PCR QUANTITATIVA

PCR LIMITI
-Falsi Positivi
-Analisi Qualitativa

NUOVE PROSPETTIVE

PCR Quantitativa
 PCR QUANTITATIVA
• Misura l'amplificazione in tempo reale durante la
fase esponenziale della PCR, quando cioè
l'efficienza di amplificazione è influenzata
minimamente dalle variabili di reazione,
permettendo di ottenere risultati molto più
accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point“.
 PCR Quantitativa

E’in grado di analizzare diversi tipi di fluorescenza emessa da:

coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in maniera aspecifica a tutto il
DNA

sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con

molecole fluorescenti

Dual-labeled (come le sonde TaqMan)

Dual-
Molecular beacons
Scorpion
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
 Cinetica di amplificazione
Scala lineare Scala logaritmica
12000 10000

10000
1000
Numero di molecole

8000

Campione 1 Campione 1
6000 100
Campione 2 Campione 2

4000
10
2000

0 1

1
3
5
7
9
11
13
15
17
11

13

15

17
1

Cicli di amplificazione
1 2 1 2

Reazione fermata a 8 cicli Reazione fermata a 15 cicli

 RT-PCR quantitativa
•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione

•Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio

•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

Plot lineare

Incremento di
fluorescenza

Cicli di PCR
Analisi tramite software
 Plot di amplificazione
Linea soglia scelta
d a l l ’ o p e r a t o r e
Normalised reporter fluorescence (Rn)

In maniera da intersecare le
curve di tutti i campioni nella
fase esponenziale

E’ il ciclo della reazione di

Indica il valore al di amplificazione in cui il segnale
sopra del quale inizia di fluorescenza del campione è
l’accu mu lo di un maggiore rispetto a quello della
a m p l i f i c a to Threshold
PCR cycle number
 Quantificazione

ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto

Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione
assoluta (utilizzo di una standard curve)

Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di
campioni

RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT

Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard
curve)

Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro
∆CT con quello del controllo endogeno
 Quantitativa assoluta
Ct
10 1
35
10 2
10 3
unknown sample
10 4
25
10 5
10 6
3500 copies 10 7
15

1 2 3 4 5 6 7
log10 quantity

Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene

espresso costitutivamente ( β - actina, GAPDH, ATPs, ATPs , β 2 etc
etc))
 Quantitativa relativa

Plot di amplificazione

Control
Sample

Numero di cicli

∆C T
 Allestimento PCR Quantitativa
Piatra ottica 96well

Tappi ottici

Pellicola ottica
 Impostazione piano di lavoro per TaqMan RT-
PCR
Non template Non amplification Control Unknown=
Standard Control Campione
 Analisi dei Risultati

3
Valutazione dei Ct
STANDARD CURVE mRNA

Plasmid dilutions:
(insert = ABL)
- 106 copies
- 105 copies
- 103 copies
- 102 copies
- 10 copies

02/02
Curva degli Standard
 Normalizzazione dei Dati

La normalizzazione dei dati è essenziale ai fini di una quantizzazione efficace.

Metodo di quantizzazione del RNA:

A260 : Conveniente ma non specifico;

Ribogreen/Etidio Bromuro: Sensibile, specifico ma non efficace
Gene Housekeeping: valutazione qPCR di un gene sempre espresso nel tessuto di
interesse.

Numero di copie normalizzate= Numero Copie Gene_______ X100

Numero Copie Gene Housekeeping
 SYBR Green I Dye
Utilizza una molecola fluorescente non specifica
che si lega al solco minore del DNA

Viene aggiunto alla PCR Mix assieme ai reagenti di una PCR

standard
Durante la PCR:
1. Si lega ai prodotti di DNA a doppio filamento
2. Il segnale fluorescente emesso (λ di 530 nm) aumenta proporzionalmente
all’aumento di dsDNA

Applicazione:
analisi quantitative
1.DENATURAZIONE
No fluorescenza

2.ANNEALING
sviluppa fluorescenza
con l’annaeling dei
primers

3. ELONGAZIONE
Durante l’elongazione si
verifica un aumento di
fluorescenza che
corrisponde all’ aumento
del numero di copie
dell’amplicone
 SYBR green
• Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa

• Non costosa

• Non-
Non-specifica
– La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie
eliche, includendo i dimeri di primers
– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici.
– Controllo della spacificità mediante le curve di melting.
 Curva di dissociazione
Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati
(65°c→95°c)
e la variazione dell'energia di fluorescenza viene
monitorata per generare una curva di dissociazione

Prodotto
aspecifico
 PCR Real-time
Sistema LightCycler
 Tecnica di PCR Fluorescente in Real-time

 Consente di effettuare PCR in tempi estremamente

brevi e di rivelare i prodotti di amplificazione in tempo
reale

 i prodotti di amplificazione vengono

marcati con sostanze fluorescenti nel corso
della PCR
 Applicazioni

1. Analisi qualitative:
 variazioni di sequenza note in geni target umani
 genotipizzazione ed identificazione di agenti
patogeni

2. Analisi quantitative:
quantificazione di carica virale
studi di espressione genica
 Il sistema LightCycler è composto da

1. Termociclatore a camera cilindrica

incremento di temperatura: 0.1-20°C/s
accuratezza di temperatura: +/-0.4°C
tempo di corsa: 30 cicli in 20 min.

2. Fluorimetro per microvolumi munito di

sofisticate lenti ottiche

3. PC con relativo software per monitorare la

corsa (PCR) on-line ed in real-time
 2. Volume di reazione:
1. Tubi di reazione: 10-20 µl
capillari in vetro
borosilicato

3. Rotore: capienza di 32
capillari
 Format fluorescenti
La visualizzazione in real time dell’andamento della PCR (incremento dei prodotti di
amplificazione) è resa possibile dall’impiego di sostanze fluorescenti che si legano agli
amplificati

Il sistema LC può lavorare con 2 diversi format fluorescenti:

• Il fluoroforo SYBR Green I
• Sonde d’ibridazione o sonde FRET
 Sonde d’ibridazione o FRET

 Coppia di oligonucleotidi a singolo filamento e

sequenza-specifici (cioè, costruite in modo da essere
complementari a due brevi sequenze interne del
frammento di dsDNA da amplificare)
 Sono legate all’estremità a specifici marcatori
fluorescenti (fluorofori)
 Vengono aggiunte alla PCR Mix, oltre alla coppia di
primers di una PCR standard
 Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Simili alle sonde TaqMan perché si legano al
DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono
però due sonde ognuna marcata con un solo
fluoroc romo (acc etto re e donatore)

accettore
Quando le sonde non sono legate alle sequenze donatore
target il segnale fluorescente proveniente
dall'accettore non è rilevato

Durante lo step di annealing PCR, entrambe le

sonde FRET ibridizzano alle sequenze target:
ciò avvicina il fluoroforo donatore
all'accettore permettendo il trasferimento di
energia tra i due fluorofori e la produzione di
un segnale fluorescente da parte
dell'accettore che viene rilevato
 Sonde d’ibridazione o FRET

Fluoresceina LC Red
3’ 5’
P 3’
Sonda sensor Sonda anchor
5’

3’ Amplicone 5’

Sonda sensor o di mutazione Sonda anchor

Estremità 3’ Fluoresceina (Fluoroforo donatore) Fosfato (all’OH- libero)

Estremità 5’ Libera LC Red (Fluoroforo accettore)

La sonda “sensor” o di mutazione, pur essendo destinata ad ibridare con la sequenza
variabile (contenente o meno l’eventuale mutazione) è stata costruita in modo da essere
complementare alla sequenza wild type

Fluoresceina LC Red
3’ 5’
P 3’
Sonda sensor Sonda anchor
5’

3’ Amplicone 5’
mutazione

La sonda “anchor” è complementare ad una sequenza prossima a quella in cui è

presente l’eventuale mutazione (1-5 nucleotidi di distanza)
 Fluorescent Resonance Energy
Transfer (FRET)
LED

FRET
Eccitazione Emissione

3’ 5’
P 3’
5’

3’ Amplicon 5’

Fluoresceina (Fluoroforo donatore)

LC Red (Fluoroforo accettore)
 NON DETECTED
EXCITATION EMISSION
DETECTED
EXCITATION FRET EMISSION

AMPLICON AMPLICON

Annealing 1-5nt
Real-time PCR con sonde FRET
 Applicazioni delle sonde FRET

1) Melting curve analysis (analisi qualitativa) per:

- variazioni di sequenza note in geni target umani
- identificazione e genotipizzazione di agenti patogeni
(rivelazione di sequenze target)

2) Analisi di specifiche sequenze (analisi quantitativa)

 Real-time PCR con sonde FRET e
Melting curve analysis

1. Preparazione della PCR mix

2. Amplificazione mediante Real time-PCR della
sequenza target di DNA contenente la mutazione di
interesse
3. Genotipizzazione mediante Melting Curve Analysis
PCR Melting curve analysis
 Melting curve analysis
 la temperatura di fusione (o di melting, Tm): T alla quale metà delle sequenze
complementari sono ibridate e dipende dal grado di omologia esistente fra le due
sequenze ibridate
Fluoresceina
3’

Sonda sensor
5’

3’ Amplicone 5’
mutazione

• La Tm è inferiore in presenza di una non totale complementarietà fra le due sequenze

(mismatch) rispetto ad una complementarietà perfetta
•Ogni variazione di sequenza nella regione della sonda “sensor” determina un abbassamento
della Tm
(Es: la sostituzione di una singola base determina una differenza di Tm di 2-10°C)
 Genotipo wild type
totale complementarietà fra sonda sensor e templato
stabilità e Tm dell’ibrido maggiore

Genotipo mutato
non totale complementarietà tra sonda sensor e DNA
destabilizzazione dell’ibrido
riduzione della Tm dell’ibrido
Incremento progressivo della T° (65°C → 95°C)

raggiungimento della Tm dell’ibrido sonda sensor-templato

dissociazione della sonda sensor dal DNA templato

no contiguità fra i due fluorofori

fine del fenomeno FRET

riduzione della fluorescenza

(decadimento della fluorescenza)
 Genotipo wild type
totale complementarietà fra sonda sensor e
templato
stabilità e Tm dell’ibrido maggiore

Genotipo mutato
non totale complementarietà tra sonda sensor e DNA Per il genotipo mutato
il decadimento
destabilizzazione dell’ibrido della fluorescenza
riduzione della Tm dell’ibrido avverrà ad una T
inferiore
rispetto ad un genotipo
wild type
 Rappresentazione grafica della Melting curve analysis

Il decadimento della fluorescenza rivelato dal fluorimetro sarà visualizzato mediante un

sistema di assi cartesiane con:

in ascissa le temperature in gradi centigradi

in ordinata la derivata negativa dei valori di fluorescenza
(-dF/dT)
 Nel sistema di assi cartesiane,
il decadimento della fluorescenza sarà rappresentato sottoforma di “picchi di melting”,
l’analisi delle quali permette la genotipizzazione del paziente
 Melting curve analysis –
Genotipizzazione
A seconda del genotipo del paziente analizzato, il grafico mostrerà
tre diversi tipi di curve, corrispondenti a tre genotipi differenti:

 Genotipo omozigote wild type → un’unica Tm e, quindi, un solo

picco di dissociazione
 Genotipo omozigote mutato → un’unica Tm, inferiore rispetto a
quella del wild type e, quindi, un unico picco di dissociazione
 Genotipo eterozigote → due Tm, una per l’allele wild type e l’altra
per l’allele mutato (più bassa) cui corrispondono, quindi, due
picchi di dissociazione
 wt/wt
mut/mut

wt/mut

Genotipizzazione mediante Melting curve analysis

 Melting curve analysis: controllo di qualità
Per eseguire una genotipizzazione priva di ambiguità è necessario analizzare ad ogni
seduta un controllo negativo ed un controllo positivo

Controllo negativo
L’analisi della curva di melting dovrebbe sempre fornire un risultato negativo:
 assenza di sequenze target a cui le sonde possono legarsi → no FRET → no
decadimento della fluorescenza → graficamente, nessun picco di melting
N.B. In caso contrario, la seduta non è valida e l’intera procedura deve essere ripetuta

Controllo positivo
E’ costituito da un eterozigote di riferimento
L’analisi della curva di melting dovrebbe visualizzare sempre due picchi di melting
(eterozigosi)
N.B. In caso contrario, la seduta non è valida e l’intera procedura deve essere ripetuta
Il Sistema LightCycler per l’analisi delle varianti
polimorfiche associate a trombofilia

La trombofilia ereditaria è una predisposizione genetica

alla trombosi

I geni coinvolti sono geni di suscettibilità poiché non

rappresentano la causa primaria della malattia, come nel caso
dei disordini mendeliani, ma interagiscono in maniera
sinergica con fattori ambientali per il manifestarsi della
patologia

Malattia genetica multifattoriale

 Trombosi

 L’evento trombotico è generalmente conseguenza di

un’alterazione primitiva o secondaria del fisiologico
equilibrio emostatico

 Bilancia emostatica = equilibrio tra fattori procoagulanti ed

anticoagulanti

 I fattori anticoagulanti normalmente tendono a prevalere,

assicurando un accurato controllo in diversi punti della
cascata coagulativa

 Il rischio di trombosi aumenta quando la bilancia

emostatica è spostata in favore della coagulazione
Bilancia emostatica
 Varianti polimorfiche associate a
trombofilia

 Variante G1691A del fattore V, detta fattore V Leiden

rappresenta il principale fattore di rischio trombotico e risulta in
una resistenza alla proteina C attivata

 Variante protrombina G20210A, associata ad aumentati livelli

plasmatici di tale fattore della coagulazione

 Variante C677T della metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR),

correlata ad un incremento dei livelli plasmatici di omocisteina
che inducono un danno endoteliale cronico
La variante genica fattore V Leiden
La variante protrombina G20210A
Ruolo della MTHFR nel metabolismo dell’omocisteina
L’indagine diagnostica molecolare per l’identificazione delle varianti
polimorfiche associate a trombofilia aiuta a stimare in termini
probabilistici il rischio di trombosi
N.B. Deve essere affiancata da anamnesi familiare e personale per
definire l’esposizione a fattori di rischio acquisiti!

In pazienti già colpiti dall’evento trombotico l’identificazione di una o più

mutazioni permette di:
 chiarire la causa dell’evento
 ottimizzare i tempi della profilassi secondaria della trombosi venosa
(durata della terapia anticoagulante e necessità di prevenzione delle
situazioni a rischio)
 estendere lo screening ai familiari del probando

L’identificazione dei portatori asintomatici permetterà loro di giovarsi di

una adeguata profilassi primaria in concomitanza con situazioni a
rischio
L’identificazione e la genotipizzazione delle varianti polimorfiche
associate a trombofilia è particolarmente indicata in pazienti con:

 precedenti episodi di tromboembolismo venoso o trombosi

arteriosa

 poliabortività

 precedenti episodi di trombosi in gravidanza

 tromboflebite o trombosi placentare

 intendono assumere contraccettivi orali

 diabete
L’analisi dei polimorfismi associati a rischio
trombotico mediante il sistema LightCycler si
articola in quattro step:

1. Estrazione del DNA da sangue periferico

2. Quantificazione del DNA con tecnica
spettrofotometrica
3. PCR real-time e Melting Curve Analysis
4. Interpretazione dei risultati
 Melting curve analysis della mutazione
puntiforme G20210A del gene del fattore II

 Genotipo omozigote mutato 䊲㻃 un unico picco di melting a 49°C ±

2.5°C

 Genotipo omozigote wild type 䊲㻃un picco di melting a 59°C ± 2.5°C

 Genotipo eterozigote 䊲㻃 due picchi di melting con i relativi valori a

49°C e 59°C, rispettivamente. Il Δt tra questi due picchi di melting è di
10°C ± 1.5°C
 Infezioni da HSV1/HSV2

L’HSV (Herpes virus simplex) é l’agente eziologico responsabile della

dermatosi vescicolare

Esistono due differenti tipi virali:

Tipo I, responsabile dell’Herpes labialis
Tipo 2, responsabile dell’Herpes genitalis
 Infezioni da HSV1/HSV2

Solitamente:
 Herpesvirus tipo 1 presenta localizzazioni labiali ed oro-
faringee
 Herpesvirus tipo 2 coinvolge la regione genitale

Tuttavia, i due tipi di virus possono essere riscontrati in tutte le

sedi in relazione al tipo di contatto

Trasmissione verticale di HSV2 può verificarsi durante tutta la

gravidanza, sia in corso di infezione primaria che ricorrente
 Diagnosi molecolare delle infezioni da
HSV1/HSV2

La sintomatologia in genere è molto grave:

 ritardo della crescita e dello sviluppo psicomotorio

 calcificazioni intracraniche, microcefalia, convulsioni

 lesioni cutanee

 alcuni bambini presentano interessamento oculare

 Diagnosi molecolare delle infezioni da
HSV1/HSV2

La diagnosi di certezza si può ottenere mediante:

isolamento del virus (3 gg)
più rapidamente, con analisi qualitativa mediante Real-time PCR

Il kit Roche per l’analisi qualitativa di HSV ½ permette:

 rapida identificazione del virus HSV (~85 min.)
 diagnosi differenziale fra HSV1 e HSV2 (tipizzazione in base ad una
variazione di sequenza del gene codificante la DNA polimerasi virale)
 simultanea rivelazione di un Controllo Interno di qualità (mediante
Dual-color detection)
 Procedura diagnostica

1. Estrazione del DNA da colture cellulari, tamponi, plasma, siero

ed altri materiali biologici
2. Real-time PCR e sonde FRET
 Amplificazione di una sequenza target del gene della DNA
polimerasi
 La PCR mix conterrà una coppia di primers ed una coppia di
sonde FRET
3. Tipizzazione mediante Melting curve analysis
 Le Tm degli ibridi sonda sensor/HSV1 e sensor/HSV2 sono
differenti (differenti picchi di melting)
Diagnosi molecolare delle infezioni da
HSV1/HSV2

HSV
DNA pol

Stessa coppia di primers per HSV 1 e 2

Sonda donor complementare a HSV-2

HSV-2
no mismatch
Amplicone

HSV-1

mismatch
HSV 2 HSV2

53.9°C

HSV 1 HSV 1

HSV 2

67.1°C

HSV 1
 HSV1/HSV2 - Melting curve analysis

HSV1

HSV2

I campioni positivi per HSV1 mostrano un picco di melting a 53.9°C

I campioni positivi per HSV2 mostrano un picco di melting a 67.1°C
I campioni negativi non mostrano alcun picco di melting
 Vantaggi della LightCycler qualitativa

 Risparmio di tempo: PCR estremamente rapide, 20 minuti per

30 cicli
 Riduzione delle contaminazioni: l’amplificazione e la rivelazione
avvengono nel medesimo capillare chiuso
 Semplicità d'uso
 Standardizzazione delle metodiche
 Completa automazione delle fasi di amplificazione e rivelazione
 Analisi contemporanea di più campioni
 Elevata riproducibilità
 Elevata sensibilità
PCR Real-time
Sistema TaqMan
 5’ NUCLEASE ASSAY USING
TAQMAN PROBE
1°:°:Elongation
ElongationStep
Stepof
of Pcr

R = Reporter
Q = Quencher
FAM=
6-carbossifluoresceina
Q
Q
R
Forward TAMRA=
primer
5’
6-carbossitetrametilrodamina
3’ 5’
5’ 3’
5’
Reverse
primer 02/02
 5’ NUCLEASE ASSAY USING
TAQMAN PROBE
2°:°:Cleavage
Cleavageof
ofthe
theFluorogenic
FluorogenicProbe
Probe

R = Reporter
Q = Quencher

R
Q
Q
Forward
primer
5’
3’ 5’
5’ 3’
5’
Reverse
primer 02/02
 5’ NUCLEASE ASSAY USING
TAQMAN PROBE
3°:°:Elongation
Elongationstep
stepcompleted
completed
R = Reporter
Q = Quencher

R
Q
Q

Forward
primer
5’
3’ 5’
5’ 3’
5’
Reverse
primer 02/02
Forward

Probe
Reverse
 Allelic Discrimination Assay
For Allele 1 - only VIC™ dye signal is generated
FAM VIC Q
Q
A G
C C

For Allele 2 - only FAM™ dye signal is generated

FAM VIC Q
Q
G
A
T T
 Molecular Beacons
• Sonda oligonucleotidica a forma di forcina
• L’ oligo ha un fluoroforo ad una estremità ed un quencher
all’ altra
Il loop è complementare alla
sequenza target, interna ai
primers di PCR
Lo stem è costituito dalle
estermità complementari tra
loro
In assenza della sequenza
target, la sonda rimane chiusa
e il quencher blocca l’
emissione del vicino fluoroforo.
 Molecular Beacons
Durante lo step di annealing PCR, la
sonda ibridizza alla sua sequenza
target: ciò separa il colorante EXCITATIONE

f l u o r e s c e n t e d a l r e p o r t e r,
producendo un segnale
FRET
f l u o r e s c e n t e

La quantità di fluorescenza prodotta ad

ogni ciclo, o dopo la PCR, dipende
dalla quantità di prodotto specifico ANNEALING
in quel dato momento
Amplicon

A d i f f e r e n z a d e l l e s o n d e Ta q M a n , l e m o l e c u l a r b e a c o n s n o n
vengono distrutte durante la reazione di amplificazione per
cui possono reibridizzarsi durante il successivo ciclo
 Molecular Beacons: come funzionano

• Denaturazione: fluorescenza non specifica

dovuta a denaturazione della sonda
• Annealing: si sviluppa fluorescenza solo se la
sonda ibrida con il target specifico
• Estensione: la sonda si dissocia dal target
• Lettura della fluorescenza (Plate Read): in fase
di annealing

Se la sonda è disegnata correttamente, è sufficiente il mismatch di una sola

base per impedire l’ ibridazione con il target.
Applicazione: SNP
 Probes : Scorpions
La progettazione delle
scorpion probes è simile a
quella delle molecular
probes, con la differenza
che al 3’ terminale del
probe vi è una sequenza,
PCR primer, che è
specifica per l’ estensione
del target

Questa sequenza è legata

al 5’ terminale di un
primer per mezzo di un
“blocker”
 Probes : Scorpions
Step 1

Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA

Scorpions primer

Probe
Target di DNA
 Probes : Scorpions
Step 2

Durante il processo di denaturazione si verifica

l’allontanamento del quencher dal reporter e del
primer di innesco dal DNA target

Q
Primer di innesco
R
DNA target
 Probes : Scorpions
Step 3

Raffreddandosi lo Scorpion esteso subisce un

riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera
target specifica. Un primer non esteso viene quenciato
 Scorpions™ Probes
The probe contains a 5'end reporter dye and an internal
quencher dye directly linked to the 5'end of a PCR primer
via a blocker. The blocker prevents Taq DNA polymerase
from extending the PCR primer.
 Step 1: Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA

Step 2-3: Durante il processo di denaturazione si verifica l’allontanamento del quencher

dal reporter e del primer di innesco dal DNA target.
Il probe Scorpion riannilandosi su se stesso presenta quencher e reporter distanziati.
Lo strumento registra l’emissione di fluorescenza.
 Riassumendo:
Metodi di rilevamento della fluorescenza

Molecular Scorpion
SYBR Green TaqMan probe
Beacons