INRIM Biologia

La scienza delle misure e la biologia cellulare: come misurare l'attivit della cellula
Paola Porcedda INRiM Istituto Nazionale di Ricerca Metrologica Torino (Italia)
ISTITUTO NAZIONALE DI RICERCA METROLOGICA
Incontri del Gioved 1 Dicembre 2011 INRiM
Cos la Biologia Cellulare
La Biologia cellulare la scienza che studia a livello strutturale e funzionale i meccanismi che regolano i processi e le attivit della cellula e le interazioni tra le cellule.
Un po di storia
La storia della Biologia cellulare nata con lavvento delle nuove tecnologie del 1600: il microscopio.
Robert Hooke stato il primo a coniare il termine cellula dopo aver osservato la struttura del sughero al microscopio (1655) Schleiden e Schwann (1838) formulano la Teoria Cellulare:
Tutto ci che vivo fatto da cellule Le cellule sono la pi piccola unit della vita Le cellule esistenti derivano da altre cellule
La Biologia Cellulare Moderna
Nasce negli anni 1970 - 80 dalla confluenza di discipline diverse, quali:

la citologia la biochimica la biologia molecolare la genetica molecolare.
Citologia
descrizione morfologica della struttura dei compartimenti cellulari
Biochimica
studio delle vie metaboliche
Biologia Molecolare
studio di proteine ed acidi nucleici
PCR: 1983 da K. Mullis (Nobel nel 1993)

Formulato da Watson e Crick nel 1958 (Nobel nel 1962)

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Genetica
studio funzionale dei geni (Mendel)
Le Unit di misura in Biochimica Biologia Molecolare - Genetica

Normalmente per la quantificazione di Proteine si fa riferimento alle unit di massa (kg) e di sostanza (mol). IDENTITA: per lidentificazione di proteine si ricorre allanalisi amminoacidica, oppure alluso di anticorpi specifici. La Modificazione post-traduzionale di alcune proteine pone problemi di Identit Spesso per, in ricerca, si ricorre ad una quantificazione relativa rispetto ad un controllo partendo da estratti proteici derivanti dallo stesso numero di cellule (trattate e non trattate) Per gli ENZIMI (proteine che catalizzano le reazioni chimiche) si ricorre allUNITA ENZIMATICA: quantit di enzima che provoca la trasformazione di 1 mole di substrato per minuto, a 25C e in condizioni ottima li
eccezioni
Il dalton (Da) ununit di massa su scala atomica o molecolare. Ha un valore di 1,660538921(73)1027 kg. Nel 2006, CIPM lo ha definito come una "non-SI unit whose values in SI units must be obtained experimentally" . La versione 2010 della Guida per Autori in life sciences della Oxford University Press d per le seguenti indicazioni: "Use the Systme international d'units (SI) wherever possible ... The Dalton (Da) or more conveniently the kDa is a permitted non-SI unit for molecular mass or mass of a particular band in a separating gel.
10
Unit di misura per Acidi Nucleici

Per lanalisi dellespressione genica, si misura il livello di RNA di un singolo gene presente nella cellula espresso in Numero di copie. Normalmente si parte da un numero cospicuo di cellule, e si assume che in una cellula siano presenti circa 10 pg di RNA.
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Lunghezza dellAcido nucleico

Lunghezza del DNA in una cellula: (Lunghezza di 1 bp) x (numero di bp per cellula) (0.34 10-9 m) x (6 109) circa 2 metri Il numero di paia di basi rappresenta il numero di coppie di basi azotate che contiene il filamento in analisi. Ogni paio di basi tenuto insieme attraverso legami idrogeno che si instaurano tra le molecole. Le coppie di basi o paia di basi (abbreviate come pb o, dall'inglese base pair, bp o bps) sono comunemente utilizzate come misura della lunghezza fisica di sequenze di acidi nucleici a doppio filamento. Spesso, data la grande dimensione dei genomi, viene utilizzata l'unit kbp, pari a mille paia di basi.
12
Unit di misura del DNA in Genetica

Il centimorgan (cM) l'unit di misura della distanza genetica tra 2 loci, determinata dalla frequenza con cui la ricombinazione avviene tra di essi. Due loci che presentano una frequenza di ricombinazione dell'1%, (cio una probabilit dell1% che i 2 loci sullo stesso cromosoma vengano separati durante una divisione meiotica) sono definiti distanti 1 cM. 1 cM corrisponde mediamente a 106 bp nel genoma umano. Questa unit di misura impiegata nelle mappe genetiche (mappe cromosomiche calcolate attraverso l'utilizzo delle frequenze di ricombinazione). Si chiama cos in onore di Thomas Hunt Morgan, genetista e biologo statunitense e Premio Nobel per la medicina.
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Negli ultimi due decenni la Biologia Cellulare stata tra i settori di ricerca a pi rapido sviluppo, grazie allapporto di tecnologie innovative (legate in particolar modo alla biologia molecolare) che hanno aperto nuove prospettive e favorito un pi immediato collegamento tra descrizione morfologica e strutturale e funzioni della cellula.
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Il misurando: la cellula
La cellula (dal latino, piccola camera) l'unit morfo-funzionale,cio di forma e di funzione, degli organismi viventi, la pi piccola struttura ad essere classificabile come vivente.
Cellule Nervose
Cellula staminale mesenchimale

Immagine di Chaiwat Prawettongsopon
Piastrine e leucociti
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La doppia faccia della cellula

Oggetto di ricerca in Biologia cellulare e Medicina
Citologia Morfologia Biochimica Genetica
Strumento:
- Test in vitro per sviluppo di nuovi farmaci, analisi tossicologiche, diagnostiche, cliniche
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Classico esperimento in Biologia Cellulare: PROLIFERAZIONE

Si parte da cellule in coltura che vengono staccate (con metodi enzimatici) Stimolo (sostanza chimica che interagisce contate (camera di conta Neubauer) con la funzione cellulare in esame) Ri-piastrate in numero noto
Le cellule sono nuovamente staccate e contate con camera di Neubauer tempo

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Proliferazione cellulare in 2D
Scala aritmetica
8,00E+10 7,00E+10 Numero di cellule 6,00E+10 5,00E+10 4,00E+10 3,00E+10 2,00E+10 1,00E+10 0,00E+00 0 20 40 60 80 Tempo [giorni] 100 120 140 160
Dati di C. Divieto e P. Porcedda
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Unit di misura per le cellule

Lunit di misura normalmente usata in biologia cellulare lenumerazione di entit; la conta cellulare la misurazione che descrive processi biologici quali vitalit, proliferazione e citotossicit che sono alla base di innumerevoli test diagnostici e farmacologici. Il CCQM consigliava luso della MOLE per quantificare le cellule.
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Una mole di cellule?

La mole una delle sette unit di misura fondamentali del Sistema Internazionale. Misura la quantit delle sostanze; essa contiene tante entit elementari quante sono gli atomi contenuti in 12 grammi dell'isotopo 12 del carbonio. Tale numero noto come numero di Avogadro, ed pari a 6,02214179 x 1023 Numero di cellule in un corpo umano: 1012-1013 Numero di uomini sulla terra: 7 x 109 nel 2011 Tutte le cellule umane presenti sul pianeta Terra non riescono a raggiungere 1 mol.
20
Confronti Internazionali
Nellambito delle attivit del BioAnalysis Working Group sono stati promossi alcuni confronti per la quantificazione di acidi nucleici, identificazione di proteine, e due confronti internazionali che analizzano cellule: 1- CCQM-Pilot Study P102: Quantification of CD4+ cell enumeration and fluorescence calibration.
2- CCQM-Pilot Study P123: Number and geometrical property of cells adhered to a solid substrate.
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P102 e P123: le motivazioni

Un numero sempre crescente di test farmacologici, tossicologici e diagnostici viene condotto in vitro e si basa sulla conta cellulare Entrambi i confronti hanno come misurandi le cellule: il primo cellule in sospensione (tipicamente cellule del sangue), il secondo cellule adese ad un substrato solido 2D.
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CCQM-Pilot Study P123: Number and geometrical property of cells adhered to a solid substrate.
INRiM, LGC e NIST preparano 1 vetrino con area di analisi definita sulla quale sono state depositate cellule marcate con fluorofori. Lo scopo dello studio pilota consiste nella validazione dellincertezza dei laboratori partecipanti nella quantificazione di: - Numero di cellule per area - Superficie media delle cellule marcate con un fluoroforo ed adese su una superficie solida. - la confluenza (superficie media di cellule x numero di cellule per area / area totale) verr dedotto dalle misure precedenti.
- lo sviluppo di campioni di riferimento biologici di numero e propriet
geometriche di cellule adese ad un substrato solido (per i laboratori pilota)
23
Perch?
Immagini di L. Revel, S. Pavarelli, P. Porcedda
24
CCQM-Pilot Study P123: Number and geometrical property of cells adhered to a solid substrate.
Il P123 preceduto da un confronto trilaterale, per identificare le principali fonti di incertezza nella preparazione dei materiali di riferimento e nelle misure
comparison
25
Vetrini LGC
Uncoated slide scanned using Axon microarray scanner for quality control (calcein stain) Cells form clumps in uncoated wells, resulting in higher well-to-well variability Fibronectin-coated slide scanned using Axon microarray scanner for quality control (calcein stain)
Cells spread homogeneously across fibronectin-coated wells, resulting in lower well-to26 well variability
Vetrini INRiM per P123

Vetrini: Cellule: Staining: piastre IBIDI coated con Fibronectina A549 NuclearMask Blue e CellMask Green
Controlli: - Analisi di adesione delle cellule ai vetrini - Analisi delle dimensioni e della morfologia cellulare a diversi passaggi - Analisi di ciclo cellulare (per vedere la percentuale di cellule in fase G2-M) - Analisi di stabilit dei coloranti - Misure dell Area dei well
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Supporto INRiM
IBIDI Dish Grid-500
-Dish35mm,low,ibiTreat, sterile Area di crescita = 3,5 cm2
Plastica di alta qualit ottica Bassi livelli di birifrangenza e autofluorescenza Nessun effetto sulla crescita cellulare
Linea cellulare ben caratterizzata: A549 (ATCC) utilizzata in HTS
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Vetrini INRiM
A549 fissate sullIBIDI Grid-500
NuclearMask Blue
CellMask Green

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Risultati preliminari inter-laboratorio

Uncoated slide from LGC
Homogeneity level
Cell count per well
600 500 400 300 200 100 0 LGC INRIM NIST
10B
11B
11C
12A
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Well code
Studio delle principali fonti di incertezza

Component Source Description Systematic effects (type B) Correction methods or stocastic (type A) B B double cells count Better slide ambiguous cells count Better slide ambiguous cells count Better slide
cellular proliferation
% cells in Mitosis
omogeneity cells agglomerates / distribution uncertainty due to measurand edge error cells partially external from measurament area decay of fluorescence intensity over the time
dyes stability
analysis over the time Better slide
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Component
Source
Description
Systematic effects (type B) or Correction methods stocastic (type A)
image assembly uncertainty due to acquisition measurement set-up
errors in the automatic overlapping of the images
comparison between automatic overlapping and manual overlapping
lens, focus, contrast, brightness,
physical standards for the microscope calibration
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Component Source Description Systematic effects (type B) Correction methods or stocastic (type A)
standard deviation of the means of the repeatibility all values on measurement measurament repeated mean of the standard deviation uncertainty due to reproducibility of the values of analysis regarding operator / every operator / automatic machine automatic machine on measurament repeated image quality image noise background noise
comparison between images
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CCQM-Pilot Study P102: Quantification of CD4+ cell enumeration and fluorescence calibration
Dr. R. Stebbings - National Institute for Biological Standards and Control, UK Dr. Lili Wang National Institute of Standards and Technology, USA
Gli obiettivi del confronto sono:

lo sviluppo di campioni di riferimento biologici per la calibrazione della fluorescenza in test diagnostici basati sulla citofluorimetria lo sviluppo di campioni di riferimento per larmonizzazione della colorazione e della conta di cellule CD4+ in ambito diagnostico basato sulla citofluorimetria.
34
Strumento di misura: il citofluorimetro

Sistema di fluidica Ottiche Dimensioni
Complessit
Elettronica Fenotipo Sorgente di eccitazione (laser)

35
Materiali prodotti e forniti dal NIBSC Granularity

1. 2. 3. Linfociti liofilizzati pre-marcati con CD4 FITC (sLL) Tampone di ricostituzione Beads Rainbow
Lymphocytes
NIST fornisce microsfere di calibrazione Size

Reconstituted Lyophilised Human Cell Standard
36
Protocollo:
1- Acquisire le beads rainbow al citofluorimetro ed analizzare i picchi di fluorescenza 2- Risospendere le cellule liofilizzate marcate 3- Prelevare le cellule marcate reidratate ed aggiungere un volume noto di beads di calibrazione 4- Acquisire cellule e beads di calibrazione con lo stesso setting usato per le rainbow beads 5- Misurare il numero di cellule CD4+ per unit di volume e lintensit assoluta di fluorescenza delle cellule marcate 6- Stimare lincertezza delle due misure
37
CCQM-Pilot Study P102 Valutazione dellincertezza di misura

Preparativa e stabilit del campione
Taratura pipette e manualit delloperatore Temperatura di mantenimento del campione
Fluorescenza
X X
Numero di CD4+
X X
Strumentale (stabilit ed efficienza laser e fluidica)

CON BIGLIE Ripetibilit - stesso tubo al variare della velocit di acquisizione Ripetibilit - stesso tubo al variare di numero di eventi acquisiti Ripetibilit - tubi diversi acquisiti nelle stesse condizioni di velocit di acquisizione e temperatura CON CELLULE Ripetibilit - stesso tubo al variare della velocit di acquisizione Ripetibilit - stesso tubo al variare di numero di eventi acquisiti Ripetibilit - tubi diversi acquisiti nelle stesse cond. di velocit di acquisizione e temperatura X X X
X X X
X X X
Analisi
Gate Analisi statistica (media, mediana, media geometrica) X X X
38
Istologia
Studio dei tessuti Interazioni tra cellule
39
La Metrologia in Medicina Rigenerativa
Progetti finanziati: Metregen Active (Regione Piemonte) RegenMed (Commissione Europea)
40
Le cellule staminali mesenchimali umane
41
Cellule e Scaffold
www.msm.cam.ac.uk
42
Morfologia e dimensioni SIMILI
Morfologia e dimensioni DIVERSE Cervello

Muscolo
Osso
43
Studi di interazione cellulascaffold con AFM

40 minuti 60 minuti 90 minuti
Immagini di E. Bernardi
44
Scaffold selezionati:
Collagene di tipo I BioCoral: carbonato di Calcio
45
hMSC in scaffolf di collagene

2D: 10000 cellule CELLULE INGLOBATE: 300 l di collagene CELLULE IN SUPERFICIE: 300 l di collagene
Immagini di C. Divieto
46
Trattamento differenziativo osteo-induttivo in 2D

Controllo 14 giorni di trattamento
10x Magnification
10x Magnification
47
Differenziamento in 3D su scaffold di collagene
48
Differenziamento osteo-induttivo in scaffold di collagene

CONTROLLO TRATTATO
CELLULE INGLOBATE
CELLULE IN SUPERFICIE
Immagini di C. Divieto e L. Accomassi

49
Classico esperimento in Biologia Cellulare: PROLIFERAZIONE

Si parte da cellule in coltura che vengono staccate (con metodi enzimatici) contate (camera di conta Neubauer) Ri-piastrate in numero noto
tempo
Le cellule sono nuovamente staccate e contate con camera di Neubauer

Le cellule non si staccano dallo scaffold
Come contarle nel 3D?

Incontri del Gioved 1 Dicembre 2011 INRiM 50
tempo
Stimolo (sostanza chimica che interagisce con la funzione cellulare in esame)
Analisi della crescita cellulare nel tempo: proliferazione
51
Contare le cellule tramite lattivit cellulare?

6,E+05 5,E+05 4,E+05 5 x 104 cells seeded 3,E+05 2,E+05 1,E+05 0,E+00 0 2 4 6 8 10 Time [Days] 12 14 16 18 20 10 x 104 cells seeded 30 x 104 cells seeded
Resorufin fluorescence [A.U.]
Dati di C. Divieto
52
Correlazione semplice tra fluorescenza e proliferazione?
25 20 2^-ddCt 15 10 5 0 1 4 7 OP CD105
10
14
18
Time [Days]
Osteopontin (OP) differentiation marker CD105 stemness marker

53
Un nuovo balzo tecnologico?
54
Sviluppo di strumentazione innovativa: MICROSCOPIO MULTIFOTONICO

-CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) - Imaging a Selezione chimica dei campioni - Label free; non distruttivo - 2PE (two photon excitation) -Alta definizione spaziale per misure in 3D con marcatori fluorescenti - SHG (Second Harmonic Generation) -Label free; non distruttivo; per studio di molecole con struttura non centro-simmetrica (es. collagene della matrice extracellulare )
INRiM Laboratorio di Spettroscopia molecolare
55
Le immagini CARS/SHG
hMSC vive inglobate in uno scaffold di gel di fibrina
DAY0 DAY7 DAY14 DAY21 DAY28
Immagini di L. Mortati
56
56
Immagine di hDF in gel di fibrina ottenuta con CARS
Typical acquisition data: 2 s/pixel; z stack resoluzion less than 500 nm
57
Ringraziamenti
Responsabile del gruppo di Metrologia delle Bioscienze e sostanze in tracce: Mariapaola Sassi Carla Divieto Laura Revel Chaiwat Prawettongsopon Alessia Demichelis Ettore Bernardi Leonardo Mortati Gianni Intermite Stefano Pavarelli Ettore Malgeri
58

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Una mole di cellule?

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