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Equazione di Michaelis-Menten
k1 k2 E +S ES P + E k-1 d[P] V = = k2 [ES] dt Ma, [ES] non sperimentalmente misurabile; quindi bisogna esprimere la conc. di questa specie in funzione di specie misurabili. E necessario introdurre alcune semplificazioni d[ES] = k1 [E][S] k-1 [ES] - k2 [ES] dt k1 [E][S] KS = = k-1 [ES] Ipotesi dellequilibrio: k-1 molto maggiore di k2: la prima tappa raggiunge lequilibrio Ks
d[ES] = k1 [E][S] k-1 [ES] - k2 [ES] dt Ipotesi dello stato stazionario. d[ES] Il complesso [ES] costantemente formato e = 0 scisso: la velocit della sua sintesi equivalente dt a quella del suo consumo. [E]T = [E] + [ES] k1 [E][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] KM [ES] = ([E]T -[ES] [S] [E]T [S] [ES] = KM + [S] d[P] k2 [E]T [S] V0 = () t=0 =k2 [ES] = dt KM + [S] vmax = k2[E]T (per elevate conc. di substrato, molto superiori rispetto a quelle dellenzima)
KM Costante di Michaelis-Menten
vmax = k2[E]T
-numero di molecole di substrato che vengono convertite nel prodotto in unit di tempo da una singola molecola enzimatica quando saturata con il substrato.
Lineaweaver-Burk
Una reazione enzimatica con due substrati: A+B C+D Rapporto stechiometrico: 1:1 KmA pu essere diversa da KmB
La Tabella descrive come variano i parametri cinetici 1) stesso enzima, diversi substrati 2) forme mutanti dellenzima con lo stesso substrato e con diversi substrati Si pu stabilire come il cambiamento (o del substrato, o della mutazione) influisce sullaffinit enzima-substrato (Km) e sul numero di turnover (kcat).
Misurazione dei parametri cinetici delle reazioni della chimotripsina con diversi pseudosubstrati
Km Costante di Michaelis Menten: - la concentrazione di substrato alla quale la velocit della reazione pari alla met della velocit massima; - indipendente dalla concentrazione di enzima usato; - simile alla costante di dissociazione (Kd) --si esprime in [conc] -Fra due substrati di uno stesso enzima, uno con Km= 1mM e laltro Km = 0.1mM, si pu affermare che il secondo substrato sia molto pi affine per lenzima rispetto al primo substrato.
Vmax - la velocit massima raggiungibile a una concentrazione di substrato tale che tutto lenzima si trovi in complesso con il substrato, cio quando la concentrazione dellenzima totale uguale a quella del complesso ES. - direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima usato nellesperimento e pu essere utilizzata per calcolare la concentrazione dellenzima. -si esprime in conc per unit di tempo.
E definita come vmax/[E] ed indipendente dalla concentrazione di enzima usata nellesperimento. E il numero di cicli catalitici effettuati dallenzima in unit di tempo. Si esprime in reciproco del tempo kcat/Km ( costante di specificit)
E il rapporto tra la frequenza con cui lenzima catalizza la reazione e la sua affinit per il substrato. Pi alto questo rapporto e pi efficiente lenzima. Esso non pu essere maggiore di k1 ( cio la costante di velocit di formazione del complesso. enzima/substrato. Inoltre non pu superare il valore della velocit di diffusione del substrato. Si esprime come reciproco della concentrazione e reciproco del tempo.
Misurando i parametri cinetici di una reazione enzimatica si possono ottenere informazioni Km: affinit enzima substrato Kcat: efficienza catalitica Kcat/Km: costante di specificit che permette di valutare -lattivit catalitica dellenzima con diversi substrati -gli effetti delle mutazioni sullattivit dellenzima -Misurare la quantit dellenzima -U (unit di attivit enzimatica quella quantit dellenzima che converte 1 mole di substrato /min)
-tutti i substrati si devono combinare con lenzima prima che possa avvenire la reazione e possano essere rilasciati i prodotti
meccanismo ordinato: il legame del primo substrato necessario affinch lenzima possa formare il sito di legame per il secondo substrato meccanismo casuale: entrambi i siti di legame sono presenti nellenzima libero
Reazioni a ping-pong
Si ha il trasferimento di un gruppo; uno o pi prodotti vengono rilasciati prima che vengano addizionati tutti i substrati
INIBIZIONE IRREVERSILE (formazione di legame covalente tra lenzima e linibitore) Esempi: serina proteasi, diisopropilfluorofosfato , marcatori di afinit, antibiotici -lattamici,
Inibizione competitiva, non competitiva, mista, inibizione da analoghi dello stato di transizione
Inibizione competitiva
Inibizione incompetitiva
Inibizione mista
Con il
Metanolo viene ossidato a formaldeide ( composto altamente tossico) dallenzima alcool deidrogenasi Questo enzima pu utilizzare come substrato anche letanolo, convertendolo nellacetaldeide.
Inibizione mista