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DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO (ELISA)

Tecnica che in generale utilizza un anticorpo a cui legato un enzima (es: fosfatasi
alcalina, perossidasi) in grado di catalizzare una reazione in cui un substrato incolore
viene convertito in un prodotto colorato. Combina la specificit della reazione
antigene/anticorpo con la sensibilit di una reazione enzimatica.

Elisa indiretto
Screening degli anticorpi monoclonali (dosaggio anticorpi).
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Si fa adsorbire ad una base in plastica lantigene contro cui si vuole produrre


lanticorpo. Si utilizza una piastra dotata di diversi pozzetti e in ciascun pozzetto
viene fatto adsorbire 0.1-1 g di antigene.
A ciascun pozzetto si aggiunge unaliquota di terreno in cui sono cresciuti i
diversi ibridomi. Se nel terreno di coltura presente lanticorpo specifico, si
former un complesso antigene/anticorpo riconoscibile tramite reazione con un
anticorpo anti-immunoglobulina murina marcato con un enzima (perossidasi).
Si aggiunge un cromogeno e il substrato dellenzima (perossido di idrogeno). In
seguito alla reazione enzimatica si svilupper colore, che risulta direttamente
proporzionale alla quantit di anticorpo specifico presente nel terreno di coltura.

Metodo competitivo
Dosaggio antigeni.
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Si fa adsorbire ai pozzetti della piastra lanticorpo.


Si aggiunge una miscela costituita da quantit nota di un antigene marcato con
enzima e una quantit non nota dello stesso antigene non marcato. Sul sito
dellanticorpo di crea una competizione tra lantigene marcato e quello non
marcato.
Si aggiunge il substrato dellenzima e si misura lattivit enzimatica. Il valore
ottenuto direttamente proporzionale alla frazione di antigene marcato
presente nella miscela.
Lesperimento viene ripetuto in presenza esclusivamente di antigene marcato a
concentrazione nota. La differenza tra i due valori ottenuti consente di calcolare
la concentrazione di antigene presente nel campione originale.

Metodo del doppio anticorpo (ELISA sandwich)


Dosaggio antigeni.
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Si fa adsorbire ai pozzetti della piastra lanticorpo.


Si aggiunge una soluzione a concentrazione incognita di antigene e dopo
opportuni lavaggi con un tampone si aggiunge un secondo anticorpo.
Questultimo marcato con un enzima e riconosce un epitopo diverso rispetto
al primo anticorpo.
Si aggiunge il substrato dellenzima e si misura lattivit enzimatica. Il valore
ottenuto direttamente proporzionale alla quantit di antigene presente nella
soluzione iniziale.

IMMUNOPRECIPITAZIONE
La reazione antigene/anticorpo, in determinati rapporti stechiometrici, pu dar luogo
alla formazione di un polimero di elevatissimo peso molecolare che diventa insolubile
nelle soluzioni acquose. Se si monitorizza la concentrazione di immunoprecipitato in
funzione della concentrazione di antigene presente si ottiene una curva. La curva
divisibile in tre zone: 1) zona di eccesso di anticorpo, dove laumento della
concentrazione di antigene determina un aumento di proporzionale della
concentrazione di immunoprecipitato; 2) zona di equivalenza, dove si ha la massima
concentrazione di immunoprecipitato; 3) zona di eccesso di antigene, dove un
aumento
di
concentrazione
di
antigene
provoca
la
dissoluzione
dellimmunoprecipitato.

IMMUNODIFFUSIONE
Quando limmunoprecipitazione
immunodiffusione.

avviene

allinterno

di

un

gel

si

parla

di

Immunodiffusione radiale semplice (test di Mancini)


Dosaggio antigeni.
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Si stratifica un gel di agar contenente lanticorpo su una superficie rigida.


Vengono scavati nel gel dei pozzetti circolari nei quali viene aggiunto lantigene.
Man mano che lantigene diffonde radialmente viene a contatto con lanticorpo
presente nellagar e precipita formando un anello che si allarga fin quando non
viene raggiunto il punto di equivalenza. II diametro dellanello funzione della
concentrazione di antigene.
Per determinare la concentrazione incognita di un antigene necessario
costruire una curva di taratura aggiungendo ai pozzetti quantit note e
crescenti di antigene. Si misura il diametro di ciascun anello e si costruisce un
grafico (y: quadrato del diametro, x: concentrazione di antigene).

Immunodiffusione doppia (test di Ouchterlony)


Stabilire lidentit (o meno) degli antigeni e se questi possiedono epitopi in comune.
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Si stratifica un gel di agar su un supporto rigido e vengono scavati dei pozzetti


in una particolare disposizione. Nel pozzetto centrale viene depositato
lanticorpo e nei pozzetti laterali i diversi antigeni. Anticorpo e antigeni
diffondono nellagar e in corrispondenza del punto di equivalenza si forma
limmunoprecipitato (meglio evidenziato con il blu di Coomassie).
Reazione di identit: si ottiene una linea continua derivante dalla fusione di due
bande di precipitazione gli antigeni contengono epitopi uguali.
Reazione di identit parziale: si ottiene una banda di precipitazione che
confluisce nellaltra gli antigeni hanno almeno un epitopo in comune.
Reazione di non identit: si ottengono due bande di precipitazione indipendenti
che si intersecano antigeni diversi.

La posizione relativa della banda di precipitazione fornisce anche una stima


semi quantitativa della concentrazione di antigene (tanto maggiore la
quantit di antigene presente, tanto maggiore la distanza della banda).

IMMUNOELETTROFORESI
Tecnica che permette di sfruttare la specificit della reazione anigene/anticorpo e la
possibilit di separare le molecole cariche tramite elettroforesi.
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Si utilizza un gel di agar su cui si praticano due incisioni parallele e si scavano


alcuni pozzetti nei quali vengono depositati gli antigeni.
Si applica un campo elettrico per far avvenire la separazione elettroforetica. Gli
antigeni si muoveranno nel gel in base alla loro carica e alle loro dimensioni.
Al termine dellelettroforesi si riempiono le due incisioni con un antisiero
opportuno e si lascia in incubazione per una notte. Gli antigeni diffondono
radialmente e gli anticorpi lateralmente, dando origine ad archi di
precipitazione.

Immunoelettroforesi quantitativa (rocket elettroforesi)


Dosaggio antigeni.
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Si utilizza un gel di agar in cui presente lanticorpo e si scavano alcuni pozzetti


nei quali vengono depositati gli antigeni.
Si applica una corrente continua: gli antigeni migrano verso lanodo (+) e
incontrano gli anticorpi che si muovono verso il catodo (-). Quando antigene e
anticorpo
raggiungono
lequivalenza
stechiometrica
si
formano
gli
immunoprecipitati insolubili e si possono osservare quindi archi di
precipitazione.
Costruendo un grafico (y: altezza archi di precipitazione, x: concentrazione
dellantigene) possibile ottenere una retta di taratura da cui si potr risalire
alla concentrazione di antigene in un campione ignoto.

Immunoelettroforesi bidimensionale
Dosaggio antigeni.
-

Gli antigeni vengono dapprima separati mediante elettroforesi su agar (rocket


elettroforesi) e successivamente la porzione del gel contenente gli antigeni che
sono stati separati viene trasferita su una lastra di vetro.
Accanto a questo gel viene stratificato un secondo gel di agar contenente un
anticorpo e si effettua una elettroforesi perpendicolare alla precedente.
Si pu notare in questo modo la formazione di archi di precipitazione con forma
simile ad una campana. Larea sottesa da ciascun arco proporzionale alla
concentrazione di antigene. Dal confronto dellarea sottesa dallarco
dellantigene incognito con le aree sottese dagli archi derivati da concentrazioni
note di antigene possibile avere una stima semi quantitativa della
concentrazione dei singoli antigeni presenti nel campione analizzato.

CROMATOGRAFIA
Cromatografia di esclusione o gel filtrazione
Separazione di molecole in base alla loro forma e al loro peso molecolare, sfruttando il
diverso valore di Kd (coefficiente di distribuzione).
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I materiali pi utilizzati sono polimeri aventi una struttura tridimensionale a


porosit ben definita (destrani con legami crociati, agarosio, poliacrilammide,
poliesteri, gel di silice, polistireni). Ogni resina caratterizzata da un limite di
esclusione, cio un parametro che indica la massa molecolare delle molecole
pi piccole che non possono penetrare allinterno dei pori della resina e quindi
occupare solo il volume vuoto.
La separazione delle molecole presenti in miscela pu avvenire in seguito ad
una loro diversa ripartizione allinterno dei pori del gel. Le molecole di maggiori
dimensioni non possono penetrare allinterno dei pori e quindi vengono eluite
pi rapidamente poich scorrono sempre sulla superficie del gel (possono
occupare solo gli spazi interstiziali tra i granuli del gel). Le molecole pi piccole
possono invece entrare allinterno dei pori in modo diverso a seconda delle loro
dimensioni e vengono eluite pi lentamente, poich si sono distribuite sia
allinterno che allesterno dei pori.
La fase mobile occupa sia il volume interno sia quello esterno ai granuli del gel,
quindi le molecole in miscela si ripartiscono tra due fasi liquide e la separazione
avviene solo grazie alle dimensioni dei pori e alla capacit o meno delle
molecole di entrare in essi.
Lo spazio fra i granuli viene definito volume vuoto V
Lo spazio allinterno dei granuli viene definito volume interno Vi
La somma di questi due volumi corrisponde al volume totale: Vt = ( V + Vi)
Il volume di fase mobile con cui viene eluita una determinata molecola
chiamato volume di eluizione V
Il campione viene eluito dal flusso della fase mobile attraverso una colonna, le
molecole di grandi dimensioni non possono penetrare nei pori e hanno un
volume di eluizione pari a V; le molecole di dimensioni pi piccole rispetto ai
pori avranno volume di eluizione V + Vi; le molecole di dimensioni intermedie
hanno un volume di eluizione compreso tra V e Vt.
Applicazioni: purificazione di macromolecole biologiche (proteine, acidi nucleici,
virus, polisaccaridi), determinazione del peso molecolare (il volume di eluizione
risulta direttamente proporzionale al logaritmo del peso molecolare),
dissalazione, studi di binding.

Cromatografia a scambio ionico


Separazione di molecole sfruttando linterazione elettrostatica tra cariche di segno
opposto.

Le fasi stazionarie consistono di resine scambiatrici di ioni: gli scambiatori


anionici e gli scambiatori cationici.
Gli scambiatori anionici presentano gruppi funzionali carichi positivamente e
interagiscono con ioni carichi negativamente. Inizialmente queste resine
vengono equilibrate con un tampone in grado di favorire un controione, cio uno
ione di carica opposta a quello legato alla resina. Quando i componenti di una
miscela vengono eluiti lungo la colonna, quelli carichi negativamente spiazzano
i controioni e si legano alla matrice.
Gli scambiatori cationici possiedono gruppi funzionali carichi negativamente e
sono in grado di interagire con molecole cariche positivamente.
Questi scambiatori possono essere distinti in scambiatori forti o deboli. Gli
scambiatori forti mantengono il loro stato di ionizzazione in un ampio range di
pH, mentre quelli deboli possono essere utilizzati in un range di pH pi ridotto.
Gli scambiatori anionici deboli hanno amminogruppi primari o secondari con
valori di pK compresi tra 8 e 10, mentre gli scambiatori anionici forti hanno
gruppi amminici quaternari con pK > 13.
Gli scambiatori cationici deboli hanno gruppi carbossilici con valori di pK
compresi tra 4 e 6, mentre gli scambiatori cationici forti hanno gruppi solforici
con pK < 1.
Nel caso in cui si debba separare una miscela di proteine la scelta dello
scambiatore dipender dal punto isoelettrico della proteina (il valore di pH a cui
la proteina non possiede carica netta). Infatti a pH > pI la proteina ha carica
netta negativa, a pH < pI la proteina possiede carica netta positiva.
Le resine pi utilizzate nella cromatografia a scambio ionico sono costituite da
polimeri come cellulosa, destrano, agarosio, poliacrilammide e polistirene.
Si possono distinguere cinque fasi: 1) diffusione della molecola carica lungo la
superficie dello scambiatore; 2) diffusione della molecola attraverso la resina
fino a raggiungere il sito di scambio (dove si scambia con i controioni); 3)
scambio di ioni; 4) eliminazione dei controioni scambiati; 5) distacco selettivo
della molecola carica dallo scambiatore e sua eluizione.
Effetto Donnan: indice della repulsione elettrostatica che si instaura allinterno
della colonna tra ioni aventi la stessa carica. Determina una diversa diminuzione
del pH a livello del sito di scambio.

Cromatofocusing
Tipo particolare di cromatografia a scambio ionico. Si utilizza uno scambiatore anionico
debole equilibrato con un tampone leggermente basico.
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Leluizione avviene utilizzando una miscela di anfoline (molecole poliammino


policarbossiliche caratterizzate da un elevato potere tamponante) titolate a pH
acido. Il pH al quale vengono titolate le anfoline sar pari al pH che si vuole
ottenere al termine della corsa cromatografica nel tampone che fuoriesce dalla
colonna. Le anfoline permettono di formare un gradiente decrescente di pH
lungo la colonna.
Il polybuffer un insieme di buffer appositamente miscelati per ottenere un
potere tamponante regolare allinterno di un ampio range di pH. Man mano che
il polybuffer viene eluito lungo la colonna, le componenti pi acide si legano ai
gruppi carichi positivamente presenti sullo scambiatore. Nelle fasi iniziali
delleluizione la soluzione che fuoriesce dalla colonna avr un valore di pH molto
vicino a quello di partenza. Man mano che leluizione prosegue (e si ha una

quantit maggiore di polybuffer nella colonna) il pH si abbassa


progressivamente in ogni punto della colonna. Nella fase finale della
separazione cromatografica il pH della soluzione che fuoriesce dalla colonna ha
lo stesso pH del polybuffer che entra in colonna.
La proteina si muove lungo la colonna fin quando non trova una zona che
possiede pH > del suo pI. In queste condizioni la proteina assume
temporaneamente carica negativa e rimane legata alla resina fino allarrivo del
fronte del gradiente. Quando il pH di questa regione della colonna scende al di
sotto del pI della proteina, questa acquista carica positiva, si stacca dalla resina
e scende lungo la colonna fin quando non trover nuovamente una zona a pH >
pI. Questo processo si ripete fin quando la proteina esce dalla colonna in
corrispondenza del suo pI.

Cromatografia di affinit
Separazione cromatografica che sfrutta il legame altamente specifico di una
macromolecola per un ligando. Purificazione proteine.
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La fase stazionaria costituita da una matrice in cui immobilizzato un ligando


specifico per la molecola che si vuole isolare. In questo modo solo la molecola
specifica per il ligando potr legarsi alla matrice mentre tutte le altre verranno
eluite dalla fase mobile ed eliminate. Successivamente, cambiando le condizioni
di eluizione e inducendo la rottura del legame ligando/molecola possibile
recuperare questultima.
Le matrici utilizzate sono: destrano, agarosio, gel di poliacrilammide e cellulosa.
Per evitare che il legame del ligando alla matrice possa compromettere il suo
legame con la molecola che si vuole purificare preferibile inserire tra la
matrice e il ligando un braccio spaziatore, formato generalmente da 6-10 atomi
di C.
I ligandi utilizzati si possono suddividere in due gruppi: 1) ligandi specifici per
una singola molecola (specificit assoluta) e 2) ligandi gruppo-specifici.
Leluizione pu essere specifica o aspecifica.

Cromatografia ad interazioni idrofobiche


Deriva dalla cromatografia di affinit.
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Aree idrofobiche superficiali delle proteine possono interagire con catene


alifatiche e questo tipo di interazione pu essere modulato dal livello di
solvatazione delle proteine. Le aree idrofobiche delle proteine, infatti, sono
ricoperte da molecole di acqua organizzate in clatrati, che possono essere
rimossi aggiungendo sali (es: ammonio solfato).
Le resine utilizzate sono costituite da una matrice di agarosio a cui sono legati
gruppi alchilici o fenilici.
Il campione viene caricato sulla colonna in un tampone ad elevata forza ionica,
in modo da favorire il legame delle proteine presenti in miscela con i gruppi
funzionali idrofobici della fase stazionaria.

Leluizione viene condotta utilizzando un gradiente decrescente di forza ionica,


cos da diminuire selettivamente le interazioni idrofobiche tra le diverse
proteine e la resina e permetterne la separazione.

FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography)


Permette di utilizzare tutte le tecniche cromatografiche migliorando notevolmente i
tempi e lefficienza di separazione di peptidi e proteine.
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possibile utilizzare come fase mobile tamponi acquosi e soluzioni saline che
permettono di salvaguardare lintegrit strutturale e funzionale delle
macromolecole che devono essere separate.
Le resine normalmente utilizzate comprendono resine polimeriche formate da
polistirene e divinilbenzene, matrici di agarosio o destrano legate
covalentemente con acrilammide. Queste matrici devono essere rigide e non
comprimibili alle pressioni che vengono impiegate durante la separazione
cromatografica.
Un sistema FPLC formato da una o due pompe ad alta precisione, ununit di
controllo per la regolazione del flusso e della pressione e per il controllo del
miscelatore, un miscelatore che permette di impostare i gradienti utilizzati per
leluizione, un iniettore per il caricamento del campione, una colonna
cromatografica, un sistema di rivelazione e un collettore di frazioni.

STUDI DI BINDING

Real Time BIA


Studio delle interazioni biomolecolari.
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Si basa su un fenomeno ottico detto Surface Plasmon Resonance (SPR). Una


specie interagente (ligando) si trova immobilizzata sulla superficie di un chip,
mentre laltra (analita) si trova in soluzione. Il segnale SPR legato ad un
cambiamento dellindice di rifrazione sulla superficie del sensor chip, che si
verifica quando il ligando si lega allanalita. Questo segnale viene monitorato in
continuo e quindi le interazioni tra le biomolecole possono essere studiate in
tempo reale.
La strumentazione utilizzata la seguente:
Sensor chip: presenta una superficie biospecifica dove hanno luogo le
interazioni tra analita e ligando.
Unit di rivelazione: componenti ottici ed elettronici per misurare la risposta
SPR.
Integrated Microfluidic Cartridge (IFC): contiene i microtubi che trasportano il
tampone, il loop per il caricamento del campione e le valvole.

Microprocessori: controllano il flusso della pompa e lo stato delle valvole dellIFC


e processano il segnale SPR
TEORIA DELLA RISONANZA PLASMONICA DI SUPERFICIE
In corrispondenza dellinterfaccia tra due mezzi trasparenti con diverso indice di
rifrazione, la luce proveniente dal lato con pi alto indice di rifrazione viene in
parte riflessa e in parte rifratta. Al di sopra di un angolo di incidenza detto
critico, non viene rifratta alcuna luce attraverso linterfaccia e si ha riflessione
totale. In queste condizioni una componente del campo elettromagnetico della
radiazione incidente, detta onda evanescente, si propaga ad una certa distanza
nel mezzo dotato di minor indice di rifrazione. A livello del sensor chip i due
mezzi con diverso indice di rifrazione sono il vetro e la soluzione tampone.
Allinterfaccia tra di essi si trova un sottilissimo strato doro. In queste condizioni
londa evanescente che si genera interagisce con gli elettroni di superficie
delocalizzati delloro (plasmoni) e si verifica il fenomeno di risonanza di tali
elettroni, con conseguente riduzione dellintensit della radiazione riflessa.
Langolo al quale si osserva questo fenomeno detto angolo SPR. In poche
parole: se lanalita interagisce con il ligando si verifica una variazione dellindice
di rifrazione dello stato acquoso, con conseguente cambiamento dellangolo
SPR. Questultimo determina la registrazione di un segnale da parte dello
strumento. Tanto maggiore il peso molecolare dellanalita, tanto maggiore il
segnale in SPR.
Applicazioni: studi di cinetica e affinit, studi di concentrazione di composti in
matrici complesse, caratterizzazione dei siti di legame, studio di complessi
multimolecolari. Gli studi coinvolgono macromolecole come proteine, acidi
nucleici, lipidi e farmaci.

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA PRIMARIA DI UNA PROTEINA


Degradazione di Edman
Successione di reazioni che consente di rimuovere un residuo amminoacidico alla volta
a partire dallestremit N-terminale della proteina.
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Prevede il trattamento del polipeptide con fenilisotiocianato (PITC), un reattivo


in grado di reagire con lestremit N-terminale libera della catena polipeptidica
formando feniltiocarbammil-derivato o PTC-derivato. La reazione evviene in
condizioni di pH basico (circa 9). Quando il PTC-derivato viene trattato con un
acido anidro (acido trifluoroacetico) il legame peptidico tra lamminoacido Nterminale e il secondo amminoacido viene scisso liberando il derivato 2-anilino
5-tiazolinonico del residuo N-terminale e un polipeptide con un amminoacido in
meno. Il derivato tiazolinonico, chimicamente instabile, viene separato dal
polipeptide e convertito, mediante trattamento con un acido diluito, in un
derivato pi stabile: il feniltioidantoin-derivato (PTH-amminoacido). La
rimanente catena polipeptidica accorciata di un residuo viene sottoposta
nuovamente ad un altro ciclo di degradazione di Edman.
Prima di sottoporre una proteina a degradazione di Edman solitamente viene
prima ridotta e carbossimetilata. Questo trattamento permette di avere una
proteina denaturata, il cui residuo N-terminale ben esposto e di trasformare i
residui di cisteina (che durante la degradazione vengono distrutti) in composti
stabili e rilevabili come PTH-derivati.

Altre metodiche
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possibile dedurre la sequenza di una proteina dalla sequenza del gene e del
cDNA corrispondente.
Spettrometria di massa
MS tandem (MS/MS)

SPETTROMETRIA DI MASSA
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)
Analisi di composti organici non volatili che presentano peso molecolare elevato
(proteine, peptidi, glicoproteine, oligosaccaridi, oligonucleotidi).
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Rappresenta un metodo di ionizzazione blanda e comporta prevalentemente la


formazione di ioni momocaricati. Non si hanno in genere fenomeni di
frammentazione del campione.
Il campione viene dapprima miscelato con un composto organico che funge da
matrice. Questo composto deve essere in grado di assorbire la luce emessa
dalla sorgente laser utilizzata per leccitazione del campione. Le matrici pi
utilizzate sono lacido sinapinico (per lanalisi di proteine) e lacido -ciano-4idrossicinnamico (per lanalisi dei peptidi).
Il campione viene risospeso in un solvente volatile (0.1% di acido
trifluoroacetico). Poi unaliquota di questa soluzione viene miscelata in rapporto
1:1 con una soluzione concentrata di matrice, viene applicata su una piastra
metallica e lasciata cristallizzare.
La piastra viene inserita nello spettrometro di massa che si trova sotto vuoto
spinto. Il campione viene investito da un raggio laser pulsante avente lunghezza
donda di 337 nm. Gli elettroni delocalizzati della matrice assorbono la luce
passando ad uno stato eccitato. Il ritorno allo stato fondamentale comporta la
cessione di una quota di energia al campione, che viene desorbito in forma
gassosa e protonato.
Gli ioni ottenuti subiscono una forte accelerazione ad opera del campo elettrico
nella camera di ionizzazione e vengono analizzati in funzione del tempo di volo
TOF (Time Of Flight), cio il tempo necessario per percorrere la distanza tra
lanalizzatore e il rivelatore.

TECNICHE ELETTROFORETICHE

Lelettroforesi consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico di molecole


elettricamente cariche. Lapparecchiatura comprende un alimentatore e una cella
elettroforetica. Lalimentatore genera un flusso di corrente continua tra gli elettrodi
della cella elettroforetica determinando la migrazione dei cationi verso il catodo (-) e
gli anioni verso lanodo (+). I supporti pi utilizzati sono lacetato di cellulosa, lagar e
il gel di poliacrilammide.

SDS-PAGE (PolyAcrilammide Gel Electrophoresis in SDS)


Separazione proteine e determinazione del loro peso molecolare. Lelettroforesi viene
condotta in condizioni non native.
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LSDS (sodio dodecilsolfato) un detergente anionico che si lega saldamente


alle proteine e ne provoca la denaturazione. In presenza di eccesso di SDS, a
circa 1.4 g di SDS si lega 1 g di proteina, fornendo a questultima carica
negativa. Quindi in questo tipo di elettroforesi tutte le proteine possiedono la
stessa carica negativa costante per unit di massa e si muoveranno allinterno
del campo elettrico esclusivamente in base al loro peso molecolare.
Questo tipo di elettroforesi viene condotto in una cella elettroforetica verticale
con lanodo posto inferiormente. Si utilizzano due tipi di gel di poliacrilammide
contenenti SDS stratificati luno sullaltro: 1) stacking gel (gel di impaccamento),
che corrisponde alla parte superiore e 2) running gel (gel di corsa) che
corrisponde alla parte inferiore.
I campioni proteici sono di solito solubilizzati in un tampone Tris HCl a pH 8.3
contenente SDS, un riducente (ditiotreitolo o mercaptoetanolo) per ridurre i
ponti disolfuro, saccarosio o gligerolo per aumentare la densit e blu di
bromofenolo (indicatore della corsa elettroforetica). I campioni sono poi caricati
nei pozzetti.
Quando si applica il campo elettrico gli ioni cloruro tendono a muoversi molto
velocemente nel gel di impaccamento (pH 6.7), seguiti dai complessi proteinaSDS. La glicina, trovandosi ad un pH pari al suo punto isoelettrico,
praticamente ferma. La glicina quindi si oppone alla corsa degli ioni Cl e del
complesso proteina-SDS. Le proteine tendono a concentrarsi in un volume molto
piccolo e determinano la formazione di uno strato molto sottile e concentrato in
corrispondenza della linea di demarcazione tra il gel di impaccamento e il gel di
corsa. Quando la glicina entra nel gel di risoluzione (pH 8.9) si trova ad un pH
superiore rispetto al suo pI, acquisisce carica negativa e si muove rapidamente
verso lanodo, non ostacolando pi il movimento del complesso proteina-SDS.
Questultimo pu iniziare a muoversi in funzione del peso molecolare della
proteina, sfruttando le propriet di setaccio molecolare del gel di acrilammide.
La corsa elettroforetica viene interrotta quando il blu di bromofenolo contenuto
nel campione raggiunge il bordo inferiore del gel. Il gel a questo punto viene
prelevato dalla camera elettroforetica e viene sottoposto a colorazione per
evidenziare meglio le bande proteiche.
Per calcolare il peso molecolare si sfrutta la relazione lineare tra il logaritmo del
peso molecolare e la mobilit elettroforetica.

Isoelettrofocusing

Analisi delle proteine. Sfrutta la separazione di molecole allinterno di un campo


elettrico e di un gradiente di pH. Elevato potere risolutivo. Particolarmente utile per
separare isoenzimi, proteine fosforilate e proteine patologiche (es: emoglobine
mutate).
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Viene condotta su gel di poliacrilammide o di agarosio in cui stato preformato


un gradiente di pH, in maniera che sia pi acido in corrispondenza dellanodo e
pi alcalino in corrispondenza del catodo.
La proteina si muove allinterno del gel fin quando non incontra una zona il cui
pH uguale al suo pI. In questo punto assume carica nulla e non pi in grado
di muoversi allinterno del campo elettrico.
Il gradiente di pH viene formato utilizzando anfoline, composti a basso peso
molecolare contenenti un numero variabile di gruppi amminici e carbossilici.

Elettroforesi bidimensionale
Separazione di miscele complesse di proteine. Combina sequenzialmente
lisoelettrofocusing e lSDS-PAGE. Particolarmente utilizzata negli studi di proteomica.
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I dimensione: focalizzazione isoelettrica


I campioni vengono diluiti utilizzando un opportuno tampone di reidratazione. A
questa miscela si aggiunge un certo numero di l di immobiline. Per la prima
dimensione si usano strisce di gel di acrilammide nel quale sono state
immobilizzate le molecole di immobiline, che coprono un range di pH da 3 a 10.
Dopo agitazione e successiva centrifugazione ciascun campione viene caricato
nella rispettiva cella. Si deposita poi su ogni campione una corrispondente
striscia di immobiline. Si chiude la cella e si procede allisoelettrofocusing,
variando il voltaggio secondo un programma specifico. Dopo alcune ore di
isoelettrofocusing si mettono a contatto con lanodo e il catodo dei pezzettini di
carta bagnati con acqua distillata, ci serve ad assorbire gli ioni che si
accumulano alle estremit della striscia e che potrebbero compromettere la
separazione elettroforetica.
II dimensione: SDS-PAGE
Al termine della I dimensione, le strisce vengono lavate con acqua ed
equilibrate con un tampone che permetta di 1) eliminare i ponti disolfuro; 2)
alchilare le funzioni SH; 3) permettere allSDS di ricoprire le proteine in modo
da poterle separare esclusivamente in base alla massa relativa. La stricia di gel
proveniente dallisoelettrofocusing poi viene immersa in una soluzione di
agarosio e si lascia polimerizzare. Si esegue quindi la corsa elettroforetica e si
procede fin quando il tracciante ha raggiunto il bordo inferiore del gel, a quel
punto il gel viene rimosso e sottoposto a colorazione per la visualizzazione degli
spot proteici.

Western Blotting
Identificazione di una determinata proteina mediante reazione con un anticorpo
specifico.

Si inizia trasferendo le proteina da un gel, in cui avvenuta la separazione


elettroforetica, ad una membrana immobilizzante. Il trasferimento pu essere
effettuato per capillarit o per azione di un campo elettrico (elettroblotting)
mettendo il gel a contatto con la membrana. Le membrane utilizzate possono
essere diverse ma tutte devono presentare dei pori, con un diametro che
diminuisce progressivamente nellattraversamento della membrana. Le proteine
si legano alla matrice con interazioni idrofobiche ed elettrostatiche e la
dimensione decrescente dei pori favorisce il blocco delle proteine allinterno
della membrana. Le membrane utilizzate sono di nitrocellulosa, PVDF
(PolyVinylDiFluoride), nylon.
Una volta che le proteine sono state trasferite su una membrana, possibile
identificare una singola proteina mediante un anticorpo specifico. La formazione
del complesso antigene (proteina)/anticorpo viene evidenziata trattando
successivamente la membrana con un secondo anticorpo anti immunoglobulina
marcato con un enzima (fosfatasi alcalina o perossidasi). Aggiungendo il
substrato dellenzima si forma un prodotto colorato che consente di rilevare la
banda proteica. Questa tecnica quindi permette di verificare la presenza o meno
di una specifica proteina allinterno di una miscela separata precedentemente
mediante elettroforesi.

Principali proteine del siero umano identificabili mediante elettroforesi


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Prima banda: prealbumina o transtiretina


Non sempre ben visibile. Il dosaggio della transtiretina (TTR) fornisce
infirmazioni aggiornate sullattivit protidosintetica del fegato.
Seconda banda: albumina
Molto marcata. Lalbumina mantiene la pressione oncotica, trasporta e stocca
sostanze idrofobiche, ormoni, farmaci, elettroliti.
Terza banda: -antitripsina
Glicoproteina che svolge una potente attivit antiproteasica contro elastasi,
tripsina, chimotripsina e plasmina.
Quarta banda: -macroglobulina
Proteina in grado di legare e inibire molte proteasi del siero, come la plasmina,
la trombina e la tripsina.
Quinta banda: aptoglobina
Proteina complessa che aumenta di concentrazione negli stati infiammatori.
Lega lemoglobina plasmatica (A, F, S e C).
Sesta banda: transferrina
Principale proteina di trasporto del ferro. in grado di legare reversibilmente
ferro, rame, zinco, cobalto e calcio.
Settima banda: proteine del complemento
Complesso sistema con diverse attivit biologiche che vanno dalla mediazione
di una reazione infiammatoria acuta alla distruzione di batteri, virus e cellule
estranee.

TECNICHE SPETTROSCOPICHE

Dicroismo circolare
Tipo di spettroscopia. Lo spettro CD di una proteina, registrato nellUV, pu dare
informazioni circa la quantit relativa dei tipi principali di struttura secondaria (, e
random coil).
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Sfrutta la capacit degli isomeri ottici di ruotare il piano della luce polarizzata.
La luce pu essere polarizzata in modo da selezionare le onde
elettromagnetiche che oscillano su uno stesso piano mediante il passaggio della
luce attraverso uno schermo polarizzante o un prisma di Nicol.
Questa tecnica permette di misurare la variazione dellangolo di polarizzazione
dopo che la luce ha attraversato una sostanza chirale. Nel dicroismo circolare
viene utilizzata una luce polarizzata circolarmente, che viene ottenuta
sovrapponendo due onde di luce polarizzata che si muovono su piani ortogonali
e che sono tra loro sfalsate di un quarto nella fase della lunghezza donda.
Anche la luce polarizzata circolarmente pu essere destrogira (R) o levogira (L)
e linterazione con un centro chirale comporta una maggiore interazione con la
componente R o L.
Lellitticit il parametro che viene misurato nella spettroscopia CD.
Nello spettropolarimetro presente una sorgente luminosa che invia luce ad un
monocromatore. La luce monocromatica raggiunge il polarizzatore lineare e ne
fuoriesce come radiazione polarizzata linearmente. Due radiazioni di questo tipo
colpiscono un modulatore ottico-elettrico, dando origine ad una lice polarizzata
circolarmente che colpisce il campione. dal campione la luce esce come
polarizzata ellitticamente e si dirige verso il rivelatore. Dopo il rivelatore sono
presenti un amplificatore/elaboratore di segnali e un registrazione.
Gli spettri CD possono essere utilizzati per studiare variazioni della struttura
causate da modificazioni del pH, forza ionica o anche dallinterazione con DNA
binding proteins.

RICONOSCIMENTO, MARCATURA, SEPARAZIONE ACIDI NUCLEICI

Blotting
Trasferimento e rivelazione del DNA (Southern Blotting) o dellRNA (Northern Blotting).
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Anche gli acidi nucleici possono essere trasferiti e immobilizzati su un supporto


solido costituito da solitamente da nitrocellulosa e nylon.
Il Southern Blotting prevede il pre-trattamento del gel contenente le bande di
DNA con una soluzione diluita di HCl e successivamente con una soluzione
alcalina, in modo da ottenere la denaturazione e la depurazione del DNA. In
questo modo si aumenta lefficacia del trasferimento e si ottiene un DNA a
singolo filamento, predisposto allibridazione con una sonda.
Il gel viene poi posto su un foglio di carta da filtro, le cui estremit pescano in
un recipiente che contiene il tampone di trasferimento. Sul gel si deposita la
membrana e si esercita una certa pressione per far avvenire il trasferimento. Il
tampone per capillarit passa attraverso i diversi strati trasportando il DNA dal

gel alla membrana. Il DNA carico negativamente si lega alla membrana carica
positivamente. Dopo che il DNA stato trasferito sulla membrana, deve essere
legato in modo permanente ad essa.
La membrana viene riscaldata ad 80 C per due ore oppure viene sottoposta a
radiazioni ultraviolette, in questo modo si formano dei legami covalenti tra i
residui di timina presenti nel DNA e i gruppi amminici presenti sulla membrana.
Si aggiunge una soluzione contenente una sonda (frammento di DNA o RNA di
20 o pi nucleotidi) a singolo filamento, che presenta una sequenza
complementare ad un tratto di sequenza presente nel DNA che si vuole
identificare e che si trova sulla membrana. Si utilizzano sonde marcate con un
isotopo radioattivo o con una molecola fluorescente o capace di formare un
complesso colorato, in modo tale da permettere la rivelazione. Leccesso di
sonda viene eliminato tramite lavaggi.
Prima di operare libridazione, il filtro viene preincubato con una soluzione di
albumina o di polivinilpirrolidone, in modo da evitare reazioni aspecifiche della
sonda. importante scegliere condizioni sperimentali che favoriscano
lappaiamento corretto della sonda con il DNA.
Condizioni stringenti: temperatura elevata e bassa forza ionica tali da favorire
appaiamenti molto specifici.
Condizioni di bassa stringenza: temperatura e forza ionica tali da favorire
appaiamenti meno specifici; in questo caso vengono identificati frammenti di
DNA correlati alla sonda e non esattamente complementari.

Sintesi DNA complementare (cDNA)


cDNA: sonda utilizzata negli esperimenti di ibridazione. Si tratta di una molecola di
DNA a doppia elica sintetizzata sullo stampo di un RNA messaggero.
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Per essere utilizzato come sonda, il cDNA deve essere denaturato e sottoforma
di DNA a singolo filamento. Le metodiche per la sintesi di cDNA sono diverse,
ma prevedono tutte lutilizzo di una trascrittasi inversa.
Consideriamo la sintesi di un cDNA a partire da un mRNA poliadenilato. LmRNA
viene incubato con un oligonucleotide formato solamente da timidine (oligo-dT),
il quale si appaia con la sequenza poli(A) presente allestremit 3 dellmRNA.
Loligo-dT funge da innesco per la sintesi di un filamento di DNA ad opera della
trascrittasi inversa. Questo enzima, in presenza dei quattro deossiribonucleotidi
(dNTP) estende in direzione 53 il primer utilizzando lmRNA come stampo per
la sintesi di un filamento di DNA complementare.
Si ottiene un ibrido mRNA-cDNA da cui lmRNA pu essere rimosso per
trattamento con alcali o con la ribonucleasi H (RNasi H). Rimuovendo lRNA
rimane il DNA neosintetizzato a singolo filamento che, a causa dellidrofobicit
delle basi, tende a ripiegarsi allestremit 3 formando una sorta di ansa.
Questansa funge da innesco per lazione della DNA polimerasi I. Si ottiene una
molecola di DNA in cui i due filamenti sono continui a causa dellansa in 3,
questultima per pu essere rimossa mediante lazione della nucleasi S1. Cos
facendo, tuttavia, vengono eliminati anche alcuni nucleotidi corrispondenti
allastremit 5 del DNA contenuti nellansa. Questo problema stato superato
introducendo alcune modifiche nel protocollo originale, in modo da produrre
molecole di cDNA avente estremit piatte.

PCR (Polymerase Chain Reaction)


Amplificare in vitro sequenze specifiche di DNA, che siano delimitate ale estremit 5 e
3 da regioni di DNA a sequenza nota.
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Si deve disporre di due oligonucleotidi costituiti da almeno 10-15 nucleotidi che


siano complementari alle sequenze delimitanti il tratto di DNA da amplificare.
Si aumenta la temperatura fino a 95 C in modo da denaturare la molecola di
DNA e separare i due filamenti; successivamente si abbassa la temperatura in
modo che gli oligonucleotidi possano associarsi alla sequenza di DNA
complementare. A questa temperatura i due filamenti di DNA rimangono
separati, perch sono in concentrazione troppo bassa per riassociarsi, mentre
gli oligonucleotidi sono in concentrazione molto alta e si associano con le
sequenze complementari del DNA da amplificare. Si utilizzano in genere
temperature comprese tra i 40 e i 60 gradi C.
La temperatura viene infine innalzata fino a 72C, cio la temperatura ottimale
per la fase di estensione, nella quale la DNA polimerasi catalizza lallungamento
del primer in direzione 53 (in presenza di deossinucleotidi e tamponi
opportuni).
Il completamento della reazione porta alla sintesi di un nuovo filamento di DNA
complementare al DNA stampo. La sintesi di nuovi filamenti di DNA prosegue
grazie alla continua ripetizione di tre fasi della reazione catalizzata dalla
polimerasi: 1) dissociazione del doppio filamento; 2) associazione del DNA a
singolo filamento con oligonucleotidi che fungono da primer; 3) allungamento
del filamento a partire dai primer grazie allazione della DNA polimerasi. Queste
tre fasi vengono ripetute circa 30-40 volte. Ogni filamento neosinteizzato
diventa esso stesso lo stampo per la sintesi di un nuovo filamento.
Durante il primo ciclo della PCR si ha la sintesi di filamenti di DNA definiti
filamenti lunghi perch proseguono oltre lestremit 3 della regione di DNA
che si vuole amplificare. Nei cicli successivi viene amplificato il tratto di DNA
desiderato, oltre a due filamenti lunghi. Lamplificazione non illimitata, la
denaturazione progressiva della DNA polimerasi, la carenza di primer e di dNTP
(generico deossinucleotide trifosfato), laccumulo di pirofosfato e la
riassociazione del doppio filamento sono fattori limitanti.
Al termine della PCR il prodotto di amplificazione pu essere visualizzato in
elettroforesi su gel di agarosio, che permette di verificane la presenza e le
dimensioni.

RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

Variante della PCR utilizzata per lo studio dellespressione genica. Amplificazione di


molecole di DNA complementari a sequenze di mRNA, a partire dallintera popolazione
di RNA ottenuta per estrazione da un determinato tipo di cellule.
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LRNA una molecola estremamente labile e non pu essere amplificata cos


come tale.
Questa tecnica sfrutta lazione della trascrittasi inversa per la sintesi del cDNA a
partire da una molecola di mRNA. Lenzima utilizzato deriva solitamente da un
retrovirus eucariotico. La maggior parte degli mRNA eucariotici possiede una
coda poli(A) allestremit 3, quindi come primer per lazione della trascrittasi
inversa si utilizza un oligonucleotide formato da circa 20 residui di timina (oligodT) complementare alla coda poli(A) dellmRNA. La miscela di incubazione
contiene lRNA totale estratto dalle cellule, la trascrittasi inversa, loligo-dT,
desossiribonucleotidi (dNTP), ioni magnesio e un tampone opportuno. A partire
dalloligo-dT appaiato allestremit 3 dellmRNA la trascrittasi inversa sintetizza
un filamento di cDNA. Si prosegue aggiungendo RNasi H per eliminare il
frammento di RNA e DNA polimerasi per sintetizzare il filamento
complementare. Si prosegue poi come una normale PCR, utilizzando primer
specifici per uno o pi geni.

Real Time PCR


Permette di amplificare e contemporaneamente quantificare in tempo reale il DNA ad
ogni ciclo di amplificazione.
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La quantificazione viene effettuata utilizzando dei probe fluorescenti e delle


apparecchiature capaci di eccitare i fluorocromi presenti nella miscela di
reazione e misurare la fluorescenza emessa, oltre che effettuare i cicli di
riscaldamento e raffreddamento necessari per la PCR.
I metodi utilizzati per la quantificazione sono due: 1) utilizzo di coloranti
fluorescenti capaci di intercalarsi in una molecola di DNA a doppio filamento; 2)
utilizzo di un probe di DNA modificato capace di emettere fluorescenza quando
si appaia con una sequenza di DNA complementare.
1) Nel primo metodo si pu utilizzare ad esempio una molecola fluorescente
non specifica capace di legarsi al solco minore del DNA. Questa molecola
viene aggiunta alla miscela iniziale. Quando avviene la fase di appaiamento
dei primer alle sequenze complementari si forma un tratto di DNA a doppio
filamento a cui si lega il fluorocromo. Le molecole di fluorocromo legato
aumentano durante la fase di polimerizzazione e amplificazione. La
fluorescenza emessa dunque proporzionale alla quantit di amplicone che
si forma. Questa metodica non specifica.
2) Nel secondo metodo si usa una sonda che ha legato covalentemente
allestremit 5 un fluorocromo ad alta energia (reporter) che emette
fluorescenza e allestremit 3 un fluorocromo a bassa energia (quencer) che
spegne la fluorescenza del reporter. Quando la polimerasi, durante il ciclo di
amplificazione, sintetizza il filamento complementare al filamento di DNA
ibridato con la sonda, determina il distacco della sonda mediante la sua
attivit esonucleasica 53. La sonda viene frammentata, la molecola
reporter viene staccata da quella quencer e passa in soluzione emettendo
fluorescenza. La fluorescenza direttamente proporzionale alla
concentrazione di amplicone presente e viene misurata da un computer

tramite appositi software. Essi elaborano un grafico (x: numero di cicli di


PCR; y: fluorescenza rilevata) ad andamento sigmoide. Dal grafico si ricava il
parametro CT che indica momento della reazione in corrispondenza del
quale stato accumulato un numero sufficiente di amplicone per permettere
la rivelazione della fluorescenza. Dopo questo valore la fluorescenza
aumenta linearmente fino al raggiungimento di un plateau, quando i
substrati per la PCR iniziano a scarseggiare.