Lateral

Cateral flow assay (test

flowassay Itest rapidi)
rapidil
H

Sono sistemi di diagnostica rapida (per controlli in frontiera, in casi di pandemie per cui i laboratori sono oberati di lavoro…), che
possono essere fatti senza richiesta di attrezzature e competenze particolari.
È un approccio importante, soprattutto negli ultimi anni, contro malattie emergenti e ne esistono diversi in commercio (coprono le
situazioni di emergenza anche in paesi con mezzi limitati in modo abbastanza facile). Inoltre, sono stati implementati e questo è
correlato con lo sviluppo di tecnologie legate ai biosensori.

VANTAGGI: i classici metodi molecolari, sono molto sensibili e specifici ma richiedono personale specializzato, strutture adeguate e
strumentazione spesso costosa (in base al paese in cui ci si trova si può avere strumenti più o meno sviluppati)
• Quelli rapidi servono per rilevare in modo diretto o indiretto il mo: nella ricerca dell’antigene si possono vedere infezioni attive; con
la ricerca di Ig si può capire se c’è stata un’infezione, senza ricercare direttamente l’antigene.
• Possono essere usati nella point-care diagnostics (diagnostica fatta vicino al paziente)
• Hanno un costo modesto
• Danno un risultato nel giro di pochi min (max 30 min).
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Ci sono, però, anche SVANTAGGI:

• un campione negativo può essere rilevato facilmente come un falso positivo —> minore sensibilità rispetto alle metodologie più
complesse
• il dato è solo qualitativo, anche se con alcuni sistemi più evoluti si possono avere dati semi-quantitativi
• devono essere fatti sempre in modo appropriato, seguendo le istruzioni (es. in condizioni ambientali favorevoli, in posizione
orizzontale…)

Come funzionano?
Sono presenti 4 settori (colori):
- c’è il sito di caricamento del campione (sample pad), composto da un materiale che consente di assorbire (possibile uso di vari tipi di
materiali) e eliminare alcune parti del campione (es. goccia si sangue: trattenere i globuli rossi così che
non influenzino il flusso del materiale);
- c’è poi la parte che contiene i sistemi di rilevamento in forma anidra (coniugate pad) del materiale da mettere in
evidenza (es. Ab coniugati ai sistemi di rilevazione).
Le 2 parti sono sovrapposte, anche se con materiali diversi, per creare un tutt’uno nel sistema.
- la 3a parte contiene la componente di evidenziazione del risultato (NC membrane) del test, solitamente una membrana di
nitrocellulosa (di vario tipo); il sistema di rilevamento può essere di Ab, ma anche di Ag, a seconda di come è disegnato il test.
- c’è poi la fase di assorbimento (asborbent pad), per creare il flusso di campione e assorbire l’eccesso.
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Ad esempio, nell’uso di sangue (usato anche con il Covid per vedere se l’individuo ha avuto una condizione asintomatica, rilevando Ab):
il siero sale, dopo essere stato diluito; nella parte coniugata, gli Ab vengono idratati e vengono in contatto con il campione; per vedere
Ab anti-Covid, se vengono trovati, l’Ab idratato li lega e dà segnale.

Questi test hanno avuto delle evoluzioni. Per la ricerca di antigeni, si distinguono due meccanismi:
• meccanismo a sandwich: usato quando ci sono antigeni di una certa dimensione, che hanno epitopi diversi che possono legare Ab
diversi. L’antigene viene catturato da 2 Ab durante il test, quindi l’intensità del segnale è proporzionale alla concentrazione del
target nel campione.
Nelle striscioline rilevate nel test ci sono 2 Ab diversi: nella striscia test ci sarà un’anticorpo immobilizzato, che lega l’antigene. Quindi
se c’è l’antigene, questo fluisce e lega l’Ab della porzione test, rimanendo immobilizzato. Nella zona di coniugazione, però, sono presenti
Ab coniugati in grado di riconoscere quell’antigene in un epitopo diverso; quindi l’Ab del test blocca l’antigene, che lega l’Ab coniugato
per il rilevamento, immobilizzandoli e permettendo la visione della banda.
Il controllo, invece, è un anticorpo in grado di legare l’Ab coniugato, quindi l’interazione avviene sia che ci sia l’antigene sia che non ci
sia (rappresenta che il campione è stato caricato e gli Ab di coniugazione sono stati idratati e trasportati in modo corretto).
Le due striscioline sono visibili entrambe nel momento in cui il campione è positivo (se negativo, si vede solo quella del controllo).
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• meccanismo competitivo: meno usato, si fa quando ci sono target piccoli e non ci sono epitopi che consentono di legare 2 anticorpi
diversi (antigene si lega solo ad un anticorpo).
La banda di controllo presenta un anticorpo che lega l’Ab coniugato come prima; ma nella banda test non c’è un anticorpo, ma un
antigene, lo stesso che lega l’Ab coniugato e che deriva dal campione quando è positivo; quindi se negativo, il campione solubilizza l’Ab
coniugato, va soluzione ma non lega nessun antigene dal campione perché non c’è. Quando arriva nella banda test, invece, si lega
all’antigene immobilizzato e dà la banda - si ha la doppia banda quando il test è negativo).
Se nel campione c’è l’antigene, si lega all’Ab coniugato prima che questo arrivi alla banda test; quindi, quando il sistema arriva alla zona
test, l’Ab coniugato è già occupato e non può legare l’antigene della regione test la banda rimane quindi non visibile o molto scoloritosi.

Nel rilevamento di anticorpi, invece, ne esistono di vari tipi.

Nel funzionamento, c’è sempre un sistema di flusso, che però presenta due siti di legame (test 1 e test 2), per aumentare la specificità
del sistema.
C’è sempre la porzione che contiene le sostanze di rilevamento, seguito dalla porzione di test.
Il controllo è formato da vidina immobilizzata sulla linea, che dà segnale positivo grazie alla presenza di biotina
coniugata ai sistemi di rilevamento; quindi, quando il campione fluisce, la biotina lega la vidina, dando la banda
di controllo (test avvenuto correttamente).
I 2 sistemi aumentano la specificità, perché gli Ab possono essere in bassa quantità, avere diverse efficienze di
legame…
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Spesso viene usata la proteina A dello stafilococco, che lega Ab umani; infatti, quando il campione con vari Ab
viene caricato, questo idrata i sistemi di rilevamento (biotina per il controllo e antigene N coniugato per rilevare
l’anticorpo); la presenza di un Ab umano che lega la proteina N, si avrà una condizione in cui l’Ab si lega a entrambi i sistemi, dando
segnale positivo nel test 2.
Per aumentare l’efficienza, è stata introdotta anche la proteina A, che lega gli Ab presenti nel siero; si legheranno anche gli Ab anti-N,
con la comparsa delle due bande.

Esistono molte varianti di questi test, con implementazioni

• detection simultanea di igM e igG: utile nel caso in cui si vuole capire la fase dell’infezione o da quanto è passata (IgG solo se
passata).
• detection delle proteine S di SARS-Cov2: simile al sandwich, non presenta un anticorpo legante, ma sfrutta il recettore ACE-2 per
immobilizzare la spike del virus. Poi l’anticorpo anti-spike è coniugato con la sostanza che dà la colorazione della banda.

Nei modelli basilari più semplici, come materiale che dà colore si usa l’oro colloidale, coniugato con gli anticorpi. Quando l’oro si
accumula nella striscia, dà colorazione che può essere messa in evidenza.
Funziona ed è un sistema semplice, ma non dà dati quantitativi; infatti, nei modelli più complessi è sostituito con nanoparticelle (di
diverso materiale), come quelle fluorescenti, che permettono di avere una misurazione più sensibile (segnale più forte) e semi-
quantitative (o qualitative se si ha un confronto). Serve, però, una luce che eccita la fluorescenza per poterla leggere.
Si stanno sviluppando anche dei sistemi di acquisizione del’immagine più semplici e portatili (dei piccoli lettori di fluorescenza per
vedere le bande), in cui si usano i telefoni per rilevare il dato fornito dalla macchina, che può essere poi salvato e condiviso
velocemente.

—> Ci sono vari kit basati su questi flussi per il Covid-19: molti usano ancora l’oro, mentre altri usano anche fluorescenza e luminescenza.
Le sensibilità sono molto alte e sono semplici d a utilizzare (es. semplice uso di goccia di sangue).

Esistono forme diverse di queste metodiche, utili anche per rilevare il DNA. Il campione è isolato, non si rileva l’antigene ma il sistema
di cattura ibrida DNA (rilevazione diretta del campione). Alcuni possono anche rilevare virus come HIV, HCV e Treponema pallidum nello
stesso test (analisi multipla).
L’acido nucleico viene bloccato e, dopo amplificazione, il segnale viene rilevato. Si usa quindi un’amplificazione del DNA su sistema
miniaturizzato, messo poi in evidenza usando lo strand displacement.
Sono importanti perche si stanno sviluppando metodologie miniaturizzate di diagnostica, fino a rilevamento di tipo elettrico e
biosensori.

Nella diagnostica per HBV, ad esempio, si rileva la fluorescenza con biosensori, che aumenta la sensibilità; ci sono anche sistemi
multipli, fatti per rilevare dello stesso campione HIV, HAV, HCV, quindi più virus contemporaneamente. Importante per fare diagnosi
differenziale, nel momento in cui nelle fasi iniziali la sintomatologia è molto generica e comune a più patogeni.

Nei sistemi complessi, vengono usate nanobiglie modificate con luminescenze molto forti, per aumentare sempre la sensibilità; anche
qui le marcature possono essere multiple per fare diagnosi differenziale (es. SARS-COV-2 e influenza).