Lezione 4 Marzo

Dott.ssa L.Manzo

Siamo simili per la maggior parte del DNA ma siamo anche molto differenti. Condividiamo il 99,5%
del’interno genoma umano e solo lo 0,5% dell’intero genoma differisce tra gli individui. La genetica forense
si basa proprio su questo 0,5%.

La storia dell’identificazione personale si basava sullo studio delle caratteristiche fisionomiche considerate
distintive per ogni individuo, come le caratteristiche facciali o la forma delle orecchie, quindi sul fenotipo.
Successivamente si è passati all’analisi delle impronte digitali, uniche anche all’interno di coppie di gemelli
monozigotici. Ancora oggi l’analisi delle impronte digitali è un’analisi fondamentale che accompagna le
analisi del DNA. Continuando poi con lo studio della diversità a livello biologico: i gruppi sanguigni. Con
l’avanzare della tecnologia si è resa possibile l’analisi della variabilità umana a livelli sempre più accurati
fino a studiarla nella sequenza del DNA, col sequenziamento del DNA.

Quando si parla di genetica forense si parla di identificazione personale. Essa si basa sullo studio delle
caratteristiche che rendono unici gli individui, studia la variabilità interindividuale al fine di identificare un
presunto colpevole, una persona scomparsa o stabilire legami di parentela
Il primo caso fu il 22/11/83 quando Lynda Mann fu trovata violentata e strangolata nei pressi di
Narborough, vicino Leicester. Il colpevole non fu trovato ma fu raccolto un campione di sperma. Il 2 agosto
del 86, in un cespuglio nei pressi di Leicestershire venne ritrovato il corpo di una studentessa di 15 anni,
Dawn Ashworth, violentata e strangolata. Richard Buckland, il giovane usciere dell’ospedale locale,
confessò solo il secondo delitto. Per entrambi gli omicidi, Buckland risultò innocente. Ma il test
(fingerprintig) disse di pi§: confermò che c’era un solo assassino, poiché il profilo genetico era lo stesso sia
nel delitto di Mann che di Ashworth. Alex Jeffreys confermò che entrambi i campioni di sperma
provenivano dalla stessa persona. Partì una caccio all’uomo: 5500 uomini furono tipizzati senza alcun
risultato. Per uno scherzo del destino una donna aveva sentito che un suo collega di lavoro diceva di aver
dato il proprio campione al posto di un amico, un certo Colin Pitchfork. La polizia lo arrestò e il profilo del
suo DNA corrispondeva ai campioni di sperma.

Le indagini criminali si basano sul tentativo di attribuire tracce reperite sulla scena del crimine ad un
sospetto, e da più di un secolo, la scienza forense riveste un ruolo di primaria importanza in questo
processo. Il confronto dei profili genetici generati da individui o campioni diversi consente di rilevarne
l’eventuale COMPATIBILITA’ BIOLOGICA. Ogni volta che sentiamo parlare di compatibilità biologica significa
dire: il DNA estrapolato da un reperto è compatibile col DNA estrapolata dalla dott…

Da dove estraiamo il DNA? Da tutto ciò che contiene cellule nucleate. Quindi sangue, saliva,liquido
seminale, urina/feci (in quest’ultimo caso la situazione però si “complica”, perché si abbiamo delle cellule di
sfaldamento ma ci sono anche molti inibitori, enzimi e il DNA non “esce fuori”), denti/ossa dove il DNA è
ben conservato nella dentina e nella polpa non nello smalto ma comunque dipende da come si sono
conservati se già entra in gioco l’umidità non si può fare molto, formazioni pilifere se c’è i bulbo ok, se non
c’è i bulbo mi concentro sullo stelo dove ricercherò il DNA mitocondriale, impronte digitali, dopo che sono
state analizzate dal dattiloscopista, perché con le impronte digitali si lasciano delle cells di sfaldamento.

In ambito penale tutto inizia con la refertazione ovvero dalla raccolta di reperti o quanto utile ai fini di
giustizia. La repertazione è compito dei corpi di polizia, i reperti vengono posti in buste di sicurezza e portati
in laboratorio. La busta di sicurezza serve a garantire la catena di custodia, ovvero dalla fase di reperta
mento alla fase in cui entra nel mio laboratorio io devo essere sicura che non sia successo niente, anche
perché i reperti possono arrivare in laboratorio anche dopo molti anni. Tutte le buste di sicurezza hanno un
codice univoco. Appena arrivano in laboratorio i reperti bisogna registrare tutto quello che è arrivato, chi lo
ha portato, in che condizioni è arrivato, verificare se ci sono NON CONFORMITA’. Nel nostro laboratorio
pertanto non deve mai mancare una macchina fotografica per foto documentare tutto. Dopo aver
registrato tutto, si da inizio alle operazioni peritali o tecniche ovvero si aprono i reperti. Mi viene posto un
quesito, per esempio hanno repertato una maglietta a seguito di accoltellamento, mi danno la maglietta e il
coltello, il PM o i giudice mi chiede di cercare tracce sui reperti, estrapolare il DNA o comunque poter dare
tutte le informazioni utili ai fini di giustizia. Il reperto è una qualsiasi cosa sulla quale dobbiamo andare a
cercare delle tracce. Si parla di traccia quando non conosco l’origine di un qualcosa, se io ho un tampone
boccale quello non è una traccia ma un campione biologico, lo stesso dicasi per una provetta di sangue. Le
tracce sono dei segni che possono essere per noi utili. Le tracce possono essere evidenti e sono quelle
visibili ad occhi nudo, oppure latenti ovvero quando ad occhio nudo non vedo nulla a meno che non utilizzi
luci forensi. Il crimescope emette una radiazione a diverse lunghezza d’onda, io posso selezionare con quale
lunghezza d’onda colpire la traccia (primo filtro), illumino la traccia, la traccia colpita assorbe parte della
lunghezza d’onda e riemette una lunghezza d’onda maggiore sottoforma di fluorescenza, ho bisogno di un
secondo filtro per poter visualizzare questa fluorescenza tramite degli occhiali di colore diverso. Questo
secondo filtro serve per azzerare la luce circostante, il rumore di fondo ma anche per proteggere gli occhi
dell’operatore. Il colore degli occhiali è importante, il bianco non filtra nulla è solo una protezione per gli
occhi, il giallo filtra bene ma non benissimo come il rosso e l’arancione è un buon filtro.
A seconda delle traccia il kit suggerisce con quale lunghezza d’onda colpire, ad esempio per il liquido
seminale ti dicono 300-340, ma non è una regola fissa perché molto dipende dalla traccia se è fresca, se è
stata lavata e dal tessuto se è poroso, quanto assorbe ecc. Quindi ci sono diverse variabili. Col crimescope
posso vedere le tracce latenti tranne il sangue perché assorbe la radiazione ma non la riemette sottoforma
di fluorescenza. Immaginiamo quindi una maglietta di colore nero con una piccolissima macchia di sangue
ad occhio nudo non vedo nulla ma nemmeno col crimescope posso visualizzarlo, ci sono altre metodiche
che utilizzano diversi reagenti (ma anche lì ci sono delle “problematiche” perché sono sostanze che devi
comunque spruzzare e già se spruzzi diluisci e soprattutto siamo sicuri che non stiamo inficiando nulla?)

Il liquido seminale lo riconosco dal fatto che il contorno è più fluorescente rispetto alla parte centrale.

Finita le fasi di identificazione interviene la fase di campionamento, come si campiona? Il campionamento

esiste tanto nel civile quanto nel penale, ovviamente cambia la metodica. Nel civile io ho campioni biologici,
nel penale io campiono mediante bisturini monouso o pinzette monouso, servono piccole porzioni del
tessuto. Immaginiamo di avere un divano, foto, ad occhi nudo non vedo nulla, (se ho più reperti a ciascuno
assegno un numero) utilizzo le luci e vedo delle tracce, ad ogni traccia assegno una letterina e le fotografo
per far capire bene le posizioni reciproche. Documento tutto, lo metto per iscritto che ci sono delle tracce
non visibili ad occhio nudo, positive alla luce forense e si può anche descrivere com’è la traccia.

Quando diciamo campione biologico – civile , tracce- penale in realtà questa non è una distinzione netta,
perché se nel penale io ho estrapolato il DNA da un reperto, se ci sono già degli indagati io lo confronto con
un campione biologico dell’indagato. I references , ovvero i confronti, si lavorano SEMPRE A CHIUSURA
dell’analisi effettuate sui reperti.

Nelle prime fasi dell’indagine si fanno quelle che sono chiamate “indagini generiche” che mi permettono
un’analisi sulla natura della traccia, ad esempio il Combur test mi permette di capire se quella traccia è
sangue (sulla base del viraggio di colore di un indicatore in presenza di emoglobina e mioglobina) ma non
mi dice se è sangue di animale o umano.

FASI: Raccolta dove per raccolta leggete repertazione/campionamento, entrambi sono raccolte però il
repertamento è la raccolta dei reperti sul luogo ed è effettuata dagli organi di polizia, il campionamento per
il biologo è la raccolta dei campioni sul reperto in laboratorio. Segue conservazione del campione nelle
buste di sicurezza e poi abbiamo analisi di genere e di specie. Abbiamo si utilizzato le luci forensi che mi
hanno solo detto che quella rilevata come fluorescenza è una traccia biologica, che però devo identificare.
Esistono dei kit (scatoline di reagenti validati esclusivamente ad uso forense uguali in tutto il mondo ciò è
fondamentale per la standardizzazione) in commercio. Quando campioniamo con bisturi e pinzetta
monouso, la porzione tagliata dobbiamo analizzarla per tutto l’iter, prima però prima di andare subito in
estrazione dobbiamo fare uno step precedente e dire: con cosa sto lavorando? Quindi della stessa traccia,
una piccola porzioncina viene utilizzata per vedere di cosa si tratta con questi kit, ci sono kit specifici per il
sangue, per l’urina e per la saliva.

Esistono test di conferma e test presuntivi. Il test presuntivo mi dice che quella traccia per esempio è
positiva all’emoglobina quindi è un test presuntivo di sangue ma non è specifico per l’emoglobina umana,
sono test in cui posso avere falsi positivi . I test confermativi sono tutti test immunocromatografici che
utilizza anticorpi monoclonali specifici per quell’antigene umano, quindi una reazione positiva specifica per
il sangue umano.

LUMINOL

Il luminol è utilizzato per determinare e rilevare tracce di sangue, anche levato o rimosso. Usando la
proprietà naturale della luminescenza, esso diventa luminescente reagendo con il perossido di idrogeno. Il
ferro, presente nell’emoglobina del sangue, agisce da catalizzatore nella luminescenza. Il colore del luminol
che reagisce è blu e dura circa 30 secondi e necessita, per essere rilevato, della quasi oscurità.

Per saliva (amilasi), liquido seminale (PSA, semenogelina) e sangue.

Ci sono delle striscette, si fa correre il campione prima in un buffer di estrazione e poi di corsa, lo
metteremo sulla card ci sarà anche un buffer di running ed osserverò la migrazione della mia bandina (se
l’anticorpo si è legato all’antigene) o non vedrò alcuna bandina e affianco ho i controllo positivo del test
ESTRAZIONE DEL DNA

Lisi cellulare, poi estrarre il DNA dal nucleo. Prima dell’estrazione c’è quantificazione, perché noi non
sappiamo la quantità che riusciamo ad estrapolare dal campione. Devo sapere quanto ne ho estratto
perché poi la reazione di amplificazione la devo fare col quantitativo che il kit mi dice. Oggi vengono
utilizzati estrattore automatizzati che riducono l’errore e la contaminazione, e che permettono di estrarre
anche numerosi campioni (fino a 96 campioni contemporaneamente). Lo strumento lavora con i kit che
sono la boccettina di buffer o la boccettina di proteinasi K o la boccettina di DDT (tioglicerolo), quest’ultimo
serve a rompere i ponti disolfuro quindi se ho i capelli che sono pieni di ponti disolfuro li riduce quindi aiuta
la digestione.

I kit di amplificazione ci dicono: per amplificare in condizioni ottimali devi lavorare per esempio con 0,5
ng/ul , per la maggiore è 500 pg di quantitativo di input. Siamo costretti a passare per la quantificazione io
devo sapere in quei 50 ul di DNA eluito dall’estrattore quanti ng ho? Amplificazione con PCR e corsa
elettroforetica questo è l’iter che vale tanto per le tracce nel penale, che per i campioni biologici come i
campioni boccali nel civile. Ci sono degli estrattori che permettono di estrarre anche in presenza di
materiale solido. Anche se il risultato della quantificazione è 0 ng/ul noi non ci fermiamo andiamo cmq in
PCR e facciamo comunque una corsa elettroforetica, quello succederà è confermare il dato della
quantificazione. Quindi il kit ti dice il quantitativo e non bisogna discostarsi da questo o meglio lo si può fare
ma dopo validazione. Oggi i kit di quantificazione permettono di quantificare il DNA totale, quantificare
quello maschile quindi già qui capiamo se c’è un maschio, una femmina o più di uno e ci permettono anche
di valutare lo stato di degradazione ed inibizione. Il DNA degradato ovvero frammentato e quindi
nell’elettroferogramma vedrò amplificate delle parti specifiche per le porzioni più piccole. Il DNA inibito
vuol dire che c’è un fattore che inibisce l’annealing dei primers può essere varia e random l’inibizione. In
entrambi i casi io non ottengo un profilo completo utile per la comparazione.

Tecnologia TaqMan

POLIMORFISMI GENETICI

Quello che noi analizziamo in quello 0,5% sono i polimorfismi del DNA. Sono stati scelti come polimorfismi
d’elezione per le analisi forensi gli STR. Short Tandem Repeat dove che l’elemento che varia è la ripetizione
ovvero il numero di ripetizioni, il blocco di ripete n volte. La combinazione di questi STRs da origine a dei
profili che sono unici (con l’analisi di 24 STRs posso arrivare ad identificare).

Ci sono sempre tetranucleotidi che però variano anche tra loro. Quindi primo punto di variabilità è l’unità
che si ripete, secondo punto è il numero delle volte col quale si ripete questa unità. Questi STRs riescono a
dare una significatività a livello di identificazione incredibile.

Se si utilizzassero STRs più grandi dei tetra si avrebbero dei frammenti difficili da saggiare con la corsa
elettroforetica, se invece si utilizzassero i di o ti nucleotidi erano si più piccoli ma creavano più artefatti.
La nomenclatura è importante. Ci sono due tipologie

Tutti i kit di amplificazione amplificano, ovvero hanno i primers per l’amelogenina che ci permette di capire
se si tratta di maschio o femmina. E’ gene che codifica per lo smalto, la differenza tra la X e la Y è una
delezione di 6bp della X. L’amelogenina presente sul cromosoma X è 106bp, quella sull’Y 112 bp.

Questi marcatori li dobbiamo amplificare per PCR, i primer vengono marcati con i fluorofori che sono 4/5/6
a seconda del kit, non abbiamo 24 fluorofori diversi per i diversi STR, allora per discriminarli giocando sia sul
colore che sulla diversa lunghezza del primer che utilizzo. Nella corsa elettroforetica, un laser colpisce i
frammenti che eccitati riemettono una fluorescenza che viene rilevata.
Nell’elettroforesi capillare non c’è una camera elettroforetica, ma un capillare in rame al cui interno corre il
polimero ed è immerso in due elettrodi. Inizia la corsa elettroforetica per differenza di potenziale, i
frammenti cominciano la loro corsa nel capillare, i frammenti più pesanti sono più lenti. Ad un certo punto
il capillare è defenestrato, ovvero il capillare non c’è, lì c’è una sorgente laser che colpisce i frammenti,
eccita i fluorofori e la camera dello strumento rileva la fluorescenza che verrà letta come picchi, il primo
segnale che vede è l’amelogenina.

La multiplex è la metodica che permette di analizzare/sequenziare più polimorfismi contemporaneamente

in un’unica reazione.