Jaffe Vs Enzimatico

SSMT
2004/2005
Lavoro di Diploma
Valentina Galiani, 3LM

Ospedale Civico Lugano
Responsabile, Dr. Roberto della Bruna

INDICE
Riassunto…………………………………………………………………………………. 2
1. Introduzione……………………………………………………………………………. 3-7
1.1. Alcuni cenni storici sulla creatina e sulla creatinina…………………………… 3
1.2. La creatinina……………………………………………………………………….. 4
1.3. La clearance della creatinina………………………………………………….. 4-6
1.4. Interpretazione clinica…………………………………………………………….. 6
1.5. I metodi di determinazione……………………………………………………….. 7
2. Obbiettivi del lavoro e strategia di realizzazione………………………………….. 8

2.1. Strategia di realizzazione………………………………………………………… 8
3. Materiali e metodi……………………………………………………………………. 9-14

3.1. I campioni………………………………………………………………………….. 9
3.1.1. La raccolta delle urine……………………………………………………….. 10
3.2. I controlli di qualità e la calibrazione…………………………………………… 11
3.3. Gli apparecchi………………………………………………………………... 11-12
3.4. Analisi statistica………………………………………………………………….. 12
3.5. Crea Plus…………………………………………………………………………. 13
3.6. Crea……………………………………………………………………………….. 14
4. Risultati………………………………………………………………………………. 15-23
4.1. Tabella delle misurazioni……………………………………………………. 15-16
4.2. Precisione dei metodi…………………………………………………………… 17
4.3. Confronto dei metodi………………………………………………………… 17-23
4.3.1. Confronto della creatinina sierica………………………………………. 18-19
4.3.2. Confronto della creatinina urinaria……………………………………... 20-21
4.3.3. Confronto della clearance………………………………………………. 22-23
5. Discussione…………………………………………………………………………. 24-25
6. Costi……………………………………………………………………………………… 25
7. Conclusioni.…………………………………………………………………………….. 26
8. Bibliografia.……………………………………………………………………………... 27
9. Ringraziamenti………………………………………………………………………….. 28
Allegati
Allegato 1; “L’HPLC”………………………………………………………………….. 29-30
Allegato 2; “ROCHE/HITACHI 912”……………………………………………………... 31
Allegato 3; “Crea Plus”………………………………………………………………… 32-35
Allegato 4; “Crea”……………………………………………………………………… 36-39
Allegato 5; “Grafici”…………………………………………………………………… 40-54
1
RIASSUNTO
Scopo del lavoro di diploma è stato il The aim of the diploma work was to
confronto tra la determinazione della compare the determination of creatinine
creatinina secondo il metodo enzimatico according to the enzymatic method and
e la determinazione secondo Jaffé, in that of Jaffé, in view of a possible change
vista di un possibile cambio metodo per of method in order to align with
allinearsi agli standard internazionali. international standards.
Le misure di creatinina e della sua Measurement of creatinine and its
clearance sono state eseguite su clearance was performed on samples of
campioni di plasma/siero e urina ottenuti serum/plasma and urine samples from
dal laboratorio dell’Ospedale Civico di the laboratory of the Civic Hospital in
Lugano. Le misurazioni sono avvenute Lugano.
entro sette giorni dal prelievo. Measurement was done seven days from
Il confronto tra i metodi ha permesso di collection.
stabilire che il metodo enzimatico è By comparison between the methods it
preciso, affidabile e sostanzialmente was possible to establish that the
sovrapponibile al metodo in uso. enzymatic method is precise, reliable and
Una leggera sottostima della creatinina substantially a replacement for the
nel plasma/siero per valori bassi method in current use.
(< 100µmol /l) è probabilmente da A slight undervaluation of the creatinine in
attribuire all’insensibilità del nuovo the serum/plasma for low values (<
metodo alle pseudocreatinine. 100µmol /ls) was probably due to the
Il nuovo metodo permette inoltre di fornire insensitivity of the new method to the
risultati allineati agli standard pseudocreatinines.
internazionali. In addition, the new method allows the
L’introduzione del nuovo metodo supply of results which are in line with
comporterebbe annualmente spese international standards.
supplementari di circa 14000,00 CHF. The introduction of the new method would
involve additional annual expenses of
around 14000,00 CHFs.
2
1. INTRODUZIONE
1.1 Alcuni cenni storici sulla creatina e sulla creatinina

1832 La creatina viene scoperta per la prima volta, nelle carni rosse, dallo scienziato
francese Chevreul.
1847 Lieberg confermò che la creatina era un normale costituente della carne e osservò
che la carne di volpi selvatiche conteneva una quantità di creatina dieci volte
superiore alla concentrazione presente in quella delle volpi tenute in cattività.
Ipotizzò così, che l’attività motoria comportasse un incremento della concentrazione
muscolare di creatina.
Circa nello stesso periodo, i ricercatori Heintz e Pettenkofer, evidenziarono nelle
urine una sostanza, che Lieberg confermò essere la creatinina.
Sulla base dell’osservazione che l’escrezione urinaria di creatinina era correlata alla
massa muscolare, si pensò che essa fosse un prodotto metabolico della
creatina dei muscoli.
1886 Jaffè descrive il metodo per determinare la creatinina.
1900 Nei primi anni del XX° secolo, estraendo la creatina dalla carne e dalle urine, si notò
che non tutta la sostanza somministrata all’animale o all’uomo veniva poi recuperata
nelle urine sottoforma di creatinina. Si arrivò a pensare che parte della creatina
potesse essere trattenuta nell’organismo per scopi plastici o energetici.
1912-1914 Studi condotti dai ricercatori Folin e Denis, dimostrarono che il suo contenuto
muscolare poteva essere incrementato con assunzioni supplementari nella
dieta di creatina.
Infatti nei gatti vennero riscontrati aumenti di tessuto muscolare fino al 70%.
1923 Hahn e Meyer stimarono che per un uomo di 70 Kg, il contenuto totale di creatina
era di circa 140 g (2 g/Kg).
1927 I ricercatori Fiske e Subbarow scoprirono l’esistenza della fosfocreatina (o

creatinfosfato), molecole di creatina e fosfato unite in un legame chimico e
immagazzinate nei tessuti muscolari.
Si scoprì che questa sostanza aveva un ruolo nella contrazione muscolare. (1)
Oggi la creatina è uno degli integratori alimentari più utilizzati da tutti gli atleti.
Figura 2,
molecola
di
creatina
Figura 1,
Michel
Chevreul
1786-1889
3
1.2. La creatinina
La parola crea deriva dal greco kreas e significa carne. (1)
Creatinina o 2-imino-1-metil-imidazolidin-4-one, ha struttura chimica C4H7N3O e massa
molecolare di 113,12 g/mol.
Contenuta essenzialmente nei muscoli e deriva dalla creatina e dal creatinfosfato.

La creatina viene prodotta e liberata in circolo dal fegato, dal pancreas e dai reni, per poi
essere assorbita dal tessuto muscolare.
Nei muscoli la fosforilazione con la creatinchinasi trasforma la creatina in creatinfosfato,
che funge da riserva energetica da trasferirsi sull’ADP.
Dalla degradazione della creatina e del creatinfosfato si forma la creatinina, la quale va in
seguito a distribuirsi nei vari liquidi corporei.
La quantità di creatinina nel nostro organismo dipende dalla massa muscolare, infatti tra i
due c’è una stretta correlazione.
Nelle persone con funzione renale normale quasi tutta la creatinina formata viene
eliminata mediante filtrazione glomerulare, ma non riassorbita. Solo piccole quantità
vengono escrete tubularmente, metabolizzate o liberate nell’intestino. (2)
Queste proprietà, unite alla facilità e all’economicità del dosaggio, rendono la creatinina
particolarmente adatta a stimare il tasso di filtrazione glomerulare.
Valori normali: Donna: 44 – 80 µmol/l

Uomo: 62 – 106 µmol/l (3)
1.3. La clearance della creatinina
La clearance della creatinina permette di stimare in modo abbastanza preciso il volume di

liquidi filtrato dal rene nell’unità di tempo (1 minuto).
Negli anni sono state sviluppate diverse formule matematiche più o meno precise per
calcolare la filtrazione glomerulare partendo dalla creatinina plasmatica e urinaria: alcune
di queste si accontentano solo della concentrazione plasmatica.
Alcune formule prevedono una correzione che tenga conto della superficie corporea e
quindi, indirettamente, della massa muscolare del paziente. Altre formule sono state inoltre
sviluppate per valutare la filtrazione glomerulare in pazienti pediatrici, e cioè con massa
muscolare molto ridotta.
La formula attualmente usata nei laboratori dell’Ente Ospedaliero Cantonale, in ml/min, è

la seguente: (5)
creatinina urinaria in µmol/l ∗ volume urinario 1.73

creatinina sierica in µmol/l ∗ tempo di raccolta ∗ superficie corporea
oppure
creatina urinaria in µmol/l ∗ volume urinario ∗ 1.73

creatinina sierica in µmol/l ∗ tempo di raccolta ∗ superficie corporea in m2
4
Altre formule usate per il calcolo della clearance:
Formula di Cockroft-Gault, in ml/min: (4)
Femmine Maschi
[(140-età) ∗ peso in Kg ∗ 0.85] (140-età) ∗ peso in Kg

0.81 ∗ creatinina sierica in µmol/l 0.81 ∗ creatinina sierica in µmol/l
[(140-età) ∗ peso in Kg ∗ 0.85 [(140-età) ∗ peso in Kg

72 ∗ creatinina sierica in mg/dl] 72 ∗ creatinina sierica in mg/dl]
Nei reparti di pediatria, per bambini di pochi anni, si usa sovente la formula: (10)
C (ml/min./1.73 m2) = 48.7 ∗ lunghezza corporea in cm

Creatinina sierica in µmol/l
Bisogna sapere però, che disponendo solamente della creatinina sierica, la stima della
clearance è approssimativa.
Per quanto riguarda invece la superficie corporea, essa viene determinata in funzione del
peso e dell’altezza del paziente con appositi nomogrammi.
Creatinine Clearance Predictor Body Surface Area

Con il peso e gli anni del paziente, Con l’altezza e il peso del
la scheda riporta quale dovrebbe paziente, la scheda riporta il
essere la concentrazione di valore della superficie
creatinina e come dovrebbe essere corporea.
la clearance.
Figura 3, indicatore della Abbott

Diagnostics, OCL.
Altrimenti per chi volesse, esistono anche formule matematiche.
Formula secondo DuBois e DuBois: (2)
= peso0.425 ∗ altezza0.725 ∗ 71.84
Formula secondo Mosteller, in m2: (2)
= peso in Kg ∗ altezza in cm
3600
5
La clearance può essere usata come parametro per valutare:
- un’eventuale riduzione della filtrazione glomerulare;
- per il controllo del decorso in caso di medicazione,
- per stimare la necessità di dializzare un paziente.
Valori normali: 17-151 ml/min (3)
1.4. Interpretazione clinica

Ipercreatininemia
→ Ridotta filtrazione glomerulare: insufficienza renale acuta;

insufficienza renale cronica;
stadi avanzati del diabete mellito.
→ Liberazione di creatinina dai muscoli: traumi;

ustioni;
processi degenerativi (distrofia muscolare acuta).
→ Medicamenti: sali di litio, di mercurio e di tallio;

analgesici/antiflogistici;
antibiotici;
diuretici;
citostatici.
→ Altre malattie: leucemie acute;

morbo di Cushing;
miotonia atropica;
artrite reumatoide;
lupus eritematoso sistemico (LES).
Diminuzioni della creatinina
→ Non è di rilevanza clinica.
→ Si riscontra in gravidanza, durante il primo e secondo trimestre. (2)
6
1.5. I metodi di determinazione
Il metodo di riferimento per la misura della creatinina è l’HPLC1(High Performance Liquid
Chromatography).
Questo metodo è una forma versatile di cromatografia usata con una grande varietà di fasi
stazionarie e mobili per separare singoli composti in base alle dimensioni, alla polarità, alla
solubilità, alla carica, alle caratteristiche di assorbimento, ecc… (6)
L’HPLC è un metodo poco usato nei laboratori in quanto richiede una tecnologia
relativamente complessa, lenta e costosa.
Generalmente la determinazione della creatinina in siero/plasma e urina avviene secondo

il metodo di Jaffé e altre varianti con picrato o il metodo enzimatico colorimetrico
L’analisi viene effettuata su apparecchi automatici.
Il metodo secondo Jaffé:

Prevede che la creatinina in soluzione alcalina reagisca con picrato dando una colorazione
giallo-arancio la cui intensità è proporzionale alla concentrazione di creatinina.
La lettura avviene fotometricamente.
Il metodo enzimatico colorimetrico:

Questo metodo fa capo all’idrolisi della creatinina e ad altri processi enzimatici, portando
anch’essa alla formazione di un colorante la cui intensità è proporzionale alla
concentrazione di creatinina.
Anche in questo caso la misurazione avviene fotometricamente.
Da fine 2003, le norme internazionali IVD2 prevedono che questi due metodi siano
standardizzati ai valori ottenuti con il metodo di riferimento.
1
HPLC: cromatografia in fase liquida ad alta prestazione.
2
IVD: in vitro diagnostica.
7
2. OBIETTIVI DEL LAVORO E STRATEGIA DI
REALIZZAZIONE
I laboratori dell’Ente Ospedaliero Cantonale determinano attualmente la creatinina

secondo il metodo di Jaffé descritto nel 1886.
Il metodo è probabilmente il più antico tra quelli ancora in uso nelle determinazioni
chimico-cliniche, e permette misure abbastanza precise a costi molto bassi.
Questo metodo è però soggetto ad alcune interferenze che influiscono positivamente sulla
determinazione. Le sostanze in questione vengono definite “cromogene” o
“pseudo creatinine” e ne fanno parte:
• l’acetone; • il piruvato; • il glucosio; • il fruttosio; • l’acido urico
• l’acido ascorbico; • le cefalosporine; • alcune proteine; • l’acido acetacetico.
Per soddisfare le nuove norme internazionali, le ditte produttrici di reagenti propongono di

usare il metodo di Jaffè compensato, in modo da eliminare l’influenza delle
“pseudo-creatinine”. Questa compensazione è comunque approssimativa, in quanto ogni
campione contiene una quantità variabile di sostanze cromogene.
Per questo motivo i laboratori dell’ente ospedaliero (EOLAB), intendono valutare la

possibile introduzione della determinazione della creatinina secondo il metodo enzimatico.
Il metodo è insensibile alle “pseudo creatinine” ed inoltre, è più opportuno per i campioni
pediatrici ed oncologici.
L’introduzione del metodo di analisi enzimatico uniformerebbe inoltre i risultati dei
laboratori principali con i risultati già ora prodotti dalla Clinica di riabilitazione di Novaggio e
dagli Ospedali di zona di Acquarossa e Faido. In questi laboratori la determinazione della
creatinina viene effettuata con l’apparecchio Reflotron (chimica secca), già standardizzato
sulla creatinina enzimatica.
Prima di introdurre il nuovo metodo nei laboratori è comunque necessaria una sua
valutazione, in quanto sulla misura della creatinina e soprattutto della clearance della
creatinina sono basati i dosaggi di molti medicamenti.
L’obbiettivo principale è valutare la precisione e l’attendibilità del nuovo metodo, nonchè
l’impatto economico.
2.1. Strategia di realizzazione
Il confronto dei metodi, verrà eseguito su una sessantina di campioni di:

• siero/plasma;
• e urina.
Verranno determinate la creatinina sierica e la creatinina urinaria con entrambi i metodi,
utilizzando un analizzatore automatico Roche/Hitachi 912, presso il laboratorio
dell’Ospedale Civico di Lugano.
In seguito, con i dati del paziente, verrà calcolata la superficie corporea e la clearance.
I risultati delle misurazioni di creatinina plasmatica, urinaria e della clearance della

creatinina verranno analizzati statisticamente secondo i metodi di:
• Passing-Bablock;
• Deming;
• ed Altman e Bland.
Completerà il lavoro una stima dei costi del nuovo metodo.

8
3. MATERIALI E METODI
3.1. I campioni
Nel capitolo 1.3. vengono elencati i fattori che possono servire per determinare la
clearance, di seguito verrà descritta la fonte dell’informazione o il modo di raccolta.
L’altezza e il peso:
• Il medico, l’assistente o l’infermiere/a indicano sulla richiesta d’analisi l’altezza e il peso
del paziente, così che in laboratorio si può calcolare la superficie corporea.
L’età:
• La data di nascita è riportata automaticamente sull’etichetta del paziente che viene
attaccata alla richiesta e memorizzata nel programma LAB4003 del computer.
I campioni di siero/plasma:
• Non ci sono stati criteri di scelta particolari per la raccolta, la maggior parte dei campioni
aveva concentrazioni inferiori o superiori ai valori normali. I pazienti erano per lo più
adulti e anziani.
L’urina:
• L’urina è quella delle ventiquattro ore. I criteri di scelta sono gli stessi per i campioni
di siero/plasma.
Per la conservazione e la preparazione del materiale, ho cercato di seguire le indicazioni

riportate nelle metodiche originali “Crea Plus” e Crea”.
Siero Plasma Urina
Provetta con il tappo Provetta anticoagulata con Provetta grande, vuota per l’urina, senza
Provetta/prelievo giallo/marrone. litio eparina o sodio EDTA. conservanti.
2-8°C 2-8°C 2-8°C

(per la conservazione a (per la conservazione a (per la conservazione a lungo termine congelare).
Conservazione
lungo termine congelare). lungo termine congelare).
Stabilità 7 giorni. 7 giorni. 4 giorni.
Scelta dei 24 femmine e 30 maschi; 24 femmine e 30 maschi; 24 femmine e 30 maschi;

campioni
Le misurazioni dell’urina venivano effettuate una

La maggioranza dei volta a settimana, perciò poteva capitare che
Altro La maggioranza dei campioni ha concentrazione l’urina rimanesse uno, massimo due giorni in più
campioni ha concentrazione patologica, alta. in frigorifero.
patologica, alta. L’urina rimasta qualche giorno ferma, forma un
deposito sul fondo della provetta, per questo
motivo prima dell’esecuzione del test miscelare
bene.
Tabella 1, indicazioni principali dei campioni, della loro raccolta e della loro
3
LAB400: programma informatico in uso nei laboratori dell’ente ospedaliero per la registrazione delle analisi.
9
3.1.1. La raccolta delle urine
Quando si parla di urine delle ventiquattro ore, si tratta di una raccolta urinaria che dura
ventiquattro ore. Solitamente la raccolta inizia la mattina.
Per questo esame bisogna seguire una semplice procedura standard:
1. Identificare l’apposito contenitore per la raccolta con nome, cognome e data di

nascita;
2. In questo caso gettare la prima urina del mattino nel gabinetto;
3. Durante il resto della giornata e la notte, urinare invece nel contenitore;
4. Infine il mattino seguente, circa ventiquattro ore dopo la prima minzione, urinare per
l’ultima volta nel contenitore.
Durante la raccolta si possono effettuare degli errori:

- svuotamento incompleto della vescica;
- perdita di urine durante il processo (es: urinare nel gabinetto) o defecamento;
- comprendere la prima urina del mattino.
Ricordarsi di chiudere bene il contenitore di raccolta e di mantenerlo in posizione verticale,
onde evitare di perdere altro materiale e di compromettere il risultato, che diventerebbe
poco affidabile.
Una volta arrivato in laboratorio, il contenitore urinario verrà preso in consegna dalla
laboratorista o dal laboratorista, che prenderà nota della quantità di urina erogata e
proseguirà con la determinazione della creatinina.
Valori normali: Donna: 7000 – 14000 µmol/24h

Uomo: 9000 – 21000 µmol/24h (3)
Figura 4, provetta Figura 4 Figura 5, rack con alcune provette

per siero/plasma, Provetta per raccolte durante la settimana, OCL.
OCL. urina, OCL.
10
3.2. I controlli di qualità e la calibrazione
Nel laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano, i controlli di qualità interni per la creatinina
nel siero e nel plasma, sono eseguiti con:
- Multiqual 1 della Biorad (Francia);
- Multiqual 3 sempre della Biorad (Francia).
Invece nel Laboratorio dell’Ospedale San Giovanni con:

- Precinorm U della Roche Diagnostics GmbH (Germania, Mannheim)
Visto che i controlli possono essere differenti da laboratorio a laboratorio, ogni settimana,
eseguivo entrambi, sia Multiqual che Precinorm.
Per l’urina invece, il controllo di qualità usato è:

- Liquicheck 1, urine chemistry control della Biorad (Francia);
- Liquicheck 2, urine chemistry control della Biorad (Francia).
La calibrazione del metodo è stata eseguita utilizzando:

- C.f.a.s.4;
- Soluzione fisiologica (NaCl allo 0.9%) pronta all’uso.
3.3. Apparecchi
Hitachi 912
L’Ospedale Civico di Lugano, mi ha lasciato disporre di un analizzatore automatico

Roche-Hitachi 912 per effettuare tutte le misurazioni.
Principio di misurazione:
• Fotometrico.
Campioni utilizzati:
• Siero;
• plasma; Figura 6, analizzatore automatico Hitachi 912,
• urina. OCL.
Una breve descrizione dell’apparecchio la si può trovare negli allegati.
Prima di procedere con le misurazioni, è stato necessario programmare l’analisi del nuovo
metodo, in quanto sull’analizzatore era disponibile solo la determinazione secondo Jaffè.
4
C.f.a.s.: Calibrator for automated system.
11
2 3
2 3
4
1
1 4
Figura 7, mezzo informatico Figura 8, piatto1: campioni, CQ;

per la programmazione delle piatto2: cuvette; piatto 3 e 4: reattivi,
analisi, OCL. OCL.
Centrifuga Eppendorf 5804 R
Per la determinazione della creatinina nel siero e nel plasma, il campione deve essere
prima centrifugato.
Programmazione della centrifuga: (5)

- 3500 giri/minuto;
- 10 minuti.
Anche l’urina deve essere centrifugata prima della misurazione: (5)

- 2000 giri/minuto;
- 10 minuti.
Dopo che l’urina è stata centrifugata, decantare il sovranatante in un’altra provetta.
Figura 9, Centrifuge 5804R, Eppendorf,

OCL:
3.4. Analisi statistica

Il confronto tra i due metodi d’analisi è stato esaminato secondo un metodo parametrico
(regressione di Deming), un metodo non parametrico (regressione di Passing-Bablock) e
secondo il metodo di Altman e Bland, utilizzando il programma Analyse-it + Clinical
Laboratory 1.65, in uso presso EOLAB all’OSG (Ospedale San Giovanni) di Bellinzona.
Alcuni dettagli sui metodi d’analisi utilizzati.
12
3.5. Crea Plus (7)
Crea Plus (Creatinina Plus) della Roche è il metodo enzimatico scelto da EOLAB da
introdurre nella routine a scapito del metodo di Jaffè.
Finalità d’uso Test enzimatico in vitro per la determinazione quantitativa diretta della creatinina nel
siero, nel plasma e nell’urina umani, impiegando analizzatori di chimica clinica.
Sommario Il metodo enzimatico è basato sulla determinazione generalmente riconosciuta della

sarcosina dopo conversione della creatinina per mezzo della creatininasi e della
sarcosinossidasi. La perossidasi di idrogeno rilasciata viene misurata tramite una
reazione Trinder modificata. L’ottimizzazione del sistema tampone e dell’indicatore
colorimetrico permette une quantificazione sia precisa che specifica della
concentrazione di creatinina. I risultati di tale metodo sono ben correlati con quelli
ottenuti con l’HPLC.
Principio del test Test enzimatico colorimetrico:

1. Al campione viene aggiunto il reattivo 1 (R1), cosicché la creatina endogena
viene decomposta ed i sieri lipemici vengono chiarificati.
2. Aggiunta del reattivo 2 (R2) ed inizio della reazione.
3. La creatinina viene idrolizzata mediante l’azione della creatininasi,
diventando creatina.
4. La creatina viene idrolizzata mediante l’azione della creatinasi in sarcosina
ed urea.
5. La sarcosina, in presenza di ossigeno, viene convertita dalla
sarcosinossidasi in glicina, formaldeide e perossido di idrogeno.
6. Il perossido d’idrogeno rilasciato, produce con 4-aminofenazone e HTIB
(grazie all’effetto catalitico della perossidasi), un colorante chinoneiminico, la
cui intensità di colore è direttamente proporzionale alla concentrazione di
creatinina presente e viene misurata fotometricamente.
Reattivi Soluzioni pronte all’uso:

R1: tampone, creatinasi, sarcosinossidasi, ascorbato-ossidasi, detergenti,conservante.
R2: tampone, creatininasi, perossidasi, 4-aminofenazone, esacianoferrato di potassio,
detergente, conservante.
Conservazione:
- componenti delle confezioni integri a 2-8°C fino alla data di scadenza;
- aperti e refrigerati sullo strumento 28 giorni.
Campioni Siero, plasma e urina:

I campioni di urina vengono diluiti 1:11 (1+10) con acqua distillata o deionizzata o con
NaCl (0.9%).
Per le altre indicazioni vedere capitolo 3.1. “Materiali usati”.
Calibrazione Lineare a due punti con C.f.a.s.

Da eseguire ogni 28 giorni, a cambio del lotto o se richiesta dal procedimento del CQ.
Questo test è stato calibrato contro l’HPLC.
Controlli di qualità (CQ) Siero/plasma:

Precinorm U, Precinorm U plus, Precipath U, Precipath U plus, Multiqual 1 e 3.
Urina:
Liquicheck 1 e 2, Precinorm Albumin, Precipath Albumin.
Calcolo e fattori di conversione I fattori di conversione sono:

- mg/dl ∗ 88.4 = µmol/l;
- µmol/l ∗ 0.0113 = mg/dl.
Gli strumenti Roche/Hitachi effettuano il calcolo automatico della concentrazione
di creatinina di ciascun campione.
Interferenze Siero/plasma:
- L’ittero, l’emolisi, la lipemia e l’acido ascorbico non danno interferenze
significative;
- La dobutamina può provocare risultati falsamente bassi;
- Campioni emolizzati di neonati, di bambini o di adulti (HbF) o raramente
gammopatie monoclonali possono interferire con il test;
- Una stima della velocità di filtrazione glomerulare in base alla formula di
Schwartz può dare valori troppo alti.
Urina:
- L’ittero, l’emolisi, l’acido ascorbico, il glucosio e l’urobilinogeno non danno
interferenze significative;
Sensibilità analitica Limite di sensibilità inferiore

- Siero: 0.03 mg/dl (2.7 µmol/l)
- Urina: 0.3 mg/dl (27 µmol/l)
Tabella 2, descrizione del metodo Crea Plus (metodo enzimatico).
13
3.6. Crea (8)
Crea, anch’essa della Roche, è il metodo attualmente in uso presso tutti i laboratori
dell’ente ospedaliero.
Finalità d’uso Test cinetico in vitro con rate-blanking e compensazione, per la determinazione
quantitativa della creatinina nel siero, nel plasma e nell’urina umani, impiegando
analizzatori automatici di chimica clinica.
Sommario Il presente metodo è basato sulla reazione di Jaffè descritta da Popper et al. nonché
da Seelig e Wüst, e modificata da Bartels. Rispetto al metodo originario, questa
versione presenta una maggiore sensibilità e una migliore precisione.
Principio del test Test colorimetrico cinetico:

1. Al campione viene aggiunto il reattivo 1 (R1).
2. Aggiunta del reattivo 2 (R2) ed inizio della reazione.
3. In soluzione alcalina, la creatinina, con il picrato, forma un complesso di
colore giallo-arancine la cui intensità di colore è direttamente proporzionale
alla concentrazione di creatinina.
Reattivi Soluzioni pronte all’uso:

- R1: idrossido di sodio.
- R2: acido picrico.
Conservazione:
- componenti della confezione integri a 15-25°C fino alla data di scadenza.
- Aperti e refrigerati sullo strumento 56 giorni.
Campioni Siero, plasma e urina:

Per le indicazioni vedere capitolo 3.1. “Materiali usati”.
Calibrazione A due punti con C.f.a.s.

Da eseguire a cambio del lotto del reattivo e se richiesto dai procedimenti del CQ.
4
Questo metodo è stato standardizzato contro ID-MS .
Controlli di qualità (CQ) Siero/plasma:

Precinorm U, Precinorm U plus, Precipath U, Precipath U plus, Multiqual 1 e 3.
Urina:
Precinorm Albumin, Precipath Albumin, Liquicheck 1 e 2.
Calcolo e fattori di conversione I fattori di conversione:

- mg/dl ∗ 88.4 = µmol/l;
Introdurre il valore di correzione per la reazione proteica non specifica:
- per mg/dl → y = ax + b (a = 1.0, b = -0.3);
- per µmol/ → y = ax + b (a = 1.0, b = -26).
L’analizzatore effettua il calcolo automatico della concentrazione dell’analita.
Interferenze Siero/plasma:
- Ittero, emolisi, lipemia, acetone, acetoacetato e β-idrossibutirrato non danno
interferenze significative;
- Antibiotici contenenti cefalosporina provocano risultati falsamene positivi;
- In rari casi i bambini di età inferiore ai tre anni e anziani riportano valori
inferiori a 0.2 mg/dl;
- Non utilizzare campioni emolizzati di neonati, bambini o adulti con HbF >5%.
- Una stima della velocità di filtrazione glomerulare in base alla formula di
Schwartz può dare valori troppo alti.
Urina:
- Ittero, emolisi, glucosio e urobilinogeno non danno interferenze significative;
- Diversi farmaci di frequente impiego, non provocano interferenze.
Sensibilità analitica Limite di sensibilità inferiore:

- 0.2 mg/dl (18 µmol/l).
Tabella 3, descrizione del metodo Crea (metodo di Jaffè).
Per informazioni più dettagliate a riguardo dei due metodi, fare riferimento alla metodica
originale negli allegati.
4
ID-MS: spettrometria di massa a diluizione isotopica.
14
4. RISULTATI
4.1. Tabella delle misurazioni
Uomini:
CREA SIERICA CREA URINARIA CLEARANCE I° Determinazione
PZ. Vol. urine Sup. corporea Jaffé Plus Jaffé Plus Jaffé Plus crea siero crea urina clearance
050318-065 1300 1.85 314 331 3004 3232 8 8 301 3064 9
050211-067 3500 2.00 129 144 2236 2563 36 37 141 * *
050328-086 2300 1.74 272 283 3773 3943 22 22 274 3802 22
050213-065 800 1.61 72 71 2879 3361 24 28 76 3183 25
050213-053 785 2.28 170 202 3470 3997 8 8 179 3930 9
050211-116 850 1.53 183 220 2903 3246 11 10 195 2955 10
050325-069 1100 1.83 347 372 5829 5942 12 12 356 5830 12
050329-139 2980 1.92 77 64 5307 5283 129 154 75 5483 136
050329-213 1580 1.61 282 296 2126 2096 9 8 293 2060 8
050414-123 3300 1.63 120 110 2893 2838 59 63 119 2803 50
050415-055 1800 2.02 247 251 4477 4620 19 20 244 4537 20
050311-114 2900 1.94 304 349 3766 4222 22 22 309 * *
050307-224 2520 2.33 109 119 4114 4579 49 50 121 4258 46
050415-105 700 1.71 434 475 7644 7774 9 8 452 7640 8
050415-084 920 2.58 93 82 20296 21503 93 112 92 20424 95
050414-171 2250 2.00 76 62 6424 6431 114 140 72 6270 118
050314-057 1200 1.86 133 125 5003 5290 29 33 136 5381 31
050316-154 1800 1.93 235 236 2475 2465 12 12 245 2562 12
050315-236 1485 1.88 102 89 4906 5054 46 54 96 4886 48
050316-162 2100 2.09 186 197 6586 6902 43 42 200 6807 41
050316-165 1400 2.18 74 65 10363 10273 108 122 72 10228 110
050316-160 2200 2.07 150 150 5579 5799 47 49 159 5763 46
050318-044 3195 1.98 51 39 2407 2341 91 116 48 2307 93
050320-083 600 1.59 102 89 4998 5328 22 27 100 5228 24
050321-145 1900 1.75 140 136 4396 4603 41 44 140 4338 41
050321-176 2100 2.03 218 233 4468 4800 25 26 226 4740 26
050323-187 2100 2.37 149 153 3065 3066 22 21 153 2987 21
050323-074 980 1.92 147 154 6677 6974 28 28 156 6676 26
050323-176b 2900 1.98 153 158 5057 5063 58 56 154 4857 55
050324-166 1880 2.07 216 221 4686 4674 24 23 217 4365 22
Tabella 4a, misurazioni di 30 pazienti maschi. Tabella 4b
* Mancano i dati.
I dati nella tabella 4a, si riferiscono alle misurazioni per il confronto dei due metodi, invece
i dati riportati nella tabella 4b, fanno riferimento alle misurazioni effettuate dal laboratorio
all’arrivo del campione.
15
Donne:
CREA SIERICA CREA URINARIA CLEARANCE I° Determinazione
PZ. Vol. urine Sup. corporea Jaffé Plus Jaffé Plus Jaffé Plus crea siero crea urina clearance
050217-133 1820 1.50 71 68 3629 4125 75 88 69 3753 78
050217-073 4700 1.72 297 336 1508 1746 17 17 301 1655 18
050311-054 2800 1.94 163 178 1338 1444 14 14 168 1278 13
050309-055 1400 1.94 153 165 1301 1392 7 7 155 1322 7
050310-038 1900 1.94 171 187 1045 1164 7 7 164 1040 7
050315-137 2350 1.76 66 63 3894 4030 95 103 69 3998 93
050315-058 2000 1.9 210 204 2443 2559 15 16 215 2504 15
050316-132 2660 1.75 134 137 4265 4466 58 60 142 4595 59
050318-055 1200 1.63 74 66 7257 7577 87 102 72 7045 87
050318-127 3000 1.67 202 166 2255 2068 24 27 210 2246 23
050321-127 1200 1.62 102 106 4064 4185 35 35 112 4098 33
050322-106 1400 1.57 75 61 5358 5552 77 98 78 5329 73
050322-128 1800 1.51 76 74 4027 4194 76 81 79 4126 75
050324-135 1800 1.33 107 99 1871 1874 28 31 103 1851 29
050324-083 600 1.52 260 266 5637 5641 10 10 274 5549 10
050324-142 1150 1.67 76 66 8354 8473 91 106 77 8192 88
050324-030 515 1.73 122 120 10034 10391 29 31 12h 123 9834 29
050324-123 2200 1.81 115 113 3891 4062 49 52 116 3861 49
050329-108 400 1.52 257 257 8907 9535 11 12 256 9374 12
050414-148 1050 1.63 77 62 4418 4548 44 57 78 4324 43
050415-095 400 1.87 146 140 13911 14184 24 26 12h 143 14020 25
050411-046 1510 1.76 89 84 2265 2136 26 26 90 2194 25
050413-094 2000 1.62 98 90 3661 3582 55 59 108 3512 48
050413-091 1700 1.93 66 57 4965 4705 80 87 79 4910 66
Tabella 5a, misurazioni di 24 pazienti donna. Tabella 5b
Anche per i pazienti donne, il confronto è stato eseguito con i dati della tabella 5a. nella
tabella 5b, sono stati riportati i dati della prima determinazione del laboratorio.
16
4.2. Precisione dei metodi
L’imprecisione delle analisi è stata calcolata dal coefficiente di variazione (Deviazione

standard x 100/ media dei risultati) ottenuto sui controlli di qualità forniti dalla ditta.
I controlli sono stati effettuati in giorni successivi. È stato quindi determinato il coefficiente
di variazione interassay.
Metodo enzimatico:
Materiale Controllo di qualità N Media CV%5
Siero/plasma Multiqual 1 7 59 2.11
Multiqual 3 7 543 0.59
Precinorm U 7 91 2.93
Urina Liquicheck 1 7 7294 4.4
Liquicheck 2 7 13569 4.59
Metodo di Jaffé:
Materiale Controllo di qualità N Media CV%
Siero/plasma Multiqual 1 7 72 2.6
Multiqual 3 7 508 1.99
Precinorm U 7 101 1.32
Urina Liquicheck 1 7 8162 2.32
Liquicheck 2 7 17828 2.86
Tutti i coefficienti di variazione sono inferiori al 5%, entrambi i metodi sono quindi da
considerare precisi.
4.3. Confronto dei metodi
Di seguito verranno mostrati i risultati statistici ottenuti, con un piccolo commento di

spiegazione.
5
CV%: Coefficiente di Variazione, espresso in percentuale.
17
4.3.1. Confronto della creatinina sierica
Test Bias plots
CREA SIERICA: Jaffé v Plus
Performed by LABDER Date 2 maggio 2005
n 54
Bias 2.759
95% CI -1.577to 7.095
95% limits of agreement 95% CI
Lower -28.377 -35.619to -21.136
Upper 33.896 26.655to 41.137
500 Identity line A=B

450 20
Difference between methods

400 15
CREA SIERICA - Plus
350 10
5
300
0 Zero bias
250
(%)
-5
200 -10
150 -15
100 -20
-25
50
-30
0
0 200 400
0 100 200 300 400 500
Mean of CREA SIERICA
CREASIERICA- Jaffé
Figura 10 Figura 11
50
40
30
20
10
0 Zero bias
-10
-20
-30
-40
0 200 400
0 10 20 30
Figura 12 Figura 13
Le figure mostrano il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo di Altman-

Bland.
Dalle figure si nota come il metodo enzimatico (Plus) tenda a sottostimare leggermente la
misura per i valori di creatinina inferiori a 100µmol/L, mentre la sovrastima leggermente
per i valori superiori.
18
Test Passing & Bablock method conversion
n 54
Coefficient 95% CI
Intercept -18.808 -23.500to -14.470
Slope 1.133 1.099to 1.176
Cusum test for linearity - p > 0.1
500
450
La figura mostra il confronto tra le due
400
determinazioni secondo il metodo non
CREA SIERICA - Plus
350 parametrico di Passing-Bablock.

300
250 La regressione tra il metodo di Jaffé (x) e il

200
metodo enzimatico (y) è riprodotta
nell’equazione y= 1.13x – 18.8.
150
100
50 y = 1.1329x - 18.808
0
50 150 250 350 450
CREA SIERICA - Jaffé
Figura 14
Test Deming regression

n 54
Imprecision SD 1.0000 1.0000
Variance ratio 1.0000
Coefficient SE 95% CI
Intercept -18.5889 3.4218 -25.4552to -11.7225
Slope 1.1358 0.0192 1.0973to 1.1742
500
450
400
CREA SIERICA - Plus
350 La figura mostra il confronto tra le due

300 determinazioni secondo il metodo
250 parametrico di Deming.
200
150
La regressione tra il metodo di Jaffé (x)
e il metodo enzimatico (y) è riprodotta
100
nell’equazione y= 1.13x -18.6.
50 y = 1.1358x - 18.589
0
50 150 250 350 450
Figura 15
19
4.3.2. Confronto della creatinina urinaria
Test Bias plots
CREA URINARIA: Jaffé v Plus
n 54
Bias 181.296
95% CI 116.736to 245.856
Lower -282.293 -390.109to -174.477
Upper 644.885 537.070to 752.701
25000 Identity line

20
A=B
Difference between methods (%)

15
CREA URINARIA - Plus
20000
10
15000
5
10000
0 Zero bias
5000 -5
0 -10
0 5000 10000 15000 20000 25000 0 10000 20000
CREA URINARIA - Jaffé Mean of CREA URINARIA
Figura 16 Figura 17
1400
1200
1000
800
600
400
200
0 Zero bias
-200
-400
0 10000 20000
0 10 20 30 40
Mean of CREA URINARIA
Figura 18 Figura 19
I le figure mostrano il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo di Altman-

Bland.
Dalle figure si nota come il metodo enzimatico tenda a sovrastimare leggermente la
misura (bias di 181 µmol/L).
20
n 54
Coefficient 95% CI
Intercept 57.970 -52.793to 141.378
Slope 1.025 1.001to 1.049
25000
20000
La figura mostra il confronto tra le
due determinazioni secondo il

15000 metodo non parametrico di Passing-
Bablock.
10000
La regressione tra il metodo di Jaffé
(x) e il metodo enzimatico (y) è
5000 riprodotta nell’equazione
y = 1.0254x + 57.97 y= 1.025x + 57.9.
0
0 5000 10000 15000 20000
CREA URINARIA - Jaffé
Figura 20

n 54
Intercept -7.2837 50.4538 -108.5266to 93.9592
Slope 1.0389 0.0086 1.0215to 1.0562
25000
20000 La figura mostra il confronto tra le


15000 metodo parametrico di Deming.

10000
(x) e il metodo enzimatico (y) è
riprodotta nell’equazione
5000 y= 1.04x – 7.28.
y = 1.0389x - 7.2837
0
0 5000 10000 15000 20000
Figura 21
21
4.3.3. Confronto della clearance
Test Bias plots
CLEARANCE: Jaffé v Plus
n 54
Bias 4.7
95% CI 2.6to 6.7
Lower -9.9 -13.3to -6.5
Upper 19.2 15.8to 22.6
160 Identity line 25

A=B
140 20
CLEARANCE - Plus
120
15
100
10
80
5
60
40 0 Zero bias
20 -5
0 -10
0 50 100 150 0 50 100 150
CLEARANCE - Jaffé Mean of CLEARANCE
Figura 22 Figura 23
30
25
20
15
10
0 Zero bias
-5
-10
0 50 100 150 0 10 20 30 40
Mean of CLEARANCE
Figura 24 Figura 25
Le figure mostrano il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo di Altman-

Bland.
Dalle figure si nota come il metodo enzimatico tenda a sovrastimare leggermente la
misura per valori di clearance superiori a 50 ml/min.
22
n 54
Coefficient 95% CI
Intercept -1.762 -2.914to -1.149
Slope 1.130 1.092to 1.192
Cusum test for linearity - p 0.01 > p < 0.05 (non-linear relationship between X and Y detected)
160
140
120 due determinazione secondo il
CLEARANCE - Plus
100 metodo di Passing-Bablock.
80 La leggere sovrastima descritta in

60
precedenza è confermata da questo
grafico. La regressione tra i due
40 metodi è riprodotta nell’equazione
20
y= 1.13x – 1.76.
y = 1.1303x - 1.7619
0
0 50 100
CLEARANCE - Jaffé
Figura 26

n 54
Intercept -3.9106 0.8996 -5.7158to -2.1053
Slope 1.2050 0.0172 1.1705to 1.2395
160
140
120
CLEARANCE - Plus
100 metodo parametrico di Deming.

80
60 (x) e il metodo enzimatico (y) è
riprodotta nell’equazione
40
y= 1.20x – 3.91.
20 y = 1.205x - 3.9106
0
0 50 100
CLEARANCE - Jaffé
Figura 27
23
5. DISCUSSIONE
La creatinina e rispettivamente la sua clearance sono tra le analisi maggiormente richieste

in ambito ospedaliero. Oltre al monitoraggio della funzione renale, molti medicamenti
vengono dosati in base alla clearance della creatinina (per esempio i citostatici).
La misura precisa di questo parametro è quindi estremamente importante.
Il metodo di riferimento internazionale (“gold standard”) per la determinazione della

creatinina è l’HPLC, preciso ed affidabile, ma inadatto ad un impiego in laboratori di
routine in quanto lento, costoso e di difficile automazione.
I metodi utilizzati normalmente negli ospedali sono il metodo secondo Jaffé oppure il
metodo enzimatico.
La determinazione secondo Jaffé è un metodo largamente diffuso in quanto molto

economico. È però sensibile all’interferenza delle cosiddette pseudocreatinine (acetone,
piruvato, glucosio, fruttosio, acido urico, acido ascorbico, cefalosporine, ecc.) che possono
causare una sovrastima del risultato di 20-30 µmol/l.
Il metodo enzimatico è insensibile alle pseudocreatinine e fornisce risultati equivalenti al
metodo di riferimento internazionale. Per questo motivo è sempre più diffuso, anche se
piuttosto costoso.
Lo scopo del lavoro di diploma era di valutare l’eventuale sostituzione del metodo di
determinazione della creatinina secondo Jaffé con il metodo enzimatico dal punto di vista
qualitativo ed economico.
Per quanto riguarda la precisione, i due metodi si sono dimostrati buoni e sostanzialmente
equivalenti. Il coefficiente di variazione per tutte le analisi è inferiore al 5%.
I valori trovati rispecchiano le dichiarazioni fornite dal produttore.
Il confronto metodi è stato eseguito secondo un metodo parametrico (Deming) e secondo

un metodo non parametrico (Passing-Bablock). I risultati del confronto sono inoltre stati
rappresentati secondo il metodo di Altman e Bland che fornisce un’idea immediata delle
differenze tra i 2 metodi a seconda del valore di misura. Un metodo di confronto
parametrico è più sensibile (meno robusto) di un metodo di confronto non parametrico a
singole misure molto discrepanti.
Il confronto metodi mostra che la determinazione della creatinina nel siero è leggermente
sottostimata a valori bassi e leggermente sovrastimata a valori alti. Questo risultato non
sorprende in quanto l’incidenza delle cosiddette pseudocreatinine (di ca 20-30 µmol/l
secondo il produttore del test) è superiore a valori bassi.
Diverso è il discorso per quel che riguarda la creatinina nell’urina, dove sostanzialmente i
due metodi si dimostrano equivalenti: il bias di 181 è infatti trascurabile rispetto agli usuali
valori di creatinina urinaria.
Per quanto riguardano le misure di clearance, il metodo enzimatico tende a sovrastimare

leggermente i pazienti con clearance superiore a 50, mentre al di sotto di questo valore le
misure possono essere considerate identiche.
In sostanza si può affermare che, dal punto di vista qualitativo, l’introduzione del nuovo
metodo non dovrebbe porre alcun problema, permetterebbe anzi ai laboratori dell’EOC di
dare risultati perfettamente allineati agli standard internazionali.
24
In vista della possibile introduzione del nuovo metodo, i clinici devono comunque essere
informati della leggera sottostima del nuovo metodo a valori bassi di creatinina plasmatica.
Questi valori, osservati principalmente nei reparti di pediatria e oncologia, possono portare
a calcoli della clearance leggermente differenti nel caso quest’ultima sia calcolata a partire
unicamente dalla creatinina plasmatica/sierica.
6. COSTI
I costi dei due metodi di analisi sono stati stimati confrontando il prezzo di listino tra la
determinazione della creatinina secondo Jaffé e la determinazione enzimatica.
Il prezzo unitario di un Kit di analisi adatto a circa 2000 determinazioni è di 251.80 CHF.
per quanto riguarda la creatinina secondo Jaffé e di 1334.20 CHF. per quanto riguarda la
creatinina enzimatica.
La creatinina enzimatica è quindi 5.3 volte più costosa.
Durante tutto il 2004, sono state determinate presso l’EOC 116949 creatinine secondo
Jaffé, spendendo 3168.40 CHF. in reagenti, calibrazioni, controlli e ripetizioni compresi.
Poichè l’incidenza di calibrazioni, controlli e ripetizioni sarebbe stata simile utilizzando il
metodo enzimatico, si può ipotizzare una spesa annuale di 3168.4 * 5.3 = 16792.5 CHF.
L’introduzione della determinazione enzimatica della creatinina in tutti i laboratori dell’EOC

comporterebbe quindi una spesa in reagenti superiore di 16792.5 - 3168.4 =
13624.1 CHF. all’anno.
25
7. CONCLUSIONI
Il metodo enzimatico per la determinazione della creatinina è preciso, accurato, e

permetterebbe di avere risultati perfettamente allineati agli standard internazionali.
Questo punto è particolarmente importante in quanto sempre più spesso vengono condotti
studi clinici a livello internazionale cui partecipano medici dell’EOC.
I laboratori devono comunque calcolare un aumento dei costi per reagenti annuale di circa
14000 Fr.
Dal punto di vista qualitativo, il nuovo test potrebbe quindi essere introdotto subito.
26
8. BIBLIOGRAFIA
Dispense:
(2) Dispense consegnate dal docente di chimica clinica G. Togni; 2004-2005.
Referenze incluse.
(4) Dispense consegnate dal responsabile del lavoro R. della Bruna; 2005.
Referenze incluse.
(5) SOP del laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano.
Letteratura:
(6) “Introduzione pratica alla cromatografia in fase liquida (HPLC), R. W. Yost, L. S. Ettre,
R. D. Colon. Seconda edizione riveduta e aggiornata da S. Gallo; 2003.
(10) “Labor und Diagnose”, L. Thomas. Fünfte Auflage, TH-Books Verlagsgesellschaft
mbH; 1998.
Metodiche:
(7) Metodica originale Crea Plus della ditta Roche Diagnostics.
(8) Metodica originale Crea della ditta Roche Diagnostics.
Internet:
(1) www.sportmedicina.com/creatina.htm
(3) www.eoc.ch/vademecum_eolab.pdf
(9) www.roche-diagnostics.it
Figure:
L’immagine in copertina è presa da: www.sportsonly.com
Figura 1 e 2: www.scienceandsociety.co.uk
Figura 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9: le foto sono state fatte dall’autrice del lavoro.
27
9. RINGRAZIAMENTI
I miei ringraziamenti vanno a coloro che mi hanno permesso e mi hanno aiutato a

svolgere il lavoro.
La prima persona che ringrazio è il Dr. Damiano Castelli, che mi ha dato l’opportunità di
svolgere questo lavoro.
Roberto della Bruna, responsabile, che mi ha seguito durante il lavoro e mi ha aiutato

nell’analisi statistica.
Marcello Niosi, capo laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano, che mi ha concesso l’uso
degli apparecchi e del laboratorio per le misurazioni.
Le laboratoriste dell’OCL per la loro disponibilità.
Andrea Boffini, docente di metodologia, per averci indicato la strada nello svolgere il lavoro
e per aver risposto alle nostre domande.
Francesco Bezzola, docente di informatica e statistica, che ci ha introdotto nel mondo

della statistica e che ci ha aiutato ad ampliare le nostre conoscenze informatiche.
Susan Gilbert, docente di inglese, per aver corretto l’abstract (riassunto).
La mia famiglia e Felice, che hanno sopportato i momenti di nervosismo avuti durante lo
svolgimento del lavoro.
Infine me stessa, perché sono riuscita a svolgere e a gestire il lavoro con impegno,
arrivando fino alla fine.
A tutti loro dico grazie!
Valentina Galiani
28
ALLEGATO 1
L’HPLC
L’HPLC, ovvero la cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (risoluzione).
La cromatografia è essenzialmente una tecnica di separazione e come tale, è forse la
migliore oggi disponibile.
L’obiettivo della maggior parte delle indagini cromatografiche è quello di analizzare il

campione. La determinazione di quali o quanti componenti sono presenti nel campione,
viene detta analisi qualitativa; mentre la determinazione della quantità di alcuni o di tutti i
componenti presenti, viene detta analisi quantitativa.
Tutta via essa è un metodo “cieco”. Essa indica la presenza di una sostanza senza dire
quale essa sia, e da luogo ad un segnale che può essere messo in relazione con la
quantità presente senza rilevarne effettivamente l’identità.
Lo schema che segue presenta lo schema funzionale di un sistema per cromatografia in

fase liquida.
Contenitore della
fase mobile
Pompa
Filtro
Manometro
Iniettore
Colonna
Registratore Rivelatore Calcolatore
Collettore di frazione
Come si può vedere, i componenti fondamentali di tale sistema sono:

- una pompa che regola e mantiene il flusso della fase mobile;
- un dispositivo per l’introduzione del campione;
- una colonna contenente la fase stazionaria ed un rivelatore per evidenziare,
mediante, opportuni segnali elettrici, i componenti separati dalla colonna.
29
Il ciclo analitico della cromatografia consiste nel trasporto delle sostanze contenute nel
campione attraverso il letto di fase stazionaria mediante la fase mobile. Durante questo
percorso le singole sostanze vengono rallentate dalla fase stazionaria in funzione delle
interazioni che si generano tra i componenti del campione, la fase mobile e la fase
stazionaria stessa. Questo rallentamento è selettivo, ciò significa che con un dato sistema
di fasi mobili e stazionarie, l’entità del rallentamento sarà differente per ogni componente
del campione.
La valutazione qualitativa e quantitativa dei risultati viene eseguita registrando
semplicemente la risposta del rivelatore sottoforma di cromatogramma (una curva di
risposta in funzione del tempo) ed elaborando i dati con opportuni sistemi computerizzati.
Quanta più luce viene assorbita o deflessa dalle sostanze che passano nella cella del
rivelatore, tanto più forte sarà il segnale.
I singoli componenti separati nella colonna possono essere inoltre facilmente raccolti per
effettuare l’identificazione con altre tecniche analitiche, preparare standard ad elevata
purezza o per altri impieghi.
Nell’analisi cromatografia lo scopo è sempre quello di determinare la composizione del

campione originale, e si assume che i picchi che appaiono sul cromatogramma si
riferiscano ai singoli costituenti del campione.
Tuttavia questo non è sempre vero, ed alcune volte possono apparire nel cromatogramma
anche picchi artefatti, cioè non presenti nel campione originale. Tali picchi artefatti
possono avere origini diverse.
Una fonte primaria di picchi artefatti è il materiale proveniente da campioni analizzati in
precedenza, che può essere stato adsorbito (ritenuto) sulla colonna o nel sistema di
iniezione. Altri artefatti provengono da molti campioni in cui sono contenuti, in tracce,
impurità di cui l’analista non è al corrente. Un’altra fonte di picchi artefatti può essere
ricercata in sostanze fuoriuscite in qualche punto del sistema; il più probabile di tali punti è
il raccordo tra la colonna e l’iniettore, oppure l’iniettore stesso. (6)
30
ALLEGATO 2
ROCHE/HITACHI 912
L’Hitachi 912 è un analizzatore automatico di chimica clinica.

La sua produttività è ideale per esami di routine ed esami speciali, è predisposto per
l’esecuzione di analisi di chimica clinica, di elettroliti, di proteine specifiche, dosaggi di
droghe e monitoraggio di farmaci.
È un analizzatore automatico di facile utilizzo, composto da un sistema analitico con

un’unità di gestione e controllo separata (PC Pentium, tastiera alfanumerica, video e
stampante).
L’analizzatore, cioè la parte dove avvengono le analisi è suddiviso in 4 piatti o rotori:

- un piatto per la gestione dei campioni, delle urgenze, dei controlli e delle
calibrazioni;
- due piatti per i reagenti;
- un piatto di reazione.
Per la lettura delle reazioni, l’Hitachi 912 è disposto di uno spettrofotometro con diverse
lunghezze d’onda.
Il principio fotometrico (spettrofotometrico):

Una luce policromatica emessa da una sorgente è resa monocromatica passando
attraverso un selettore di lunghezze d’onda (λ). Il raggio reso monocromatico attraversa la
soluzione contenuta in una cella di misurazione (cuvetta) e viene parzialmente assorbito. Il
raggio non assorbito colpisce una fotocellula che trasforma in corrente elettrica l’energia
luminosa del raggio incidente su di essa.
Altre particolarità sul sistema e caratteristiche tecniche:

- prediluizione automatica;
- accesso 24h/24;
- reagenti liquidi e pronti all’uso;
- 50 posizioni per routine e 20posizioni per urgenze;
- 17 posizioni per calibratori e otto posizioni per controlli;
- identificazione dei campioni e dei reagenti tramite barcone;
- rotori porta-reagenti refrigerati;
- 120 cuvette lavabili. (9)
31
ALLEGATO 3
32
33
34
35
ALLEGATO 4
36
37
38
39
ALLEGATO 5
analysed with: Analyse-it + Clinical Laboratory 1.65
Test Bias plots

n 54
Bias 2.759
95% CI -1.577to 7.095

Lower -28.377 -35.619to -21.136
Upper 33.896 26.655to 41.137
500 Identity line
A =B
450
400
CREA SIERICA - Plus
350
300
250
200
150
100
50
0
0 200 400
50
40
30
20
10
0 Zero bias
-10
-20
-30
-40
0 200 400 0 10 20 30
40
20
Difference between methods (%) 15
10
5
0 Zero bias
-5
-10
-15
-20
-25
-30
0 200 400
41
Test Passing & Bablok method conversion

n 54
Coefficient 95% CI
Intercept -18.808 -23.500to -14.470
Slope 1.133 1.099to 1.176
500
450
400
CREA SIERICA - Plus
350
300
250
200
150
100
50 y = 1.1329x - 18.808
0
50 150 250 350 450
20
10
Residuals
-10
-20
-30
0 10 20 30 40 50
Running no.
42
7
5
3
Cusum
1
-1
-3
-5
-7
0 10 20 30 40 50
Running no.
43

n 54

Intercept -18.5889 3.4218 -25.4552to -11.7225
Slope 1.1358 0.0192 1.0973to 1.1742
500
450
400
CREA SIERICA - Plus
350
300
250
200
150
100
50 y = 1.1358x - 18.589
0
50 150 250 350 450
1
Standardized residual
-1
-2
-3
-4
50 150 250 350 450
Estim ate of True Value
44
Test Bias plots

n 54
Bias 181.296
95% CI 116.736to 245.856

Lower -282.293 -390.109to -174.477
Upper 644.885 537.070to 752.701
25000 Identity line
A =B
20000
15000
10000
5000
0
0 5000 10000 15000 20000 25000
1400
1200
1000
800
600
400
200
0 Zero bias
-200
-400
0 5000 10000 15000 20000 25000 0 10 20 30 40
45
20

15
10
0 Zero bias
-5
-10
0 10000 20000
46

n 54
Coefficient 95% CI
Intercept 57.970 -52.793to 141.378
Slope 1.025 1.001to 1.049
25000
20000
15000
10000
5000
y = 1.0254x + 57.97
0
0 5000 10000 15000 20000
500
400
300
200
Residuals
100
-100
-200
-300
-400
0 10 20 30 40 50
Running no.
47
6
2
Cusum
-2
-4
-6
0 10 20 30 40 50
Running no.
48

n 54

Intercept -7.2837 50.4538 -108.5266to 93.9592
Slope 1.0389 0.0086 1.0215to 1.0562
25000
20000
15000
10000
5000
y = 1.0389x - 7.2837
0
0 5000 10000 15000 20000
2.5
1.5
1
0.5
-0.5
-1
-1.5
-2
-2.5
0 5000 10000 15000 20000
49
Test Bias plots

n 54
Bias 4.7
95% CI 2.6to 6.7

Lower -9.9 -13.3to -6.5
Upper 19.2 15.8to 22.6
160 Identity line
A =B
140
120
CLEARANCE - Plus
100
80
60
40
20
0
0 50 100 150
CLEARANCE - Jaffé
30
25
20
15
10
0 Zero bias
-5
-10
0 50 100 150 0 10 20 30 40
Mean of CLEARANCE
50
25
20
15
10
0 Zero bias
-5
-10
0 50 100 150
Mean of CLEARANCE
51

n 54
Coefficient 95% CI
Intercept -1.762 -2.914to -1.149
Slope 1.130 1.092to 1.192
Cusum test for linearity - p 0.01 > p < 0.05 (non-linear relationship between X and Y detected)
160
140
120
CLEARANCE - Plus
100
80
60
40
20
y = 1.1303x - 1.7619
0
0 50 100
CLEARANCE - Jaffé
10
4
Residuals
-2
-4
-6
0 10 20 30 40 50
Running no.
52
9
7
5
3
Cusum
1
-1
-3
-5
-7
-9
0 10 20 30 40 50
Running no.
53

n 54

Intercept -3.9106 0.8996 -5.7158to -2.1053
Slope 1.2050 0.0172 1.1705to 1.2395
160
140
120
CLEARANCE - Plus
100
80
60
40
20
y = 1.205x - 3.9106
0
0 50 100
CLEARANCE - Jaffé
2.5
1.5
0.5
-0.5
-1.5
-2.5
0 50 100
54

Jaffe Vs Enzimatico

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SSMT

Valentina Galiani, 3LM

Responsabile, Dr. Roberto della Bruna

2. Obbiettivi del lavoro e strategia di realizzazione………………………………….. 8

3. Materiali e metodi……………………………………………………………………. 9-14

1.1 Alcuni cenni storici sulla creatina e sulla creatinina

1886 Jaffè descrive il metodo per determinare la creatinina.

1927 I ricercatori Fiske e Subbarow scoprirono l’esistenza della fosfocreatina (o

Contenuta essenzialmente nei muscoli e deriva dalla creatina e dal creatinfosfato.

Valori normali: Donna: 44 – 80 µmol/l

1.3. La clearance della creatinina

La clearance della creatinina permette di stimare in modo abbastanza preciso il volume di

La formula attualmente usata nei laboratori dell’Ente Ospedaliero Cantonale, in ml/min, è

creatinina urinaria in µmol/l ∗ volume urinario 1.73

creatina urinaria in µmol/l ∗ volume urinario ∗ 1.73

Formula di Cockroft-Gault, in ml/min: (4)

[(140-età) ∗ peso in Kg ∗ 0.85] (140-età) ∗ peso in Kg

[(140-età) ∗ peso in Kg ∗ 0.85 [(140-età) ∗ peso in Kg

C (ml/min./1.73 m2) = 48.7 ∗ lunghezza corporea in cm

Creatinine Clearance Predictor Body Surface Area

Figura 3, indicatore della Abbott

Altrimenti per chi volesse, esistono anche formule matematiche.

Formula secondo DuBois e DuBois: (2)

= peso0.425 ∗ altezza0.725 ∗ 71.84

Formula secondo Mosteller, in m2: (2)

Valori normali: 17-151 ml/min (3)

1.4. Interpretazione clinica

→ Ridotta filtrazione glomerulare: insufficienza renale acuta;

→ Liberazione di creatinina dai muscoli: traumi;

→ Medicamenti: sali di litio, di mercurio e di tallio;

→ Altre malattie: leucemie acute;

Diminuzioni della creatinina

→ Non è di rilevanza clinica.

→ Si riscontra in gravidanza, durante il primo e secondo trimestre. (2)

Generalmente la determinazione della creatinina in siero/plasma e urina avviene secondo

Il metodo secondo Jaffé:

Il metodo enzimatico colorimetrico:

I laboratori dell’Ente Ospedaliero Cantonale determinano attualmente la creatinina

Per soddisfare le nuove norme internazionali, le ditte produttrici di reagenti propongono di

Per questo motivo i laboratori dell’ente ospedaliero (EOLAB), intendono valutare la

2.1. Strategia di realizzazione

Il confronto dei metodi, verrà eseguito su una sessantina di campioni di:

I risultati delle misurazioni di creatinina plasmatica, urinaria e della clearance della

Completerà il lavoro una stima dei costi del nuovo metodo.

Per la conservazione e la preparazione del materiale, ho cercato di seguire le indicazioni

Siero Plasma Urina

2-8°C 2-8°C 2-8°C

Stabilità 7 giorni. 7 giorni. 4 giorni.

Scelta dei 24 femmine e 30 maschi; 24 femmine e 30 maschi; 24 femmine e 30 maschi;

Le misurazioni dell’urina venivano effettuate una

1. Identificare l’apposito contenitore per la raccolta con nome, cognome e data di

Durante la raccolta si possono effettuare degli errori:

Valori normali: Donna: 7000 – 14000 µmol/24h

Figura 4, provetta Figura 4 Figura 5, rack con alcune provette

Invece nel Laboratorio dell’Ospedale San Giovanni con:

Per l’urina invece, il controllo di qualità usato è:

La calibrazione del metodo è stata eseguita utilizzando:

L’Ospedale Civico di Lugano, mi ha lasciato disporre di un analizzatore automatico

Una breve descrizione dell’apparecchio la si può trovare negli allegati.

Figura 7, mezzo informatico Figura 8, piatto1: campioni, CQ;

Centrifuga Eppendorf 5804 R

Programmazione della centrifuga: (5)

Anche l’urina deve essere centrifugata prima della misurazione: (5)