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Zn2+ Inibisce l'attività della RNA polimerasi del coronavirus e

dell'arterivirus In vitro e zinco ionofori bloccano la
replicazione di questi virus nella coltura cellulare
Aartjan JW te Velthuis1, Sjoerd HE van den Worm1, Amy C. Sims2, Ralph S. Baric2, Eric J. Snijder1*,
Martijn J. van Hemert1*
1Laboratorio di virologia molecolare, Dipartimento di microbiologia medica, Centro di malattie infettive, Centro medico dell'Università di Leiden, Leiden, Paesi Bassi,
2Dipartimenti di Epidemiologia e Microbiologia e Immunologia, Università della Carolina del Nord a Chapel Hill, Chapel Hill, Carolina del Nord, Stati Uniti d'America

Astratto
Aumentare lo Zn . intracellulare2+ concentrazione con zinco-ionofori come il piritione (PT) può compromettere efficacemente la
replicazione di una varietà di virus a RNA, inclusi poliovirus e virus dell'influenza. Per alcuni virus questo effetto è stato attribuito
all'interferenza con l'elaborazione delle poliproteine virali. In questo studio dimostriamo che la combinazione di Zn2+ e PT a basse
concentrazioni (2 mM Zn2+ e 2 mMPT) inibisce la replicazione del SARS-coronavirus (SARS-CoV) e del virus dell'arterite equina (EAV)
nelle colture cellulari. La sintesi dell'RNA di questi due nidovirus lontanamente imparentati è catalizzata da una RNA polimerasi RNA-
dipendente (RdRp), che è l'enzima centrale del loro complesso di replicazione e trascrizione multiproteica (RTC). Utilizzando un test
di attività per RTC isolati da cellule infettate da SARS-CoV o EAV, eliminando così la necessità di PT per trasportare Zn2+
attraverso la membrana plasmatica, mostriamo che Zn2+ inibisce efficacemente l'attività di sintesi dell'RNA degli RTC di entrambi i
virus. Studi enzimatici che utilizzano RdRps ricombinanti (SARS-CoV nsp12 e EAV nsp9) purificati daE. coli successivamente ha
rivelato che Zn2+ inibito direttamente il in vitro attività di entrambe le polimerasi nidovirus. Più specificamente, Zn2+ è stato scoperto
che blocca la fase di inizio della sintesi dell'RNA dell'EAV, mentre nel caso della SARS-CoV l'allungamento di RdRp è stato inibito e il
legame del modello ridotto. Chelando Zn2+ con MgEDTA, l'effetto inibitorio del catione bivalente potrebbe essere invertito, il che
fornisce un nuovo strumento sperimentale per in vitro studi dei dettagli molecolari della replicazione e della trascrizione dei
nidovirus.

Citazione: te Velthuis AJW, van den Worm SHE, Sims AC, Baric RS, Snijder EJ, et al. (2010) Zn2+ Inibisce l'attività della RNA polimerasi del coronavirus e dell'arterivirus In vitro
e ionofori di zinco bloccano la replicazione di questi virus nella coltura cellulare. PLoS Pathog 6(11): e1001176. doi:10.1371/journal.ppat.1001176

Editore: Raul Andino, Università della California San Francisco, Stati Uniti d'America

Ricevuto 17 maggio 2010; Accettato 1 ottobre 2010; Pubblicato 4 novembre 2010

Diritto d'autore: 2010 te Velthuis et al. Questo è un articolo ad accesso aperto distribuito secondo i termini della Creative Commons Attribution License, che consente
uso, distribuzione e riproduzione illimitati con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore e la fonte originali siano citati.

Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) con sovvenzioni del Consiglio per le scienze chimiche (sovvenzione NWO-CW 700.55.002 e
700.57.301) e una sovvenzione NWO Toptalent (021.001.037). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare
o nella preparazione del manoscritto.

Interessi conflittuali: Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

* E-mail: ejsnijder@lumc.nl (ES); mjvan_hemert@lumc.nl (MJvH)

introduzione In vitro studi con rinovirus purificato e proteasi di poliovirus 3C

Gli ioni zinco sono coinvolti in molti processi cellulari diversi e si sono
dimostrati cruciali per il corretto ripiegamento e l'attività di vari enzimi
cellulari e fattori di trascrizione. Zn2+ è probabilmente un importante
cofattore anche per numerose proteine virali. Tuttavia, la
concentrazione intracellulare di Zn . libero2+ è mantenuto ad un livello
relativamente basso dalle metallotioneine, probabilmente a causa del
fatto che Zn2+ può fungere da secondo messaggero intracellulare e può
innescare l'apoptosi o una diminuzione della sintesi proteica a
concentrazioni elevate [1,2,3]. È interessante notare che negli studi sulle
colture cellulari, Zn . alto2+ concentrazioni e l'aggiunta di composti che
stimolano l'importazione cellulare di Zn2+, come hinokitol (HK), pirrolidina
ditiocarbammato (PDTC) e piritione (PT), sono stati trovati per inibire la
replicazione di vari virus a RNA, incluso il virus dell'influenza [4], il virus
respiratorio sinciziale [5] e diversi picornavirus [6,7, 8,9,10,11]. Sebbene
questi studi precedenti fornissero informazioni meccanicistiche limitate,
ciò suggerisce che lo Zn . intracellulare2+ i livelli influenzano un
passaggio comune nel ciclo replicativo di questi virus.
Nella coltura cellulare, il PT stimola lo Zn2+ assorbimento in pochi minuti e
inibisce la replicazione del virus a RNA attraverso un meccanismo che è stato
studiato in modo ragionevole solo per i picornavirus [11,12].
hanno rivelato che l'attività della proteasi è stata inibita da Zn2+ [
13,14], che è in linea con l'inibizione dell'elaborazione delle
poliproteine da parte degli ioni zinco che è stata osservata nelle
cellule infettate con rinovirus umano e coxsackievirus B3 [11]. La
replicazione dei virus segmentati a RNA a filamento negativo come
il virus dell'influenza, tuttavia, non dipende dall'elaborazione delle
poliproteine e dall'effetto dello Zn mediato da PDTC2+ è stato
quindi ipotizzato che l'importazione derivi dall'inibizione della RNA
polimerasi RNA-dipendente virale (RdRp) e dei cofattori cellulari [4].
Inoltre, un effetto inibitorio di Zn2+ sull'attività di RdRps purificati da
rinovirus e virus dell'epatite C è stata osservata, ma non studiata in
dettaglio [15,16].
I dettagli sull'effetto degli ioni zinco sono attualmente in gran parte
sconosciuti per i nidovirus. Questo ampio gruppo di virus a RNA (+RNA) a
filamento positivo comprende i principali agenti patogeni dell'uomo e del
bestiame, come il coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-
CoV), altri coronavirus umani, gli arterivirus, il virus dell'arterite equina (EAV) e
il virus riproduttivo dei suini. e virus della sindrome respiratoria (PRRSV)
[17,18]. L'ascendenza comune dei nidovirus si riflette nella loro simile
organizzazione del genoma e nella strategia di espressione e nella
conservazione di una serie di funzioni enzimatiche chiave nella loro

PLoS patogeni | www.plospathogens.org 1 Novembre 2010 | Volume 6 | Numero 11 | e1001176


Riepilogo dell'autore
I virus a RNA (+RNA) a filamento positivo includono molti
importanti agenti patogeni. Hanno evoluto una varietà di strategie
di replicazione, ma sono unificate nel fatto che una RNA polimerasi
RNA-dipendente (RdRp) funziona come enzima centrale del loro
macchinario di sintesi dell'RNA. Il RdRp è comunemente
incorporato in un complesso di replicazione associato alla
membrana che è assemblato dall'RNA virale e dalle proteine virali
e dell'ospite. Data la loro funzione cruciale nel ciclo replicativo
virale, gli RdRps sono bersagli chiave per la ricerca antivirale.
Aumento di Zn . intracellulare2+ è noto che le concentrazioni
compromettono efficacemente la replicazione di un certo numero
di virus a RNA, ad esempio interferendo con la corretta
elaborazione proteolitica delle poliproteine virali. Qui, non solo
mostriamo che la replicazione di corona e arterivirus può essere
inibita da un aumento dello Zn2+ livelli, ma utilizzano anche
complessi di replicazione isolati e RdRps ricombinanti purificati per
dimostrare che questo effetto può essere basato sull'inibizione
diretta di RdRps nidovirus. La combinazione di protocolli qui
descritti sarà preziosa per studi futuri sulla funzione dei complessi
enzimatici nidovirali.
grandi poliproteine a replicazione [19]. Un segno distintivo del ciclo
replicativo di corona e arterivirus è la trascrizione di un 59- e 39-
coterminale nested set di mRNA subgenomici (sg) da cui sono
espressi i geni delle proteine strutturali e accessorie virali [20,21].
Analogamente ai picornavirus [13,22], è stato dimostrato che gli ioni
zinco inibiscono alcune scissioni proteolitiche nell'elaborazione delle
poliproteine di replicazione del coronavirus nelle cellule infette e nei
sistemi privi di cellule [23,24]. In questo studio riportiamo che lo zinco-
ionoforo piritione (PT) in combinazione con Zn2+ è un potente inibitore
della replicazione del SARS-coronavirus (SARS-CoV) e del virus
dell'arterite equina (EAV) nelle colture cellulari. Valutare se - oltre a un
possibile effetto sul processamento proteolitico - le subunità RTC
nidovirus e la sintesi dell'RNA siano direttamente influenzate da Zn2+,
abbiamo impiegato in vitro sistemi per la sintesi di SARS-CoV e EAV RNA
che si basano su RTC associati alla membrana isolati da cellule infette
(da qui in avanti denominati saggi RTC) [25,26]. Inoltre, abbiamo usatoin
vitro saggi RdRp ricombinanti per studiare direttamente l'effetto degli
ioni zinco sulla RdRps di SARS-CoV e EAV [27,28].
Usando questi indipendenti in vitro approcci, siamo stati in grado di
dimostrare che Zn2+ altera direttamente la sintesi dell'RNA del nidovirus,
poiché ha avuto un forte effetto inibitorio sia nei saggi RTC che RdRp. È
interessante notare che Zn2+-l'inibizione mediata potrebbe essere
invertita con l'aggiunta di un Zn2+ chelante (MgEDTA). Abbiamo quindi
applicato questo composto per fermare e riavviare ilin vitro
Attività di sintesi dell'RNA a piacimento. Questo comodo strumento ci ha
permesso di studiare più in dettaglio vari aspetti meccanicistici della sintesi
dell'RNA dell'arteria e del coronavirus. Inoltre, l'inibizione mediata dallo zinco
della sintesi dell'RNA del nidovirus qui descritta può fornire una base
interessante per esplorare ulteriormente l'uso degli ionofori di zinco nella
terapia antivirale.
Risultati
Zinco e piritione inibiscono la replicazione del nidovirus in vivo
Gli ioni zinco sono coinvolti in molti processi cellulari diversi, ma la
concentrazione di Zn . libero2+ è mantenuto ad un livello relativamente
basso dalle metallotioneine [1]. Zn2+ e composti che stimolano
l'importazione di Zn2+ nelle cellule, come il PT, è stato precedentemente
scoperto che inibiscono la replicazione di diversi picornavirus, inclusi
rinovirus, virus dell'afta epizootica, coxsackievirus e mengovirus nelle
colture cellulari [6,7,8,9,10,11]. Per determinare se Zn2+ ha un
PLoS patogeni | www.plospathogens.org
Zn2+ Inibisce la replicazione del Nidovirus
effetto simile sui nidovirus, abbiamo studiato l'effetto di PT e Zn2+ sulla
replicazione di EAV e SARS-CoV nelle cellule Vero-E6, utilizzando virus
reporter che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP), ovvero EAV-
GFP [29] e SARS-CoV-GFP [30]. EAV-GFP codifica per una fusione N-
terminale di GFP alla proteina virale non strutturale 2 (nsp2), uno dei
prodotti di scissione delle poliproteine della replicasi, e fornisce quindi
una lettura diretta per la traduzione del gene della replicasi. Nella SARS-
CoV-GFP, l'espressione del reporter avviene dall'sg mRNA 7, in seguito
alla sostituzione di due geni codificanti proteine accessorie (ORF 7a e
7b) che sono superflui per la replicazione nella coltura cellulare.
Per prima cosa abbiamo valutato la citotossicità di un intervallo di concentrazioni di PT
(0–32 mM) in presenza di 0 a 8 mMZnOAc2. Trattamento con PT
di concentrazioni fino a 32 mM in combinazione con,4 mMZnOAc2
non ha ridotto la vitalità delle cellule infettate dopo 18 ore (Fig. 1A),
come misurato mediante il saggio di vitalità MTS colorimetrico (3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-5(3-carbossimetossifenil)-2-(4-solfofenil)-2H-tetrazolio).
Come Zn . elevato2+ è noto che le concentrazioni inibiscono la traduzione
cellulare, abbiamo anche usato l'etichettatura metabolica con 35S-metionina
per valutare l'effetto di PT e Zn2+ sulla sintesi proteica cellulare. Incubazione di
cellule Vero-E6 per 18 h con le combinazioni di PT e Zn2+ menzionato sopra,
seguito da un'etichettatura metabolica di 2 ore, non ha rivelato alcun
cambiamento nella sintesi proteica cellulare complessiva quando il
concentrazione di ZnOAc2 era ,4 mM (dati non mostrati).
Utilizzando queste condizioni non citotossiche abbiamo successivamente testato il
effetto di PT e ZnOAc2 sulla replicazione di EAV-GFP e SARS-CoV-GFP.
A tal fine, le cellule Vero-E6 in piastre da 96 pozzetti sono state
infettato con una molteplicità di infezione (moi) di 4. Un'ora dopo
l'infezione (h pi), tra 0 e 32 mM di PT e 0, 1 o 2 mm
ZnOAc2 sono stati aggiunti al terreno di coltura. A 17 h pi, un punto temporale
in cui raggiunge l'espressione di GFP nelle cellule infette non trattate
il suo massimo per entrambi i virus, le cellule sono state fissate e la
fluorescenza GFP è stata quantificata.
L'espressione del gene reporter sia di SARS-CoV-GFP che di EAV-
GFP era già significativamente inibita in modo dose-dipendente
dall'aggiunta del solo PT (Fig. 1B e C). Questo effetto è stato
notevolmente migliorato quando 2mM di Zn2+ è stato aggiunto al
medio. Abbiamo trovato che l'aggiunta di ZnOAc2 da solo riduceva
anche la replicazione del virus, ma solo a livelli vicini al 50%
concentrazione di citotossicità (CC50) di ZnOAc2 in celle Vero-E6 (,70 mM,
dati non riportati). Ciò è probabilmente dovuto alla scarsa solubilità
di Zn2+ in mezzo contenente fosfato e l'assorbimento inefficiente di
Zn2+ dalle cellule in assenza di zinco-ionofori. Il
combinazione di 2 mMPT e 2 mM ZnOAc2 ha portato a 9861% e 856
Riduzione del 3% del segnale GFP per EAV-GFP e
SARS-CoV-GFP, rispettivamente. Non è stata osservata citotossicità per
questa combinazione di PT e ZnOAc2 concentrazioni. Dal
curve dose-risposta in Fig. 1, a CC50 valore di 82 mM è stato
calcolato per PT in presenza di 2 mzinco M. mezzo massimo
concentrazioni inibitorie (IC50) di 1.4 mM e 0,5 mM e gli indici di
selettività di 59 e 164 sono stati calcolati per SARS-CoV
e EAV, rispettivamente.
Zn2+ inibisce reversibilmente l'attività di sintesi dell'RNA
degli RTC nidovirus isolati
In precedenza abbiamo sviluppato saggi per studiare il in vitro
Attività di sintesi dell'RNA di RTC isolati da cellule infettate da SARS-
CoV o EAV [25,26]. In questi saggi RTC [un-32P]CMP è incorporato sia
nell'mRNA genomico (replicazione) che nell'sg (trascrizione) (Fig. 2).
Questo ci ha permesso di monitorare la sintesi delle stesse
molecole di RNA virale che possono essere rilevate dall'ibridazione
dell'RNA da cellule infettate da nidovirus. Un vantaggio di questi
saggi è che l'attività non dipende dalla sintesi proteica continua e
che ci permette di studiare la sintesi dell'RNA virale
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Figura 1. Il piritione ionoforo di zinco inibisce la replicazione del nidovirus
nella coltura cellulare. (UN)Citotossicità del PT nelle cellule Vero-E6 in assenza
(cerchi blu) o presenza di 2 (quadrati neri), 4 (rosso
triangoli), o 8 mM (diamanti grigi) ZnOAc2 come determinato dal test MTS
dopo 18 ore di esposizione. (B) Curve dose-risposta che mostrano la
effetto di PT e Zn2+ sulla fluorescenza GFP in cellule Vero-E6 infettate con un
ceppo reporter EAV che esprime GFP a 17 h pi I dati sono stati normalizzati
all'espressione GFP in colture di controllo infette e non trattate (100%). I
diversi Zn2+ le concentrazioni aggiunte al terreno erano 0
(cerchi blu), 1 (triangoli verdi) o 2 mM ZnOAc2 (quadrati neri). (C) Effetto di PT e
Zn2+ sulla fluorescenza GFP nelle cellule Vero-E6
infettato con un ceppo reporter SARS-CoV che esprime GFP a 17 h pi I dati
sono stati normalizzati all'espressione di GFP in cellule di controllo infette non
trattate (100%). Colori per diversi Zn2+ concentrazioni come in Fig. 1B. Le barre
di errore indicano la deviazione standard (n= 4).
doi:10.1371/journal.ppat.1001176.g001
indipendente da altri aspetti del ciclo replicativo virale [26]. Per
indagare se l'effetto inibitorio di PT e ioni zinco sulla replicazione
nidovirus nella coltura cellulare si riflette in un effetto diretto di
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Zn2+ Inibisce la replicazione del Nidovirus
Figura 2. Inibizione del in vitro Attività di sintesi dell'RNA di RTC isolati da Zn2+.
Incorporazione di [un-32P]CMP in RNA virale da EAV (UN) e SARS-CoV (B) nei
saggi RTC in presenza di vari Zn2+
concentrazioni, come indicato sopra ciascuna corsia.
doi:10.1371/journal.ppat.1001176.g002
Zn2+ sulla sintesi dell'RNA virale, abbiamo testato l'effetto di Zn2+
aggiunta sull'attività di RTC. Sia per EAV (Fig. 2A) che per SARS-CoV
(Fig. 2B), una diminuzione dose-dipendente della quantità di RNA
sintetizzato è stato osservato quando ZnOAc2 era presente. Per entrambi i
virus, una riduzione di oltre il 50% della sintesi complessiva dell'RNA è stata
osservato a Zn2+ concentrazione di 50 mM, mentre meno del 5% di
attività è rimasto a Zn2+ concentrazione di 500 mM. Sia la sintesi del
genoma che la produzione di mRNA di sg sono state ugualmente colpite.
Per verificare se l'inibizione dell'attività RTC da parte di Zn2+ era
reversibile, le reazioni RTC sono state avviate in presenza o assenza di
500 mM Zn2+. Dopo 30 minuti, queste reazioni sono state suddivise in
due aliquote e in uno dei tubi è stato aggiunto EDTA saturo di magnesio
(MgEDTA) a una concentrazione finale di 1 mM (Fig. 3A). Abbiamo usato
MgEDTA come Zn2+ chelante in questi in vitro saggi, perché chela
specificamente Zn2+ durante il rilascio di Mg2+, a causa della maggiore
costante di stabilità del complesso ZnEDTA. L'EDTA non complessato ha
inibito l'attività dell'RTC in tutte le reazioni (dati non mostrati), molto
probabilmente chelando il Mg2+ che è cruciale per l'attività di RdRp
[27,28], mentre MgEDTA non ha avuto effetti sulle reazioni di controllo
senza Zn2+ (Fig. 3B, confronta la corsia 1 e 2). Come mostrato in Fig. 2,
l'attività EAV RTC che è stata inibita da Zn2+ (La Fig. 3B&C, corsia 3)
potrebbe essere ripristinata mediante l'aggiunta di MgEDTA (Fig. 3B,
corsia 4) a un livello osservato per le reazioni di controllo senza Zn2+
(Fig. 3B, corsia 1). Rispetto al controllo non trattato, il test EAV RTC ha
prodotto circa il 30% in meno di RNA, il che era coerente con il tempo di
reazione più breve del 30% dopo l'aggiunta del MgEDTA (100 contro 70
min per le corsie 1 e 4, rispettivamente). Sorprendentemente, i test RTC
SARS-CoV che sono stati integrati consecutivamente con Zn2+ e MgEDTA
ne incorporavano leggermente di più [un-32P]CMP rispetto alle reazioni
di controllo non trattate (Fig. 3C; confrontare le corsie 1 e 4). Questo
effetto non era dovuto alla chelazione dello Zn2+ già presente nel
surnatante post-nucleare (PNS) delle cellule infettate da SARS-CoV,
poiché questo aumento non è stato osservato quando MgEDTA è stato
aggiunto a una reazione di controllo senza ulteriore Zn2+ (Fig. 3C, corsia
2).
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Figura 3. Inibizione dell'attività di nidovirus RTC da parte di Zn2+ può essere
invertito mediante chelazione. (UN)Rappresentazione schematica del in vitro
saggi con RTC isolati, iniziati con [un-32P]CTP, in assenza (campione 1 e 2) o in
presenza di 500 mM Zn2+. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 30tuC, sia il non
trattato che Zn2+-i campioni trattati sono stati suddivisi in due aliquote e 1 mM
di Zn2+ il chelante MgEDTA è stato aggiunto ai campioni 2 e 4. Tutte le reazioni
sono state successivamente incubate per altri 70 minuti prima della
conclusione. (B) Analisi dei prodotti di RNA sintetizzati in saggi con EAV RTC. I
numeri sopra le corsie si riferiscono ai numeri campione descritti in (A). (C) In
vitro
saggio di attività con RTC SARS-CoV.
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Gli ioni zinco influenzano l'attività in vitro del nidovirus
ricombinante RdRps
Per stabilire se l'inibizione dell'attività RTC potrebbe essere dovuta a
un effetto diretto di Zn2+ sull'attività di nidovirus RdRp, abbiamo testato
l'effetto di Zn2+ sull'attività degli RdRps ricombinanti purificati di SARS-
CoV (nsp12) e EAV (nsp9) utilizzando saggi RdRp precedentemente
sviluppati [27,28]. Utilizzando un modello polyU 18-mer, l'EAV RdRp ha
incorporato [un-32P]AMP in prodotti di RNA fino a 18 nt di lunghezza (Fig.
4A). L'iniziazione eradi nuovo, che è in linea con le osservazioni
precedenti e la presenza di un ciclo di priming conservato nella
sequenza nsp9 [28]. A differenza dell'EAV RdRp nsp9, ilin vitro l'attività
del SARS-CoV RdRp nsp12 - che manca di un ciclo di priming - ha
dimostrato di essere strettamente dipendente dal primer [27]. Pertanto,
per studiare l'attività RdRp di SARS-CoV nsp12, è stato utilizzato un
modello di polyU innescato (Fig. 4B), consentendo così di campionare [
un-32Incorporazione di P]AMP come descritto in precedenza [27]. Come
controlli di specificità, abbiamo utilizzato il mutante SARS-CoV nsp12
D618A [27] precedentemente descritto, che contiene una sostituzione da
aspartato ad alanina nel motivo A del sito attivo RdRp, e EAV nsp9D445A,
in cui abbiamo progettato una sostituzione da aspartato ad alanina al
sito corrispondente di EAV nsp9 [28,31]. Entrambi gli RdRps mutanti si
sono mostrati notevolmente ridotti [un-32Incorporazione di P]AMP nei
nostri saggi (Fig. 4), confermando ancora una volta che i prodotti di RNA
radiomarcato derivano dall'attività di nidovirus RdRp.
Aggiunta di ZnOAc2 ai saggi RdRp ha determinato una forte inibizione
dose-dipendente dell'attività enzimatica sia per l'EAV che per
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Zn2+ Inibisce la replicazione del Nidovirus
Figura 4. Saggi EAV e SARS-CoV RdRp con enzima wild-type e mutanti del sito
attivo. (UN)La polimerasi EAV non era in grado di estendere il primer e
richiedeva un 3 . libero9 residui finali e poli(U) per iniziare. Il nucleotide che
incorpora l'attività dell'enzima wild-type e del mutante D445A di nsp9 su uno
stampo di poli(U) 18-mer ha confermato la specificità del nostro test. (B) Saggi
SARS-CoV nsp12 RdRp
sono stati eseguiti con un duplex di RNA con un 59 tu10 sporgenza come
modello. Il grafico a barre mostra le attività che incorporano i nucleotidi
di wild-type e D618A nsp12. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della
media (n=3).
doi:10.1371/journal.ppat.1001176.g004
Enzima SARS-CoV (Fig. 5A e B, rispettivamente), simile a quanto
osservato nei test RTC. Infatti, rispetto ad altri ioni di metalli bivalenti
quali Co2+ e Ca2+, che tipicamente si legano a catene laterali di
amminoacidi contenenti atomi di ossigeno anziché gruppi di zolfo, Zn2+
era l'inibitore più efficiente dell'attività di SARS-CoV nsp12 RdRp (Figura
complementare S1). Per verificare se, come nel test RTC, l'inibizione di
RdRp da parte degli ioni zinco fosse reversibile, i test RdRp sono stati
preincubati con 6 mM Zn2+, una concentrazione che ha sempre dato
. 95% di inibizione. Dopo 30 min, è stato aggiunto 8 mM MgEDTA a
sia una reazione di controllo che la reazione inibita con ZnOAc2,
e i campioni sono stati incubati per altri 30 minuti (Fig. 5C). Come mostrato
in Fig. 5D, l'inibizione dell'attività di EAV RdRp da parte di Zn2+ potrebbe essere
invertito dalla chelazione di Zn2+ (figura 5D; confrontare le corsie 3 e 4). La
quantità di prodotto sintetizzato è stata costantemente di 6065% di quello
sintetizzato in una reazione di controllo di 60 minuti (Fig. 5D; confrontare le
corsie 1 e 4), che rientrava nell'intervallo previsto dato il più breve
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Figura 5. L'attività dei RdRps di EAV e SARS-CoV è inibita in modo reversibile da
Zn2+. Attività RdRp di EAV purificato nsp9 (UN)
e SARS-CoV nsp12 (B) in presenza di vari Zn2+ concentrazioni, come indicato
sopra le corsie. (C) Rappresentazione schematica dell'esperimento per
verificare se Zn2+-l'inibizione mediata dell'attività di RdRp potrebbe essere
invertita con MgEDTA. Reazioni RdRp, controlli non trattati (campione 1 e 2) o
reazioni contenenti 6 mM Zn2+ (i campioni 3 e 4) sono stati incubati per 30
min. Entrambi Zn2+-i campioni contenenti e di controllo sono stati suddivisi in
due aliquote e ai campioni 2 e 4 è stato aggiunto 6 mM MgEDTA. Tutte le
reazioni sono state incubate per altri 30 minuti e quindi terminate. I prodotti
di reazione dei saggi RdRp con EAV nsp9 e SARS-CoV nsp12 sono mostrati in (
D) e (E), rispettivamente. I numeri sopra le corsie si riferiscono ai numeri
campione descritti in (C). doi:10.1371/journal.ppat.1001176.g005
tempo di reazione. Anche l'inibizione del SARS-CoV RdRp era
reversibile. Durante i 30 minuti di incubazione dopo l'aggiunta di
MgEDTA, SARS-CoV nsp12 ha incorporato 4065% dell'etichetta
incorporata durante una reazione standard di 60 minuti (Fig. 5E).
Questo era leggermente inferiore alla resa prevista e potrebbe
essere causato dall'elevato Mg2+ concentrazione, che si è dimostrata
subottimale per l'attività di nsp12 [27] e risulta dal rilascio di Mg2+
da MgEDTA per chelazione di Zn2+.
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Zn2+ Inibisce la replicazione del Nidovirus
Effetto differenziale di Zn2+ sulla fase di inizio e di allungamento
della sintesi dell'RNA del nidovirus
Per l'EAV, un'attenta ispezione dei saggi RdRp ha rivelato un effetto
meno pronunciato di Zn2+ sulla generazione di prodotti a lunghezza
intera di 18 nt che sulla sintesi di intermedi di reazione più piccoli (Fig.
5A). Questo ha suggerito che Zn2+ ha inibito in modo specifico la fase di
inizio della sintesi dell'RNA dell'EAV. Per verificare questa ipotesi, un test
RTC è stato incubato per 30 minuti con CTP (iniziazione) non etichettato,
dopodiché la reazione è stata divisa in due. Quindi, [un-32P]CTP è stato
aggiunto a entrambi i tubi (impulso), 500 mM Zn2+ è stato aggiunto a
uno dei tubi e i campioni sono stati prelevati in diversi momenti durante
la reazione (Fig. 6A). La Fig. 6B mostra che in presenza di Zn2+ [un-32
P]CMP è stato prevalentemente incorporato in molecole di RNA
nascente che erano già oltre la fase di iniziazione nel momento in cui Zn
2+ è stato aggiunto alla reazione. Non si è verificata alcuna nuova
iniziazione, come indicato dallo striscio di brevi prodotti radiomarcati
che si sono spostati progressivamente verso la posizione di RNA
genomico a lunghezza intera. Questo ha suggerito che Zn2+
non influenza la fase di allungamento della sintesi di EAV RNA e che
inibisce specificamente l'inizio. Questo spiega anche l'intensità del
segnale relativamente debole delle bande di mRNA di sg più piccole (per
esempio, confrontare la variazione relativa del segnale di RNA2 a RNA7)
prodotta in presenza di Zn2+, poiché sono necessari più eventi di
iniziazione su queste brevi molecole per ottenere intensità di segnale
simili a quelle risultanti da un singolo evento di iniziazione sull'RNA
genomico lungo, per esempio, 16 volte di più nel caso dell'RNA7. A
differenza di EAV, l'effetto di Zn2+ sulla sintesi dell'RNA da parte degli RTC
SARSCoV non si limitava all'inizio, ma sembrava compromettere anche la
fase di allungamento, dato che l'aggiunta di Zn2+
completamente bloccato l'ulteriore incorporazione di [un-32P]CMP
quando aggiunto 40 min dopo l'inizio della reazione (Fig. 6C).
Nei saggi RdRp, i brevi modelli utilizzati hanno reso tecnicamente
impossibile eseguire esperimenti simili a quelli eseguiti con RTC
completi. Tuttavia, abbiamo precedentemente notato che a basse
concentrazioni di [un-32P]ATP (,0.17 mM) L'attività di SARS-CoV
nsp12 RdRp era limitata all'aggiunta di un solo nucleotide al primer
[27]. EAV nsp9 produceva principalmente prodotti di RNA abortivo
molto corti (2-3 nt di lunghezza) e solo una frazione di prodotti a
lunghezza intera, come è comune perde novo avvio di RdRps
[28]. Questo ci ha permesso di studiare separatamente l'effetto di Zn2+
all'inizio e all'allungamento eseguendo un esperimento in cui un
impulso con una bassa concentrazione di [un-32P]ATP è stato seguito da
un inseguimento in presenza di 50 mM di ATP non marcato, che ha
aumentato la processività e ci ha permesso di studiare l'allungamento
(Fig. 7A e C) come descritto in precedenza [27]. I risultati di questi
esperimenti erano in accordo con quelli ottenuti con RTC isolati. Per EAV,
con inizio e sintesi dinucleotidici completamente inibiti dalla presenza di
Zn . 6 mM2+ (Fig. S2A supplementare), la quantità di intermedi di reazione
inferiori a 18 nt diminuiva con il tempo, mentre i prodotti dei modelli su
cui era già iniziata la RdRp venivano allungati a molecole di 18 nt a tutta
lunghezza (Fig. 7B, pannello di destra). Ciò era coerente con
l'osservazione che l'EAV RdRp rimaneva in grado di estendere il
dinucleotide sintetico ApA ai trinucleotidi in presenza di Zn2+ (Fig.
supplementare S2B). Probabilmente a causa dell'assenza di reiniziazione
nelle reazioni mostrate in Fig. 7B, della bassa processività dell'EAV RdRp
e della competizione del substrato tra i restanti [un-32P]ATP e l'eccesso di
.200 volte di ATP non etichettato, le differenze tra i punti temporali di 5 e
30 minuti erano piccole. In assenza di Zn2+, la RdRp ha continuato ad
avviarsi come indicato dalla scala di molecole di RNA di dimensioni più
piccole al di sotto del prodotto a lunghezza intera (Fig. 7B, pannello di
sinistra) e dall'andamento temporale mostrato nella Fig. S2A
supplementare. Al contrario, l'aggiunta di Zn2+ a una reazione SARS-CoV
RdRp ha anche bloccato l'allungamento, poiché
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Figura 6. Effetto di Zn2+ all'inizio e all'allungamento in in vitro
saggi con RTC EAV e SARS-CoV isolati. (UN)Un in vitro Il dosaggio RTC con RTC
EAV isolati poteva iniziare con NTP non etichettati (iniziazione). Dopo 30
minuti, [un-32È stato aggiunto P]CTP (impulso), la reazione è stata divisa in
due volumi uguali e Zn2+ è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 0,5
mM in uno dei tubi. Nei momenti indicati, sono stati prelevati campioni e
incorporati [un-32P]CMP in RNA virale è stato analizzato. (B) EAV RNA
radiomarcato sintetizzato nei punti temporali indicati sopra le corsie in
presenza e assenza di Zn2+. (C) RNA radiomarcato sintetizzato da RTC SARS-
CoV isolati in reazioni terminate dopo 100 (corsia 1) e 40 (corsia 2) min.
Prodotti di reazione di una reazione a cui 500mM Zn2+ è stato aggiunto dopo
40 min e quello è stato terminato a t = 100 sono mostrati nella corsia 3.
doi:10.1371/journal.ppat.1001176.g006
estensione del primer radiomarcato come osservato in assenza di Zn2+ (Fig.
7D, pannello di sinistra) non si è più verificato (Fig. 7D, pannello di destra).
Lo zinco influisce sul legame del modello RdRp SARS-CoV
Per valutare se Zn2+ influenza l'interazione di SARS-CoV ricombinante
nsp12 con il modello utilizzato nei nostri saggi, abbiamo eseguito saggi
di spostamento dell'elettromobilità (EMSA) in presenza e assenza di Zn2+ (
figura 8A). Per misurare l'affinità di legame della RdRp per il modello,
abbiamo determinato la frazione del modello legato a varie
concentrazioni proteiche e abbiamo osservato una riduzione di 3-4 volte
del legame all'RNA quando Zn2+ era presente nel dosaggio (Fig. 8B).
Abbiamo anche valutato se la pre-incubazione del RdRp o dell'RNA con
Zn2+ era un requisito per questo calo dell'affinità di legame, ma non ha
riscontrato differenze significative con esperimenti che non
prevedevano tale preincubazione (dati non mostrati).
Non è stato osservato alcun legame quando è stato eseguito un test di
legame simile all'RNA con EAV RdRp purificato. Allo stesso modo, nsp9 no
legare l'RNA in esperimenti pull-down con Talon-beads, His6-
marcato nsp9 e RNA genomico EAV radiomarcato o vari
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Zn2+ Inibisce la replicazione del Nidovirus
modelli di RNA corti incluso polyU, mentre siamo stati in grado di
rilevare il legame di una proteina di controllo (SARS-CoV nsp8, che ha
dimostrato attività di legame di RNA e DNA [32]) utilizzando questo test.
Al momento non è chiaro il motivo per cui non siamo in grado di rilevare
il legame di EAV nsp9 ricombinante a uno stampo di RNA.
Discussione
Sebbene sia stata studiata una varietà di composti, attualmente
mancano ancora antivirali registrati per il trattamento efficace della
SARS e di altre malattie correlate al nidovirus [33]. Gli RdRps sono
bersagli adatti per lo sviluppo di farmaci antivirali poiché la loro attività è
strettamente virus-specifica e può essere bloccata senza influenzare
gravemente le funzioni cellulari chiave. Diversi inibitori sviluppati contro
le polimerasi, ad esempio il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e il
virus dell'epatite C, sono attualmente utilizzati nella terapia antivirale o
negli studi clinici [34,35,36]. Pertanto, facendo progredire la nostra
conoscenza molecolare dei nidovirus RdRps e dei complessi enzimatici
più grandi di cui fanno parte, e utilizzando il potenziale di recente
sviluppoin vitro I saggi RdRp [25,26,27,28] potrebbero in definitiva
aiutare nello sviluppo di strategie antivirali efficaci.
Gli ioni zinco e gli ionofori di zinco, come PT e PDTC, sono stati
precedentemente descritti come potenti inibitori di vari virus a RNA.
Abbiamo quindi studiato se l'importazione stimolata da PT di ioni zinco
nelle cellule inibisse anche la replicazione dei nidovirus nella coltura
cellulare. Utilizzando EAV che esprimono GFP e SARS-CoV [29,30],
abbiamo scoperto che la combinazione di 2mMPT e 2 mM Zn2+
hanno efficacemente inibito la loro replicazione, senza causare
citotossicità rilevabile (Fig. 1). Inibizione della replicazione da parte di PT
e Zn2+ a concentrazioni simili (2–10 mM) è stato precedentemente
osservato per diversi picornavirus come rinovirus, virus dell'afta
epizootica, coxsackievirus e mengovirus [6,7,8,9,10,11].
L'effetto inibitorio di Zn2+ sulla replicazione dei picornavirus sembrava
essere dovuto all'interferenza con l'elaborazione delle poliproteine virali.
Nelle infezioni da virus dell'epatite murina coronavirus (MHV), Zn2+ interferiva
anche con alcune delle scissioni delle poliproteine della replicasi [24],
sebbene a una concentrazione molto più elevata (100 mM Zn2+) rispetto a
quello utilizzato nei nostri studi. Poiché l'elaborazione alterata della replicasi
influenzerà indirettamente la sintesi dell'RNA virale nella cellula infetta, ne
abbiamo usati due sviluppati di recentein vitro saggi per indagare se Zn2+
influenza direttamente anche la sintesi dell'RNA del nidovirus. I nostriin
vitro gli studi hanno rivelato un forte effetto inibitorio degli ioni zinco
sull'attività di sintesi dell'RNA di EAV e SARS-CoVRTC isolati. Saggi con
enzimi ricombinanti hanno successivamente dimostrato che ciò era
probabilmente dovuto all'inibizione diretta della funzione RdRp. L'effetto
inibitorio potrebbe essere invertito chelando gli ioni zinco, che fornisce
un interessante approccio sperimentale (on/off) per studiare la sintesi
dell'RNA del nidovirus. Addizione di Zn2+ dopo l'inizio della sintesi
dell'RNA dell'EAV ha avuto un effetto scarso o nullo sull'incorporazione
di NTP in molecole la cui sintesi era già stata avviata in assenza di Zn2+
(Fig. 6 e 7), indicando che Zn2+ non influisce sull'allungamento e non aumenta
la frequenza di terminazione, come precedentemente riscontrato per Mn2+ [
25]. Pertanto, Zn2+ sembra essere un inibitore specifico della fase di inizio della
sintesi dell'RNA dell'EAV. Al contrario, Zn2+ ha inibito l'attività di SARS-CoV
RdRp anche durante la fase di allungamento della sintesi dell'RNA,
probabilmente influenzando direttamente il legame del modello (Fig. 8). Nei
coronavirus, gli ioni zinco sembrano quindi inibire sia il corretto trattamento
proteolitico delle poliproteine replicasi [23,24] sia l'attività di RdRp (questo
studio). Contrariamente ai test RTC, le concentrazioni millimolari anziché
micromolari di
ZnOAc2 erano necessari per un'inibizione quasi completa
dell'incorporazione dei nucleotidi nei saggi RdRp.
È stato ben stabilito che DNA e RNA polimerasi utilizzano una
triade di residui di aspartato conservati nei motivi A e C per legarsi
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 Zn2+ Inibisce la replicazione del Nidovirus

Figura 7. L'effetto di Zn2+ sull'attività di inizio e di allungamento di EAV purificati e SARS-CoV RdRps. (UN)Una reazione EAV RdRp è stata avviata in presenza di [un-32
P]ATP in condizioni che non consentono l'allungamento, cioè, bassa concentrazione di ATP. Dopo 20 min, la reazione è stata divisa in due volumi uguali e Zn2+ è
stato aggiunto a uno dei tubi. Un inseguimento con 50mSu entrambe le reazioni è stato eseguito ATP non marcato M, che consente l'allungamento, e i campioni
sono stati prelevati dopo 5 e 30 min. (B) EAV RdRp prodotti di reazione che si sono accumulati in presenza e assenza di Zn2+
(indicato sopra le corsie) dopo un inseguimento di 5 e 30 minuti con ATP non etichettato. La lunghezza dei prodotti di reazione in nt è indicata accanto al gel. (C)
Una reazione SARS-CoV RdRp è stata avviata in presenza di 0,17 mM [un-32P]ATP, che limita l'allungamento. Dopo 10 min, la reazione è stata divisa in due volumi
uguali e Zn2+ è stato aggiunto a uno dei tubi. Un inseguimento con 50mL'ATP non marcato M è stato eseguito su entrambe le reazioni e i campioni sono stati
prelevati dopo 5, 10, 15 e 30 min. (D) Prodotti di reazione SARS-CoV RdRp formati ai tempi di inseguimento indicati sopra le corsie in presenza e assenza di Zn2+. La
lunghezza dei prodotti di reazione in nt è indicata accanto al gel (p è la lunghezza del primer).
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ioni di metalli bivalenti come Mg2+, che successivamente coordinano i
nucleotidi in ingresso durante la reazione di polimerizzazione [37,38]. Mg
2+ è anche lo ione metallico bivalente necessario per la in vitro
attività di RTC SARS-CoV ed EAV isolati e RdRps ricombinanti
[25,26,27,28], sebbene de novo l'inizio di EAV nsp9 è principalmente
Mn2+-dipendente. Zn2+ non potrebbe sostituire Mg2+ o Mn2+ come
cofattore in quanto incapace di supportare l'attività della polimerasi
di nidovirus RTC e RdRps in assenza di Mg2+ (dati non mostrati),
come è stato riportato anche per il poliovirus RdRp [39]. Inoltre,
l'inibizione dell'attività di nidovirus RdRp da parte di Zn2+ è stato
osservato anche a basse concentrazioni e in presenza di un eccesso
di Mg . di oltre 25 volte2+, suggerendo che sia l'affinità del sito attivo
per Zn2+ è molto più alto o che Zn2+ non compete per Mg2+-
legame e si lega a un altro sito di legame dello zinco (specifico) nella proteina.
Specifici domini proteici o tasche che contengono ioni zinco possono
essere coinvolti nelle interazioni proteina-proteina, proteina-RNA/DNA
interazioni o cambiamenti conformazionali nelle strutture enzimatiche. I
domini che legano lo zinco sono comunemente costituiti da almeno tre
residui di cisteina e/o istidina conservati all'interno di un tratto di
, 10-30 amminoacidi, come nei motivi a dita di zinco e metalloproteasi
[2,40,41]. Tuttavia, in RdRps ci sono solo pochi precedenti per la
presenza di sacche leganti lo zinco, come quelle identificate nella
struttura cristallina della Dengue RdRp [42]. L'analisi della sequenza
della sequenza di amminoacidi EAV nsp9 ha rivelato che manca di cerotti
ricchi di cisteine conservate e/o istidine. Al contrario, l'ispezione della
sequenza di amminoacidi SARS-CoV nsp12 ha rivelato due di questi
cerotti, ovvero H295-C301-C306H309-C310 e C799-H810-C813-H816. Una
struttura cristallina per nsp12 non è attualmente disponibile, ma è stata
pubblicata una struttura prevista che rappresenta i due terzi C-terminali
dell'enzima [31]. È interessante notare che in questo modello, C799,
H810, C813 e H816 sono in una disposizione spaziale simile a quella
dello Zn2+

PLoS patogeni | www.plospathogens.org 7 Novembre 2010 | Volume 6 | Numero 11 | e1001176


Figura 8. L'effetto di Zn2+ sul legame del modello SARS-CoV nsp12. (UN)Saggio
di spostamento della mobilità elettroforetica con dsRNA radiomarcato e
nsp12 in presenza e assenza di Zn2+ (indicato sopra le corsie). La posizione
dell'RNA non legato e legato a nsp12 nel gel è contrassegnata a sinistra del
pannello. (B) Determinazione dell'affinità nsp12 per l'RNA in presenza e
assenza di Zn2+. Una quantità fissa di RNA è stata incubata con una quantità
crescente di nsp12. Ciò ha rivelato una riduzione di 3-4 volte della percentuale
di RNA legato in presenza di ioni zinco (grigio) rispetto alla percentuale di RNA
legato in assenza di ioni zinco (nero). Le barre di errore rappresentano l'errore
standard della media (n= 3). doi:10.1371/journal.ppat.1001176.g008
residui di coordinamento nella tasca legante lo zinco Zn2 trovata nel
motivo E del virus Dengue RdRp (vedi Figura supplementare S3).
Chiaramente, è necessaria un'analisi approfondita del nidovirus RdRps,
ad esempio attraverso l'analisi strutturale e successivi studi mutazionali
mirati alle cisteine e alle istidine sopra menzionate, per fornire ulteriori
informazioni e una base strutturale per lo Zn.2+-ha indotto effetti inibitori
sull'attività di RdRp documentati in questo studio. Tali studi possono,
tuttavia, essere complicati quando Zn2+ il legame risulta essere di natura
molto transitoria e non rilevabile con i metodi attualmente disponibili.
In sintesi, la combinazione di ioni zinco e zinco-ionoforo PT inibisce
efficacemente la replicazione del nidovirus nella coltura cellulare. Ciò
fornisce una base interessante per ulteriori studi sull'uso degli
zincionofori come composti antivirali, sebbene debbano essere
considerati gli effetti sistemici [43,44] e uno zinco-ionoforo solubile in
acqua possa essere più adatto, data l'apparente mancanza di tossicità
sistemica di tale composto a concentrazioni che erano efficaci contro i
tumori in un modello di xenotrapianto di topo [45].In vitro, l'inibizione
reversibile della RdRp da parte di Zn2+ ci ha anche fornito un comodo
strumento di ricerca per ottenere maggiori informazioni sui dettagli
molecolari della sintesi dell'RNA (nido)virale e ha rivelato nuove
differenze meccanicistiche tra gli RdRps di SARS-CoV e EAV.
Materiali e metodi
Cellule e virus
Le cellule Vero-E6 sono state coltivate e infettate con SARS-CoV (ceppo
Frankfurt-1; accession nr. AY291315) o SARS-CoV-GFP come descritto in
precedenza [46]. Tutte le procedure che coinvolgono SARSCoV vivo sono
state eseguite nella struttura di livello 3 di biosicurezza presso il Leiden
University Medical Center. Le cellule BHK-21 o Vero-E6 sono state
coltivate e infettate con EAV (ceppo Bucyrus; accession nr. NC_002532) o
EAV-GFP [29] come descritto altrove [25].
Effetto degli ioni zinco sulla replicazione del nidovirus nella coltura cellulare
Un giorno prima dell'infezione, le cellule Vero-E6 sono state seminate
in cluster da 96 pozzetti trasparenti o neri (bassa fluorescenza) a 10.000
cellule per pozzetto. Il giorno successivo, le cellule sono state infettate
con SARS-CoV-GFP o EAV-GFP con un moi di 4 e 1 h pi l'inoculo è stato
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Zn2+ Inibisce la replicazione del Nidovirus
rimosso e 100 m1 di terreno contenente il 2% di siero fetale di vitello (FCS) è
stato aggiunto a ciascun pozzetto. In alcuni esperimenti 0–32mM di piritione
(Sigma) è stato aggiunto in aggiunta a 0–2 mM ZnOAc2. Le cellule infette
sono state fissate a 17 h pi aspirando il terreno e aggiungendo il 3%
paraformaldeide in PBS. Dopo il lavaggio con PBS, l'espressione di GFP è stata
quantificata misurando la fluorescenza con una piastra LB940Mithras
lettore (Berthold) a 485 nm. Per determinare la tossicità di ZnOAc2 e
PT, le cellule sono state esposte a 0–32 mM PT e 0–8 mM ZnOAc2. Dopo 18
ore di incubazione, la vitalità cellulare è stata determinata con il Cell Titer 96
Saggio AQ MTS (Promega). EC50 e CC50 i valori sono stati calcolati con
Graphpad Prism 5 utilizzando il modello di regressione non lineare.
Modelli di RNA e oligonucleotidi
Oligonucleotidi di RNA SAV557R (59-GCUAUGUGAGAUUAAGUUAU-39)
SAV481R (59-UUUUUUUUUAUAACUU-
AAUCUCACAUAGC-39) e poli(U)18 (59-UUUUUUUUUUUUUUUUU-39)
sono stati acquistati da Eurogentec, purificati
da 7 M Urea/15% PAGE gel e dissalati tramite colonne NAP-10 (GE
Healthcare). Per ricotturare l'RNA duplex SAV557R/SAV481R, gli
oligonucleotidi sono stati miscelati a rapporti equimolari in
tampone di ricottura (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl e 5 mM
EDTA), denaturato mediante riscaldamento a 90tuC e lasciate
raffreddare lentamente a temperatura ambiente, dopodiché sono
state purificate dal 15% di gel PAGE non denaturanti.
In vitro saggio di sintesi dell'RNA virale con RTC isolati
SARS-CoV e EAVRTC sono stati isolati da cellule infette e analizzati per
l'attività in vitro come descritto in precedenza [25,26]. Valutare
l'effetto di Zn2+, 1 ml di un ZnOAc2 la soluzione madre è stata aggiunta allo
standard 28-ml reazioni, con conseguente Zn . finale2+ concentrazioni di
10-500 mM. Quando Zn2+ doveva essere chelato nel corso della reazione,
è stato aggiunto EDTA saturo di magnesio (MgEDTA) ad una
concentrazione finale di 1 mM. Dopo l'isolamento dell'RNA, il32I prodotti
di reazione marcati con P sono stati separati su gel di formaldeide di
agarosio denaturante all'1% (SARS-CoV) o all'1,5% (EAV).
L'incorporazione di [un-32P]CMP nell'RNA virale è stato quantificato
mediante fosforigrafia dei gel essiccati utilizzando uno scanner Typhoon
(GE Healthcare) e il software ImageQuant TL 7 (GE Healthcare).
Espressione e purificazione di nidovirus RdRps
SARS-CoV nsp12 e EAV nsp9 sono stati purificati essenzialmente
come descritto altrove [27,28], ma con modifiche per nsp9. In breve,
E. coli BL21(DE3) con il plasmide pDEST14-nsp9-CH è stato coltivato
nel mezzo di autoinduzione ZYM-5052 [47] per 6 ore a 37tuC e altre
16 ore a 20tuC. Dopo lisi nel tampone A (20 mM HEPES pH 7,4, 200
mM NaCl, 20 mM imidazolo e
0,05% Tween-20) il surnatante è stato applicato a una colonna HisTrap
(GE Healthcare). L'eluizione è stata eseguita con un gradiente di
imidazolo 20-250 mM nel tampone A. La frazione contenente nsp9 è
stata ulteriormente purificata mediante filtrazione su gel in HEPES 20
mM, NaCl 300 mM e 0,1% Tween-20 su una colonna Superdex 200 (GE
Healthcare) . Le frazioni contenenti nsp9-CH sono state raggruppate,
dializzate contro 1000 volumi di tampone B (20 mM HEPES, 100 mM
NaCl, 1 mM DTT e 50% glicerolo) e conservate a
220tuC. RdRps con una mutazione D618A (SARS-CoV) o D445A (EAV)
sono stati ottenuti mediante mutagenesi sito-diretta del plasmide
wildtype (wt) pDEST14-nsp9-CH [28] con oligonucleotidi 59-
TACTGCCTTGAAACAGCCCTGGAGGTTGAT-39
e 59-ATCACAACTCTCCAGGGCTGTTTCAAGGCAGTA
- 39, e plasmide pASK3-Ub-nsp12-CHis6 con oligonucleotidi 59-
CCTTATGGGTTGGGCTTATCCAAAATGTG-39 e 59-
CACATTTTGGATAAGCCCAACCCATAAGGA-39, come descritto altrove
[27]. Le proteine mutanti sono state purificate parallelamente agli
enzimi wt.
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Saggi RdRp con enzimi purificati
Condizioni di reazione standard per il saggio RdRp con 0,1 mM di
SARS-CoV nsp12 purificato sono descritti altrove [27]. Per studiare
l'effetto di Zn2+ in questo saggio, 0,5 ml di una serie di diluizioni di
0–80 mMZnOAc2 è stato aggiunto al 5 ml miscela di reazione,
ottenendo Zn . finale2+ concentrazioni di 0-8 mM. Il saggio EAV RdRp
contenuto 1 mM nsp9, 1 mM RNA modello poli(U)18, 0.17 mM [un-32
P]ATP (0,5 mCi/ml; Perkin-Elmer), 50mMATP, 20 mMTris-
HCl (pH 8,0), NaCl 10 mM, KCl 10 mM, MnCl . 1 mM2, 4 mM MgOAc2,
5% glicerolo, 0,1% Triton-X100, 1 mM DTT e 0,5
unità RNasiOUT. ZnOAc2 è stato aggiunto alla reazione per dare una
concentrazione finale di 0-6 mM. Chelare Zn2+ durante le reazioni,
MgEDTA è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 8 mM. Le reazioni
sono state terminate dopo 1 ora e analizzate come descritto [27].
Saggio di spostamento elettroforetico della mobilità SARS-CoV nsp12
SARS-CoV RdRp è stato incubato con 0,2 nM 59 32Duplex RNA
SAV557R/SAV481R marcato con P, per 10 minuti a 30tuC o
in presenza o assenza di ZnOAc . 6 mM2. Le reazioni sono state analizzate
come descritto in precedenza [27].
informazioni di supporto
Figura S1 Effetto di vari cationi bivalenti sull'attività RdRp di SARS-
CoV nsp12. SARS ricombinante purificata-
CoV nsp12 è stato incubato con uno stampo innescato, ATP e [un-32
P]ATP in presenza di 6 mM Mg2+ solo (corsia 1), e con concentrazioni
crescenti di un secondo metallo bivalente (M2+), in particolare: 2–6
mM Ca2+ (corsia 2–4), 2–6 mM Co2+ (corsia 5-7), 2-6 mM Zn2+ (corsia
8-10), o 2-6 mM Mn2+ (corsia 11-13). L'inibizione più forte è stata
osservata per Zn2+. Per maggiori dettagli sul test SARS-CoV nsp12
RdRp, vedere il testo principale. Trovato su: doi:10.1371/
journal.ppat.1001176.s001 (1,55 MB TIF)
Figura S2 Effetto di Zn2+ sull'estensione del dinucleotide
attività di EAV nsp9. L'EAV ricombinante purificato nsp9 è stato
incubato con un U18 modello in presenza di [un-32P]ATP, ATP, 4 mM
Mg2+, 1 mm Mn2+, e 1 mM ApA. (UN) Le miscele di reazione sono
state suddivise in due aliquote, una delle quali è stata integrata con
6 mM Zn2+, e i campioni sono stati prelevati nei punti temporali
(minuti) indicati sopra le corsie. In assenza di Zn2+, Inizia EAV nsp9
de novo e produce di- e trinucleotidi, indicati rispettivamente con
A2 e A3. Una banda non specifica, non correlata all'attività di RdRp,
tra A2 e A3 è indicata con un asterisco. In presenza di 6 mM Zn2+, la
sintesi di dinucleotidi e trinucleotidi è stata bloccata. (B) Quando si
esegue il saggio descritto in (A) in assenza di Zn2+, si forma un
prodotto a lunghezza intera di 18 nucleotidi. Questo prodotto non
lo è
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Zn2+ Inibisce la replicazione del Nidovirus
osservato quando il saggio viene eseguito in presenza di 6 mM Zn2+,
ma nsp9 era in grado di allungare il primer dinucleotidico ApA
fornito in prodotti tri-(ApA*pA) e tetranucleotide ((ApA*pA*pA)
(l'asterisco indica fosfati radiomarcati). A causa dell'assenza di un 5
9 trifosfato, questi prodotti di reazione migrano molto più
lentamente nel gel di acrilammide al 20% e urea 7 M utilizzato per
questa analisi. Vedere il testo principale per ulteriori dettagli
sperimentali sul dosaggio EAV nsp9 RdRp.
Trovato su: doi:10.1371/journal.ppat.1001176.s002 (2.16 MB TIF)
Figura S3 Presunti residui leganti lo zinco nella previsione
ed struttura di SARS-CoV nsp12 e confronto con la struttura del
virus della dengue contenente zinco RdRp
dominio. (UN)Allineamento della sequenza di coronavirus RdRps che
mostra la conservazione di quattro potenziali amminoacidi residui
leganti lo zinco (C799-H810-C813-H816 in SARS-CoV; indicato con
asterischi) nella regione C-terminale del coronavirus nsp12.
L'ombreggiatura nera indica la completa conservazione tra i
coronavirus. Le sequenze di coronavirus RdRp sono state allineate con
Muscle 3.6. Le sequenze allineate e i numeri di accesso NCBI sono i
seguenti: virus dell'epatite murina ceppo A59 (MHV_A59; NP_068668),
CoV umano 229E (HCoV_229E; NP_068668), virus della bronchite infettiva
ceppo Beaudette (IBV_B; P0C6Y1), coronavirus bovino (BCoV;
NP_742138.1 ), coronavirus felino (FeCoV; YP_239353.1) e ceppo SARS-
CoV Frankfurt-1 (SARS_Fr1; AAP33696). (B) Struttura cristallina del
dominio RdRp del virus Dengue che mostra la posizione di quattro
residui di cisteina e istidina che formano Zn2+
- tasca per rilegatura Zn2, situata vicino al motivo E (raffigurato in
rosso). Un secondo Zn2+-In grigio-blu sono indicati la tasca di
legame (Zn1) e i due ioni zinco identificati nella struttura cristallina. (
C) Modello di struttura tridimensionale previsto di SARS-CoV nsp12
(Xu et al., Nucl. Acids Res. 31: 7117–7130), basato sul codice PDB
1O5S, reso con Swiss-PdbViewer 4.01 e POV-Ray 3.6. Sono indicate
le posizioni dei residui conservati di cisteina e istidina indicati nel
pannello A (C799-H810-C813-H816) vicino al motivo E (raffigurato in
rosso) e residui del sito attivo RdRp (D618, D760 e D761). La
disposizione spaziale di queste cisteine e istidine in questo
modello ricorda in modo sorprendente il posizionamento dei
residui di coordinazione degli ioni metallici della tasca Zn2 che si
lega allo Zn nel dominio RdRp del virus Dengue (vedi pannello B).
Trovato su: doi:10.1371/journal.ppat.1001176.s003 (0.86 MB TIF)
Contributi dell'autore
Ideato e progettato gli esperimenti: AJWtV SHEvdW EJS MJvH. Eseguiti gli
esperimenti: AJWtV SHEvdW MJvH. Analizzati i dati: AJWtV SHEvdW ACS RSB EJS
MJvH. Reagenti/materiali/strumenti di analisi forniti: ACS RSB. Ha scritto il
documento: AJWtV EJS MJvH.
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