Coltivazione dei batteri

Fattori influenzanti la crescita

Identificazione dei microrganismi

Giovanni Di Bonaventura
B.Sc., Ph.D.
 Terreni di coltura

Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul

quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in
vitro di un microrganismo
Caratteristiche:
concentrazione adatta di sostanze nutritive per la
crescita batterica
adeguato grado di umidità
reazione (pH) adatta
sterili e protetti da qualsiasi inquinamento
 Terreni di coltura
Contenuto qualitativo (1 di 2)

Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti

per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine
(caseina, soja, ecc.)
NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le
necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni
microrganismi parassiti
Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti
per scopi specifici in terreni particolari
Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori
di crescita e sali inorganici
 Terreni di coltura
Contenuto qualitativo (2 di 2)

Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte

disidratato, gelatina vitamine. Necessari per la
crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista
nutrizionale
Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a
spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto,
sodio-azide)
Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo
fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.)
permettono di seguire il metabolismo fermentativo
del batterio in esame, determinando il viraggio di
colore del terreno a valori critici di pH
 Terreni di coltura
Classificazione (1 di 3)

In base allo stato fisico:

Terreni LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e

sterilizzati.

Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali

(terreno alla patata) o vengono solidificati per
aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina,
silica-gel)
 Terreni di coltura
Classificazione (2 di 3)

In base alla costituzione chimica:

Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri
autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono
presenti come sali inorganici in composizione e
quantità note.
Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione
chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui
il batterio necessita sono presenti in quantità note.
Terreni COMPLESSI: ignota l’esatta composizione
chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di
bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior
parte dei terreni usati in laboratorio.
 Terreni di coltura
Classificazione (3 di 3)

In base alla funzione:

 Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie
microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più
breve rispetto ad altre specie microbiche.
 Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche
(sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide,
cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o
rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non
di altre. Utilizzati per l’isolamento di specifici
microrganismi da campioni altamente contaminati.
 Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici
di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel
terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.
 Terreni di coltura
Tecniche di semina per isolamento
Semina per isolamento
 Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (1 di 3)
Cetrimide Agar:
Terreno selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di
Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per
stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide, verso cui P.
aeruginosa è resistente, inibisce la crescita di gran parte dei
microrganismi.
Columbia Blood Agar Base:
Terreno di uso generale e base per terreni addizionati di sangue (S.
aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori,
Gardnerella).
Hektoen Enteric Agar:
Terreno differenziale e selettivo per l’isolamento di Salmonella e
Shigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali
biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di
tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per
evidenziare la produzione di H2S (colonie nerastre, Salmonella)
Cetrimide Agar
Columbia Blood Agar Base
 Hektoen Enteric Agar

Salmonella: colonie lac- Klebsiella: colonie lac+

 Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (2 di 3)

MacConkey agar:
 evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli
Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La
presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di
Gram+. La presenza di lattosio evidenzia la capacità
fermentante: le colonie fermentanti il lattosio (Klebsiella, E. coli,
Enterobacter aerogenes) appariranno rosa acceso, incolori
quelle non fermentanti (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia,
P. aeruginosa).
Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar:
 non selettivo, per la crescita e tests di sensibilità degli anaerobi.
Urea broth base (terreno di Christensen):
 evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae
mediante viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo).
 MacConkey agar

A B

A: colonie lac- di P. aeruginosa; B: colonie lac+ di E. coli

Urea broth base
 Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (3 di 3)
Mannitol Salt Agar:
Terreno selettivo per l’isolamento di stafilococchi presunti
patogeni. Azione selettiva dell’elevata [NaCl]. S. aureus
produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi
coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.
Mueller-Hinton agar:
 per la determinazione dei saggi di antibiotico-sensibilità.
Saboraud Dextrose Agar:
 terreno acido indicato per l’isolamento di diversi funghi e
lieviti. Candida albicans (colonie incolori/rosa); Candida non-
albicans (colonie rosa scuro/rosse).
Salmonella-Shigella Agar (Agar SS):
 terreno selettivo e differenziale per l’isolamento di
Salmonella e Shigella dalle feci e da campioni di altra natura.
Mannitol Salt Agar
Sabouraud Agar
 Salmonella Shigella Agar
(SS-agar)

Salmonella typhimurium

Salmonella dublin
 Fattori influenzanti la crescita
(1 di 6)

Crescita vs Tolleranza
 “Crescita” generalmente indica l’acquisizione di
biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione).
 Alcuni microrganismi possono sopravvivere a condizioni
non permissive per la loro crescita.
 Il suffisso “-fili” viene spesso usato per descrivere le
condizioni permissive per la crescita, mentre il termine
“tollerante” descrive le condizioni in cui il microrganismo
sopravvive, ma non necessariamente cresce.
Ad esempio, un “batterio termofilo” cresce in presenza di
elevate temperature, mentre un “batterio
termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma
cresce a temperature inferiori.
 Fattori influenzanti la crescita
(2 di 6)

 Obbligato (stretto) vs facoltativo

 “Obbligato” (o “stretto”) indica che una data condizione
è necessaria per la crescita batterica.
 “Facoltativo” indica che il microrganismo può crescere
in quella condizione, sebbene non necessaria.
 Il termine “facoltativo” viene spesso usato in presenza
di condizioni sub-ottimali. Ad esempio, un “termofilo
obbligato” necessita di elevate temperature per la sua
crescita, mentre un “termofilo facoltativo” può crescere
ad alte temperature ma anche a temperature più
basse.
 Fattori influenzanti la crescita
(3 di 6)

 Temperatura
 La maggior parte dei batteri cresce in un
intervallo termico di circa 20°C, esibendo la
massima velocità di crescita ad un certo
“optimum termico”
 Psicrofili: ~0 – 20ºC
 Mesofili: ~10 – 50ºC
 Termofili: ~40 – 75 ºC
 Ipertermofili: ~70 – 110 ºC
Fattori influenzanti la crescita
Temperatura
 Fattori influenzanti la crescita
(4 di 6)

 pH
 Acidofili:
 crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)
 funghi e lieviti (pH 5 - 6)
 Neutrofili:
 crescono tra pH 6 – 8
 maggior parte dei batteri
 Alcalofili:
 crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)
 Fattori influenzanti la crescita
(5 di 6)

 Concentrazione salina (pressione osmotica)

 Alofili:
 Crescono ad elevate concentrazioni saline
(generalmente 1 M), sopportando elevate
pressioni osmotiche;
 Stafilococchi
  Batteri AEROBI OBBLIGATI
Fattoriinfluenzanti la FACOLTATIVI
crescita
 vivono solo in presenza di O2
Batteri AEROBI-ANAEROBI
 vivono in presenza/assenza di O2 (6 di 6)
 Batteri ANAEROBI OBBLIGATI
Ossigeno (O
2) vivono in assenza di O2
 Batteri MICROAEROFILI
 vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)

Aerobi Aerobi Anaerobi Anaerobi

Microaerofili
obbligati facoltativi obbligati facoltativi
Terreni particolari per l’isolamento
di agenti eziologici poco frequenti

Origine Diagnosi Batteri patogeni Terreni per

prelievo presuntiva l'isolamento

Feci Colera Vibrio cholerae Acqua

Vibrio peptonata
parahaemolyticus alcalina
TCBS
Faringe Infiammazione Haemophilus Agar sangue
ostruttiva influenzae cioccolato o
epiglottide e agar Casman
faringe

Agar Loeffler
Agar Tinsdale
Faringite Corynebacterium Terreno al
membranosa diphteriae tellurito di
sodio
 Terreni particolari per l’isolamento
di agenti eziologici poco frequenti

Origine prelievo Diagnosi Batteri patogeni Terreni per

presuntiva l'isolamento
Tampone Pertosse Bordetella Bordet-Gengou
rinofaringeo pertussis alla patata
Escreato Tubercolosi Mycobacterium Lowenstein-
tuberculosis Jensen
Middlebrook 7H-
Micosi polmonare Blastomyces 11
dermatitidis Brain-heart
Infusion agar
Urina Leptospirosi Leptospira spp. Semisolido di
Fletcher
Sangue, midollo Brucellosi Brucella spp. Agar brucella
osseo o biopsia
 Terreni per l’isolamento degli
anaerobi da campioni patologici (1 di 2)
Terreno Scopo

Agar sangue (AS) Terreno in piastra non selettivo di uso

generale
Agar cioccolato (AC) Utilizzato principalmente per
l'isolamento di Haemophilus e
Neisseria; usato anche per l'isolamento
di anaerobi esigenti

Agar MacConkey (MAC) Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed

anaerobi facoltativi
Agar sangue feniletil Isolamento cocchi Gram+ anerobi
alcool (PEA) facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+
e Gram-
 Terreni per l’isolamento degli
anaerobi da campioni patologici (2 di 2)
Terreno Scopo

Agar sangue kanamicina- Isolamento selettivo di bacilli anaerobi

vancomicina (KV) Gram-

Terreno al tioglicolato Brodo di arricchimento utilizzato per

(BBL-0135C) + emina + arricchire i terreni in piastra
vitamina K1 (THIO) particolarmente se il campione è scarso

Terreno di Thayer-Martin Impiegato per arricchire i terreni per

modificato (MT) anaerobi quando si sopetta nel
campione la presenza di Neisseria
gonorrhoeae o N. meningitidis
  Giara per anaerobiosi

Anaerobiosi

 Cappa (camera) per

anaerobiosi

Figure 6.5
 Carbossifilia
(5% O2, 10% CO2, 85% N2)

 Giara con “candela”

Sistemi per generazione di

carbossifilia (CO2-packet)

Figure 6.7
 Identificazione dei
microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)

 Colorazione di Gram
 Colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali)
 tipo (aspetto) coloniale
 emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
 crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche
4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
5. Tipizzazione fagica
6. Identificazione genotipica
 ID dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie
(1 di 2)

Forma Rilievo

puntiforme d < 1 mm effuso sottile, allungato

circolare piatto

irregolare, a filo
filamentosa intrecciato
sopraelevato

rizoide irregolare, ramificata

convesso

irregolare umbonato
 ID dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie
(2 di 2)

Superficie Margine

liscia intero

rilevata ondulata
ondulato

radiata eroso

concentrica anelli concentrici

filamentos
o
rugosa raggrinzita
arricciato
 ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (emolisi)

Streptococcus spp
Staphylococcus spp
 ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (fermentazione)

Staphylococcus spp
 ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (sciamaggio)

Proteus mirabilis
 ID dei microrganismi
Caratteristiche biochimiche

Enterobacteriaceae, in particolare:
 capacità di utilizzare determinati substrati come
unica fonte di carbonio
 acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) +
indicatore pH (blu di bromotimolo: vira al blu a pH basico)
 presenza di particolari enzimi
 ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi,
beta-galattosidasi, ureasi
 produzione di specifici prodotti metabolici terminali
 H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)
 capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test)
 1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan
(produzione di gas)
 ID dei microrganismi
Caratteristiche biochimiche

API (bioMérieux) Identification System

 ID dei microrganismi
Caratteristiche antigeniche

Produzione di antisieri (Ab specifici) mediante

inoculazione di microrganismi nella cavia
Utilizzo di antisieri per reazione di agglutinazione
 colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico
 reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi
Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica
(tipi sierologici o sierotipi)
Agglutinazione

Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
Ab
 ID dei microrganismi
Tipizzazione fagica

 Una singola specie può comprendere ceppi

diversi (sottospecie o tipi)
 Impiego di batteriofagi a fini identificativi
 esempio: tipizzazione di S. aureus
 estremamente sensibile a numerosi (20) batteriofagi
virulenti (litici)
 sensibilità non uniforme (stipite-specifica)
 individuazione di “tipi fagici”
 Utile ai fini epidemiologici (studio delle
modalità di diffusione dell’infezione)
Tipizzazione fagica
 ID dei microrganismi
Identificazione molecolare

 Polymerase Chain Reaction

 amplificazione di sequenze “bersaglio”, specifiche per il genere, la specie od il tipo batterico
 elevata sensibilità (necessità di poche copie del target di partenza) e specificità.
 sequenziamento genico (genotipizzazione)
 RNA ribosomale
 grandi quantità di rRNA altamente conservate in specie differenti;
 presenza di sequenze di rRNA “specifiche” per specie e tipo. L’amplitudo della differenza
nell’rRNA di due batteri rivela quanto filogeneticamente “vicini” essi siano: piccole differenze in
rRNA sono suggestive per una vicinanaza tra le specie, mentre grandi differenze indicano che
le specie sono più distanti tra loro.
 L’individuazione di un pattern in rRNA che non trova riscontro in nessun altra sequenza nota,
indica la scoperta di una nuova specie.
ID dei microrganismi
Identificazione molecolare