino azzurro). In realtà le nucleasi sono DUE, una di queste, una endonucleasi,
frammenta ulteriormente il DNA, riducendone la lunghezza, e una esonucleasi degrada uno dei due filamenti della doppia
elica.

Il filamento viene degradato a tal punto che nel processo di trasformazione non entra la doppia elica nel batterio ricevente,
ma entra un solo filamento di DNA.

Il filamento di DNA libero all’interno della cellula può avere due destini diversi:
 Degradato perché una molecola di DNA a singolo filamento nella cellula batterica viene degradata
 Legato da delle proteine, che si chiamano proteine di legame del DNA a singolo filamento (pallini marroncini),
che possono proteggerlo dalla degradazione

È a questo punto che il filamento di DNA protetto dalla degradazione può essere legato dalle proteine RecA e se ci sono le
caratteristiche necessarie può essere substrato per gli eventi di ricombinazione omologa.

DNA trasformante

La natura del DNA trasformante

Nella maggior parte dei casi si tratta di DNA a doppio filamento rilasciato nell’ambiente per lisi dei batteri.

Alcuni microrganismi (es. Neisseria gonorrhoeae) rilasciano il DNA (a singolo filamento) all’esterno, con meccanismi regolati
e controllati (sistemi di secrezione di tipo IV), in modo contatto-dipendete (in seguito al contatto con la cellula o il batterio
bersaglio).

Gonococcal genetic island (GGI) di N. gonorrhoeae

↳ Isola genomica che contiene un set di geni che codificano per l’apparato di secrezione deputato al rilascio attivo di DNA a
singolo filamento in modo contatto-dipendete.

137
Il destino del DNA trasformante

Parametri fisici:
- natura (lineare o circolare)
- dimensioni
- concentrazione

Caratteristiche genetiche:
- omologia con quello del ricevente
- specificità d’ospite e/o compatibilità di gruppi (plasmidi)

Il DNA lineare può essere conservato nel genoma del ricevente mediante ricombinazione omologa
o grado di omologia
o lunghezza del frammento (0,5 kb-30 kb)
o concentrazione

LA COMPETENZA

Non tutti i batteri sono sempre capaci di acquisire DNA, l’acquisizione di una molecola di DNA presente nell’ambiente da parte
di un batterio avviene solo se il batterio si torva in una particolare condizione fisiologica, che chiamiamo competenza.

La competenza si traduce nella capacità di esprimere sulla propria superficie un complesso di proteine, apparato di
competenza, e in alcuni casi il rilascio di alcuni fattori/peptidi, che vengono chiamati fattori di competenza.
Queste proteine vengono prodotte solo in particolari condizioni, questo significa che i geni che codificano per queste proteine
vengono espressi solo in particolari condizioni  possiamo dire che la competenza è un processo inducibile che si realizza solo
quando il batterio si trova in particolari condizioni.

Per poter assumere DNA la cellula ricevente deve essere COMPETENTE, cioè esprimere particolari proteine
(FATTORI/APPARATO DI COMPETENZA) implicate nel processo.

La competenza è un processo inducibile che si verifica in particolari condizioni fisiologiche, variabili da specie a specie. In
alcuni casi la competenza si verifica in risposta a:
• stress ambientali
• carenza di nutrienti (Haemophilus influenzae in terreni che non permettono la crescita o inibiscono la sintesi proteica)
• fase di crescita (transizione tra fase logaritmica e fase stazionaria in Bacillus subtilis, durante la fase logaritmica in
Streptococcus pneumoniae)
• Elevata densità cellulare

Neisseria gonorrhoeae è competente in modo costitutivo  è uno dei microrganismi in cui l’espressione dei fattori di
competenza non dipende da stress ambientali, carenze di nutrienti, ecc.

LA COMPETENZA NATURALE
Alcuni batteri sono naturalmente competenti, cioè naturalmente trasformabili. Molti microrganismi naturalmente competenti
sono microrganismi ambientali che vivono nel suolo e nell’acqua.
Specie batteriche patogene per l’uomo, naturalmente trasformabili: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae.

LA COMPETENZA ARTIFICIALE

138
Alcuni batteri (es: enterobatteri) possono essere resi competenti in laboratorio per es. mediante trattamento con una soluzione
di cloruro di calcio a freddo (competenza artificiale) che modifica la struttura della parete rendendola più accessibile alla
penetrazione di molecole di DNA.

LO SVILUPPO DELLA COMPETENZA E LA TRASFORMAZIONE NEI BATTERI GRAM POSITIVI

(Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae)

Nei Gram positivi la regolazione della competenza avviene mediante secrezione di peptidi prodotti dal batterio (Es. CSP,
competence stimulating peptide, negli streptococchi). Induce la sintesi di una serie di proteine che stabilizzano lo stato di
competenza.

Il fattore di competenza viene riconosciuto da un recettore che si trova sulla superficie del batterio  è un fattore che viene
prodotto e rilasciato dal batterio ma che viene riconosciuto da un recettore presente sul batterio stesso. Il legame di questo
fattore di competenza con il recettore determina, con un sistema di trasduzione del segnale, l’espressione di un set di geni
che sono quelli che codificano le proteine dell’apparato di competenza.

Le proteine dell’apparato di competenze sono:

- autolisine → una proteina che crea delle rotture sulla parete del microrganismo in modo da esporre le proteine della
competenza sulla membrana del batterio, che sono le proteine leganti il DNA (pallini azzurri) e le nucleasi che intervengono
sia per frammentare la molecola di DNA, nel caso in cui sia troppo lunga sia ad attività esonucleasica per degradare una
delle due eliche.
LA TRASFORMAZIONE NEI BATTERI GRAM NEGATIVI
(Haemophilus influenzae, N. gonorrhoeae)

Nei Gram negativi, l’induzione della competenza è un processo esclusivamente intracellulare e non avviene grazie al rilascio
di un fattore. In si ha la formazione dei “trasformasomi” (trasformasoma → apparato multiproteico che coinvolge anche
proteine associate alla membrana esterna e pili), strutture associate alla membrana che si estendono sulla superficie cellulare
permettendo la traslocazione del DNA all’interno della cellula. Lo stress ambientale viene percepito dal batterio e questo
segnale comporta la trascrizione e l’espressione dei geni che codificano per le proteine del trasformasoma.

In N. gonorrhoeae e in Haemophilus influenzae il DNA deve essere a doppia elica.

Non tutte le molecole di DNA possono essere davvero internalizzate da Haemophilus o da Neisseria ma deve contenere delle
brevi sequenze specie-specifiche intersperse nel genoma. Il DNA deve contenere sequenze specifiche (10-15pb): DUS (DNA
uptake sequences).

DNA uptake sequences:

1% del genoma
• 1 ogni 1200 pb in Neisseria
• 1 ogni 4000 pb in Haemophilus
Sono dei siti di riconoscimento per la trasformazione

La trasformazione avviene preferenzialmente con DNA omologo.

IL TRASFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE: SIGNIFICATO BIOLOGICO E EVOLUZIONE

139
Trasformazione

• DNA rilasciato nell’ambiente in conseguenza della lisi cellulare

• DNA attivamente secreto e rilasciato all’esterno (es. Pseudomonas aeruginosa)

La competenza è indotta in particolari condizioni fisiologiche:

• Elevata densità batterica
• Carenza di nutrienti
• Presenza di particolari Sali
• Variazione delle temperature (congelamento/scongelamento)
• Passaggio di corrente ad alto voltaggio (scarica elettrica dovuta ad esempio dai fulmini)

L’acquisizione di DNA esogeno è una delle differenti risposte adattative in risposta a carenza di nutrienti o a particolari stress
ambientali. Può costituire:
- una fonte di nutrienti → l’assunzione di nutrienti avviene quando il DNA internalizzato viene degradato
- una modalità di riparazione del DNA danneggiato
- una modalità di generazione di diversità genetica

I nucleotidi sono fonte di nutrienti perché sono formati da zuccheri, basi azotate e gruppi fosfato → di fatto sono fonte di
carbonio, fosfato e azoto. Nella maggior parte dei casi i batteri hanno evoluto la capacità di divenire capaci di acquisire
DNA eterologo perché l’acquisizione del DNA può essere innanzitutto una fonte di nutrienti ma anche una sorta di
substrato da utilizzare nei meccanismi di riparazione del DNA nel caso in cui lo stress abbia comportato un
danneggiamento del DNA. La molecola internalizzata può diventare substrato per dei fenomeni di ricombinazione.
In condizioni di stress il primo obbiettivo del batterio è quello di sopravvivere e non di modificare il patrimonio genetico.

27/11/20
TRASDUZIONE

(14.4-14.5 del libro → batteriofagi)

Processo che permette il trasferimento di DNA da un batterio donatore ad uno ricevente tramite dei BATTERIOFAGI (virus
batterici)  può essere definita come il processo di trasferimento di DNA da una cellula all’altra mediata da batteriofagi.

140
Chi sono i batteriofagi? Sono i virus dei batteri, delle particelle nucleoproteiche, quindi delle strutture inerti quando non
sono all’interno di una cellula vegetale o animale. Sono definite particelle nucleoproteiche perché sono costituite da un acido
nucleico, che nella maggior parete dei casi è DNA, e da un insieme di proteine che proteggono l’acido nucleico del batteriofago
dalla degradazione delle nucleasi ambientali. Alcune di queste hanno un ruolo fondamentale nel mediare il legame del
batteriofago con dei recettori che si trovano sulla superficie del batterio bersaglio.

Le proteine che proteggono il genoma del fago, DNA circolare, nel 96% dei casi sono organizzate in una struttura che va a
formare una testa icosaedrica, che prende il nome di capside. Nella morfologia del fago si possono distinguere altre proteine
che si strutturano a formare: una coda, una piastra basale e le spine della coda. Queste ultime strutture, la piastra e le spine,
sono quelle che servono al fago per legare in maniera specifica delle proteine che si rovano sulla superficie del batterio
bersaglio.

Grazie alle spine e alla piastra i batteriofagi rimangono attaccati sulla superficie esterna del batterio. Dopo l’absorbimento al
recettore cellulare, il batteriofago inietta solo l’acido nucleico all’interno della cellula ospite mediante un organello specifico
chiamato coda. La coda è attaccata al capside che contiene il genoma impacchettato attraverso un processo che richiede
energia, prodotta dall’idrolisi dell’ATP.

Ci sono altri fagi che costituiscono circa il 4%, chiamati fagi filamentosi, che presentano una morfologia diversa: il DNA è
protetto da un capside in cui le proteine si dispongono attorno al DNA a formare una struttura ad elica, struttura a filamento
elicoidale. Sono presenti delle proteine che hanno la funzione di adesione ai recettori sulla membrana della cellula ospite.

FASI PRINCIPALI DEL CICLO REPLICATIVO DEI BATTERIOFAGI

141
Per replicare il proprio genoma e sintetizzare le proteine fagiche, che andranno a costituire altre particelle fagiche, i fagi
sfruttano l’apparato biosintetico del batterio bersaglio.

CICLO LITICO (fagi virulenti):

1. Adesione del fago al batterio (mediata dalle proteine che costituiscono la piastra basale e le spine), cambiamento
conformazionale della coda, ed iniezione del genoma fagico all’interno del batterio
2. Replicazione del genoma fagico
3. Assemblaggio (processo spontaneo  autoassemblaggio) e liberazione nell’ambiente di nuove particelle fagiche (nella
maggior parte dei fagi accompagnato da degradazione del cromosoma batterico e lisi del batterio)

CICLO LISOGENO (fagi temperati):

Integrazione del genoma fagico nel cromosoma batterico (il fago non si replica ed il genoma fagico viene replicato come
parte integrante del cromosoma batterico e trasmesso alle cellule batteriche figlie). Il genoma fagico può escidersi dal
cromosoma batterico dando avvio a un ciclo litico.

Ci sono dei fagi che non inizio subito un ciclo litico, ma con il processo di ricombinazione sito-specifica integrano il loro
genoma nel cromosoma del batterio. In questo caso il genoma del fago rimane come parte integrante del cromosoma
batterico (non viene espresso), quindi come parte di esso viene trasmesso a tutte le cellule della progenie nelle generazioni
successive che si origineranno dal batterio. Questa non è una situazione perenne ma in seguito a particolari stimoli si può
escindere dal cromosoma, circolarizzare, e dare avvio ad un ciclo litico.

Quindi possono essere definiti i fagi temperati quella tipologia di fagi che una volta infettato il batterio possono integrare il
proprio genoma nel cromosoma batterico (ciclo lisogeno) e in condizioni particolari, escindendo il genoma dal cromosoma,
può dare avvio ad un ciclo litico.

• Nel ciclo litico il batteriofago si moltiplica nella cellula ospite e la progenie virale è rilasciata con la lisi.

142
 • Nel ciclo lisogeno il DNA virale si integra nel genoma dell’ospite e si replica insieme alla replicazione del cromosoma
batterico, con produzione di una discendenza di cellule lisogene.

Morfogenesi della particella fagica:

assemblaggio dei componenti ed impacchettamento del genoma

I diversi componenti vengono costruiti modularmente lungo la

catena di montaggio indipendenti:

- sintesi del DNA;

- costruzione di teste immature vuote;
- costruzione del corpo della coda e delle fibre della coda;

Successivamente queste componenti vengono assemblate in

strutture più complesse:

- il DNA viene impacchettato nelle teste, formando le

teste “piene”;
- le fibre della coda si associano alla coda;
- la coda si associa alla testa piena formando un fago
maturo.

Sistemi di incapsidamento del DNA:

In questa fase è presente un elemento che contraddistingue fagi diversi cioè la fase in cui il DNA del fago viene impacchettato
all’interno del fago stesso. La replicazione del DNA del fago avviene con un meccanismo a circolo rotante che porta alla
produzione di un filamento lineare costituito da tanti genomi fagici in successione l’uno all’altro. La linea rappresenta il risultato
della prime fasi della replicazione del DNA circolare. I pallini rappresentano le sequenze di riconoscimento, che vengono
riconosciute nel primo sistema (estremità fisse) e non nel secondo (a testa piena), perché in questo caso ciò che viene
riconosciuta è la lunghezza e non la sequenza.

Per molti fagi a DNA lineare a doppia elica, il DNA substrato per l’impacchettamento nei capsidi è costituito da concatameri
da cui i genomi monomerici vengono “ritagliati”, grazie a endonucleasi specifiche, e inseriti nel capside.

a) A “estremità fisse” → fago . In questo sistema un’endonucleasi, detta terminasi, associata a un vertice specifico della
testa vuota riconosce una sequenza specifica (sito cos) sul DNA e la taglia in modo sfalsato. L’assunzione del DNA continua
per la lunghezza di un genoma intero, fino a che non si incontra una seconda sequenza detta ter (terminus).
b) A “testa piena” → fago T4. La testa vuote riconosce in modo più o meno specifico un primo sito sul concatamero
substrato, genera la prima estremità e assume una quantità fissa di DNA pari a quella che la testa può contenere. Il
genoma è più piccolo della quantità di DNA incapsidato.

143
 TRASDUZIONE GENERALIZZATA

Avviene in seguito ad un ciclo litico. Il fago ha un sistema di impacchettamento a “testa piena”, quindi che dipende dalla
lunghezza del genoma e non dal riconoscimento della sequenza cos.
Qualsiasi gene del cromosoma batterico può essere trasferito da un fago ad una cellula ricevente (la frequenza è bassa,
ma identica, per tutti i geni batterici).

La trasduzione generalizzata avviene ad opera di batteriofagi litici. Il fago si lega alla cellula batterica, inietta il genoma e si
replica portando poi la lisi della cellula ospite.

In questo processo può capitare che le particelle del fago anziché incorporare nella testa del DNA fagico, incorporano
frammenti di DNA cellulare (batterico); si formano fagi che strutturalmente (testa, code, fimbrie) sono fagi normali, ma che
hanno incorporato delle porzioni di DNA batterico.

Questi fagi sono in grado di infettare delle nuove cellule (perché l’infezione, il riconoscimento e l’iniezione avvengono
ad opera di proteine strutturali del fago), solo che avendo incorporato DNA batterico iniettano quello, creando una
situazione in cui nella cellula batterica donatrice sono presenti frammenti di DNA cromosomico proveniente da un’altra
cellula.
A questo punto possono avvenire processi di ricombinazione, che creano così una variante diversa. Qualunque gene
batterico può essere quindi trasdotto.

144
 TRASDUZIONE SPECIALIZZATA

Può avvenire solo se il fago si è precedentemente integrato nel cromosoma batterico (ciclo lisogeno).
Solo porzioni specifiche del cromosoma batterico (quelle fiancheggianti il sito di inserzione del fago) vengono trasferite
ad una cellula ricevente. Il batterio si troverà nel citoplasma un gene che proviene da un altro batterio.

Il genoma fagico si escinde dal genoma batterico e inizia a replicarsi formando delle particelle fatiche che andranno ad infettare
le altre cellule batteriche (ciclo litico). Se il processo di scissione non avviene correttamente ma il DNA del fago incorporano i
geni batterici adiacenti al sito di inserzione, si otterranno particelle fatiche con genoma modificato. Questi quando si liberano
e vanno ad infettare nuove cellule batteriche, si avrà l’introduzione di geni batterici di un’altra cellula nella cellula ricevente.

 (spiegazione dettagliata nel libro)

IL TRASFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE: SIGNIFICATO BIOLOGICO E EVOLUZIONE

Trasduzione

Elevato numero di batteriofagi negli ambienti naturali (107 fagi/ml negli oceani; 1030 specie fagiche).

145
La trasduzione generalizzata può contribuire alla diffusione di molecole di DNA.
A differenza della trasformazione il DNA è protetto dal capside fagico (testa fagica) dalle degradazioni ad opera di nucleasi
ambientali.

La trasduzione specializzata è un evento frequente in natura (elevato numero di profagi integrati nel cromosoma di specie
batteriche; in E. coli O157 il 15% gel genoma è costituito da profagi, cioè porzioni di fagi lisogeni che sono rimasti integrati
nel cromosoma batterico stesso).

01/12/20

LA CONIUGAZIONE

Processo mediante il quale il trasferimento di DNA da un batterio donatore ad uno ricevente implica un contatto fisico tra le
due cellule mediante la formazione di filamenti (pili) che si estendono al di fuori della cellula (avviene anche in presenza di
DNAsi nel mezzo).

Il processo di coniugazione è mediato da elementi genetici autotrasferibili, i plasmidi coniugativi (plasmide F in E. coli).
L’informazione per il trasferimento dei plasmidi coniugativi si trova sui plasmidi stessi. La coniugazione può avvenire tra
ceppi della stessa specie o tra ceppi di specie e generi diversi (anche se con una frequenza minore).

Il fatto che il processo derivi dal contatto, anche se nell’ambiente vengono inserite delle proteasi che tagliano il DNA, il
processo avviene comunque perché il DNA non è mai in contatto con l’ambiente esterno, ma avviene attraverso un poro. Il
processo è, mediato da plasmidi chiamati coniugativi (plasmide F in E. coli).

Il plasmide F contiene tutta l’informazione genetica che serve per indurre, regolare ed effettuare il processo di coniugazione.

Una volta avvenuto il contatto si ha la depolimerizzazione (perché è formato da tante subunità di un’unica proteina, la pilina)
che determina l’accorciamento del pilo e l’avvicinamento delle due cellule. Quando sono abbastanza vicine si forma il poro di
coniugazione.

IL PLASMIDE F DI E. coli

• La regione tra (transfer) comprende i geni necessari per l’induzione della coniugazione:
- geni mpf (mating pair formation), sono i geni che codificano per la formazione della coppia coniugativa, sono i
geni necessari per la sintesi della pilina e il controllo della formazione del pilo
- geni dtr (DNA transport and processing) I geni che controllano il processamento nella cellula ricevente

• Regione leading: prima porzione del plasmide che viene trasferita alla cellula ricevente, che codifica per diverse proteine
tra cui le SSB che, legandosi al ssDNA (il DNA viene trasferito sotto forma di SINGOLO FILAMENTO), lo
proteggono dall’azione delle nucleasi, e altri prodotti genici coinvolti in meccanismi di riparazione del DNA.

146
  Geni ssb: codificano per proteine SSB che legano il DNA a singolo filamento e lo proteggono dall’azione delle
nucleasi. È importante ricordare e sottolineare che il DNA viene trasferito sotto forma di singolo filamento

• Regione rep: replicazione vegetativa del plasmide

• Elementi IS e trasposoni: inserzione del plasmide nel cromosoma batterico

Il plasmide coniugativo F è un EPISOMA. Può essere libero nel citoplasma o essere integrato nel cromosoma batterico.

I plasmidi coniugativi possono essere trasferiti da una cellula all’altra sia quando sono in forma circolare a doppio filamento
e liberi nella cellula batterica, sia quando sono integrati nel cromosoma batterico. Quando sono liberi si replicano
autonomamente, e l’inizio avviene in una origine di replicazione che è comune a quella di tutti i plasmidi.
In più, però, questi tipi di plasmidi hanno una sequenza, IS2 e IS3, responsabili dell’integrazione del plasmide stesso nel
cromosoma batterico.

ccdAB → inibizione della divisione della cellula ospite

incBCE → incompatibilità
oriT → sito d’inizio del trasferimento del DNA ed è situato ad un’estremità della “regione tra”
oriV → origine della replicazione bidirezionale
parABCL → partizione
traABCEFGHKLQUVW → biosintesi e assemblaggio del pilo
traGN → stabilizzazione dell’accoppiamento
traL → “Nickasi” oriT-specifica; DNA elicasi
traMDZ → stabilizzazione dell’accoppiamento
traY → esonucleasi, coadiuva la “nickasi”
traJ, finOP → regolazione del trasferimento
traST→ esclusione di superficie

Esclusione di superficie: il plasmide coniugativo codifica per proteine che si localizzano sulla membrana interna ed
esterna della cellula, che impediscono l’adesione da parte di un pilo omologo.
La coniugazione non avviene tra ceppi con plasmidi coniugativi omologhi cioè di pili che vengono codificati da geni presenti
su plasmidi omologhi.

147
IL SISTEMA DI CONIUGAZIONE DI TIPO F

148
Processo ad alto dispendio di energia e quindi potrà essere adottato dai batteri solo in particolari condizioni
fisiologiche.

CONIUGAZIONE F+/F-

Le cellule che partecipano sono definite: F+ (donatrice); F- (ricevente)

Non si ha mai il trasferimento del plasmide ad una cellula che lo ha già.

Fasi principali del processo di coniugazione:

1) Sintesi del pilo e formazione della coppia coniugativa

La regione tra del fattore F contiene l’informazione per la sintesi ed
assemblaggio del pilo, per la stabilizzazione del contatto e per il
trasferimento del DNA. I pili sono costituiti da PILINA, una proteina
altamente idrofobica che prende contatto con i recettori per il pilo
espressi solo sulle cellule F-.

Una volta preso il contatto, il pilo inizia a retrarsi ed alla fine si forma il
pro di coniugazione, che non è altro che il continum…, così può avvenire
la coniugazione.

2) Trasferimento (mobilizzazione) del DNA

- taglio a singolo filamento nel sito nic in oriT
- sintesi del rilassosoma (traI): attività nucleasica di elicasi.
Processazione del DNA per la traslocazione ed associazione al poro di
trasferimento sulla membrana.
In circostanze ordinarie l’unico elemento che viene trasferito è proprio
il fattore F.

3) Separazione delle cellule

Al termine del processo di coniugazione si avrà un plasmide F completo,

circolare a sdoppio filamento nelle due cellule.

149
 TRASFERIMENTO DI GENI CROMOSOMICI MEDIATO DA PLASMIDI:
coniugazione Hfr x F-

Il fattore F può comportarsi da EPISOMA, cioè può integrarsi nel cromosoma batterico tramite un cross-over reciproco a livello
di sequenze di inserzione (ricombinazione sito-specifica).

Una volta integrato, il plasmide si replica insieme al cromosoma; anche se integrato

può ancora promuovere il proprio trasferimento.

CELLULE Hfr (high frequency of ricombination): cellule batteriche con il fattore F integrato.

Il DNA del cromosoma batterico può essere trasferito mediante coniugazione.

Solo alcuni geni del Fattore F entrano nella cellula F- all’inizio della coniugazione. I geni restanti verranno trasferiti nella cellula
ricevente solo dopo che tutto il DNA cromosomico sarà passato attraverso il pilo.

Una cellula F+ con plasmide integrato nel cromosoma batterico è una cellula Hfr (alta frequenza di ricombinazione).
Queste cellule Hfr possono coniugare e trasferire il fattore F; siccome il fattore F è integrato nel genoma batterico, dopo la
formazione del poro, si avrà il trasferimento non solo del fattore F ma anche di geni presenti nel cromosoma.

Il trasferimento dell’intero cromosoma richiederebbe circa 100 min a 37°C; solitamente questo processo di coniugazione si
interrompe prima che il trasferimento sia completo. Si ottiene quindi che nella cellula ricevente vengono trasferiti solo alcuni
dei geni cromosomici.

Si ottiene quindi una cellula che sarà diploide per alcuni geni, che potranno andare incontro a fenomeni di ricombinazione
andando a creare una nuova variante batterica.

Il plasmide F non viene trasferito alla cellula ricevente, quindi essa rimane F-.

150
 FORMAZIONE DEL FATTORE F’ E CONIUGAZIONE CON UN CEPPO F -

Talvolta il fattore F integrato può tornare allo stato di plasmide autonomo per escissione dal cromosoma batterico.
Tale processo può, anche se con una frequenza molto bassa, avvenire con degli errori.

Durante questo processo può succedere che il plasmide si porti dietro anche alcuni geni del cromosoma: da una
cellula Hfr può originarsi una cellula F’ che può andare incontro a coniugazione con una cellula F -.

Anche in questo modo una cellula ricevente può ricevere geni derivanti dal cromosoma batterico della cellula
donatrice.

La cellula ricevente è diploide parziale (merozigote) per la regione genomica presente sul plasmide F’.

Il fatto che dal cromosoma batterico si stacchi un gene può creare problemi alla cellula batterica
donatrice?

L’effetto che ne deriva può essere più o meno deleterio e questo dipende essenzialmente dal gene:
- Se il gene codifica per una proteina essenziale per la sopravvivenza
- Se il gene codifica per una proteina regolatoria che regola l’espressione genica/sopravvivenza in particolare
a particolari stimoli
- Se ci sono geni omologhi che possano sopperire all’assenza del gene che è andato a mancare

Se è dannoso il fenomeno di coniugazione non avviene perché costituisce un processo molto dispendioso al livello
energetico.

151
IL TRASFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE: SIGNIFICATO BIOLOGICO E EVOLUZIONE

Coniugazione

Richiede batteri in stretto contatto, in condizioni di abbondanza di nutrienti (i batteri possono attivamente replicarsi e
sintetizzare le proteine coinvolte negli apparati più dispendiosi  possono anche dare luogo al processo di coniugazione):

- nei biofilm → anche se in minor misura, i batteri in questa condizione possono trovarsi imbrigliati in una matrice
extracellulare

- nella rizosfera delle piante → l’elevata quantità di nutrienti richiama numerose batteriche che si troveranno in contiguità
l’uno con l’altro

- nell’intestino di animali → la flora microbica intestinale è costituita da un insieme di popolazioni batteriche, in stretto
contatto l’una all’altra, in un’ambiente ricca di nutrienti.

Può avvenire anche fra specie batteriche diverse.

IL DESTINO DELLE MOLECOLE DI DNA ACQUISITE PER TARSFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE

152
I sistemi di Restrizione-Modificazione

Enzimi di modificazione (es metilazione di adenine o citosine in specifiche sequenze)

Enzimi di restrizione: attività esonucleasica sul DNA non metilato.
Il DNA endogeno/omologo viene modificato (metilato) in modo che sia distinguibile dal DNA esogeno. Il DNA esogeno (non
metilato) viene così riconosciuto e degradato dalle nucleasi.

Sistemi di RM osservati in ceppi patogeni di Neisseria meningitidis, ma non nei ceppi commensali. I ceppi patogeni hanno
evoluto dei sistemi di protezione dal DNA esogeno per “proteggere” il loro patrimonio genetico e conservare il loro “potenziale
patogeno”.

Sistema CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palidromic Repeats)

Sistema di “difesa specifica” dalle infezioni fagiche

Approfondire a pag. 448-451 del libro

La sigla CRISPR sta ad indicare delle brevi sequenze palindromiche intersperse, da altre sequenze, organizzate in un claster,
cioè riunite in una particolare posizione del cromosoma. Questi sistemi (“Cas” sta per “proteine associate ai loci CRISPR”)
sono stati scoperto nei batteri e per i batteri costituiscono il “sistema immunitario”. È un sistema estremamente sviluppato,
molto più evoluto dei sistemi di restrizione che sono presenti nei batteri e che permettono loro di difendersi da infezioni fagiche
o dall’internalizzazione di plasmidi.

La regione è costituita da brevi sequenze di origine fagica o plasmidica, intervallate dalle regioni palindromiche ripetute (in
questo schema sono indicate come rombi). La trascrizione del locus CRISPR porta alla formazione di un Pre-crRNA, che avrà
delle regioni a loop che corrispondono alle sequenze palindromiche (rombo) e delle regioni genomiche che sono provenienti
da fagi o plasmidi che hanno infettato la cellula e che sono entrati all’interno del batterio. Il Pre-crRNA viene tagliato a formare
dei piccoli crRNA con una regione a loop e una piccola coda, che deriva dalla sequenza fagica o plasmidica.

Si chiama sistema immunitario perché

quando un fago dello stesso tipo infetta il
batterio, che è dotato di questo locus
CRISPR, succede che in virtù del
riconoscimento del DNA fagico con le
sequenze specifiche che si trovano sul
corrispondente crRNA, portano alla
formazione di un complesso che viene
riconosciuto dalle proteine Cas.

Alcune delle proteine Cas sono delle nucleasi

che tagliano il DNA fagico  di fatto è un
sistema che i batteri hanno sviluppato per
ricono scere un eventuale fago al momento
della seconda infezione.

IL DESTINO DELLE MOLECOLE DI DNA ACQUISITE PER TRASFERIEMNTO GENICO ORIZZONTALE


Espressione (TRASCRIZIONE) dei geni acquisiti
• Riconoscimento del promotore

153
 • Integrazione in prossimità di un promotore presente sul cromosoma batterico

L’acquisizione di molecole di DNA eterologo permette al batterio ricevente di acquisire proprietà fenotipiche precedentemente
evolute in altri batteri.

TRASPOSONI

• Sequenze lineari di DNA presenti in genomi cellulari, plasmidici e virali, che possono “spostarsi” da un sito ad un altro del
genoma (trasposizione).

• Non sono richieste sequenze omologhe per la trasposizione del trasposone nel sito bersaglio.
• Non sono autoreplicativi, ma vengono replicati come parte del genoma in cui sono localizzati. Le sequenze trasponibili
contengono geni che consentono la loro trasposizione.

- Non sono fagi, in quanto non hanno un ciclo di sviluppo che consente loro di esistere indipendentemente dalla cellula in
cui sono presenti
- Non sono plasmidi, in quanto non possono esistere indipendentemente dal genoma in cui sono presenti

Sono fondamentali perché l’inserimento di un plasmide da un sito ad un altro del genoma può interrompere un gene inducendo
una mutazione (e quindi anche la perdita di una funzione).

Vennero scoperti da Barbara Mc Clintock intorno al 1940 (Premio Nobel 1983) nel Mais, e sono stati studiati estesamente nei
batteri.

Trasposizione CONSERVATIVA: escissione del trasposone dal sito donatore e re-integrazione in un nuovo sito (sito
bersaglio) senza che ci sia la replicazione del trasposone stesso.

Trasposizione REPLICATIVA: replicazione in situ del trasposone contestualmente alla traslocazione della copia nel sito
bersaglio. In contemporanea al processo di trasposizione si ha anche la replicazione  al termine del processo si avranno due
copie dell’elemento, una nel sito originale ed una nel nuovo sito.

TIPI DI TRASPOSONI

LE SEQUENZE DI INSERZIONE (IS)

154
Le sequenze di inserzione sono piccole sequenze di DNA (800-2000 bp) che contengono solo i geni necessari per la loro
traslocazione (TRASPOSASI) ed inserzione. La loro trasposizione ha come conseguenza un effetto mutageno.

La parte più chiara è il gene che codifica la trasposasi (enzima che media il trasferimento del trasposone da un sito all’altro).
Quindi le sequenze IS contengono il ben che codifica per la trasposasi, fiancheggiato da delle sequenze IR ripetute ed invertire.
Ai lati del trasposone (accanto alle IR), ci sono delle sequenze DR ripetute dirette.

TRASPOSONI SEMPLICI

Hanno maggiori dimensioni (> 2000 bp); presentano IS alle estremità che ne regolano il trasferimento; presentano sequenze
codificanti per esempio: resistenza ai farmaci che possono “saltare” da una zona all'altra del cromosoma o dei plasmidi
trovando così la collocazione più idonea (ad esempio: in un plasmide coniugativo) per un loro trasferimento in altre cellule.

Questo tipo di trasposoni possiede ai lati le sequenze dirette ripetute (DR), poi quelle ripetute invertite (IR), il gene della
trasposasi (IS); in più contiene 1/+ geni di resistenza ad antibiotici ed altri geni che invece codificano per delle proteine che
regolano la traslocazione.

Questo trasposone, traslocando sul cromosoma può interrompere un gene e dall’altra parte introdurre stabilmente un gene di
resistenza per un antibiotico.

TRASPOSONI COMPOSTI

I trasposoni completi (o complessi) hanno una porzione centrale che codifica per la resistenza ad un antibiotico e geni
coinvolti nel processo di trasposizione, fiancheggiato da interi elementi IS in cui sono presenti altri geni codificanti per la
trasposizione.

La trasposizione di queste tre tipologie di trasposoni può essere dannosa quando avviene casualmente, interrompendo delle
sequenze codificanti, ma può avere delle conseguenze notevoli per quello che riguarda la diffusione dei geni codificanti per la
resistenza dagli antibiotici nei batteri.

155
CARATTERISTICHE GENERALI DELLA TRASPOSIZIONE

 Tutti gli elementi richiesti per la trasposizione sono codificati dal

trasposone

 La trasposasi è l’elemento essenziale

 Tutte le trasposasi riconoscono e tagliano in modo specifico le estremità

del trasposone ed il sito bersaglio

 Ogni evento di trasposizione determina la replicazione del sito bersaglio

(origine delle sequenze ripetute-dirette fiancheggianti il trasposone)

 Ogni trasposasi riconosce solo le sequenze terminali del proprio

trasposone

MECCANISMI MOLECOLARI DELLA TRASPOSIZIONE

Trasposizione CONSERVATIVA

Si ha un meccanismo nel quale il trasposone si scinde dal sito in cui si trova e va ad integrarsi in un altro.

La trasposasi (pallino giallo) lega prima le estremità del trasposone, avvicinandole (b) e poi lega a caso una regione sul
cromosoma batterico.

Dall’interazione di queste molecole di trasposasi si forma un aggregato dove la molecola donatore e ricevente sono vicine. A
questo punto l’enzima taglia le sequenze adiacenti il trasposone sulla molecola donatrice, taglia il DNA sulla molecola bersaglio
e poi media il legame e la riparazione.

Alla fine, si ottiene, quindi, la molecola ricevente con il trasposone inserito e la molecola donatrice iniziale che ha perso il
trasposone.

Trasposizione REPLICATIVA

La trasposizione replicativa è più complessa. Si ha:

- una molecola donatrice (nero) con un trasposone (verde) fiancheggiato dalle sequenze ripetute dirette (DR);
- una molecola ricevente (rosa) con il sito bersaglio (che non deve avere necessariamente analogia con le sequenze del
trasposone).

156
 Si ha un taglio sfalsato alle estremità del trasposone sulla
molecola donatrice (il taglio è all’estremità 3’) ed un taglio
alle estremità del sito bersaglio sulla cellula ricevente
(all’estremità 5’).

A questo punto le estremità 3’ della donatrice si uniscono a

quelle 5’ della ricevente. Adesso si ha la saldatura dei
frammenti a singolo filamento, e la riparazione e la sintesi di
filamenti complementari. Portano alla formazione di una unica
molecola (“cointegrato”), in cui sono presenti 2 copie del
trasposone fiancheggiati dalle sequenze DR.

A questo punto l’enzima resolvasi (codificato dal trasposone

stesso) rescinde le due molecole in donatrice e ricevente (con
però due copie del trasposone: una che è rimasta sulla
donatrice ed una che si trova sulla ricevente).

157