cura di Keith Wilson

John Walker

Biochimica e
biologia molecolare
crac i~ tecniche

. Nh~và e·dizion ,· · r:,à

. a~cura di· Mirel ···-
.Lòredanò·~Ét
e.h
'iii,rr· .~ . i o..
·.--s .
• I' •· ' ...._ -_, ~

Rtgfoello
Corti11a
Editore
Biochimica e biologia molecolare
 1U'a di
ith Wilson e John M.Walker

iochiinica
biologia tnolecolare
·ncipi e tecniche
Sesta edizione

Edizione italiana a cura di

Mirella S. Pilone e Loredano Pollegioni

~l¼fàelloCorti!la Editore
Tuduziont
Indice
w,g• ùlzobt
Piol~;(ltt acon trJIIO

G,anluca Molb
RJCtfOIIOlt di 810(hm1K•

LuoJno Piubdh
Rl(t'ftltorc J, B1odum1u

Um\'ffllUd~• ~,ud.idcll'lnsul>ru \'amt

www.ralJadlooorttnLII XIX

XXI

XXII

Principi di ba~
K. Wibon (par. 1.7 in coll~boruione con J Fyj[()
Studi b1och1m10 I
I II Glt ..:op, della ncnca b1och1ml<a I
I 1.2 l.l progcttaz1onr dcll"md.agmc b10<h1m1,1 2
Unità d1 mi,ura 3
12 I Unità SI 3
1.2 2 Sohutonr come s, tspnmr b concentrazione 3
I 2 3 C..,ncrntru1onc o 1111,,11! 7
Elcttrohu dcboh 9
I 3.1 lmport•nu b1exh11mca Jcgh dettrolin Jeboh 9
1.3.2 lomu.monr J, md, < l>a,1 dcboh IO

Soluz1om t.mponc: .omposmonc e prcparaltonc 13

1.4 I Cur\'e d1 taratura 13
IA 2 fquarionc d, Hrndmon-Ha~lbalch 15
I43 Capac,t.1 umponc 16
I 44 P~r.u,onc d, -.olu11om tampone 16

J.S Elcurodi a pH e a o,s1geno 18

I SI fJrttroJ, d, nfer,mcnto 18
1.5 2 Hrttrodo a pH r •hn dcnroJ, 1ono.ck111vi 21
I53 flcurodo a o~s,geno 24
I 54 5tud, dc11nxh1m1u di 11ngole ~llulc 27
Titoloongm~
Prumpln and Tw,111qua ofB,ochrm trrdnd Molaular BtolOfY 1.6 Misure b1och1mrchc quantitative ~7
S:xtb cd11ton O (..;ambndgc Um>'Cl'Ut Pie-< umbndgc 2005 1.6.1 C-Ons1derai,om .inah11,hc cd cnon spcnmcnwh 27
Ib 2 Valuwmnc delle prcsta11om dr un metodo ~nalnico 30
Rc2h 0Jl1one ed1ton1lc I b.3 \'•luunonc dclii prcm1onc 32
S<amupcru S • l Milano Ib4 \aluta11onc ddl'a.cur•tru.a 35
11>, \,1hJ•21onr d1 un mctod<> analitico. !"uso dc, t-tt\t 39
ISBN 88 6030 06o, S
I 6 t, Metodi d, cJlibrmont 4~
2()(Jt, Raff dio C.mllna Editore
I b7 ~l.lndatd mterm 46
Mi::no, \ L1 Rossm1 4
 ~=
\: li

Pruiarl ddl nwm a fim c!upioon prognosun e Ji morutoragsio Centrifugazione 101

I"
l"I lk<l dt§'anms, dci lhcdi di b,odumic2 chrua K. Ohltnditck
t·~ ~dcibl,.mtOrl
lntroduzannc 101
"lf.n=aloP~
I, 4 l"°'--rdilrt per d a:muollo di qualiU Pnn,1p1 fondamcn!.il.1 della \C<l1mcntaz1onc IOl

1.8 S,.-u:rt%D m labontono Tipi, manutcnz1onc e; upcth d1 iKurc,u delle centrifughe 107
3.J I T1p1 d1 anlnfu~ 107
19 ~pcruhfflonkn~ 3.3.2 Tipi dl rotore 109
).J.3 Cura e m.uiutcn11onc dcUc ccntnfoghc IU
3.J.4 untnfug,11onc C w,ureua 114
2 C,ohurr cdlulari
A R. &mbn Centnfugauonc preparativa 115
U.1 un1nfupnonc difftrmmlc IIS
li lnuoduzjonc H.2 Caurifugaz10nc m gr•dimtc d1 dcn,11• liii
~ano e stnlllltflta.DOM per rolt~ ,dlulm
u, Apphanom pr•lldic della ccntnlugu1onc pn:pam1v.i 117
-2 344 Frazionamento sul><.cllularc 119
Il b!,ontcno pn co1rutt cdlulan
34.5 Punfia.zionc per aflim_. d, ~ e di membrana 120
~ pn colturr cdlubn
Centrifug&lJOnc analitica 125
13 As;C di w."tllttU odk roll~ .:cllubn JS I Applicu1om ddl ultraccntrifugwonc analttia 125
~ =lJ e buone praudic d1 llbontono pcr le colture cdlul.m 3.5.2 Dctcmunanonc della rnus.a molccolatt relativa 126
3.5.J Codficicntc da scdamcnta.r.JOM 127
24 I lluaDr ~br
k1C'll!lll..W"""fd ~ ddlt conWlllllUIOIII bancm:hc e tungmc
H.2 Sugerimenu per uherìon letture 128
2.0 i=cuuca...,uoc ddlt (:lllUl!:1nWOnJ dJ rmropwma
'44 L-----""'~ do m,roplwru
79 Microscopia 131
arattmstidtt 1n roltur1 S. W. Paddock
79
80 Introduzione 131
ddlt tnl111tt di cdlul,e animali 80
le ailnm dJ cdlult ammah 81 MiaolCOp10 ottico m
82 4.2.1 Componcnll di bue del m1,ro1COp10 omeo 133
14 4.2.2 llcampaonc 138
86 4.2.3 Il a>nlr<Uto nel mteR11oCop10 ottico 139
88 Sezionamento ottko 146
m coltun 88 4.J. I Umicroscopio confocale a ,um,onc Ltscr 146
89 4.3.2 nnuaoscop10 confocalc a d11CO rountc l-4i
90 4..l.J Lt unrnagin1 • fotoru mul11ph 149
90 4.J 4 La dccon>0IUDon< 149

2.6 91 lmaging di ceUulc e truuu viventi 150

91 441 Evitare gli 1rt<fa1t1 150
92 44.2 lm.gmg • mtCf\'alb di tempo (umc- b~) 151
92 443 Coloru,one 0uora<<ntc d1 cdlulc ,mmli 151
'J~ 44.4 lm.ging muludimcn.,onal< IS2
94
45 Stcrcomìcro\00p10 153
9-1
4.6 Micror.c:opao eleu romco 154
95
4.111 J>nnc1p1 IS4
95
462 Pr<J.>MUJOOC dt1 umpmn, 154
96
Hd R«cnu .svJupp1 nelle l«n1,hc da m1<=r•a cltttmmca 1\1
4114 M1cro1eop1• 101,gnt~ I~..
99

• 99
4i lmagmg e bio<h1m1ca 1~7
X Xl

6J, Apph,auonc dd donJggtO 8°'"" Marcatura d1 antttorpi 315

wncnto del tDSA d,m.ato
6.C> 1 ScqU(IU In vitro r p~tta11ont m1onak 7SI Pro<cdurc 1mmunoch1michc dirette e md,rtttc 315
t,.6l M u ~ d idi 7 S 2 Muc,l lura rad1oa111va 3 16
C..6.1 Muttgmni dirctta d.l ohgonu tot
7 S 3 Marcatura con compo,t1 Ruornccnti 318
6.6.4 \ luUStnt>I mC'<l1antr P< R 7S4 Muutura con cn,1m1 319
fap~,11mc di gcm t$lranc1 7 5.S Anticorpi h1011mlat1 321
6.7
C..? I ProdlJIIOII( di protn[I( di lu$iont
lmmunoblottmg 322
6.7l Tecnìdlt d1 plust d1~by
Dosaggi immunologici 323
68 Anall\l Jci gcm r Jrll'nprt"tonc. gtm.ca 7 7.1 lmmunodoS1gg10 compct1t1vo 324
c,.&.1 ldcnt1ficarlonctamlt>1 ddl mR_K\ 7.7.2 Dosaggi 1mmunomctnc1 ,26
6.tl.l Anahs.i m"tu dt gcm 1.1 3 Dosaggi mcdwl!e lcgime lU fa.e '°hda (per b dtternunanoncd1 an1Jcorp1l 328
c,_gJ An11w drlk mtcrUJ<>nt promotorr-protnnr
7 7.4 lmmunodosaggi a.mphfiutt 330
6 8 4 Orpn1SJUI tnM~m,1 t gror targflmg 7.7 5 Do5aggi 1mmunolog1ci d1 lcg,une mccli.ante pcplldJ 331
611.5 ~lodul.uio0t ddl'tsrr~<ionr gem.:a rm,llintt RNA!
7 7.6 Dosaggi 1mmunologic1 mediante Ouor=nu e fotolumtnesc:CI\Ll 332
c,.8 6 Analw d, mutmom groet,,hr 7.7.7 Dosaggio unmunolog,co per aumento della OuortSCtnu nunbta dc, lantanidi 332
e,.&.? lnd,vì<lumo[I( di polimorfonu dd l)SA 7.7.8 lmmunodosaggio mcduntc ,ubstrat, Ouo~cnt1 omogcnc, J33
l>.S 8 MKroamy < IIU(IOOltp d, l>NA
lmmunoistocitochtmica 333
6.9 An.1h>1 d1 gm<>m1 complcn 7.8.1 M1aoacopu unmunocnzunattca 335
6.9 I Mappitun fi,ìu dtl grn<>ma 7.8.2 La tecruca per0Uldu1·ant1pcro.s1dasi 335
6.9.2 ldcnt1f1CwoM t localìznzionc di geni 7.8.3 Tecniche d1 unmunoOuoresccnu 335
69.3 J>rot:tttogmom&umuo 7.8.4 Capptng J37
7.8.5 Citomctna a flUMO 337
6.10 fanrul<:ogffiOffll(a
7.8.6 Microscopia unmunocltttromca 339
6 I\ Btotecnolog11 molc..--obre e \ ue appli..u1om
Affinità e avidità J39
6.12 Suggtrunentt per ultmori letture 7.9.1 Misurazione d., affinità e av,dJtà 339

Utilizzo immunoch1mico deUa risommza plasmonica superficiale 339

7 T«nichc immunochimichc
R Thorpt. S. Tho• Suggcrimenti per ulteriori letture 340

7.1 lntroduz1ont
7 II li ,istcma ,mmun,1ano I Struttura, furificazionc, caratterizzazione e analisi funzionale
7 I2 AnU.:O!pl clclle protcme 341
7 I3 Struttura e geni ddk lmmunoglobuhn, t gmtnnun, ddl• dn~rul~ 1nt1corpalc J.M. Wa/kn
7.2 Produz10nc dt ant1rorp1 8.1 Propmtà ioniche di ammmoaod1 e protcinc 341
7.2.1 Rispo5U unmumuru t anlKOrp1 pohdon1h e monodon•h
7 2 2 Produoon, d., anllcorpt polidonali (antw,n) 8.2 Struttura dcUc protcmc 345
7.2.3 Ant1oorp1 rnonodonah 8 2.1 Modifiche po,t-tradullonah 347
7 2 4 Prod11Z10nt d., ibndom,
8.3 Purificazionc delle proteine 348
7 1.5 Tmformn1onc d, lmlooo am VlrllS r prod11Z10nt di anucorp, monoclon1h unmu 348
8.3.1 lntwchwonc
716 AntKorp1 mgcplmZUtl
8.3.2 l>eternunazione deUa conccntrauone proteica 349
7.3 Punfiaziont e fnrnmmtmc e ddlc 1mmunoglobul: c 8.3.3 Rottura delle cellule e produnont degh (>tr1ttt grcu, m1mh 352
7 } I Tccruch, di prtapltlllOM 8.3.4 Mttod1 d, frazionamento 357
7 l 2 C,d fillnllorue 8.35 lngcgncrm..111onc d1 proteine per la punfica.zìonc 367
7 3 J Cromatogr.ilii 1 1taml>10 10n co
8.4 I>ctcrnunanonc della struttura proteica 369
7J 4 Cromatografia d affin u
8.4 I Mu>-l mol«olare rcl111va 369
7 SS fnmmcnt.monc t dwoauiooc < munoglobul,ne
8 4.2 Ana!ISI degli amnunoat1d1 371
4 lmmunopm: ;m.monc 8.4 3 Dc1trmma11onc della struttura primana 372
•4 I lmmunopreaptllZlone ma r t 8 4.4 Ghrnprotcme 378
~4 2 1mm nopreapttmonc: uil 8.4 5 !,truttura tcman,1 381
XII Xlii

FUJIZlone delle proteine e pro1wm1c.i Tecniche dcttroforctichc -4}9

85
a.s I 2 D PAGE •. affiniU coJ1fiatt ~ ootopt 1.M \\.alku
a.s 2 i.tirature w
8.S l Dttmrunwone ddla funnonc di uni protnna Principi generali 439
8.S ◄ lntcrworu protrina-protema
a.s ~ Protcm uny
Matcm1lt dt supporto 442
Biologu dtì wtcrm 10 2.1 Gd duprosto 443
8 5.6
10.2.2 Gel da poh•cnl•mm1de .f.45
86 :,usgcrimmtt per ultrnon letture
Elettrofo1U1 dt proteine 447
10.3 I Elcttrofom1 su gel da pohacrtl.,mmMI.- tn presm,,. d1 M>d10 dodc,;a.lsolfato 447
9 Spettrometria di massa 10.3 2 Ekttrofore>t tn condizioni native .f.49
A."11.ltn 10.3.3 Gel tn gradiente 451
lo.3.4 lsoclettrofoahzut1one 451
9.1 Introduzione
10.3.S Elcttrofore>t btdumnsaonale <U gd da polucribmm1de 4S◄
91 I Gct,ml,t1
Compontnn di uno srcttrometro d1 mwa 10.3 6 Elettrofora1 su acetato dJ cellulosa 455
9 l .2
IG.3 7 Rivelazione, stima e recupero delle protcmc da gel 457
9 l.3 '>utfflU di ,-uoto
IG.3.8 Blottmg ddk protc:tnc lwestern blottJng) 459
92 lomUlll0DC
Elettroforesi di aad.t nucleici 462
9 ,1 1 lomzuzaorK ptr impatto d<1tronaco
9.2.2 loruzunone dnmaca 10 4 I Elettroforni del ONA su gel d1 1garos10 -462
llonibanbmmto con 11om1 ,cloc1 10.4.2 Gel per il ,equcnz~mm10 del DNA -46S
9 .2.3
9.2 4 tonlZUZJOM per eltttrmpny IO 4 3 Elettrofom1 su gel a mtennmenu d, arnpo 465
10 4 4 Elettrofom1 dt RNA 467
9.3 Anahzzaton dt massa
93 I lntrodUZJOnc Elettroforesi capillare <467
9 32 Spcttromc:tru di nw.s.t quadrupol.ue
9.3,3 Spcnrometru d i = a tnprola 1omca Elettroforesi su microchip 472
9.3 4 ~pr.n e spc1tro111etru di m~ undcrn ,n hnca
Sugenmmu per ultenori letture 473
9.J 5 ANlizzatorc a settore rmgnetaco
9 1 b lonlZL1ZIOIK per doorb1mcn10 da pla,ma
9 , 7 MAIDI, spettrometna d a ~ TOf e MAUll-TOF Tec:nicbe aomalografichc ◄iS
9.3.8 l>cudimcnto post ,ort;cntc K. Wilson
939 1'UOV1 slr\lmrnll 1bndi
9 3 10 Spcttromttro d i = a mon.mu ,omca d1 ctclotrone m truformata da l·ouner Principi della cromatogra& 475
11.l.1 Coefficiente dJ distribuzione ◄75
9.4 Rhd~ton
11 I 2 Tip1 d1 crom.itogr~.a 4i6
9 4 I lntrodUDOne
IJ I 3 Selcnone dcll.l t.u.e swaonana e ddla fJs., mobile 4ì8
9 42 Molllplutorc dettror o e dmodo da ,omernone
11 1.4 Scp1raz1onc degli an.aht, cd dumonc H8
95 lnformmoru ilnlnurah mcdtantc spcttromctna dt m~'-1 t~ndcm
9 5 I lnUodUZlO~ Parametri che determmano le pr~t.11ioni crom.uogr.ifkhe ◄19

9.S 2 Sequ=t pro e epcpud, 11.2 I lnUUd11ZJunc 4i9

9 5.3 <..onfronto tra spett I t.2 2 Tempo dt n1en11unc e ,ulume da clumonc 411()
da m.tSY e stqucnzumcnto da Edman
9 S◄ Isotopa del carbo li 2 3 Fattore d1 gpacllJ 480
diHd:.lllollt ddlo stato d1 cmu d1 un rq,tadc
9 ~ S Stqucnzwncnto 11 2.◄ Altta..a dc, paat11 e molu11onc 482
.id&r satuméllli)
9 ~ t> Modifia.noru pos li 2 5 Anahsa qwntnatl\C e qwhtat11c 486
iuli da protnne
9 ~1 Mo toraggio di ICI 11 2 t, l'reparuaune del ,ampaonc 4811
u
96 Ami dt complc:Mt protctc Cromatografia hqutd.i ◄90
9 I Pttparmone dd camr 11 3 I Crom•1ognlì1 hquad.t a b,i--.a pr,-."onc ( l.PU: ) 490
9().. ADAlw quanUUll\J con 11 , 2 I rum•togr.,fìa l1qu1J• •J •ltc prc,t.utom (IIPLC) 495
musa d1 mLKde protciche .:omplcsse
11 3 3 Ra'<bton 502
9 Am e Il 11 , 4 CrumatoEulia hqu1Ja ,do,e delle prnt<,nc (I l'I.C l t;0-1
9
11 3 ~ flcttro, nxnatogralia <,tp1Uuc S04
p eme 11 \ b l 111nu1ograli.a dt pcrfu>1nnc SOS
9 'i menu per llltmon letture 11 3 i ( rontatOj?raf~ •u membrana 505
 IX
xv
506
Il 4 (""'utncnl 506 Spettroscopia a rJgg1X ; 4,;
trarX 507 IHI l'rm<1p1 IC'OflCI 515
~- ~te 507 12.J 2 ~trumenta11onc e appltcJrn>n1 546
Croi::u!lll;n!IIFffm~'IIJO~ldiofubn
SOi ~nros.:opid nell'ultrav1olctto e nel YISlbile ' 47
12.4.1 Prmcop11com1 5-17
Il \ ( ram,atog:rzll,O di pmw0IX SOi
Pnnapt ia.ma 12.4.2 Strumcntu,onc S4H
Il 510
l i \ ' ~ lìqlnda Ili ~ aonmlt
12.4.J Apphca110111 555
510
Il l ~ : ; i liq...b ID b;c lllfflS3 511 Spettrofluonmetna 560
U::,Q21C'V'ltlalìqwda ID fUI" mm1'1 pff &CCOf'rW!H'OIO JOnKO
11\4 512 12.S I Pnncop, teorico ~I,()
Il ~ dllnle 12.5.2 Strumcntai1onr 562
514 12.53 Apphcu,oni ~1.2
11 6 Clmlumgrafia I ILll!lhlo IOl'll(O 514
I 11.t P'rmllJ!l lrOnL"l 515 SpettroKop1a di dicroi~mo circolare 569
IIJù r.wmahrarpbcwaai 517 12AI Pnncip1 trorK1 569
110., (na: •,r.Y11lr:::m0nc 12.6.2 Strumcotuion< 571
SII 12.6.3 Apphcazaom 572
1l • Cromstoçm, a (S(hwont mokcobrc (gd filtru1one) 511
Il I Ptmaplk11r>O Turbid11nt1n1 e nefelometria 573
520
11- Matmalìt,q,pliaz.,onl
11 • l ~ moiraibtt
su Lwninomctria 573
12.11 Pnnc1p1 l('oOLI 573
11 l.rcmatognfia di afi:ruù
su ll.1.2 Strummtaz1onc 57◄
52J 12.8.J Applianom 574
IIAI l'nooplrUXl
SlA
111 MJlaUb ~~ 5prttrolcop11 atomica 576
I .J. ~ di affuuù con lfftinr
527
12.9.1 Principi della 1pettromctna atomica d, fiammi 577
11 l. ◄
~ di IIDl!IIIDPaffmltà
521
129.2 SlrummtAz,onc 577
lii. ~umchtbtldi mrulli 521
129.J Appbcaz10111 580
1lU <..mmatopml COII tipndt color&U sa 12.9.4 Spettrofotometri/I di Ouorn<:en1..i atom1ea ~I\O
lll. ~CO<Jkntt S2t
5RI
9 ognfu r;u--bqwdo CLL o G{,) 52'
52' 11 Sugerimenti per ulteriori letture 582
1191 "'-'rtleffla
,, ~•poudw-t~ 530
lltl l:fflatcrl m Tecniche spettroscopiche Il:
I 9 ◄ ~•ntXE• 535 Spettroscopia vibrazionale e risonanza magnetica 581
Dli Gordon
11 535
535 lnttodUZJone 58l
536 Spettroscopia neU'infraro"° e Raman ,114
537 13 2.1 Pnnupi generai, 584
I Il di 13.2.2 Strumcnunonc 585
537
13.2.3 AppltCUJOm 586
Il I ');z:zm:nmcslb pa ktturr 539 Spettro5COp1a di risonan,,a d, $pm elettronico 586
UJ. I Fcnomclll m~gneuu 58()
12 T ~ spcttrosa,p1dK l: 133.2 Cond1ZJon1 di roonanz~ 588
~pettroscopia dt1tronia atomica e molecolare 541 13.U Pnoçop1 Icona ~89
B. 1))4 Strurnenta11onc ,;90
133.5 Apphcaz,om 590
541
SpettrOKop1a d1ri~ nam,a magnrt,ca nucleare 91
541 1341 Prm, ,p, S91
l
541
134 2 Strumcnwum~ 601
., ~
IH l Apphcaw,ni 602
544 13 5 5uggcramenll per uhcraon lcUurt bO'l
545
 XVJ/
X\I

15 4.2 Studi rnn marc.ttor1 ,h .illimt• e 1mb11ori 1rrc-,en,b1h l>'Jh

14 iècnlchc mlioisotopt\hl'
I S.4 3Studi d1 oncllca 696
RI SlatN 15 4 4 ~tud, mcd1•ntc scamb1u tsotor1w 697
14 1 ùnsint' della rad103111' 11/1 1S 4 5 Studi lpt'ttrolutomctriu e Jptllr0Kop1<1 6'J8
14 I 1 Suunun ddl'otomu 15 4 6 s1ud1 d1 mu11grnct1 ,110 ,pcetliut 6911
14 I.? Stabnul 1ton11<1 e radimuM 15,4 7 Mcc"m1m1 uat.thtiu. wncha,om dcgh 11Udi iuli• rilionuda" A 700
14 I ) Tipi d1 Jccad1nttnto nd1oat11vo
I nrtglJ &I J«11,hnlf'nto raJ101lll\'O Controllo ddl'a111v11.'1 cn11mattca 701
14 I 4
14 I ~ \'tloctù di dradml('nto r•d1oa11111,1 15 S.I Con1rollo dcll'•1t1v111 dea 11ngoh mz1m1 iOI
14 1.6 Unità d, nmura cklb r~J0.11t1v1tl 15.S.2 Controllo delle v,c mct•bohchc 703
14 I 7 lnttl'IDOll( della rad1<>atl1V1li con 1, nutcrt, 15 5.3 Ampliliuuonc dcl scgn,lc 707
15 S.4 Controllo ■ lungo tcrrmnc ddl"•1t1v11.i cn11m.tll<• 709
14 2 R1kumrn10 e- nusurariont Jdll_rad1oa11t, ità
Sugerimcmti per ulteriori lttture 710
14_2.l Mrtods ~ 11 ,ulla 10mzzwonc dt n g.11
14 , i \lctodt l,ai;i11 aull'r.:'111ZlOII('
t 4;
J Mcto,h l,u3u wU c-spo"uone d1 miuh1<11U lotogr ,tìdtc
Recettori cellulari di membnna 711
Altri a\l>ttll prott,i dcli~ misum11om• ,ldla rJJ10~111vttl e JrU'anah,1 Jr1dati IC. Wibon
143
14 , I C.ara1tcmtKhc dtt wnwon
1 Rccdtori per la trasmissione del segnale 711
10 2 Canttnhtithe Jd ~mr,onc c ddfoo1<1p,
14, \ Acquuto,con1trvwonH ~,urrzu dtt '"'"I'""' n1,1rc.it1 rnJ1<o.1t11,amcnt,· Aspetti quantiuiuvi del legame r«cttorc-ligando 712
Amv,t1 spmfka
14 ) 4 16.2.I CuM' do,c-rilpmla 712
10.S s«lu del ~1onud1Jc 16.2.2 Paramctn dd lcpmc ttccttott-hgando 717
14 4 \',llltaggi e hmlll dtgh cspn1mcn11 con trJw~ntt ml11wuv1 Tecniche per lo studio del legame rCC(ttorc hgando 721
14.5 Asptttt nguartl~n11 Ll itcurw:3 16.3.1 Proscttaz.aoM dcgh t1ptrimm11 721
16.3.2 Proudutt 1n11ltichc ptt lo 11ud10 dd ltgamc rc«ttorc-hpndo 725
14.6 \pphca1Jon1 Jc1 raJ11motop1 nelle ..:1cn1c biolog1,hc 16 ).) D111 ttlattVJ al ltgamc rttcllott-hgando 736
l<lb. I Studio dcl mtU!i<d,uno
146 2 Appl1Gl21on111uht1<hc Struttura molecolare dti recettori 737
14 6.3 Altrt' appli, utonl 16.4.1 Natura molcwlatt dd recettore 737
16.4.2 Domini di legame dti r«ctton 739
14 7 'iuggmmrnu ~r ultcrion lrtturc
Mea:amsmi di truduzionc del qnale 742
16.5.1 Truduz10nc dcl segnale mcd1antc: e.inali ionill ,uiv~ll .ul hg.tndo 742
15 Gli enzimi 16.S.2 Truduziorw dd 1Cg11alc media ntc r«ctton acwppia11 • protemc: G 7<14
E; \\ rlson 16.S.3 TruduZJOnc: dcl ,c:gn.ilc mcd1.11 ntc rccctton con a111v11l pmtc:m chmuJC.t mtnnk<ll 7.50
l~.I CarattcriillCheenomtnd11ura Daenaibilizulione e riciclo <lei re,etton 75◄
lS.2 Metodi 1uu.htKI per lo stud10 dtllc rc,morn cnL1m~11,hc 16.6.1 Dam11b1ltZUZ1onc dei ttcctton 754
15 l I <.otU!dttwor. gt"ntta!1 16.6.2 Endoatos1 e n"do dc, rccctton 754
15 2 2 t.lctod1 an.liti.1 pcr stud ' , \Ut fil.l101U110 Suggcnmenli ~r uhcriori letture 757
1s.1., Metodi , rcr studi
I~ 2 4 Metodi an.l t I per gh ,tu 1
15.l 5 Mctodun LI r« 1 do$l tut, 759
15} Ctncim1 rnwnauc ~o SIJlo Sl dl Il no
li.li t1chea mgol •tn 7115
1q 2 Rn!IOnt(lltl • ht I due ,1
IH J Rtmoru degli m,o:
IH4 Effct10 dcll1 con<, tr11110n
l'l ~ Effetto ddla ttr'pcratwi
ISH Eitctto dd plt
I~'~ Effrno ckgl, m1h1 j (IUJ

lr..t Sm .illt\ 1dq;li cn 1mt c mn-c

I 4I Stud, dt ,r ull u
Prefazione alla sesta edizione inglese

Nella prefazione della precedente edizione d1 questo hbro c1 eravamo postt l'obietuvo d1
produrre un testo universitario che comprendesse I princ1p1 teonc1 e I dettagli pratiCI delle
tecniche sperimentali, indispensabili per la comprem1one e per I approfondimento della b10
chimica. Nei trent'anni trascorsi dalla pubblicazione della prima edizione, nel 1975, si sono
registrati enormi progressi nella conoscenza dei processi biochimici che caratterizuno le cel-
lule viventi. Tali progressi sono ben rappresentati dal recente completamento del Progetto ge-
noma umano e dall'emergere di numerosi campi dì studio corrclau, come la bioinformatica e
la proteomica. Molte di queste aree dì ricerca sono comprese nella nuova vasta disciplina del-
la biologia molecolare: ci è parso quindi appropriato esplicitare anche nel titolo del libro que-
sto aspetto essenziale, cui è dedicata buona parte della trattazione.
Nel decidere i contenutt di questa sesta edizione, abbiamo anche cercato dt tenere conto
dei commenti, sempre costruttivi e incoraggianti, che c1 sono pervenuti da università e istitu
zaoni dove è adottato questo testo, sia nel Regno Unito sia all'estero. In risposta a queste solle-
citazioni, abbiamo ampliato gli argomenti trattati inserendo due nuovt capitoli dedicati alle
a>lture cellulari e alla microscopia. Inoltre, abbiamo ritenuto opportuno includere nuove im-
portanti sezioni relative ai principi e alla prattca della b1och1m1ca clinica, con un'attenzione
particolare per la diagnostica enzimatica e i metodi stat1stic1 alla base della valutazione della
qualità dei dati forniti dai laboraton di bioch1m1ca anahhca quantttattva (compreso il ruolo
dei protocolli esterni di valutazione della qualità come quelli del Umted Ki11gdom Nat1011a/ Ex-
ternai Q11aliry Asmsment Servrce - UK NEQAS). Modificando i nostn precedenti orienta
menti, abbiamo inoltre deciso di non limitarci a quelle tecniche sperimentali che gli studenti
più facilmente incontrano nei laboratori didatt1c1, ma di discutere tutte le tecniche che oggi
contribuiscono al rapido progresso della nostra comprensione delle funzioni cellulari. Due
esempi di questo nuovo orientamento sono rappresentati dal capitolo sulla spettrometria d1
massa - dove si enfatizza il ruolo fondamentale di questa tecnica nella chimica delle proteine e
nella proteomica - e dal capitolo sui recettori d1 membrana - dove sono discusse m dett.igbo
tecniche analitiche, come la spettroscopia d1 risonanza pla\monica, essenziali per un approc-
cio moderno alla comprensione della funzione dei recettori e della trasmissione dei segnali
nelle cellule. lntcn capitoli sono stati aggiornati alla luce dei piu recenti ~v1lupp1 e molti sono
completati da esempi che integrano la trattazione.

Diamo il benvenuto a cinque nuovi autori: Ala1star A1tken (spettrometria di ma~!>J), An-
war Baydoun (colture cellulan), John Fyffe (b1och1m1ca clinica), Kay Ohlendieck (centrifuga-
zione) e Stephen Paddock (microscopia). Desideriamo esprimere I nomi ~inceri ringrazia-
 pR{J.\lJOSI ,\IJ.\, ,T~ tlllllll1't IN U:.5E

e<>ta mio, ,1 ed111one Ric..or-

11 stc,ura dI qutorc d1 due cJp1toh ~uIle tec-
tu!tl oh ,\UlOrl rcr
. la toro Loopcru1011e ne J
di 1)' k ((1fdon, au Autori
mmtl J l in.1tur.1 ~,ompar~ lrl ' h tim entw,1,1sta e dedito
d b10 Ullll.l ' '110'
"
di.1mo lll n tn,teu.t J prc . .
h Dlrck e \tato un m~egn,mtc i l I' ortanza dei pnnc1p1 ch1m1c1
ntlhc ,pdtroslOPll e ett ·re a1 ,uo1studenti unp
I o la,oro. che ha ,aputo trasm < . li b hm11ca pratica
.i propnd ltA tecmchc anahuchc "entrali ne a IOl . nno dagli )tudcnll che utihzza-
alla b.1..c I mo ~ m che LI pcn:erra I li
u per i wns1gh e le o~crvaz10 ·h' I adottano nei loro corsi. n me,
<;.ircmo gra d d . ti umvers1t,m L e o di A.Altkcn K.Ohlmdìed R. Thor~
lo libro per i loro studi e di di OLtll l'1 editori che Cl hanno permesso D1vu1on of Medie.il & <hm,il Dcpartmmt of Biology 1'a11on4f lnst1tutc for
no qu~
. primcn: la nostra grautu ne a gli auton e ag •
, , . ~tnna Halhday e a1 suoi co -
l Laboratory Sc1cnccs NAUon.tl Un1vcmty of lreland 81ol"gical S1.md•rds and Cont rol
vogI1.uno es I tn nngraz1amcn11 .. "'' Univtrsity of Edmbwgh Maynonth Blm.:hc l..inc
-e le figure coperte da dmtU, e nos nella ste,ura d1 questa nuova
nprodu.. h · hanno so~tenu10 Geori,eSquue Co Nlduc South ~iunrns
leghi della Cambridge Umvcrs1ty Press, e e c1 Edmburgh EH8 9Xl> lrcland Pottcrs B.ir
Scodand,UK HcnsE."i63QC.,UK
edizione. s.w. Paddock
}OBN WALKER A.ILBaydoun Howard Hughcs Medicai ln,111utc s. Thorpc
Kt1IH WJLSON School of Lifc Sctcnces Dcpartmmt of Molecula.r !-.at10nal ln,tatutc for
Univenny of Hcrtfordshirc B1ology Biolog,cal Sund.ird,, and Contro!
College Lane Umvm1ty ofW1scomm BI.anche Lane
Hatfidd 1525 Lindcn Dnvc SouthM1mms
Hms ALI0 9AB. UK Madt~n, \\1 53706 Pultcrs Bar
USA Hcrt.s E."-6 }QG, UK
J. Pyf&
Consultant Oinical BiochcmlSI R. Rapley J.M.Walker
Dcpanmcnt ofChrucal B1ochcmistry School of I.J.fc Saences School of I.J.fe Scicnces
Royal Hosp1w for S1ck Chlldrcn Umvcn.11y of Hcrtford>hire L'nm:mty ofHcrtfurcbhtrc
Yorkbill CoUegc Lane College Lane
Glasgow G3 8SF Hatficld H.auidd
Scodand.UK HcmALl09AJl,UK HcrtsAll09AB UK

DJLGonlon R.J. Slatcr K. WUson

Department of Biological Sc1enccs School of L1fc Setcn,es School of uk 5-,m,-es
Metropolitan Uruvenity Uruvcrs1t)· ot Hertfordslurc Uni\'t'l'Sll:V of Htrtfordslurc
olManchestn College Lane CollcgcLanc
ester Strcct Hatfidd Hatfidd
cster .Ml5 68H, UK Hcri.AL109AB. UK HcrtsALI09AB. UK

Curatori dell'edizione italiana

Mirella S. PUonc Loredano PoUtgioni

Professore ordinario d1 B,ochmuca
dlttttorc dd d1pJrl1mento
di Btotccnolog,c e ~1cnzc Molccolan
Univtnità dcgh S1ud1 dcll'ln,ubna,
\lame
Profc-.,on: , 1r.1ordma.r10 dì 810.:h1m1,a
prr<idcnh: del , or.o d1 l.iurca
in 8mtr,;nolog1c
llnl\cr"ti d~ h Studi dcU'ln,ubri•.
\ an,...,

L'ali::1011~ 11,i/rnna il, q11e,10 l:bro i! dedwlla u Lord/a e a tut1< I, pmo11e 1h,· ,, tn:,1 ano ad a/[rotllaf'(' ,m mule {'IU gmn
dtdt loro, per l '111,cgu11mct110 dt 11m1ltd rd11a1aoa d1re1 tla,1110.
 CAPITOLO 2

Colture cellulari

2.1 Introduzione
L'insieme delle tecniche delle colture cellulari riguarda l'isolamento e il mantenimento in
vitro di cellule isolate da tessuti o da interi organi, derivati da animali, microrganismi o piante.
In genere, le cellule animali hanno esigenze nutrizionali più complesse e richiedono condizio-
ni di crescita e conservazione più stringenti. I microrganismi e le cellule vegetali, invece, ri-
chiedono generalmente condizioni meno rigide e crescono facilmente con esigenze minime.
Indipendentemente dall'origine del materiale impiegato, dal punto di vista pratico le colture
cellulari vengono gestite secondo gli stessi principi generali: necessità di una coltura cellulare
pura, non contaminata; adozione di appropriate tecniche di sterilità; condizioni idonee per la
crescita ottimale delle cellule.
Una volta che le colture sono state allestite, le cellule possono essere utilizzate per diversi
scopi. Per esempio, le cellule in coltura sono ideali per studiare processi che avvengono all'in-
terno della cellula, come la sintesi proteica, i meccanismi di trasduzione del segnale e il meta-
bolismo dei farmaci. Le cellule in coltura sono state ampiamente utilizzate per lo studio dei
meccanismi di azione dei farmaci, delle interazioni tra le cellule e della genetica. Inoltre la
tecnologia delle colture cellulari è stata utilizzata in medicina, un campo nel quale le anoma-
lie genetiche possono essere identificate dall'analisi cromosomiale di cellule ottenute, per
esempio, da una donna in gravidanza. Allo stesso modo, le infezioni virali possono essere og-
getto di analisi, sia qualitative sia quantitative, su colture di cellule isolate. In campo indu-
striale, Je cellule in coltura sono normalmente impiegate per verificare gli effetti farmacolo-
gici e tossicologici di preparati farmaceutici. Questa tecnologia fornisce quindi agli scienziati
uno strumento prezioso, costituito da un sistema facile da utilizzare e relativamente econo-
mico, il cui impiego consente di evitare i problemi legali, morali ed etici associati alla speri-
mentazione su animali.
NelJe prossime pagine saranno presentate le nozioni fondamentali riguardanti le colture
cellulari, unitamente a una serie di principi e protocolli generali che vengono applicati quo-
tidianamente per la crescita in laboratorio di cellule animali, batteriche e vegetali. Oltre a
fornire le conoscenze di base per quanti si avvicinano per la prima volta alle colture cellulari,
questo capitolo può rappresentare uno strumento d 'aggiornamento per coloro che hanno
gia acquisito un'esperienza parziale in questo settore. t stata dedicata un'attenzione partico-
lare all'ambiente di lavoro, sottolineando gli aspetti relativi alla sicurezza, parallelamente alla
puntuale descrizione delle principali strumentazioni necessarie per il mantemmento delle
colture tissutali.
 810( IU!JI( ,\E IIIL'UX.JA MOU OL,l.kJ
tOITT IU llllll,\IU 71

2.2 l.uboralono e ,1n1111cn1a11oncp(r colture cellulari l,iri d.11l'opi:rJh>rt', ma, in alcuni c,1,1, per proteggere I opi:ratMc dalll· wlt11rc. Queste ,.,ppe
,rngono Sl'ncr,1lmcntt• ddin1ll' J 11u~~u la1111nJrt· pmché g,·m·r,ino un flu,\o unitornll' e LO
l..Z. I Il fobomtorto prr wlt11rt cd/11/,iri ,t,lllll' d1 a11a ~te11le fìltratJ attraver,o un liltr,1 J<l .ili.i tllK1cn1A1 per matcriJlc p 1rt1rnlato
I HI PA, ll1gl1 I JJÌ(l1'1t1)' Pt1111cult11r Atr hlta). hi~hmo due 1ip1 d1 cappe a lluWl IJm111.1rc:
I.a progctt.wonc ,. I.i gestione del 13borJtono t for-<' l'aspetto piu_1mportantr nel , ampo oriuontalt o vcrt1c.ih. Le cappl' ori11011tah perllll'ltcmn all'ari.i d1 fluirr dtrcttamrnre verso
delll' nilturr ,l.'Uul.in. ixi,,ht un ambicntl' ,tmle è fondamcntJle pe'. 11 trallamcnto cklle cel- l'opaJtOTl' e, di wn,egucn1a, rnno m genae u11lt11atc pa I., prcpar,1t1onc dei terreni <lt ,re
lule e dn tcrmu d, roltur.1, ,hc dOI rcbbero ~re pnv1 d1 m1aorgam,m1 rnn1amm.int1. Que- "Ila o qu.indo ~, l.i,ora con m.itcrialc non mlètt1h>, wmc quello dt origine vcgl·talc. 1l' ,appr
sti, mfatll, se non uintrollJt1 potn:bbcro ~upèr.H( ncllJ crc-.Cl!J le ,dlulc 111 wltura, avendo vnt1Cah u)nO,etllll anche come LJb111e d1 sKuren.1 b1l>log1t::1) ,ono p.irucolanncnte 111d1,atc
come c,trtrn.t ,on,cguenu la morte del!J colturJ ldlulare J ,.iu'>J del rilamo di to,\ine e/o pt·r l.1vo1arc rnn org,1m,m1prnrnlosi, dal momento die, prim.i Ji pas.,Jre ndl'.1mbientc llr-
dd romumo dei nutr,mti del terreno dt coltura. wstJnte, l'.m a, iene fi ltrata
Quando po"1b1k, un laboratorio di colture cellubn donebbe mere progettato in modo (,c:ner.tlmcnk sono 1mp1eg,ltl almeno tre d1n:rn modcUi dt çappt•, d,1'luno dei quJh oftre
d.i ag"ol.uc I.i prrpu.irionc dl"l terrem coltur.ilt e permettere J'i,olJmento, l'os<,crvat 1onc, la d1(frrenti ltvdh d1protl'7ione per le colture, per l'opcrJtore, o per cntr11mb1,
valutazione e il m,1ntenm1cnto delle colture IO condtztoni d, ,tcrihtà controllate In una ,11ua-
11O11e ottinule do, rebbc c,mtcre una 1tan,.a deJ,c,IIJ J ,i~,uno dei comp111 sopr,l dencati. Cappe d, classe T Quc,re 1.Jppe, come quelle dt cl.Mc Il, hanno uno ,chermo ~ull.1 parte
lutt.iv1.1, ,pec,almcnte m Jmb1to .iccJdemtco, molti laboratori per le colture cellulari co~tirui- fr(lnt.ile che fo rma una barriera tra l'oper.iror~ e le cellule:, ma 1.0n\ct1ll' l'au~,o alla c.1pp.1
¼ono solo una inne di laboraton pmgr,mdt e,comr tJlt,go<lono dt ~paz1 hm1t,111. Non e raro, attraverso un ,1perturc1 nella parte mferrore (F1g. 2.1) QucHo schermo impedi,1.e che d.11
~r,1ò, trO\arc amh1en11 comum dove ,engono delimttatt ,pJ11 per attt\'ttà ,pc:cifìche. Ciò l'estcrno ,cng.i generata unJ turbolen1.1 troppo forre nel flu,so dt ana e, fatto piu 11npor1an•
non <O)t1tu1!><.e un problemJ grJve fintanto che vengono ~dottJte Jlcune regole fond,1mentali: te. fonm,e una buonJ protezione per l'operatore. Anche le colture ,ono protette, 111c1 111 n11-
per =pio, do\ rebbcro ~M"rc ~mpre U!>;lle buone ternichc d1 sterilita (par 2 4 ). Dovrebbe- ~ura m more m pctto a quJnto avviene nelle cappe di dassc Il, po1Ché l'aric1 rbuc,h1ata d.tl•
ro ~sere moltre pmenll attrruature Jdcguate per I.i preparazione e la Meriltu.JL1one dei ter- l'esterno viene a~pir.ita .ittrawrso la cabma vcr,o l,t parte superiore dell.1 cappa. Quc,te ap•
reni, e_ tutti I m.1tcr1.1h des1tnat1 Jlle colture dovrebbero C\!>ere mantenuti m condlllont di sre- parecch1.1ture ~ono adatte per organismi a bc1sso ns,h10 e quando~ ne,e,\JrJJ la ,ol.i prole•
rihrl fino ~1 mom~nto dcli u11hno. lnolll'e, lullc le )upcrfkt ,1.U-mterno dell'area destinata alle zione dell'oper.1tore
C-Olture dovrebbero C\~rc non-poro)e r· nc-r 1011--vtrc
n..A I'a~rbtmènto dt terreni o di c1ltro mate-
ri ale ehe potrC'hbe cO\1ttu1re un huon suhst JtO dI Cappe d, classe Il Le cappe dt clas\e li sono quelle che s1 trm .mo p1u frequentemente ne,
h d r crc\uta per 1nucrorga111sm1, con grave ri- l.iboraton d1 colture tl\sutali, m quanto assKurano una buona protezione sia per l'operatore
"' io i mqum.imemo per le rnlture Tutte le sun,,rfì d bb
tutti r rifiuti gcner.ui dovrebbero · r- "' ovre ero e,sere d, faci le pulma e \IJ per le colture cellulari. D1wrsamcnte da quanto ilV\ iene nelle Lappe d1 cl.i,,e I, l'.iri.1 J~pi-
C)SCrc e11mmatt 1mmcd1atam t d
potrebbero pm-cdcre u prchminarc t. 1 en e, ~econ o procedure che r.ita d.ilrestcrno, puma d1 fluire ,ulla colturJ cdlulare, p.is<,a attraverso un.i gngl1.1, posta d1
) crt tZ1.111onc IO auto IJ, • d gl I
re\.01topm)1onc(l21°(clOSkPa) ' e e 1scart1u1111zando vapo• fronte all'area dt lavoro, e viene filt rata attraverso un filt ro Hl:PA, collocato nella p.1rtc wpe•
d1srru11one dei mMorg.ini)mt. ptr un tempo prc)tabilito. TJl1 condmom assicurano la n ore della capp.i (F1g. 2. 1). ·1Ale procedimento proteggi.' l'operatore l' a,,Kura , hc l',mc1 ,11 d,
Per unlt corretta gemonC' delle attrezut 1 sopr,1 delle colture sia sostan21almente stc:rrle. Que\te cappe ,ono adatlt: per li: 1.olture di ,d-
re controll.ita quot1d1anamcntc co I co ulre,d~ tcmperJtura degh mcubaton dovrebbe esse- lulc ani mah, che potrebbero contenere .igcnu a b,1~.i!modaata toss,ut.ì o mlcttl\ IIJ, ma
Iando Ia prn\10ne delle' bombole' di' CO mcba 1spomb1ht.ì dI g.is per gI11ncubator1 con trol- non ,ono idonee per l'ut1l1110 con patogi:m .id .ilto mch10, c.he nch1cdono un ltv.:llo p1u elc:
I .tgncttt ad acqua d bb '
temente pul111, e le aree '0tlo)tantt le )U"" fi d ,. ovre ero e~sere tenuti co~tan- vato dt c.ontcmmento.
bc ro essere npuI1tc dalle ~,t~zc •Clidmtalrr et t wvoro delle caPJ't .i ilu~so laminare dovreb-
menre ro\esc1ate. Cappe d, dasse III l e ,appc d1 )11,;urc,z.i d1 d a~,e lii ~ono nc:,c,~Jne qu.indo è n,hie<.to il
m.i~ uno l1vdlo d1 prota 1one dcll'oper.11ore e del materi.ile mampolc1to Queste cappl' ,ono
2.2.2 Attrez::arure ptrcolturt ul/u/ari
completamente s1g11Iatc e provn ~tc d1 due t.i"hc a forma d, gu.into attrava,o le quah l'opna-
Tra gli \trumcnu mdbpen~,h VJ • tore puù lavorare sul materiale po~to all'mtcrno dd la <..tbtnJ (Fig. 2.1 ). L.1 completa prott·11O
• ,
tori, '.>Ono. una cappa ne dell'operatore rende lr , appc d1 classe III pJrt1colc1rmcnte .idaue per la\lirare wn oq_i.1ni •
un ,1uw..: 1.1ve e un miuoscop,o 1': 11 per co1Iure h~utah • b.t
str e altri ~trumcnll esscrmah . e e pagine seguenti verranno br"~ 'unto od p1u .m~u • , mi .iltamcntc mlclt l\'l e con , amproni d1tessuti ~O11tam111,11t da patogeni um.m1.
• , --men e escntt1 que·

uppe per colture cellulari Sugger1tllt'flli pratici t sicurezza nel/'1,tilizzo delle cappe per colture cellulari 'lut!t· le ,appe
dovrebbero e, scre mantenutt· puhtc e hbt're d,1oggc:ttt 111gombr.1nt1, po1'hé un C:H{ ,~i,,1 c1m-
La ,apra per Il' wltur1: ,ellulan e 1•
ptUll' lutte le n1.1111pol.u.iont ddlc ctUu!appar«chmura pnntip.ile Il ma\s.unento d, oggetti al loro 111terno polrebhr .1ltern1e ti flm,o dell'ari.i e cuus.1rc <.ont.un1-
e è Progettata non ne a quale vengono wm- n.uront Qumd,, come regola gi:nNak·, u nno po,11 .1IJ'mterno della ,ahina ,olo gh oggetti
soIO fl(r prot.:ggere le ,olturr Ltllu-
 ll()(JIOIJC AE 610l0GIA MOUC.01.\U
ì2 COln'll Ulll IAIJ 73

Incubatori a CO
Il n.·--.l. Per un.i crc:,ltla ottimale delle cellule m londwom costanti e controllate (!,olttamente una
tempera1ur.1 d1 37 •e e unaatmoslera co,111u11.1 cu ana e CO. :il 5-10%) sono n;xc:s'>Jrt tn<U·
baton tcrmostat.itt a camKta d'acqua. Li funzione della CO è quella d1 assi,-urue che ti terre-

l~ t no d1 coltura ~1a mantenuto .tl pH fis1olog1co opponuno (generalmente ì.1-7 .f) Tale ob1c1t1
\O viene raggiunto tornendo .tll"m.-ub.itore CO da una bombola attravcrw una vah C'IJ prc-d1-
\po,t.1 per immettere ti gas ogm quaholta il çuo livello scenda al d1 ,otto dd v-alort' 1mpo,tato
(5% o 10%) La CO lhe entra nella c.unen. interna dcU'mcubJtore ,1 d1,uoghe nel tc-rreno d1
lOltur.i wmenente bicarbonato, che l'\!.lgcndo con gh H ( gcnerau d.il mcrabohsmo cellulare),
~ I \ form.i acido carbonico, a sua \Olta m equilibrio con H_O e CO,. In tal modo il pii dc:! terreno
Classe Il è mantenuto .i un valore d1 crrca 7.1.

Hco•+tt·....:: HCO, ~ col+Ho

Classe Hl
Figura 2.1 lùppmmwionudimu
tiu uctJt ca~ ptt colturt ll<suuli.
necess.an e tutte le superfia di U\'Oro devono
Questo tipo d1 incub3tore VJCne umidificato mediante un \"illS010 d1 acqua ,tcnlè r~,~to ,ul
piano mfenore; l'e-.aporaz1onc dc-ll'alqua genera un' atmo)fcra n,ca di um1d11.1, che contrt·
bu1sce a prevenire 1'"'~1c~o1mento del tnrcno di coltura.
L'n'altcrnall\a agh mcubaton umid1fìca11 è ..:ost1tu1t.1 dalle unità .i )t<eo ,el\Z3 gas ,he, pa
mantenere un pH equ1hbrato nel terreno d1 coltura, s1 b~no ,ull'uso d1,1stem11ampont' co-
me l'HlPES I aCldo 2-(4-(2•1dro~,ie11I" I p1perum•elamulfontlO) o 11 MOPS a1.1Jo morto•
lin-propansulfonontlO). Il \JOlagg10 d1 que,to ,btema m1cde nel fatto che \iene ehmmJto 1I
-+ At,a della stanza ri\Ch10 d1 ,ontammaz1om di~. nell incubJIOre um1d1tì,:ato, ro"ono denvJre d.ùl'alqua del
-+- Aria contaminata va:,_!>-Oio. Lo S\ol.nt•gg10 è rappresmtato dalla rap1dJ cvaporJz1onc del turcn<l d1 coltura, ._on
.._ Ar,a pura conseguente str,,~,., delle cellule. L'n modo per n,olvcre que~to probkma è collo.:are k pt,btrc
per le colture cellulari m un· s.ind" 1ch box•, OV\cro tra vaschette d1 a<qu.i ,tenie; ~on 11 ..opcr-
J_n ch10 del sand\\ 1ch box \OIO p.ima.lmente chiuso, I t'\aporaz1one dcll'alqua ,onh:nu1.1 ndlc \J•
~hette genera un"atmo..rera um1d11icata .11l'm1crno del ,onten11orc, ndu..endo il pcrkolo d1
t'S.\iccamcnto del terreno di coltura

una conccntraZJone effelU\-a del -0% (

i~ 1
n,uurato per uso industriale (l~fS, lrrduitnal ~;;~ '.te, pnma e do?.° l'uM>, con alcol de-
} d Spmt). Quest ultimo viene uSJto a
Cons1gl1pratici e sicurt=%11 ne/l'utilizzo degli 111cubatorì ptr rotture cellulan L m.-uhatore
dovrebbe e~re cmt•ntemente m.intenuto ali.i temperatur.i 01t1ma.le (37 °C) e nlC'rn110 d1
acqua m1ll1Q) e agis«- contro ba1;er1 • prq,~ato agg1~ngendo ì0% voi/voi d1 IMS a 30% di
' \pore ,ungine dmd ta d fi CO (510%). Per mantenere co,tante la temperatura, o..corrc po,111onare un tc:rm,,mctro
d mdo cou la contanunuwne delle ,ohure. ra n o e issando le cellule, 1mpc· nell'in~ub.itorc, prcfenbilmente :,_ul uh> interno dello ,po nello d1 wtro mterno dell'apparc..-
Alcune cappe sono equ1p~•••"ate
-" -e,,,
con una ,. wmpada a ra chm; controllando penod1c.,men1e le temperature r<111,trate, ,1 po~no effettuare I ne<t"U.lrt
puu ~re utthzuta per irradiare,. p•n ggi u1trav1ole1t1 (a onde corte) cM
.. • e mttrna ddla e.ab agg1mtamen11. I h\elh d1 CO all'mt.:mo dell'umtl po:.,ono essere monllM3tl mediante un
gamsmi. La bmpada a ultraV10lett1 d ma m modo cu uccidere I micror• ,mahu.atore d1 it,h (wme l'~nah,utort' ff)nlt'). \,1 ~untrollato rt'i;olarmcnt,: andle 11 li~dlo
-•·
ste,wzzare Ia parte UlltTn, ddla cahma cvc ~ e ac.:e,.i
con aI meno 15 mmut1 d1 an11c1po per
ncorcure ehe la rauuZJont
.,__ 'cornpraa la su~rfi d1 I d1 CO ndl.1 bombola d1 ga,. ,he duHcbb;: c,,crc •,d.,t1tu1ta po.:o pnma che ,1 es.sunmi, pt"I
ultra\mlctta puo C'Utrt r IClt ,noro Occorre, tu1t.1v1a, evn.ue d1 ,ottoporrc a sire~ o uc..sdcrc le allult' Peraltro, la maggmr parte dcgh m,ub.tton l!
\"Ono quindi inllpre adottate le opportune p causa di danni alla pelle e agh o,ch1: de- dotata d1 un allarme mcurporato che regt\lrando 1I (.lo 1mpro~"'''° dd h\'tllo d1 CO ncll.i ca
dlllto dagli l,'\ Al tmrune ...
uc:1lavoro, bnogiu reau,ioru
a affinché I'opcr.itore non ,cnga irra
51 mera, sqinala ti momento m ~u1 la bombol.i u rap1damt'llte $<l)lllu1ta. \ttu.ilmmtc è pms b1•
unaldo rapposito pannello frontale Inrllc- c.ap~ ~ ~ che la c.ipp.i \ eng.i ch1u sa ncollu• te connettere ,on1cmporancan1cnh: due hombolc d1 g,.,, med1~nte un d1~pm11l\"O m grado di
ne meno IO mmutt pnma .,..,,, r • ~ I e Il) La
uc:u inmo dd lavoro ,._ cappa \,1 messa 1n fun110 p.iu.are automau,amentc aU.i s«ondd hombol.i quJndo la pnnu è vuota
z.irsi D urante q ~ p(rK>do b •r" COl!Stnttrt aJ Il ,
tale dcll app,arccch10, che il O IK>gna ventìare sul pannello u150 J aria J1 stab1hz Qu;altU3 ~eng.i uttltz.uto un mcubatorc um1d1tì,.ato, ~ fondamcnt.ile ,he l'uc-qu1 contenu
prc-vlStl d, 11curczu lllSo d ari., e gli altn PUilllC"tn ;.P<>smon,.to nell.i p.irtr fron 1a nel ,-asw,o \t.l controllJt.t rc:"Solarmenlt' e mantenut.a sterile, mrd1ante l'asg1unta d1 .inh
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 i5
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~::t4.rc:.a..":èil.c:is.:,.~ e-, r.s.-,~, roo \lOO pmoo puhto trn...
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~ r i e ~~fGICl.'=~s.-u,-'.-a'\."1Cfl:-~.c:n~~fmo Jdl'obie-nn'1 oon~rc"*
l'Utl'(' dit' dd n-....luo rarpl'("S("\'IUtCI d,ùl'l:tihzzo d,j m.t:malt biorogiro. I Opt'-
$:o; ~ - ' - sco.. t ' t t - ~ a ..~ , °'~''ftO ru-"' ~ tnfi.vmuiom r.ttott 00\-rebb.:- l\l'tt ~ t ; t lm"J'UUIO~ rtr quanto ron..-ml<' ramt--:t'ftt(' di Ul'OfO <' 11
l: e.tt~~, ~ &:n~ ,i."Cl!b.'Q. ~s:::c., f\'t c,,:ct,...._\ C--.."-"1't' ~ t e - n• rom:uo ~ ddlt app.1~'1.iti.tturc' utilùntt, dt<' possono auch .-...se- cost1tw.tt un strio
~~o~-&:m:~ ~ ~ d i ~r~~n,~ r,tl'k--oln. Lt- - ~ ~ lt ùlhutt d o , ~ e-,m:- xlttoro-- ~ a 11.WlUtet\Zlont ordinaru <'
~~-~ controlbtt (-uc;i llpll ~ ~) per gmtntm- b ,1"1l'tlZ3 ddfop,ent~. che a sua \'Olt2 do-
,'n'bb<- adottan- al, Ull(' nu,llft' pro:.aU?Jon.ili d1 wnttm:- ~ t ,-omt ~'lUn- di mmpare
o t-.."ft' dunntt il bnm, alb ~p,a <' ~ b r,or~. per t,,w-e l'~r,nont m\'ulootuu
.:li w•tmtC' no..-1,T. l>on'C'blx-n., molttt-, ~"'""" >ffllr""' 111do,53t1 Uldummn protctu,1 adt'-
~u. ,muC' un ,.mu,-r ruhto r-gumti, da g, ttan- dOl~.\ a,tt mJ.n(l:SJ.3l,l matm.tlt n,)n ~tenl<'
o -UOt:untn!tO.

.:.-1 ~~ure ,terili e- buont pratidlt di laboratorio ~r le roltutt cellulari

1.-4..l Bwlh' p,uridt~

~ 1'!l:llltt>nett- un .am!-xnte ruh:'-' l" ,kuro l'\'r le- (Oltutt ,dlufan. do,Tcl>bero ~ ~m-
r~ ~"UÌtt r-ro..-rdutt .a..xtudlt' ,, ,ttrili. Ciò :¾nifk;1, ~lì,fflltntt, la\'(\roU\" Ul ,"\.UJdw..lnÌ
& rtt,\~wo i] r-a,.~~I<) Jì nù.:rorpni,nù "-'nt.mun.mti J.ùl'.unbimtt .alle ,olture. Tra lt
r..rl.'\.-.&U%1(1ll1 da ~ ,1 -..:-IK' il l:l\ .a~,1 Jdle m.1ni oon s.ipont anrut"ttico l" il m.inkruml'.'n •
tll m ,.,,nJ.: i,.\l\J di pulizia t -rerùirl Ji tutte k ~upn"tìci Ji b.wro mcJ.imtc- 1.i,a~1,, e di.,mfc--
ZÌl.'\Dt ,.""\.lll J\l:> ,I-~ primi Ji ìnìzi.lrt il b,·N'-'- Inoltre. tuttt" k (\rtruioni, comprt"1 la rrc--
p.tr.w...m~ Jc, t ~ I'.' il trattJ.ll1('ntO Jdk ,cll~. do\l'ttibero e,...~ ._,-oltr '°tto ull.l aipp.t
l'('f ,"\lhurt,dlubri. O\"'\ 1.1mentt llllllt(OUt.l rulitl I'.''~~('.
(À>\~N e--ctt ptt'-t' ~ k-'4'\lfflll p!t\.--:tUZl,"11 fond.untt1t.Ù1:

• e-,,tan' dì p.trbfl", ,t.ununtt <> t,\~Ù"t nd!.a ..abin.a ,, dm:tt.amente ,ulk ,ollUtt;
• utilìzurt' una p-l,J'(tta putiu rcr ,~ noo\-:i pro.-edur.t r ~n utiliz:ure-, m ne..,.un_a..-.o. I.i
.)t(-...'3 rir<tU J'('f di,~ b..lltipìe Ji t ~ pru,..iie aò uuemmt~ qgnili,.itn-a-

nlffltl" il n,dùt, di .:oot.unÌIWhlllt" cro..--ut;i;

• rìJ"Uhtt ,uhit,, tutt'(' k ....~.antt (V\~--Utt m.1~wrt1umentc, rcr t'\'l:JJT ,be l~OO un t(T
ml(\ di ..~ , t i I nu.:ro~~rru ,'ODtJ."tUOJlltl ,be rot~l\.l c-,.-.crt ~nu od) Ul.L

la l?WKiltJ :WlW\Uk' J1 qu,~IC' rnxaunom f"\ln-bbl'.' ~.... '.t ,.iU"-1 di ù)Qta!IU.'l3ZIOO( dcl.'t
~ dic- put.\ r,-...-n- ndo{u "m l'tmp~, Jì .1.nt1lwt,,., 1....1t.e-u. comunq~. D<U1 --rmpre
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n:11\" l.t llt'\~tì di rrrutrrt\" ~• ilnllh1ot1 i1 lu.il 77
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dilì I i1.uw,,orah1111,d1,mt111.u-frr J ,...,.
I lUli.lllr ( rlli l'llht.anun.i IOII(' I li Uhi( ,l\'";lff,• pl'I f'l\'\\'111,t la Cilllll' P"'' i,111 d.illr hm11w pr ,11 i, lw ,h l.1hor,t111111, f,1 sh'f 1!11il ddk "'lturr don('bl)(' l"$S<'fl'
loOlto <a11p.z o ndl'm,ub.i101'\', l1111I~;;::;~~ ~t•' un.1 ,'\litura ,,1111~111111,11;1 pu,\ •'"1'~ •J>trta 11•ntt,1ll,1t,1 fl'll'''•lfllll'llll' pn ,lù1rl,ur l',1<,l'nt.,1 ,h 1111,rorg.u11,m1, C,ti è p.uti..,IMml'nfC' im•
~hnuruto tmr!M\lì.t1.ui1t nit il ltmunr ,ltl l.a:1:~::r:;il~ ~• ,,11:i ,l,·1 •' l ,,r1,, ,li:,;,1111,un11111o l'''' 1,llllC' ndl., l''"l'•'r.,rnmr di pruJ111t1 ,km;iti d., l't'lrurl' <Cllul,m o ndl.t pro.:lu11nnl' di
norn1411\.a ''-'tlltr, ,hr J'tr'l\\k ,hr r lt'\l\ki ,, '" t\' l'),, rr ,~, 1-11i111 lll'I ri~lt'tto '"''" di ,dluk dt·,1111.11r ~ l'"l'h· lllll<Cthlll', In gml'rull\ IJ f'h'S('ll1.t J, 4uc~11 orga1mrn1 J'lll\
'•~mu, Matl\1 rn, mm, r• un.a ,kll'dmuna~i,1llt' ;" ,h ';,11 lil ,I, llr "'hurr (rllul.u i,' ,1111pru1I t "r' •· '' t 1l'l'tl,1 pr t'l.1hx111rnlr l\ d1 ,,m,, gm·ura, pn,~on,1 i:,-...·rr prr,c lr mi,1uc ll<'l.<'•s.tnr pt·r
n ~;:llnu04n11 t i:li ~.tr Il ,1.1M ilttto.l.11.1111111i':\.l•;- o un d1,1111r11.i1t11') ,. 'lw t1111i i m1tr- l'l'lldlt' 111111 01nh1mu11111,1nt· ,u l,11i:,1 ,,.il,, l\·1 11 !l',t 1h ,ontrollo ,, \lhp<'ll<lono le ,dlule, o i
• ' ~llonrddkrulrurl'crlful,111 d r ,1111·,,,rq,'l'.1!~11 ,, u11rnrti11, J'llllfntt, J., l'"l' 11ttrnut1, 111 u111t•11t·nu ''l'J'llllu1111(lin"k."1111p1011r ,oi,1, 'I ~Il, prr l'1nd111Ju.1-
lontr J1 Jll'l'\.l\rnr,w.ll1C', l>l\l'N f.1110,: "'~::,hrn ,h ,1mt•nu11u1,111r Uf'J'h ,,·11111 l.1111 u11 •1· ·'• r111nr J1 h.111t•11, n tt·11( 110 ,1111ti-m·11k 11oi:h1ol,110, 1 GM, per I tuni:hi) (' ~i f"''nt' a rn,ubJrc /)('r
lnon, non ad.in , - 111,1 "'lllr ,h1111 , .,.., I ·I i:1111Ili, t·-.1111111~11<!11 t.Jll!lhJ1Jlhlt111·ntc l,11t1rh1di1.\ ddl,t ''"l'l\'ll\tlllll', ,on,ìJaJl.t un 111J1<a•
1110 Il lt l'\ rn.,"l\1ur, )!ml, 1lll\'nt1 (' in h' IJ ,, lii )'Jr Il\tll.tre: 1111 .1111l•t<'lllr d1
fi hiijl(' o l- un/'l'lt.tntr, 1101,h~ I.a lunr..- l'flo ' ~ ,,~,~ 1$,11 llr ,kll\1p1·1.11111\· Qlll"\f'ulf h11r di ut·,111.1 11111 rnh11,1 r nc"·",ttlll Jll1·,t 1rt' , in par,illdo .,I <ò1111p11m(' JJ <ontwllJrc, con•
llll8 ~ ~1'111telml.:it~ .:uJJ' 'lJ\I (' ,fdfl' Hllll,1111111 l • 1 ' J I 1111111 ,1,1 p,1,,11,·i Mli nq1<111n Pn , p111111, al po,rn Jdk ,dlul, ,1 J.-, pr,\tfot11 dJ ,01111011.m·,
Pfilh1 ,11 labor,1torro l' pn)l.~r<'!atott ,\l.1111.-11-,r un ,1111hrrntc pul.'r •,Il t~1 J h,mc, ,. hr,·iti o , ltlll' IIIIJ'IC!tlllJ liii.I ,1hpcn,1011r J1 h,1t11•r1 sllllll' H,1c ill11< ,11bt1li, o l/1H/rrd111111,p,1t"1,;111, ,, Ili•
n1 Comunq11r,nl'fraso l"!\ Ult',tc~~"fùq'C{,l'Cq111n,f1,11utM\·J i . .a llll,1h• un;1111rn:-1t1
llll' t1llll1'tll1 lll'!t.111\ 1Wflt:llno u11hn.11t: brutr ,ontrncnri "''., ,I 1.-rr,'1111111111 imxul.110. QuJI•
il prohkm.. A qu~r ' q1.tc; tr ~1 \fhfi,ih'l('f\\ <' '"'hti,h ,1>1lr " r11lu1 i, il Il¼ h111 Jr ullàjo. ,1J,i t1p11 di 1,1nt.um11~11u11<' dl·tc1111111,1 un 1m1c111rn1v ,li torhiJ,1:t dd tcrrrno, ,lllllC J\"\ 11·nc
r•l'M"lll.tl'\J ll<'f ~~ :·op,-..~ m1po11Jlll(' (Ullll\q I\' I '.tì, ,'' t'~1,,,·111• ,11111111 '"'' dmri,wtt
11d \l\flll\lllH 111.1,111\ll. Il n111tn1lll1 11r11,111n1 1101 rrhht· i1111,r rimJll<'II' lnnpiJu l 1• ,olturl'
~l'J ••ho Jdft ool ' lllr nu111u"1'flf. , ' ipr'' llll1t111111• dt(' 1'11\Mlno
' lurt J1 C't'llul1· .tn11 I I ,onlJllllll,lll' 1l1wn.•blicn1 r,wrl' dmun,lll'. llll'llll<· 411dk ri,ult.1fl• 11\'f:Jlivr (rarrno limJ11dol
mr:ntr t;ioh J.a iJ"ntrtìc,ul' ,, bOIJ • lld ,, " mti-,111111 h~u,, ,, h,· r • d,,, ll'hlwro 1',\fr( ,icu,,r fl(t f'u11l111011 I,, lllllltl\ .viont·
d.i 1111,'0l'b,1111,' "•ù 11ì-•I tt'. l ahm hJ•o J, «1111,,111111,. h111N111r ,,1110 td.ttì,-.
,. ,w I f)m..11111111 ( • • • 11111(' 11111 I
nwn.amrnrC', J't", d, 1•.11l't(' ...,, I 'ur:a o.\ 1101 ,h J1Jmo, il I ll'tj111·111r ~ • JU)illll
lllatn f " U '1t' I 1111.J.i
rn1 nu. ,, ({lnnl<-1.lfl,1 .thn ., <"tnt;rttJoJ1 tnlltt~lt' ' lll l1IJ1 li J
I t· •
t 1-c-p r,u~, .ault>•
crllul(• m rt1hur11. Alimplasuw /noi,,u,qu<' ~l'C'l:1<' d1 """'PI "'Il r 'llopfJ,111~ tlrllC' u•ll11IC' Ji I 1111,opt,,,nu ~11110 w111,1mmJ1ll1 Jdk· ,oltur,· ,cllulJr, nwlto più tl11tu,i J, QUJnto ,rcJJnu
lt'rmrntarn l' Ad1tùrplium., lai,J IW m11,.\1,...,,1asn,,, 111~,,,,,;, \f,I lll sr.e,lo Ji 111111.1111111.en.- IC' .tlh hr nwltr ,ul,kt11,11 l,tv11r i; k 1Jg11111i \lllll' 1·~•,u11iJlmrntl' due: 11 miwplJ~mJ non t vi,ihik
11mh/, m.11tdtr, re11, h~ Mli son,~:r•,~ IIIIC'l10111 C'JU~t(' J,1~u,'.:;;r/,1J111111'"1/t, .\t,n,rl,on," ,11 m1111,,"1p1i1 otU\O t' IJ ,11i1 ,tt,, IIJ non Jl'IHllllll,1 un rn,rrrn1·1110 ,h torhtc.htj Jd terreno
l!on,r d;1 mlropb,1114 }(' ''"'n ·nt .,, ' ,,,ti,h cd dun10~hil1 I1 ,I Ol11 hll):Jflhtll1 ~uno pi1·1
ult ' •v \I• l'l:u .era
, un-, ,omr u1mhtamrn11 nrJ nirr t 1' <".ellS.1 ,lrgl, rth lh •mp, r I I
' ' 111011.. f f
t 11,· l,1 wntJ111i11o1
m,1rtologi.1 r ndlJ 'rcs.:11.1. G1ò può , "' l\lllo_ orli.a s1111r-'1 ,l1 11~~ 11 ,, 'm.a ,l,1110,,.j Jlt·r I<'
rnltur.il1• I ,.1mh1i1111rnt1111Jo111 d.i 411r,10 mi,Nf!(Jlll\mo wno, iofa111, meno pl'r,rwbili l'"
m111111\",tJIIO pru1,1p,1lmrn1c l\111 un rJllrnt,1111,·11111 JdlJ. \chilità d, , fl''l 11.1 d,•Ur cdlulr t' ,011
un ,,11nh111mrnto Jd 01ch1hoh)mll l' ,kllc 11111,ioni ,cllufari. C,1111111i.1ur, dopo l'er,ldKJ,wnr
duohd, <' • rmdo111 b1olos1,1 non":::'.'"'• ruuh,111 J/'l'f11nc111.a1: ,;,;n~~-', r l'l\•trinr, ndl.a dd 1111,11pl.1\lthh 11cnl·r,1lmr11tr le n·llulr 1111u1ui,1.mo l,1 foro morfolog1.1 or i~inalt• r rrrrcnJo•
h J!l1h r non flJ'ro
'" ,,., '
....... ah1//hca:11111r .
rJ •I' · .
1111 .i llll•lt1ph1drM 11 \'dt)<.ll,I norrn,1k in tempi rd,11ìv,un~ntt• r.1piJ1
hno" n,111 molto 1r111p11 IJ, ,., ,<lllt;t11u11.ttio11c J.1 mì,upf.i.m.1 Jl'IJ,• ll1lt11l't' era J,ni,,lr d.1
' '"''~'''"" dtil .
k coman11J1.1.Zm111, Mii hlrru '"hr il.e In
t "'"'""''".U. '""' b,mrr,, hr f' /11ngint'
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lll l lllld111v111 .irmhrdir .. .11 •c jltl 14 gi1111u, C11m1• ,0111111ll0 ll<'gJIIVO \Ì\'lll' US.lld Ull,I b.:ut.1
• f'CJ t crn11orm non dctìnt1 d·/1, g • '"''ree, 11 Jist CS.Sac rtq1110K • · J11,•m·1to no111110,11l11ta. ll!lni .l giuro, 1·cnguno l'rde\'al(' ;,lìquoll' di ll'llrnn J,1 u11li12.m.• pç,
l'-dLi mll88Jor p.trtr dr, c.u,, I.a 50f~~ l < wfonir <hr li i, ,lupl',1ntgu0z10 rn I.a lung., .•~h 1111,, ul,ltt urht pio~tr.i J, ,111ar, ~u"~'h-amrntc irrcuh.ttJ in u111d1zw1111mJuoh1ehc wmi: d.--
k rnltlUl' conran1111.t1r Ndl- t • ne, pru N"mpltcrcu,,..,._ iuJ ll"rtcno
• .u1 tnllJalr dcli ..._. nel , ,, 1111 11 ,..,p1,1. Ilupo 14 giorni Ji in,ubuiunt·, lUll(' I,· pi.t,trr wni;onn cs.imm.1tc ,ti 111i.:ro,,,,.
ou, m,smun10 rt'S""JU.lb·'- rn~• il u1111.am1n41101, r1muo1'rrr r-• I
,·- UC' <'ULlllll' n,)('f 11 I ('" l'Uò 1 u (' lllunarr p111 ttl\c,ti.ito J un ingnm.lunrnto J, JOt)I(, Ndlc wltutC' pmlll\c M 11,-.cn~ la ltirma,,on.:-
COtK1, ru11a,1a, qucst.i proced 11 J\ilggr (' ,uh rnr.u..- J, rft-
t.i ur.i non ~ ro,u,.,, h 1 111 .UJom co ..,lllll'f ti 1kllr 1,p,dir wlunil' .lc1 111i.t1pf.,1mi, <it•t1~11zutr J.1 un.i 11111a ll'lllr,1.lc gr.111ul1:;t opJ1.':I c,r.
nunaft' lllJ ,memo ddJ art.i d1 IJ 't"ui i C' '"'••hr fa n n ant1h1011" o an
smwm contamuun11 inrn Sl<'.rrlr ac, ~r /4 ro»,b 1,•,~•1dlOI.Juonr dr coltu-""11 wnJ.ita d.i un horJ,1 1r.ulm1Jo ,hr ,onla1){l' nllr rol11n1r un t1p1w u,ptlto a uom lr 1110
, , • • d11f1UKt ,.. con (I ig. .l..l), I11 l'·" Jlldu l">trthbr ffit'I<' orcosar,o ,111,-st ue un c11ntrol111po~1t1111, m qu<'sto C-JM>
nr dt-i 11'1/0'or.
Il' l'IJ~IH' r ,1 icrrrno donC'bbcro CS5t'ft ino,ulJll u111 un ll'ppn 11010 J, nu,opla\m,1, romr
,\hnir/,1111111 ,11,1/1 \I ,\lrrllp/,1J1nil p11r11111t111Mf,
 i6
IUOOfUa ,\l BlOlOc.?A MOUOltAII
rom:u CD.U'lAkl
nue b necessità di ncomrt agli antibiotJn Qwlora alcun col
com nmUO\nle unmeduwnm1e dal bbo e ture nsultmo contaminate, oc-
diffus _,,_ ratono, dmnfttUrle e autoch\'atle Come pm1sto d.llle buone pr:1t1chc dJ bboratorw. usteriliù delle colture d<n-rrbbt (S3Ctt
ioni.' ucll.a cont.1.m111u1one In D'"""'n ,.,,,,, l per pmau.rr li
•..,.. ....., una co tura conwnin.ata ò controllata regolarmente per a c ~ l'asscnu d, rruaoq;mwm Ciò~ putKOwtnaltc un
sotto ap~ o nell incubJtore. lnoltrt, tutto a1 nutm~e di d pu essere apttta
ed tlunuuto unmeduumrntc al temune dd b\uro. Ciò d=o r'>'t' Nere decontamuuto portante neUa prcp.iranonc di prodotti dcm-au d.l cnlnm ccllubn 0 ndla prodtmone di
ddb nomutm1 \'J!:mte, che pr~'tdc che I prodo di be csscrt cstgu1to nel O)pmo ~tock d1 cellule dt:)tmatc a essere comm-..te. ln gmeme la prc:smn dì qu~ ~ può
terrm1, ~wio rey mmi rnnu ddi'duninuJ ttJ scino ddlt colture cellubn, compl"C'SJ i c,..cre scoperta precocemente e, di corucgumza, pos50no c:sscre p:t'S(' le nmure ncccssane per
rùl1 contarrunm11 enl1 <;a,rtJ m M _.,_ one (usando un d1S1nftttante) e che tutti in,~,. C\'lt.tre una contammaz1onc su larga sciL1. Perù trst dt controllo 51 sospendono le cdlule, 0 1
, «>' ~ .iutuu.1\'ill pnnu d ........
Ne!Ja S(Slmnt' ddlt ~olnm cc11..1._ il i cssertgettat1 o lllCffltnti prodotti da ~ ottenuti, m un tcrrmo orponuno brodo tnptonc soia TSB per I md1\"1d~
fi d uun, nsch10 d1 CODI.IIlllnUJ uonc d1 batteri, o terreno contellffltc u~ro, TGM, per I funpu e si pone a mcu~ pcr
ome • PR'Oecupanonc Dn'tfSI &tton ~sono onc rappft)Cnta la pnncipale
b,1>ro non a<Utto, pr~ure stcrùi ~ andico~tnbwm, m p.irt1col.are· un ambiente di 14 g1orn1, oaminando quoudiarwnmte La torbidrtl ddla sospensione consadcnu un mdlGl-
mo aupeuo è importante poicL• ,_ f e e ~ rgime ddl'operatore Qu-t'ult tore di ,~cita micn)bica. t n~~,wio .ùlesurc-, 111 p.mtl}do al amp1011t d.l controllart, con•
fungh è , IK" w onte pflll(1pale ddk COll • • • .., I•
J • uppròellt.11.1 d.tU"opcratorc. ~Untcncrt un ~ o n i da b,tncn, lievita o trolh sia po\1ti,1 ,1a neg:uin Ptt I primi, al po510 delk cdlule o da r..rodoru eh contro!hrc,
P~• di laboratono e procedur<' ~tcrib doncbbe amb1tnte pultto, adort.irc una COrrdfa viene 1mpicg.1ta una 50,pcm1one d1 Nttm come BaaJJus subrilis o Oosm:!111111 sporc,gma. co-
ru. Comunque, nel ~-aso queste si ,-erificass.cro, ~ qumd1 ilutare a ridurre ti rischio di infezio- me controlli n...-gau, i ,engono utìhzntc brute contC'llfflU 50lo il tcrrmo non inoculato QU3.1-
ìl problema. A quC\to scopo, t importante con:11S1gl1~bilc occupmcne )Ubito ed cbmmarc s1asi upo d1 contamm.111onc detemun., un m,'f'ffllt:nto d1 torbidità dd tenmo, come 3''\1enc
pr~ntJrM per ..a pere come nconosccrk ere I 1\-ersj tipi d1 lnfC?Jonl' che po!>SOno nel controllo po•1t1,u. n . .\)ntrollo nq;.111\'ll dO\-rtbb<- am"ttt nnunc.-rt limpido. Lt coltutt
~d Cl5o delle lolturc d1 cdlttle am al . . - l0ntammatc dm rehbero n.-en- d1nunate, moitn- quelle ruultue otsatt\T terreno hmp1do)
mente facili d.i 1den11fi m •• le m1cz1om battcnch fu dov rebbcro e,..crc "cure per l'utiliuo o b ron$CT\ UJOne.
d.l micopb.smi . '.arei e bOl.m. L'altro tipo d1 cont.irninu e c ngme sono rclati,-a-

=~~:•
n

i:cUulc mcohur.1:
'' p1u picco I proc-u1011 (ma 0.3 . ione p1u frequcn11: ~ aur.ata
t
f,:;:1 p.irete cellulare rìg1d.i e in ~d~~1:::) grado J1 replicarsi au10-
,\f:;~ ~cn:unque S(ltclc J1 m1coplasm,1 inCltopdlasma delle ,clluk di
2.4.3 Mtnrifinuionr dcllt C<intami11a.:iom da miropln.,ma
I mi.opl.t\ml M•no wntanunanu Jdlc colture ccllulan molto più d1ffus1 d1 quanto ,reJano
fnmmtans e A.chokpla.<ma : ;;;} IIIU, .\f)t1>pllum11 arg1n,n, Afrcopra o d1 con1.1m111.in- le an... he molu addetti a1 l.tmn, k- ragioni --000 e,smz1almrnte duc· 11 nuu1pl.1snl3 non ~, l\ib1k
problcrnat1,he, po,lhf non ~~o i;;'· ~ i~e11om c.iusarc da •questi ;;111 ora/~, M!toplaJma al m1m1'>Copia otti...'o e la )U;t ,l"CSClt.a non JcllT111ma un m,mncnll, d1 1orb1J1tl del terreno
ZJone da m1copl.1Sm.i, ~ non contro~:::~. ili ed elirrunabw facilrntntc.
~-olrurc, come ~--amb1amm11 nel
1::rlSlllJ sono p1u
bolila~ dcglt effetti impcrccttJbil tre I.a cont.imma-
rnlturak. J ..,11mb1.1mcnu mJ,1111 J.1 quc,to mtù\ll-gamsmo sono, mfatt1, meno percettibili e l.J
mamfè-tJno prin...ip.,lmrntt:· ron un rallentaml"lllo dclJa \'nOC'ità J1 crcscna delle ,ellule e con
morfologia e nrll.1 crc~11.a, Cio ~et.1 smo, nella smrcs1 <h DNA R~rn,1 danno~1 per le un cambi.tmrnto del metabol"mo e delle funzioni ,cUulML Comunque, J\'lpo l'erad1,uaonc
dulib1li e a prodotti bioJog· . pu po~r.irc a risultati srcnmcntal1 no. 'm e proteine, nell.i del nuc<•pla)m.t, gcner.i.lmcntl' le . ., llule rÌil~qubtano la loro morfologia ongmak e riprendo-
1c1 non Mcun. n a 11bbil, .
e non npro- no a mohiph,.11'Ì a,clo...1tà m1rmak III tempi rcl.itl\ammtc rap1J1
2.4.2 ldentifica.--,one ed elm11naz1ont del/eco t . . . Fino a non molto tempo 1.1, b ,·ontammazione ~ mr,oplJ,ma dellr colture era d1fti,ìle da
n a1111na.:1on, batt . h ncon0'-'cre e I c.impioni dO\"C'\'300 e--strt' anahzull d.t l.iÌ'Oratori \p«ialuzau; attu.ilmente
l -et~·
,e contamm.1zion1, \1,1 batteriche \JJ fun . JJ•trg,nc \OOO mH-.:r J1spomb1li tt\:nichc m1gbori che con\C'ntono l'1drnutkaz1om· dei micoplasmi ne-
agenti r~pon'>,lb1li ~onn L - .b li gine, '>Ono faolmentc •·d 6 gli sll"SSI labor Jton d1 colture cellulan. Tali lLxmche ~1 b.1S.1no ,uU.1 coltura microbiologi~a
..,, vc-11 v1s1 1 a occhio d enti cabT
cclJule non wno v1s1btl1) lnf,.tt" I nu o sm dalle fasi in;,.•, ( 11 P01ch~ gli delle cdlule mfe11e oppure \Ulla ,oloruionc indiretta dd D~A. u~ndo 11 ...olor.intc specifico
•• so llamcnre I b.ttr d ·--1 in real I
1 • •
t.. e un ambiam<'nlo del colore del tcr J· en ercrminano un auro ti e ~ingolc tluoro.:romo Hoc:-;:hst 33~58.
d.iUa contammaz1onc· inoltr- n1ed rcno • coltu~, dovuto al c.irnb1•rn enro dcU.i rorb1dj. C.On la prima tecnica, le cellule in so~pcn~ione sono inoculate in terreno hquido e incubate
' •· 1.uirc un csam • Cllto d'
come strutture tondesg1.1nu m m . e m1croscopko, P<>M<.ino •pH c.i~to m condizioni aerobiLhe a 37 "C per 14 g1orm Come controllo ncgati,o viene ~ta una beuta
f.-' . O\ llllcnto. I funghi · . . . . ~re n
SC"ll~ I ..e e per i contorni non dcfin111 delle colonie eh• lll_\tct, s1 d1~11nguono per b ~nosnuti di terreno non inoculata. Ogm 3 giorni vengono prdc,·ate aliquote d1 terreno d.1 utilizzare per
:-lclla maggior p.1rtc dei Cali, I.i solu.1ionc e s1 wiluppano sul terr<'no ungi ere. inoculare una piaslr3 di agar, suc~~1,'3mtnle incubata in condmom ana~robichr c~me dc-
le colture Cònlammare. Nelle fasi m111.11i dclr~~~cmphce c~nsi,te nel rirnuov~ ed xntto sopra. Dopo 14 giorni d1 incubaziom·, tutte le p1ame ve~gono esaminate al m1cro~o-
m1crvrgam,mo rcspons..1b1le m d. . ntamina11one s1 può rmt• d· c ~ c pio ro,·e.ciato a un ingrandìmento di 300K. NeUe colture pos1t1ve s1 OS\Cn'3 la formano~c
e 1ante npctu11 lavJv,, · b . . «re I chrn
cot1~; tuttavia, qu~ta procedura non è cons1 .,.,1 e mcu .umn1 con an11b101i llluc tl
tammate all'mtcrno dell'arca d1 l.a\·oro sr ·1 ghab1Jc poiché la mampolu1one d Qi° antllll1-
dcUe upic.:he colonie dei micoplasm1, carattenz.1.Jte d.t una_zona ~e~trale granulo"~ opaca m:
condata da un bordo tra~lucido che confc:ris.:c alle colonie un t1p1co .bpetto J uorn fntto
8Jnismi contamm,mti. en e acut:M.c la pob1bil11à d1 d1tfu~10 • ~ ru" COn-
nc et m1cror. (Fig. 2.3 ). In parallelo potrebbe ffiC'rt ncce~o allesure un controllo po~1ti~o; m que\to C.l\O
le piastre e il terreno dovrebbero essere inoculati con un ceppo noto d1 m1copla,m.1, come
,\fycoplam,a orale o Mf(op/as11111 p11,•u111oni11r.
 com-u CllW1.AaJ
79

runtt accerurs1 cht la fluol'CSCfflU Il<>SSef\'314 non

".'otam;...., l<eoh"" ""°" ,. • I
mo '" ,mpo
DU d, <onùmmuoo0< lu11tt1" o I •
d 'l''""' '"'°"'°"'° "' •
rlast1a dd·,
' b,nm •pp,nr.mno P,
sia donna alla prese I "-bbncazionc. ~d pnmo 050. •-·-i Nel s«ondo
I nouso duranrc a ru w -'-uficano i .nucopw~u1 ••
""'"'"
grandi mo a,. punti. o ai 6bmmti
rispetto i lruo=ti
fl Nenu,h, non"""
umformca au~ d,IJ,,ldT,,,ou od•
,....,,. lo sporco dovrebbe generare una uor •onu ndLt plasuca.
.......,,
le dimt'tUioni delle paruce• Ile no· rmalmm1e pr~...

2.4 4 E
limina...-iont dei mi,oplasmi . . do nucopfasm1 era
. . d 'dùniomon, •
. ti il metodo p1u utilimto fl( T~e soluzione, tuttavia, non
d·
Anw, ;, ""'~• "'."' •nihWoci romd, ''"""'"'"'· m,b , ,_ "' • •~
;., "'"°"""
""'P"
'""'"'• d,II •mp"'° '

Joohtt, ù
·
"l'I' ,ffi=, ;,, q,..,o non """ "PP
. ib;o,"' non ""'P"""""
""P"
; ID mkopt..m,
·,. "ù '°'"" " •"·"'""'·
• l'dmù"'"°""
,nnd . hnn.,,; ,iiliu,ù puu " " "
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n<
""'° d,U'U>lttu>-
11

ptib;.,;a ID nuo,, """~ .

ne, e la maggio~ parte c1 ru rcparazione lnnrn.. :cù
I an_anche a concentrmom re 11·
ente, è ~uta mtrodo~ u p cffiCICt' contro J m1copl~m1 prodono vengono tra•
fl, ~ t
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(Plumoon) . eh' è " è.dimo~trata
. h, cr; •••.,;.,.,
, . <Onlrnuu ml'dimmwo0<
questo . !asma
dd m«op
· -• ••, • I_ ., ...... I I 'i,ò • • l ... ff f I \'3Jl1Cnte ba~, non c1t?_1 ~co delle cellule, faa1itando ~1
li atm-amente alJ mtrm . ctabolbmo cdluùrc. d i rodutton, doneb-
,po"' dT,11;.,..,.,,wm . · " m1i,h,,..,,, o p ,o1,,.,,,J.
"'°""' """"'· ""'" '•'°""•"' "••<hswu
t., -
..U.. dd DNA, <0>111";~, "o',l"""tiv, ' " ~ ; ~ : : , . ; , ,ono '"::'.::;;;..,:_.,il""':';:::::ologiro d,, •i
,.i,, kg,,o,1 Dx.,.il ""°"•· in grado di elunmare
., "°"''"
""'"' pa _..,_, " " - • """''"'
33256 - roo 1,-, "''""""" '"'"" ffoo,._,,_
"""""'"'" b llu°""""' ! d,,pa., , . , , _ od aio'"""", "''~ d,U. p-...,
odi, <dJul, Q-. b<ro "':, ,«,n; .,..u,-;
l,lm," lb m,m1,,..,. dd m•op
P" k"",!; Vno di qu~i è il .\fn1?x, t.1 e dando inizio alla
<nmpro=nrndon< I '.""'.::.,.,,..<>non, , P•'.·
_,.,,.., m~ "'.,. h1<n1;, non =ndo ,I
d, ""'°l>Luma;,1
solamente dcl nucll"O.
a ln--dlo"""""~k«!Jw, ooo ,........_, _,...,"" ffuo,"<ou., IO<>I.,,.,. ""8" "'· T,k P"""'° "'''""PP' lo n·d,ppo d, "PP• "' ·mm,io ..,,,,,..
l'ulteriore ,-aniaggio d; non "'"""'"'"
te non è no.:ivo P" k roli,tt
~
"" d,<1runo0<. """'
di' ··duaJ'(' d,a 1-Sfg di D'<A
fino · d,
--~•""""''° ,uH-."118,_"°'"'il•rupa,o•r., lttok, bwt, senta
f ,. un anll b·otico.
I Questo .igen
t olto sensiibile•potendo m '"mp1one,
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. ed efficace contro
"'"""'"'° "' """"~""- ""''° ""-"''""'"' ddb <o/"" "' <oo-
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2.5 Tipo ogi·e ce loro
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1o d g,wno "'= Al mnoo ,..,_,., ,.., ,gg;,... ,., ,.,,,,.,., 6,,,, d,J <olotano . an
utilizzaleene e e · - dil'isc m ue
I tipi dJ cellule anun~ ne e 1mtt cdlulan.
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a...,-.,. ..,,,,,.,.,..,., • ,.. . I rcpnma
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1, aHuJ, ,of~lat, (F,,._ 2.<~ tm,J,, rolon a 759). Ndkro11u" ""''"'•po,,."""'-· 1.5.1 Colw""Uul,,,ip,i=n,. .
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1nm, ff<s- 2,~ ,.,..,, , <olon p 759). n.,,..,,. '""" 1«.,,. •_,,. , - . m p,nko- I,"'""" . e sono cos111u11e . . essuto detti ~p,anu.
pru~,an <> od, fr,mmmO d, I .,., ,h,
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tr l'n""'""' d.., cnu1c- n1l>JII t1p1 1nmn11 di re,\1111· 0••cn<'ral-
• -"C>""- n iessuto util1zuto d<'lmnuu il I di rdluJ • ' ··-·
utr cW.l'mdotriio dd \.... .-,,.,M,,..,, ~~- ' l (' ISOUI(", Pcr (S('fflpÌ~ )(" crllulC' uo- Tabella 2. 1 Alcunr lmcc ccUu!an da uso comune lornur J.a banlhc.' J1 ldlulr
.,. _,.,-o..l \'OlgOno unlllllC' cdluk r dot li3 li
cùllo stmo mtmntdio dci ''1il • • _n <' .' menr~ quellr isolite I 1nractllul1tt Morfologia 5p«ic 1e~\UtoJ'origmr
l.iscr. Sd>brnr mtramb, i up, rv,~1 r da tts,utJ antloghi 50no Jrlìni1c c:dlule muscoJari ---~
r ~ ~~ ottrnuù dagli st~ · · • · RAt:- 1 Endotdi.ali llo\mo Aorù
morfologicamrntr di\~ lr cdlulr tndo1dwi ~, \'2\1, >Ono INolog,l-am~te f IUIK 21 hbrobLuu Cnctlo ••mno Rene
itrato, a.mtmzuio d.a un.a mo,folllò'U cbc ;:cra!mmrr Clt)('Ono fornu.ndo un unico CJlt) I ibroblut1 <.r,cctounrsc Ov.mo
musrobn I~' im--• ,,,.. .11 neo una r,mmrnr.wonr
...., .,,,.,0 ;wUn!;llt con nt1cmitl ru . a cmttoh · ,.. c·U··•-
• .. • wc: {t)s.,n F,hrobwu <~pllC'CO JllgJO\<trdc Rrnc
stnu, ancht qumdo ~ lllllltmutt in coltura. Oh s,tomu e c~ono disponrndosi ~u più lld~ lp11~1 Uomo Ccl'\ lct utrrinl
di colturr cdlubri, l.trgamm1r utilizutt, <km"ltt re a quC'\t~, t"!btono molte altre IÌpologie Hlli:,Z9) l:;p11m.1h llomo lkne
dli le~\uto connt11nu, i linfociti IUI d.1 numet'OSJ lb.\Ut1, Ira i quali , tìbrobluti H~l9 Ep11duh Uomo <.olon
quello ep.iuco. ~~,. • n('Uioru IUI ,~,uro nm"OSO e gli ep.uociti da MRC-5 f1bmbl.u11 Uomo t\,Jmonc
~< I lit,(,() f.pllordh l'omo fulmonc
1.5.1 Linre cellulari ronttnut ~ll"31'3 frbmbwt1 Toro l:mbnonc
TIIP-1 Monoou Uomo ~ngoc
u lmet ccllu!ari con11nur )(!no f, \ '.79 librobw11 t:ri,clo Clll('S(' J\ilmonc
mà d1 c~rre mddin onn.atr da un uruco llpo ccllu4rc h IU.l'I ~~h,-111 l 'omd h-gato
nedellrcdlule iumrnt<'. ln gtncrrqu~ ca~,1ù co . e ehi acquisito li cap,t-
mjon<' a d1vrrs~:~:ura mn di,"tl'.1 metodi, tra i quah il trar~ in ~ilo a lrasfonnuio.
(f.R\') od ,,rus ddh....,:;~il \"lflb dcli(' ~mnur s,ml.lll 40 ';:~o~ cance~g~1o l'~po- l 1n altro wmponrntt' fon<Umcnt11lr Jd tcrrt·no d1 l<lhura e il ,icru, ,ohtJmcnr,· bo\ ino,
J)ttdiu da p.lrt<"dcllc ·rii i.a munna d1 Abdson A·Mut\·' Qu 'I ,i.nu d1 [pslrin-Bur anlhe fctJlt', I.i lUi funzionr t t;imp,.lnarr 111crrcno d1 cohur.1, m,1, sopr,111utto, l.ivome l'ndc•
lule tra~fonnate ~ ule de!l.t ap.101.1 d1 ,onirolbre I.a crcx ••ei.Co11 tra1umen1i causano la ~ionr Jdlr lCllulc l" fornire nutri,·nti .1dJ11ionah c fattori d1 Cl'CSllla con att1\ ,1:i s1m1lorn1ona-
no oontmu.amrntr • '"' mt conse I le, eh<" , umol,mo I.i \fC'SCtl:a delle lrllule. An,he \<" le cellule 50110 111 grado di produrre autono•
!'<'nodo d1 ,,~ mfinu.i (\1 J fi r, ,ontran.amrnte alle coh guenza e ceJ.
che, g_cneralmcnte, le cdlule :r~~ono •mmortaJ1u.11t'). l'aspc-t10 n ure pnmar~e, h.tnno un mJmcntc :akuni fatton d1 c-roc11.1, il trntat1vo d1 ~olri\'arlr in a~st·nu d1 \icro gcnc1almen1c
no ongm.anamcnte, rn ,-nu ln o~•:~ renfono llcune <kllc
n~rti l •
cara,~,.11~'0 <on,1)te nel fatto
• p,trtl,owrr' crrte lmet ,tUulan \labtl~Ull,he eh e po,>CU<'\'a•. _.1
non dà luogo 11 colture- ),.)OC o wdd1,faccn1i. 'JuttanJ, nono,rantt· i ,uoi VJnt.1gg1. l'u~l dd ~ie-
,- com gm1 te-.suro lp«ifi ro è IUl'""° in Ji!Ku»ionr !oCmprc p1u 'Pl''"°· non d.1 ultimo per 11 fatto lhe può introdurre cle
1 1 1
du~ 1f.at1or1 dcli.a co.an.,1 · ' ~ C'.SClllpio, le lmet cdlulan ,.,, h non t'$primono alcuni m<'nti non ptt,·1,1i, tra i qu.ih agenti mfc111v1 come, iru, e mkopl.nrni
t-"'.tZJone. \,.Qmu.nq 1 1 .,.au, t son
laI11.UII<", prC')ffltano dl\-r . . uc, e mec cd.lui.in ·o . o incapaci di Pn>· La compaN in lt·mpi rC\:cnll Jdl.1 "mal.1111.t ddl,1 muu::i p.11.ZJ" (rncdalopati.i .spongifor-
b r,1 ,.ani.1~1 rup(no ali ' nunur olr
CTC'Selta, h.tnno un tnnpo di du hc . e rnlture pnm1r1c-; ridu~- re a C').\t"re •mmor- me hO\ina) ha .aggmnto un ulteriore drmrn10 ni:ga11vo, partu:olumcnte rislhiow per l'opc•
alb .supnfiae delle~ P .u.ione p1u brt'\;: e rouono •=no mrno siero ""r rarore, mccntiv·,mdo I.i mhic,1.a di proJoui altr:rnJtiv1 ul siero. A qur)IO propo\itu, J1vcm
A lL'll c. crcscert 'e" d r
Il mente ~no disponibili I I ~ O\'cr adrnre proJutton di ingn-tl1c.'nti per lOhurc lCllulari hanno wilupp,110 lcrrcm privi J1 siero intt'grJII
n:ndr p,u facilr Ollrnc.'re qur~u tim~ te mcc cellulari fornue dt di,'l' con J,fkrenti wmponen11, lrJ i qu.1h J'albu111111.1. l,1 trJn,krrin.i. l'm,uhna, fattori Ji <r&Ua e
~ : ~~~~;~~ilrJform~o~: li~:l~~:~u:;; ~o;:!::rn~c:
•uK ra~ltsbun G
iari fornire cu quo-ua o,p
,,...n'-"lkcrionof
·' m ,ran Bretagna. Uiu .sci
::.h~!
~:~ult; ciò
e mag-
"°"'mal Ctlt e 1
altri tlcmcnll c~n11ah prr IJ cr~cira 011im,1le dc.llr lCllulr, Quc)tO ICrf'('ni sono molto uuli,
,pcl1almcnrc per le M><irtà fJrma,eutkhc o b101ccnolog1chc 1mpcgna1c nella produzione di
f,umJci o prnJoui biologici dC':\IÌn,ui al ,omumo umano o animale.
nlZZ.Ulone t nport.ara nrll.i t.abcfb , I CZ!ooe d1 .!cune hn- 11" •
• • ,., lt U•
~.S.J Terrt11idicr~scitatdtsigtnudtll l . 1.5.4 Prtparazionr dri ttrrtni i'" lt colturt di ullulc animali
t co turr d, cel/u/t an,nia/
ll terreno utilIZUto ptt le colture d1 cdlul . . . , Prob.1b1lmcnre s1 d.\ per ~ontato che la prcpar,1zu111e del terreno d1 cohura Ma una proce
nutnenu (amm.m0.1cid1, fonti d1 c.irho c_amm.1li t CO)llluno d.a una dura ~cmplKc e hnr.arc e, ~pCSMl, non le s1 attribub<r la giu\ta com1dcr.monc r a11cn11one.
(contrnenti,ptt<"Semp10,nugnes10,sod::r.a11; come il glucos10, e v11am~l1c?111p1~d1 Comr conscgucnu, I.i maggior parte delle cun1amin,1.1ioni nei lahora1ori di colture ,cllulJri
d r anr1b1011c, a larrn
lo) cb•··-
i~ttro. .>e
·o- r
po mio, alao, lusforo' clo ro,so1r. 'I ~ bJo.,.,_.
VCTIC' non . ·-•ICI deriva proprio dai tt"rrcni 1mp1rg,11i. Allrncndmi alle semplici ma cffk.1c1 pmccJure docnllc
,spcn~bde includere un fung1c1d.a comr I' .\~~pre ncct'l.Sano, m akunr .i o e b1Qrbo~, nd pJragrafo 2.4 I,~ pmi1bilr cv11arc, o comunque ridurre al minimo, 11 mch10 d1 contami-

a a$«::~~:
cilmmte il pH del terreno, può~ mclu am otcn<~~.a B. Prr como<111.ì, COnd1zion1 t 111.
da rosso (a pH 7.2-7.4) gw/o o fucsia :td•l.'.ltore d1 plf m=f:~~oll.irt fa.
pH dl\enti alido o ~1 l 'che '1ra
nazione dei terreni durJnte I.i loro prep.u Jzionc.
La prcpararione del 1crrcno dovrebbe cs~rc- conJoua in u0.1 cappa sterile; generalmente
comporta l'aggiunta e.li sirro, addtZioruito d1 un11b1otic1, m quantità adeguala al volume pre-
• C1 mo.
,1ab1h1o d1 terreno. ui quantità di Mero aggiunta dtprndc dal tipo di crlluk-, mJ normalmente
 62
BIOCHL\tlCA f 11101.0CJA MOLCCOl.ur

COIJ1,'Ttf Oll1IWU 63
vana dal IO al 20% Gh ant1b1otrc1 usau p1u frequentemente sono la peni1.1Uina e la\ .
cma, ~he imb1scono b crescita d1 un amp1osp(llro di b,men Gram- )lt1v lrtptom1-
~ pemc1lhnJ agl5(e inibendo l'uh1rna fa~ del'3 smte51 della parete ,:ular; ;a~;am-negatl\ I
s1rtptom1~1na blcx~ fa ~into1 delle proteine erica, mentrr
Una volta prcpMata, qu~ta m1s..--da, defiruta trrren d
S<:n.1ta a 4 •e fino all'u1il1uo Per minunJZ.Za I o i_crescua completo, den~· es,ere con-
zione, è cons1ghJb1le prcp.irare solo ti vofuni r:g I sprechi, e ridurre il mchio di contamma-
ten·.tllo <l, tempo mtrctto Inoltre com ul e terreno n~no da utilizzare entro un m-
bn: u li d • e tenore pr«..11mone è ~m
mp, eua del terreno pnma dell'utih.zzo li prc: opportuno control-
do\ rebbero ~\creehmma111mmed1atamcn1e . UltJ • terreni chr appaiano torb1d1 o \dati
~ore dd terrt'no, che a pH lìs1olog1co dovrt'bbe Inoltre do\Tebbe ~re controllato anche il co-
cnolo ·' ltrrcn1 che appJJono g,.ùh acidi esscrr rO)\O per la pr~u del colorante roS50
a que)u ,-alor1 di pH I.i \11.Ù1t.l - .,_ ) o fucsia (.ùcalin1) dovrebbero e5.5ere çcartat ~L
, , w con'>egllenu la cr d I po1u,é
l'SClta elle cellule, viene comprome<;sa.
2.5.S Subcoltt1re cell11tar,

Con il termine sulx-ohurJ s1 intende ti

dt.luuc tn un tmrno d1 cresc processo mediante ti ual I
ne la prosecuzione del! 11.t fresco e poste d1 nuovo in una ti q e e cellule sono raccolte,
a crcsCJta Questo asca per colture
~no per mintencre le ceUul . proc~. che,1enedef111 t h per consentir-
nodo d1 tempo, le cclluJ I~ rn uno stato sano e vitale: m caso I o anc e p.is~gg10, è neces-
adcrcnt1 CTNono fo e nde e colture contmue PQ)5on~ co~rrano, dopo un certo n.o. rigur• 2 'i ~h1c111 per cdlulc.
bi! nnan o uno strat monre. Ciò avv r-
m e a quQto punto \1 dic eh I o tnmterrouo fino a occ iene perchè le cellule
confluenz.a smettono d1 divi~e ~~coltura cellulare è a conflu~~are~urta la superfioe d1spo.
Rnccoltn tielle cell11le usando en:imi protc:ol1tici Possono e,.)erc utilill.3U dh-c~1 enzun1 pro-
sc1t.t 'iene interrotta ( ~nes.:c~ entrano m una '",e d1 qu,Ck u. uando le cellule sono i
e ottenere deUe tra~fonnuioni ~e .tll.t fine muoiono Quindi tnz., durame la quale la ere- teoh11c1 tra cui la t 1p,m.1, un enzima che rompe le .::onne~1oni proteiche tra le cellule e tra le
cellule e la superfk1c della foN·a nella quale crescono. L'1mpu:go ddl.t tr1p~ma determina il ri-
noi a una completa m1bwone da co~:":1'' queste devono ~•:::bcor m,antl'llere le cellule \'itali
co te poco pn h ...uo. In condizi llvate pr h lascio d1 ~mgole .:cllule, una cond111onc: ideale per preparare )Ub.:ohure po1,hé aa,;cuna d1 cs-
I.e nu e e raggiungano lo oni idea!J le ctUuJ d una c e arrin- 't: andrà m1.on1ro a dr,1S1one, favorendo in tal modo la propagazione della coltura.
spon b~Uulelpossono es~re raccolte:~:~• ,confluen1.a.
1 11, sce la esscnz I O tnate util
e avrebbero essere rac.
a,..
Solitamente, la mp~111a \ iene uuhzzara in combma21one 1.on EDTA, che ne ~e l'effi-
ra mente a seconda che le ceUuJe IZZ.tndo una delle diverse t .h ,a,1a. l\nche impiegato da ~lo l'EDTA t m grado d1 s1a1.carc le cellule aderenti, poiché chela
S b I siano aderenn ecmc e d1 gli ioni u nchiesll da alcune mole..:ole d1 adesione che faùhtano le mteraz1om tra le cdlulc
u co ture d, cellule aderrnti I.e Il I oppure m sospens10
te US.tndo una ,parola d1 ce u e aderenti P0s.so ne. o tra le cellule e la matrice. Sebbene l'ED IA da wlo sia molto p1u delicato rnpetto alla tripl>I•
us.tnd d g1 gomnu (ch1am no ~sere ra J na, quest.i ,i rende comunque nec~saria per il distacco d1 alcuni t1p1 dr 1.dlule, che aderiscono
I o e • en21m1 protcoli11" I.e ccUul ara anche r11b"" polte eco te sia rnecc.inicamen
une m terreno fresco d e m SO\rv... . eman) )li en. • con forz.i alla plastica.
., pren endo u d r•=•onc \en , ....1rna11cam
genuo un ugual volum d n e1ermma10 Voi gono m,·ece sem ,. ente, La pro,edura standard per staccare le 1.ellule aderenti us.mdo tnp)ina e EDTA richiede la
e I terreno fr~o urne d1 ~spcn Pucemcme di
· s1one ceUu,_ preparanone d1 una -oluzionc: dì tnpsma allo 0.1% p1u EDTA allo 0.02% m tampone PBS
Rac I lilTC e agg1un
co la mtccanica delle cellule (Pliosph111t·-811ffm·d Salme) pmo d110m CJ.1• e Mg •. Per rimuovere trac.:c d1 ~icro che potreb-
1,~.i1.1menre le cellule d.tJJa t \Cmplice e d1 facìJ bero matt1\·arc la tnpsma, 11 terreno, iene .up1r.110 d.tlle colture a contluenZ3 e le cellule ven-
un mamco ngido di superficie di cresc,t.t med e attuu,one S1 Proced
gono lavate almeno due \Ohe con un terreno pmo d1 siero (come PB~ -.enz.1 Ca e Mg- ) A
JlO.s),lno poi risospcn::~rcnc e da una lama ~flìc/~~te u_na spatola d1 o; raschiando de-
celluJc, poiché l'operJ11one ~ lerren~ d1 coltura. Questo P0lie1ilt'ne (F1g. 2\, ma formata da
questo punto, .1Ue cdlulc in monoMrato ,1 aggiunge la solu11one d1 tnp\ma-EDTA circa I
cm ogni 25 cm d1 ~uperfide) e si agita per alcuni \CCOndi. L'eccl~ d1 tnpsma-EDTA ,,cne

tanre "ondurre akune pro, ;;:t

morte d1 un num~-ro cons1s1 • Ta'>Ch1amen10 può dann metodo non e adatto, in modo che s1
cellule. Prima d1 u11~e la membrana,
,-aiutare la ,11.tl1tà delle ceUuJ d imman, u1d12Z.Jndo u e questa tec,11,a t rmm>illdo I.i
/c;; tu11, • hp1 d1
quindi aspirato lasciandone ~olo la quantità ne1.e~s..ina per formare un ,do ~on1ll" al da sopra
del mono\trato. I a lìas.::a viene qumd1 m~ubata per 2-5 mmut1 a 37 °Cm un incub~torc per
e opo fa r.itcolra na Piccola qua ,qumcJ,, unpo colture cellulari controllando, a inlervalh rcgolan, mediante un m1croscop10 r0\csc1ato,
n11tà di ca r- quando le cellule: inmano 11d a,~umc:re un .i~pctto tondc:gg1.1n1e e a ~t,1<.'C:lrM li morutoragg10
mp1one, per
ha lo scopo d1 C\Jtare la ,o\·raci.po,1zione alla trip)ma che potrebbe comportare gra\1 danna
alla :.upertìC1e cellulare, fino a prom.:are la morte delle 1.ellule. È unportante, qumd1, che la
~- - -~----
 84
l:OOIDIICA [ Bl010GIA MOU(°'Aal
COLrtJli CfllllLU.I
re.wone di prott0lui s~ blocaua ra 1dam
rnatlJVilre l.1 lrrpsrna u SOS t'
% Il aggtungtndo terreno completo, in grado cfj
cmrnfug;it.1 a 1000 .rnm pensl10one , a u e ,·iene r.iccolra rn un rubo ~tenie d.i centnfuo,. •
85

, per nunu11 allo scopo di sed' _, a-" t lmm , 1mm , 1mm 1

qumd, mospcsc m un ,.....lu d rmentare 1e ccilule, che vm-
• v mc- noto I terreno dr cohu I , o-,.., :: !I! il.
SIia ,.:llul.1re desiderata. ra comp eto ,roco, per ottener,· la dea.
■■■1:1 I. ~lllf.'lfi'WIU■
Come ptt IOiie le proctdure UJ CUI " m.tni un
OCCorrr la,·orur ~mpre rn condaio SI I
,anno CSC'gUl!e m cappe per colrure r: :;i.'·
r .
o colture rwutali, anche in questo caso
,,o sr~nilica che tutte le opcra1ioni dt'SC'ri~
■■■lii I 11 1/li.i,fllll■■■
■■■l,11 ·11'/U ,'l'Nl■U
. - - ~ , ,lll:illfl!IIII, ~ ~
====
1mm

la pnu d1 soffermam ~ I.i gestione d luu i ,o ;ndu.ioni d1 ~tmlna. lin punto sul quale vale 1mm
a 20-C e-, rruna dell'UtJJìuo posu ~ ~rti , tr1ps1n~; questa doud>be euere con~rva -■■■llilll'!llilllliii­
scongdamento· trmp1 supen~ri dcte:~~~~;~: .t 37 ~C ~lo per il tempo n~sano
la. la IOIUZJone di tnpsina e- WTA dovrebbe
al;
'"'illone ddl'enzim.i. Una volta prepara-
··••11 I /fil!'.I IMI■■■
■■ll/1 iIl '/,I i 11:1111
1mm

essere Coru(n-ara 1 4 "C per 3 m . ■1111! 111111! 111 ,1111

Subcoltura d, <tllult in <A •
1
t'SJ a ma~~imo.
., 11I:1'
I
-1·
I .: I
~sptrwont Q do 1
sottoporne prrlim uan e cdlule sono • I I
scendo.,,,• marmente, un'alrquou aU'ts.tm• _m so~pem1one, è import.anic 0.25mm
-,...tratc- una J.tll' J • m1croscoprco b'J
s.......,•1 - s1 dctt'l'Jll ila tu o come •""''"°'1
r • •~ one, oo-·o- 1 ~· I pnmo ca ·per )t.t J uc se ~tanno rYWo
·, "e ..... f1gur1 2.6 Ernoc,tomtlro
si senun.t alla dens,~~• dnumero dr cellule- conrenute (come:, s1preleva un'aJ1quo~ di so-
dr cclluJe con terreno I ~, e~~t.1 m una nuo~-a lì~ itlTlpl,,- escr11to nel paragrafo 2.5.6) e
.
m uJ a= le- ·dluJ d
r&o u proc--' =ura t diversa ,. il t
· " "'ente
•
diluendo Ia sospensione. esprtSsa per cenlJmetro cubo. Generalmente, in un.t cmiera di emootometro s1 depositano
"" • t ovr,1nn0 .... erreno e~ ·
reno fresco e tr:>• r_, ~se-re ccntr1fuf!,ltc a 1000 umo e nsulta aCJditìcato· etrc.i 10 µl d1 sospensione cellulare e si contano le cellule all'interno dei quattro riquadri d'an-
~•~..te rn um nuo
Le ~ellulc-che crc:)Co
li
V3 WQ
rp.m per IO ·
mmu11, mospese in ter-
• golo, con l'aiuto dJ un micr<»c0pio con ingrandimento 20 •. LJ conta effettuata viene poi con•
no come a""'"° 1 ., __ vertita in numero d1 cellule per cm•di sosptnsione.
spese m terreno fresco CO oo- -D.i ' uat>no, tm«e eucr
un'aptrtur.1 ili ndou d" me cdlu!e .11ngole, us.tndo un' e prima centnfugate e poi ruo- Affinch~ la misura sia accurata, il \'etrino coprioggetti deve esstrc saldamente: po~izionato;
e 1mr ns1on,, .t P1Pffl.l P.1.Steur O 0 il ule scopo si inumidire il copriogge1t1, lo si fa scorrere dehcatamente sulla camera ddl'rmo-
na pipetta con
2..5.6 Dttermina:• .,
cuomelro e s1 preme con dec1Sione fino a quando sul lato a contano con la a mera compaiono
iont utl numero di celluk gli anelli d1 rifrazione d1 Newton (sunil1 a un arcobaleno). A questo punto, ~, effettua la conia
Pcr- oumerr una uac,ia 0 del numero di cellule in ciascuno dei quattro riquadri d'angolo da O. I mm· d1 \ olume, con
11ppropru1a. Se le cdlule ,-en;~rr;ie, t c:s.scnzwe che le ,ubcofrur . l'accortezza di includere, oltre a quelle contenute all'interno del riquadro, \Olo quelle che toc-
gheranno piu tc-mpo per r.agg SC'nt!nate a un,1 densiu in(; e siano Stmmate a densità cano , bordi superiore e smistro, C'SCludendo quelle che toccano I bord, ,nfenore e d~tro.
~ im-rce la semina ,.,__ 1 ngere l,1 confluenz.a e .Jcune mO"Jore a quella OIIJmaJe tmpie Inoltre, non dovrebbero e~e contate le cellule al d1 fuori dei riquadri. anJie se comp.aiono
la a -"" <:utttua1,1 • una dou1U troppo d onranno Pruna
e.on uenu lropJlo ,·docan
• . ·
di giungervi
• nel campo visivo. Se pmentì, gli aggregati dovrebbtro e~scre conteggiati come cellule \ingolt .
~ t o ~ farro che la tripsina : ; ifornendo ruuJra11 sperim~ le cellule r.agg,ungeran~o Idealmente, ptr assicurare un elevalo grado di accuratezza, in cia)CUn riquadro dovrebbero
' cLgmre .le- Proteinr dr supcrlìo eg.tta nclb PrtQden1e o r . non "Producibili. Ciò è essere contare più di 100 cellule; se il numero è inferiore a 100 o SC' più del 10% delle cellule
sono richiedere anche alcuni,,; e, ~ompresi i recettori Ptr rpe(.,: :1o?e di racc.olt.1}è in grado appaiono aggrrgate, occorre agitare vigorosamente la sospensione cellulare ongrnale e ripete-
può du J o-Orni. J.;a ma ~•ua<:1, eh rt il conteggio. Allo stesso modo, se il numero compless,w di cellule è maggiore di 400, la so-
e uogo a ~ ruposra \~nablle ai f. nca~ ngenerv,one delle e pe~ nnnovarsi pos-
Allualmente sono duponibil, d oUIJUc1SJ)ecifìciPtr 1.1l proteme d1 superficie spensione andrebbt ulteriormente diluita ptr ottenere una conta compr~ tra 100 e 400.
qucsrr, quelli UIÙJZUta p n-rr1e tccnid,c per detc 're~tori. Poich4! alcune cellule potrebbtro non soprawJ\·cre al trattamento con tnpsma, è opportu•
BurkaJ, clic ha il \7lnta_:~ d.rirr1Juentemen1r nchrcdt l'uso~ •narr d numero d1 cellul- t no aggiungere, pruna della conta, a una piccola aliquota di sospensione celluLttt un identico
CO' es.sere .srnipl w un en-, • ~, ra
volume d, colorante blu tnp.ino, che VIene a.ssorbito \Olo dalle celluleo morte. In tal modo k
mumto di una piccola cam- I,- ,ce rd c-cononuco S oc11omc1ro (cam• d '
,ulwndìsso ....,,u ondodrUa · 1 tr.i11,1 di ,r.i 1 cellule vi,·e appariranno come strutture quasi trasparenti. mentre quelle morte appanranno
m cdtciivig fil nm-rgrilld1 nquad ~uale sonomc,~deUegr;.., uno spesso vetrino
m e una profondità di O.I mm.contcn n n:quclj,d'angofo,che ha 't,'lt'. La camer,1 h.i un colorate di blu (par. 2.5.12). Le cellule morte potranno cosi euere esclust' dal conteggio com-
Quindi, qumdo ihl'trrno coprio88t go o il loro ,011.i 16 qwd
un \1Jlr.11ne di O. I mm• (I.O mm d, a.rea ~JotJtaro apPoggi~10, e,~:" nno unHupcrtìcie di I
P,u prccoJ, (fig. 2.6).
re-, la concenrraz10ne ddle cellule ( ,, I . I mm di pro(ond11.àJ I qua<futo corrispon<k
plessivo, e la densllà di semina rifletterà con precisione il numero di cellule v11al1.

Calcolo del numero dì cellule

e u oro numt'ro o ~<m' N a
compJru,vo) puo · 010 que~to \'alo- Sohtamente, 11 numero d1 crllule vienr esprc-sso per centimetro cubo cd e cakol,110 molt1•
~ r determinata ed phcando il numero medio delle ctllule contate per un fattore d1com-emone coitante per ogm
 87
l!ICXll Mie.\ l 1101.0C.lA MOUO>IARE
l.OUV {llU:.ul
86

rm<X1tomctro li !attore d1 comcmone \ICOC fr,s.ito a 10', poKhé c1a~... un riquadro gr,mde
I.SEMPtO l
rapprt'SCnta un volume complc~SSl\"O di 10• cm Quindi: Calcolo del numero di cellule in coltura

numero d1 cellule contate >< fattore ti1 ...om c.'rs1um uoMANDA m un \-olumr finale d1 5 cm • coru1dcnndo
cdlulecm (".,a\colarc il numero totale di cellule nsospcsc e che il numero d1 cd.lule c.--ontatc
numero d1 nquadn contali
che le cellule sono state diluite 1~ pnma ddb conta
Se le cellule sono state diluite pnma della conta, occorre tener conto anche del fauorc di d1- con l'cmocuom<"tro e 400
lu1Z1one,qumd1
ltl'òPOSTA
numero d1 cellule contate numtro dt cdlule contate x fattore di -.-on,-ec.1onc
cellule on fattore d1 con~ernonc fattore d1 d1lu1Z1one
numero d1 qu.idrJII wntall cellule cm '= numero di nquadn contati
Infine, per determinare il numero compl~\h·o d1 cellule raccohc:, il numero di cellule cal-
: 40() X 10'
colato per ...cnllmeuo cubo dovrcbbt: t!--.crc moluphcato per d ,olume ongmale della coltura 4
da cui ~ stato prelevato 11 campione,c1oc::
= 1 000 000 cellule ,. m
numero complCM1vo d1 cellule raccolte= cellule cm ,-olumc totale della coltura . a .,, il numero di ,.eUule per cm è:
Poiché il fattol't' d1 dilu1Z1one ~ pan -
Metodi alternativi per la dettrminazione del numero di cellule I 000 000 x 2 = 2 000 000 ~dlulc an '-
Esistono dl\cr~i metodi altcm.111,, per determinare 11 numero dì cellule m coltura, tra 1 6 al di 5 m' ù numel\"l totale.- d1 ..dlule c.
Quindi, nel volume n e " '
quah la m1~ur,1 diretta con un Coultcr counter dcttmmco, un metodo automatuzato, che
cc.m~nte d1 mamrare 11 numero e le dimc:n~iom da parttcclle m1ao~op,che Lo \trumcnto è 2 000 000 ,e 5 = I O000 000 cdlulc
cosutu1to da un.i sonda da vetro nella quale t an\Cnto un elettrodo connt!-\0 a un o:.cilloscopio
e a un elettrodo esterno (Fig. 2.7). 1..1 sonda pr~nta, m pros~1m1tà dcll'cstrenutJ inferiore,
una piccola apcrtur.i d1 diametro li<.so Quando la sonda viene 1mme~ m una solunone con-
tc.-nentc le cellule m sospensione, queste flu1scono aura,cr~ l'apertura,dctc:rnunando un mo-
mentaneo aumento della res1ste01a elcttna dovuto ali.\ parziale mtcrrUZJone del flu~~o di
mmm
c..orrentc. li fenomeno dà origine a un segnale che è regi!.trato dall'osc.illoscopio. a ogm \Cgna-
g Slatetna di misure ci.gli ,mpulsl
le comsponde: un.1 cellula. Uno degh svantaggi da quoto metodo e che vengono contate ~ia le
cellule vive sia quelle morte.
Le celi ule po~ono ,IJlche e~~ere contc1te md1rctt.1mcnte, determinando la quanllt.\ tot.tic di
proteine c.dlulJn e uuhz.undo unJ cuf\a \tandard (quanuu. da proteine contro numero di VefWO t. ~ de y~O
cdlulc) per determinare: 11 numero d1 cellule nc1 dawm camp1001 Tut1,1~1a. la quantità di pro-
teme ,.,.r
,-- cC"llula è wggella a ,;inazione durante la crc'>Clla della cohw.1 e potreLL.
~ non n et-
fl
tcrc: .:orrenamente 11 numero totale: dJ cellule Alternauvamcntc, . come n~ram•t d
,... • ro per etcr-
rmnarc il numero d1 c..ellulc, potrebbe C!>.,ere u-...to 11 contenuto m DNA in quanto
questo.nelie
c..dlulc Japloidi, è solitamente costante Comunque, .1nc:he 11 contenuto tn DNA delle cellule Elenrodo intorno
P uò ,·Jri.lrc durante 11 l.ado cellulare e, qumd1, non ,c:mpre formsce una ,11m1 accurata deI nu- Elettrodo esterno
mero J1 cdlulc.
- --!f-r-- Apertura

2 _5 7 Semina d, celf11le s11 piastra Sospensione cellulare

, , ,olta cont.ite, le cellule donc:bbc.-ro essere ~mmate a un.1 dem1tà che ne 0 mno un moinentillle<' in,1c-
1,,;n3 ommalc.-. E qumd1 · cMCOl1Jl.c che, dur~nte I'a Il c~tamento delle ~ubwlture,
' ~nll
le cc:U Ia
crcsc.ita Ilo! c:he 1rans11ano :attr;&•eno, l';&pertura Gt'fl
,do intC'fnO -"
e qucuo c:stemo.
~_,.,anale :.illa corretta dematà, Se M:mmate a una demua troppo bassa le Il ulc . .., ~ coultcr countcr •~ « str:l<l iull'o1,<.,ll<>"-0l''o, tra I dcllrt
"cngano .,..... (I • cc ule n I ,gur• • ·' ~, ,cne rcs•
chieJcrchbcro piu tempo per raggiungere l.11.on uc:nz.i, e a1cune potrcbb<ro mourepn~d; mento di 16~tenz.&, e
 88
IIIOO!IWICA L BIOJ.OGIA MOU:C.01.\at

COU\JU Ol1 l1AIJ 89

raggiungere questa fa~ d'altro unto, st ~male a unJ densità troppo alta, raggi un ercbbt-
ro IJ confluenza troppo \d0ctmrn1c,dmdo ongme a ruultatHperimentali non ri r:
comr t ~rato già VI.Sto precedentemente (par.2.5.6). I.a den it.l di . d d p ( uc,biJ1,
!
ceUula e da.li' rfì ~ ~mtna iptn e dal tipo di
'\Celta della dc:,/:t:Cm~c,:~==d~~rre q_umdi tdcnere p~nti questi fattori ndJa
• •i;,I cspcrunenu .i compiere.

2.5.8 Mame11imento delle cellule'" coltura

EtmpOM3nte (he, dopo b scmma, le fi.tsche . . .

,,mone della dat.1. dd tipo di cellule e del num~no ~1,hett.1te m maniera chiara, con l'indi-
generare subcolture o ~ttopostc a p.usa I ~ dì _volte che le ctllule ~no ~tate usate per
u"°
per la nutnzione e la subcoltura affinch:fo. tre, s1 do\Tebbe stabilire un sistema rigoroso
che, nutnenti del terreno d1 coltura . e cc ule stano nutrite a mten'al.li regolar, (CVJtando
sco 51 esaunscaoo) o checresun
po, occorre seguire una procedur,1 Stvldard . o troppo a confluenza. A tale
cond111oni di crescita ottun.ili Inoltre le col t : mantenere le cellule m uno stato Vitale in
mente al m1croscop10 rovcsc1ato, con . dovrebbero ~ esamtnate quotid1
~ec~n!::~~ :~~C::;a~e~nna dclle:~~:~;0
t al d
ure 'sotto della confluenza
i co1tura Gcnermi,
.
3
~:;~:;,::;::enu
I
nella morfolo;:a;
portanti ptr valutare
ente, ce Jule tondcgg1ant1 o gaJ.J . figura 1 8 Cuna dic iDu.rua k ~ n hsi di aoou, ddlccdluk m .:oltura.
cellule sofferenti o morte Anch;°in sono un buon segno e potrebbero md1car er•ano m col-
uttle per valut.ire lo stato d1 i O'ICOntro di cellule di dunensioni s e a presenza dj
quando la coltura tm·ccch sa.Iute della coltura: tl numero dJ ~ upenon il.la norma, è tenore della cre--.:1ta .t ..~u...;i dcll'~unmfflto d1 nutnenll nd tcrrmo, dcU'a,'Cumulo c:J1 pro-
ev1tJt1 nmp1azundo 11a o di\·enta meno vitale. I \·alon dJ H I ctU~c. tnfattJ, aumenta dotti dJ \arto del ml-tab\,h,mo l~pure della mancanra d1 ,plllo per una uescita ulteno1, S..
rego annente tl tcrr P estremi do bbc
essere e~cgu11a a giorni alterni lì eno ~unto con terreno fr vre ro essere le cellule vengono lobCiJte in fa~ )lU1onaria, dopo un crrto periodo di tempo inwcran11,, a
confluenu; a questo unr I no a quando le colture non ra esco. Tale operaz.ione può morire d,mdo luogo alla fN• d, d(\.imo ndu <.un'I di ~ t a .
ma11 oppure tratwte :On to, e cellule possono essere utilllla1• gg1un_gano il 90% circa della
d npsma e usate ili ~ per gli cspe
m icate nel paragrafo 2.5.5. Il volum per CSttre delle ~ubcolture nment1 program. 2.5. IO Cr,c,coruemuione ddludlule
generale, le cellule al d1 sotto del
terreno ogru 5 cm • queUe tra ti 25
;5::
delle cellule e dalla superficie deU fi e dJ terreno aggiunto d1pend 'stguendo le procedure
nell,1 quale le colture ven e dal grado d1 confluenu
'conlJuenu possono ~~ono Incubate. Come regola
SlOrte d1 l('llulc, da utiliu.m: m tempi )U<.'Ct''>s1,;, po,;ono e...rrc: collS<'n-ate in modo elti-
llente, congd.1ndole m azoto lt~u1do, m«l~nte un prcxòx> noto ,ome criocollS('n'Ulone.
45% m 2 cm, ogn, 5 cm' Q d e ,J 40% d1 confluenza in I 5. ~ coltivate tn circa l cm, d,· In t'lli:ttì, qualllr.l ,1.ino Ji,porubili ,C1hure m buone ,ond11fom, t con)igltab11e congelarne
• uan o \1 ene • cm ogn 5
oppure sulla superficie deU.i lì.ua sos11tu110 tl terreno è I cm· e quelle oltre il un.i parte. Ciò llln,ente d1 d1'porre -.empre d1 nuo\c cellule, ,ell.l.1 do,·erle ncccs)dnamente
toccare dirctumente d monostrato o~:t.i a quella ove son~ a~ppo~tuno P•J)ettarlo su.i lati prt'p.irare ogni, l1ha a partire d.t1 te~uu. Tunana. 11 ..ongelamcnto può a, ere etTcttt letah sul-
neggaamen10 delle ceUule st~ o il~ are, un evento che avrrb~se e celluJe, per evnare di le ,ellulc:, m M."guito all.1 lormar1onc dì ,mtalh di ghiacC10 e a .:ambiamc:nti neUa con,entra-
oro distacco. come conseguenza il dan- zione di elettroliti e nd pH. ~l11.m1entc:, per mmimiz.ure que)tt ri~lu. prùna del congela-
2.5. 9 Cinetica di crescita delle cellule mento s1 aggiunge alle .::eUulc un agcnte ,noprotctllvo, come 11 DMSO, per abbas~rc 11 pun-
animai, in coltura to d, congd.1mcnto r<l c:v1tare la formazione di cristalli di ghiac..10 all interno delle cellule.
Quando Je cellule vengo Inoltre, la prima parte del pro.:es.,o d1 congelamc:nto nene compiuta gradualmente, con)cn-
d no manrenut
ma 'crescita (pattem) caratteris1. .e'" COnd121oni di colt tendo alle cc:llult- dt pa~~re lentamente :a una \doc1tà di 1-3 °C mm') dalla temperatura
Nella fase llllllale, detta fa,c la ,"o (F1g. 2.8), nel quale s1d ura o1t1miJ1, Sl'guono
ambiente fino a - 80 °C. Al tennmc d1 questo procesw, le via! criogeniche (provette in poli-
ta evidente delle cellule. La durar!~• 0$5Crva un'a1t1v1t.t cellu~:~8Uono dl\"erse fasi un sche.
propilene in grado d, M>pportare temperature fino a - 190 °C) ,engono immediatamente po-
là delle cellule StC">Se, la denm,\ alla questa fase dipende di di\" e elevata, tn assenza dJ
~te in un contenitore ,on .11oto liquido dove pos,ono rimanere per un periodo indefinito, fi.
La fase lag è segu11a da una fase d quale sono stare Pia.s1ra1e crs1 fattori Ira i quali I cresci-
no al momento dell'uso.
v.1~1~•11.i metabolica, durante la ~;~e;:;1a C$ponenziale, deu:;:;~mpos121one del t:;:;~- La preparallone d1 ,anipioni d1 cellule congelate t ~emplicc e ncluede la racoolta delle: ,d-
a ne, le cellule raggiungono l I numero d1 ceUuJe a og, carattenzza1.1 cl.i o.
a a,e ,tJ.Z1onana in . umenta molto ra . elc- lule (p.tr. :?.5.5) e la loro mo~pcm1one m I cm d1 terreno per ..:ongelamento, contenente stero
CUJ non s1 OSsen· .P1damen1e. al 40%. La M>spem1one di cellule viene contata e diluita in modo dJ ottenere una den\Jtà fina-
a un incremento uJ. le compresa tra IO e 10 cellule per cm Un'aliquota di 0.9 cm, viene tra,fenta in una ,-ial
 90
BIOOIL\llCA f BIOLOGIA MOUCX>i..w
e OlnllU 0:U.Ul.U.I
cnogcmc-.1 \Ulla cui ct,~hdta vmgono riportati ,I tipo di ldlulc, il numero di pa . 1 91
: l~' ~-, lta. Il camp!one , iene qumd, portato a I cm' mediante l'aggiunta d~\~::a~~
' 1 ('l ~heanà qumd, u01conccntr.111ondìnalcdd 10%). Lc-viah-anno p · . m. di Come dc~rmo precedentemente, il numero totale dr ~'l'llulc- \Ìene calco.lato usando Li se-
,, 111t, uln dehcate-zz.a per d' t b . i rima agitate o in- guente equazionl':
tàs(.di raffmld ' i i~ n utml" um onnem_cntc ,I contenuto, e poi avviate alla ri
l'l' m altcrn.11 '.tmmto. ler ule ta\(,pUÒb-.e!l' imp1egat,1 una c.amer.a di congelamento ~ rna
, numero d1 cellule contate
• , .t, un appo~1to contcn1tore !chiamato commerc1.1.lmente UM F ·") . PP~- c:c11 u1e cm = " fattore d1 comns1onc- r.mon- di d1lwzronc
to con ooprop.inolo che po~to a SO •e, r rost} . nemp1- numero d1 riquadri contali
d1 I oc mm•), fond.t~cnt.tle n.•r ouc as),CUra un raffreddamento graduale (a una velocità
• t • nm una CrtOl:On\(n·a,ione cllì Le al
\'tngono qumJ1 tmferite m un contenitore con a1O1O h ud icacc \·i congelate e la pc f({'ntuale di cellule vi~ \'lene detenmn.aca lbmdo Li ìormub ~ente:
~no tsserl" oonscn-ate congelate fino al loro utilizzo q I o. A quc~to punto le cellule pos.
Tutte le pr\Xedurr devono c~me
ne delle ~"'Oltul'l', che di\Cntcrebbc 7 wtc in .•
condmoni sttril1 per evitare la con tam mai.io
nuovamrnte m ..:olturil Come lt e~, cnt. una ~·olta che le cellule congelate venissero po t.
..,. d
7V
Il I
ICt' UC\'I\C=
numero d, cellule non colorale contate
- -
numero tot;ilc di cellule contale
100

u cnorc prtcauzione è I bil se

•l'l"SL1la nelle 24 ore che prt<cedono la raccolta d U . cons,g ,a e nmp1anare il terreno di Per evitare che: 11 loro numero ~i.a wttosumato, e importante che le cellule m-c non ~wio
'>Cl'l' ut1l1IZ.11e cclluJc in fJ~ di crtxit.1 c~poncn~ cdlule da congelare. Infine, dovrebbero es- esposte al colorante per più d1 5 minuu prima del amtl-ggio, po1.:-hc! J'aoorb1mcn10 dd colo•
q11Jnto la loro cr~Clla potrebbe c,.;ers1 gi~ armtat:.e non troppo pro\Sime alla confluenz.i, in rantc dipende d.tl tempo di incubazione e il color.mte potrebbe o..sere 3550fb1to anche dalle
cellule vive se l'incub.llione do,esse protr.11"-i ptt 1crnp1 lu.ngh1. lnoJtrc, il blu tnr,mo.. 3\'mdo
2.5. 11 Sco11gtlame11ro delle cellule corrgelate un'elevata affimt.i per le proteine del ~ii:ro, può origin.tn- un'cl(\-atll oolo.razion<" d1 fondo. U
campione di cellule d.t coni.tre non dovrebbt' quindi ronteoe«' ~im,, che può "'--ere rim~..o
Quando nc.e~no. le \corte d1 cellul lavando le cellule con PBS pnma della .:onta.
~:~tlo ~nv~!~_i:!e~~:~;:~:~:1~c~~~~::n:~:~:~=0n~r;a;:~:a';,c~~cp1:, t~u~-
lc' ,a non r.igg1ung.1137 •e,. g iac<10. r.. import h ~ m1- 2.6 Colture cli cellule batteriche
s1onc di •cllulc " I IO quanto le cellule potrebbero and te e e la temperatura del-
,..,ongc ate può c,,s f, rapi amentc
giunto dd terreno frc co ·cere tr~ enta IO un tubo da ccntnfu morire la ~ospen- Come per le colturc di cellule anim:&li, le colture pun- di b.attc:ri (d1e ron1ensono una ,oh
' • e centri ugata a 1000 ga nel qual · specie di microrganismo) sono nom1.ùmente coln,·ate e mantenute per un tempo mdefinno.
cs,crc r1mo~o ~r elimina 1 r.p.rn, per IO minu ' e viene ag-
cdlule dovrclibcro esse re' DMSO. uuhaato durante il p 11. Il surnatantc dovrebbe u~ndo procedure ~terili onnai st.tndardiuate. Tuttavia. poidit le ~-d1u.le b.tttcriche $ODO w·
. . re OUO\"ilmcntc ~spc roces,o d1 congcl rattcnuate da un più ampio gr.ado di d1,ersit.\, in termini di e,i~nic ,ia nutrwon.t.li )13 am-
c~ntu,1h aggregati vengano ridotti a e ·Il '< IO I cm' d1 terrtno fresco amento, e le
una PJJ>(tta P,hteur d1 \ctro ' - U le ule smgole, o ad aeo.......ti m I • a~1curandos1 che b1cntal1, le cond121om J>(r la loro rolll\-UÌone wno divel'Slfi..-atc e le es~enre altmiente dipen-
· LA; cc u e possono
q ua1e sarà stata pre.:edtntemcnte d OC"''li" o to p1u pie 1 denti d.ùla ,peae lOfll\J.IL D1 ~110 sono d~tte alcune procedure e 3(,u~imenu Fetlml·
. L qulO ' venir pipet"t . co ,, us.indo
d t I fi aggiunta .. quanuu "' e tn una lì li che vengono adottati durante la Cl1ltura di cellule b.tttm.:he.
~ o; .1 ~-a, it•ne qu10d1 post;i ncll'incub nC"Cc$.s,aria d1 lerrtn iasca, nella
srutr aderire e cr•-sccre. atore ~r colture cellulari e I o fresco premcal-
e cellule \cngono la- 2.6. J Aspetti di sicurezza ntlla coltura di batteri
1.5. J1 Determinazione della ~italità delle cr/lult
Come le colture di cellule di origine animale, an,hc quelle di ,-dlule m1crobiche ridtm:lono
~• tr.atta d1 un'oJ>(TilZlone otrem attenzione e tecniche stwli, non ultimo per ent11re la cont.unin.u.ione a,.:identlle dcllc ,"'Ohu-
d ll li I amcntc tmport;i t .
e e cc u e può d1ptndcre d.t.lla d •• Il n e, poiché Lt e~. re pure. In parti•olare, O('corrc pR~tare fa m.:b,tma attenzione alLI protezione dell'operatore,
I dluJ cn~1"' a .t quale son ·-Ila e Lt ,~
ee e nenc dt'lcnnin.110 n•II• . o state ~nunatc Il ~Jlr;iwivrnza '>Oprattutto da microrganismi potenzialmente r.:ri,ol(\.çj, [)(wrclibtro. qumdi, e5,crc ro,ran-
• , • maggior pJrte d · · grad d
qu" c morte mediante iJ mt1odo d li' 1 ei casi, dtscrunina d O I VilJ.lità dcl- temente adottJte le tea111:he .ucttì,hC' e le mi~ure di )Ìcurczu de-:<critte ~ le colture di cellule
e CK us10ne dd color n o le cel]uJ .
non"assor..ono deternunati color;inti, che v
L
ante. Scntanz,,tJ e \1\'e da an1mal.t Inoltre. gh ~lruml-nli utilizut1 durante fa m.uupol.uione delll· colture dondlb<-ro cs-
morte L'no dei colorantt p,u u~tt m engooo tm•cce rap1darncn1crnen1c,fccelfuJevin: sere sterìlizzau, prima e dopo l'uso, medi.mie risaldamento ,ulla fiamma d1 un Bunsm. Per
quc:51e an,1fo1 è 11bi ~un1r .1.11
\-Cngono rn..:u bate ~on quc\tO colorante a un' u tnpano. Le ccUuJ \iotJ e cellule evitare fa diffmione dei b.1tteri, le aree di Lm>ro JO\ rcbbtro C,,\ffl: d(\."Ontanunate dopo l'uso
\1
cne posto m un cmocuometm L'cm · e e o 0.-tl)(i e m •~
• conccntraiion d Il
~•i>auionc con sprar germicidi e/o radiazioni ultr.1\'lolette, J>(T c:v1t.1re che: 1b.mm ,1 diffondano rap1di•
· OCllomctro viene O~ •qUJnd1 iJ
.sciato con mgranJ1men10 100>< e le cdJuJ• . n.ato con un rn· <:atnp1onc mente, trasportau dall'aria. Coerentcmcnte ron qul.')te pr«aUZ1oni, tutti I niatm.ili non n..'l•
25 6 • ~"ngc>no conta 1cr0Sc
•conteggiando separatamente Jc cdluJc ~n-c Il tc corne d~ntt op,o ro,•e. dabili utilizut1 per le colturt" mi.:-rob1che dovrmbero nse-tl" dimuw.11 in modo cormto, pt'f
e quc e morte. o nel P•ragrafo esempio, pnma della dimmu1onl\ è m-.:e,s.mo autod.mue tutto LI nutmalc eh p.Lisna e, re-
sidui delle- colture ~Uului.
 92
9J

l.6 2 81gmu n11trmomi/1 dr, battm

I.a C'rt$Cll.t dl'I bJttm r1,h1tde cond11mm molto p1u 5tmphc1 J1 quellr lk'xnlll' per le cd S«worl par a.rtDm-atura• pH
lule ammali, 1u11.a11a a caUS.1 drlla loro d11'l'rsilà, bcompos1none dd lrrrrno può variare cd~ ~ ubo pe,a.~llPÌ()nalTl«!tl
10
grJn partr dt1rmima1a d.ttl.a cl.us1ficv1one nutnz1onalr &1 nuaorgamsm, coltJ\'lll ~
)h, m gencrr, ncJdono IO due c,uegone pnnupah gl, uutolrolì (11rgam~m1 m grado
tizi.art da wh il nu1 f,
d: ,.
~m....
nmento, SOito orm.a d1 zucchm, sfru1tando I rnerg,a luminosa del I
gh rlrrolrofi (organnnu chr nm-ano l'mtrg,a th1m1ca dalla rottura Jellr molr I Ml~~~
m('1.1bolt1.z.11r). r nlrambt le ca ~o e orgamUK"
trofi e hem ' _1cgonc wno uhenormentr ~udd11 •se m chL·rn10- e fotoauto-
' io e 1olottero1roll I chrnuo.tulot fi r lì
Ionie J, carbonio m I ro I e J ,01oau101ro ' uti11zzano la CO comt
• a n,a1 ano energia d.t fonti complct Ja
sost.inu morg.im,hc '~ond1b I I .tmmtr ' ercn11.1 prmu util11uno
' ucc mm,1chrm1otttrotro6 fi •
PO)ll org.111,c1 ,ome lon1r pr10 ipale d bo t I otorterotroh usano ,om-
d1 tncrg,a, ffi('ntr(' glr or"·'Ol)~I app.art'ar n1ol, • fotoc:ttrotrofi utrlll.Uno la luC'C' ,ome fonte Acque di
I.i .,.. rnrn11 • ~llogrup"" d h r~
propria rnerg1a da.I mrtabolt,mo ddl , ~ c1 e cm1oe1erotrolì oncngono
t SOSl.inza orgamchr

2.6.J Terrri,i di crescita per colt11rt battmche

Per f,3 Ul"S<lll dc, batteri .\oOno im ir a
in ~<:rrem compll~M t trrrrm ch1m1.:m!:;~;;.::i'1p1 d, terreni che po,~no O!>t're .suddivisi
pruni, m gcncrr, \Ono co,11tu111 dJ
d, l~r1 ,to, e I.i loro prcct\3 compo1111on:~1.inn• di ongmr n.i1ur.1lr, comt' !'~tratto d1 car
reni mm pie," ~ h , t conseguenza e IO b ne o
\m1 ~,gen11 ,he .::,o fil, 'dt nutrienti, quindi •nd1ca118~•r•I rga m1,ur,1 ~ono!>C1ut.1. I ter- f asura 2 9 RA~tulOOt lldlnn.ina di Wl fmnmutott
r-r crt'><cr(' Tl<hicJ ' • mrntc.- perla d
I terreni ch1m1c,1rncntc definu o~o rn1)Q)c d1 moltcphl1 nutncnti CTt'$<1ta I organi-
stud1J11 \ u[l.t bJ~e delle ~
co,t1tu111 d.i premi <om '!::u ,. a contra.no, 5<>no piuttosto .
spwfiche del b.ititno da lOh1\:phu Solnamcntt, M>no
rr.ihu.Jrc terreni con d,tr:° 11 m1scd.a11 tra loro m quantua d e, d1 lOn\Cguen,..i, M>no
Per le colture su larga scala ''ffliOno utilizuu I fmnenut n o b on:-.1tton , dot.lU di appo·
s111 mtenu dt ag1taz1one che ooruentono un rune:s...""t>Wnento e uno 5<.-amb,o dì gas più t'tlìcact.
re, o tlimanarc, drtcrmm ~rcn1c compo,111onc i·1cnr com un l'ttrmmate. La poss1bdità d, Queste apparec~h1ature ( F13. 2 9) k'OO Mllitammte equipaggiate con sonde che permettono il
r, P('r cwmp,u, quando~ e Spt:'<1t bat1enchc:, ifru1undo I• lormcnrc ut1l111..11.1 pt'r ~lrz1ona- momtoragg.io di dl\~l'll p&ramttn, come pH concentl'U.IOne dt OSSJ8C'DO e temp<-ratura Mol-
G .- necc,\3no I ' ro pccuha
r.1m-nc:ga11v1. ,omc S,1/monrll SI co ll1·arr ~lettll'amentc I b n ei1gcnu alimenta- ti modelli sono m\:oncùti Ja una curucta ad acqua, ncUa quale sco~ acqua lredda pcr dissi•
po,lhé la loro pre~cnl.1 in1h ;' o ugd/11) posstmo C'Skre m I Jller, en1rrte1 (h.istoncèlh pare 11 ~.alore generalo durante I& ~ntallone ~no prnenu mdit' ,-ah"Ole di saneo pt.--r al-
,., e C,r.im•n('gJt1v1, '~<' J crck1ta della maggior PJrtc~ u11 nel terreno dc, ~h b1hari,
lontanare la CO, e .altn gu proJom dal mrtaboliilllo ,dlularc.
cgh ahr, hJttcn C,ram pos111- Nell'impiego Jti fcrmtntaton, sono ne.:essanc mbure che nduQJlo il nsch10 d1 contama-
2.6.4 Procedure perla colt . . naz1one da p~ne da m1uorganwna prnmu ndl'aru, quando questa~ amufihta nel terreno d1
,~a:,ont delle ctllult b
Ib lllttrrcl1t coltura Può quindi C'$6l'tt nt'\'.~no itcrihzure l'ara, tacendola pas).lre attra,erso un filtro
Jtl('n po,,ono c-s~rr lOll11.111 tn <~on pon d1 <il\."i O2 µm ) colltk.--ato nel punto di angre»0 nel \bO del lermentatore.
ltqu1d1 ,cngono, gcncra.lm,·ntc ,udd l.ibora1ono U\ando terreni In genert', il terreno "°lido ,iene pttpuato sohJ1ficando al terreno prtsceho con l'aggiunta
re. Le beute ~nno qumd1 ,.,___ ' iv,~, in beute e maculat ~Y l1qu1di ~•a •,ohd1 r t
b ~,a1t· m ag 1 , con iJ 01 • crrem dell'l•2% d1 agar (estratto cù alghe) che, seb~ne di ongme organaca, non nenc degradato
or IIJ1e, '" modo thr le lOhure M ' a11onc co,t.intr \U un Jg I ICrotgJnhrno d.i wlt1va.
d,illa mags1or partt dc, microrganami e fomu.:e dunque un supporto merte, di consL,tcnz.1
qut'~to tipo d, rnltura, dr1r l~r :no nmc~olatc e lr cclluJr I atorr dotato d1 moviment
d
rcrmc1t~rl' un' d (' ._\<I.Ilo uno ~p
J C!,'IJJta d1t1u~1onrdcll'o .
_ mintcnu1c 111
n,o ~Ufhl1cn1e al d ~~pt'm1one. In
° gelatino:.a, sul qualr i batteri possono ,rescctt. I terreni ~hdi sono ampiamente utili.z.ull per
t lcrre110 non dovrebbe l'\scrl' ~u (' \\Jgcno 111 ~lu1mnc: Co • I ~pra drJ terreno separare coltutt m1stt t ~oslltuLSCono la base per l'isolamento da colturt batteriche pure. A ta-
rJzt011e adeguata t pJrtteol.inncni ~•ore JI 2()% del ~olumc,co ml' rcgolJ grntr.ilc, il voi• per le S(Opo, colturt dalullt d1 batteri l'cngono ~trisciatc sulla superficie di una paa~tra d1 agar
m1uurgan1sm, an.1crob1 (' importantc per ' b.att mpbs11·0 dcli.i brut U ~mt usando un'an~ sterile per in()(ula. le cellule ~trisc1.itt sulla piastra formano ,olome, ciascuna
cri atrob, m a. n ae-
. rnrre lo è meno per i multante dalla prohftrmone di una 5ingola cellula e, qumdi, di una singola ~pecie.
Una l'Olla isolate, le cellule po550no eut>re colllnte siam d1,ulntmuu (L•,ttrl1 rolturr) ~•a 111
wntmuo. le pnme sono più frequentemente amp1cgatc ncUe colture hqu1dc e con~istono nel-
 llk'.11)1 ~Il\ l lllOlO(.UMO&.t u,
C'Qln'lt UU\ .\tu
Il~
I mo..---ulo di «-Ouk- mun.:i ~u ,tmk .ontmfflt(' u113 qu.1ntì1:t J~tmnuuta d, k nl'n,1. ~llt--
,to tnrtodo '"lfflC' dcfuuto duu._-o ro:,iitb di~ruhil1tl dì uutnm11 t hm11.ata a qudla r~n
l'(),}1h1lr I.a fWll<'lllllOllt ,l1 IIU0\1' r1:intr l p.trhrt' d., ,YIlli IC l".\ll nple1.i111cn1r .l1iTrrt'l1r1,1tl'
_.. Il 111rd1~1tl('\11
te- all'tnlZJO drlb ~,t.i. ln tal1i'\.,n<b-m1 b m:-d1.a \\'llhl\u('l"J IÌM l.ll1'(,;1urìmm11\ dt'1 t1u 1111
lllffltt o fino a qw.noo non ,1 s:irà t.:mmuùu llll3 \jU.tntllà ~~'1\3 d1 l\l('tJN•ht1 ll\.\SICI
u11hrJ',ll<' ,h\\·rst tl'.;111,h, ~tan,lard. \ ,111oi., \C'\'1'11• I1 " ·llulr wns,11111 lllulln nu \ ,,·n nm'

rrudotn \ÙI rn1~~ ,~-.i. ln q~11-t,tam, qumd1.li "'"'J'''ÌlÌ,•n_. <' In ,t.ih• tìsmlo. l'u,,, d1 dl\'t'r~ 11sm11, (omr 11h o1 mo1u (IIIL'\lll<' <' citi', t1111d 11 1111111prcm1lr u • u•hlll'I'
<'1<1111 • 1'd •

j;h.--0 dclk-cltuk ,-uu dunntt la,~,1a. ••111111111.1,h ,, tl1t1'1'<' <'" 11g~nr1.11..- UIIA n111•1i1 pi.in 1a••• :x 111,t,·t I lI l 1ntr
I l'(I 11ol • 1•tonc
1 n,rt11C,1
~ ~dir ,-olturr contmut ldu.mutt- 41Kht stStl'nu •rmt) il tcTn•n1•, Ìt'tll' rinn,,\ alo .1 lnlt'r
"'111!;111, lllhl\\" QII\ li.i Jt l~•llll '"1\l't 1I1fil. h,,:u('
- • 1111 •'"1h1rntr str11 r, Il,1 dd mnm • •
I 1horat<i111, d,)\ ~I•
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m nl(~.., nmr~ qui'll1H..;iun11., J.1.lk ,'clluk. l ,1 '-''l"' d1 \jlh:,11 ,,,tl'nlÌ t
,1, i ,,11111'-1,1111 l "11hhr11111i J, ,r\'~111 l)('n t!rhnllr I 1l'qtm111 s,t'llrmJ Il '1d "111111nh m.i con
I,;:"' c-s,, e ,umh II qudh ,I,'),r 1111 l)H'\ ' 'I.
1
, utl'tnrn Il'.' 11rr I, ,:o lur<' i '(' u...•,st" " d...,lt• , uh.a•
nunrC'n<"ff' lr ,-tlluk m -andlZIOOI Ji CTNtt.:i ~,,n,nmk, ml-dÌ.llttt' 1I contmll,1 ,kll.1 ,l\Q• 11 . t Ir Il,. m I111 1l' et Il ula11 ,....,r11h l'cr rsrm1110, n11 " I•' ics. •o 11n
1, lllh' J1ih-1rnrr rnuha11 •., 111 ddl,·
,-entrul\1nç.k, nutnmt~ ddla Nt\llu,..,. l'Jci l~""-mì d1 ,11rto. 1.:in;ind,, ''J'r,•nun.tml'tltt al I " I lu.za1l" una '~m,, .1 prr .. '
h'II ,1 C(\, 11,h11'\lt I~• k ,dluk :.111111,1 i , \I p111 u ,• I Il ,ndm1•11111111l'llrn111h llt'l\'_)
~r.idQ dì dilUlllOn(' ddk -dturt, Ll' ,'Oltutt ù'II\IÌnll\', ~ < ' più ,,,mph--.,r ,l.1 lll<'ltl'rt a l I I t, rnir :,:,n11<1ll~10. 4\ , unr, e r"
•i.1111, ''l'l'UI\ un,1 ,unta Il\ lii l , • I I Il ' ,111111 "<'111•1111, ,1, "'
runto, offrono ak"'UIU 1.uit~1 nlf\'tto alk ci.\ltu~ m ll.lr..-h, in qu.tntt, n-n,f,1n,, l""'•l•1ll' I. ,.,ii\' 1•,•t .1w1, 1mhf\',,l1;1 . u1t11111hI 'f'Il,·11,,,•Il,\ u M.'\llll, li .. I I i.I ~I'('\
turoI\ . • ...
l,hJUnhtll rl'mkmll,\
~'lt.a ddle \'dluk U\ mndmon1 ,tumn.aric-, nclk- ,tu.tb I.a ,li, 1,1,m(' u-lh1l.11,• <' I.a l•1\\,111l<'Si Il '""'''' r1,·,, in C\•11,idt11\th1t11' r,, ,,111nh1111 .!mmc ile J trm1 l'r11 '
-...,n,, 'lrrt~m.:nte irr.aur.- Di -net~ f,, ,1.21,,, fi,i,11..'St~, Jdk ,'riluk ~ riù cl\1J1 .ani<"ntt d~ll.1 lu\èl' l.t ,Imati& dd '1d1\i1,.11hJ11111, hi,~1, J..1llr r13llh',
defìn1t0, mn ,~nUl\,nt mm111~ 1\db "'nlP-)'-lth'lit (\-llubf( Juantc il -id,, \lì ,r('S.:Ìl.1. Il
probkm.11 rnn-1l"lt dci ,1,tmù armi~ 1'~111, n-.duo J, ,,,n1;1n1in.u1,)11<', a,,,,-; ì.at\, .111• J.7. l ·'-'I¼' tti ,li ~i, um:,1 ,1(1/,1 ,ì•ltur,, ,-f, cd/11/,• ,-rS(talì ~
.oniìnu.a.d~1z:i.•nc- Jdk ,olt~. (\\111wiqut. l'llJ'pli..--uit,n<- d1 t1'1.'lll,h.- :i~ttidi<" r~,,f\\\C',
dur.tntd ~•unt.a Jn outn..-nt1 t dunn~ b ft\oolt.a Jclk i.'dluk, rhlu.ç 11 rì,(hi,, ,li, ,1ntJn\l• ~d ,,1,,1 ,kll,·"•ltmc ,h ,dlulr \\'Sl'tah,, rmhlt·m1 Id1 &irur,u:i dl11l,·
~•111111bhast,mu l11111t 111,s,
111111n,1H o h.1111 ri,h, .
n;uionc. lnolm-, t,,no il 'L>tl.'!l-ia pu.\ e<-~ autom.atiuJh\l\'l!kpnJ,, ,I \J"' Jcl tcrmcntatl.•~ , , r , , 11;111..l,1 ~I ,\\\>Ili 111U l
~
1
.,,.,h,1111.lti \llll lr rl'\',.l\llllllll llt'ù, ., Il .. • "'•h nn\~Unìl Tllf'P" ~l'lllilr(' un
ll1 ~ l l l l J1 t, ~ - i •ttm~, '~1>k"''knù1J1, di~ l'''-'l\lt,1, '-"-'I\' .&(l<'rt\" q11.1ml,, 11~ ,l'lt I •;1 i ,m1 .ti, um ccs.,1111 '\"8' ,.. ..-~ I
l I\ I ' ' " \\IOl,lllllll,llt l ., llll\l'\11); I l • \A 11111•(',III\' ,I 1111,h'I 111\t'llh' Il ,I
,e-.-..i.110. In _q ~,,to 1~,\'!Ja, il ,,mtato ù1m1,, \Ull l\~at,'tt ,, ,,,n 1.tml>,l"ntt l'-l,--rn,,, ,,nr h, • •• . I I li' 11n•(u11l1,1111 I .i
1
~ I' •1x-:1.:i1ore ,lall'malaw1111•,,1
•
m1t1to al m1n1mo, riJlKtndo uhcfl\1mi..'ntt ìJ ri,i\ì,, J1-,.,nt.tmiMr.foni. 1 "' h11,: qm111h dt<1,,11,, f"''"" ,\\ utt.11, ia 'l 1
' • ,k1"'t\l.lllllll,1111\, {,, ,,1111.ittuttt" 11er pmt~'<'rt
111,1•~1111111111· I . .
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Qul."III l\\l~\'1111 Jll\'\\'lllillll\ ;l I 11 ' \ ,,1111 1111 11'< lltl ~11\;l ~I~\\ Il nl,llhlllt' I•11111, I11,1I·, .
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' - ' frrr,•rti ptt i".\l/tUri' l't).Vt,1/ì

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I al,1ht A t,11, '"'l'<I ~ .it111.1ln11·111t', ,.
I ll\,,Mlli tli ,,,1tu1r ,li ,t'lluk ,,·i:,·t .tl.I 11-..1,111111 ,111, p1,·, I
t.
d, un., pi.m1,1 ,n 1~n 1,·rtt·1"' ,hI·'~h•,, •Il '"'i,11111•111 d11n "'- 'hm11n1tnl'llh' ,ldì11ì1t, l'ttll 11111 ~ ., , .u..
p11' I , . ( I
,,,,,nihilr i111'.1111p1a g,1111111.1 J'. h i r. m, • Ili1 l.1f~· \h1111,hii:,• l" :-l.,11111, l;,1mh111g 11r;, N1t!IC h,'
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I\' ,tl\,lnhl<' ,, n - i;l11,tN\l. ·;-;-: ' . \ hi11i11r ,,111w 1., h\ltlll,1 (\lii \(\Il\('<''"' 11.11111 ., ,. ~ I J '
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I\ I\ ''-"l'l,"llll\ \ ·(' ) I Ml\l
hdivi,11\l1t'1<'llul.11,-.11a1<1u,11 ,,111, inttin1I \l,um• ,,111111, l'''""llll m ,e ,1,
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,Ili.I . t<11·" ., (I fmhml .11111111111• p111111.1 (, •. ·li 1l 11 • ..,nw ,I "'lllJ'1hh1 n.11111,1
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,•~11l,1hll 1,unt t ,u1· .1l'.1tl\llM dw l'h'lllll\l\<lll\ t
,inh'tl, "'1111 1· ,1, 11I,, ••'4 ' li' 11110 k11t1I ,,-.,1:tull·
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h 11 1
I,•.-,llld,i mJ,,hl. ' '''" ""' . \I-\\ 1 1• "'llll'<
. . . flll1'lll,H,1.1&:i1111srn«1111mp11,1• 1, ' ith1111,1h , ,.,tuJ
t'orctlt' lt" ,-clluk , 1·~e:.d1 '<'no lollpot, nti (,m.,l in ....,J J· l I\. ,1.11•m\,•"1·1,· uhc11111n11111, m,11 I {llut,• l'l'r;) 1d11 migh,11011111 ,1pp,,r1<1 •
1 \ll. J, '" I 11 li I l'\,l lll,I ' • . •
tJ ,ompJ, ra) ,ono ut1h.1:Z.Jtr III bbor.stono po- I all,~tunmrc:
.,.~ ' d ., 11n.l I•u1•1';11• .1nr.i .1Ju).
I !:C'll(TJ11•
r,111 ,1\l\ ''"~•·•w (l'I r~) ,,,1111· .I l'<'I ~I: ..:\ IAh,,lt., \liii\\ ,l&;Ì\11111 lll'Ì lo l\'IH ,1111.111.11111 ..hlll
1
1
<u,tur,• lhlllt.1h. I\T n'n.lc-r,· '"''u~n,, .,llr ,dluk. ~11111<1l3m1~'' I.i ~,•,e,·11,· 1•,1li1•1<1p1k1w i'h1h1111, I Ml p, I uu111c111.11, l.1 I ,r
i,1111,1 <' ,,,m,· ti "-'I'''Imi. ~I\\ ,,,1 ••"''' I
 96
BIOOilMJCA EBIOLOGIA MOI.LeotAq
COIJUIU Ul.1.UVJU
97
meabilttà ddl1 membrana plasmatica. Ceni terreni possono contenere carbone atuvo (o 3%)
o poli\1~1lp1rroltd_one (P\'P) e ant1oss1dantJ per evitare la necrosi dovuta al rilascio oss .d· . ancora chiare le colture generate dJ meristemi wno, qumd1, un matcnale d1 partenza adatto
ne e pohmcnzzu O d I f, I c.bL- • 1 azio-
i ne e eno o. .x- ucne gli ant1b101Jo non siano normalmente agg,unt·1 al
terreno, pos\Ono ~re per la rmcropropagaz1one u colture d1 memtemi possono CS$ere talrnha usate per curare
u11lizz.ttJ d · di
n.111. PO\\Ono inoltre essere a i quan o s, rm necessano npulire espianti molto contam,j. piante mfctwte da viru~. dopo un trattJmento ad alta temperatura (termoterapia) e/o con
trazolo per ndurre le anom:eU:t~;;~:: 7;~ n1Md.int1 la crescila come il Paclobu-
l'mcubazione dei t~uti per tempi prolun atJ Q io og1che che possono svilupparsi durante
agenti ch1m1ci (chcmiotaap1a).

I calli
nec~1a se~• utilizu per la c g uesu muura preventiva può risultare meno
deU' I% circa, pfr). resou terreno solidificato con agar (alla concentrazione finale li callo (un tessuto indifferenziato che ~i forma all'altezza di una fent.1 sulla p1.1nta) ~ spe~-
so u\ato come materiale di p.trtcn1.J per colture in sospensione. In questo caso una m,~ela dr
cellule singole e d1 aggregati cellulari viene incubata m un terreno bqmdo che den~ ~re ae•
2.7.J Sistemi di coltura di ctT/11/t i·tgttal, rato art16aalmente, per 1mped1re che le cellule s1 saturino dr acqua La tendenza a formare
una sospem1one cellulare è m gran parte controllata geneticamente ma, nella pratica speri-
SI~ messa a punto d1 una coltura d1 cellule o di tessuto . •
zzu1one supcrfiCJa.le dell (',pianto che ò "'&ctale IDIZla con I escissione e la mentale, la tendenza alla disgregauone può e~re mcrementata, per e.'>Cmpio, riducendo i li-
~ seconda degli ~op1 dello studio). G:Oe~en~nvare. da una parte qualsiasi della pianta \'ell1 d1 calcio nel terreno, alterando la composizione della mi)Cela d1 g.u fornita alla wltura,
di nz.a parete) sono prefente le foglie; per la rod • per l 1SOlamento dei protoplast1 {ceUule cambiando ti regime di regolazione della cr~ita della pianta o aggiungendo degli antio~si-
germogli prol.tferan11 i meristemt dei ger! gliUl.Jone di cellule aplo1d1 le antere; per colture danti, oppure con una combma1ione di queste strategie.
. . o e per le colture dtrad1ci gli apiet rad.i aJi
Gli espianti c • Le sospensioni cellulari
GIJ espiantJ po~ono essere esciss . Le sospensioni cellulari possono crescere come colture d,scontmue, <,enucontmuc. o conii•
p1ant1cdle incubate in condw i sia sul campo sta da piante ere . nue, su piccola, media e grande ~ala Per esempio. nel caw sia fondamentale per una nccrca
lop1u m«hante alcuni min om sterili: La sterilizzazione della su e;iute m Strra oppure da conoscere l'origine clonale della pianta, le ~mgole cellule possono ~re fatte cre5eerc: md1V1-
p:v ù cloro m forma assUtl dì esposwone _a una solUZlone dir lCleVJeneeffettuata per- dualmente in camere su vetrini per microscopio. Per colture d1scontmue su piccola scala sono
(ctrca 5 mmuuJ l'1poclg . osa agisce come biocida Dopo un pocodlonto di sodio 0-10%
' omo m ccc d pen o d t ' prefente le beute Erlenmeycr .1 collo largo, agitate \U un agitatore orbrt:tle onzzont.1le Per col-
bond.inu lav.iggi con .icqua dutilla esso . eve essere imrnediatamente . i empo prestabilito ture su larga scala sono stati mvecc progettau fermenta ton con capacita da I fino a 50 000 dm
La probabilità dì ta sterile. nmosso mediante ab-
ti . I sopr.iV\,venz.a degli e .• Le sospensioni cellulari coHitmscono un modello eccellente per lo studio della d1v1s1one
s10 og1camen1e atuvo (cioè non ID spianti m Vitro è maggiore uan . cellulare, dello sviluppo delle cellule, della d1fferenzia21one cellulare e degli intermedi del
menstema11co formato da c Il I . qu1csecnu). Molti tipi di q do il tessuto scelto~ metJbohsmo, per la facilità con cui s1 possono aggiungere I compo5t1 da s.1gg1are e raccoglie-
cali d'a e u e ID grado di d. 'd espiantr conte
o tn u,erenziato, costitu1to da ccl iVJ ers, Appena do I' ngono tessuto re le cellule e il terreno per le analisi \'a però com1dera101.he per le loro carattcmtrche fh10-
cuoh. Questo tipo dj tessuto può vii lule con una ndotta quanntà ~ _esass1one s1 forma un log1che sono p1u difficilr da usare rispetto alle cellule m1crobrche Inoltre l'.11!0 costo del tcr•
s1e~o1d1 che po~sono dare ori . s uppare centri dr accresamcnto / "'?Plasma e grandi va-
reno d1 crescila per colture vegetali, i tempi d1 fermentazione piu lunghi (m genere dcli ordi-
mai1on~ di radici). oppure a e:~tulob, ne,1 (induzione dì gerrn~calizza11 chiamati meri-
ne delle settimane), il maggior ,o~to nei processi ,ucceSSJ\'t e le po~1bil1 alteraz1om nel nu-
nogenesi è controllata gen•tJc e. La capacità del callo dì an-L gli) o a ruogcne\i (for-
.t h · · ~ ~ente ma UMe inco mero di cromosomi (cioè l'imtab1lità della plo1d1a) che s1 mamfe\t,mo nelle subcolture man•
c1 oc mine/auxine nel terreno di col ' m Vitro, può es~re stimolai ntro a questa orga- tenute per tempi lunghi, sono tutti aspetti che dimmurscono la loro ut1htà per ,copi com-
mente, favorisce la proliferazione deltut Un elC\ato rapporto tra Cltoc~~Iterando il rapporto
so promuove LI formazione delle radi! 7;1oglio, mentre un rapporto Clt
m Vitro delle piantu:elle complete a .a un punto di llista Prallc
lllJt e 3u.xine, solita-
oc .ll!lllc/aux:ìne bas-
mcrc1ah (cioè come produttori d1 farmaci, add111v1 aJimcntari, profumi b1ocid1 ecceter.1).
Nonostante queste difficoltà. ~ono m corso ncerche sull'u11l1110 di fcrmentatori per la pru-
duzione di una serie di prodotti secondari delle piante che non è po~1brle (o economica-
prolife?2!~ne del germoglro in un te::.:~llre_ d<1 un callo or~noge::~no essere prodotte
gli fogl1ar1, m terreni rrcc.hi di au.xin ~ ncco dr CJtochmme e qu. d: stunolando puma la mente vantaggioso) smteuzz.are ch1m1camente. Inoltre, po1che molti prodotti mtere:,sanll
Le radfrr possono formarsi anch: !"r indurre la formazione d1 rtd,· I, trasferendo •germo- ~ono ncavau da piante che vivono solo maree ecolog1Camente ~ensib1h, esiste un'ulteriore
tazìone L' ~ m l'l►'O a p.itt0 eh c1 pressione sulle mdustne chuniche manufattiere affincht! trovino fonti Jlternauve d1 approv
· organogenesi dal callo non • e le piante sian
i°
rro delle pianticelle (m1cropropagaz è g;"eralmente consigliata per protette dalla dis1dra- V1g1onamen10, ecologicamente sostemb1lr
Le colture di cellule veget.ih m sospensione ,ono uulr negli c~penment1 do\'e sia ncce)~rio
poru alla produzione di piante gen:~: po1tht! vi sono forti md1c~t?h1plicazione lii v,.
può es,ere Ottenuta us.indo meristemi d':1ente abcrran11. Un'elevata ~ che questa pratica selezionare dei mutanti, che possono es.sere 1solat1 facendo cre:,cere le wlome m prc~nza di
• germoglio come esp1an1 sta ihtà cromoso--• agenu selettivi. In condi11oni 1deaJ1, per la ~elezione dei mutanti dovrebbero e:,~re ut1h12a1c
I IOIZ1a]1 n., . ""'e sospensioni costituite '>OIO da singole cellule aploidi. Le sospensioni di cellule singolt: po,~ono
• r~r ragroru non
C'.!>Cre ottenute mediante filtr.111one ~quenziale attraverso una sene graduale d1 filtri fmo a
 C.01 nJRECl.U.ll,\RI
99
98
in••ok <ellule, in partteol
• e colon1t gcnerJtC<l dJIl C' " un terrc:no d1 produza te ( I0-200 µs, 1-3 k\' cm 1), <he provo,ano la form.mone d1 pori nella membrana dl.'1 proto
1 10
una J1mt'ns1one dc, pon d1 .,oµ~ ,-rn ono ,.,htJmtntt ua,tcntc do !J d1,·1,1onc cellul.tre plJ,tl e permettono I.i fu11one tra le cellule ne, punti m cui le: mcmhri1nl' ,ono molto v1une.
quellc carallt'mLJtc da rese dcutt, S ,trt", 1mpcden Rii petto al metodo ch1m1w, quc1tJ tern1ca ,on\cnte un grado d1 controllo m.1ggmre del pro•
nt1rtarc un kggrro
ne opcraz1one che potrd.,t,c com,~ di ditkrtn7IJ110nt le"o d, fu\lone
prumuo, (nJo, mH'<C, un certo SrJd0

li protoplasto b I· pre,,ione o~motKJ. che poss1 2.8 Potenziali applicazioni delle colture cellulari
I •ricJ ,cn,1 I e a11a I
Il proto11lasto t una cellula d1 forma' e • ellulJre. I protop .ull po,~ono
n'J della parct, < Divem llp1 d1 ,olture cellulari (d1 amm.ih, ,cgetah e- microrganismi) ~ono ,cmprc pm
una membrana pla,mauc.1 integra. ma ma c d I1 arctc ,dlulare enz1maucamente o
ifruttate non solo d.agh 1, 1en11Jh, per lo studio dell',u11v11;1 ddle cellule 1sol.11e, m.1 anche da
sere prepar.111 a p.uure da etIl uIe intere. nmuo,cn <> • P , 10, 1ata J ,dlu]a,1; neI ~econJ o,
hz.u p('llnJ\I a, • diverse so<1eta operanti nel campo h10te,nolog1<0 e farma,eutJCo. pc-r la produzione d, pro•
pure mcccam<.imentc. Nd primo ca}O, 51 un ono stJccau dalla p.irete cellulare
1 dotti b1olog1<1 a elevato valore .igg1unto, come vac,1m, 1rah ( per esempio 11,ac<tno della po•
disperdono 1essull pla,moh..au, nei qu PrOIOP JSII '' ' • o,mouca (05 ,notmmi), per ese
J.111
leHtJ pre<\100, · hom,ehte), ant1Corp1 (pc, t"iemp,o Ok"'T3 usato nti trap1ant1, per ~oppnmere 11 ngcuo ,mmu •
seguito a m.:ubnmne m una wIu71one a e . Il olamcnto enz1matKO fornisce
) lir I due protoco 1, I 1' nologico) c diverse prott"mc: n<1imbmant1 L'apphcaz,one delle te<mche del U:-.A momb1-
pio J, manmtolo (500 m\l ma · a
, ,,a le con 1z1om di ,ncubaz1onc devono es
d nante ha generato una .\Cne, m lOstante cspan1ione, d1 prodotti per uso tcrapeut1Co umano 11a
m.1gg1ore re,a d, protopla511 un11orm1, tu11a · ' one ,g11enzimi che: deg
1 e una \OHae<PoSIZ1 g da cellule d1 mammifero 11a da batteri Tra questi prodotti commeruah po"ono c)1cre "tat1 il
ddìmte e control!Jte <On attennonc per cii ar bohche con conseguenze deleterie. f.lllore \'IJI per l'emofil,a, l'm,ulma per 11 d1abete,gh interferoni~ e a per la chfm1oterap1a Je,
deret>be la parete cellulare, portando ad ahcm1om mclJ I
he ,ano ~,ate stenI1zute m una ~o uz tumori e l'eritropo1etma per l'anemia. I..c colture batteriche sono ~t.atc ampiamente ut1l11ute
I prolopl~ll po,sono e,sere 1\0la11 da fogI,e '>JOC ' 1 I , .
• d d , ,ore \'lene 1talc.1ta e a ,ogl1.1 viene anche per altn scopi mdustnah, tra cui la produzione su larga s<ala d1 proteine ,dlul,m, rego-
ne d1 1podonto per CJrca IOmmuu Lcp1 mm e m,er 0
~- n11m1 d1ge1t1\1 al buio a 25 C, per laton della crescita, ac1d1 organiCJ, alcoli, 1olvcn11, ,teroh, ,urf.ittanu, nt.ammc, ammmoa<1d1
gl1ata tn p1Ccole ~c-,iom e incubata con una 011)1.eIa w e •
' e1scre scpar.111 da, framm eccetera. l'n'altra importante apphca11onc delle cellule microbiche t la dcgrada1Jonc d, pro
nottt'. I protoplam nla!>C1all m w1pens1one po,<.0no, qUlnd • .
cellulari e purificati mediante una combmv1onc d1 filtr.tZ1onc (u~ndo set.iw fim d, nylo dotti d, scarto. m part1Colar modCI dell'agnl.oltura e delle mdu\trie ahmentan Queste ,olture
centnlu~z1one a ha\<a velocHa c la\agg, La quahta dd prodotto può esserc ver'.ficata e sono sfruttate anche nella b1oconversionc dc, nfiut1 m prodC1t11 utili e m studi tms1cologici,
trullando la ,11aht.t de, protopla}ll per mmo d1 ,oloranll come la fluore1 ceina d1.1cetato o dove alcum d1 questi m1Crorgamsm1 stanno rapidamente rimp1aizando gh 11mm311 nei teM
blu J1 fa'am. Il primo , iene accumulalo dai protoplasu v111 e m ..egu1to convertito J fluo prehmmari d1 tossiCJtà degli xcnob1ot1ci. Pm recentemente ~no stati sV1lupp.iu mtcm1 d1 cd•
M:cma da cstcra}1 endogene-; quota puo ~5trc qumd1 rnuahzzata mediante m1cro\cop1a lule sia d1 mammifero sia d, batteri per nmp1aZz.tre, e mtegrarc, l'uso degh ammali m studi
tr.i, 1oletta. Al contrano, 11 <olorante blu d1 [1am non viene a,sorb110 da, protopl.ist1 vitali to\sicologm. Le cellule d1 mammifero e batteriche non 'Cino gh unK1 Mstenu che ,engonCI uu-
quindi, può essere u-..ito per d1st1ngucrh da qudh morti huau. Le coltu~ d1 cellule vegetai, vengono usate nelle tr.1~torm.1zwm genct1Che e nelle ,hn
Dopo la ngenera11one della puete lcllularc, 1protoplasll mu1ano a d1v1ders1 e a for daz1om somatiche; la ~ione de, protopla\t1 s1 t d1mo,trata p.arhwlarmentc uule negli espc•
nuovi calh entro 24 ore d1 coltura Per faohwe quc1to proce110, appena 1sola11, 1 protop nment, d1 allevamento vegetale, dove sono U'\Jtc per \Uperarc I mcuam,m, d1 mcompaub1h1.1
dovrrbbero e»erc contall per definirc la densna otllmale dell'moculo per la crescita ( IO' sessuale tra piante di genere diverso che 1mpcd1sumo la torma11one d1 2.1got1, 1tal1
lule per dm'). pnma d1essere p1a1tra11. Come ne, cu, prccedenll, CIO può cs1ere fatto usa
un emocnometro
In alcuni t1p1 d1 c1penmen11, può essere nch1c,ta la fusione tra protopla,11, che puo 2.9 Suggerimenti per ulteriori letture
particnl,irmt'ntc mtcrc,!>ante per e1penmenu di 10lroc10, ne, casi m cui l'incompatib1htà
su.ile tra gc-ncn d1vcrs1 può co1111u1re un fattore hm11Jnte. La fusione de, protopla,lt puo e H\1.1, /I S &u1tr1al <tll ( 11/turt bir1111al / >,1111 Jnhn \\ 1lt} & Sons In-. New \ork 1997
re indotta ch1m1Camcnte o fa1camcnte (elcttrofimoneJ. I uwgcm come ,I pohctilengh /\dtguata rratt.umne d1 base delle 1c, m, hr per lt ,ollure h.attrn,he
[hVJ 'I M 81111< (.~I/ ( ,,,,,,,, " l'mtrcn/ l,rrr,1,h "· 2' cd ()xfor.t l nl\rn11, l'ress, Oxfonl 2002
( PF G, al .30% circa) o una 50luLJone d1 cak,o aelcnto pH ( J. Iq0 , p/v, uCI ·6H o m manru [r1t11z1one complt1,1 delle lccn1chc dr bak' per le c,,h111t ccllulm
tolo al I 0%, ph, a pH 10.4) po~~no e\scrc usau per mmm• que5to proce,~o che )I compi IJIXON, R A, (ft)N/.Al l , R /I P/,mt ( tll I 11/111,r I, J>rn1,ca/ l,ppn>ud1 lllforJ l mwn,11 l'rcu. ( hford
m meno d1 30 m111ut1 • 199◄
I 'elettrofu)1one ,·iene eseguita m due fa)i·'~ella prima, 1pro topIa111 vengono po ti m un ~ormsce una buona conoscrn1.1 sullr cohurr ,h lffiut1 H:gcuh r ,ulle loro •rph,az1on1
terreno il ha1sa condutt1v1ta tra due dcttrod 1(fili di pi t d ) I n ll~IY, R I <11/t11rrofAmmnl <r/11 A Ma11u11I o//111 1, Trchmqur lohn \\ 1lcy & !=.ons. lnc.., New \<1rk
a mo 11po111 paralldamente n ve 2000
Irmo d .a m1uosrnp10). \ 'iene applicato tra gh clenrod iu u
(0.5- 1 5 ~IH,), che determina l'alhncamcnto d i un campo ,iltcrnato ad alt.i freque frattazionc completa dtllr ,ohurr ccllulm ammali e delle loro apph,az1om
1 fl!IUt, /1 K (ed) <R< lla11dbo,1ko(l11born1or> \a/ttJ,,l'cd < Il< f'ren, Hoca R,11on 199.5
me d, dettroforc..1 Nella seconda luc ,cngono: p;otopla\ti m un proce1so conosouto co- <,u,da wmplrta ,ulla s1curr1z.a m labonllono
PP 1Cat1, uno O p,u, brevi 1mpuls1 d1 correo
100 I IJOt.OGI~ NOIHD -

HSC Advisory Committee On Dangerous Pathogens. Tht Managtmrnt f>ts,g,t and Opm:ltJOn of,.,,.__
bral Contamment uibomtorres. HSE books, Sudbury 2001.
Guida contenente i requisiti d1 legge e le tnformlllom tecniche dettagliate sulb p ~ . _,.
ministrazione e funzionamento d1 bbonton a maggior grado d1 ,acuran
PARI .KH, S. R., VINa, V. A. Handbook of Industriai Cdl Cullurr.· Mamnialran M,crobull ond ,,,,_, QA.
Humana Press, Toto\'f-a, NJ 2003.
Buon:i trattazione dello 5tato dell'arte delJe t«mche per b selezione a lweUo mdustnak, la c.olliwa-
z1one e lo scalmg-up delle colture di cdJule ammali, ,-egt1~1 e macrobache
CAPITOLO 3

Centrifugazione

3.1 Introduzione
L'analisi biochimica di strutture subcellulari, di complessi sovramolecolan e d1 m,1eromo-
lecole isolate riveste un'importanza fondamentale per la comprensione della b1olog1a moleco-
lare della cellula. Un prerequisito importante per lo studio delle propneta bioch1m1che e fisio-
logiche di organuli e biomolecole è la conservazione delle loro funzioni e proprietà b1ologiche
durante la separazione delle componenti cellulari.
Una tecnica chiave per separare e analizzare i vari elementi di un omogenato cellulare è
rappresentata dalla centrifugazione. Lo sviluppo della prima ultr,1c<:ntrifuga .1nahth. .1 da parte
di Svedberg, verso la fine degli anni venti, e il perfezionamento della tecnica della ccntnf ug,1
z1one preparativa da parte di AJbert Claude e dei su01 collaboratori, negh anni Quaranta, ha
posto la tecnologia della centrifugazione al centro della ricerca b1olog1ca e b1omedka per
molti decenni. Attualmente, le tecniche centrifugative rappresentano uno strumento indi-
spensabile per la biochimica moderna e vengono utilizzate in quasi tutti gli studi subcellulari
invasivi. Mentre la centrifugazione analitic.a viene utilizzata principalmente per gh studi di
macromolecole purificate o d1 complessi sovramolecolari 1solat1, 1 metodi di centnfugaz.1one
preparativa vengono utilizzati per la vera e propria separazione d1 cellule, strutture -.ubcel1ula-
ri, vescicole di membrane e altre particelle di interesse biochimico.
Durante 1 corsi pratici, la maggior parte degh studenti universitari avra modo dt appren-
dere i protocolli delle tecniche di centrifugazione preparativa e potr,1 sperimentare anche
quelle di centrifugazione analitica. Questo capitolo comprende, perciò, una breve mtmdu-
zione sui principi teorici della sedimentazione, una panoramica degli a.,pett1 pratin dcli· u,o
delle centrifughe nei laboratori biochimici, una presentazione schematil.a dell.1 centrifuga
zione preparativa e una descrizione dell'ut1lita delle tecmc.he d1 centrifuga11one per la (arat-
terizza1ione biochimica delle macromolecole. Per facilitare la 1.ompren,ione dei prm1.ipi
fondamentali della centrifuga1ione, viene pre:,entato lo schema generale dei d1,er-,1 rnton e
dei proce:,s1 di :,eparazione.
Spesso il processo di apprendimento degli studenti è ostacolato dalla marn.,mza di un cor
retto collegamento tra le conoscemc teoriche e le apph1.a1iom pratiche. Pt>r ,uperare qul~to
problema, la descnz1one delle tecniche d1 centnfuga11one prepar,1t1va viene ,KLOmpagnata da
un diagrnmma d1 flusso e'>plicativo e dalla dett,1gliata descrmonc dei protol:olh eh trazion,1-
mento sub,ellularc di una specifica preparazione ti-.sutalc Prendendo come c,empio l'i~nla-
mcnto di frazioni di omogenato d1 muscolo ,1.helctrico, ,engono -.p1eg.1t1 1 fondamenti logid
che :,ono alla base dei singoli passaggi preparatl\1. Pollhé i mi:tod1d11-.ol.1mento bJ'>ali -.ull at -
 ttUlll(l< l\~llllll lll \M.t
11101 111~11( l l L"I I llll l l,AZll>~i
10,

• qu.mlll lll,l~IOlc e l,1 ùc11,11.\ ,kl l\ll'lll,1 1,11npum· hmlug1,11, 1,11111, p,u l,11t.1111rn1c una
p,1rt111•1l,1 , 1lllllllV( lii 1111 l,llllpo ll'lllflfullu,
• qu,1111<1111,11•1J1
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111,· e 11 111' -lh111 nI I I r111m1,1 I,-. 1.11110 p111 I,·11t.1mcntl;'" 111110\l· l,1 p.1111,dl.1,
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• qu.11111, m,1,rni1lll' r I I I 1r, l, 11111 I ug,1, 1,11111, p111 v,· Io,enwnt,• un,1 p,Hl1<.,·ll.1 ~• d1111rnt,1,
• I., w l1,, 11,\ d i ' l'di1111·nt.11111nc d, 1111.1 d.11.1 p,1rtt,l'll,1 ~ H·w qu.111dn l.1tlrn~u.1 ddl.1 p.n 11,dl.1
1• qudl,1 d,•I 1111•11n M•no 11 11,1h.
11
I e I':" 1,,,•lk hmlng1.lw, , hc " lllU()Vonu ,1llr,1vcr,n un in,uo, "'-o,o. \llllo ,ottopmt, .,
1111,1"''" le111.1 h 111un.1l1•. , 1or ,1unJ tor,.,. , he ~!li,cc 111 d11 l·1111111 llppn,1,1,1ll,1 wù1111rn1.121nnc
,·,_I r 111411.,lc .1ll,1 ,d,,,it:) <ldl.1 pJrt11..dl,1 mohìpli,.11.1 l'l"r il ,ol'l lì, 1l·n11• fr111011Jk. q111 ,1 11h111111
1hpl' l11h- J.ill"' ù11m•mio111 l ' d.1ll,1 101 m.1 dl'll,1p.irt 11.dl.1 b1UIOt(l1,1. l\kntn il ,.1mp1,11ll' ,i mun
v,• wr,n 1I tnnùo del tubo d,1 l l'ntnfug.1, l,1 ,11.11do,11,\ .111111c11t., .1I ,re,u·rc dcli., ÙI\IJn .11,1
1la,1k: ,11 tl'llll'O s1c,,o. li: p,11 ltlclle 111w111r.1110 un.1 rc\l, tcn,,1 fi 11io n.lll' prnpor 11011.111' ,1ll.1 loro
\dudt,\. l ,1 hirl,\ li 111011.ùc cui ~ , olll\po,t,1 un.1 p.11 ti<dl,1d1c " 11111ovl' 111 u n thudo vi,,1ho ~
il prl1clo1t1, tll'll.1 , ,111 vdodt.\ l'l'r il , uc1,ol'lll<ll'lllC h 111t1n,1lt-, e ,1gh,c 111 d11 c111in1· nppn,IJ .11\.i
,cd1mcnt.11ionc.
I >,,ll\•qu.1Li<111c , . 1 per 11 , .ilrnlo ùel l,llllp11 cent nfugo ,1pph, Jto n,uh,1c\'ldentc: che:, qu.1n
d11 w ngono dc~~nttc le condmom pl'r I,, wp.1r.111onc medi.lilli: tl'nlrifu g,11i11ne J1 un.1 p .ir11-
1;dl,1 bìologic,1, devono ""ere fomiti' mlorm.uiom pre,i,,• ,11ll.1 n-hi.. 11.1 <Id r.i111n•, ,ullc: ,h
mt·n,1011.i r.1ùi.i.lì c ~ull.1 <lui .11,1 dcll.i. lcntrifug.1Lt01\l' b~c111i.1l11wntc, IJ H:lO<ll~ d1 ,cù11ncn1.1
, ione chp,·nJc dal ,JJn~,o l l.:lll.J tlugo .ipph...110. G t,m, ), che ~ dl'll·m1111.110 d,1ll.1dist,1111.1 1,1-
di.ùc, r (1.m), ddl,1 p.uti..cll.i J.lll'.1~~e ùi rota11011c e ,fai qu,,ùr.lto <ldl.1 \lfo.it.1 ,1111:11l.1re, "'
(r.1d s '), <lei rnlorl':

(, wr ( I Il

I ,, vdoc1t~ .mgol.1re ml'ùi.1 d1 un corpo rigido d1e ruot.1 mtorm• J 1111 ,111g,1l0 fo"' 111·nc
.\•.:? Prim ipi lo nd11nh·nh\li Jdlo !>Cdimcnhlzione • . ,k lìmt,1,ume 1I r.,pportl, tr.i lo , po\l,1mcnto .111g,,l.ue l' un d1·tt'rnHn,,ttl mll'1,.1l10 d1 t1•mpo.
' . l nt,' 1.1 d1ff1·1~111J tr.i ~t'thllll'llt,11111n.:, ÙòVU\,1 Jll d Un r,1dhlntc, ~oht.u11t:nto.' ,1hhre\'i,ll(1 ,omc l r.1d, r,1pprl·,cnt,1 1'.1011,nlo ,Il ,,ntro J1 un., ,1r
P,111\:,p<"rl<'n •,1-tu1111J1.111.1, n~ull.i (\I<'-' ) mcntù Jdl.1,cl<Ktt:\ J1 ~cd11ncn- \.tllllert:nl,1 Mlltc,o .i un Jl\:O J1 lun~hcz,., p.,n .ti r.t~h) ùdl,1 11r~ontc1~·111.1 Pl11d1c 'Nl0
lll' t •r1è,trd11 981-m~ ,e.m •
1.-11,, dd<,1mp,, ~"" it.irw1 '. " ( 9RI - l lln l',..-111p1ù ,.:mphu.:, Ili.I c,ph.:.,11H,: ,ig- c4ul\'.llg0111, ,12rt r.1d1.in11. un giro dd ro1t1re può H' nirc l')pr.:"" ,omc .!1t r.,d. 1)1 ,nn,l·gm·n-
t.1111111..- lll un <,m1p1' <<'nmtui::o l 11' 11 ' <°'11' ,· it,l·1 1 ql1c,'" ,Cl.'nJ11nn hmt.m1cnll' ,·cr~o
- • I r I JU.\ 'e ... p.lrtll:C l' 11 ,. • . ' ,.. '
!(IUlll,:éllll1l m un '~,_.11\,0'11,J\~'rntc itt il ,,•uh1l1, l.1 ,t'(hmcnt.11i110l' .1,, it•ne molto più , dou··
11 t1md11 per ~1.1, i..,. · ' 1
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li ' t:\
e
r~r Calcolo del campo cent rifugo
ft' I 111\ll \ lc.'IIC Il\ •1 111 · ·
• 1, I •tt 1.,11\IJ J d le fou1• .:hr ,wi-.l•no ~ullc p.1rli<.d lc bw\og1.:he ~o~pc, c tn u n llOMANI)"
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411 1111 11
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• , u.rntn nugg1url! è l.1m,,"-' d, 1111.1 r,mi,dl.i b1olog1._,, , t.into più w k,co.'meutc e"·' ,i 111110
1
\ c.' lii \111 ,.,111p1• lèlltntugl1;
 810< IIIMICA t 81010<,IA MOLH \lLARt
( I ~RIHllòAZIONl

104 105
· termini di velocità del rotore m giri al
1
ò ssere c~pre~ n
z..i, la. velocit.ì angolare del
rotore pu e 100000

minuto, revolr1t1011 {rev) per r,111JJ1tt: 95000

(3,2) ,0000
2irrcv mm '
w-
60
ò essere espresso come:
di conseguenza il campo centnfugo pu
(3.3)
4,r (rev mm ')· r
G
'600 1 000000
. . alm te espresso in multipli del campo gravitazionale, g 900 000
800000
Il campo centrifugo ,~1~~~"~~ncr I teno {RCF Relative Ce11trif11gal Field), che è il rapporto 700000
800000
(981' cm s '). Il• campo u:ilUJ..U'f!,O
'fu re specifico
a 1, '
raggio e la velocità ali,acce1eraz1one
• dt• gravità 180 500000
tra l acce1eraz1one centn ga, a uno . I ' aZJone·
. '°° 000
180
normale, può essere calcolato mediante a seguente cqu · 300000
1'11
(3.4)
4ir (re,• mm )· r 120 200 000
RCF-= -
3600 981
100
Le unità RCF sono quindi espresse in multipli di g (x g) e i giri al minuto sono solitamente
1
90
100000
abbreviati in r.p.m. ( r1wol11t1ons permrn11tt). Più semplicemente: RCF == 1.12 x 1o•s r.p.m. r. 80 90000
80000 30000
70000
Sebbene la forza centrifuga relativa possa essere facilmente calcolata.i manuali sulla centri• 70
80000
fugazione forniscono solitamente un DOmogramma che consente una fac ile conversione tra 60 50000
forza centrifuga relativa e velocità della centrifuga, a differenti raggi dell'asse di centrifugazio- 'l!OOO
ne, in un punto specifico del tubo dai:enuifuga. UQJlomogramma consiste di tre colon ne che 30000
rappresentano la distanza radiale (mm), la forza centrifuga relativa (x g) e la velocità del roto•
20000
re (r.p.m.). Per la conversione tra forza centrifuga relattva e velocità dell'asse della centrifuga,
20000
in r.p.m. a differenti raggi, vtene traeciata una retta passante per i valori noti di due colonne e
30
il valore desiderato viene letto all'intersezione della retta con la terza colonna. Nella figura 3.1
10000
9000
è illustrato l'uso di un nomogramma. 8000
7000
eooo
20 5000

E5fM PIO 2 •ooo

Calcolo della velocità angolare 3000

DOMANDA 2000
Per la sed1mentaz1one della frazione microsomal d.1 .
a
un'ultracentrifuga viene fatta funzionare una / 1 u;
; 1.mogenato d1 fegato,
4 10
velocità angolare, a>, in radianti al secondo? e ocu o000 r.p.m. Qual è la 1000 10000
Dlstania radiale Campo cen1nlugo Veloc1ta del rotore
(mml relativo ( 111 (rpm)
Rl\PO~ I~
. w. si calcola utilizzando la seguente equazione:
La velocità angolare, .
Figura 3.1 Nomogr.unma per la de1em11na1ione del campo ccntrifu I
2,rrev mm ' un dato raggio del rotore. Le Ire colonne rJpprl.'sentano la dt~lanu ra3~:1~e(J11,ol pler, una d.11a Hfu·louta e t'cr
X g' J •ml tà d I ( ) p I ' mm , 3aI ona ccnln ga relativa
w== - ( , e ,1 ... oca . e rotort r.p.m... er.a .;omer\lonc tra la foru ~entnlu a r I l •
60 della centnfuga
•d d m r.p.m. ò
a differenti raggi, tracciare un,1 hnea re.tta che unisrga e 1 t\'a e advcdloutad
· d I a11•· , i,aonnoll t ueu1onnc 1dl asseti
vaIor< est erato pu qum I essere etto mt.ersez1one Jclla linea rclt.t wn I.i tcrz., culo 3
w == 2 x 3. 14 16 x 40 000/60 = 4188_8 rad s 1 (Per gcnllle contesMonc della &ckman Couhcr ) "" ·
 B!Ol ftJMll A I BJOL()(,lA MULHOl,\JU
l I llTRlfl,uAZJO);I
107
ton
<li rotazione al menisco del liquido, Pp è la densità della particella, p.,, e la demit.i del mt'uo e w
è la veloc1t.1 angolare del rotore.
I ,1 ,11•111 3 •fugo relativo La velodta di '>Cdimentazione di una partICella b1olog1Ca può essere espressa anche come
Calcolo del campo centn . . ,J tubo da centrifuga cocllicu:ntc dt ~cilimcntazionc (s):
in l1"hl ..
m1n1m0 , , _ .- - . la la figura 3.2a
IIOM-'"11A . ieJc un rJgg10 , d1 7.0 cm, :,1 Ht . •
Un rohir~ .id angolo 11,so p<m 5
ul 1,,ndo del tuli<. ad angolo fj~,o e illustra la s= (3.7)
· Jss1mo, r.,.., d1un rotore I · l tJ r
di 3 e; lm e un raggio 01 • e trJ,1'tr..a1t . tto funiionarc a una ve OlltJ
.. h J della se71l'n e i iene 1,1 I I b d
lhe riporta uno s, cm mw ~ il rotor ) li dtu: c\trermtJ te tu o J
mn1111oe mòliS I (RG a e Poicht la vdocita d1 sedimt"nta11one per unità d1 campo centrifugo puo essere determinata
poS1z1onc dd raggio I ntnlugo f( a1110
d1 20 000 r p.m., qual t 11 cJmpo le J temperJture diverse e m presenza di meu.1 diversi, 1v.ilon sperimentali dei coefficienti di se-
centrifuga! dimenta,ionc vengono corretti per una costante d1 sed1mentaz1one teoncamente nfenta .i).
do J'equa11onc; l'acqua a 20 °C. ottenendo 11 valore SJ0 11 • I cot'flicienti di sedimentaz10ne delle macromolecole
1uwo\ r \ ò -ere ,alwlJtO ull1,uan biologiche sono relativamentt" piccoli e vengono solit.1mente espressi come umt.t Svcdht"rg, S
Il campo ,cntnlugll rdJt1H> pu e,
( par. 3.5 ). Una unità Svedberg corrisponde a 1O s.
RLI _ 1.11 x 10 • r.p.m.'r
In cima al tubo da lentnfu~: 3.3 Tipi, manutenzione e aspetti di sicurezza delle centrifughe
RCF = l.12 x 10 :. (20000) x 3.S=IS680'1
3.3.1 Tipi d, centrifuga
Sul fondo dd tubo dJ <cntnfuga:
RCF- 1.12 x 1o•x (20000)lx 7.0=31360g . . . Le tecmche centrifugative rivestono un ruolo centrale nei moderni studi d1 b1och1mica e di
fisso il campo centnfugo m erma biologia cellulare e molecolare. A_seconda delle part1colm applicazioni, le centnfughe d1ffcri-
h ·on un rotore ad angoIO ' •
Quc~m calcolo mostra e e,' fi . re aquello sul fondo, m questo caso <.eono nel loro disegno generale e nelle dimensiom; tuttavia, sono tutte caratterizzate da un
.il tubo da centri tuga è com1dcre1olmente meno motore centrale che fa ruotare un rotore contenente I camp1om che devono eççere ç,•parat1 Le
.ippros~imativamcnte di un fattore due. paruceUe d1 interesse b1ochUDico sono generalmente sospese in un sistema tampone liqwdo,
contenuto in appositi tubi, o camere di separazione, che vengono posizionati in spec1fili roto-
ri. li mezzo biologico viene scelto 111 funzione della specifica applicazione centnfugatil·a, e
In una ~ospens1one d1 parucdle biologiche, la veloc1ta di scdimentazi~ne dipende non ~olo
può essere considerevolmente diverso a seconda che questa sia di tipo preparativo o analitico.
dal campo ,entri fugo applicato, ma anche d.illa natura della parucella, cioè dalla su~ densità e
Come sarà de~critto 111 dettaglio, allo scopo di preservare le funLioni biologiche, occorre valu-
dal suo raggio, e dalla 115cos1w del mezzo che la ~i~conda. La legge dr Stokes descrive queste
tare accuratamente le condmom ottimali d1 pH, concentrazione !>alina, pre~enza d1 cofattori
relazioni per la sedimenLUione di una part11:cll.i. ngida sfenca;
stabiliZZJnti e ingredienti protettivi, come 111ib1tori di proteasi. Le differeme piu ev1dent1 tra i
modelli di centnfuga sono:
(3.5)
• velocità massima alla quale sono sottoposti I campioni b1olog1C1;
• presenza o assenza di vuoto;
dove v è la \docit.i d1 Sèdimcntmone JdlJ sfm, 2/9 è la costante di forma per una sfera, r è il
• poss1bihta di refrigerazione, o regolazione della temperatura, durante la centrifuguione;
raggio della particell.1, Pr e I.i densita della part1CeUa, p. è la demità del mezzo, g è il campo
grJHt,monale e r, è la vi~osit.i del mezzo. • volume massimo dei campioni e capac11a dei s111goh tubi della centnfuga.
Una miscela d1 particelle b1ologiche, mnu forma approssimativamente sferica, possono In commercio sono disporubili numerosi t1p1 d1 centrifuga, tra 1quali:
quindi eççerc separare in un campo centrifugo sulla ba.se della loro densità e/o della loro for· • centnfughe preparative d1 grande capacita e bassa velocità;
mc1. li tempo di sedimentazione (m secondi) per una particella sfenca è:
• centrifughe preparative refrigerate ad alta velocità;
9
t- l'J x In r~ • ultracentnfughe analit1i:he;
2 w r ~ Cp, /Jml r, (3.61
ultracentrifughe prcparaliw;
dove I e 11 tempo d1 sedimentazione, 'I è la viscosita d 1 • centrifughe per u~o d111ico su larga scala;
'P
la distanu radiale dal centro d1 rotazione H do e mezzo, e il raggio della particella,,~ è • microi:cntrìfughc su piccola scala per labor,llorio.
a on del tubo, r, è la distanza radiale dal centro
 BIOOII\IIC.' E ali llD<..l, \IOllCOLUI
ll1' 1RlfUGA7101'E
109
che richiedono notevole
de\'O1u me'
10s . odelli di gran . onati centralmente in ap. ia tubi da centrifuga, ma un continuo flU\so di terreno. Quando il terreno entra nel rotore in
tcun1 rn . nere pos1z1 . I b
. d. bioshirn1ca, a . ngono 10 ge di· ,cntnlughe l ,l anrn dì 01ov1mento, le particelle biologiche vengono sedimentate contro la ,uperfaic del rotore,
, d. umcnll I more, ,e . iluppo
:s;e1 ipar olto .:alore e ru . Tutta,·1a, 1o s, . 1 centrifughe, ha permesso la mentre l'eccesso d1 liquido viene nmosso attraverso un'u\cita apposita.
,paLio e generan'.1 m. all pparecch1a1ure. me pure d1 u tra L' ultracentrifuga1ione ha notevolmente migliorato l'analisi biochimica dettagliata d1
.. I . li de!>t1nat1 e a . . him1che, co . .
po,iu osa .· . er applicazioni biOC boratori di ncer~a. lzzano durante le esercitaz10- strutture subcellulari e di biomolecole bolate. I:ultracentnfugaz1one preparativa puo c~erl'
1
pi.:cola capda~qll:!,i modelh nei singoh1·astudenll un1versitan Udllfil1n1te per il piccolo volum _e d1 effettuata con campi centrifughi fino a 600 000 g.Allo scor.o di evitare il ris,aldamento ecle, ·
d1ftu~1one 1 . Jj che g 1 h (cosi e sivo del rotore, provocato dalla resistenza fr121on,1le tra ti rotore in movimento e l'aria, la ,a.
I pnnc1pali tipi dlcenu udga, o le microcentrifug_fue he preparauve d1 grande capacità, le
. b e compren on .n le centri g •fu h mera del rotore viene sigillata, per fare il vuoto al mo lllterno,c refrigerata. A ,e.:ondJ del mo•
ni pratiche d1 3' ' Iubi E pcndou,, . _ ultracento g e. ..
·on• ,entnfug.ito in p d .11, ,·elootà e le . modelh e vengono utiltllate, dello, dell'usura e delle cond121001 dell'ultracentrifuga, 1I raffreddamento alla temperatura de-
campi • fr" eratea "'~ bl n van siderata a regime, e la generazione di un vuoto stabile, può nch1ederc tempi anthe com1derc:-
~11tnfughe preparative re idg b ,o sono disponi 11 I I b1'ologico (come cellule email-
~- •fu he a an . d. materia e f voli. Per evitare ritardi durante le procedure biochimiche che prevedono l'ultracc:ntnfuga110•
Le scmphci ccntn g ghere . . ole quantità 1 . . ocentrifughe non re rigerate
p1cc . tel0 k m1cr . ne, i sistemi di raffreddamento e per la generazione del vuoto dovrebbero essere mc,,i in fun •
Principalmente, per racco . dei campiOlll pro ' . rocentnfughe refrigerate sono
. ,. d naturaz1onc derne mie . zione almeno un'ora pnm,1 della centrifugazione. D'altra parte, le moderne ultrJcentrifughc
che) . .Per evitare "' e . ere fredde, Le mo . . - standard, per la sed1menta-
·1 nate in cam . d1dimension1 . . po,sono essere messe in funzione anche in assenza di vuoto stabile, effettuando l'elimin.11io-
vengono_ spesso uu i 11 ·ar• tubi d1 p_la~uca, , nire campi centrifughi fino a
· per a oggi ' . h ossono 1or ne dell'aria dalla camera del rotore durante la fase miz.J.ale di.acceler.1Z1one.
do_ tate d1 adattaton O5 e 1; cm_· PotC e P . . rappresentano uno strumento
zione di. voIumi· compresi tra . · . b.10· logio neU'arco di m1nut1, Per ragioni di Sicurezza, in particolare per prevenire danm all'utilizzatore m ca:;o di movi-
d mentano campioni . odi b ochimic1. . menti incontrollatt del rotore o di vibrazioni pericolose, la centrifuga è ra"hm,a tr,1 pe,anti
IO 000 g e se t . d !>abile in numerosi met . I concentrare camp.iom protetcL
d separazione m ispen . e utihuate per piastre blindate. Una centrifugazione non può essere iniziata senza la corretta th1u~ura ddla
1. ifugbe n1K<nno, inoltre, esser da una colonna cromatogra-
Lc m1crocentr r-· ione proteico, e1u110 . qimera del rotore. Per prevenire dannose vanaz1001 della temperatura della camera, v1bra1io-
Per esempio, e I' levata diluizione d1 un camp •
bi ma per le ana11s1 su ccessive Una soluzione
. può essere ni eccessive o l'utihno del rotore a velocità superiore a quella massima consentit.l, i moddh th
ti1ca, puO. spe>SO rappresentare un proediantc e apposite . uru··, "'
di filtrazione abbmate a. provette
. . ~ltracentnfughe più recenti sono dotatt di sofist1cat1 s1stcm1 d1 regolazmne dcll,1 tempcratura,
e-,entata dall'ultrafiluazione, m ., . •n base alla proteina d1 interesse, a1 di alben moton fle,,1b1h e d1 un d1,pos1uvo d1 controllo della ,doc1w ma,,1ma. Sebbene un
rappr , b~ forza centruuga, 1 . . . il
di plastica, in ~i~ocentn,uga a ·o molec.olm dei filtn utilizzati, m pocru mmull cam- lieve sbilanciamento del rotore possa essere assorbito nelle ultracentrifughe di recente costru-
t.imponi biologia uuhuall e al tagli l z1one, uno sbilanciamento maggiore dei tubi provoca lo )pegmmento automatko della cen-
P ione può ~re concentra
IO da 10 a20 vo te.
d . . d·mem1oni sviluppano campi centri u I
· ·e gh" trifuga, in particolare nei modelli con roton a bracci oscillantt.
. h 11· ·e da banco I magg1on I d
• Le cenmfug e prepara ' .. con diversi ttpt di contenitori. A secon a Va considerato che, per I numerosi mtem1 d1 ~1curez1a d1 cm \Oml dotate, le ultra,cntnfu ·
. . d. 3000 .7000 ne po~sono mere ull1izu1e .
rnass1m1 1 . " .. . , . alloggiato un considerevole numero d1 provette ghe moderne sono macchme robuste che toller,mo, entro una certa mi,ur.1, un U\O improprio
del tipo di adattatori d1spomb1h, puo ~emre . d ELISA Que~ta ca- da parte d1 operaton mesperu (in proposito, M vedano anche I par. 33.3 e 3.3. t
t. :a da 5 a 250 cm, d1 volume, o d1 p1a~tre da 96 pozzetti per osagg1 .
m:!::s:~c; confemce alle $Cmplid, e rtlati'ltmente poco costose, centrifughe da banco un Contrariamente alle ultracentrifughe prep.uauve, le ultr,tcentrifughe ,1nah11che contc:ngu•
no un rotore compatto che, nei modelh pm semplici, mclude una cella anahllla e un.1 d1 bilan-
~~olo centrale in numerosi s.aggibiochimic~ in p,uticolare quelli che_ richiedono ti procc:ssa-
mento rapido di molti campioni, e per i quali è fondamentale la rapida ed efficiente separa- Qamento. Durante lo svolgimento della centrifugazione:, un ,1,tem.1 ottico rende pos1,ih1le
l'osservazione del materiale c.he J,ta seduncntando. Dur.mte l,1 lCntnfuga,ione._le vanMiom
zione d1 precipitati gieai e cellule integre. . ..
della concentrazione nel campione b1ologico po,sono e,serc determinate in umtinuo mc:•
Le centnfughe refrigerate ad alta e ad alt1!>S1ma velocità wno assolutamente md1spe~sab~1
diante un 1,istema ad assorbimento di lule, un ,b1t·m:i di '-<hheren u un sistema mtcrfcromr
per la sediment.ll1one d1 precipitati prote1c1, d1 gro~i organuli intatti e di detriti cellulan dm·
trico d1 R,1yli:1gh. Questi ult1m1 nle\ano le ,aria11om dcli mùKe d1 rifr.11iom· della ,olu,innc:
, anti dall'omogeneizuzione di tNuti e m1cro1ganwni. Come \Ì vcdra nel paragrafo 3.4, per
causate dai cambiamenti di wncentr,monc, e po,\onu quindi e,,cre impiq:,lli per Il' .111,1lt\1
la ~parazione di gran parte degh clementi cellulan,condotta prima dell'ultracentrifugazionc
dcll'equilibno cli scdiment.lZionc. Quc,ta ,.iratteri\tKa rende l'ultraccntnfugJ1ionc an.lhll<a
preparauva, s1 ncorrc a questo tipo di centrifuga, in grado di operare con campi centrifughi
uno ,trumento relativamente .iccur.ito per determinare I.i m,1,,a molnol,ue di un.1 ma<10•
fino a circa 100 000 g. lalt forze ccntnfughe non sono sufficienti per sedimentare le piu picco·
molccol.i 1~ol.lta. Es\J può, inoltre, fornire mforma1,oni cru<iali \Ulle p111prietà ttmlodmam1
le ve5cicole micro~m~h o i ribo~mt, IN possono ~e impieg.ite per la separazione difk
che d1 una proteina o d1 altre: gro,!>C b1omolc,ole.
renziale d~ nude1, mrtocondn o clo~oplas11. Qu~te centrifughe po~mo anche e~\ere utilizza·
te per sedimentare aggregali prote1c1 d1 grandi dimensioni, come l'app.nalo contrattile rili·
~c1ato dalle fibre mmcoun mcduntc om,-n--...
•
aomulc:colc d1 OIIOSI04 C: actuu aggregate tn fiumcnt '• _
-D" -10ne, co~1ttu1lu prrvalcntcmcntc ua ma·
r • ) •
.1
uò
' J.J.2 Tipi di rotore
·r. uuliu~t.i anche con•· ~,.,1.1:1 n..... 1. ._.. cmtn1ug.t11une ad alta ve 0~1ta r Pn tllu~tr.1rc le: dìffcrcn,e ncgh s~hemi co,trut11~ 1tra rotori ad angolo fa~o. roton ad allog
es>t: e ......"'41.laa.llllWOCOlltJnuo
000 rotori 10nal1, per rauog 1ere c ·
1· d
Jule d1 hev1tu o b.itten <h grOSSJ volumi d gi,1mcnto ,crlt<Ull· e wtort a hra,<I oscillanti, ndl.1 figura J.2 vtt'lll' mn,trata l.1 S('1111ne trJ
i ttrrnioeohur.Je. QuC\ta tecnica quindi non uula·
 tlllll III MII \ I tllOllX.I ... '101 r

< r NTRIFU,A 10).f

111
I Ili \\er,.ile d1 que)ti tre Up1 cli.a h
pp.irec1. tJture. le a11enJe produtt11ll Je,1gn.1110 1 ro ton m base
,,I tipo, .iIla veIoc1t.1 ma:,i,1m,1 c , I
tal , On!>cnllt,1 e, 1.1 ora, ,Il m.ttert.ih "on 1.u1 sono r~Jh11at1
le ,orze centufughc alle q 1· è
• . • UJ 1 '>Oltop1hto I 1rotore m mm m1entn, ,uno d1ffac n11 a c, on -
d.t che~• lr.itll di un.i ~emphce centnfug., a ba"·' velu,11!1, d1 una ,entrafut;.i ,id alta ,rtoc11 o
Aogolo d1. un.i ul~accntnfug~· • • <li con~eguenu, 1· divcr~1 11p1 <l 1' rotori vengono co,tr11111 con 111.11< nah
del 1ub0 d1fleren~ 1 I rotori per b.i,,e veloc1t,1,ono m ,m;1a1O o m ottone, me
14 ,o· I rolort per alte velo\.!•
tà \ono_ma lumi mo, lltamo o materiali wmpos111 nnfor1.1t1 d., fib~aholu l'e,tcrno del ro
t?re è ncoper~ co~vermci protctuve: per esempio, I rotori per ul~ntntuga11one 111 lega d1
tlta_mo sono rivestiti d.i uno strato d1 poliuretano; quelh d1 allumm10 \ono pru1e111 dalla ~or
ros1one da_un robusto strato di ossido d1 .illumm10. Per e, itare d1 danneggi.ire qucq1 strali
protett1v1, 1 rotori vanno \empre manegg1a11 con cura.
Asse del rotore I rotori ad angolo fisso (hg. 3.2a) sono lo \trumento 1de.ile per preup1t.ire, durante la se-
paral1one d1fferenZJale, particelle b1olog1che aventi velocit.i. d1 sediment.wone ,1g111ficau,a

(b)
- Campo centrifugo
mente differenti, per e\emp1O nuclei, mitocondri e microsomi. Inoltre, ,.ono ~omunemente
impiegati per la separazione delle particelle mediante formazione d1 bande nella 1.1:ntnlug.t
11one 1,op1cruca. Con questo metodo, la centnfugaz1one viene contmuata fino ;1 che le p.irh-
celle biologiche hanno raggiunto nel gradiente I.i loro po\111onc i,opirni,;;,11 ,;;hc cormponde
alla posmone nella quale la velocit.1 d1 sed1mentaz1one è zero, m quanto la dens1tJ delle parti-
celle biologiche è uguale a quella del meno che le arcond.i. In quest.i class.: d1 rotori, 1tubi da
centnfuga vengono mantenuti a un angolo di mclina71one fisso compreso tra 1-t e -10° rispetto
all'asse verucale. Poiché il campo centrifugo viene esercitato a un determin.ito angolo, le par•
tlcellc s1 muovono radialmente verso l'esterno e devono percorrere solo un.i breve di,1a111a
per raggiungere la loro posizione 1sop1C111ca m un gradiente, se si uulizza una tecnH.a m 1so-
densllà, oppure prima di andare a collidere contro la parete C\terna del tubo da centri tuga, ,e
~del rotore si utilizza un metodo per centrifugazione differenziale.
campo centrifugo I roton verticali (Fig. 3.2b) possono essere classifìcall m roton verticali ven e propri e in

~-
(cl roton quasi-verticali. Nei roton verticah, 1 tubi da centrifuga sigillati sono mantenuti paralleli
,.ill'asse d1 rotazione e sono trattenuti nelle cavità del rotore da viu, guarniziom speoah o tap-

~
pi. Poiché i campioni non vengono separati lungo l'.isse vert1c.ile del tubo da centrifuga, ma
lungo il diametro, ù tempo necessario per I.i separazione 1sopi1.mca è con~1derevolmente 1111-

. -, :'. ·:=- nore, se confrontato con quello necessario con i rotori a braco oscillanti. A d1ffercnu d1 quelh
ad angolo fisso. i rotori quasi-verticali presentano un angolo d1 indmaz10ne- dei tubi ridotto
(c1rCJ. 7- 10° rispetto all'asse verticale) e utili:z.uno tubi a Lhiusura rapida. li mmore angolo d1
inclinazione consente tempi d1 separazione molto mfenori rispetto a1 roton ad angolo fisw. I
rt. ,i ~-1"!; rotori quasi-verticali sono indicati per centrifugazione su gradiente d1 componenti hiolog1u
Il che non si separano convementemente mediante gradienti trad1l.ion:ih.
In un rotore a bracu oscillanti (Fig. 3.2c), i bracci vengono fi,sati mediante app(Nte cer-
niere o barre. In questi modelli il caricamento viene effettuato m po,11ione ,ert11:ale- e, duran-
Asse del rotore
te la fase d1 acceler.iz1onc m1ziale, i bracci del rotore ~i di~pongono onnont.1lmente.
Fagur.i 3.2 S<hcma dc, trr pnnopah 11p1d1 rotori ut1lizu11 nelle ireniche centnfugauve comunemente U: La separazione delle particelle nei tre pnnc1pah tipi di roton è illustrai.i nella figura 3.3, ~he
pieg.lli: m ,.impo h10,h1m1co. \cngono mo,tule le ~,1om tuwcr..ah d1 (a) un rotore ad angolo fis-.o, schematina il monmento dei campioni biologici durante la fa,e im1ialc d1 ac1.elera7111 ne-, la
un rotore a 1uh1 vcrllcJlt, (cl un rotore a brac,1 osC1llan11. Ln quuto ttpo J1 rotore è r,tppre~enwto d.db fase prmcipale di separa11one della centnfuga11onc, la <le..:elcr.i,ione- e, mtìnc, durante la ral•
dJ"< dei roton q11.1s1 Hrllcalt
colta delle p.irticelle sep.iratc all'arre,to del rotore. '\Jcl ~a,o dcli.i centntuga110ne Mlpt~m"a tn
un rotore ad angolo fo,o. 1 tuh1 da centrifuga vengono riempiti dd1latamente lllll un .ippro
pnato gr.idtente. li 1.amp1one, iene, qu111d1, lario;;ato lOn c.mtela al d1 ,opra d1 que~ta soluz10-
 BtO<JIIMll, I ~IOUX,IA MOl.l(.Ol>.lJ
, I ~ I RIFV<,fdlONE

112
cent11fù1JO tore vertiLale (hg. 3. lbJ. Sebbene in que,to tipo d1 rotori 11 tempo dt cor~ \Cnga nd,mo. e
(1) c,111po " poss.ino essere ,tlloggtalt un numero elevato dt tubi, I.i molu11onc delle bande separate du•
rantl' la LCntrifug.i21one 11op1cnic.i è minore mpetto a quella ottenut.i nei rotori a bracu o,L1l-
lantt. Infatti, t rotori a bracci 0~1llantt, che po,~ono e,~ere util11 ,au con una maggiore v.1rid.1
d1 gradienti con diverse: pendente, sono I roton d1 elc11one quando e rkh1e,ta la ma,s1m.1 ri
wlu11onc delle bande (F1g. 3 3c), come negli \tud1 ,onah d1 velocit.ì, ba'>.111 \ulla ,cpara110ne
d1 particelle b1olog1che in funttone del coefficiente dt sed1mentaz1one

J.J.J Cura e manute1mo11e delle certtrifughe

La LOrro\1one e la degrada11onc, dovute a1 ~1stem1 tampone biologKt utthzz.iti con i rotori,

ibl o la contamm.izione dell'mterno o dell'e,terno della centrifuga, dovuta .i perdite dì hqutdo,
puo seriamente compromettere la durata dell'.1pparecch1atura
Un altro elemento e~~enz1ale è ti corretto b1lanc1amento det tubi, importante non •,olo per
ragioni dt sicurena come descritto ptu a\anlt, ma anche per evitare danni, indotti da v1bra-
z1oni, al rotore ~te~~> e all'albero motore della centrifuga Qumd1 la corretta mampolaz1one e
la cura, cosi come la manutenzione regolare, sia della centrifuga sia dei rotori, sono fonda-
mentali per pre~crvarne la buona funt1onah1.1
Allo scopo dt ev1t.ire danni agh strali protett1v1 del rotore (per esempio alla vernice pohu
retanica o ali'ossido di allumm10) occorre pre~tare molta attenzione quando s1 pulisce l' c,ter
(cl
no: non dovrebbero essere utìhzzate spaaole ruvide khe potrebbero graffiare la protezione) e
bisognerebbe 1mp1egare esclusivamente detergenli non corros1v1. La corrosione può e,\ere
---~·
c,r,,po centrifugo
provocata dalla prolungata cspo~1Lt0ne a soluz1om akaline, t.tmpom ac1d1, detergenti aggre)
s1v1 o sah: 1 rotori dovrebbero qumdt essere lavali accuratamente con acqua d1st11lata o <leio
.. ___, ___J • Il 11 IJ ... mzzata dopo ogni util1220.
Per la comervaz1one durante la notte, 1rotori dovrebbero prima e~sere la\ctali capmoh1, m
modo da drenare il hqu1do m eccesso, e quindi posizionati m un luogo asciutto e sicuro Per
ev1t.1re dannegg1amenli alle cerniere det rotori a bracci oscillanti, dopo la nmoz1one dei re\i•
al i di rotori uulmall nelle tecniche ccntnfugall\C dui d1 tamponi b1olog1c1 e il lavaggio con acqua, tutti I componenli dovrebbero essere as\:iU•
I ,gura \J Mod.1hu d, furu1on.un~n10 dei tre l'nnupl .•~Poni tr•s,--· ·'1 d1 un tubo da centrifuga po11110
h1mi O \en•ono mo,tutc e ~.i • '°"' · 1 Lo ''h' gali con panno carta. I rotori da centrifuga spes\O non vengono correttamente con,enati m
'°'
b
:•:t:~:~~~t~
O
p,u m uso m umpo e 1 I tubi ~crtlCalt e (cl un rotore a bracci oscil anu.
;°
10
n.1 1 <tl ut"~~'.~~::1 un luogo puhto; tale mcuna dovrebbe essere evitata, perché può determinare il rapido dete•
0~;;:. ~ durante la fase mwale d1 accelm~1one, la!ar pnnorit
3'1, U\~~,'.nH b fast d, decckrwonc-c l'i»ttto fin1le delle parucclle sepaulc ali arre,to e wtore. I di rioramento del rivesttmento protetttvo. t opportuno conservare I rotori in un apposito loLale
h~~~1o un rotore ad ;ingoio 1tub, \Cngono mmp111 con un gra_d1en1e, 11 camp1one;•1ne carJ!i\~;i~cc-
fis10,
wpuJi qUC>ll> c qumJ, 11ubl\(ngonopo,mon,t1dcntroghallogg1.1men11dcl rotore e cor\O IOM
puhto, fisicamente separalo dalla stanza dove e posmonata la centrifuga, con \paz1 mervall a1
singoli rotori.
kru,one del ro101c. il u.mp1onc e ùgr.di.:nlc 1ulm.:.onu UD riorientamento che determina l.t ~cpar.11
ddk puucclle i,entt d1ffmnu propncu eh 11'..duncnwwne Un ,1m1le nonentamento del gra~tente.
fom,u,one di b,nde d1 ruu,dlc m1roe •nl.hc 111 un rotore a tubi verticali. Per la gr.inde \Jrtcl.l dt gr
'°: Alcuni ricercatori preferiscono pre-raffreddare I rotori, pnma dt una centrifugazione, tra-
sferendoli m una camera fredda; sebbene questa pralica sia accettabile e consenta, per esem-
d,cnt1che puo ,,sere 1mp1~u.1 roton ;i bm,1 O\sùlanll co,IIIUl¼Ono il metodo dt elatone qumdo viene pio, dt ridurre al minimo la degradazione proteoht1ca, 1 rotori non dovrebbero e\sere mante-
n,htC,ta b m,~,!fll<l roohwonc déllt b.uide
nuli per lunghi periodi dt tempo m luoghi umidi e fredd1.
Una manutenzione regolare dei rotori e delle centrifughe da parte del personale tecniLo e
importante per assicurare la s1cureua delle operaz1om dt un servmo centraltzz.110 J1 ~entrifu-
ne e I tubi vengono posìz1ona1t a uno ,pwfico angolo fisso nelle c.ività del rotore. Durante gaztone. Per valutare se e effetttvamente neces~ario so~1ttu1re un rotore o parli dt una centri-
l',1w:lcrJ11onc del rutorc, la \Olu11one del campione e 11gradiente si norientano nel catnPo fug.i, e essen1ialc che tutti coloro che fanno uso delle attrezzature comp1lmo correttamente un
centrifugo, e" ha la ,eparazione delle particelle m base alle d1fferent1 proprietà dt sedimenta apposito registro, riportando t tempi e le veloc1ta dt centrifuga11one· t,1lc proccdura e impor-
none ( F1g. 3. 3a). Durante la fa1e d1 dMlerazione, il gradiente ntorn.i alla su.i posizione ongt tante, m quanto le cicliche acceleuz1ont e deceleraltont del rotore po,,ono dch:rminare 11 k
n~k, le bande delle par11cdle sep.mte po\~ono e~scre recuperate dai tubt all'.1rresto del rotore nomeno della ~fatica del metallo"
L:nanalogononentamentode1•radirntiedellcb
0 . Ile avviene
ande deIle parttce . anch e rnunro
 Bl()(Hl•U< ~ E IIIOIOGIA MOl.t< O1,'.RI
Cf :STIUJ-t.t.A.llOSE
115
11.\
Infine, un importante .I!, 11O d Il
. . h pe e .i sicurezza nguarda 11 corretto trattamento delle parti-
J J 4 Ce11trifugaz1011tt sicurt-:JO h b10,h11mi:hc ~on<> attrcn,1ture ccli e b 101og1c e separate dopo I •f . . .
· · ' e ,(ntnlug ( .d 'fu d a centri ugaz1one. Allo scopo d1 anahnare le singole frazioni i
fì , 11e k mo1krn . ,·1di ,icurc11,l. tu.b I J centri g.i evono ve mre · spesso ,,orali· o taghau · · a fette; per esempio,
· le bande delle ve•
'
Pur c\scndo .1lt.1mente ,o 1~11 • • 0 0101t1 d1,p<)'111 li ltrJcc:ntrifughc ,ono ,emprt· sc11.,o1e separate possono es ·
. h n orP'-HJn I tl e de e u fi . d , . · sere recuperate dal fondo forato_del tubo da centrifuga o raccolte
rdativ.,mcnte re",tcnll, e e 1 ' 'f h• ,J altJ ,et'-' ttiiti per 5opportarc mo ,l un tag I1.in o a 1ette 11 tubo do
. .
d
po un rapa o congelamento. Se I camp1om vengono pre-mcubati
d ·li cntrt ug • • 0 progc
Le LJmerc dd rotore e e' ., \tolti 01,,Jelh :,{'11. • , di , pcgn1mento auto- con marcatori radioattivi o lg
1 an d.I toss1c1,· d eve essere evitata
· · ·
. • bhnu.ite, • d ti dt un ,1,1e1113 . la contammaz1one della camera
r,llch1u,c 111 pe\Jnll P1·1\ 1re •olitJmente 01•' ., n tubo durante la ccn trifu - della.centnfuga .e delle cav1t J de I rotore o d e1· contemton. Qualora un processo dt separazione
. bI nto e ~ono • 11un1 ul u
lt:rto gr.ido d1' 1anu.ime L.n bilJn.iato. 13 rt1 ., · •nwlo 5c v1brMio111 I roto- mediante centnfugalione debba essere cond otto routlnanamente con una sostanza poten
.1. • I in un rowre.,.. quindi, ul pc
malico. uttav,a, Jlll ie L l •n<1,mento e, Q ndll il rotore può ew:re 11almente. dannosa '. per elim·mare Ia poss1·b·1· 11ta d I contammaz10m· crociate,· ·
può essere utile
d un ~r.1,.:- ~"' ~ • · J tubi u.i
gJLionc può c,\cre c3 u,.1 1 . eo . un numero d1w3 r'. . 1 : - · li.imetr,1lmentc oppo- ded1cargh una part1cola1e centrifuga e i relativi rotori.
r i non devono m.11 e,,erc ,.1m.1t1 lOn re ,ol10<.all in posizioni \ Q
. · t, devono ~,e . no 11 a>\C. uesto Jccorg1-
c,mcato ,olo p.1rz1.1lmente, 11u 1 . Ji,tnbu1to intor 3 .
·h . r·ico ,i.1 ,immetm.imcnte . mpi centnlugh11_nolto elevata, ma 3.4 Centrifugazione preparativa
\te, m mod o l e 11,.i fughe con l,l .
mento è import.inte non solo per le ultracentn. ad alta lJp.acità, nelle quali I roton vengono
13
anche per le centrifughc d.1 L "Jnlo, s1.1 .1 ba,\J ' 3.4.1 Centrifugazio11e differenziale
usualmente montati ,u ,osp,:n,10111 P ., · · 1un°1Je. te ·ancare I contenitori · soIo d opo aver
. li nll è unpart.in '-
s.1 . . I Le tecmche d1 frJ11onamt:nto ctllulare e \uhu!llulare sono metodiche fondamentali nella
Nell'uhllllo di roton .1 braù.l o a • . b' icmpitl con le soluLtom sono so a-
. d L Anche se i tu I r . . . ricerca biochimica. Sebbene la scpara1ione adeguata di molte strutture subcellulari possa es
vcrific.ito la corrett.i ch1usur.1 ei t.ipp . ·allanll vuoti, poiché sono parte mte-
·hc I contemton o,, . . sere ottenuta solamente mediante ultracentrifuga21one prep.irativa, le strutture cellulari d1
mente ùue, devono e,,ere mont.ill an_l d t re In alcuni rotori a bracci oscillanti, 1
b I •ian1ento e I ro o · . . grandi dimensioni, 1 nuclei delle cellule, 1 mitocondri, 1 cloroplasti o i grossi aggregati proteici
grJnte del \l\temJ genera1e d 1 1 ~n, b m re essere montati nella pos1z1one loro
\ ingoli contenitori ,ono num~rau_c do\re: er~ ~ ,!tnfugaziom con i rotori a bracci oscil-
possono essere isolati mediante centnfugazione convenzionale ad alta velocità e a bassa tem-
.w,egn.ita Per non perturbare I dclic.iu gr.1 ilienu, .• completamente stabilito, iniziando e peratura. La centnfug.immc ù1fterc:n11alc si basa sulla differente velocità di sed1mcntaz1one di
. . .· uando vuoto s1 e parucelle biologiche aventi dimensioni e densità diverse. Gli omogenau d1 tessuto contenenti
lanll vengono soht.imente .1ni.1te q d · e Questa pratica evita inoltre il
· .,. . 1 31 one e ece1eraz1on . , , QrS!}nu.11, vescicole d1 membrana e altri frammenti cellulari vengono separati in diverse fraz10-
tcrmmanùo a basse veloc1tJ u1 acce er I • li d . t b. d 1·
.. · · · d . · ali deformazione o a a rottura et u I e e 1- m, mediante centrifugazioni successive, a velocità progressivamente crescenti. Dopo la sed1-
vcrificar,1 d1 1mprovv1S1 sbilanuamenll ovuli a
mina qumd1 vibrazioni potenzi.1lmentedannose . . . . . mcntaz1one iniziale, mediante eentrifugaz.ione, delle particelle ptu grandi d1 un omogenato
I ,,. e l• buona prauca d1 laboratorio sono aspetti rilevanti m ogm (cmne I frammenti cellulari), i diversi aggregati e le strutture biologiche vengono separati m
G encr.i Imente, a Mcure....... ~
progetto J 1 ricerca, e la cons.ipcvolezza d1 essere esposti a sostanz~ pote~z1alm_ente ~~nn~se precipitato (pellet) e in fraz1om di surnatante, a seconda della velocità e della durata dei singo-
dovrebbe preoccupare tutti gh operatori. Se durante le procedure d1 centri~uga~1one s1 1mp1e- li passaggi di centrifugazione e della densità e delle dimensiom relative delle particelle. Per in-
g.1no composu pericolosi, matenah potenzialmente infettivi o sostanze rad1oa_tt1v~, occ~rre far crementa.re la quanutà di strutture di membrana e di aggregati proteici rilasciati m soluz1one,
riferimento a manuali d1 sicurezza aggiornati e alle norme adottate dal proprio d1p,1rt1mento. spesso 1 pellet c.ostitu1u da frammenti cellulari vengono ri-omogenatl e quindi centnfugau
Prim.i d1 eseguire spenment.1210111 unportanti, dovrebbero essere condotte centrifugazioni nuovamente. Questo procechmento, che viene ripetuto ptù volte, è particolarmente utile nel
di prou per evitare la perdita di campioni prez1os1 o d1 sostanze chimiche costose. Come in caso di strutture biologiche resistenti, come il tessuto muscolare o connettivo, o nel caso d1
tutte le altre procedure bioch1m1che,gh e\perimenll non dovrebbero mai essere condotti fret - piccole quantità di campioni di tessuto, per esempio materiale provemente da biopsie umane
tolosamente e gli operatori dovrebbero sempre indossare indumenti protettivi. I tubi da cen- o da colture primarie di cellule.
trifuga vanno maneggiati lentamente e con cura per non disturbare il precipitato, le bande La sedimentazione differenziale di una sospensione d1 particelle m un campo centrifugo è
contenenti le particelle separate o I gradienti instabili. Per quanto riguarda la scelta del tubo da mostrata schematicamente nella figura 3.4a. Inizialmente, tutte le particelle dell'omogcnato
ccntrifug.i più adatto per una particolare applicazione, è buona norma seguire le istruzioni sono distribuite uniformemente nel tubo da centrifuga; m seguito, durante la centrifugazio-
fornite g~neralmente d.u costruttori dei rotori. Per ragioni di sicurezza, e per garantire la riu- ne, si muovono verso il fondo del tubo, ciascuna secondo la propna velocità d1 l>CdimentJLJo-
scita dell e_spenmcnto, è importante assicurarsi che I singoli tubi da centrifuga siano chimica- ne. Le particelle di dimensioni maggiori formano un pellet sul fondo del tubo, mentre le par-
mente resistenti a1 solventi 1mp1ega11, che abbiano la giusta capacità per il caricamento del ticelle più piccole nmangono nel sumatante.' Tuttavia, durante questo passaggio ini11.1le di
campione, che po~no essere util~u nel tipo di rotore scelto e che siano in grado di soppor· centrifugazione, rimangono intrappolate nel pellet, contammandolo, anche panicelle di d1-
mens1oni minori. Al termme di ciascun passaggio d1 centnfugaz1one differenziale, il pellct e le
tare la forza centrifuga massima . e I intervallo di temper at ura deUa spec1'fi1ca centn'fu ga. Jn u n
rotore ad angolo fisso, grandi _forze centrifughe tendon o a causare a d e f,ormaz,one . d e1· tub1, fra1ioni di surnatante vengono separati con cura. Per diminuire il rbch10 di contamina11oni
. . I
che devono qu_ mdi essere scelti con pareli spesse· ne1 t _çrociate, solitamente i pellet vengono lavati diverse volte mediante nsospcns1one m tampone
,
meno \oggetti a lia d e1orma21one, in genere si utili b. .
d
• ro on a angolo mobile invece, essen
.
. .
' .
d
°
·1· l: ncentrifugaz1one nelle stesse cond111oni. Tuttavia, questi ripetuti pas\aggi d1 lavaggio po~,o-
zzano tu I tn pohallomero con pareti sotu 1.
 81lX HIMII \ F BIOLl lt.l \ MULI l.UI.ARE

l l"- I RIFl (,ALlll"'E

l lb Il"'

una preparazione eterogenea d I b

re, . d "d mem rane m,-.r~nualt, \lene ~tra11fkata ,ull.1.>omm1tà J.i
centnfugaz,one
d m~ un grad 1ente t ens1ta lìquid0 ' • ·
Te . d. . preiormato. fa1ste un ampia \ce.li.i d1 materiali per la tonna
◄ Solvente
Z.Jone d.e.i gra
. 1ent1 a seconda d ll ·r. 1· ·
e a spect ica app 1ca11one b1olog1c-a. Il cloruro d, .:es10 t l.uga
o
"'
'È
••• • ◄ Particelle di piccole dimensioni
mente impiegai~ pe~ la separazione di DNA m bande d1\crete e per 1"1\olamentu d1 pla,m1d1,
proteine
. nucleari
. ev1rus.JlbrQmuro e Io 10d uro d.I sod.10 ,engono u11hz.z.i11, n,petllum..-ntc-,
e •••• ◄ Particelle d1 medie dimensioni per~ fraztona~ento delle lipoproteine e per la separazione delle molecole d1 D~A o R:-:A. I>i -
•u 0 ~
oc. •• ◄ Particelle d1 grandi dimensioni
vers~ produttori offrono un'ampia gamma d1 materiali (come Pc-r1..oll, F11..oll, de,trano, Metn
zamtde e Nycodenz) yer la formazione di gradientt per la separaLione di cellule complete ed,
.,E
u stru~ture subcell~lan. li saccarosio a elevato grado dì purezza (pm,o d1 DN:\~1. RNA,1 e pr,1-
teas1) è un materiale adatto, e ampiamente u1thzzato, per la preparazione dì gradienti ,tahili
per separare vescicole dimemhrana derivate da omogcnau di te~ull.
lb) Qualora si desideri separare, durante un unico pa:.saggio d1 centnfug.iz1one, tutti I t1p1 d1
Tempo di centnfugaz1~
membran a compresi in un determinato mterv.illo di dem11.ì, la demuà ma,s1ma del grad1cntt'
deve essere superiore a quella delle vescicole più dense. A tale ~copo ,engono ut1hu,1t1 ,1a gra
oe, dienll discontinui sia gr,1d1en11 a den~1tJ contmu.i. Quando non sono dispomb1h formatori d1
◄ Particelle d1piccole dimensioni
'E
e
Campione
••••• ◄ 0 a bassa densità gradiente automatici, come accade spesso nei laboratori did.1111.:1 de~tmall agli studentt, un
•u Gradiente
◄ Particelle d1 medie d1mens1on1 gradiente discontinuo può venir versato manualmente, utilizzando m modo piuno~to ,em-
o a densità intermedia plice e raptdo una pipetta.Al contrario, la formazione d1 un gradiente .:ontinuo stabile e mol -
8.
..
E
u }
d1 dens,ta
◄ Particella d1 gn1nd1 dimensioni
o ad alta densita
to p iù difficile e richiede la disponibiht.ì d1 un formatore di gradiente. Dopo e,,ere ~t3tt \ er,a-
ti, 1gradienti vengono raffreddati in camera fredd,1 e trasportJti, utiliu.ando appo~ui ,uppt1rt1
per evitare il mescolamento dei diversi stralt. Durante la ~parazione delle parttcdle ~uhct·llu -
fi r.o '-" SchmLl del comportamtnto dtUe part1ctllt durantt la sqmanone d1fferenz1ale e i>opicmca. lari in base alla velocità di sedimentazione, la frJ.ZJone de!>iderat..1 non raggiunge ù proprio
D~antt 1a ~mcnllllonc d1fferenZJalt dJ una sospensione d1 paruccUc ~ un c~po _centrifugo {a), 11 mo~ punto isopicnico all'i1U!:m0.dtlgradiente. Durame le -..:par.u1om l:,t1p11..m1..h<", 1me..e, l,1 ...~n -
vtmento delle putJCeUc dipende cl.olla loro dtnsnl. forma e d1mcns1onc. Ndla scparv1one d1 paniceUe b10• trifugazione viene protratta finché le particelle non raggiungono 11 punto nel grad1t·nte a h,d
togkht ,n gradiente dt dcns1U (b1, 1camp,oru vmgono strauficau rnn cu~ su.Ila '>Omm1ta d1 un grad1entt
d, dttuit.a preformato prima della ctntnfug.wone. N'dla separazione 1>0picmca,),t <tn1nfug~1one \ ime lo del quale l,1 loro spinta idrodinamica è uguale alla demit.ì del gr.idiente.
protratta finthe le part1ctllc de)1dera1e non abbwio raggiunto la loro posizione 1sop1cm.;.o ':11'mterno del
gr~d,mte Al contrario, durante Li sqiuuiooe basal.l sul];a \>tlo.:n~ d1 std1menta11one, la fru1one che dn't
~re punfical.l non raggiunge 11 ~uo punto oop1cruco duranle b ccntnfug,mone. 3.4.3 Applicazioni pratiche della ce11tnf11gazio11t prepam ti va
Per illustrare le applicazioni pratiche della ,entnfuga11onl' d1ft..-renzi.ile, Jdl'ultr.i,entnfu
gaz1one in gradiente di densll.ì e della tecmc.i rer Jflìnit.ì, ,errà de,... ntto l'isol.imento ddl.1
no ndurre in modo wnsid«evole la r~ finale del pellet e sono, quindi, d a evitare q uando SJ. frazione m1Crosomiale d.i omogenau dt mu,colo e la \Ulce"1,a ,,:p.1raz10ne d1 ,c:s,;1«1le J,
util1z.z.i una quanllta lim11a1a d, materiale di partenza. Lt frazioni dt surnJtante ottenute ven· membrana aventi demi1,1 differenti (E 1g. :\. 5 ), l'i\olamento d1 ,e,1..1<.ole d1 -..ircokmma a dc,a
gono ccntnfug.1te ad alta ~e1oc1u, per periodi d1 tempo prolungati, per separare le particelle 10 grado d1purezza (Fig. 3.6) e ù rnbtra11onam.:nto dei '"ll·mi d1 memhrane rmt.\ConJri,,h d,
d1 pja:oÙ: dunemiom d.l qudledimcdiedimcn.ioru. !lldl'•mb1to della punficazìone degli or· fegato (hg. 3.7).
ganuh e delle vesacole di membmu, le tecnkhe d1 centnfugnione differenziale posrono es· Ncll.i figura 3.5a ,ono mmtrate m modo , ...hcmJlll\\ le fibr,: d1 mul><:ok\ -..::hcl.tn,o, ~trut
~re utilu1..1te per 1wl.1re COffi'.CIIJClllcnente m1•~-ndr·1,. m· · tu re .iltamentc spec1alinate ,o,muhc nella ,ontra,1one, l. i rda11, 1~,sum1 d1 memhrana, ,hc
__, ~ Krosom1 mtatll,
m.mtcngono I alcoppi.imento tra e,,11.i211\ne e l0ntrilZH>ne mu,,._oJan•, la regolazione: Jcl me
J.4.2 Cnrtrìfugazione in gradit ntt d1 dtm1ta t.iboli\mo energc11,o e I.i ,tah1haa11one della r<"g1one \Up1•rlì, 1alc della ,dlul,1 La membrana
wperfidale i' formata dJI ,,u,okmma e dalle ,ue m,.1g1naz11,m, che 1..ost1ttmcono 11 st~tcma dt
1..i tecnica p1u wtta per nugliorMr ultcn ,. h membrane 1.te, tubuli tr,1s,eN. <,1 pl•ssono J1,t111guerl' Jm· t1pl>log1l' d1 tubuli trilS\er I qudh
inaiu duncn 1oru mmh m.i drnSìU divn rmmtt u scpar.u1one da partKdle b1olog1c e ~,tu.ili ndla reg10nc non g1un11on.1l,:, e qudh s1tuat1 nc:ll.1 reg111ne delle trm<l1 che lormano le
preformato o autofumuntnL Pouono ie. e1ultracmtnfuganonc 1n s1;ul1ente e.ii deruitl zone di ..on tatto c:on le , 1\terne tc:rmmah Jel re11colo .sar,opl.1~11111t1u) I.a ,frpolanzuZJone dd
qtà dt sed1ment;wonc ddJe ,....~..n- ~ , uuhzut, Sta mrtod1 basati sulla d,ft\: rcnt.c n:lo ~uuilrmntJ, indott.i d.al m1,toncuronc, tran\tlJ .utr.iH r"' 1 tuhuh tras,cr I e at11H un com
r-........,;,Ulmctodj ali Nn,,la._
Nella figura J ◄b \ICilt mostrata u ~ ~ • o plesso rei cth>r e , ollaggto 1,cns1b1lr ,he pro,11CJ 11nmcJ1at.m1en1e I 11pc1 t ut • t rans1toru1 d1 un
di.inie ultra«ntnfuga,wne Pttpant,n U oc d, put1cdle, uvcnt, deOSJtl crcsccnll, me '--anale gnmzion.ile (Jun,110,utl rha1111tl) per 11 ul.iscw del calcio
tni5ccu cl.a ~nicdle come qurlJ.a co uru,ta da
 l!IOf Hl \UC ~ I 810! LIGl,HU 11..UOIJ.AI
e rNTJUFUGAZIOS
119
116
li .'>tstema d1 membrane eh. r,
e orn1\ce la n,erva lummale degli 10m lJkm, the regolano la
(al wntra11one, e r,tpprc,entato dal d
rct1w Io en opla,mattco ,pcc 1ah1✓ ato. (Jue,to torma dei n
vestimenti membr,mo,1attorno ti·
I . a app.irato contrattile, 1 cui tubuli longnudmalt \ono wm-
,o 11 soprattutto nel nassorb1men10 degli 10m c,1k10 durJnte la fa,e di nlas,Jmento dc:I mu
scolo, mentre le Cl\terne term ma I1 ,ormano
' Ie ,trutture che comcntono 1I nla~no rapido dc:!
calcio che da m1110 alla contraz ione, mu,co Iare. I m1tocondrt, che ,ono le reg1om dove a,,..
iene
la fosforilazione o,s1dattva po .,
, ss1euono un comple~o Sl\tema d1 mcmbr.rne, una interna e
un,1 esterna, coinvolto nel metabolismo energetico.
Per una omogeneinazione ottimale dc, camp1om d1 te,,uto, e richiesta la pre~en,a d1 un si-
stema tampone che, oltre a mantenere 11 corretto pH, form,la un',1deguata forza 1onK,1, colat-
Tubulo I
,,..verso I ton stab,huant1e agenti chelant1. Per m1mm1LLare la degradaL1onc proteohttCa sono nnes,a
non g,unz1on1I• Tnade n un rapporto ottimale tra peso umido del tessuto e volume del tampone, una temperatur,1
Fibra di muscolo scheletrico adeguata (solitamente 4 °C) e l'aggiunta al campione d1 una miscela d11mbiton delle proteasi.
~ M,tocondn
Prima degli anm Settanta, raramente I tampom per omogenei11az1one contcne,ano 1111b1
ton delle proteasi e agenti chelant1; etò determinava la degrad.wone di molte proteme a ele,a-
to peso molecolare. Da quando nei protocolli di frazionamento ,ublellulare sono state mtro •
dotte misure protettive, per prevenire l'azione degradativa degh enzimi endogem, e \lato pos
lbl

Tessuto muscolare
Omogeneizzazione 0mogenato d1 tessuto

~
J Omogeneizzaz,one
sibile isolare proteme d1 grandi dimeimom mtatte, come la d1strofina (427 kDa ), 11 recettore
per la nanodina ( 565 kDa), la nebulina (800 kDa) e il polipeptide pm lungo finora con0'>ltUto
chiamato tttma (2200 kDa).

CJ
1om,na10000 11 Le miscele d1 m1b11on delle proteasi dl\pomb1h m commeruo, po,siedono solitamente
un'ampia specifietta, essendo m grado d1 mib1re le proteasi uste1111che, sermiche, le asp,trtato
/ Nucle,' frammenti cellulari
Surn1tante proteasi, le metallo proteasi e le ammmopep11das1. Vengono usate a concentrazioni mKrn•
molari e sono piu efficaci quando vengono aggiunte a, mtemi tampone appena pnma del
1om,n110000~
processo di omogene1uaz1one del tes5uto. A seconda dell'emivita dei smgoli imbitori ddle

Apparato contre!,le ~ proteasi, della durata del protocollo d1 fra1ionamento subcellulart· e della quantltJ di en11m1
_-,-_7 _ Su~rnatante
Centrifugazione
differenziale
endogeni presenti nelle singole frazioni, e frequentemente netes,,uio aggmngere aliquote
fresche d 1imbuon delle proteasi alle sospensioni tmutah.
- r """'i'io mina 20000 11
Sono moltre d1,pomb1h ku d1 mib1ton delle proteasi per la formul,wone d1 miscele pcNi-
nahzzate; questi kit possono contenere ,o.,tanze diverse, come: inibitore della trip,ma, I 6-1,
lft>,. M,tocondn
~ Surnatante amminoetilbenzensulfoml fluoruro, ant1pa111a, aprotmma, benzam1dma, bestatina, lh1mo,ta-
tina, acido c-amminocapronico, N-etilmale1m1dc, leupeptina, fo,for,1midon e pepstatma I
60,,m,nalOO~ chelanll degli ioni d1valen11 piu comunemente usati per imb1re gh cn11m1 degradanti, tome le
metalloproteasi, ,ono l'EDTA-aetdo et1lendiammmotetratet1<0 -e l'l::GTA- aodo etikngh-

- col-b1s (2 amminoculetere)tetracetiLo.
C,tosol
Gradiente d, dens,11 d1 saccaros,o - - M,crosom,
110-60%1
Membrane superf,c,ah 3.4.4 Fmzionamento subcellulare
Tllad, Centrifugazione

' Frazione leggera del rellcolo sarcoplasmat1co

Frazione pesante del ret colo sarcoplasmatico
in gradiente
Nella figura 3 5b è presentato schemJtllamcnte un protowllo per 11 lra11onamentu ~uh
cellul,ue. A setonda della quantlt,1 d1 m,1tcnalc <l1 partema (,hc nel l,1,0 delle prcpar.1Lw111 d1
Frarnmenti mu~colo ~chcletrico e solitamente umtpre,a tra I e 500 g), per ogm ~mgolo pa"agg10 <ldlJ
procedura di isolJmento ,engono \,clii un partKolare tt~o d1 rotort• e un tubo d,1 st'ntnfuga
hgura \.~ S.:hemJ della 'Kpòlrmont dell'omogamo di m IO che po,sit'dano Il' dimens10111 Jd,1tte. I e Cl'lltnfugalllllll ,u,le""e, a ,elo,1tà progrosl\,1
'
l:m In (a I , ,me m~trato 11Sl!IC'IIJ.1 di manb d U f, l&o schdetrtlO m dtfler~ntl fra11om sublellu· mente piu ekv,1te t' per tempi p1u lunghi, detcrrrnnano la ~ep.u,111one ùell'om<>gcnato d1
pro!Cl«>llo dt fra11onamm10 di qunte mnnb~:nnc e e ,bre di muscolo scheletrito; m (b) e presentato il
dellht'Otnfugòllloncd1ff,·ren11akequtl~mgr~t~~~:n~ir omogenat1 dt te,\uto, u,ando la teln1Q mu\c.olo in frMioni d1\tmte. I par,111wtr1 ,pt·nmcnt.1h u1th11at1 pm lrequcnt~mcnte rcr I d1
 BIOClf(MI AI 81O1.()(,IA Mnu.r01.ui
C "TRI IClN

g, per far preopitare i nuclei e 1 121

120 1000
IO 11unu11 a l'apparato wntrattile: 20 minu lai
ne sono 1p11arc , • M,acela d, &are ,Es1ratto d, membrane superf,c ah
ssa""' d1 ,cn1ritugJ110 10 oOO g. per far prcL In n11tocondn; un ora a 100 000 g
,<1s1 p.i = 1111 a 1cchttJ li '
0
omma. tubulo tras,ors, e ret,colo nrcoplasma11co

~,·
trin1111cnt1 lellulan; 10 m1n ,tare una franonc arr he Per nmuo~cn· da e. prcpar.iz1on1 d1
ti J ~o 000 1/, per IJT prc<tp
• on1 m,,ro\O
m1ah e cito,ohl
S50no c~,c
•re uuhnatt lavaggi con ,olu11on1 a
bf . . .
€9 .,,
a " l'JrJr< k fra/I na re, 1Jue, po ltenormcnte le rn raz1on1 m1cro~ ~ ij I
rmemhr,ma le moIc,nle di m10,1 I Quindi. per ,e
parare u f
11haata la lentn uga11one in gr1
. + loct,na WGA punftc1t:-
ne sa 1na \ ene u •
nwdcr,11,1 con,entr,iLtO t,rJnC musw1an, 1

mi.1h JcmJIC Ja'

(1lfacntl mcm ·r
Il I l' unJ foru lCntn ug,1 \uffìc1ente
2m,na15000~

J1cntc: J1,Jlc,H 0,10 I• 0 uno a brJ•l I o,d Jn i./J Jella nu·mhr,ma ,upcdiciale I• Vesc,cole d, ~
G I
/ _
l sNf
I
,re \cr11,a " , ·onc grez •• sarcolemma <SU
t 1,.1ndn un 101< ere ,ci•JrJtC lJ 1rd11
1
J Jdk Lt,tcrnc 1crm111al1. I e bande agglut,na1e • • , f
mente e1c,J •
IJ po>'ono e"
d tuhuh Jong1tu n
di Jh e k ,c,dlll1e 11
d nem irJn
c,,cre !CLU
pcratc 11 muovcndolc manualmtntc i+ O 01% TrtlOn X 100
tr1J i, i I li• J1\tr,e frJ11oni po\,011 O cli i In ,ilterna11v,1, nel ca,o c.11 grad1enr1 Vasc,cole d; aarcolemma <SL) ~ - ... ,
lorn,pom enti J • rte ,upa1orc mcJ1Jntc unJ P1P r• le H'\Ulolc l II mcmM,lll,I , po\\ono agglutinate• solub11tn1 te ~-- 1
con cautdJ J ,i Il,i PJ Il0 11,mc trJ 1O <'1 I , _., ✓
ibih O J 1 bande ml, , tt•nuto ao111ungendo un 1qu1c.lo a dcn.,.
rdJt 1vJrncntc ,n,I · ,r,o I J1111 o , "''
, nicJiJntè ,p1JaJrncnh1'" , 1 do Jd tuho JJ lCntnfug,1 med1.inte un 2m1n11~
c,,crc nmo\\t ,iltC' ud1 11n
• oppure pn,,onu r:,,ert rac• tuho d.1 centrifuga viene forato e le fra-
1.1 m.i~i1lr"
.,1itor<'Jutom,111cod1 lrJm,m
In que-to LJ,o 11
t,'o rer rauogherc le lraL10111 m gradienti
Vnclcole d, SL agglulln1te I, ,!
rJe, 0 ,,
/Ioni ,cn11ono rJlltilk prr gr.1
, , itJ lfn altro mc l u
, fu,..
.
Jono J\Crlo congelato. Que~te ultime
++02MNAG S #
3
" I tubli uJ Len1n " • Ve1C1COle d SL d•agglullnate
,n,tJhih con,l\tc nd ,wonarC' i . Jd tulxi da centrifuga, sono comunemente
due tcc111Lhe, lhe ,omport.1no lJ d,,truzwnc
~ • 1 5 0 0 0 0 (1
u,.itc nei IJborJ!llfl di mma om di \~cicole di membrane, un fenomeno me-
I
1.1 u1ntJmin,111onc lflKIJtJ Jdlc P''r<> m L ·cllularc ~ dovuto all'impossibilità di con-
Surnatante S.rcolemma molto amcch,to
I J J 1fraz1on.1mento ,ulJ\. •
, 1tJb1lc durante a proce ur.i d Jl\er i tipi di ,truttura che si possono ongmare dal-
. J ' Jlamentc la form.lllonc Cl ) • •
troli,m J egu , onedd t~suto. Pomoni d1 membrana, ongmariamen- lbl
)J mcmhrJnJ durJntc I oml1grnc1a.1z1 I 1· . Proteine totalt marker per SL marker per la frazione non SL
. I I ne )ubcdlulare, possono formare una mo tep 1c1ta di
te dcm anll dJIIJ ,tc,\J o,a ,uuio .
. - -1·ole con orientamento corretto (ngltt-s1de-011t), vesocole
. . ~ 600
,trutture dr 1krcnll, coinprt,c h,l e . .

◄ ◄
o 400 i-
fOW\llJIC ( 11151</ t'•(lll Il, o, 1ruttur•, o•igillate• vesocole aperte (/eaky). e/o ~trat1 d1 membrane. ic:::::!
• • , ?
Inoltre, le W)mole piu pillole' po~ono essere intrappolate in vescicole ptu gr~nd1. D1fferent1 ii
~
.. - ◄ ◄
,istcm• di membrane ptis,ono aggregare m modo non specifico, legare oppure mtrappolare al !
100
loro interno qu.111111.1 devJte d1 proteine solub1h. 01 con~eguenza, qualora sia necessario otte- o

-
~
nere prcpJr.1110111 di membrane a de,·ato grado d1 purezza, per studi ptu sofisticati di biologia o
E
o b111Lh1m1LJ cellulJre, è nccmano ricorrere alla punficaztone per affinità.
li d1agrammJ d1 flus,o e lo ,chcma dell'unmunoblottmg, mostrati nella figura 3.6, 1Umtra· ..
o
o.
30
-

-
no I p11nL1p1 prcpJrJllvi e analitici d1 questo approccio b1och1m1co. Le moderne tecniche pre· 2 3 2 3 2 3
pJrJll\e d1 affimtJ, che uuhzzano passaggi d1 centnfugaz1one, possono essere eseguite usando GeVblot cors,a 1 Estratto d, membrane superficiali
\ari hgJnd1 ,him1C1 o biologici Nel caso della purificazione per immunoaffinità, vengono Gel/blot corsia 2. Frazione non legata alla lecuna
usati ,mt1corp1 per legare m modo specifico 1rispett1VJ ant1gem. Gel/blot corsia 3 Sarcolemma allamente purificato

3.4.5 Purifìcazio11e per affi111ta di vescicole di membrana figura 3.6 5cpauLione per affimtJ mediante cen1r1fugaz1one d1 ve)cacole d1 membrana d1 m~olo -.chele
tnco aggluunato con una le,una. ln (al e prc~entata la \Cquenu dei pa\s.1gg1 preparat,~1per la punfi,.,Zto
ne delle ,escJCoie d1 sarcolemma a elevato grado d1 pureua (SL); m (h) viene mo,trata ,~hcma11c.1mentc
Nella figura 3.6a viene mostrato un met0do moto I diffuso
• di ,1gglutmaLtonc mediante In· l'anahs1 per 1mmunoblotting Je1 campioni ottenuti ,on questa procedura d1 fra11onamento. li nfenmenlo
11m, proteine frequentemente d1 ongme ve tal h • t per SL è la dl\trofina a\\ocaata alla superficae (427 kDa), mentre 11 ntenmento per le tra.11om non '>L t la ,u
ture ch1m1Che formate da e b d li ge e e e SI legano fortemente a specifiche stru · bumtJ a ,_ del rece!lorr della d11drop1ridina (170 kDa).
ar 01 rati mo11vo il al · ole NAC,, N-aceulglucosammina; WGA, aggluumna da germe d1 grano; SN, \Urnatantc
d1 sarcolemma s, utilizza la lcct · tfi per qu e per la purificazione delle vescic
ina pur cata da germe di grano (WGA, Wheat Germ Aggluti·
 J!Cl< lii~ I ~ I i lllOGIA MOl.tUll.ARI
0!>."TIUFUGA7101S[
122 12}
., r parte <lei u~1 1I pia
ne neIlJ mae,o010 (al
ll'omogencJZJJIIO ' he ncrcio espongono 1 C,tosol
11111) u111,1,tc nd tatto lhl", in ~<'~u,to a mt nlll lorretto,' r . Membrana
k lon oricnIJ spes,o rowsc1.1te e, esterna
,111.llcmma d1 mu\Colo torma ,e\ltlO b h trJ\\cr,1 sonO
l,trbo1Jra11. Al contrario, le ,c,ltcoI·e JemJtc dai IU 1u,1ne dcnvJnll . · dJ )l'ibbondante
• .
ret1eolo
qu111J1, non c,pongono I loro lJr 01 rJb d II lcglllOP"' t
lx d 1II mono,l1u1e J qucs d , 1opirt1LOlarcge
'
MAO
,.1rcoplasm.i1tco non rnn1cngono rcg10111 di ,ar li 1' • , 100 agglutinJtc dall.i lcctma da
ncrl· d1 lectma Qu111d1, ,olo le ,e.-..:1coIe dI \Jrs11km111Jb'cngt ·
trJ\\Cf)I mediante lCnt n fugaz10
arJl<l d.i1 Ili liI1
germe d, gr.ino, e l'aggrcg,110 pllO es~re ~p
ne per 2 m111u11 a I5 000 q b e ,llperfiuah Jgglutinate rivela Membrana
delle mcm r.1n
1·os\cn·a11one al mllro,cop10 eIe11ronico clc11rondcme Per nrnuo interna
I d I ma h,cc lOll 111•1u,1 0111
J,1 prcsrn,a d1 grandi vc,uco e 1 \.!reo cm dJI rdtlolo s.1rcopla,malllO, le vescicole Mat11ce m,tocondriale
vere quesll contJmmanll ve,ucolari, che demJno on 10111,o Tnton X I00 a bas
te con 11 detergcn Ie 11
superfìc1alt 1mmob1l1na1e ,engono lrJIIJ J, solubiliuare le protemc integrali <li
,a conce111raz1one. Qlll"Sta procedura non è in gr,,dO . d1•arcolemma che permetto- tbl
1
mcm b rJna, ma cau,a IJ 1,orma11one dI aperture nelle \C)lllO d de ' 001 molto inferiori Le
no il nlasc10 delle \CScirnlc del rettcolo \Jr~opla,malllO, 1 ,men>I . d ·
,esC1cole dt sarcolemma .igglllltnalc ,engono qumd1 '
cpar.1te dai contammant1 me tante
d Il
scntnfugaz1one a ba,so numao d1 g. Per nmuo,cre la I·es 11111' a e vc~c1co e pun11ca e, 1
camp1one viene incubato lOn lo 7UlChero N-alell IgIUlos.:immma •che compete con le ghco-
protemc d1 superficie per 11 legame con IJ IecllnJ stc~\J. Le vescicole d1 ~arcolemma
I " t ·1

. a elevato
.
M1tocond11
intatti R1gonf1amento Miseela d,
contrazione
sonicaz1one
r ~
vescicole

o~
~ po
.,., ij
Gradiente d, densità d1 saccarosio (30-70%1

~
IW!!!IOi
Membrane esterne
Regioni d1 contatto
Membrane interne
gr,1do di purena vengono raccolte come pellet mediante un passaggio finale d1 ccntnfuga-
z1011e per 20 mmu11 a 150 000 g .
Un metodo .1nalt11Co, prallco e veloce, per venfi....-ire la numta d1 questa procedura dt fra-
11onamcnto subcellulare, è 1'11nmunoblott1ng con un d1spos1t1vo per mini-elettroforesi. La fi- (cl
gura 3.6b mos1ra uno slhema delle bande protetChe 1otah e di queUe riconosciute come anlt- MAO GT SDH
gcne specifico, rnrmpondrnte a membrane d1 superficie prima della punfica21one, della fra-
11one lhe non si lega alla led ma e della frazione ah.tmcnte punfìcata di s.ircolemrna. La sepa-
ra11one d1 entrambi I t1pi di membrana può e~rc monitorata ulllizzando anticorpi contro 1
manaton det tubuh trawcrs1 e del sarcolemma, come la subumtà a ,s del recettore della dii-
70

60 • • .... •.... ..
..
...•·..
.. 1O

08 ..-
UD
- e
ci 2
dropmdma (170 kDa ), per i tubuli trasversi, e la d1s1rofina (427 kDa), per il sarcolemma. ..
o 50
oe i~
o
~-=
Quc~to metodo anahlllo è particolarmente uttle per la carallenzzaz1one delle vescicole d1
membrana, quando non sono d1spo01bili si~tem1 sempho e veloci per dosare l'attività degli
cn,imi d1 nfenmento.
:.u
.,e,
<J)

~
40
• D
o,!!a.
- .
>-
;;e
D_urante la separa11one delle membrane mitosondnah, la d1stnbuzione all'interno dei 30 02"=
grad1cnt1
. dt dens1IJ della membrana mterna• delle zone d,· contatto edeIl a mem brana ester-
nJ viene dctermmata an,1ltnando la d1m1bu11one delle allivit,.. en11ma · t 1che, pmttosto che
20 o
,. .
I 1mmunoblot1mg. I dosaggi d1 legame o enz1mat1c1 rappresent ..--
. ano I metodo p,u tra <l.mona-
I
Ic per cJrattennare le d1vase
·h
fra11om subcellulari dopo la ce11 I f
.
· Il
n ugaz1onc. Ne a figura 3.7a
2 • 6 8 10 12
FraZ1on1 del grod,ente
14 16 18 20

sono se em.it121.it1 1 m1lfocomparumentt dei m11ocond d 11 • li 1 -

,
d1 menmento 1oro assoltall. ~1entre la monoammmossidast n e c ce u e epatiche e gh enz11111
(MAO
nella membrana e,terna, l'enzima succmato deidro, SD ) multa p1u concentrata I 1gura 3.7 S<;hemJ della scp,1r,111one delle membrane derivate d,1 m1toumdn d1 kgJlo Son,, prc5'tn1Jlt:
mnnbrane interne; la glut,llione tramferas, (GT) genaSi (, H) e associato al ~•~terna dt (al la d1stnbu11one degli cn11m1 d1 nfenmento nei m1crocomput1ment1 dei mll,><ondn delle cellule tpJ
, Imvele, t1Che (MAO, mon0Jmmmo\,1da\l; SDH, ,uc,mato de1drogcn,1,i; GT, glutJtt0nc tran,kr,1>1); (b il meto
rcg10111 d1 cont,1110 tra le due membrane L~ d e un enzima d t men ' . mento d eIle
do per I\Olare le fra11um altJmente arne<h1tc delle crc,tc della membrJnJ mttrn.1 , Jtlle zone d1 contatto e
· , ,e~c1co e I membrJ
a pJrllrc da mil<Kondri 1111att1 mediJnte mh na possono CS\ere prodotte della membrana m1tocondn,1le e,ternJ; (e) l.1 dl\tnbu11011e delle mcmbr,1nc m11oumdr1,1li dopo ,entrifu
' con,ecut1v1 dt ngonfì gatione 111 grad1en1e d1 den,1IJ.
,0111cJ11one degli organuli m ~ospemione la d" iamento, contr,11ione e
. nmceI.i ' vescicole .
d1antc centnfug.111one su gradiente di saccd viene quindi scp.ir,1ta, mc-
ro>1o, m tre t1pol · - .
og,e pr111c1palt dt membrane
 R!O<.lllMll.AI RllllOGI\\IOLfl lllARt

124 ff1•.,K1Fl t.AllllNt

125

3.5 Centrifugazione analitica

~
~ 8,ferimento
Vista
dall'alto 3.5.1 Applicazioni del1'11ltmce,1trif11gazione analitica

¾
R,1,colo
d•d,ffrazoone
1oro,dale Campione Poiché le macromolecole
. b10Iog1c
· he mostrano un moto termico ca~uale, 11 campo gra\ 1ta-
t
zwnale terreS re non influenza significativamente la loro di,tribulione rel.it1va in un ambien-
)
Rivelatore della te acquoso. Le biomolecole in solulione sedimentano in modo sigmfìca11vo ~olo quando¾>-
, / /i <:> luce ,nc,dente no sottoposte ad _accelerazioni molto elevate, come in un campo ultracentnfugo. Una upica
I ,, I /
ultr~centnfus:1 èmgrado di generare nella sua cella anaht1ca un campo di 250 000 g. Per wn
II I
I/ 1
I
,
I
,,{/
sent_ire una mi_sura accurata della distribuzione della concentral1one delle particelle, la cella
del! ultracentrifuga è progettata m modo da permettere il passaggio di un fascio di luce, attra-
/ , / . R,flenore
,IJ ~,,, verso le particelle biologiche, mentre 1I campione è sottoposto a un campo gra\'Jtaz1onale
I I I estremamente elevato. Lo schema della figura 3.8 mostra il sistema ottico di una moderna ul-
I/ '' tracentrifuga anaht1ca. la cfupombihtà di lampade allo xeno a elevata mtensll.ì e 11 m1ghora-
I I I
'' mento della sensibilità degh strumenti e dell'intervallo di lunghezze d'onda u111izzab1le, ha re-
,// : Applnllo contenente

/'' ' la cella del ,,...,1--=-.,11 so possibile l'analisi accurata d1 campioni proteici molto dilu1t1 a lunghezze d'onda inferion a
,// campione. nfenmento 230.nm. Le ultracentrifughe analitiche, come la Beckrnan Optima XL-A, consentono d1 utiliz-

,~/ :-~-,
'"
Rotore zare lunghezze d'onda comprese tra 190 e 800 nm.
La sed1mentaz1one di proteine o acidi nude1c1 isolati può essere utile per determinare la
t'
'Il I r;-;-;, massa molecolare relativa, la purezza e la forma d1 queste b1omolecole. L'ultracentnfugaz1one
' l1.!J; S1stem1 d1 acqu,s,z,one
i 1
I
111
\.V I
radiale di 1mma91ni
analiuca per determinare la massa molecolare relativa d1 una macromolecola può essere ese-
guita sulla base della velocit.! d1 ~edimentaz1one oppure dell'equilibno d1,c<l.imcnt.w one.le
,__-o+-<>-
1
T __ 1 Fmura 12 nml proprietà idrodinamiche delle macromolecole sono definite dai loro coefficienti di sed1men-

'~"""
J
1azione, e possono essere determinate misurando la velocità con la quale 11 fronte d1 concen-
trazione delle singole biomolecole si muove nel campo gravitazionale. Questi studi del com-
lampada portamento in soluzione delle macromolecole possono fornire informazioni dettagliate sulJe
allo xeno proprietà di aggregati di grandi dimensioni e, quindi, confermare 1risultati ottenu!I mediante
analisi biochimiche sulla formazione d1 questi complessi. U coefficiente d1 sed1menta21one
può essere ullh.zzato per descrivere vmaz10111 delle dimensioni e della forma delle macromo-
lecole, al variare delle condizioni sperimentali. Ciò permette un'analisi biofisi,a dettagliata
Figura 3.11 XMma dd ,1s1mi.1 omeo di wu ul1ncm1nfu I degli effetti di variaziom di pH, temperatura o cofattori sulla forma delle molecole.
delruhracen1nfuga ~dunan OptJma XL-A mo I u ga ana ll!Ca. La lampada allo xeno ad alta intensità
d'onda nel! mtcrvallocomprt>Otra l90e800,nm i_,~1 in qbt•
figura, con1ente l'ut1lizzo di lungheue L'ultracentnfugaz1one analitica viene spesso utilizut,1 per:
(P.-r gentile con.:rs,ionedeUa Bedman-Coulttr.) "mo 1
ltt' t•
J"as.orbanu ~rmelle d, anahuare campioni pr~t,i · a 10 d del mlema ottico utilizzato per misurare
Ultl a lungheue d"onda inferiori a 230 nm. • determinare ti grado di purezza di una macromolecola;
• determinare la massa molecolare relativa di soluti nel loro stato nauvo;
• esammare 1cambiamenti della massa molecolare relativa d1 complessi so,nmolelolari;
mllocondnali lf1g. 3.7b). La distribuzione Il
riferimento indica che la membrana ~t• ne e vane frazioni delle attività degli enzimi d1 • studiare I cambiamenti conformaz1onah;
• ,rna po~s1ede una d b
interna. Le zone d1 contatto, contenenti GI , ensu.i p1u assa rispetto a quella • determinare le costanti di affinit.l tra hga.nd1 e proteine (par. 16.4 I).
. 1I· interna e quella ~terna che conti• •I ,ormano una banda, tra Ia membrana mitocon-
d ria
. . • ,ne e att1v11unl t h Il metodo basato sulla velocità d1 sedunentaz1011c può essere impiegato per determinare 11
1 mtem1 d1 membrana {fig. 3.7c) c1· . . •ma ic e caratteristiche di entrambi
· 1 tnz1m1 utJlizzatI b grado di purezza cli un campione. I profili d1 sediment,111one pos~~no essere ottenuti us.11~do
strutture subcellulari :.ono: l'ATPasi ~ JK d a itualmente come nferiment1 d1
f,os t:ata\J per I I reticolo endopla~matJco
• a · •pendente II
un mtema ottico Schlicren. In questo tipo di apphcaz10111 ~ iene misurato il grad1l·ntc ddl m-
Ia atto1dt , P1asmalemma·• la glucosio-6
gal per
SDH per• mJtocondn; la fosfat.1)1 acida •J)(r i 1150 ~ans,eras1 per l'apparato del Golg1; la
dice di rifrazione, m ogru punto dcll.1 cella delrultm.cntnfug.1, a d1vcrn intervalli d1 tlmpo.
de1drogenas1 per il cJtosol. somi, la catala~1 per i pcros~i~omi; la lattato Durante l'anali\i ba\ata ~ulla \CkK1tà di sedimentazione, un.1 prep.1r.111one omogenea forma
un fronte di \ediment,,z 1one singolo, \immetnto t· ben delineato: cio d1mo~tra che le macro•
 Sl(l( JIIMI( ~I Bllll<l(,IAMOlf<UIARt
t:lN rtUFU.AlJOSL
12h 127
IJ :,tc:,._...i formJ e le stcs\c d,
I3re rdJUIJ,
OJJ'"1 mok,0 ·celle abb1Jno Jnche la ste~s.1 Complesso drstrofino gllcoproterne
mok,olc ,111JhuJll' h,111110 IJ ,tc,,J t•to(hequc,tep.itll d t ·he •lett r
. .
ml'n,10111 IuttJv1J, non ,1 puo Jr
d e per scon • . .,
s· 1lo ulteriori 1nuagm1•
u,Jn o Clntc e ro,o
. d ll·galaltolldas, J Tireoglobulrna
lJn,.1 dcttr1,J o J.1 ,te"J Jtt1v1IJ 1..''1ol>gt<"ll-.
' • di d1,t1nguere -.nuesU >01tot 1p1 1 macro. (markerl& Si OGC (marker 19 SI
. 0
. IIli, 11errncttonIl .lllde vantJg!;IO del metodo
rl'lllhe e dm,1gg1 b1olog1,1/cnz1mJ . _ bJsato ,un J • * •
mok,olJre. gr ·coli o p1u gr,md1 po•.,·

. :1,- rro::
.
molnok ,urnh J1l'nt1 IJ ,lc\\,I mJ,,, 1 tammanll p1u pll
fatto che i con . . . I e/ .
vcloutì di scd1mcntJ11011e lon\lste neI - etne dd picco prmup,i e o come è
• . e s alle o Jsm1111 . ,t · • e
,0110 c,,crc nconosl1u11 ch1Jramcnte ,om P . multJrl' 1tlloh com1g IJII nel p.ir,1

(}
0
. .,
pinhi ,1ggiunuvi Per un Jpprolonumien ''
,
t i " po,wno ,o
. . I . . t ifuahe JOJ1Ili< e,
.
·h, offrono un Jmp1,1 ..cc ta I testi
. .
I d 6
1a,
grafo J .6; rnoltrc, 1produttori d1 u trJ_.n r " od ulle ,ue Jpphca11on1 ,peC11ìche. 04
E
per un,1 prcpJra11one teorica ul, basc•,u que,IJ mct 1cJ e' 02
~~

o
3.5.2 Determi11nzio11e della massa mo/eco/are relativa r-- T -,--,--,~ -.---.-~--~

. pJr~1•oiab1k per determm,ue accu_rata 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

I .uItr,1Ctntn·1·uga11one Jn,u1
., t 1CJ e UllJ lt'(Olld 1m '"" · Qupst metodologia nch1c-
I
Frazione dol gradiente
mentl IJ ma~sa mokcolare relativa d1\OIutl neI loro stato nau, o. ' • · di - li
JO ') e ba\se urncentru1oni par11ec e I igura 3.9 . 1\n4ti1i medwi~ st11ment.L1one di un compi= ..on11u1to da p1u prote111c; rl wmple"o J1 -
dc ,olo p1cwle quantlt.l d1 c,1mp1one (20-I. mm . · t Il
, d. t I b olou1lhc entro un ampio m crva o \lrofìna-gl1rnpro1emc (DC.,C). Comparando la m1grwonc di wle complev-.o um quella delle protrmc d1 rr -
(0.01 I g dm'); inoltre, comcnte I anah~1 1 mo eco e 1 " • ienmento fl-~fatto.rd~-i /!6 51 ~ lrrtoglohulrn~ {19 SI e 1tato ~t1m~to che le ,ue d1mcm10111 \1,1110 pan a
e · d anJli~i elettroforcuche, cromatografiche, cnstal
di mJMC moIecoIan reIauve. ,e associa1a J d •• I c.w:a 18 S. Poicht I cocffic~lJ d1 sed1mcnta11one delle mJcromol~olc b1ologrche wno rdJt1vamen1e pic -
lograhlhc e d1 ,equenu, questa tecmca permei te d'1de1ern11nare con gran e prens1oue
· · . e coli, quem vengono e.pr=im un1u \vcdherg tS1 l i Se pan., IO ·• \).
propncta biochumchc· · delle parucelJe b10togJChe,'~ · · comt1nque ~ottohneato
. che
. puo essere__
,1pplKJta ,olo se J'a,,orban,a delle biomolecole da analizzare (proteme, c.ubo1drat1 o ac1d1
nucle1ll) è differente d,1 quella del solvente rncostante. 3.5.3 Coefficiente di sedimentazione
All'm1110 d1 un e,pmmcnto basato sull'Jnahs1 del fnmte d1 ,cd1mentazione, le particelle
b1olog1chl· ,0110 distnhu1te umformemcnte nella soluzione all'interno della celia analitica. Gh studi b1och1m1c1 compiuti negli ultimi decenm hanno d1mo~trato rnequivoc,1bilrnente
l 'applKJ11one d1 un c.1mpc1 centnfugo prov0<.a la m1graz1one attraverso 11 solvente delle b10- che le macromolecole b1olog1che non svolgono le loro funz1om b1olog1Che e b1olh1m1Che m
molecole, d1m1bu11e 111111almente 111 modo casuJle, in direzione radiale rispetto al centro d1 modo isolato. f:. ~lato dimostrato che molte pro terne svolgono p1u funz10111 e che la loro atll\'I·
rot,1z1onc. S1 viene qumd1 J formJrc un fronte netto tra IJ regione della cella priva del materia- tà è regolata da articolate 111teraz1om che s1 rnstaurano all'interno di complcs~1 \la omogenei
le che sta sedimentando e quella do,e i111ece è ancora pre5ente La velocità di spostamento del sia eterogenei. t ormai certo che la c111e11ca cooperativa e l'mfluenza e,ercuata d,11 m1crodo-
fronte fonmce una nmura della velootà d1 ,ed1mentaz1one delle b1omolecole. Il coefficiente mrni giocano un ruolo fondamentale nella regolazione dei processi b1och1m1c1. 'Pmché I cam-
d1 ,ed1mentazione e direttamente proporz1onale alla massa delle particelle b1ologtehe, mentre biamenti conformaz10nah nelle macromolecole b1olog1che possono influenzare la loro ,elo-
la d1,1ribu11one dellJ concentra,ione dipende dalla massa molecolare relativa d1 galleggia- cu.ì di sed1ment,1z1one, l'uhracentnfugazione analitica è lo \trumcnto 5penmcntale ideale per
mento. In que~to modo è po,s1b1le delenmnare la veloc1tj di movimento delle biomolecole lo studio d1 tah mod1ficaz1oni 5truttur.1li. Per esempio, un,1 macromolecola che, in ,eguito a
nel c,unpo lcntrifugo e co,truire un gr.ifico, riportando il logaritmo naturale della concentra- una mod1ficaz1one conformaL1onale, diventi più compatta, d1mmu1scc la sua resi!.tcnza fn
lJOnc del ,ol_uto in_fun11onc del quadrato della distanza radiale dal centro di rotazione (In eri- z10nale dovuta all'attrito col solvente; al contrario, tale resisten/J aumenta quando un com-
,pctto a r }; 1punii d1 tale grafico sono d1\po,11 a formare una rettJ 1J cui coefficiente ,1ngolare plesso molecolare diventa p1u disorgJnizzato. L.t pzcsenza d1 lig,md1 (come 1111bi1ori, attivatori
e proporz1onale alla m,Ma molecolare della molecola. o substrati) oppure vanaziom della temperatura o del tampone po,\ono rndurre cJmbiamen-
Un mclodo Jlterna11vo per. calcolare IJ massa mo tecotare relativa d1 un.i macromolecola ti conformaz1onah nelle subun1tà delle biomolccole che, a loro volta, possono dctcrmrnare ri-
biologica è la ICllllCJ della ,cd11nen1az1ont a hJnde Jn q t I • levanti modifiche nella ~truttur,1 quatern,1ria dei complessi. Tah cambiamenti po\,ono c"ere
.. ue~ o caso I campione viene strJt1fi-
lato ,opra un \ohcnle p1u demo Duranl• J, c•,it ·fu ·
·
·1
' • ' n ga11one 1 ,olvent fi · nlevati dalle differenze nella velocita di ,edimentazione delle ,pec1t molccol,m. Gli C)peri-
grad1enll'd1 dl'n\llJ e vienneguuo ilmol'lmento nell . Ila '1 . e orma un proprio menu d1 sedunen1az10ne all'equilibno ,ono utili per determinare le dimem1oni rda11vc delle
k paruu:lle di cui .,1vuole detcrm· a ce aoa llica della banda formata dal- singole subu111t,l che formano 11 complesso, la steLhiomctria e le dimemioni d1 un comple"o
mare 1a ma,,a molecolare.
la dl'll'rmma11onc dellJ mas1a molecolare r 1 1. d' in d1fferent1 cond11io111 fiswlogJChe e la forn dell'mteralione tra le 5ubumta.
·r
puo c,\ere u11haatJ per l'anali,i di niol · 1 e a l\'J me 1ante ult racentn uga11one an.i 1·1t1cJ -
Lo stato ohgomenco d1 una protema d1 nuova 1dcnufic.1Lione che, in condi,ioni nathc,
eco e aventi una ma I I
.a parndu m1lmm. Que,ta ksnica vitnc q d \~ mo eco are da poche cent10a1a ,embra formare un comples,o di grandi d1mcmi"111, puo cs,crc determm,110 mcdi.mie di,n-
. um I usata per I' I1 1· d - .
ll'1m•,ac1d1 nuckm,v1ru,eparticdlesuh ·li I ana ' 1p1ccoh carbo1drat1, pro- ,e tecmche hwchim1che Ak.um e,cmp1 ~no; 1',111abi medi.mie gd-lìltrJLwm·, l'.111ah,1 mr-
•t u Jfl come I mitocondri.
 BIOCHIMl<,U OIOLOGIA MO! fCOLARJ: CFNTRIFUGAZIONE L!9
128
à J'jnununoprecipitatione diffe- LAUE, T. M., SrAFFORD, W. F. 111. Modem applications of .1nalytkal ultracentnfugauon Annua/ Re1·iews
diante ncono~cimento su blot, la aomJtog- rafia per affila11111 ' . ·
centrifugazione, I'anaI1s1· med ·iante 11181ophys1cs and Biomolecu/ar Structrires I 999; 28: 75-100.
P anto concerne · f, . Fornisce un quadro riassuntivo delle informazioni di~pombili sull'ultracentrifugaLtone analitica e
ren:11ale e il cross-hnkmg__chumco. ~ qu d d le ""' ottenere queste m ormaZ10ni
- · · è un meto o 1 ea ,-- , • d" · ~u come questa tecmca possa essere usata nelle moderne applicazioni.
sedimentazione in gradiente d1 densit.l d · un complesso, w se 1IDentazione MURRAY, B. E., OttLENDIECK, K. Chem1cal cross-linking analy~ìs of Ca'· -ATPase rrom rabb1t ~keletal
t le d1mens10111 I
b1och1m1che. Per determin,ire mmalmen e . confrontata con que Ua d eI nuovo muscle. B1ocher111ca/ Educatron 2000; 28: 41 -46.
olecola re nota, viene dim . . d "f Descrizione per studenti universitari di un esperimento di frazionamento di un omogenato dì mu-
d1 proteine d1 nfenmento, J maSSJ m . . niolccolare, forma o ens1om 1 -
U b
complesso proteico. Le paruce e .'o og I ,che a venu massa
J;fli nt• (par 3.1 ). Come s1· osserva d al- scolo scheletrico.
~ n ,·elootà w ere · RAI.STON, G. Introductron to A11alyt1cal Ultracentrif11gat1on. Beckman lntruments, Fullerton, CA 1993_.
ferenti, m1gra.i10 nel campo centn ugo co . h me dimensione il secondo (s); per la
Descrive I differenti tipi di esperimen1i che possono essere eseguiti con un'ultracentrifuga anahuca.
l'equazione 3.7, il coefficiente d, sedimentazione ahco . il valore del coefficiente di sedi-
di mtere~e bioc 1m1co
m:1gg1or. pari.e delle macromoIecoIe preso tra J e 20 mentre per le
db (S _ ,~s) è normalmente com •
m..entaz1one m unità Sve erg -: _ . . mi e i mitocondri è compreso tra 80 e
g randi particelle bwlogiche come I nbosom1, l OllCIOSO . d I
'alb · serica che poss1e e una massa mo e-
alcune m1glta1a. Una upic.i proteina solubile, l umma •.
colare relativa d166000, ha un coeffic1ent.c di sedunentazione dt 45 S. . . .
La figura 3.9 mostra l' an.ws1
. ,. per seJ·-•ntaz
U1111, 10ne del complesso d1strofina-ghcoproteme •
(DGC), recentemente 1den11ficato; confrontando la sua migrazione con quella deU~ prot~m~
standard t3-galauos1das1 (16 S) e della tireoglobulina (19 S), è stato suma~o che le d1m~ns10m
di questo complesso siano circa 18 S. Quando è stata identificata per la pnm~ volta la ~1strofi~
na (componente del citoscheletro di membrana), è stato dimostrato che era m grado dt legarsi
a una colonna di lectine, sebbene non possedesse alcuna catena di carboidrati. Tale osserva-
zione ha suggerito che la distrofina potesse formare un complesso con le glicoproteine di su-
perficie; l'analisi d1 sedtmentaz1one ha confermato l'esistenza di tale complesso (DGC) e la
centnfugazìone, dopo diversi trattamenti biochimici, ha permesso di comprenderne in detta-
glio la composizione. L'estrazione in ambiente basico, il trattamento con acidi o l'incubazione
con differenti tip, di detergenti, causano la dISgregazione differellZlale del DGC. Attualmente
è ~oto che la distro~~a è f?rtemente associata ad almeno dieci differenti proteine di superficie
comvol~e nella stabihzzaZione della _me~brana, nell'ancoraggio di recettori e nei processi di
trasduzione del segnale. La carattenzzaz1one del DGC, mediante analisi di sedimentazione
costituisce u~ ottimo ese~p!o d1 come la centrifugazione possa essere utilizzata per ottener~
rapidamente mformaziom biochimiche su una proteina fin dalla sua scoperta.

3.6 Suggerimenti per ulteriori letture

F1s01.,w, J. B. C., EVA.~S, W. H. Bìolog,ca/ Mtmbranes. In Pra
Oxford/Washtngton, DC 1987. etica/ Approac/1ts 111 810,hemistry, JRL Press,
Contiene due ampi capuoh sulle procedure di centrifu
mento subcellulare d1 cellule ammali e vegetà gazione differe112Jale usate per il fraziona-
foHER, D., FRMCIS, G. E., Rlcxwooo, D. (eds.) ull St n
IRL Press, Oxford/Washmg1on, DC 1998. 'Jla ation. In Practrcal Approaches in Biocl,emistry,
Descrive la metodologia di frazionamento dcli llul .
GRAHMf, J. M., Rlcxwooo, D. (cds.J Subul/u/ar ;« e mediante sedimentazione
IRL Press, Oxford/W~hmgton, DC 1997. rnc11ona11on In Practrca/ Approaches m Biochemwry,
Conuene una descnz1one delle tecniche fond .
r •. T.M B
...,,1.;I, •
h· - ., d b
1op ►Sic... stu 1~ y ul1raccntnfu .amcntahd1fr azionamento subcell 1
579 583 garion. Currtn1o 1111011 u ,ire.
• ·
Fornisce un eccellente quadro nassunuvo Il'
'P m Structura/ 810/0 200 I; 11:
gy
zione del comportamento delle macromol su Ulùt2zo dell'ultracentnfu .
I
reo e 1n soluZioni CO gaz1one per la carattenzu-
mp I~.
( APITOLO 4

Microscopia

4. 1 Introduzione

. L'ana~ISl biochimica è frequentemente accompagnata dall'esame microscopico di preparati

d1 tessuti, cellule o organelli. Queste osservazioni vengono utilizzate in molte differenti apph-
caziom, per esempio per valutare l'integrità dei campioni durante un esperimento, per defim
re nei dettagli la distribuzione spaziale delle macromolecole all'interno delle cellule o per mi-
surare direttamente fenomeni biochimici all'interno di tessuti viventi.
Esistono fondamentalmente due diversi tipi di microscopio: il m1cro,cop10 ottu.:o e il m1
croscop10 elettronico (Fig. 4.1 ). Per formare l'immagine, il primo focalizza la luce utilizzando
una serie di lenti di vetro, mentre il secondo focalizza un fascio d1 elettroni utilizzando lenti
elettromagnetiche. L'ingrandimento massimo è di 1500 volte per microscopi ottici e d1 circa
200 000 volte per quelli elettronici.
Tuttavia, il criterio migliore per valutare l'utilità di un m1croscop10 non è rappresentato
dall'ingrandimento ma, piuttosto, dalla risolullone, cioè dalla capacità di dimnguere due
punti molto vicini tra loro in un campione. Per le analisi di routine, il m1aoscop10 ottico h.1
un limite di risoluzione pan a circa 0.5 micrometri (µm). Per contro, il microscopio elettro-
nico possiede una risoluzione fino a I n.mometro (nm). Mediante il microscopio ottico è
possibile osservare sia campioni vitali sia non vitali, spesso nei colon reah, mentre al micro
scopio elettronico possono essere osservati solo campioni non vitali e m,u nei colori reali.
Progressi recenti hanno aumentato fino a 0.2 µm il limite di risoluzione del microscopio ot-
tico per particolari applicazioni (par. 4.8).
In campo biochimico, gli utilizzi del microscopio possono e~ere relativamente sempho e
abituali; per esempio un veloce controllo dello stato di un preparato cellulare o d1 cellule m
crescita in una coltura di tessuto. In questi casi, un normale m1croscop10 ottico <la banu> è
perfettamente adeguato. D'altra parte, le neces,ità possono essere più complesse, rnme qu.111-
do si misura la concentrazione di calcio lll un embrione vitale nel tempo d1 un milli,econdo,
nel qual caso sarà necessario utilizzare un miuoscopio ottico piu avanuto (spe,~o indicato
come sistema di 1111ag111g). Esigenze ancora maggiori possono derivare, per esempio, d,111.1 ne-
cessità di localizzare macromolecole m compartimenti delimitati da membrane .1ll'interno
della cellula; la scelta del nucroscop10 elettronico, in tah c1rco,tanze, e obhhgat,1, m quanto ( 1I
solo strumento 111 grado di formre le risoluzioni dell'ordine dei nanometri m:h1cste per que-
sto genere d1 immagini. _ .
Alcuni microscopi sono piu adatti d1 altn per specifiche apphc.1L1cm1 Powmo e~,ne nl·-
cessarie immagini di campioni aventi d1men\1oni molto d1ver.,e tr.1 loro ..hc mhieùono in
 Blt\CIIIMICA l BIOUJ<,IAMOL[( OIARf MKROS<:OPIJ\
133

0.1 nm 1nm 10 nm 100nm 1 O ~m 10µm 100 µm 1 mm

M1croscop10 elettronico
M1croscop10 omeo a trasm1ss1on•
sorgente d1
elettroni
l
_ i
, Virus llcv1t1 C elcgoM

r ~anero
I'.
\1...__e_m_.1i_rio_n_1_ _ ...J
Lente del -
condensatore I R1bosom1 i Cellule vegetalo

Vetrino
j~___o_,g_li.,n_e_n_, _ __,1\1 Cellule: an,mah

M1croscop10 elettronico
Lente
- dell'obb1ett1vo
M1croscop10 ottico

Risonanza magno11ca

Occhio o macchina Schermo o macchina
fotografica d1g1tale fotografica d1g1tale
(L1m1te d1 risoluzione 0.2 ~m) (L1m1te d1 risoluzione 1 nm)
Cellule vive e mone Solo cellule mone
1-igura 4.1 M1croscop1a omca ed elettromca. Lo schema mette a confronto il percorso della luce attraverso
un m1croscop10 01ttco (MO) composto con il ptf(Orso deg).1 elettroni attraverso un m1croscop10 elettronico
a trasm1\Smne (MET). L.1 luce pro-entente da una lampada o un fascio d1 elettroni pro,eniente da una sor-
gente d1 elettroni vengono foolt=11 ,ut campione, nspet11vamente, mediante una lente condensante d1 ve-
tro o una lente elettromagnet,ca 1':el caso dd ~IO il cam~1one è montato su un vetrino, sul quale~ po~izio-
nato un cop11ogge111, mentre nel MET 11 campione~ posmonato su una griglia d1 rame. L'immagine viene
mgr,mdita mediante una lente dell'ob1et11vo, m ,c1ro nel MO cd elettromagnetica nel MET e proiellata su
un ri,elatore mediante la lente dell'oculare nel ~IO e la lente del proiettore nd MET Il rivel;tore può essere
l'occhio o una macchina fotografica d1g1talc nel MO e uno \chcrmo fosforescente O una macchma fotogra-
fka d1g1tale nel MET
(lmmagim in m1croscop1a ottica ed elettrontca nprodotte per gentile concessione di Tatyana Svitkma.)
E·S:lfrl::ii;;.P
Figura 4.2 Dimensioni relative di camp1on1 b1ologic1 d1mostrativ1 e di alcum ,trumenll ut1huati per o~,er-
varh. L'intervallo d1 nsoluz1one per ciascun strumento è indicato dalle barre in colore \~Uro \IIUJtc: nella
parte inferiore della figura.
Negli ultimi vent'anni, il settore della m1croscop1a è stato oggetto d1 un rinnovato mtcre~~e
e ha visto numerosi miglioramenti tecnologici degh strumenti. Molte immagmt micro~cop1•
che vengono ora registrate e visualizzate elettronicamente mediante tecmche d1g1tah per la
produzione di immagini: telecamere digitali, programmi per \'acqu1siz1one d1 1mmagim digi-
tali, stampanti e metodi di visualizzazione digitali. Tah progresM hanno determmato un au-
mento delle applicazioni della microscopia m campo biochimtco, ~paz,ando dalla semplice
osservazione abttuale di cellule ed estratti cellulari a tccmche spee1ahzzate, per misurare dirct
tamcnte eventi biochim1c1 all'interno delle cellule.
4.2 Microscopio ottico

grandtm.enti differenti (Fig. 4 .2.); per esempio• interi animali (metr·)

1 , tessutt· ed em b noni
• · ( mt-
· 4.2. I Componenti di base del microscopio ottico
crometn), fi.no a cellule, proteine e DNA (nanometri) Lo studt·o d. Il I · . . •
. . · 1ce u e viventi può richie-
dere nsoluLtom temporali la cui durata può variare da divers I · • ( La forma p1u semplice di microscopio conmte m una ~mgola lente di vetro montata m una
rnghono ottenere 1mmagim dello sviluppo neuronc1le O di giorni per e~e'.11pio qu~nd? ~1 cornice metalhca: la lente d1 ingrandimento (F1g. 4.3). In que,to caso, 11 campione ri...hiede
. • d • . . procem patolog1c1) a pochi m1lh- una minima preparazione e la lente , iene solitamente tenuta tr ,1 l'occhio e il campione dalla
~ccond 1(per esempio quan o s1 vogliono ottenere imniag· d., .
zione cellulare). 101 11enomem come Ia comuntca- ·
mano dcll'oper,1tore. La foca.lizzaiione della regione di interc\~e ~i ottiene muO\endo, l'unu
 , f Bltll tX.lA MOI FCOL \R.l
BttXHIMIL• MILROSLOPI"-
I 15
D4
a

Lente di
ingrandimento

Figura 4.4_Due tipi f~nd:imenta_li di ~•cro~cop1 ottici. (a) Un microscopio diritto e (b) un micro\cop,o ro-
vesciato. S1 noli che e è pm spazio a dtspom.1one sul portaoggetti del microscopio rove,oato. Quc,to ,tru-
mento è approntato per la microiniezmne mediante un d1sposi11vo porta-ago alla sinistra del portaogg~tu.

to intorno ai bordi degli oggetti nell'immagine: tutte le nuove lentl vengono corrette per evi-
tare questo problema.
Immagine /_..../,:.....~4~:--'~-::;::o-' Tra i componenti principali di un microscopio ottico composto vi è una sorgente di lu..e,
virtuale
che viene focalizzata sul campione dalla lente del condensatore. La luce che passa attraverso il
campione (luce trasmessa) o che viene riflessa dal campione (luce riflessa) viene focalinata
Figura 4.3 Ingrandimento in un microscop10 semplice: una lente d, ingrandimento di vetro. La lente del-
l'occhio ( il cristallino) mette a fuoco la luce sulla retina- un insieme di cellule sensibili alla luce, situate nel- dalla lente dell'obiettivo sulla lente dell'oculare. L'immagine viene vista dtrett.imcnte a oclhto
la parte posteriore dell'occhio. Per la messa a fuoco, la lente com·essa viene posizionata tra il campione e nudo nell'obiettivo oppure, molto spesso, viene proiettata in un rivelatore, per e~empio una
l'occh,o. L'ingrandimento dell'immagine del campione viene ottenuto mediante l'ampliamento dell'angolo pellicola fotografica o, più frequentemente, una macchina fotografic,1 digitale. Le 1mm.1gim
di visuale della retina da parte della lente. In questo caso l'immagine appare come se si trovasse dalla stessa
parte del campione rispetto alla lente ( immagine virtuale). vengono visualizzate sullo schermo di un sistema di visu.ilizzazione computerizzato, 1mma
gazzinate in formato digitale e riprodotte mediante tecniche digitali.
La parte del microscopio che mantiene in posinone fissa tutti i componenti viene chiama-
rispetto all'altra, il campione e la lente; la sorgente di luce è solitamente il sole o la luce am- ta supporto. Esistono due tipi fondamentali di supporto per m1croscop1 ottici compmt1: per
biente artificiale; il rivelatore è l'occhio umano; il sistema di registrazione è rappresentato da mteroscopio diritto e per microscopio rovcsci.1to (Fig. 4.4 ). Nel primo caso, la sorgente di lu<.c
un disegno o da un appunto. si trova al di sotto della lente condensante e gli ob1ettiv1 si trovano al d1 sopra dell'allogg1a-
mento del campione (detto anche portaoggetti): questo sistem.i e ,I p1u comunemente uttl11-
Microscopi composti zato per l' osservazione di campioni. li microscopio rovesciato è costruito m modo tale d11~ I.i
sorgente di luce e la lente condensante siano poste al dì sopra dell'allogg1amento del camp10
.Tutti I moderni microscopi sono formati da più lenti. combi'nate t ra Ioro. I componenti·
prmc1pah sono la lente del condensatore, la lente dell'obiettivo e I I t d li' • ne, mentre le lenti dell'obiettivo sono poste al di sotto: ciò consente d1 avere maggiorc spa,10
. . . . . a en e e ocu 1are. Questi
strumenti sono qumd1 chiamati mtcroscopi composti (Fig 4 I) e· d. . per la manipolazione del campione direttamente sul portaoggetti; per esempio per l.1 micnn
• • • · • • iascuno I questi compo- niezione di macromolecole all'interno di cellule in coltura, per la fertilizzazione m 1·1tro d1 u:1-
nenti è, a sua vo 1ta, costltmto da una combinazione di lenti n • . .
. • . . . f; • ecessane per produrre 1mmag1-
111 mgran d 1te aventi m1111m1 arte atti e aberrazioni Per es · b .· lule uovo o per osservare nel tempo lo sviluppo embrionale.
. • • . . . · empio, a erraz10111 crom t'1che si
venficano quando raggi lummos1 d1 differenti lunghezze d' d a Per ottenere immagini e microfotografie d1 elevata quJlità, è cruciJle la corrctt,1 1llumin.1
. on a vengono sepa fI
attraverso una lente con angolazioni diverse. Questo r ra e passano zione del campione, mediante l'utilino di una sorgente lummosa, costituita gencr,1lmcntl' da
. . . ,enomeno present I · · ·
microscopi d1 Antonte Van Leeuwenhoek e di Robert Hook ' e anc 1e net pnm1 lampade al mercurio, allo xeno o laser. L.1 luce proveniente dallJ ,orgcnte luminmJ PJ\SJ nell.1
e, produce un arcobaleno colora-
 Bl<ll 111\11< Af Bllllllt;l,\M()UC.O~

\il( R()\t lWIA

137

La knle dcll'ob1ct11,o è r~ponsabile della . ,

~ere il componente piu produ11one dcli immagme mgr.mdna e può es
COSloso del m1cro\lOp10 ott ( F ' 5 e d 'b 1
obiettivi diversi, su lutti sonori llO ig . ., . ,ono 1spom 11 numems1
mento (4 >< !0 x "0 40 60 portate dJC1ture con mtorma,1om quah fabbricante, mgrand1-
, ' ~ x' ><, >< I 00 ~) re l' ·
del vetrino copno etti (usuaÌ ' qu1S1t1 per immersione (aria, oho o acqua), spe,"mi
gg . mente 0.17 mm) e altre propriet.1 otllche ptu speofiche della
Ien te ( par. 4 . 2.3). l n aggiunta posso ·
. . ~ . .. • no e~scre riportate anche mformo1z1om relati,e alle corre-
zioni per arte1att1 ott1c1come abe · h
. " fl ,, ( bb . rraziom cromali, e e .ipp1atttmcn10 d1 ,11mpu; per esempio
I.1 ~cntta uo a rev1azion d I· f1 · '
,, bb . . . . e uonte) md1ca la lente meno corretta, mentre "pian"o "pian
apo (a rev1a21one d1 piana apocromattea ) m · d1Ca Ja Iente con la p1u alta correzione.
. Le lenii
. possono . essere. a secco o a 1mmer,10ne:
· come regol.i pratica generale, molti· ob1ett1-
·
vt c?n mgra~dimento minore di 40x sono ad ana (,, secco) mentre quelli con ingrandimcnto
P,an ~. ~up~nore 3_40 < s~no a immersione (in olio, glicerolo o acqua). La dicitura "Oll" o
OEL mdica che I ob1ett1vo è stato progettato per operare m olio; v1 sono altn mezzi d1 1m-
n:1ersione, tra • quali ghcerolo e acqua, e gli obiet11v1sono marcati per indtcarh. Spe~,o, iene
nportato anche un codJCe colore specificato dal costruttore.
L'apertura numerica {NA, Numerica/ Aperture) è sempre indicata sulla lente ed e solita-
mente compresa tra 0.04 e 1.4. La NA è una misura della caparnà eh una lente d1 raccogliere la
luce dal campione: lenti con bassa NA raccolgono meno luce d1 quelle con alta NA. La nsolu -
d I t dell'obiettivo montate su un microscopio dmtto (b Lione varia con la NA, il che significa che obiettivi con alta NA forniscono la m1ghor nsoluz10-
figura 4.5 La lente ddl'obie1t1vo. Una ~lezione ~ 'ri~ura indicano che esse producono un ingrandimento ne. In generale, gh obiettivi di maggiore potenza hanno una NA piu alta e una risoluzmne mi-
ricerca.~ -.cnttesulledue lenll m pnmo piano ne ar·ic• 0 3 e o 16 ri~petuvamente. Entrambe le lenti \Ono
rela11,amente basso ( lo 'e s xl e•on a""rtura
r
nume • lente
be e La · lOx· •~ posizionata sopra il campione montato gliore rispetto alle lenti meno potenti con minore NA. Per esempm, una risoluzione di 0.2 µm
Pian Neofluar, cioè rono corrette re1a11vamen1e n . on un co no etti. può essere ottenuta solamente utilizzando una lente piana apocromatica, a 1mmer~ione in
su un -ctrino, tenulo fermo sul portaoggem, e coperto c p gg
olio, con ingrandimento 60 · o I00 • con NA pan a 1.4. Nel caso s1 debba scegliere tra due lenii
aventi lo stesso ingrandimento, generalmente è meglio optare per quella con NA piu alta.
lente del condensatore; questa è montata al di sotto o al di sopra del portaoggetti (a seconda La lente dell'obiettivo è anche la parte del microscopio che può essere p1u facilmente dan•
che l'apparecchio sia diritto O rovesciato), in un supporto che può essere alzato e abbassato neggiata da uno scorretto utilizzo. Molte lenti sono coperte da un nveslimento protettivo ma,
per mettere a fuoco il campione (Fig. 4.4). li condensatore mette a fuoco la luce della sorgente nonostante ciò, un graffio sulla loro superficie può provocare un grave detenoramento del•
e illumina il campione con raggi luminosi paralleli. Una lente condensante, correttamente po- l'immagine. ~ quindi necessario avere grande cura nel maneggiare le lenti dell'obiettivo: de-
sizionata, dà luogo a un'illuminazione uniformemente brìllante e priva di riflessi su tutta la vono essere pulite seguendo la procedur.i raccomandata dal produttore e solo da persone qua -
regione del campione (illummaz1one Kohler). Uno scorretto allineamento del condensatore e lificate. Una lente dell'obiettivo sporca è la principale fonte d11mmagm1 di scar,-a quaht.1.
un'impropria apertura del diaframma sono tra le principali cause della scarsa qualità delle La risoluzione della lente misura la capacità di di~linguere tra due oggetti nel campione.
immagini nella microscopia ottica. Minore è la lunghezza d'onda della luce mc1dente, maggiore è il potere d1 risoluz1one del rm-
L'alloggiamento del campione (portaoggetti) è un dispositivo meccanico accuratamente croscopio (Fig. 4.6). Il limite di risoluzione di un mKroscopm che utiliaa luce visibile è drLa
progettato per mantenere ben fermo il campione nella propria sede (Fig. 4.5); infatti, qual- 300 nm con una lente a secco (in aria) e 200 nm con una ll'nte a tmmcr~ione m olio. l!!>Jndo
siasi movimento o vibrazione pregiudica la qualità dell'immagine finale. Il portaoggetti con· luce ultravioletta come fonte luminosa, la risoluzione puo es,ere aumentata a 100 nm gra,ic
sente di muovere ti campione, posizionandolo mediante movimenti precisi e uniformi, sta alla mmore lungheua d'onda della lm:e {200-300 nm l Que,ti hmiti di ri~oluz1onc sono ,pe~-
onzzomalmente Sia trasversalmente, lungo gli assi X e Y, per localizzare una regione di inte• so difficili da ottenere, nella pratica, a cau<,,1 di .iberraLioni nelle lenti e delle SLar~e propncla
z,
resse; 11 movimento puo anche essere verticale, lungo l'asse per mettere a fuoco il camp10· ottiche di molti camp1om b1olog1ci. l\.hcrosrnpt per ricerca piu ,pedalizzati po~,ono ora rag
giungere una nsoluz1one di cirLa 20 nm per applicazioni partirnlan I par. 4.8).
ne oppure,
. neld m1croscop10
. mverttto
. ' sono gli. obi.ett·1,.1stessi· ch e vengono mossi,· mentre !'al·
Iogg1amento e1campione rimane fisso s0 J L\Kul.irl' lavora 1m1eme ,,Ila lente dell'obiett1vo per ingr.1nd1re ulteriormente l'immagine,
Iana e una d I. prec1S1one
. .
per mgrandi
· llamente, sono presenti una regolazione grosso·
·b · d che può qumd1 es,ere rilevata dall'occhio o, più comunemente, c,,cre proiettata 111 una ll18l-
.. . . mentt assi e alti, rispettivamente La regolazione 1
prec1s1one comente mcrementt di I m O · • • • . . • • , chma fotogr,1fic.1 digitale per e~cre rc.-g1~tr,1ta. L'o, ulare ,ohtamente mgrantfou: d1 10 ,ohe, m
g1amen10 del campione può essere mosso µ ' meno, nei mighon m1croscop1 per ricerca. L allog·
manual ., quanto ingrandimenti maggmn determmano ,olo un mgrand1mcnto del1'1mmagme, ~cnza
ratamente mediante un comput t . mente, o può essere controllato p1u accu aumento d1 n,oluzione. Esiste un !mute ,uperiore all' ingrandimento utile che s1 puo ottenere
er, ram1te motori li al
controllo d1 precisione del microsco . passo-passo (stepper motor) co egall d,,ll'm,1eme delle lenti d1 un miLroscopw; per ogni lenk dell'ob1etti\O l'mgrand1mcn10 puo
pio.
 ttl<ll 111\11< \1111010\,IAMllll< oLAal

\I Il Rl I\( 0 1'1 \
IW
1 micrometro)
ometro• O00 l.1bdlJ 4 . I Protolollo gen,·ral • . 1,.1
Nanometn I1 nan e per mmunof111ore1,len,.i indm·Ha
'onda vt51blh ►
Lunghezze d I i,,,11e 111 lorm,Jldr~;-;;:;:.,muti
Infrarosso
IIR • invisib1lo) 2 RM iau111o1rc in tJmpo,w freddo
Ultr1v1oletto .I 'IJmponc d1 blouagg10
IUV • inv111b1lel
I lncubJrt• rnn an1i,orpi priman, rac'l'mp10
. ·
Jnll ,tubuhna d1 lupo•
V B G V R 5 l~1vare I volte in tJmpone
_LL ,so 500 550 600
650 700 750 800 850 6 lmubJrc wn an11corp11oernnJ ar1·, per c,rmpm an11 topo d1rnmgl10111Jrca11 wn Ouorr,cema •
300 350 7 l ,w,1rc 4 volle in IJmpon\'
Spettro della luce bianca
Il lmub.H\' 111 pre,er11a d1 un •app0,1·1o rcagcnlc antl\tolonmrnto ( pt•r r-..:mp10
· Vcl.la~h1dd)
. ,lcall'onhio um,1nu. l no,111 ollhi M11111 in gr,Hlo <l1 vedere i co. 9 Mont.irc ~u vetrino con vrtrino copriOl(SCIII
1-<11ur J u, I o ,p,·ltro JdlJ h1,r_b1Jnt1 ' 11'~·ooJJ dd visilule, ,oli1Jmcn1c ndl,1 1c111011c lr,1 100 11111 (v1olct.
IO Osscrv.1rc u11h11,1ndo la micro~copia in ep10uorcicent,1
hm Jdlo ,pdlr.• rnmpm1 _nelle lunghcn{ ri clc1tioni,i h,urno 1111.1 \Cll\1b1h1,\ ,hc ,1 c,1,·n<lc ohrc lo \Ptl•
h>) e 750 nm (ro,,o). Moh1 modani m-t Jllo IR inlrJnw;o· \' vllllcllo; Il, blu; l,, v,•rdc; Y, i:1,1ll0; R, ro1"1 !
1 tcmro Ji im.ubat1onc "•11• • ~ da Jtl upo d1 lt" 111u10 J,1 lO minuti 11rr t.tllu!r J1 c.olturt 11,~ut.1.h tump1om M,t11h), •
trn, l\1b1lr Jll\1"h1,1 um,mo.t\', uhm 10 ,·110; · • ' . un ullt r• uonr prr tm 1nion11nttr1 {ump1oni 1pn.,o.

c,scrc ,1ument,1to fi no J un punlo •Il di soora del qu,1le è impossibile molve1e ulteriore dettagli
r . . I protocolli di prepar,mone del camp10ne possono essere relativamente semplici oppure
· Q I ·
ne1~amp1one ua ,1a\l mg .. , , r•n t,
· m~nto al di ,opri
· • di questo
.. punhi
. viene
~
!>pesso
. . ch1,1mato
, . 111 comprendere molli passaggi che richiedono d1vers1 g1orn1 per essere completata (Tah. 4.1J. Un
~r.m<limcnt,t \ unllt. li modo migliore per aumcnt,ue I mgrand1mcnto e ut1h1L,1re I ob1ctttvo protocollo semplii;e potrebbe consistere nel prelevare un'ahquot,1 dellJ preparazione biologi
~on il piu .ilto ingr.m<lnncnio e la m,1ggiorl' NA. Nel ca,o m cui non fosse po!>~ibil_e ottenere e.i, per esempio spermatozoi vivi, nel posizionarne una goccca su un vetrino e nel mettere un
una molu11onc ,uflì"cntc con il m1uo,copio ottico, \Jrà nei:ess,mo ut1huare 11 m1croscop10 copnoggetto sulla goccia. Affinché non s1muova, il vctnno coprioggctti viene fissato sul vetri-
elcttro111c,1 (p.1r. 1.6). no, per esempio utiliaando smalto per unghie o cera d'api; le forze frizionali, derivanti dal
Oltre ,1ll'olch10 umano e .iUa pellicolJ fotografica esistono altn due tipi di rivclaton ele1- movimento del copnoggeth sul vetrino, possono danneggiare il campione o l'obiettivo.
tro111O impiegati ne, moderni microscopi ottKÌ. Questi sono I nvel.itori di area che formano Molti campioni sono troppo spessi per essere montati direttamente su un vetrino e devono
<lncttJmente l'immagine, pereM"mp10 le\i<leo.:amm: e 1d1spost11vi ,,d ,1ccoppi,unento d1 ca- essere taghatt lll sez10ni sottili mediante un m1~mto1110. li teS!>uto viene incluso in un blocco
ri,., (C( O, C/111rg,·-Co11pfrd Drvrrel. In alternall\·a, l'intensità dell'immagine può essere misu- di cera e tJgliato con la lama del microtomo in \ezioni so11ili ( I 00-500 µmdi spessore). Le se-
r,11.1 con mclatori puntiformi; per esempio, tubi fotomoltiphcaton (PMT, PhotoMttltiplier zioni vengono qumdi posizionate sopra un vetnno, colorate, bloccate con un mezzo d1 mon
T11lir,) e foto<l10<l1. I md atori puntiformi sono m grado di produrre immagini di microscopia taggio e sigillate con un copnoggetti. Alcuni campioni vengono congelati e tagliati mediJntc
J \C,111S10IIC (p,lr. 4.3) un .r1ostJto: praticamente un microtomo, m grado d1 mantenere il campione congelato, che
produce sezioni congelate più adatte per la marcatura con anticorpi (par. 4.2.3).
4.2.2 Il cn111pio11e Affinché si conservi a lungo, prima del se1ionamento il tessuto viene solitamente trattato
con un agente chimico chiamato tìs..attvo; tra i più comuni vi sono la formaldeide e la gluta
•ll l,1111p1onc
. può e~re rappresentato da un orgamsmo · ·
mtcro o da un organo sez10nato, da raldeide, che formano legami crociati tra proteine e alcoli e agiscono mediante prec1pita21one.
un aliquota raccolta duranle un protocoll0 b.1 ·h· · · Tutti i fissativi sono scelti per mantenere l'integrità strutturale della cellula. Dopo la fissazio
. . • 0, 1m1co (per un rapido controllo della prepa-
r.izmne) o da una pK,ol.i parte di un o · (b. · ne, il campione viene in genere permeabilizz.110 per wnsentare al colorante d1 diffondersi nel-
. p rganismo 1ops1a), oppure da uno striscio di sangue o
<l a ~pcrmatozo1. cr ottenere unmagini d I l'intero tessuto. li grado dt permeabi11zzazionc (tempo e intensità) dipende da molti fattori,
appropriato per l'o~erv, al . e campione, questo deve essere preparato m modo come la dimensione del colorante e la densità del tessuto. Que~ti parametri vengono determi-
• ..11onc mccroscop10 ~condo fi · • fi I è
una por,ione di lò\Uh> rei , 1· . . ' !>peet tet protocolli. Il risultato ma e nati per ogm nuovo camp10ne mediante prove ed erron, m,1 le condiz1om sono solitamente
. , .. 1vamente sottile e semitra . . .
(\ ctr1110 ) 111 un mcao appropr t ( sparente, posta su una lastrina d1 vetro dispombili in protocolli pubblicati
1a o come acqua 1, d'I 1
perla da un ,ottile quadratmo di vet ( ' meno co tura del tessuto, glicerolo), co-
. . . ro ,opnoggettt) sig 1li I •
I ,ctnm lOpnoggetti \0no graduai·I b · ato sopra a vctnno.
m ase al loro spess 4.2.3 Il co,itrasto ,ie/ microscopio ottico
coI numero I, che cormponde a u . ore. t ptu sottlh sono i:ontras~egna1·1
. · · • · •
no spessore d1 O17 ·
<lal_vc1rino copnoggctt1viene semp · mm c1rca. Jl lato del campione coperto Molte cellule e tessuti sono incolon e qu.1si trasparenti e mancano d1 contrasto quando
1u11onc ott1111a . Ie, è es'>Cn11ale utiliz re posto verso
. la lente' deIl'ob'1ett1vo.
. Per ottenere una mo· .
vengono osservati in un microscopio ott_cco. Per questa ragione, per visualizzare ogm detta•
, . zare un copnogg 11 •I d
d1 un 1attorc cnuco per ottenere , . e a atto alla lente dell'obiettivo: si tratt,1 glio dei componenti cellulari, è necess,mo contrastare 11 Lampione. Ctò può essere ottenuto
. un •mmagme ad I .
s1b1le ~e ti vetrmo copnoggetto e I a to mgrand1mento che sarà infatti impos· sia mediante meni ottici, utilizzando una specificJ rnnfigura21one del n11croscop10, sia me-
roppo spesso. '

140
Figura 4.i Metodi di COntra5lO per Um1cro,cop10 OIIICO
(a-b1 Conlronto tra 1mmagm1 mc.impochiaro (a) e 1 ·
sonati sulla cuticola d1 una ffi05<.a app,uono S<;Urc IU ;r:r~scuro lb);_ln que,te immagini le setole ~n-
bunche !u ~tondo nero, ndl'immagmc m campo
dovuto alla pr=za d1 pigmento.
c-dJ lmmagm1 m contrasto di fase di ceJlul•i·n e
-
estraile Ja un.a '>C(Juenza YJdco rrmr lapse (tl' tem rt'SCua mcohure dI· te;,uto. Sono presentate due immagini·
quenu mostra il mm1mentod1 unacdluladi ';?btraS<;orso tra le due 1mmag1m e pan a 5 mmuti). l..i se-
CO S1 noli il bnllante ·alone di f~• intorno alli:cll~~!arcoma ,ff.3 di topo e uno ,pe~~o fibroblasto cardia-
e f1 lmmagm1 m uintrasto a interfcrmu d ffi
Le unmJ.gim (<"!ed I fl sono nproJoue ptr ~~;nmJe di due piani focali dell'al~a multicellulare \'i.J/n>.t.
lll<XltlMl(A E Dllllll<,IA MO! t:c_ol.\Rf
~ 0 i.u-o, ndl 1mmagmc m campo chiaro (al, e
!<C\lro I J.11 colore icuro nelle setole piu grandi in (al è
0
·
conct11ionc di ~hchad Oav1dson.,
Ml< ROS( OPIA
141
d,ante colorazione del campione O • _
dt entrambi i metod·1 p . d. ppure_, p,u comun_emente, ricorrendo a una combinazione
· art, ,verse dell JI J
piegando d1fferent1 coloranti. a ce u a possono essere colorate selettivamente im -
Contrasto ottico
Il contrasto è ottenuto
.
mtrod d .
ucen o van e1emenll nel cammino ottico del m1ermcop1O,
.
usando
. lenti
. e filtri
_ che cambia J · à
no e propnet e a luce che passa attraverso 11 campione e ·11
d Il ·
sistema ottico. .S1. può ottenere semp11cemente
· ·
agg1ungen do un pezzo d1· vetro colorato, o un
filtro con densita n~utra, nel cammino dei raggi lummos,, o cambiando l'intensità della luce,
oppure regolando 11 diametro dell'apertura del condensatore. Solitamente tait operazioni
vengo_no mess~ a punt? fino a raggiungere un livello di contrasto dell'immagine acc.:ettabile.
Il sistema P'.U sempltee utilizzato nel m1eroscop1O ottico, che può essere ottenuto con il mi -
nor numero d1 elementi ottici, viene chiamato campo chiaro (cioè su sfondo chiaro). Il con-
trasto nelle immagini in campo chiaro viene solitamente prodotto dal colore del campiont'
stesso. La microscopia in campo chiaro viene quindi usata molto spesso per ottenere immagi-
ni da tessuti pigmentati, sezioni istologiche o cellule da colture tissutali sottoposte a colora-
zione artificiale (Fig. 4. 7a e 4.8b).
Molte configurazioni del microscopio ottico sono state specificamente introdotte, nel cor-
so degli anni, per aggiungere contrasto all'immagine finale. L'1llummaz1one in campo i;curo
produce immagini di oggetti fortemente illuminati su uno sfondo scuro (Fig. 4.7b e 4.Sa J.
Questa tecnica è stata tradizionalmente utilizzata per visualizzare 1contorni di oggetti in cam-
pioni liquidi (come spermatozoi vivi, microrganismi, cellule in crescita in colture di tessuto) o
per un rapido controllo dello stato di una preparazione biochimica. Per bassi ingrandimenti,
una semplice regolazione del condensatore adatta per il campo scuro è sufficiente. Per imma-
gini in campo scuro più sofisticate, a ingrandimento maggiore, è necessario ut1hzzare un con-
densatore per campo scuro unito a un obiettivo adatto.
Il contrasto d1 fase viene utiliaato per osservare cellule non colorate in crescita m colture di
tessuto e per il controllo di cellule e preparazioni di organelli per la lisi (F1g. 4.ic-d). Questo
metodo genera le immagini sfruttando le differenze nell'indice di rifrazione delle diverse strut-
ture cellulari. La luce che passa attraverso le parti p,u spesse della cellula viene ritard,lla rispet-
to a quella che passa attraverso le parti più sottili o del citoplasma. Quest,1 tec.:nica richiede con-
densatore e obiettivi spec1ah per contrasto di fase (entrambi contrassegn,111 con "ph"). C,a,1.u-
na fase del condensatore viene regolata m accordo con la fase dell'ob1ettivo. Qu~te sono sohta
mente numerate come fase I, fase 2 e fase 3 e s1 trovano sia sul condensatore sta ,ull'obietti\o
Il contrasto a interferenia ditfrrermalc: (DIC, D1flèn•ntial Interfere11ce Co11trast), una tecni-
ca dt m1<.:roscopia J intcrferenZJ che produce immagini con ombre in rilievo (Fig. 4.7e-f), \ 'te-
ne impiegata sia per l'osservazione di cellule non colorate , in colture di tessuto, uova o em-
bnorn), sia m combinazione con alcune colorazioni. Nel secondo caso la forma d 'in,ieme e 11
rilievo delle strutture sono visualizzate mediante la tecni1.a DI(, mentre alcune ~trutturc cel-
luJari sono ev1den1iate mediante un .ippos1to colorante (Fig. 4.81.).
La mic.ro~1.up1J m thmrc-sc.enzJ e attu.1lmente la tecnica a contrasto piu amp1.imcnte uuhz
zata (Fig. 4.9). Nella tecnic.i d'uso piu comune, la m1crP~cop1.1 otllc.J m ep1fluorescrn (Jove
il prefisso "epi" significa semphcemente~da ,opra"), la fonte di luce proviene da sopr.i 11 cam
pione e la )ente dell'ob1ell1vo funge si.i d.11.ondematore sta da ob1e1tivo (1-tg. t. lOJ. I.a lluore-
 ., EBICIOGIA \101..ECOLAIU
RO( IIIMI ~ MI( kOS< OPIA
143
142

figura 4.? M1uos.:op1a in tluores,en,,1 u•ntronto Ira 1mmagin1 in ep1l1uoro.:en1J e m rn1cro,,op1

loc.tk a ltuore,~n,a d1 un fuso m11mu.o marra10 mrll1ame marcatura per tluore,uuu inoirett on a
tubuhna (anticorpo pnmano l e mca,ame un anucorpo secondario marc.tto wn un.a mol.-cnla flu"
te. I 1mmagme dd campione e ,tata ottrnutJ ullhllando /a l la m1cro~op1a 01t1Ca 111 ep1f1,1<>rcsun
ven11on•1e e (be CJ utwuando la microscopia conhK,tlC a ,,,rn,wne la,er .)I noti I aa:re,,..1ut;i Il.i(•·
dei nucrotubuli nelle due 11nmag1111 conlocah (b) e (cl rl\pett.i all 1111mJi:111e co11wn11onale a I e r,
rappre~ntano due d11ter~nu regola110111 della molu11one dd m1crmwp10 wnfocal L 1rruna~111e b
ta ollenutd con una aperiura maggiore rispetto al 1mmag,
(Immagine riprodotta per gentile rnnce<,1nne d1 ilr d AI:-
e

Sene dt CCD

Filtro d1 em,si.,one

Lente

figura 4 8 hemp1 d1 d1tkrent1 preparmom IO m1uo,mp1a ottica (a) Immagine in campo scuro dt una
prcpara11one d1 >pt"rma d, ratto. Un"Jhquota proven1en1e d., un protouillo spernnentale t stata raccolta per Sorgente
valutare I ammontare del danno 111h110 da una popolrnone d1 \permato101 durante una wn1camine. Nella lum1noaa
pecch10 d,cromat,co
prepara11une po»ono esser< o,<erva1e vane ltslt d1 •J><:rma10,01 e le hbre della coda che " stanno sfila,
1.1ando ttrclciaJ. fhl lmma~me IO ,,1mpo chiaro di unJ nilormone per le proteine d1 una seztone, ottenut.1
con m1aotomo. d1 un o.:,h10 d1 mo,,a ,olomo con Uw1ma\<1t bnlhanl blue. (c) lmmal!ine con la tccn1<,1 Filtro d1 eccrtaz1one
DIC d1 un embrione d1 Drosop/11/11 colorato med1an1e colorallone per 11 1e,suto neuronale. La t~cntca DIL
torn,~ce I punii d1 nlenmenlo 11rutturah dell'm1ero embrione, uimemendo la colloca11one della colora110
ne \peohca per 111essu10 neuronale nel contC\lo ana1om1c~ Lente dtlll'obiettivo

scen1a ha avuto ~ucce~,? gra~ie alla po,,ibilita d1 ottenere marc,lture altamente specifiche dei
com~.ut1mcnt1 cellulari. Le 11nmagm1 solitamente sono formate da distinte regioni fluore
figura 4. JO Microscopia in ep,fluore¼enza._ La lu« pmvemente da una lampada ;ilio xeno o al mercurio
~centt (bianche) ~opra larghe reg1om non fluoresccntt (nere), che forniscono eccellenti rap· c~orgcnle di luce) pas,a attraver,o la lente e 11 filtro do e-.11a11om· ed~ nfl~;.1 dallu spccchm d1croma11to
portt segnale-rumore. La fonte d1 luce è solitamente una lampada a vapori di xeno O mercurio nella lente dell'ob1et11vo. Que,t'ult1ma mette a luoco la luce .ul «unp1one attraverso 11 fluido d11mmer"o
ad_ alta prc:mone, che emette_ lu,e d1 lunghezza d'onda compre,a tra l'ultravioletto e il rosso ne (solitamente oho) e 11 vetnno copnoggetll !,e11one in11rand11a). L.1 lu,e multante dall'e,c,ta11one fluo
(I 1g. 4.6). Filtrando una ,pecifìca lungheaa d'onda 1n grado di· ecc·t I I fl rc~cenie del campione tornJ 1nd1ctro attraverw la lente ddl'ob1et11vo e, po1d1e ha una lunghena d onda
, 1 are una mo eco a uore- maggiore della luce di ecc11a11one, pa,sa attraver,o lo ;pec,hio d1cnimat1co. li filtro d1 enwmone consc,ntc
SLente (o fluoroforo) presente nel campione (F,g 4 JO) s 1·0111· ·n I d" l h d' ,ola mente alla luce ,1ven1e la ,peulì,, lungh~,u d'onda_ d1 em1»10~1e del lluomcro1110 d1 interesse d1 pas
, · • , e e una uce I ung czn on·
da maggiore che produce I 1mmagme Nel · . \Me attravcr>o il rivelatore, 111 que,10 ,a~o un appar JtO CCI>, dove I 11nmagine viene quindi lormata
· m1croscop10 a fluorescenza, la luce viene filtrata
 Bll X IIIMICA l UIOW<,IA MOLEC'.(Jl.A.at

MIC NOS<:OVI A
144 teri~tiche di eccitazione e di emissio
. r le carat . a1· ne 14 5
ri specifici pc tre filtri princ1p i: un lt 1tro <l1 ecl. tali
om d i filt
i I tamente rJbella 4.2 <aratteristichc d • . .
uuhu.indo comb1naz1
O-
0
prestnll so 1 1 co) e un tilt r >,bam ~ra. montati in un ~ - ~--- ~ ei pnnc1pah fluorofon
•resse, :,on h" ato u1cro1 . ·1 fl
dd fluoroforo di int~ a11co (sp(SSO e ,am l'obietuvo. Per esempio, I uoroforo fluore. Colorante Eccitazione Emissione
ne, uno specchio dicro~ di sopra della lente del
~ingoio 1,11logg1Jmen10, a to ncnc tecitato ommbam4, )
ente alla lunghezza d onda d1 488 nrn e -- --
Huorofori comunemente impiegati
massima (nm ) massima 1nm)

meni<' us.t · m (Ta • ·• • · · h" Fluorcscema I FITC)

~lein.i, llllTlune d rn·r!)ionea 51 8 n •one della fluorescema ne tede che tutt -196
1mo I e suahzWI e Bod1py 518
prcscnlJ un mass J" ftltri d1 vetro ptr Ia v1 la pada siano bloccate, eccetto quella a 488 CY3 503 ~li
La rnmbina,Li~~: d~IIJ luce proveniente dJll~ c:iwione) che consente il passaggio della 554 568
fet rametilrodJmm.1
O 1 554 576
le lunghc:ne d • d ombik un filtro (filtro viene quindi diretta sul campione Per L,ssammJ rodamma
m· J tJk ,cupo" isp La lu.:e a 488 n 01 fl R.u),o h:xa~
572 ';90
n ' , d IUl<' a 488 nrn. . marcato con uorescema presente net 592
ma~\1ma quanut.. i . Q als1a~1 e1emen10 d 1 ( ·y~ 6)()
. - hw d1lrorna11co. u I luce J 518 nrn emes!,,l a c.Jtnpwne pa%a sia 652 t,7;!
meuo deIlo )pnl 488 nm; a · I 1 Color;1n11 per 11 nudeo
lJmp1one viene el Citato dalla luce auraver)O 1.1filtro 1 barriera e arriva a. nve . atore li filtro . dr
, toech,t H.342
ro dMomauco, SIJ a di pJssare attrav<'hO 11 rive 1 atore. ilS\tLuran 346 160
JttrJ\cr,o 1I filt
1 Il luce J 518 nm . VAPJ•
359 461
ne permette solJmcnte a a di rntere,sr tu r,1gg1unga ( per ultenon di:ttagli A ranc,o d1 acndmii
eml\,1U ti I fluorocrumo 502 526
fr,duro d1 prop1d1<1
do lhoolo il ,egnale emess~ / . 12.5 e lb. L!). . . . 536 617
ullJ tluorcsLenza, )I 1edano 11ar • 1 ·on due O pnt fluorouom1 ( m,trLdtura rnul11 l Ol<JJ
642 t>61
s d mp1l>nl mar,a i l • . Bromuro d1 elidi,,
Per ottenere 1mmJg1m ,1 ' 3 e pro"ettall per filtrare due o tre \pe(.Jfìche lun Omod1mero d1 ttld10
5 10 595
. . •flt po,wno esser r 528
plJ), 11t1'pecch1 lrnmJIICI ti n I
.,_, . mpivne ~ ,pe,so troppo b.i!>SJ per c~erc coh,1 dal- Feulgm
617
lJtuon dctl'mtenallo <l1 Iung hczze d'onda rilevabile 570
ghem· d,onda. La Il uorNenza ernc,>J u.u aldi ·
lnd1uitori di alcio
625
l'u.-h1u umJnu oppure plttreblxe~l)ert Ontano (Fi". 4.6). Un semibile apparecchio fotogra- Auo -3
. . esemlllo ne ro'-o I r 506 526
J.1ll o,,h1u um.1110. per r _ P\I f mdJ l,1dlmente questi 5cgnah. Verde c.ilc10 506
filo d1g11Jle, per e,empw un CCD o un . . 533
'-folecole reporter
Protema fluorescente verde (G~P) 395/4119 509
Colora11onc del campione V\Rt-d 558 583
· dotto nel lamp10ne utilizzando uno o più coloranti. Questi Mitocondri
Il contrJ,to può e,,ere mtro . . .
possono e,sere non spc,11•1•
• ·r. come il Coom,1me bnlliant blue che colora tutte le proteme
. . d • JC-1 514 529
f r n org.1ndlo per esempio il nucleo, 1m1tocon n eccetera. Per colo- Rodamma 123 :07
(f1g. 4.8), o spw ICI pe li ' u· b' . . d" . 529
rJrc d1,cren 1I org.. e 1n ,·olon
.f' •n •Ut , contra5tanti• possono essere ut. 1zzate
. com . maz10m
. , p1u
... • llAPI. ◄',6" Jumidino-1 fcruùndolc.
coloranll. Sohtamente, moli! culoranll 1,tolog1c1 vengono visua!Jzzat1 mediante 1mmagm1 m
,.,mpo chiJro. Altre tecniche d1 microscopia ottica possono essere im~iega_t~ per osservare
l'intero tessuto con1emporJneamen1e alle porzioni colorate; per esempio, utilizzando la DIC Una tecnica correlata, 1'1bnda21one 111 ,it11 m fluorescen1:1 FISH, Fluorescence In Situ
per o,servare l'intera morfologia di un embrione, e un colorante per ottenere l'immagine del- Hvbridizat1011) utilizza la spec1ficita di sequenze d1 DNA o dì RNA marcate con molecole
1.i distnbozione ,prnale della proteina di interesse, all'interno dell'embrione (Fig. 4.8). fluorescenll. Le ~onde di acidi nucleici vengono 1bndate su cromosomi, nuclei o preparazio-
Con l,1 mKro,lop1a in fluorescenza vengono solitamente utilizzati coloranti più specifici. ni cellulari. Le reg10m che legano ù marcatore vengono visualizzate utilizzando la microsco-
La m"roscopia m 1mmunofluore5eellZ,l viene impiegata per determinare la distribuzione pia in fluores..:enza. Nella stessa preparazione, sonde differenti possono essere marcate con
spaziale d1 mJcromole.:olc in cellule e tessuti. li metodo si basa sul legame altamente specifico J1fferenu fluorocrom1. La FISH a colori multipli "lene ampiamente impiegata per la diagno-
tr.i ant1corp1 e proteine. Gli anticorpi vengono prodotti contro la protema d1 mteresse e mar- ,·, clm1ca di malattie genetiche ereditane. Questa tecnica e stata applicata per la rapida identi-
~.1tt con unJ sond.i fluor~ente; il legame anticorpo-proteina determma, quindi, la marcatura ficazione d1 anomaJie cromosomiche e nucleari in malattie ereditarie, per esempio la sindro-
dell.i prot~ina di interesse, che puo essere v1sual1z.zata utilizzando la microscopia a fluorescen· me di Down.
za. In pratica, le cellule vengono normalmente marcate utilizzando I ,mrnunol1uore~.:en1a ir Per le analm d1 fluorescenza sono dispombili molti tipi diversi d1 molecole fluorescenti
dm·tt.i. In qu~to ca~o. I anticorpo contro la protema d1 interesse ( ,rnttcorpo pnmano) viene che possono essere attaccate a sonde quali ant1corp1, DNA o RNA (Tab. 4.2 ). Tutti questi rea-
maf(ato con un secondo anticorpo ehe porta II marcatore fluorescente ( anticorpo seLon · dJ genll, inclusi gli anticorpi pnmari, sono disponibili commerc.1almente oppure, frequente-
n,1). Que:.to tipo di pro1ocollo produc
.. fl . •
e un segn e uorescente maggiore d1 quello ottenuto
al mente, sono formt1 dagli stessi laboratori che li producono. Un settore m attivo sviluppo i! la
ut1lruando un smgolo ant1Corpo eh è produzione di sonde fluorescenti piu bnllanti che vengono eccJtate da mtervalli di lunghezze
e stato marcato con sonda fluorescente (Tab. 4.1 ).
 a1r1(1U\!ICA E 8(~1L(l<,IA M()lfLOIAR[
Mll:R(l'){OPU

146 h. 147
·nosa (fenomeno c 1amato
•. -·1 zione Iumi fl
, ate dall e-:.i a ti vi sono la uore-
d onda minori e non ,engono danneggi . . . ueste sonde fluorescen . .
·"o.tob'l,:a I
p.. ) lì
( m,g . ra gli esempi orma• dass
_ ic1 d1 q . t'
. 1 d0 no t coloran t e d ,Ila serie Alexa
. e. t coloranti
. .
~,eina e la rodamina. Esempi più recenti 10' u . d Ile sonde fluorescenti per •m~agmt ~
t
c1anmid. Una delle ultime acquisizioni nella liS a e fl rescono ma risplendono m colon
rappre~entata dai puntt q,,1nti.:1, nanocnstalli che non d uo U dimensioni d e1· pun 1·I e h anno il I I J
dipendono a e 1
diversi se sottoposti alla luce laser. I coIon I
- ,I - - ,I - -•- H
I

I
vantaggio di non subire photobleaching. A A A
\ -· \ --·\ G K
I
4.3 Sezionamento ottico
A
. . essi prodotte usando la microsco-
Molte immagini raccolte da camptom relatwamen~e sp d' erché l'immagine è formata
r1., m t:p1tluorexenu, non sono abbastanza.chiare.d Ciò
11
acca e P
fl
. .
scenza sopra e sotto il piano fo-
dal piano ottico di interesse insieme al contnbuto e a uore • nale raccoglie tutte le in-
.. . . . . . ifl rescenza convenzto
cale d1 mteresse. Poiché il rmcroscopto m ep uo . I La " fluorescenza
formazioni dal campione spesso viene defmito microscopio a campo .irgo.. h d
' li - iche optoelettromc e per pro ur-
non a fuocon può essere rimossa utilizzando mo1tep ct tecn
re ><::.'toru ottt~he (Fig. 4.9). •· . . . del cam ione iù sotti-
Con il termine SC2.1one ottica si intende un 1mmagme mtcroscoptca P P .
le di quelle prodotte utilizzando un normale microscopio a epifl~?resce~ a campo ampio;
F
tale risultato è ottenuto mediante la rimozione del contributo all tmmagme dovuto alla luce L
fuon fuoco e, nella maggior parte dei casi, senza ricorrere al s~ion~e~to fisico ~el ~essuto:
Questi metodi hanno rivoluzionato la capacità di raccogliere 1mmagm1 da camp1001 spessi Figura 4.11 Schema del flusso di informazione m un m1cro.cop10 confoale a scansione laser. I.a luce prO\c.-
niente da un laser (A) passa allrave™> un filtro a densità neutra ( 8) e un filtro d1 e.:,11az1one (C), nel suo
marcati con molecole fluorescenti, come uova, embrioni e tessuti. Sezioni ottiche possono es- cammino verso l'unità di scansione (D).Quest' ultima produce un fascio di scansione sul piano fu.:ale poste
sere prodotte anche utilizzando ottiche DIC a elevata risoluzione (Fig. 4.7e-f). riore della lente dell'obiettivo (E), che mette a fuoco b luce sul campione (F).li campione viene anahuato
nelle direzioni X e Y. in un percorso di scansione, e nella d1rez1one Z mediante una me~ a fuo-;o fine (le tre,
ce indicano il movimento della lente dell'obiellivo E). La fluo~s,enza proveniente dal campione torna ind,e
4.3. l n microscopio confocale a scansione laser tro ,lllraverso la lente dell'ob1e11i,·o e l'unità di scansione, e viene d1~11a ~r meuo dello spe,:,hio d,,romah
co {G) verso tre minuscoli fori (H).Questi agiscono come filtri spaziai, l'(r bloc,arc tutta la lule pn1'eniente
u sezioni ottiche vengono prodotte nel m1croscop1O confocale a ,cam1one la~er (l.SCM, da sopra e da sotto 11 piano del campione a fuoco. li punto d1 luçc nd campione è conti.x;ale con l'al'(rtura dl l
forellino. Questo significa che solamente regioni distinte del campione ,engono analizz.ite l..i lucc ,he pa~
1.Aser Scanning Confocal Microscope) mediante la scansione punto per punto del preparato con allraverso i forellini colpisce i rivelatori PMT (I) e il segnale proveniente Ja questi viene tra,tormato 111
un raggio laser focalizzato sul campione, utilizzando un filtro spaziale, sohtamente un minu- un' immagine nel computer (I), L'immagine viene v1suali1.zJta sullo schermo d, un ,omputer (K) ,pe\so ,o
mc tre immagini in scala di gngio (Kl, K2 e 10) insieme a un'immagine a ,olon ottenuta Jalla tu,,one ddle
scolo foro o fessura, per rimuovere la fluorescenza non desiderata proveniente da sopra e sotto
tre immagini in scala di grigio (K4 e Fig. 4.13a, tavole a colori p. 7b0). li computer ,in,ronizu gh ,pc.,h1 J1
il piano focale di interesse (Fig. 4.11 ). La potenza dell'approccio con focale deriva dalla capacità scansione con la costruzione dell'immagine sullo '1<:hermo e controll,1, inoltre, numcro,i d"?O"'", l'(nlcn
dì fornire immagtm di strutture a livelli discreti all'interno di campioni biologici intatti. ci. Per esempio, controlla i movimenti di uno strpprr motorcollegato alla reg,,lazione lìnt' Jclla me"a a fuo~o
Esistono due principali vantaggi nell'uso della I.SCM rispetto alla microscopia ottica in e li coordina con l'acquisizione dell'immagine allo scopo d1 produrre una '>erte Z. li computer u>ntr<>lla ~n
che l'area del campione che deve e~ere analiZZJta dall'umt.ì d1 scan,ion<", m modo ,he pos.'wl e"erc taulmen
ep1fluoresce~za conve~zion_ale. I ~iflessi_ provenienti dalle strutture non a fuoco nel campio- te ottenuto un ingrandimento eseguendo la scamione d1 una zon~ più pi,wla del ,amp1onc. In quc~to mo
ne sono deetsame~te n~oth e la rnoluz1one è aumentata sia lateralmente, lungo le direzioni do, viene assegnato a un singolo obiettivo un inten allo d1 ingrandimenti '°""he 11 ,amp1one non Jehha cs
sere mosso quando viene cambiato l'ingranJimento. le 1mmag1111 vengono reg1'tr;ite ,ul d,s.:o tìs,o del ,om
X e Y_(0.14 µ~), sta ass1alm_e~te, nella di~ez•?ne Z (0.23 µm). La qualità delle immagim di puter o esportate in diversi disposihv1 per la v1suah11a11one, la ,1.1mpa o l'ar,h1,·1a11one ( L).
camp1001 rel~llvamente 5:<>tt1b, per esempio dt corredi cromosomici e di lamellipodi di cellu-
le m crescita m colture d1 tessuto
. (< 0.2
. .µm di spessore J, non v1·ene m1g· 1·1ora a s1gm
· · fi1cat1va-
·
1
mente dalla LSCM, mentre 1mmagm1 d1 campioni piu spessi, come emb noni· p1unce · 1u Il ari· La LSCM ha trovato moltcplic1 apphca,ioni in ,.impo biomedtl-o; akune di que,tc ~,,no
marcatt con molecole llu~rescent1, pos)ono essere ottenute ~olo utilizzando la l.SCM. Per st,lte re~e possibili dall,1 l..lp,1cit,\ dello ,trumento di produrre un,1 ,ene d1 ,enom 0111,he a m
buone 1mmagtnt confocali, dovrebbe essere impiegato un nu · · d" , • terv,11li d1scre11 attravcr,o 11 campione ( hg. -t ,12). I e seziom Otlllhe ralulltc, ,on un 1111,ro
mero nummo 1 ,otom per ec
cttare ciascuna sond a fl uorescente che marca 11 campione m t scopio confolale, lungo l.1 d1rcz1one Z (sene Zl ~ono tutte in c,att.1 wrn,pundl'nza tia lor,i l'
,. ·
b 1II! d 1101001 ·d
emessi .11 11 uorocrom1 dovubbe attraversa 11
• en re 11 maggior numero poss1- · pO))OllO c),ere umte per formarl' un'un1,,1 proiaione ddl'1mmagme ( pr 11 I n 7) o una
to fino al rivelatore re cammmo otttl.O dello strumen-
rapprc,enta1ionc tridi1m:n'1011,1lc ddl'1111111.1ginc (rt o tru 1011 \l)).
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Figura 4 1-1 llluminaz1one nella microscopia a campo ampio, confocale e a fotoni multipli. La figura mo-
stra una veduta laterale schematica d1 una cellula marcata con una molecola fluorescente su un vetrino da
microscopia. L'area m colore scuro rappresenta 11 volume di eccitazione fluorescente prodotto ndla cellula
d · me ,onfocale (a) Sed11.1 sezioni 0111 da ciascuno dei tre diversi microscopi. La microscopia in ep1fluorescenlil convenzionale illumina attraver
figura 4.12 Rico,1.ru11onc 1nJ1men11onak al computer I un •m,mag . la PtK I uilorata con anticorpo so l'intero spessore della cellula. Anche nella LSCM l'illuminaz1one fluorescente attraver~a mteramente la
che in ,ene raccolte a intervalli d1 O3 um d1 un Ju10 m11ouco ut uua ce11u . z cellu!a, ma l'apertura pos~a di_ fronte al rivelatore esclude la luce fuori fuoco dall'immagine. Nella micro-
'
antl-lubuhna · r '
e con un ,ecundo anticorpo marcato ,on rod anuna t;1• ndo.
un programm,1
Id lì perd Isene ,, un scopia a fotoni mult1ph, I eca1az1one avviene solo sul punto a fuoco, dove 11 flusso d1 luce ~ suffic1ente-
'
numero predefinito d1 ~"uen,e puo e1,ere !>Ommalo e I immagm e tra,lcnta. su 1,co
b R isso e computer.
. •d mente elevato.
lo ,trpptr motvr mumc 11.,controllo fine della me,sa a tuu,o a mcremen u preh1>-1t1 · ( ) 1costruz1one
I In i-
men,ionale ddl',mieme di dati prodotta uuhu.ando un programma per la ncostru11one 3D a co~puter
Que,to genere d, programmi può rs~re ulihzuto per v11ualunre la 1ene d1 dati da angoh spectfìCJ o per
produrre video 31) della strultura m rotazione 4.3.3 Le immagini a fotoni multipli
Il microscopio a fotoni mult1ph costituisce un'evoluzione del microscopio confocale. In-
Immagini con marcature multtple possono essere raccolte da un campione marcato con fatti, molti strumenti utilizzano lo stesso sistema di scansione della LSCM oppure il sistema a
piu dt una sonda fluorescente, usando per l'ecdtazionc sorgenti di luce laser multiple (Fig. disco rotante. La differenza risiede nel fatto che la sorgente di luce è un laser a impulsi ad alta
4.13, tavole a colori p. 760). Poiché tutte le 1mmagm1 raccolte alle diverse lunghezze d'onda energia, con lunghezze d'onda regolabili, e i fluorocromi vengono eccitati da una molteplicità
d1 e(c1tazione sì trovano IO esatta corrispondenza, è relativamente facile combinarle in una di fotoni, anziché da fotoni singoli. Le sezioni ottiche vengono prodotte semplicemente foca-
singola immag111e mult1colore. In questo caso, ogni sovrappos1z1one di colorazione viene vi- lizzando il raggio laser sul campione, in quanto l'eccitazione di un fluoroforo con fotoni mul-
sualizzata come un'ulteriore variazione di colore. La grande maggioranza dei microscopi tipli avviene solamente quando i livelli di energia sono sufficientemente elevati - statistica-
confocal1 è 10 grado di produrre immag101 utiliu.ando tre o quattro lunghezze d'onda con- mente limitati al punto di focalizzazione dell'obiettivo (Fig. 4.14).
temporaneamente, e alcuni strumenti piu moderni possono rivelare e separare fino a 32 dif- Poiché nel microscopio a fotoni multipli viene utilizzata la luce rossa, le sezioni ottiche
feren ti lunghezze d'onda. possono essere raccolte da punti del campione situati più in profondità, rispetto a quelle rac-
colte con la LSCM. La microscopia a fotoni multipli viene generalmente impiegata per otte-
4.3.2 Il microscopio co11foca/e a disco rotante nere immagini fluorescenti di cellule viventi; queste, infatti, riportano con la luce rossa dan-
ni inferiori rispetto a quelli provocati dalle lunghezze d'onda più corte, utilizzate con 11 mi•
li 1111,ro,copro ,onfo,Jle J d1,_rn rntank utilizza un s1·stem d. · d ,.,. d I croscopio confocale. Inoltre, poiché l'eccitazione del fluoroforo è limitata al punto d1 foca-
. . a I scansione 111erente a que -
lo della LSCM. An11che con un singolo raggio il campione vi'ene col ·t lizzazione nel campione, vi è una minore possibilità di ~ovraeccitare la sonda fluorescente
• p1 o contemporaneamen-
te e anal_1zzato da numerosi raggi, e le sezioni ottiche vengon · I • I I (photobleaching), provocando il danneggiamento del campione stesso.
. . . . o v1sua 1zzate m tempo rea e.
moderni m1croscop1 a d1\co rotante sono stati migliorati sigo·fì t' dal('
. . 1 ca 1vamente aggiunta allo
strumento d1 sorgen!I d1 luce laser e rivelatori CCD dr alta l"tà •
1 • 1s1stem1. . •
·1 I ·
uu izzano genera mente IO esperimenti nei qualt vengon0 qua I • a disco rotante s1 4.3.4 La deconvoluzione
11one a velocità. elevata (ele\ata nsol · •a1 racco te 1mmag101· ad alta ns · olu-
. . . . . uz1one spazi e e temporale) e ven ono utilizzati erse- Le sezioni ottiche possono essere prodotte utilizzando un metod?. di processam_ento d~Ue
guire, rn cellule v1vent1, la d10am1ca di proteme marcat g p immagini chiamato deconvoluzione, che consente d1 rimuovere dall 1mmag10e d1g11ale le IO-
e con mo1ecole fluorescenti.
 Bl(X..flL\tlCA E RiOlCX;IA MOLECOLAR{
~ti( RO-C'OPIA
151
150 . te l'uso deI compu t er, a partire
·
to mcd1an . ,, d . . ghezza d'onda corta causa ma - . d
. viene ottcnu ' . . no due 11p1 10n amentah d1
formazioni fuori fuoco. Tale risultato ·o convenzionali. Esisto J'tà di immagini co - nuta con un colorante eh gg1on anm cellulan d1 una v1sualizzalione del citoplasma otte-
1 e viene eccitato nel rosso lontano
da immagini in microscopia a campo ampi è . miglioramento della qufa . d' d's . n 0 ccorre grande cura per mant . ·
. . bi ,~(c10 11 d Jla unzione 1 1 persiane
algontmi di dcconvoluz1one: d,· 1117/1•' . Ila conoscenza e . vitale In genere per ·1 enere i1 tessuto sul portaoggetti del m1c.roscop10 allo. ~tato
. . . L' wo s1basa su • solitamente misurata me- · , montare I campio .
fuse, indistinte) e nprist1mi appro ,. J inc. Questa viene ' . camera per cellule \'lvcnt ra ne su1 po~taoggetll del m1cro~cop10, è necessaria una
dei punti del sistema d1 ottenimento dell m1m g sempio una piccola particella fluorescen- . ~ ppresentata essenzialmente da un vetnno modificato con un
i me per e ·1 . d' ada tiamen to d eI copnoggett'I h , -
diante l'imm.agine di una sorgente punti or . ' (O1 m) osservando come I punto viene 1- e e consente I accesso al campione da parte dell'obiettivo e del
. d' · luz1one · µ ' · li d bb cond ensatore. La camera inolt • 1 .
te di dimensioni inferiori al hm1te I nso . eale della parttce a e a essere un . Il d' . ' re, mantiene e cellule m un ambiente costante e, a seconda del
. . . • he l'immagme r . · Il tipo ce uIare I interesse fo · · ·
sperso nel mtcroscopIO. Poiché s1 assume c . . ll'immagme della part1ce a generata . . • rnisce temperatura, um1d1tà, pH e livelli d1 biossido di carbonio
eI o .ossigenofacostanti Molte camere perme ono I mirod urre fl u1d1
ti d' . . . o d1. pcrfondere la prepa
punto, è possibile calcolare I entlt e a' . à d Il distorsione. d' ni're ripnstinata ut 1zzand o una f un-
ne . il' .·
ò qum I ve razione con rmac1 per trattamenti sperimentali.
dal sistema. L'immagine reale del punto pu . . •successive raccolte nelle stesse con-
. Ile immagini
zione matematica, che può essere appI1cata a
dizioni operative del microscopio. . no relativamente lente; per esempio, 4.4.2 Imaging a i11terval/i di tempo (time-lapse)
. . . . d' d' d convoluzione era .
Le pnme vers10ni dei meto 1 1 e nalizzarc al computer una singola
. . .
con alcuni algontm1 potevano essere ne
cessarie ore per a ' '
f
.
vanzati la deconvoluz1one è oggi ~ immagi~i ti11:e-lapse, raccolte a intervalli di tempo predeterminati, sono ut ilizzate per lo
. . . . d . mputer e a so tware a , s~ud10 delle dina~1che cellulari (Fig. 4.13c-h, tavole a colori p. 760). Solitamente, viene posi-
sezione ottica. Grazie a1 mo erm co . , · confocale per produrre sezioni
. , 'd ·1 d è f ontab1Je con I approccio zionato n~I cammino ottico un dispositivo a otturatore, in modo che questo sia aperto solo
moIto pm rapi a e I melo o con r . ottenere immagini di cellule
. h La d 1 . resenta un metodo pratico per quando viene raccolta un'immagine, per ridurre la quantità di energia luminosa che colpisce
otuc
. e.. econvo uz1one rapp • I le ed ecce e nei con fronti' dei metodi a scan -
li ·
le cellule. Quando le immagini vengono successivamente riprodotte, viene generato un video
v_1vent1 e fissate,_marcate ~?n mo1_te~11c1 mo :'o . ' ·v mente deboli e sottili, come le cellu-
s10ne nell'ottenimento d11mmag1m d1 campioni relati a . . . del processo di interesse, accelerato rispetto aJ tempo reale. Le immagini time-lapse sono ut1h
Ie d 1. 11ev1to.
· · Questo metodo pu ò anc he essere utilizzato. per .nmuovere 11 segnale . d1. fondo per studiare sia il comportamento delle cellule in tessuti ed embrioni, sia le dinamiche delle
·
d aIle 1mmagm1 · · raccoIte con Ia LSCM , con la microscopia a disco rotante o con 11 mtcrosco- macromolecole all'interno delle singole cellule. Il fenomeno di interesse, insieme alla quantit.l
pio a fotoni multipli. di energia luminosa assorbita e tollerata dalle cellule, determinano l'intervallo di tempo uti-
lizzato. Per esempio, una cellula in una coltura di tessuto si muove a velocità relativamente
bassa e potrebbe essere adatto un intervallo di tempo tra le immagini di 30 secondi. Per otte-
4.4 Imaging di cellule e tessuti viventi
nere buone immagini tune-lapse, è estremamente importante la stabilità del campione e del
Esistono due approcci fondamentalmente differenti per ottenere immagini di eventi bio- microscopio; per esempio, il fuoco non dovrebbe essere modificato durante l'esperimento.
chimici nel tempo. Uno consiste nel raccogliere immagini, da una serie di tessuti fissati e colo- Tutte le forme di microscopia ottica possono essere utilizzate per la produzione di immagi-
rati, ottenuti a tempi successivi deUo sviluppo; ogni immagine rappresenta un singolo punto ni time-lapse (par. 4.2.3, 4.3). Il contrasto di fase è la tecnica tradizionalmente adottata per ot
temporale nell'esperimento. In alternativa, lo stesso tessuto può essere osservato mentre è an- tenere immagini dei movimenti cellulari e del comportamento di cellule in crescita in colture
cora vitale, durante il suo sviluppo, catturando direttamente i fenomeni di interesse. La secon- tissutali. La DIC o la microscopia in fluorescenza vengono generalmente scelte per raccogliere
da metodologia, basata sull'osservazione di ceUule e tessuti viventi, è tecnicamente molto più immagini dello sviluppo di uova e di embrioni. I metodi di visualizzazione computerizzati
complessa delJa prima. possono essere utilizzati insieme alla DIC per migliorare la risoluzione. In questo caso, un'im-
magine di fondo viene sottratta da ciascuna sequenza time-lapse e il contrasto delle 1mmagm1
4.4. 1 Evitare gli artefatti viene aumentato elettronicamente. Ciò consente, per esempio, di visualizzare 1 microtubuli
assemblati in vitro a partire dalla tubulina, in presenza di proteine associate ai microtubuli. Le
L'unico mo_do per eliminare gli artefatti dalla preparazione del campione, è osservarlo men- immagini cosl ottenute sono al di sotto del limite di risoluzione del microscopio ottico. Que
tre è ancora :,i1taJe. Molti_ c_ampioni v\tali_sono sensibili alla luce, specialmente quelli marcati ste preparazioni hanno costituito la base dei SJgg1 Ji molllita per le proteme contrattili, per
con• coloranti
• • •
fluorescenti,
• •
m quanto I eccitazione di fluoro'or
1, 1
· neila cellu Iarad'1-
· può rilasciare esempio chinesma e dineina.
cah hben c1totoss1c1.
, Inoltre,
., alcune lunghezze
., d'onda sono p'm' dannose d'I aItre; generaln1ente,
le. lunghezze d onda
. . pm . corte sono pm dannose di quelle pi·,u Iung he e, per ottenere Ie 1mmag1-
· · 4.4.3 Colorazione f111oresce11te di cellule viventi
ni, la luce nel v1Cmo mfrarosso è preferita a quella ultrav'ioletta (F' ) ['' · , d
1g. 4.6 . mtens1ta e a uceil I
non deve compromettere le cellule: a tale scopo si utillZZa' · • Solo un numero piuttosto basso di cellule possiede fluorescenza intnmeca ( autofluorc-
• fl · 1 . ' no intensità estremamente basse, co-
loranti uorescentl re auvamente brillanti e fotorivelatori altam . .. . . ,lCJIIa), sebbene alcune molecole endogene, per esempio 11 NAD(P)I I, si.mo fluore,centi e
delle cellule può dipendere a h dal . ente sens1bi11. Inoltre, la v1tahtà pos~ano essere utilizzate per ottenere immagini. Molecole fluorescenti re!Jti,-.imcnte pi.:cole
. ne e comparllrnento cellulare h è il fl -
rocromo. Per esempio, visualizzare il nucleo con e e stato marcato con uo vengono inserite in cellule viventi utilizz,mdo molt1 metodi d1ffcrcn11, che mcludono IJ dittu-
un colorante che viene eccitato con una Iun-
 SU>< fll\llC:A f BIOLOGIA MOLECOLARe
MIC R( >SCOPIA
l'i2
153
(e)
lbl
lel
Serie Z a singola
lunghezza d'onda
4
Lunghezza d'onda
lmmag1n1 nel tempo
1t1me lapsel a singola multipla
lunghezza d'onda

•
Variazione
nel fuoco
I
j

Variazione
nella
Variazione t lunghezza
d'onda ~
nel tempo ~
◄ y ........
X ..

I igur,1 t. 15 tmagmg multidimensionale. (a) fwta 71one nel tempo a singola lung~eu~ d'onda (o time-
lapse .\,l' 1magmg); (b) serie z di un'immagine lungo le d1remm1 X, l e Z. l.i combm,mone d i (a ) e(.~) è
un'nn magme in 40. (e) lmmagme a lungheza d'onda multipla LI wmbinallone d1(a), (b) e (c) è un 1m-
magme m SD.

sione, la m1croiniez1one, l'inserimento mediante particelle e l'elettroporazione. Proteine più figura 4 16 Uno stereom1crosrnp10 per ricerca. 51 nott che la sorgente di luce è po,ta lateralmente, caratte
grandi, marcate IO modo da renderle fluorescenti, vengono abitualmente iniettate all'interno nstJca che puo dare un effetto d'ombra al campione: nell'e,emp10 una fiala dt moscenm. 11 grosw ob1e1t1vo
delle cellule, poiché dopo un certo tempo vengono incorporate all'interno del pool delle pro- posto sopra 11 campione puo e,sere ruotato per mgrandire l'tmmagme (zoom ).
teine cellulari e possono essere utilizzate per ottenere immagini.
Molte molecole reporter sono ora disponibili per studiare l'espressione di specifici geni in
cellule viventi, utilizzando la microscopia in fluorescenza (Tab. 4.2). La proteina fluorescente ging 5D. È attualmente disponibile un software per l'analisi e la visual!Z7azione di serie di dati
verde (G FP, Grce11 F/11orescent Protein) è un reporter dell'espressione genica molto pratico, in 4D e 5D. Per esempio, puo es~ere seguito il movimento d1 una struttura attraverso un gran
quanto d irettamente visibile nelle cellule viventi, utilizzando la microscopia ottica in epifluo- numero di immagini consecutive, possono essere misurate variazioni di volume di una strut-
r~scenza con co1_nuni combinazioni di filtri. Il gene della GFP può essere legato a un altro gene tura, e sequenze di dati 4D possono essere v1suahzzate come sene di proiezioni nella d1rez1one
d1 mteresse, cosicché l'espressione di quest'ultimo è accompagnata nelle cellule viventi dalla 7 o come video stereoscopici. Esperimenti multidimensionali possono presentare difficoltà
fluo rescenza della GFP, senza necessità di fissazione, di substrati o coenzimi. La fluorescenza per la notevole quantità di dati che deve essere trattata, in quanto da un singolo esperimento
della GFP è estremamente brillante e_non è soggetta a photobleaching. Varianti spettrali della in 4D possono essere raccolti dati che occupano gigabyte di memoria.
GFP e al_tre ~olecole reporter, come~ DsR~d, sono ora disponibili per marcature multiple di
cellule
. . viventi.
. Queste
. sonde hanno nvoluz1onato la possibi'li'tà di' ottenere 1mmagm1
· · · d 1' ceIlu Ie
4.5 Stereomicroscopio
viventi e d1 tessuti con la microscopia ottica.
Un secondo tipo di microscopio ottico, lo ,t rl ,m1crnsrnp1n, viene utilizzato per osservare
4.4.4 Imaging m11ltidimensionale la superficie d1 grandi campioni (Fig. 4.16). Questo strumento è particolarmente utile quando
sono richieste informazion i 3 D, per esempio per l'osservazione di interi organismi ( Fig. 4. I 7,
La raccolta, nel tempo, di serie nella dimensione z v·e h' · . tavole a colori p. 761 ). Gli stereomicroscopi sono indicati per la micromanipola11one e la dis-
. . 1 ne c tamata 1mag10g tetrad1mcns10-
n,1Je ( 4 D ) ; con questa tecmca, le smgole sezioni ottiche (d · · · sezione, operazioni che richiedono un grande campo v1s1vo e la possibilita di aumentare o di-
differenti profondità nel campione (d' . Z) . imen~io~• X~ Y) vengono raccolte a
imens1one , IO tempi d1vers1 ( d' . ) m inuire l'i ngrandimento. Un'ampia gamma d1 oh1ettiv1 e oculari è disponibile per differenti
cioè una dimensione nel tempo e tre nello spazio ( F'1 4 15 I 1 quarta 1mens1one ' applicaz1oni. Le sorgenti lummose possono essere poste sopra o sotto il campione, o cm.on•
nel tempo anche lunghezze d'onda mult' 1 Q , gj . · ). no tre.' possono essere raccolte
tp e. ueS t u timo approccio è stato chiamato ima- dare quest'ultimo mediante una I 1ct' .iJ ,meli,, oppure essere situate lateralmente, per dare un
 Blll\:111\11< \ I lllll!IX;!\ MOLI UllAAI
\11< Rlh<<llH
1,-1 l'iS
. . J""'iungono contr,1sto o effetti
. . . ' li d1 ,llun11n,17lone ""' . . . fl .
cltetto d, campo ,.:uro. Que,u d1ver,1 Jngo .b h sten:onucrost0pt tn uorescenz.i
. . ·100(tre d1spont 1 · . •
d1 ombre 111 rilievo ,,Ile 1mmJg1ni Sono . . t con GFP e sue v,mantl.
. ,, •mu mJrlJ i
utihn,111 per l'analisi d1 tessuti anim,11I trJm,,t

4.6 Microscopio elettronico

4.6. 1 Pri11cipi
d è nchiestJ t,1 mJggior ri,oluzionc possi-
la m1Lro,cop1J
• • ckttnrn1eJ . v,ene .ut1hnata
· I o · ·o (ME) nve
qu,111 . I,mo I' uItr,,,tru tt urJ deIl e
bile. le 1mmag1111 prodotte III un m1aos,op10 e cttrontl . . . .
· Il I E · d · d {li • d. · opt' •lcttronicr 11 n11Lro,u1p10 ekttmntLO ,1 tr,1
Le u e. s,stono ue t1p1 1 erentt I nucrosc ' · MET 1•. · ~
• . (MES) Ne1 · , 11nmag111e" ge-
,m",1onc (MET) e 11 n11uo,u1p10 clcttrOnllll J sc,llhlOllt
· · ·1 ·
. I
• nel MES' gh e ettroni ,ono n essi
·n .
nerata dagli elettroni che passano anraverso I ca111p1onc, .
dal campione (deuroni \ccond.ml e generano un'immagine dellJ sti.1 rnperfìcie.
l'equivalente della sorgente d1 luce in un microscopio elettromco ~ rappre~entato d,il ~an.
none elcttromco. Quando uo alto voltaggio, compreso tra 40 000 e 100 000 V (voltaggio d1
accelerazione) viene fatto passare tra un catodo e un ,rnodo, un filamento d1 tungsteno emet-
te elettroni (Fig. 4.1 ). Gli elettroni caricati negativamente passano attr,werso un foro nel-
l'anodo formando un fascio elettronico, che passa successivamente attraverso una serie di
lenti elettromagnetiche (wlonnal, la focalizzazione del fascio di elettroni viene ottenuta
cambiando il voltaggio applicato trasversalmente alle lenti elettromagnetiche. Quando il fa-
\Cio di elettroni passa attraverso il campione, alcum d1 essi vengono dispersi, mentre altri
vengono focalizzati dalla lente del proiettore su uno schermo fosforescente o registrati utiliz-
zando una pellicola fotografica oppure una macchina fotografica digitale. Gli elettroni han-
no un limitato potere penetrante, ciò s1gnifìca che il campione deve essere sufficientemente
sottile (50-100 11111) per consentirne il passaggio.
Campioni più spessi possono essere osservati impiegando voltaggi di accelerazione più
elevati, come nel m'.lro,copm det~ronilO ad alto wltagg10 (HVEM, High Voltage Electron
Mteroscope), che .uuhzza un voltaggio d1 accelerazione . d1 I 000 000 V, o nel lllllro~copm
· · e Iet Figura U8 Microscopia elettronica a 1ra;m155ione. (a-e) Se110111 ultratìni in Epon ((,() nm d1 ,ptewire) d1
1romrn ., volta~10 111tc:rrned10 (IVEM, lnterrned,ate \loltage Electron M,croscope) che utilizza m
una cellula 5perma11ca via d1 sviluppo colorata con acrtato di uran,le e c,trato d1 p1omho. (h) Copia m
carbonio della superficie di ~perma d, topo.
un voltaggio · hd1 accelerazione
• di circa
. 400 000 V· In questo caso, vengono prodo t'te 1mmagm1 · · ·
stereoscopie e raccogliendo due immagini inclinate tra loro d1· 1
10° I · ·d . un ango o compreso tra 8 e
. mmag1111 i questo tipo sono utili per determinare le relazioni 3D degli or anelli ali'·111 - pale svantaggio dell'osservazione di campioni biologici in ME consiste, quindi, nel fatto che
terno deUe ceUule, quando vengono osservate in uno stereosco • O . g . •
stereopro1ezione digitale. pto medtante un sistema d, l'osservazione awiene necessari,1111ente in condizioni non faiologiche. Tuttav1,1, l'aument,1ta
risoluzione resa possibile dal ME ha fornito molte informaz10ni, riguardo alle strutture biolo-
giche e ai fenomeni biochimici all'interno delle cellule, che non potrebbero essere raccolte con
4. 6.2 Preparazione dei campioni nessun'altra tecnica di m1croscop1a.
Per l'analisi al ME è richiesta una lunga e laboriosa prepara11one del campione: per tale ra-
li contrasto nella M[ dipende dal numero at .
• . omico: quanto più ele t è ·1 • gione possono presentarsi problemi nell'interpretanone delle unmagini, a cau~a degli artefat-
co, tanto maggiori sono la dispersione e il cont t . d' va o I numero atom1-
·1· • ras o, 1conseguenza · ti dovuti a tale procedura. Per esempio, i campioni vengono tradmonalmente prepar.iti per la
sto, vengono ut1 1Lzat1 metalli pesanti come . . , per aggmngere contra-
. , uramo, piombo e os . N li . MET mediante fissazione m glutaraldeide, per form.ire legami croc1,1ti tra le prote111e, segu1t,1
ture marcate appaiono nere O •~l~ttr,
• "ndensc (F.1g. 4.18) mio. e e immagini le strut-
da un trattamento con tetrossido di osmio, per fì,sare e colorare le membrane hp1dichc. Tah
Per essere osservato mediante ME dal :
. . ' campione b1ol · d . trattamenti sono seguiti d,1lla d1S1drat.iz10ne, mediante pa,sagg1 m una serie d1 ,1koli e, quin-
qua, 10 quanto 11 fascio di elettroni può ess d ogico eve essere rimossa tutta J'ac-
ere pro otto e focal' 1 di, dall'inclus1one in una plastica come l'Epon per la prepar.11ione di ~c,ioni sot11h (I ig. -t.18).
izzato so o nel vuoto. li princi-
 6J()( 1II MI! A I OJ(\J (>C,IA MOJ H lllARF
MICROS< Ol'II<
M6 157

con la differenL.a che, mvece d'I d

.. . Il una son a fluorescente legata a un anticorpo secondario, ven-
gono uu11zzate part1ce e di O
.
u ·d 1 .
roco 01 a e elettrondense. La marcatura multipla può essere ot-
tenuta con parllcelle d'oro d'1d'1 · · · · ·
. • mens10111 diverse ( 10 nm), attaccate agh ant1corp1 contro le
proteme di mtcresse. Il metodo dipende dal legame della proteina A alle particelle d'oro, in
quanto la protema A si lega a su
. . . a voIta a1 ,,rammenti· d1· ant1corp1.
· · Sono state formulate alcune
resi~e (per esempio Lo~rcryl e LR white) per consentire agli anticorpi e alle particelle d'oro di
ve111re attaccati a sez10111 ultrasottili per la marcatura immunologica.

4.6.3 Recenti sviluppi nelle tecniche di microscopia elettronica

Nel tentativo di evitare artefatti durante la preparazione del campione e di osservarlo m
condizioni più vicine al suo stato vitale, continuano a essere sVJluppat1 nuovi metodi di fissa-
zione. I campioni vengono rapidamente congelati (nell'arco di mì1lisecondi) mediante conr,e
lamento ad alta pressione; in questo modo è più probabile che le condizioni biochimiche della
cellula siano meglio conservate. Molti dr questi campioni idratati congelati possono essere os-
servati direttamente al ME o possono essere fissati chimicamente, utilizzando il metodo della
so,utuziont> .i freddo, che prevede l'infusione dei fissativi a bassa temperatura nella prepara-
zione e, quindi, il lento riscaldamento del campione a temperatura ambiente.
Usando la tomografia e.rio elettronica (Cryo-ET) la struttura 3D di cellule e macromoleco-
le può essere visualizzata a 5-8 nm di risoluzione. Le cellule vengono congelate e montate in
un apparato che muove il campione sottoponendolo a ME sotto diversi angoli di inclinazione,
hgur~ •l.19 Micro,copiJ ,mmunot'lettronalJ, fmmJgmc al m1cro,,.:opìo elcttromco J scansione (MES) del per ciascuno dei quali viene raccolta un'immagine 2D. Da questa serie di immagini, mediante
microrganl\mo Ellt,·ro«x.-us (à,~·.,/,s mJr,Jto ,on pJrticdlt d1 oro col101dale d, IO nm d1 diametro. per la
protcinJ d, JdeMone ,uperfic,ale l ..,,,tJnza J1JggrtgJ11one). Quc,ta proteina tac1h1a lo scambio d1 DNA un software appropriato, è possibile ricostruire una rappresentazione 3D del campione.
durante la comugJzione. La marcJturJ moro appJre lOme punii b1Jnchi ,ulla ,uperfiue del batterio.
( lmm,1gme riprodotta per gentile con,e,>1onedi Stan frlJnd,en.) 4.6.4 Microscopia integrata
Lo stesso campione può essere osservato prima al microscopio ottico e, successivamente, al
PKcoli peni del tessuto incluso vengono momati e sezionati su un ultr,1minotomo, utiliz- microscopio elettronico, secondo una procedura definita microscop1.1 integrata. li confronto
zando una lama di vetro o d1am,mte, ottenendo sez10111 ultrasotllli dello spessore di circa 60 delle immagmi dello stesso campione, raccolte utilizzando l'elevata risoluzione temporale del
nm. Le sezioni vengono la>eiate galleggiare sulla superficie dell'acqua, utilizzando i loro colori microscopio ottico e l'elevata risoluzione spaziale del microscopio elettronico, fornisce infor-
di interfercnz.i per stimarne lo spessore; infatti, le sezioni avenll spessore di 60 nm hanno, sul- mazioni addizionali rispetto alle immagini ottenute utiliizando le due tecniche separatamen-
la superficie dell'acqua, un colore di interferenza argento/oro. Quindi, le sezioni vengono pri- te (Fig. 4.20). L'approccio integrato, inoltre, risolve il problema degli artefatti. Sono attual-
ma montate su griglll' per ~lf-, in rame o oro, e poi colorate con metalli pesanti, per esempio mente disponibili sonde che risultano fluorescenti al MO ed elettrondense al ME.
.icetato di ur.mile e citrato dr piombo.
I c.impioni per la MES vengono fi'>Sat1 in glutaraldeidc, d1sidratat1 attraverso una serie di
4.7 lmaging e biochimica
solven_ti e asciugati complet.imente in ari,1 o con l'e,,JùJlllt'lllo al punto cntJrn. Questo me-
todo_ rimuove
. 1stantant>amen.te
. tutta l'acqua presente n"I
, can1pione, e•,·t .:1 ando Ia tens1one
· su- La comprensione della funzione delle proteine all'interno delle cellule viventi intatte rap-
perl1c1ale nel processo
_ d1 css11:camento e, di conseguenza , " ,a11 I a essa corre at1.· p rima
gJ ·
1 ~rter · 1 · presenta uno dei principali obiettivi della ricerca biologica. L'osservazione di specifici eventi
d1 essere o~servatJ al MES, 1 campioni così preparati vengono mo I t ·I cellulari ~ stata notevolmente migliorata dalla moderna microscopia, che consente non solo
. . . . . . n a 1111 uno spcc1a e conte-
nitore portacamp10111 d1 metallo t' ncopert1 con un ,ottile •Irato d' (F' I l'osservazione qualitativa, ma anche la raccolta di immagmi dalle quali~ possibile ottenere
. _ ~ oro ·1g.4.17,tavoeaco-
lon p. 161 ). Le superfici po,sono essere VJsualinate anche al ~!ET ·1• d • ·· mformazioni quantitative. La raccolta di dati significativi è stata notevolmente facilitata dal-
negativo o rep I.1C he 111 c.irbomo <l1. campio111 es~1,ca11 all'a . (F • , ut1 1zz.in o coloraz1om m
., IS)
.d . na 1g.-.. l'avvento delle tccmche <l1g1t.1h di proce~~amento delle 1mm.1gm1. Sottili cambiamenti nel-
r mctod 1 1 1mmuno-~IJ conscmono la lo~alinaz'o I d.I I . I · , . l'mtensità delle sonde dei fenomeni biochimici possono essere colti mediante sens1bih rive-
I (con Ia.\lET)esullasuperficiedell Il I mo
am b1entt•ceIl uare
ne .
e~oI
e ali interno del m1cro-
.
ecc<l ,u e con a ~IES). latori digitali. Queste mnoval1oni tecnolog1che hanno permesso di mdagare gli aspetti spa
lule vengono prep.irate con procedure analoghe a quel!. ·•. Fig· -t · 19)· L'e<.:·cl -
e e11e tecmche <l1 1munolluore5cen,a, ziali dei meccanismi molewlari.
 B1()tlllMiUF 810l lK.IA ~IOIH C>IARE
Ml< R<>S( OPIA

-
m
,.
,
t", ~-
• 4', • . -- >-'·~
.
'•._:•.r: ·.
. .. ,; ..·:" :I:(
La luminosità della fluoresc
della quantita di sonda present enzJ pr~venicnte dalla sonda puo e,sere calibrat.1 ,ulla base
esempio, . la concentrazione d' e m ogni. data poslllone
usando coloranti indicatori·
l'aumentare deUa quantitil d'
. .
per i1ca 1c1O (per e
. .
. Il Il I
1 ca1CIO viene m1s t ne ,1• ce· ud a,,a e evJtJ
I
•
.
molu11one
ura a m regioni 111erent1 d1 embrioni v1tah
Il 3) I .
scmpio, uo- J cui lluoresccnLa aumenta al-
1ca1CIO 1ibero nella e I) 1 (F 4 21 I
159

Per

,. ·& ' state sviluppate molte sond ffi e u a ig. · , tavo e a colon p. 761 ). Sono
'('. - ~ -';i/};- I"
trolli sono una partn ne e pedr e ettuJre questo tipo di m1sur_az1oni in tessuti vitali. I con-
~ •• \ • i io:IM..:r.;&,'111 , cessana I questo g d. . .
. v ,\j :-,'il:°t!"n,y,,~·Nr diversi artefatti dovuti al coloran e~ere 1_espenment1, m quanto il photobleaching e
'"·' '
le controUo può essere effettuaite, durante l esperimento, possono falsare la misura reale. Ta-
confrontando le luminosità n. o colorando il.camp_10ne con due coloranti ionosensib1li e
11surate durante I esperimento. Queste misure vengono solita-

... . mente espresse come rapporti (

. m110 111111g111g) e controllate per evitare problemi dovuti al ca-
ricamento del . . . strumenta 1..
. colorante•al photobleachi'ng e a variazioni
~~· ~

■;~ ~: -~
1
-~'
~~~,.. ' ~~~ ~ ~
Le proteine marcate con sonde Il uorescentt· possono essere 1mettate
· · ·
all'interno delle cellule
dove'. col tempo vengono incorpo d U · · consente d1 olle•

FIJ,T
.. •. rate a e strutture macromolecolari. Ciò

,,~- --
n~re immagini di queste strutture, a intervalli di tempo (time-lapse), utilizzando la m1crosco-
p 1a m fluorescenza. Questi metod1· possono determmare e1evall· hvelh
· · d1· fondo d1· colorante e
. . ~~i
·
,~ ;
.~~(1\
risultare dt ~iflìcile inter~retazione. In aggiunta ai metodi d1 sezionamento ottico (par. 4.3),

~ .. ~-:iht.~
;~
~~
,~...'\1.miì~ . ~
hgura L'!O M1rroscop1a integrata (a) Immagine 111 epi0uomunu e (b. c) immagmc in MET whole 111011111
(a corpo mtcro) a differcnll ingrandimenti della 11r-;>.1 cellula. L'trnmagme mcp1fluomunza e marcata con
rodamma falloidina, che colora l'actina polimerill.ltl. Una fibrJ ISJ)ffllt.'I alla pcnfena della cellula appare
come una linea bianca neU'unmagme mfluorescenu (a), mentre quando vengono oSStrvate m MET le fibre
1sp=1te appaiono come un addensamento allmrato di fibre di acuna. L'immagine m MET wholt 111011111 è
stata preparata mediante estrazione con detergenti. fiss.wone chumca, r-;sìccamento al punto cnttco e nve-
\ltmento con platmo/c.irboruo. (Immagine gentilmente fornita da Tat)ana Sv1tkma.)
Misure relativamente semplici includono il conteggio di particolari strutture all'interno di
un'immagine 2D o la misurazione di aree e lunghezze. MtSure d1 profondità o volumi posso-
no essere effettuate utilizzando serie d1 dati in 3D, 4D e 5D. Le immagini sperimentali posso-
no essere calibrate mediante l'immagine di una griglia d1 calibrazione, ottenuta neUe stesse
condizioni operative adottate nell'esperimento. In molti sistemi di processamento deUe im-
magini, l'introduzione di un fattore di calibrauone assicura la confrontabilità di tutte le misu-
razioni successive
Il rapido sviluppo deUa microscopia in fluorescenza rnsieme con le tecniche di imaging di-
gitali e, soprattutto, lo sviluppo d1 nuove sonde fluorescenti per attivita biologiche, hanno ag-
giunto_ un nuo\'O livello di complesslta all'analisi quantitativa delle immagmi. Gran parte del-
le analisi sono basate sulla misura, mediante un sistema per immagini digitale, deUa Jummosi-
ta di una sonda fluorescente presente rn un campione. Questa e anche la base della onll 1 1
a 1' , (par. 16.3.~), te~mca che misura la lummosita individuale di una popolazione di cel-
l~le, nel momento m cui _p_a~sa attraverso un raggio laser. Le ceUule possono essere separate in
d1fferen11 popolaz1on1 utilizzando una tecnica correlata, la sep,1raz, l t, ~ attivata dall.i
flu flSC n ( FACS. Fl11orescence-Act1vated Ce/I Sortmg).
. sono state sviluppate tecniche per evitare elevati liveU1di fondo nelle misure in fluorescenza d1
fenomeni biochimici nelle cellule.
~
Il recupero della fluorescenza dopo ti photohlcachrng ( FRAP, F/11orescence Reco~·ery Aftcr
Photobleach111g) utilizza l'elevato flusso di luce proveniente da un raggio laser per distruggere
localmente i fluorofori, che marcano le macromolecole, per generare una zona con assenza d1
fluorescenza (photobleaching); 1 successivi movimenti dei lluorofori non ddnneggiat1, all'in-
terno deUa zona senia fluorescenza, danno una misura deUa mobilità delle molecole. Ciò ren-
de possibile l'analisi biochimica all'interno delle cellule viventi (par. 16.3.2). Una seconda tec-
nica, correlata aUa FRAP, è la fotoatt1va11one, che utilizza una sonda la cui fluorescenza può es-
sere indotta da un impulso di luce di lunghezza d'onda corta. La sonda attivata viene nsuahz-
zata usando una luce con lunghezza d'onda maggiore. In tale caso il rapporto segnale/rumore
deU'tmmagine può essere migliore di queUo ottenuto con gli esperimenti di photobleaching
Un terzo metodo, la m1croscop1a tn fluore,ccn1a a macth1e, scoperta in seguito a un'osser-
vazione casuale, è attualmente molto diffusa per ottenere immagini della dinamica macromo-
lecolare all'interno di ceUule viventi. In sostanza, una piccola quantità di proteine con marca-
tura fluo rescente viene iniettata nel preparato cellulare, cosicché neUa ceUula la proteina d1 m-
teresse non sarà completamente marcata. Quando vengono osservate al microscopio, le strut-
ture cellulan non marcate presentano, quindi, un aspetto a macchie. Le regioni scure agiscono
come ma ·latori d1 lOntrnllo per l'osservazione deUa dinamica.
Con il traskmnento d1 energia per ri,onanza tn fluorcslen 1 (FRET, Fl11oresce11ce Reso-
nance Energy Transfer) è possibile portare la microscopia in fluorescenza oltre ti Iunite d1 mo
luzione teonco del microscopio ottico e osservare in v11·0 le mteraz1oni protema-protema
(Fig. 4.22). Il FRET ha luogo tra due fluorofori, quando l'emissione del primo (donatore) ser-
ve come fonte di eccitazione per il secondo (accettore). Ciò avviene solamente quando dui:
molecole di fluoroforo si trovano molto vicme l'una all'altra, a una distanza di 60 A (6 nm) o
meno. Un esempio d1 un esperimento m FRET utilizza delle varianti spettrali della GFP In
questo caso, l'eccitazione d1 una protema marcata con una proteina a fluoresccnz,t azzurra
(CFP, Cyan Ff11orescent Protcm) viene utilizzata per seguire l'em1\sione d1 una proteina marca
 IIICX IIIMI< H RIOUlt,IAMOUC.oi.,.RE
MICRllS<.OPIA
160 !fil
, 90 nm em11s1one
430 nm ecc1taz1one di fluorescenza verde E\r ,1Pto I
con luce blu y
Localizzazione di una prot · · · • · ·
tl .J cellulare
ema incognita m uno specifico compartimento

•t::::t nessuna
fluorescenza OO~IA~l>I\

~
NON
FRET Avete isolato e puritìcato
. una nuova proteina
· da una preparanone· · ·
b10,h1m11:a. In qu.1le
t
modo potreS e determinare la sua di,tnbuz1one e la sua possibile funminc all 'mtt'rno
della cellula'
Fluorocroml seperetl
IUW\/H \

Numerose sonde fluorescenti marcano in modo specifico I d1verM compartimenti

cellulari. Per esempio, TOT03 marca 11 nucleo mentre lt' falloidme fluorescenti mar..ano
,90nm ! contorni cel_l~lari. Si potrebbe produrre un a~ticorpo specifico per la proteina d1
fluorescenza verde interesse e ullhnarlo per marcare le cellule con sonde 1mmunofluorescenti. Con la
"- 530 nm emissione
'30 nm tr11ferlmento di fluorescenze ro■se marcatura multipla- ed eventualmente con una tecnica d1 sezionamento ottico, come
luce blu di energie y
la microscopia confocale a scan,1one laser - può es,ere accertata la d1stribu1.1one della

FRET ·ee
7. l '\ _r proteina nella cellula rel.it1vamente alla d1stribuz1one di proteint' con Iocahnaz1onc
nota. Per nsoluziom maggiori, si puo ricorrere alla 1mmuno-EM oppure alla FRET.

La ri,onanl.l m.igneti..a (MRI, Magnetic Resonance Jmagmg), g1a molto diffusa per la rav
Fluorocroml edlecent, colta di informazioni 30 da grandi strutture (per esempio un animale intero), è stata recente•
1-igura 4.22 Trasferimento di energia ptr nsona!ILt in lluoresccnz.i (FRET, Fluoresct11ce Resonllnce Energy mente adattata per la raccolta di immagini, con risoluzione relativamente alta (10 µm ), dalle
Transftr). Ndl'estrnpio suptnore (non FRET) la proteina a lluorescen_za anurra (CPP, <;yan Fluortsc~,!t zone più interne di te~ull microscop1c1 che risulterebbero opachi con altre tecniche: per
Protein) e la proteina a lluorescenu gialla (YFP. Ytl/ow F/110,mem Prottm) non sono suffic1,ent~me_nte v1c1- esempio, per l'osservazione dell'anatomia 3D di embrioni vitali durante il loro sviluppo. Co
ne ptr perrnettcrt alla FRET d1 avert luogo (più di 60 A, 6 nrn, di distanza). In questo caso, I eccltaZJone con
la luce blu a 430 nrn ha cornt multato la sola em1Ss1one di luce verde a 490 nm da parte della CPP. Al contra- minc1ano a essere d1sponibih agenti d1 contrasto che possono essere ut1l1z1A1ti sia per la m1cro
rio, nell'tsernpio inferiore (FRET), la CFP e lii YFP sono sufficientemente vicme affinché avvenga il Mtrasfe- scopia in fluorescenza sia per la MRI dello stesso tessuto. La tecnica MRI è m grado d1 pene-
nrnento d1 energia" o FRET (più vicine d1 60 A). In questo caso, l'eccitaz1one con la luce blu a 430 nm pro- trare l'mtero volume del tessuto, mentre le 1mmag1m m fluoresce01.a possono essere ottenute
duce la fluorescenza della CFP (verde) e della YFP (rossa).
solamente dai primi micrometri d1 tessuto 1mmed1atamente al d1 sotto della superficie del-
l'embrione (par.13.4.3)
ta con una proteina a fluorescenza gialla (YFP, Ye/low Fluoresce11t Proteiri). La fluorescenza del- Un'altra area in cui la ncerca è molto attiva è lo sviluppo delle tecniche di rivelazione d1 sin-
la YFP, in condizioni di eccitazione della CFP, avrà luogo solamente se le proteine sono molto gole molecole. La miuoscop1a a nlk"1on~ intcrn,t tot.ile (TIRF, Tota/ Imemal Reflcct1011 M,
vicine tra loro. Poiché il fenomeno può essere seguito nel tempo, la FRET può essere utilizzata croscopy) utilizza le proprietà di un'onda evanescente all'interfaccia tra due meui (Fig. -1.23 ),
per misurare direttamente il legame delle proteine o dei complessi proteici (par. J6.3.2). come la regione situata tra il campione e il coprioggetti. La tecmca s1 basa sul fatto che l'inten-
Una tecnica più complessa, l'1magmg basato sull'em1v1ta della fluorescenza (FLIM, F/uore- sità del campo evanescente decade rap1d.1mente, in modo che l'eccitazione d1 qualunque fluo-
scence Lifet~me Imagi~g), misura la durata della fluorescenza di un fluoroforo, dopo l'eccitazio- roforo è confinata in una reg10ne d1 appena 100 nm al di sopra della superficie del vetro. Que-
~e con un 1~pulso d1 luce laser della durata di 10 nanosecondi La FLIM viene usata per ana- sto valore è più sottile dello spessore delle sezioni ottiche ottenute utilin.mdo 1metodi confo-
lizzare molti fluorofon, con diverse durate di fluor-cenza
~. e spettn· d'I em1ss1one
· sovrappost'1. cali, e consente di raccogliere immagini di singole molecole situate all'interfaccia.
Il m1crm..:op10 a forza atonm.1, invece di utilizzare una lente, esplora la superficie del cam-
4.8 Tecniche specializzate dj imaging pione con un puntale acuminato, lungo molti 1mcrometri ma con diametro (alla punta) mfe
riore a IO nm ( 1111,tgmg m ,.11npo \ 1uno), situato alla fine di una leva lunga cir,a 100-200 µm.
l progressi tecnologici continuano ad avere n 1 1 . . Durante il movimento del puntale sul campione, le forze presenti tra i due ..:au\ano un'md1 -
e della produzione di imm . . d _o _evo e impatto nel campo della microscopia
. agm1 e ren ono possibili un nu . d' . nazione della leva, il çu1 movimento viene rilevato da un computer, che elabora un'immagine
sperimentali. Nuovi strumenti . . . . . mero ancora maggiore I approcci
. per app1icaz1om speciahzzat d" . 1 d li della superficie del campione ricavandola dalle minuscole dev1J1iom del punt.1le. li metodo
b1och1m1ca vengono conlinuament il e e non I routine ne campo e a
e sv uppa11. produce immagini d1 superfici a devat.1 ri,oluzione (Tab. -I 3)
 a1ont1\III ~ f RllllOGIA MOI FCOIARE
MICRO'><'OPIA
16.2
163
4.1 O Suggerimenti per ulter'i o . 1
Vescicole e m1cro1ubuh n etture
al d1 fuon del cempo
AoRAMOWlrl, M. M1croscope Bas,c d B
evanescente
Testo introduttivo di buona qu~~à f 0nd· Olympus of Amene.i lnc , Melville, NY 2003.
ca - disponibile anche on Ime co~e ~lee~~ust rato su tutu gli as~ltl d1 ba5<' della mJCro~opia o111.
CAMPO EVANESCENTE Al.Bt RT~, B., }OHNSON A., LlWJ~ J. RAFf M R '
- 100 nm Garland Science, New York
2002
(T ·•. OBflITT, K., WA1TER, P Molecular B1ology of 1he Celi, 4• eJ,
Buona introduzione a tutte I fi r. ~ · B,_olog,a mo/eco/art della ct/111fa. Zanichell1. Bologna 2004).
Vescicole e m1cro1ubuli per I b1olog1 cellulari. e orme I macroscopia e all'ottenimento d1 immagini d1 cdlule vual,
all'interno del campo AN~R.EWS, P.D., HARPER, l.S. e Swwww J.R. lì
8 ,anescente m the postgenomic era. Traffi, / , _
2005 3 29 3
~_so
and beyond; quantitative fluorescence m1cro'k:opy
Rassegna sulle 1mmagm1 multidime - al1 . _
database mternazional d. - . nSion • su, metodi d1 gestione delle grandi ..cric d1 dati e dei
1 11mmagm1.
BARUCH, A., JHFERY, D.A., 8oFYO M E ·,
Tc 11 1 rnnl Rrflect1011 M1croscopy). Una reg10- 14: 29-35. ' · nzyme Jctiv11y- 1t sali about 1mage Tren,ls III Ccli 810/ogy 2004,
hgura 4 2, t.hcroicopia a nlles11one m1rrna IOlalc (TIRF, 0 'é
"/vetro-acqua quJndo le cond1tio111 di il
ne d1 ecc1t~110ne J1 100 nm d1 i,pe>$ore viene prodotta all'mier ace.i O wlo le vcmcole e I microlubuh pre-
Rece~Cte rassRJegna sugli es~rimenh da bioch1m1ca che u_lihzzano la fluore,ccnza.
BRAGA, r . ., CCI, 0 - Atom,c Force Mrcro p B d f /
lummanon<' ~ono adJII<' per la nfkss1onc mlerna In quc:i~o{~r:~:o~e dell'immagine m fluorescenta alla !ne., Totowa, NJ 2003 _ sco r- iomt ,ca Mtt 1od.s and App/1callo11,. Humana Pr~s
i.en11 ali mlerno del c.in1po eva.nescenle con1nbuiranno a
ni.ol1mone d1 100 nm lungo la direllone Z Metodi pratici e appLcaz1on1 della microscopia a forza atomica.
.Env,s,omng Screnct·· Tht DtSign and era,r
FRANKfl., F.
MA .~ o,.r tl1t Sc,tnct lmagmg. MIT Press, Cambndge,
2002
. • · ulteriori informazioni Famoso libro sull'ottemmento deIle 1mmagm1 · · con ut il I suggenmenll- per lo stercom1croi.cop10.
4.9 Archiviazione e presentaz ione delle 1mmagtm e .
HAUGLAND, R. Hat1dbook of Ff11orescen1 Probes and Rtstarch Prod1icts. 9" ed. Molecul.ir Probes lnc. Eu-
• - vengono uccolte in formato digitale. gene, OR 2003. '
Molte immagini prodotte dai moderni nucroscopi d Il I .
• - • · I straordinario aumento e a ve oc1tà Un compendio di tutte Il' modl'rne sonde fluorescenti unito a protocolli e riferimenti b1bhografio-
L uso delle tecniche d1gitJli ha consentito non so o uno h
• - - · d · dell'esperimento), ma anc e la gene- aggiornamento continuo trarrute web.
di raccolta delle 1mmag1111 (e una d1mmuz1one e1 tempi _ . . .
· d' b · - · · d ' 1· ·1 'd tras"er1·n1ento delle mformaz1om tra H URTLEY, S.M. l' HEJMtmt, l. Biologica! 1magmg. Scrtnce 2003; 300: 75-145.
razione I data a~e d1 1mmag1111 1gtta I e I rapi o ,, " . . . I la-. Ottima raccolta di art1coh nguardanll argomenti sui metodi moderni d1 ottenimento delle immagini.
boratori attraver;o internet. Inoltre durante 11 trasferimento tra i laboraton e nelle pagine dei INOUE, S., SPRJ~<,, K. Video M'.croscopy, Tlie Furulamtntals. 2' ed. Plenum Pubhshmg Corp., New York 1997.
giornali elettronici, le unmagini ra:colte al microscopio non perdono risoluzione O bilancia- Eccellent~ hbro mtrodutt1vo sull'ottemmento di immagini d1 cellule viventi, sulla v 1deomicro~op1a
e sulla m1croscop1a m generale.
mento de, colora.
Diventano sempre più ampi I database mternazionali per la conservazione e l'accesso alle ISHIJ)MA, A., YANAGIDA, T. Single molecule nanob1osc1ence. Trends ,n B1ochem1caf Screncts 2001; 26:
438-444.
irnrnagim da luoghi diversi. Nelle tecniche avanzate di microscopia, vi è la tendenza a produrre Rassegna sull'ottl'mmen10 d11mmag1m da singoll' molecoll'.
un numero sempre maggiore di dati, specialmente quando vengono generate serie di dati muJ- LEWIS, A.• TAHA, H., STRINKOVSICY, A., MANEvrrn,, A., KHAKHAmURIA1''l~, A., DEKTHFR, R., AMMAN1', E.
11dimens1onah. Questa tendema nsponde alla necessità di sviluppare metodi automatici di Near-field optics: from subwavelength 11luminat1on 10 nanomctrn: shadowing. N11111rt 81otechnolo•
analisi delle immagm1 denvanti dai data di espressione genica ottenuti dagli studi di genomica. gy2003;21: 1378-1386.
Rassegna sull'ottica m campo vicino e su recenti sviluppi.
Informa1ioni più dettagliate sui microscopi e sulle loro applicazioni in biochimica possono
MCINTOSH, J.R Electron m1croscopy of cells: a new begmnmg fora new century. Joumal ofCt/1 B,ology
es\ere ottenute da internet. Molti sita web sono stall indicati come punto di partenza p e r ulte- 2001; 153: F25-F32.
riori Mudi (par. 4. IO); se non fossero aggiornati, informazioni su qualunque argomento posso- Introduzione breve e d1 buon hvello sulle moderne tecmche per 11 ME
no essere ottenute utilizzando un motore di ricerca. Il campo della microscopia evolve rapida- Pf.RIASAMY, A Mtthods III ufl11far lmagmg. Oxford University Press, Oxford 200 I.
Eccellente raccolta d1 tecniche avanzate m microscopia otlica, che include la m1croscop1a confoc.ile,
mente, ma i principi di base della microscopia ottica ed elettronica rimangono invariati.
la microscopia a fotoni mulllph e la FRET.
Scttut DT, A., SMALLRllX.E, R. lmagmg in celi b1ology. Supplemento a Nature Ct/1 810/ogy 2003, 56.
Tabell.i 4.3 Risoluzione nelle immagini ottiche Recente rassegna generale delle moderne tecniche per l'ottenimento delle 1mmagmi.
SEOUWICK, J. Qwck Pho10Sl1op for Research: A G111de 10 D1g1MI frnagmg for PhotoShop. Kluwer i\c.ide•
XY z mie/Plenum Publishmg, New York 2002.
Mocroscopia clasi.ica
- - -0.S0µm
- ----------------
1.60µm
Protocolli basati su mform,uioni pratiche per la pre~enta11one d1 1mmagm1 dig1tah d1 m1uo">Cop1.1
SHAPIRO, H.M. Pract,cal Flow Cytomttry. 4' ed. John Wiley and Sons, New York 2003.
Confoc.tle/a fo1on1 muh1ph 0.25 µm 0.70 µm Libro d1 base sulle tecniche m fluorescenza e sulla citometn.i ,1 flusso, scritto m modo eccellente
f!RF onda evanescenie• 0.50 µm 0.30 µm SPLC IOR, D.L, GotDMAN, R.D. L1ve Celi f111ag111g: A Lrbort11ory M1m1111l. Cold Spnng Harbor l.aborato-
1-oua a1omica-campo, 1cmo_ _ _ _ o.os µm
___ 0.01 ftm
ry Press, Cold Spring Harbor, NY 2004.
• l lRI, I ,t.Al /utcm.al Rt/lt'<tr"n \f1tr11kopyf mk.rok.Op1.1 ~ rtO("t.\lOnc 1n1tm.1 tou.lc) Buona mtrodu11one a1 metodi attuali di raccolta delle 1mmJgini d1 cellule VI\Cnll.
 BJO( Hl MILA r BIOLOGIA MOll.( 01...\R.t
164

• \'lSUllhn.ns [:ene expn.--ss1on and protem mterac-

\ A.-.: R1.tf~$CL.. P., BRM'l>, A H. lmogms mto t be fut~; ,; 4: ElS·l:.'"20.
t1on w 1th tluon')(;ent protcms. Nafllrt t.dl Bi!llog) • 00 •
Buon:l mtrodunone ru GFP e FRET. , ~ons guide 10 decomolution in light mkro ..
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Rassegna :.ugli ,.viluppi Ji ~onde tluore-.cenu d1 atU\ • ~ • ·

Siti web utili

Mh:ro1,copia generale
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Tecniche elettroforetiche

10.1 Principi generali

Il termine elettroforesi dl-scn,-c la m1graz1one dt p;1r11~clle ..anche $.Otto l'mtlu,nu d1 un

, .. mpo elettn,o ~ume~ molc.:olc dì rùcv.inte mrc:r~.c b10•-o. .:ome amnunoaud1,
pept1d1, proteine, nudco11d1 e arnl, nuderc1, pt>\.\ll'<lono grurr1 1on1wh1h e, d, ..on~esuen1a,
.. ogm d.110 valore d1 pH c<o1stono m wluZJOne ..omr ,pe,:1r dl'nnc:a.mcn tl' e:&ndu·. cauom ( -t)
o anioni ( ). Sotto l'influenza dt un ca.mpo elc:ttnco, queste p.1rt1..clle ._.u11.hc m1gr,1no ,u~o 11
catodo oppure ver\O !"anodo, a ~..ond.l dcli.. nuura della loro <.'lln,11 netta
L"app.1recch1;itura nch1e,ta per l'elr11rotorcs1 t co,111u11a lond.unent.1lmcntc d1 Juc p..rtl
un aJ1mentatort e una cell.1 clt'ttroforc11l3. !>onCJ,,d1$p<.>mh1h .:-clic '-ht' fun1Jonano con s1stcm1
su gel vcrt1c.1le o ontzont,ile In commcroo )t trov.1no ccli<" elcttrolorclllhC per gd vcrtt<.ali,
comuncmeotc u11h1n1c rcr la \t'p.traJ,unc dr prorcmc m gel d1 .1,nlamnudc (par. 10 .:?) li sd
, iene prepar;110 tra due lastre dr ,c1ro, tenuh: -.cr.1rate d.1,p.121a1on d1 pl.a\ltCa I e ..dk p1u trc-
qucntemcnte 1mp1eg.1tc wno I c1»1d&t1, .ippar.ui mmì-gel \F1g IO I). I.e d1men'lom del sci
sono 11p1camcnte 8.5 an d1 l.irghcu.i per 5 .. m J1 .iltcaJ , con uno ,p~sorc J1 0.5 -1 mm Un
Jppo\llO pettine d1 pi.i\! 1u, 1c-nc '"lcm.110 n, ll,1 soluuonc- del ict e- vu:ne rimosso dopo la po-
hmen11az1onc, m modo da form,m: fino a 10 poucttt per 11 <.J.rt<."'llmcnto dei c.impl()lll, Qu.111-
do l'apparcnh1.t1ura \Jcn, a\.Stmhlat.i, il t1mr- ,ne ddl.1 \'"3-...hetta clettllllorctK.t mfmorc o r
lOn<b le la~tnne contenc:nll 1I gd, g.uantcndonc 11 r,1flrcddJmcn10 Un .. ar.1111:11,IKO ,1,kma .1
gel orauont.t.le e m,~,1ra10 nella figura IO 2 li i;d, iene prepu.ito ,u una l.1~tr11 d1, rt ro, o pl.l
SIiea, e .1ppogg1.110 ,u una p1.1~tra refnger,,nlc (un.i $UpcrlÌllC 1,ola1.1 .iur.i,·c-r~o la qu.ilc, iene
fo1tt.1 pa,~rc a,qua d1 raflrcdd.lmcnlo ixr d1"1puc 1I l.&lorc pn'<iotto~•l La '-"r ne -ione tra i.I
gel e 111amp<mc, nel qu31e '><>no 1mme~1 gh dc1trod1, ,1n iene mc<l1.111te un,1 -.01t11l ,tll¾I.& d,
CUI.i dJ filtro bagruta I F11? 10 21 .. ~1 o,-cn I tutLl, ,~. <l\c ntU c:e11ro,..,r(:")1 d, I O'\\ su gd d,
.ag.1ro,10, il t;cl ~ immc:~o ,omple1amcn1e nel IJm11one (p.ir 10.4 I) I'ahmcnt.1tmc forntK<.'
una corrente um1111ua 11gh clettrod1 della cell;i de1trotorc110 I utti 11tp1 d1 eldtrofor01 ven -
!(Ono condotti m un appropriato tampone, du.· e c-,~cn21ale per mantl·ncrc- lo,tantc lo ~t.ito J 1
1onwa11one delle molc.:olc da ~p.u.irc QuJh1.u1 ,u1;111on~ d1 r,H potrc-bb<' modificare la
lar,ca tou.lc,qumd1 I.i mob1htà (I.i ,clixllà d1 m1grumnc nel <.ampo upplicato l delle molecole
.da .scp.u.ue.
Prr comprrnderc appieno ti m<.-.::~.1ni,mo d1 Hp.1r.11111nc- dclii." ,pc, tt' ltlfld11:·, t nr,c-\S.lno
r"ordare alcune ,empl1c1 ,qua11oni rclatth' all'cle11rolorcs1 Quando M:apphCll una diffcrrnz.a
d1 po1cn11alc (,ohagg10) tr.1 gh dettroJ1, ,1 gl.'nc.-r.1 un gradiente J1 po1enz1Jlr l'-ampo dettn
co), E. uguak al ,olt~c, apph.. .ito, \', J1nw J'(r I.i duta.nza, d tril sii dc11md1 Qu.indo quc

44
\ -
I tpira 10 I Fotogufu che m<lilll il cmcammto dri camp1om nei pouctu d1 un m1mgd per 5DS-PAGE
Sri poucm, riei qu.:ah J ,m1p1one t già ~uto ,mmmo, r,mono ~re 1dcnufit...1U d.il oolor~ntc blu (blu di
bromolcnolol che u pMIC dd umponc d, c..nummlu
Compar-.rmenu d•I
Mrbatolo <s. tampoM
F, ra 10 2 T1p1co appuato onuontalt come quello u11!1ZU10 pn tmrnun~lnuotorcs1, 1soclcnruhxahz•
U21one (cl dcttroform d1 DNA e RJSA su gd d1 ISJl'OIIO
~, mn
IOIUll<III
141
~hl pJ1.hcn1c J1 potrn113tc f 1
uJUI11mb 1.
'
d1l' Jdla mulc,ol.l dcli.i ua 1·
• '
' COc app1!lato la fnr1J c,u,nata m un.1 molcwLl J1 c.1 11,.1 q
I lii U:JJ !r,1111.·\\J in ne1,ton). I qu1."'IJ lor1,1 ,he ,pmge un.1 mokcolJ ç,111,a vcr~o
un eItttro1Io l ,,,te tutt.1, 11 h
· • anc e una r('m k01.1 fr1m1n.1le ,h1.· rallenta 111111.1,uucnto 1.ldla
p.111,._cliJ 1,u1,., ' que~ta forta f r121nnaIt rappr~~ nt.1 unJ 1111,ur.1 J rllc J1mrn~10m 1Jr0Jm3m1-
orma, JeIle J1mcm10111 Jc1 pon dd me110 111,u1 J\\1cnc I'd el•
uoloro1 t ddla v1~1;1h1t.1 del l'ulllpone. 1.. ..... 11:Ioc11à, 1•, d1 una mok,ol,1 cane.i 111 un C'J mpo d el
tn,o è quindi data dall'cquaminc
IO I
dovt / rapprc..enta 1I rncffk1cn1e fr111on.tlc.
P1u comunemente viene ulihnato 1I termme moh1.hta d t ttroloreuca (JI) d1 uno ione:, ,he
rJpprc~nta ti rapporto tra la ,do,11a dello mne e l'mtemlla del lampo elcttnu> ( \'/I). Pcrt.tn•
to, quando~, applica una d1flcrcnz.a d1 poten11alc, molecole con d1flcrcntc canea totak· m111a•
no a M!parars1m funzione della loro d1vcr~ mobilita clcttroforcuca. Anche molrcole con ~an-
che \1m1h, ma con d1vcr-.a ma\,a molecolarc, 1JUZJano a '><:pann.1, m quanto \Uno !>OII0po)ll" a
d1ffcrcnt1 for7c fr111onah.
Rimuovendo il c.impo elettrico pnma che le molecole nel campione abbiano raggiunto gh
ekttrod1 1componenti s1 ~pareranno a ,e,onda della loro mob1ht.1 elettroforctaca. t..:demo-
fores1 è dunque, una forma mcomplcta d1 clt11roh\1. I campioni <.cparau ,engono quindi,.,
~uali1:,..a11 previo trattamento con un opportuno colorante oppure, nel C.N> ,,ano marlJl1 ra-
d1oat11vamente, mediante autoradiogr.uì.1 (par 14 2.3)
La corrente nella ~oluz1one tra gh clcttrod1 , iene condotta pnncapalmc:nte dagli 1001 dd
tampone, mentre gh 1001 del campione oc conducono ~olo una piccola parte la legge d1 Ohm
cspnmc la relazione tra l'mtcm,tà d1 corrente (n, 11 voltagg,o (V) e la rc,,1\tcnza ! R)
V
-R I IO 2)
Parrebbe, qll1Jld1, pos\1b1lc accelerare una separazione clettrolorcllca aummundo 1I vol-
taggio .ipphcato, 10 quanto ciò dovrebbe determinare un cormpondcntc iumcnto del flu~~o
d1 corrente I.a d11tanu pcrcor'"1 dagb 10111 sar~ propomonalc si.1 .tlla corrente, sia al tempo.
In quc,,to modo, tultavta. s1 trascurerebbe uno dc, prmetpali problemi per l.1 maggior parte
dei up, d1 elc1trofores1, ossia lo s, 1luppo d1 calore
Durante l'elettroforesi, la potcnz.i (W, espressa m watt) generai.i nel meno di )Upporto e
data d.tlla seguente eqU31ionc:
I\' JU lU 31
L.i mJggior putc d1 queo,l.1 potcn1.a viene d1ss1p.1ta wtto forma d1 calore li n~.1IJ,11uc:nlo
del meno in w1 ,1vv1cne l'clettrofores1 produc.c 1~gucnu effetti:
Piastra
di r1f!r1ddam1nto , awnento ddlJ ,clc>llt.l d1 d1flm1one dei c.1mp10111 e dcgh 10111 del tampone, fenomeno che
comporta unJ mmor dcfìn111one dea camp,0111 ~cpar.111;
• form.111onc d, correnu wnw111ve, che portano al 11me:..:ol.uncnto dei ,amp1on1 sq,,m111,
•
 IIIOUtlMlc.A E 8101.lXdA MOU COl.ARE
442 nonau IUTn.OfOll'11011
443
- S(nstbth al calor<, ltO può d.uc luogo alla
• mstab1l1t:S tcrnuca de, C':lmp1oni 111agg1ormenl• , , .
., ( di
l I('Jt.l(UfilllllO< uC11 e prol(IO(' <jUIO I . .
n,r ~mp10 •
all.1 p<;rd1t.1 Jell atu, 1tà degli enl1m1);

• dunmu1Jonc de Il a \t~o,111 l • JeI t u•nipon~ - ,,umd1• ndu11one della re\lsten1.a dd mcno

, , , .,

n,
~an do, Il< I 1.ono Jeli'eJe11rot t,r- , -nc appliato un \Olt.ags10 C.O)t.tnlc,
u 1, 1 , •
L1 wrrcntc au -
menta l'<"r clldto Jcll.1 dimmu,aonc <lellJ rcs1,tc:n1.a (lcgs1: d1 Ohm, cquammc 10 2)· CIÒ dc

tC'mun.a un ultenure m, rcmento dd ,alorc \\ 1luppato P.:r que~ta ragione vengono \pC'SO utt
lu7Jll alimentaton st.1hahzut1, ,hc tornL"-ono unJ potcn,a co,t.1nte cd ehmmano, d, ,on~-
gucnz.i, lc Outtu.11wni di 1..ilorc.
li "ht,mt,· ~\ iJuppo di calore nm;ine, comunque, un problema. Una solu11one potrebbe
..:umastcrc ndl'cscguirc la ,or.a dcttroforeui:a a una polenu molto bJ\\J (ba\\;I corrente), per
0 ,,,.1n: .1 ogni prohkm.i J1ns..ald,miento, m.1 quoto può portare a ~para11om hn11ta1ecome
u1t1S1."g\len,.i dell'aumento d1 d1tlu~1one, dO\uto al m.1ggior tempo necc~sano per la ~cpara ·
zwne. ~• Je\ono quindi tro\'Jie condwom J1 compromc,-o che ,onsentano I lUO d1 potenLe
r-.ag1onc\'oli, m modo dJ a,ere tempi d1 \l'J'U,wone a1.cettab1h, a t.tle scopo, \1 può anche n •
1.orrcrc a un opportuno ~•~tema d1 refngcraz1one ptr d1~\1p.irc ù calore prodotto. Nono\t.tnte
sl\tcm1 del gene-re tun11onino abha~tJnu btne, gh effetti del nscaldamento, t.tlvolta, non sono
d1minat1 completamente. Per e,;cmp10, nelle dettrofort'\1 c)C8Ultc m gel posti all'interno dt
tub1,m1 ul111dn,1 o tr.a 1.astnnr, \ebbene 11 calore sio1 generato uniformemente attnvcN> 11
meno,, tene dM1p,1to ~ol.amcntc allc estrcm11.a, ctò s1 traduce in un gradiente d1 temperatura
all'mtcmo del gd. uin la parte interna p1u cald.t nspetto a quelle esterne. Poteht 11 fluido più
1.-:ald<;!, nell.i 7ona centr.Je, è meno VJscoço, in quc~ta regione le mobi.htà elettroforettehe <,QOO
p1u elc,o1ti:...01: mob1htl dcttroforetiche aumen1o1no dt circa 112% per ogni grado m p1u della
umpcntura) e le bande dcttrofore11che as,umono cosi una fonna arcuata. con una m1gr.u10•
ne- p,u vdOi:c nelle ione centrali rupctto ai bordi.
Un ulumo f.ittorc ,hc può influcru..rn: l.t ,;cparazionc elettroforetu:a è 11 fenomeno dell'el,·1
trOC'ndosmOSJ ( noto .tnche come tlu,~o dcttronnollco), dovuto alla presenza d1 gruppi carichi
sull.i ~urcrfi.. 1c del meno d1 ~upporto. Ptt C)Cmp10, la carta pr~nta alcuni gruppi carbo~s,h-
c,, l'agar0610 (a )Aond.a dcl ~uo gr.1do dt purcu.a) conttcnc gruppi \Oliato, mentre la supcrfì-
ltC delle p.lrl Il dJ vetro, supporto u~to ndl'elcttrofore,,i capillare (p.ir I0.5 ), presenta gruppi
61lanolt1."1 (~1-0H). La figura l0J mo,tra come a,'\·tene l'elettroendosmosi in un tubo cap1lla-
rc, ma ti pnnap10 e 11 mtde.\lmo per qualunque meuo d1 supporto che procnlt sulla supcrfi -
uc pupp1 canclu In un tubo capillare tn ,1h,c fu\,1, a valori d1 pl I superiori a 3 circa, 1 gruppi
nlanoh..1sulla p.ucte d1 s1lioo <lei c.ip1l1Jre ,.iranno 1omu.Jt1, generando s1t1 carichi negauva•
mente S..'>no quc-stc cariche che d.anno luogo all'elettracndo\mo,1 I gruppi ~1lanolic1 ionu1.i1t
gcnc-rano un doppio strato elettnco. o regione d, ~r.ira11one dt ~ano, .1.ll'inurfai:ci.1 parete
dd c-Jptllarc/ckttrolna Quandu \lene apph1.,llo un ,oltagg,o, 1calloni ddl'elcttrohta v1dm
alla p:arctc del ap1llare migrano \TTSO d alodo, lras.:inando con sé la solu11one d, elettrolita
uò dctc-rmma un flu~~ dettrot'lldosmoll~o netto ,crw ,I c.atodo.
10.2 Materiali di )Upp<>rto
Gh studi p1omem11c1 sull'elettroforcs1 d1 A lhcl1us e lOll.ibor:itnri furono wndotll m S<I•
tu ione libera Tutta, ,a, ben presto fu duaro lhe molti problemi ac.wci.itt a quc~ta mctod,ca,
n part1c lar modo gh dfetu nrptm ddla d1ffuoonc e ddle correnti conH"lll\e, pote~ano es·
0
0
Parete del
capillare
• I grupp1 1danohc1 ac>d, conferiscono canche neg11,ve an. pareta
• I contr01on1 migrano verso ti catodo. tra11e1nandol, del 10lven1e
f 1gura 10 .I Flu,so dcttroosmotKO m un upilluc dl\dnt I c~11oru ckll dcurol,u ,ono attratti •n'° le p.1
reu dd up1lbre, dove fomuno un Jopp,o itnto clcttnro Qu.mdo" apph.:a un v.1fugg,o, il mo.uncnto
netto della wlu110M dc1trol1t1U •= ti atoJo t noto come lluuo elct11<1c:nd0\mo11u1
~re ltm1tJtJ .stab1l121.a.ndo ti mel2o. Tale multato fu r.iggmnto l~uendo l'elettrofor~" \U un
supporto mecC1ruco poroso, che vcmv.i imbevuto del tampone dcU'cleurofor~ e ali mtcmo
del quale poteva aVlientrc l'elcttrofore.1 degh ioni del tampone e del c.1mp1one li mluo d1
supporto, infatti. clinuna le ,orrcnu ,ometuve e la d1fTu~1one, 111 modo che I componcnu Se·
parali rimangano m bande nette. I prum ,upporu ut1hzza1t erano costitu111 d1 strt\C<.' d1 carta
da filtro, od, acelato d1 cellu)o)ol, 1mbtvu1e dt tampone per l'dettrofore\t At tualmcnte que,t1
supporti sono u-.all raramente, -.eblxne l'acetato d, lcllulo'>,J trovi ancora apphca11unc (par,
10.3.6) In particol.uc:-, per molti .mm, molc,ole p11..colc come ammmoac1d1, pcpt1d1 e l.arbo1•
drall, sono state ),(parate e anahu.ate mediante elettrofor~1 su ~upportt qu.il1 ,art.i o !>Ottili la
strme d1 cellulo'>.l, 51hce o .allumina. Sebbene:- tait tc..n1che s,,mo 01.1.3\tonalm,·nte ancora u~tc.
quc:,te moletole ,ono oggi analizzate con tecniche p1u moderne e: \Cn\1b1h, cllmc la "rom.1to•
~ grafia hqu1d.1 ad ,1lt.1 nsohmone (HPLC; par. I 1.3 2), Mentre per anah114re p1u:olc mokcok 1
\upporlt d1 carta, o a ,trato ..otulc, dmno buoni ruultati, per macromolecole, quali proteine: 0
ac1d1 nudc1c1, la scpara11one r 111rod1fofaC<'ntc
L'intmdu11one Jc1 gel come me111 d1 ,upporto h.i comunque dctcrmrnato un r.ip,do 1111•
glioramcnto net metodi d1 .m.ilm delle mauomolelole. li pruno ~~tema ~u gel a e,~ re: 1U.1to (!
stato quello su gel d1 amido, ~cbb.'.ne questo M)tema troH ancora quakhl· u11h1u\ la gran p.tr
te delle t,-cmche cletLrOIÒr.:t1uic: attu.ilmcnte L01p1eg,1 gel d1 ag.1ro,10 o J1 .1,nlamm1de
102. J Gd di agaro~io
l 'agaros10 I! un pohsaccaride Ime.ire d1111.J'-sa molrullar,· relJll\'a media ,h l.tr,--a 12 000,co•
s11tu110 dt unità base rtpctulc d1 agarob111m1, 111ter,al.1tc d.1 untlà alternate d1 g.,IJ11os1C1 e J1
 BICX: ttlMIC.,,. l lllOU:11-,IA ~IOLI ( t >I Mli
H4
OH
o I gel d1~ha<.nlamm1dt- ,on Jq;am1 aoc1au \'t'ngono preparali mediante pohmenzzauo
logura 10 4 A(;nob10$11>,l'umt1cho inpt''.t ndl'aguo,10
3,6-amdro~ (F1g. I O 4 ). L'agaros10 ~ uno dea costituenti dcli ·agar, una mhccla di PQli•
~ ,.u;;i1 rKa\ata da alcune specie di alghe h<.0 viene ~hwncnlc u11hzuto m c.onccntraz10-
m comprhe tra l'I e il 3% I gel da agaros10 vengono preparali sospendendo il pohsaccandc m
pol\'erc 10 un tampone acquo<.0, e bollendo la sospensione fino a ottenere una ~luz1one hm
p 1d.1 Quc,ta viene qumd1 \'Crs.tta e lasciata raffreddare a temperatura ambiente per formare
un gel sohdo Le proprietà gclific.,anu \'engono attribuite a1 lcgam1 idrogeno sia mtramolecola-
n , ~•a tra diverse lunghe molecole d1 agaros10. La struttun rcucolata conferisce al gel buone
propnctà anticomctt1ve Le d1mcns1oru dea pon nel gel <.0no determinate dalla conccntrv10-
ne mwale dt agaro~10: partendo da ba\sc concrntrazioru, s1 formano pori d1 grandi d1mcns10-
m, mentre da conccntrmom p1u elevate s1 ottengono pon più piccoli. Sebbene l'agaros10 sia
sostanualmcnte pnvo da canea, alcuni gruppi delle umtà ghcosid1chc costituenti possono es-
sere sosutu111, m rmsura dt\·crsa, con gruppi carbossilici e mcto~~•ho, con ptrUvato e - m ~r-
t1colar modo - con solfato. Queste sosutu11om possono dare luogo, durante l'clettrofor~•. al
fenomeno ddl'clettroendosmos1 e a llltera.uoru toniche Lea il gel e ù amp1ooc, effetu ent.ram-
b1 mdesidcrat1 L'agaros10 viene pertanto c.ommcrcial1zzato a d1vcrs1 gradi d1 purezza, m base -
alla concmtra11one da -.olfatì quanto p1u quest'uluma ~ ba~sa, unto maggiore èla purezza
I gel da agaros10 vengono u11hna11 per l'elt-11rofores1 sia dellt- protetnc sia degli aetdt ou-
clc1c1. Nel primo caso, lt- d1mem1oni dei pon d1 un gel ali'!% sono troppo grandi, ~e con-
frontate con quelle delle prott-mc I gel d1 .igaros10 vengono percio 1mp1egau m tecniche co-
me 1'1mmunoelc1troforcs1 (pu 7 4 1) o l'isoelettrofocali11.111ooc orizzontale (par IO 3.4),
nelle quaJ1 le proteine devono muoversi, srnza ostacoli, nella matrice di gd a st-conda della
loro canea nat1\a Quc~t1 gd con pon larghi sono ut1h .inche per ~eparare molecole molto
p1u grandi come ti DNA o I RNA, m quanto le d1men,1on1 dei pon sono tali w c.omcnurne il
passaggio, In que<.to caso, però, le d1mcns1on1 dei pori sono dello \le~so ordme dt grande1..za
di quello delle molcc_olc e gh effetti fn21onal1svolgono un ruolo non tra<,curabile ndla scpa-
r.121one (par. I 0.4 ) Ln ultenorc vantaggio dcli'utilizzo dcll'agarO\IO è rapprc~entato dalla d1
\pombilita d1 questo pohs.accandr a bas\.J temperatura d1 fus1ont- (62-65 °(.) Qucslt gel pos-
sono t-,st-rc hquefatu nuovamente mediante mcaldamcnto a 65 °C; 10 tal modo, per l''>em-
p10, 1campioni d1 D"'A separati m un gel po~sono e,<,ere recuperali ntaghando e '>olubih7 -
u ndo I.i powonc d1 gel mter~ta
Per la scarsa clast1c1tà, e I conseguenti problemi nella loro nmollonc da tubi piccoli, 1gel di
agaros10 non \ODO adat11 per 11 \ 1stcm.1 su supporti a tubicino ,·1 1md n<.o, · taJvo lt••
- una tecnica
"" .-...0 ne, o I 1mmunoeIc1tro10r(.')1
uuhuata <.On I gel d1pohau1l.lmm1dt- Per 1'11,0c)cttrof,-,,ahz-n~, r ,c1 pohmt-nuato: la nmouone dc:U'ana prc:\ iene que,ta poss1bù1tà
1n agaro,10, vengono perciò u~u, sempre ,
s1stcm1 con "C
o
l ora,,o t I h h
n a 1, e l' sono anc e 1mp1<:ga11
regolarmente per 11 DNA e per I RNA, schhene alcuna riccrr~•t011 UtII1/ZIOO I ,1,tem1• ver11.. aII
TT I< llf IUTIROIOIUTIOl 445
10.2.2 Gel di pol1acrilam n11dt
I ckttroforc:,1 ,u gel da pohau1lamnudc viene s ~ md1cata con 11 termine PAl ,f. 3 ,rom
mo di l'11h .Aa1/11n11Je <.ìdEuarap.horrm
ne d1 monomeri d1acnlamrmdt-, m prt'SC'nu d1 p1..,ole quantità d1 'NJ',..,.-metileneb1sa..nlam-
m1de (nota comunemente come bis .au1Jamm1de) (F1g 10 5) La bis acnlammide t un com•
-~\IO formato e~almmte da due molecole d1 aailimumde legatt- da un sruppo mct1lc-
nico, e: \'lene uuhzzato pcrch~ m grado dt formare legami <.TI>Clall. La pohmenZ7.ll.lOnc: dei
monomeri d1 acnlamm1dc: t del 11po tcsta•wda, 11 che porta alla. formazione d1 lunghe ..ate•
:;ic, nelle _quali s1mscnscl' occas1onalmentc una molecola d1 b~-acnlammrde. mtrodu,enJo
co~I un 1.econdo~to per l'c:.tCJUJ.one della ~tena <.1 forma m questo modo una m.'ltn..c con
legami crociati d1 struttura bc:n definita {Fitt 10.5).1.il..wlimenzzazmnc dell'o,nl.tmnudc ~
-..!!.!' c,cm.E.!_O d1 catah\t rad1calu:ae ha m1210 con l'aggiunta d1 unmomo pcr'\Olfato e della ba~
NN.N' ,N'-tctramctùend1.Ammina (TE!\.1.ED) li TEMED catalllla la dc..-omposwonc: dello
ione per:.olfoto, cht- porta alla produzione d1un radiale~~ o.oc di una mQk,ola.a, cntt·
un..,elcttroo.c sp31.1.to):
S O, + e ➔ SO. + SO,
Se questo rad1calc hbero nene rappresentalo come R' (J o,e il punto rapprc,cnta un elct-
tronl' ~patata) e M è una mole<."Ola d1 monomero di acrilamm1de, allora la pohmt-nZUZ1one
-
può essere rappresentata coml' segue:
R' + M ➔ Rl\.i'
RJ-,tM~M ➔ Rl\.1MM" «cctera
I r.1d1cah hhcn ~ono 5pecic altamente reattl\e a cau~ della pre..cn1.a dt un elettrone spaiato,
che deve accopp1am ton un altro elettrone per stab1huarc la moll'\:ola. R' reagis.ce quindi ..on
-M l' forma un ll'game 1.mgolo. cond1\1dendo 11 ,uo elettrone \pa1ato con uno proveniente dal
_guscio l'Sterno della molecola del monomt-m Qu~to produce un nuovo radicale libero R l\f ,
che~ ugualmente reamvo l' che legherà un' ulteriore molecola d1 monomero. In que,to modo
\1 fonn.ino lunghe catene di acri.12mm1de, ,he ,cngnno legate tra loro da legami che ,,, torm:i-
no a causa dell'introduzionl' di o.:,;monali molecole d1 b1s-acnlamm1de nella catena m ue~c1
ta. Po1cM l'o\"geno nmuo-.e I radi,ali libcn, tutte le ~oluziom d1 gel ,engono solitamente d~
~te prima dt-U'uso l k ~luz1om \Cngono poste pt-r breve tempo ,otto vuoto per nmuo\crc
!aria dbOolt.a) La nmo11one deU'ana dallt- ,olllZIOOI d1 gel ha .in, he un ~crondo \1.opo La
pohmerizuz1one dt-U a,nlamm1de ~ una rca11one c:.ott-rm1ca e 11 m1..1ldamcnto della ,oluz 10 •
~ne d1 gd potrebbe prO\'<Xare la fomuzìone d1 bolle d·ana che rimarrebbero mtrapp..i!Jte nel
La totopohmennazmnc ~ un metodo alternatl\o \he può e"scre 1mp1cgato per IJ prepara-
zione dt-1 gel d1 acrilamm1dt-. In questa tc.. n1'a, I ammonio pcr~olfato t 11 11· '.\tE!) ,cngono
 IH, 1110< 111J.IIU. f llll>LUGIA MOUCOI.\Rt
n1':'.ICltl IU:Tl'll(>fOJU:TIU II
447

CH 1 -CHCONH1 CHztNHCOHC-CH1l1 10.3 Elettroforesi di proteine

acnla,nm,de N N N ,N· me11leneb1sac11lammIda

!
C.t11ltz21t0ft

-CH -~H-f-CH1-CH1CH
CO l
• radult liberi

COn
-,H-CO
I I I tet:mca particolarmente utile per valutare l,1 pureu..1 delle protcme e, ro•chè e ba~ta ,ull.1 se
NH /loH NH
I _ paraz1one delle proleme m base alle loro d1mens1om, può e<,,cre u11hznta anche per detenni•
CH, CH,
I I
NH NH NH
co J co~l- co
-CH,-b.lCH -CH1~1-!H-
r rgura IOS 1'<>1111&ZJ<lnt di un gd di poluaillllllllklc a puurt cii ~cnl~mmuit t bu-amlamm1de
""'ìlelJa molecola Viene qumd1 completamente m-™.herata dalle molecole d1 SD\ ....mche nega Il•
~vamentc La struttura filamentosa rimane, m qw.nlo ogm rotazione 1,.he tende a chiudere la
'0Jt1tui11 dJ.lla nbolhVUL1; inoltre, dopo o~re staio versato, il gtl viene esposto a una luce m-
Jcru.L per l·J orc..u fotodccom~mone delb nbofl.tvina genera un radicale libero che dà
mmo alla pohmerru.ariollt!.
I gd di acril.amm1de \Cngono 1dentifia11 m base alla percentuale totale d1 acrilamm1de
prCKnte. u drmen~ion1 dei pori dd gel ~no essere v.1riatc c.imbtando le concentrazioni
Ma ddJ'.acrilamm1de s1.1 dclb bi.).,1crilamnude li contenuto di acnfamm1de è normalmente
compmo fra 11 .3 e il 30%; pttt.tnto, gel a bas53 pcrcentuolle (come 4%) posuedono pori d1
grandi d1mens1om e .sono utilizzau, per e)Cmp10, nell'elettroforo1 d1 proteine quando venga
n~hiesto 11 hbcro mo\ uncnto delle proteine, indotto dall'elettrofor()1, senza alcun effetto fn
ZJon~e. romc odi 1\0dettrot,x.Jlt1.l.11Jone orm:ontlle (/lat-bt,i) (par IO 3.4) o net gel d1 im
p.1e~amen10 (stJ1ckmgtt/J nell.1 SDS-PAGE (par. 10.3.1). 1 gel a bassa percennule d, acnlam·
m1Jc- VC'ngono anche- wau pt-r separare DNA I par. 10.41; quelli c,;on contenuto d1 acrdamm1de
tra ti 10 e il 10% tro~-ano impiego m tern1che come la SDS PAGE, nelb qu.de le d1men~1om
p1u p1u.ole dei pon introducono un effetto Sd.lcc10, che conlnbu1sa aJJ.i separazione delle
pro1eme m base-alle loro d1mens1om (par. 10.3.1).
Ongmarwnmte,le prolclllC \~ntvano ~rate su gd d1 poliacrtlamnude f.itt1 polrmcriz·
:t.iR: 111 wlu ili \-Ctro di arei 7 mm d1 diametro e IO cm dr lunghezu. Qucsu tubi «ano fac1h
da can~rc e ri..h1cde,-ano I 1mp1cgo d1 apparecchiature J.Cmpliet, però era possibile far correre
UD.$010 campione per ogm t~bo e, po1ch~ le condmoru dJ sc:pu,mone polevano variare da 1u
bo a luh<>: iJ ..onfronto do nsultall tra dt\'Cf'St camp1oru non sempre era accurato. L'mtrodu·
z1onc ddl elettroforesi \'Cfl1.:.ile ha permesso d1 ana.Ju.urc,m una ~ingoia cors.i clcttroforetica,
Vino a ::!O ,amp1001 nelle it~ cond1z1oru._Ogg, l'dettrofores1\ertie.tlc: vr~"Jle usata quo11d1a·
ruuncntcsm per I an.tlm ddleprolc,nc (p.1r 10.3) su per$Cpar.trt'1 frammrnt1d1 DNA duran·
re il scquenz1.1mento dcgh .:1c1d1 nucJem (pai. IO 4)-;Srbbène akum nCCl'Qton otrhumo gel di
.JICT1lamm1dc- cu essi Jtrss1 prcp.uau, altn acquuuno, ~r tecru~he quali l'SDS P.AGL l'cktttlJ•
forcsi IUll\11 e la lSOClettrofocahzzanone IFF , gd gi.ì pronti rcpcnbth m ~ommcmo
10.3.1 Elettrofores, su gel di polmmlammide III pr~en:n di sodio dodmlsolfato
Lelettrofore~1 ~u gd dJ pohacnlamm1de m pre:.enz.:i d1 ~10 dodml'>oll.:tto (SD'> PAGE) è
1I metodo d1 p1u largo 1mp1ego per l'.mal1~1 qua.buuva di m1~cl<' d1 proteine ..,, trau.1 J1 una
iure la massa molcwlarc rcl;.1t1Yil delle prorcmr Il ~d,o dode\ i1,olfa10 SD'I t un detergente
amomco, d1 formula CH {CH1) CH OSO ~a . I c.imp1om che de\ono evs<rt: anahu.111
mediante SDS-PAGE ,·engono pnma bolh11 per 5 mmuu, nd t.unponedcl omp1one {~rr11ple
buffer) contenente SOS e 2-mcrcaptocQD.Olo Qw::.ùùumo ndu<..e 1 ponu disolfuro C\'cntual-
menle prcsenu. che ~no 1m1eme li ~truttura tcnian,1 delb1 proteine, mentre I SI)')" lega
fortemente alle protewc e le dciutura. Tutte le proteine: della miscela \'cngono, qumd,, com-
pletamente denaturate da questo trattamento, e~• aprono m una ~truttura fil.uncntOl>a ,l\cnte
una sene dimol.ecole d1 SDS cariche negarivamcnlc lungo la catena polipcp11d1~-a In med1.1.,
Viene legata una molecol.i d1 SDS ogm due residui .1mmmoaaclia. LI ~nca naU\"a originale
catena proteica determinerà una repulsione tra le canche negatJ\-c sulle d1\'er\c: parti della c:.a-
tena proteica, che renderà la conform.iuone d1 nuovo filamento);}. Usmnple /,11flrr contiene,
moltre, un tracc1anJ.e colorato 10012Z.Jbùc, di )()lito blu d, bromofonolo, .:he con-.cnlc dJ ~w-
re l'andamento della cors.1 ele1trofore11c.1, e del ~ccaro~•o o del ghccrolo, che rendono La dcn-
s1t.l_della soluuone dc! campione adeguat.1 per ,onsenume la dcpo~1z10ne, attr.t\C™l il lam -
pone d1 elettroforesi, sul fondo del pozzcuo di Cilll.camento (F1g. IO. I). Una \Oha c.m~au tutt t
i camp1om, viene falla pa~~1re corrente attravcno 1I gd. In realtà, 1campioni c.he de\'ono CSM'·
re ,eparau non vengono mtrodott1 direttamente nel gel d1 separazione. Infatti, dopo che 11 gel
d1 separwone (di ~b10 della lunghezza di c1Ko1 S cml t stato venato tra le due lastnnc d1 \e•
tro cd t awenuta la sua pol11ner1zz.iz1011e, gh viene vcr..ato sopra un gel d1 unpaccamento
(51ad111ggdl p1u corto (dell.i lunghezza d1 mca 0.8 cm), nel quale \'Cngono form.iu I poucttl
e ar1ute le proteine. li gd dJ impaccamento ha I. funzione d1 conccn1rare 1I campione d1 pro-
teme m una sotuJe band.a, prima che en1n nel gel d1 separa71one 1,de multato s1 ottiene uu
1111.ando forza 10111ca e pH duferentt tra il lampone elettroforetKO e 11 tampone nd gel di un .
.raccamenlo, condwo.ru che danno onginc al fenomeno noto come uota~oforcs1. l1_1;el di 1m-
paccamento ha pon d1 dUT1em1om molto gr,md1 (4% d1 .1cnlamm1de) che comcnlono .ùle
protemc di muo\'Cr$1 ~ n t e e d1 concen1rars1, o 1mpa~,m1, ~ouo l'azione Jd ,.impo
dettrico. Leffetto di ~u,ghamcnto delle bande dipende dal fuuo ,hc gh mm ghun•lo \;an-
ch1 negativamente (prc:.cnll nel 1.1mpone elenroforeucol hanno una mob1h1.i elcttrolorctmi
ptu bassa di quella dei complcss1 proteina '>DS che, a loro volta, hanno una mob1hta inknorc
a quella de&l1 10111 doru.ro (Cl ), pre<.cnU nel i.1mple /111Jlrr e nel tampone del gel d1 1mp.i,c:a-
meoto Quando nenc apphcara la corrente, tulle le spcx1c 1on1<.he dovr.inno m1gran .illa Mc,-
'iJ vdoc11.1, altrimenti" venfichcrcbbc un'mtcrrultone del cu..u110 dettr1,o, Gli mm gltuuato
potranno muover\! alla ,tesi.I \cloc1là dr:gb 10m cloruro ,olo \CM trovano in una 1cgmnl' con
..un campo clellnco d1 m10:ns1tà maggiore. L'm1em11.ì del campo dettra~o è 1mas.tmrntc pro
pomonale alla condut11v1tà, l,1 quale è propomonak· nlla ~on,cntra71une. li multato è che le
 "48 &IUClll\11( H allll.(X,l,O.MUU( lll.AJU

tre ~pc,,..- 1on1,hc mtc:rc,,sJtC' \.iruno b loro concentr.u1ont· 111 modo ,hc ~QJ~(protc:ina-
'ill)"'hlt•lllat_0) ro,,ht 1,omrlc ,1 pwwn.1-~DS ~\00 presenti \Olo ID ptea>la quanut.1. .sJ
-
TI( ,m ltl Il l lTI\(lk}Rll 1a11'J- 44'1

Cilllet:ntruno Ul wi b.an.i.1 molto .>(lttJe tr• gli 10m g,IKinato e gh ioru O Una volta che 11 glic1-
na10 r,1"1unic ù gd di ~cp.u.wonc. di,cnt.icomplewncntc.lo=to a CaU$.l dell'ambiente a
pH m~wrc e: la su.i mobiliùcr=~tl pH ddgd d1 impu:camento è 6.8,quello del gel di se
puu1onc: è t< s l,h 10m glic1na10 l' doniro m.igc,1110, quindi, p1u \cloccmente dei compl~il
pnitcma <;[),, 1q1ah \Cngono Lua.iu sep.uare CL1sruno ~e,ondo la propria mob1ht.\ elettro-
lorclJ.c.l.. J ,ompl~s1 protcJ.m..S05. cam.lu negativamente, continuano a muoversi verso
l'anoJo e, ('<!1,hé po»'1cdono tutti la st~ canea per umt."1 d1 lunghezza, s1 muovono all'inter
no Jd gel d1 ~unione <;(lito l"cfletto dcl campo clcttnco apphc.1to, tutti con la stes~ mob1-
h1.1 Q..uando pU},lno attr.1\<:llO ti gel di separazione, tutta\1a, le proteine s1 separano a causa
dell'eftetto ~tau10 molc,olare del gcl stffiO. In puole scmpha, più piccola è la proteina, più
---
- -- -- - --
l.ictlmcnte t<,:,a potrà ~ r e attr,neno I pon del gel, mentre protei.Ile d1 d1men$10n1 magg1on~
, erranno ntardate dalJ.i fC'SIStenu frmonale do~-uta .ill'effetto sct.icc10 del gel li colorante blu
di bromofenolo, e.sendo una molecola piccula. non nene ntardato in alcun modo e rappre-
.5èllta qwod1 il fronte d1 m1G{'u1one. Quando tl colorante r.1gg1unge il fondo del gd, la corren-
te\ iene tolt.a, 11 gel \1cne nmosso dalle due wtre di vetro, messo m .ig•laZlone per alcune ore Figura 10.6 Tipico gd d, pohacnbmllllde m pIC5oCDU d,SD$. I d1c,1 pol.Ulll .ono 1,ut1,,mc.1111u1u wn u
m Wl.1 sol1Wooe colorante adatta (di solito, Coomass1e brtlhant blue; par. 10.3.7) e, qumd1, la- s1cssa nu-cd1 complC\1.J di proteine (Per gentile conCcSl-1onc ddla 810 R.id LlboratonC\ l td )
,.ato m un.i sohwone decolorante Quest'ulurna nmuove dal gd il colorante che non s1 è lega-
to, las.;1.indo le proteine\ 1S1btli come bande blu su uno sfondo trasparente Un normale mim- Tabella IO.I RelaZJone tra conccntraz1onc d, acnlamm1de nel gel e 10tcrvallo d1 fra1Jona -
gcl nch1cde cm:.i I ora per la sua prcparwone, 40 mmuu pcr l.1 corsa a 200 V e I ora per la co- mento delle proteine
lorauone con tl Cooma»IC bnlhant blue. Le bande proteiche p1u mtensc sono visibili sul gel ---
Conuntruioned,acrilamm,de(~) lntcrnllo di fruìonunmto (M, x IO')
-00po 10 10 m1nut1, ma la dccoloranone per una notte è ncces~na per nmuovere completa-
mente il ,olorantc che non s1 è legato alle proteine&ricorre sempre ali•denrof~cs1ver11c.ife.1 5 60-350
m q~to ess;i permette di ca.ne.are fino a IO differenti campioni m un S1J1golo ~!,.Nella figura IO 15-200
10.6 è monrato un t1p1co gel d1 pohacrilamm1de I.Il prC'SC'nza di SOS 15 IO 100
. Tip1~cnte, pcr ti gel d1 scp.1ru1one s, utw.zu una pcrcentu.ùc dt acnlamm1de del lSo.o,
Ciò detcrmma dime1H1oru dei pon uli che le protnne aventi massa molecolare rclauva (M,)
pan a 10 000 s1 muo,ono anravnso il gcl qll.15l scnu mcontrarc O)tacoli, mentre quelle avenu .ne del logaritmo decunalc del suo M., co\trucndo CO\l una curva d1 cahbraz.ione S1 m,~ura
M, pan a 100 000 nocono a malapena il entra.re nCI pori. .Gel al 15% di pobamlammide sono quindi la d.!$liUU,l d1 m1g=ne della proteina avente M , mcogmta e, m base alla l'Urv;i d1 ca-
q_wnd.ì utili per separare proteine con .\f compreso tr.t IO 000 e 100 000. D1Jnque, una prote1- J1bra11onc. sL otlJene 11 valore dt M c.crc.ito
no1 3'-Cnte .\f, p,ui a 150 000, non potrebbe penetrare IO un gel al 1500 , IO questo caso 51 può l'SDS-PAGE viene spesso ut1l12Zata, dopo ogm pass.agg10 dt un protocollo d1 punfìc,mone,
utilizzatt un gd con pon r,,u larghi ( per esempio un gel al 10% o anche aJ 7.5%), m modo da per valutare dgrado d1 purezza raggiunto dal camp1oneAJn.1 protc10a puu do\'rcbbc dare IO
permettere anche il una proteina di queste d101ensiom di !)(nctrare nel gd per essere cosl co- SDS-PAGE una singola banda, a meno che la molecola 110n sia formata da due ~ubumtà d1ffc.
lorata e 1denuficata. t onio. qwndi., che h S<eha del gel da utilizzare dipende dalle dimens,o- n:nu, nel qual caso s1 osserveranno due bande, cormpondenu alle due subwi11.1 Po1chc per
01 della protruta che ~1 ,-uole studi.ire, La rtlmone lri gli 1111m~ di franonamento dcUc:
questa tecnica sono n~,.ine quantili\ d1 protema rnknon al microgrammo,~ .:.uffic1entc
proteine e le d.iffemiu pcrantu.il1 d1 acrtlammide dei gel t illustrata nella tabella 10 J 51può _poclu.ssimo matenal.e per vcnfìcare ùgrado di pureua, 100ltre ~ pos\lb1le, nello ste\W t.,;pcn•
~are, pc e5emp10, che protttne J\enu un.i masu maggiore di 200 kDa non possono en- mento, determinare anche la M della proteina (come d~ntto m pre'-cdrn,.a)
t~re in un gd al 10%, nel quale pouono essere sq,arate proteine con M, compro.i tra 15 000
e_()() 000 Proteine ,on \1, mmorc o uguale a 15 000 sono tror,po pic.:.ole per subrre l'effetto 10.3.2 Elettrofores, 111 condiz1on1nat,vt
scucoo ddla ~tri~ di &de m1grc:unno,qwndi, tutte UlSirmecome una banda ~m ola m te•
sta al fronte ekttroforc:u,o g Nonost,mte l''iD'> PAGI:. ,i.1 11 sistema \U gel p1u frcqurntcmentc uuhzzato per lo .,,1ud10
delle proteine. e~><> non ( 1mp1cgah1le ~e s1 rnolc mdr\11duarc una part1COljrc prote10.1 (5p~~
La M d1 una pwtcuu può csscrc determinata confrontando Li wa mobihtl con quella di
w un ennmil) ,ulb botie della ,ua atti, 11a h1olog1ca, m quanto I.i proteina (o l'rnmna) , u:nc
ura ~ne d1 protnnc a\Tntl M nou (prott'lne st.u1dard)• eh•, .,-no sepautc suJl o ~tfiSO gcL
• ~"""' denaturata dal procedimento. In quuto ca,o, è nl·ce~~nu operare IO conJ111on1 nun Jeno1tu
, pr 01c:me,und ard,m funno•
si npona poi IO un grafico la dounu ~,orsa.da i.:iascuna d•Ue
 4<;0 IIICX Jfl\llC-& l 11101-0LIA Mt )lJ 00!.AJI na.101r W1T110fOR1Tll"lll 151

I \I MPIO l
Dctcrmin.u1one della musa molecolue mediante elettroforesi
JlOMASDA
I.la sq;ut'.'ntc tnl-dla mostr.1 lc dl\Uruc p<rlor:.c m un gd di pohaml.1mm1de m SD5
d.1 una ~ne d1 protone d1 nferunt'.'nto ,1,en11 una m,1~sa moklolare rdatJva (M,)
conosout.1 fou proteina purificata ttcentcmcntc (X), fatta lOrrere ~ullo st~o gd,
mostr.1 un.i ~mg,1u Nn~ che pcrlom: una d1stan1J pan o1 45 mm qual ~ la sua M/
re. la d1ffirnone cl 101cr.t11one dcll'en11ma e del ,ubstrato ira I due gel Jc:1crmma IJ forma•
11ont' d1 bande colorate dovi: s1 tron l'enzima ",pc.\sO \l:ngono caricata )lii gd due ,t"ni: 1dc:n•
uchc d1 campioni, 11 gel ,,ene qumd1 tagliato m due e, mcntrc una parte, 1t'ne color.it.a per
1'.1tt1v1tl, l'altra viene colorala pt'r le proteine tot.)h. Jn quc)to modo ~1 po,~ono .mahu.,rc lt'
proteine tolah e.on tenute nel C3mp1onc e 1dmufic...uc I.i band.i corr1'pondcntc all'en11ma, m
base .al multato del gel colorato per l'a111,11a
10.J.J Gel m gradiente

Protruu M, Dl)Wll.a J'f'r,ory (mm) Ancht' m questa tecnica,, tratta d1 un gel d1 pohacr1bmm1de, tuttavia que)lll non ha una
poros1t~ cost,mle (per esempio, un gel al IS''o), m quanto ,·iene formato un gradiente, nel
Tnru!CTTUU itSOOO fl.0
Albwruru d, llffl> bovino bj)()OO 12.5 quale la concentraz1one d1 acri.I.ammide van.i, upacamentc, dal 5% alla ~ommu.i al 25% sul
Om,11bwrum -15000 320 fondo dcl gel li gradiente viene rcahz.z.ito mediante un formatorc d1 gradu:nte ( p.ir 11 .3 I ),
t,IKmaldride-J-fo~fato dridrogcn,1" 36000 }80 versando la solu11onc tra le due lastre di \dro "he conterranno al gel La con~cntraz1one d1
Arudrru carbonica 29000 50.0 acnlamm1de maggiore (per esempio, al 25%) viene ver;,ata tra le due l~tre d1,c1ro per pn•
Tnpsmogeno 24000 540
Imbi1orc ddl., lnpilftl di iou 20100 61.0
ma, mentre a seguire~• forma un gradiente continuo a conct'ntra.z1one de..:r~centc d1 aera•
fi,-iattoglobulma 11400• 690 lamm1de. Alla somm11.ì del gel multano pemò prcsenu pori dJ grandi dunens1oni (5% di
Mwglobina 17800 690 acrìlamm1de), mentre, man mano che 11 campione~ muo,c ,erw 11 b.i~ aura, crw il gd, la
].HOlllD,I l ◄ lOO 790 conccntrazJone d1 acnlamm1de aumenl.t lentamente e, d1 con~uenu, k d1mcm10111 dei
utoaomoc IHOO 86.5 pori d1mmwscono. J gel m gradiente "cngono normalmente uuhm1ti m prcsenz.J d1 SD~ e d1
0
La rs-bttoglohulina tu una m~ molecolare relativa d136 800 ma t un dimero un gd d1 impaccamento
J1luhun1t11dcn11"he, a,-mu ~ molecolare rclatl\'a d1 18 400. Nelle cond1z.ion1 I vantaggi conn~, aU'uuhzz.o dei gel m gradu:nle wno due li pnrno ~ che p(W,ono c~~ere
nducmu del sampl~ 'l:1uffrr I lcg21T11 d1solfuro che legano le ~ubumta sono a~nti, separale proteine all'interno d1 un intervallo dJ \f molto pili estc<io, mpt'tto a un gel ,1 per-
d1 conscguniz.a ~uJ gel wno cv1dmmte le catene monommchc. ct'nluale fa~ In una miscela compl~~a. le proteine con pe,o molecolare molto ba\\O m1gr a-
no liberamente attra,erso d gel e inmano a i.cparam qu.1ndo raggiungono I pori di <l1men•
RI PO \
s1on1 p1u piccole, veN> la parte bai.~ dd gd Le proteine p1u grandi, d'altra parie . po,)ono
SJ costrulSCe un diagramm.1 d1 al1brwone nport.tndo m un st~lemA di assi cartesiani il ancora entrare nel gel, ma rn1Z1ano .1 l.Cpar.irs1 sm dall'mmo a "au~.1 dc.:lleffetto ~lac..c..10 Jd
los,;intmo dec1nulc (log) ddl.i M, m funnone dcli.i dutanu pcrcor~ da ciascuna gel Il 5ccondo van1.1gg10 dei gel m gr.1d1en1e è rapprc-,cnt,llo dalla po~)tbihtà d1 ~cpar:trc pro•
proteu1a ~tand.ird. S1 determina cml UIU ~ molecolare rebtt\'11 della prote1n.1 X pan teme con valori d1 M, molto sm11h, multalo che non st n~,t' a ottenere con I gel a pcr"cntua.
a orca 31 000 Sa mscn1 che, poiché quoto mt'todo ha un'accuratcu.a di circa i) 10%, la le fissa Man mano cht' le prott"me s, muo\'Ono altravcr,o 11 gd, le d1mens1om dc, ron dl\cn•
r~post.i è 31000 i' 3100.
uno sempre più piccole, finché c1~c:unJ proteina non raggiunge le proprie d1mcn>10111 lima.
te dei pon Quando le dtmciu1oni dei pon nel gel diventano troppo p1lc..olc pa conscnure 11
pass.igg10 delh proteina, questa s1 impacca m una banda sotulc Una protcma da dm11:n 10m
r11Jl!!, Ndlc ekurofol"CSl m cond1t1oni nallvè vengono an"ora utahn..iti j gel dt pohacrtlam s1m1.h. ma avente un M, leggermente mfenorc ~rà m grado d1 migrare per un trailo legger
nude ( normalmc-nle al ì .5%), ma I ~DS ~ assente e le protdn(' non vengono den.iturale pn· mente piu lungo, ;ittraverso il gel, pruna di raggwngere lc rropne d1mt"ns1om hmllc dei pon,
ma Jel caria.mento. Po1dié lune le proteine nel campione~ anah.zure consrn.ino la loro dove formerà anch·es~ una b.1nda \ottile. Quc~le <luc proleme, .iwnn v.1lou d, \I k~cr
canea nnllva al pH del g_cl ~l11ammtc pan a 6.7), lt" proteine 51 sq>ar~o m b~ alle loro mente d1vm1, s1 scpar,1no quindi m due )()ll1h bande ..,,,mc
diffcrcnu mobilit.a clcttrofom1Chc e ali effetto $t'tt«1o del gd. ~on è poiS.lbilc prc\c:dere
qwlc
• comportammto mostrc-ra .una dctrrmm.ita pro1-na •• 10 un gcI nattvo, ma, grane aI• I 0.3.4 IsoelettrofoCJJl1zzaz1011e
I amp111 mtervaJlo d1 anche e d1 d.imcnSJona deUe protein•• pr--t ~ • 1 m una de1ermma1a ma·
Kda. ~ po~1btle ottenere• una buona rnolUZJone• L'en7 uua ...., di inie • __ tiICll· I 'irocle11rofocahzzaz1one lf P, lsoElmc,c Fornm,g grl) è irlca..lc p,.:r Ll ~q•.u,11J<mc d1 M>·
resse può c-sscrc lu.cnll
to mcub,ando Il gd in un appropnata solunonc d1 substrato, in modo I.tIe ~ he m cornsron· · >WU.C:anfotc~ come le pro1eme.m quinto è ba,.110 ~ulla ~cp.tr.monc dclk molc"olc m b.iw: .11
dcnza della pos1Z1onc occupata dall ci:zuna nel gel s1 wilurr• un prodotto colorato Un me- .roco dl\'trso punto 1soclcttnco (p.1r R I). 51 lrJtla d1 un metodo ad ,alta usuhwonc• ..:Jp.a.., J,
todo altanall\O per I. mclu1one dell enzun.1 consiste neU',ncl udere tl substrato m un gcId1 ~parut' molecolt' con punii 1soclet1nca che d1tf.:mcono tra loro d, O 01 uruta da pi 1.11~1.'>lrnl,\
piu uuhwto nella te<:n1ca 111 1mp1ega gd onuontah 6 U piastre d1 vctro o logli d1 plasllca. La
=
1~ros10 che, 1enc succes.s1,-amc:n1c ,ersa10 sul gel di po'·-cr1Iamm1de e luc1110 po I1mcr11.za·
 BIOOIIMlf.A E ~101.0GIA MOI I COLARE
-CH1-N-1CH11.-N-CH1- dove R • H o - (CH1 1.-COOH
I I n• 2 o 3
1CH11. tCH11.
I
NR1
I
COOH
I agura IO 7 Formula ~nenie dtgJi antul111
S;S:p.l.ClZionc, iene otrenuta applil,mdo una d11Terenu d1 potenziale alfr C.:)tremua d1 un gel che
uinticnt· un gradiente d1 pH Que~t ultimo viene rc,il1uato mcd1,mte l'mtrodu11one nel gel di
,;ompo5ti chi.un.ui .1.nfol1tt: rni51.cle compl~e di ac1d1 p0Liammmo-pohcarbo)silic1 ,mtetic1
(r 1g. 10.7,wii r9Mno uqw~tarc anfohu che coprono differenti intervalli cL pH.s1.1 .uup1 (per
~pro, pii 3-10), \la mtrrtt1 pcrNmpio, pH 7 S1,J'intcrv.illo di pH vumescelto m modo
che comprenda i ,aJon dei punu 1\oclettm1 (pl) dei campioni dJ ~eparare Tra gh .mfoli11 d1-
.sponibili m 1.ommcruo 'l.1.\0no I composti Bio Lyte e Pham1alyte
Trad1Z1on.ùmentt, 1 ncercatori utilizuno gel per 1wdettrof0<;altz.z.az1one deUo spe~'>Ore d1
1-2 mm, ma a.I co,10 relat1vamcnlc .ilio degh anfolit1 rende quc~t.l tecrua piulta510 co~tosa, se
-~• dcvonu usatt.molti gel Tuu.ma, l'introdUZJone d1 gel per IEF a strato sottile, che hanno
uno spc~ore di ~oli O 15 mm e vengono preparati 1mp1egando una stmcia d1 n.1.stro •~olante
come sp.u,.1atore tra le due p1a,1rc del gel, ha ridotto notC\olmente I costi d1 preparazione, ren-
dendo questi gel d1 u,o comune. Poicbt le protei.ne sottoposte al campo_cleur.u:o de,wno po-
teN muovert liberamente m_b.uc alla loro c.ar1~ u tCl;mca IEF viene ~gu1ta m_gel a bas~_
~n:entl-lilk,pcr ev1t.ue quabwa clkno d1 sctacoo molecolare all'interno del gcl.s~ Vcn-
_ gonQ usa.ti c.om.unemente "el d1 pohacnlamm1de (4%), ma anche l'agaro~ìo può ~re utihz•
uto, specialmente nello studio di protcmc con alta M,. che potrebbero subire effen1 d1 setac-
cio anche in gel c l ~ mountruionc d! .i.crilammide.
l'«- la pr~paraztone d1 un gel per IEF ,,utr.ito 50tti.lc, gh .infohu, che coprono un mtcrvaUo
Ji pH adatto, e la riboflavina vengono m1\cclat1 con la '><>luz1onc d1 acrilammide e la misccl.1
, u:ne r.oi Hr~ta wpra una J.uu-a d1 \!etro (tipicamente dt 25 . IO cm) contenente lo spaziato•
re. ua $CC:Ollda lastra d1 vetro viene, quindi, J>Ojizionata sulla prima per formare J) contenitore
del gel; quc-.to \;ene prepuato mediante fotopolimen.aazione esponendo I.i solurionc a luce
mtcm..i La fotodecom~one della ribo~,ma genera Wl radaule li~ro che dà mttto al
procCMO dt pQlm1enu..uJOne~par. 10.2.2), per il q~e~no n«~e complessivamente 2-3
urc. Una volta che il _gel ~1 ~formato.la fa,tra d, vetro supcriorc viene stacçata, )asciando 1( gel
m~ollato a quella mfenore. Gh elettrodi a stoppino,.cos11tu11i da spc~~ (J mm) str~e di carta
da filtro inumaJ1ta (di acido fosfonco per l'anodo e di 1dro~ido di sodio per il catodo} vengo-
no ro~ona11 lungo i due lati mJ88ion del gel. S1 1prhca po1 una differenza dt potenziale,
~0110 I effetto della quale gh anloht1 formano un gradiente di pH tra l'anodo e 11catodo. La
tliffercnz:a ili potenzi.le ~me qumd1 nmo~ e I ampmni ~·cngc>no .ippliuu appoggiando sul
gel Jt·1 pJCcoh quadratllll d1 au-.t.t imbe..-ut1 del camp1onc~tc»o si applica nuu\amcnte un
"oltaggw per etrc..i 30 mrnut1. per pttmcttcre al campione di p~l..lrc (per elettroforesi) dalla
carta al gel, do~1ch~ 1quadratini ili c.irta possono essere rimou1 A bC.:unda del punto dd
gradiente d1 pii m cui' iene appliato il camr1one, le pro1dne che" tro\-ano 1na1 ialmcnte in
TI OIIOtr tuTfltClfOUTIUlt
45.3
una rci;mnc nenie un pH mfcraorC;' .il propno punto uockttrlCO M ClrlLhcrJnno p1hllt\'a•
mente e mazaer.inno a nuguce ,er~ il ca11,Jo. Tutta\ 1.1, man m.1n11 che e,sl· ,1 ,p(1,1Jno, 11 pH
deU'ambirnte circo\tantc a.umenta m modo uniforme e, di conSC;"gucnu. la amca po,111\'.l del
Ll. prOtCill,l dimmu1:.1.c, finché la protema raggiunge alla fine la p<Nzione m cui 11 pi I i' uguale
.tl c,uo punto ~odcttnco.A <jUC)t0 punto la protem,1 h.1 forma 7.\flttenon1C.1, prl\J da c.in..:a
nctt.u:yqwrul.J, cc~!>.l di muo,ersi.
Analogamente, le "<hUnze che \I trovano inizialmente in una regione a,cnte un pi f \Upt."•
norc al proprio punto 1!>0clettnco, 1)1 can..-:ano ncp.tJ,'òtmente e iniziano a m1grare, crw l'ano-
do, fincht non.ragg,ungono, loro punti 1,oelcttnci e~i•rr~o.S, ~ - • e.be, po1~ht le so-
\tJnze sa muovono ,empre verso I loro punti •-lcttrac1, il punto del gel m cui ~1 applicano 1
_,.1mp1om non rappresenta un fattore cn.tico Per ottenere ~arworu rapide (In 2-3 ore), vcn-
_gono ut1hn.111 voltaggi rd.Livamente alu (fino a 2500 \')~ J>o1cht M sviluppa una. notc,olc
quanllt."i d1calore. 1 gel venguno fatti correre ~u pi.ll>trc refrigeranti (10 °C) e~ ta riwr~ ad
ahmentaton per ~tab1linare la potenza prodotta e, quindi, miniminarc k flutt1J..1ZJ001 tcrnu•
che Dopo l'elettroforC!.1, il gel deve ~re color.ilo per m·clare le proteine Quc,ta opcr.111one
non p.uò ~~ere, tut.Llvia.esegui.u.cùrcu.uncntc.m.quanto anchcghanfohu H:rrebbcro ..olora
u e s1 otterrebbe un gel completamente blu. U gel, qwndi, ncnc prnna l,wato I.On una ,oluL10-
ne ~ ( pcr t$Cmp10, acido tncloroacet"o .il 10%), che prcap.1.ta.lc..protcine.ncl gel e n
..muovclc molecole d1 .1.nfoht.i, molto p1u pi«o!c; a qu~to punto ,,ene colorato ,on Coonus
$1ehrjlliant blue e decolorato (pJr 10.3.7). Un t1p1co gel IEF ~ mo\trato nella figura I0.8. Que-
sta tecnica è molto simile a quella del chromato{ocusmg (par. 11 .b.3 ).
llpl d1 una partacolare protema puo Cl>Sett facilmente determinato facendo correre una
miscela d1 proteme aventi pi noto ,uUo stc\W gel In commercio \Ono repenl:,1b numerose mi-
scele d1 proteine con d1\"ersi valori di pl, che t.:oprono l'mtervaUo tra pH 3 5 e 10 Dopo la co
!orazione, I.i ~ z a di ciascuna banda da un elettrodo nenc m1surat.1 e riportata III grafico
m funZ-lone dcuuo pl (che corri~ponde al pH in qud punto). La curva da calabraz1onc, co,1 ot•
tcuuta, con~tc.di de-terminare il pi mcogmto d1 una proteina dalla sua pow1011e sul gel
La IEF è una tc~-naca molto ..cnc,1bile, part"olarmente md1cata per studiare la macmctero
gcnettà di wu protcma. P.:r ~mp10, una proteina può app.1r1rt come una ,ingoia banda su
.!!Il gel m SDS, ma può onguure tre bande su un gel IEI ; 1..omc ac1..ade quando un.i protcma
O1ste m una form.i mono-, ba e trifosfori.lata. La prcsenz.a di uno o due gruppi fosfato m pau
non ha un effetto s1gnifiwu,·o suUa n\aS.>.1 molecolare relativa tot.li.e dcUa prutema, per cui nel
gel III SDS 51 ott1ene'-!na smgol1 binda, ma la p1ccola d1ffcrcnn da canea in1rodotta ,u ogni
molecola può essere 111\Cl.:C melata d.ill'lEF.
li metodo è parucolarmentc vantaggioso per separare gli 1soc:nLirni (par. 8.2), ciuè forme
da\·crsc dello st~ cn11ma che, spe,w, d1ffen)cono per wh uno o due rt-~1du1 a.mmmuac1d1c1
• Poicht le protcme ,0110 nella loro form.i nallvJ, gh en11m1 possono es~re rilevali mcubando 11
- scl non ~lo e non 1..olorato m un'appropra.ua -.olu11011e d1 sub~trato, oppure str.iufìcando
su J 1esso un gel di agaros10 LOntencnte il sub~trato. Que)ta metodologia ha trovato una p.uu
colare apphc.wonc nella .)(ienz.i forense, nella quale tra~..e da sangue o d1 altri l1u1d1 b1olog1c.a
p~ono e~>Cre anahzutt· e confrontate in ba~c aUa compo~1Z1one d1 dctermm,1t1 l\ocn11mi;._
Sebbene J'IH' ~•.s 11np1e:gata -.oprattutto nelle ,cp.1ra2ioru an~.htKhr, può c~c u1tl1aJta
.1.Uchc per ~cori preparati, 1 l\cll lEI· vertl~-ale ~u ~olonna_~i ~uli_,~.i una rnlnnna da \"Ciro, rJf•
fr1.-Jdata ,on acqua e riempita ,on una m1sLela d1 anloh11 ,caolu m una ,olu11onc d1 ,a,~.1ro•
~o. ,hc forma una gradiente d1 dcn\llà per pre\emrc la d1lfu-.1011e. Quando IJ .\Cpa.razmne è
 8!0ilt1MICA [ PIOI OGIA Mili I COIAJU' TfC!<I< lii 11 F11ROI0PI 11011

ne m bJ~c alle d1mcn!>1om. La combm.u,one d1 queste due tc ... m... he ncll'clcttroforc~, b,duncn-
"onale (2-D PAC.l) d.'1 luogo a un metodo analiuco molto sofislllJlo per l'anJh,, d1 m1,u:h:

-.-..
~ _prote1d1.c Allo scopo d1 ot11m1a.,ue la ~parv,onc, molti ncercaton ut1li11.mo gel 1 D i.li
grande formato (20 cm • 20 cm), sebbene 11 ~,~tema m1111gd po~ e, .ere uul.iu.110 m akum
cast ottenendo ~cpar.urom adeguate Nel caw de, gel d, grande formato, IJ pnma d1mcm1one
(1soclettrofocaliUU1one) viene condotta m un gel d1 acnfamm1de preparato su unJ ~•n:.1.1J dr
plasuca ( 18 cm · 3 mm d1 IJrghezza). rf gel contiene anfohu (per formJre 11 gradiente dr pH)
ms1eme a urea 8 Me a un detergente non 1oruco, e.be denaturano e mantengono Ul solullone
Jc.p.roteme da anahz.zare. D1 conseguenza, le proteine denaturate s, separa.no m quc~lo gel a

~
seconda del loro punto .LSOelettnco. La strlSCJa per l'IFF vume qu1odi wcubata m un appo~1w
tampone-(samp/e buffer) contenente SDS (che s, lega COSJ alle proteme dcnaturJtd e quindi
posta tra lcrut.c.ine dJ vctro,10 cima a un gel per SDS-PAGE al I0% precedentemente prepara-

- -to..L'elet1rofores1ha mmo e le proteine legate all'SDS corrono nd gel e s1 M:parano a second.i

_della loro dimensione, come descritto nel paragrafo 10.3.1. I gel per IEF sono fomiti come
stnsc:e d1S1dratate, che devono essere reidratate per una notte. l...l corsa della prima d1mcn,10-
ne IEF nch1edc circa 6-8 ore, il passaggi.o di equ1lrbramento con 1I sample buffer per SDS arca

- - - ~ e
15 mmutt e, infine, 1I p~gg,o dr SDS-PAGE s1compie in circa 5 ore Un Up1co gel 2-D è mo
strato nella figura 10.9. Con questo metodo~ possibile separare regolarmente tra le 1000 e le

--
3000 proteine da un estrailo cellulare o tissutale: alcuni ricercatori hanno nferllo, in cas, par-
~ ~ ticolari, La separazione di un numero di proteine compreso tra 5000 e 10 000. Per le applica-
zioni della 2-D PAGE e per una descn z1one del ruolo centrale di questo metodo nella proteo
mica s1veda il paragrafo 8.5.1
. .-.
.,_.. 10.3.6 Elettroforesi su acetato di cellulosa

Sebbene sia uno dei metod1p1u datati, l'elettroforesr su acetato d1 cellulosa vanta ancora un
certo numero di appltcazioni In particolare, continua a essere 1mp1egata neU'anah~1 clm,ca
dei campioni d1 siero. Rispetto alla carta, l'acetato dr cellulo$J ha il vantaggio dr e~ere un
mezzo molto piu omogeneo, con pon tutti deJJe stesse climens,oni, e d1 non adsorbire le pro-
teme come mvece fa la carta. S1ha qurnd, un minore "effetto stnsciatJ'' delle bande delle pro
2 3 teme e la r1Soluz1one ~ nughore, anche se non pan a, hvell1dea gel d1 poltacrilammrde Qu(')tO
5
metodo è 1u1tav1a p1u semplice da allestire e da eseguu ec Clmp1om srngob vengono solita
hi;tini I OI Tipico gd di 1'0Clt1trolOOl!iuuionc Il nnio
i
dud IVCllll punu isodettna notJ I 1-'(lZUlll dal 1~ po~no connme una mis«la d1proteine stan mente fatti correre su ~tnsce dr acetato di ceUuloSJ (2.5 x 12 cm), sebbene frequentemente pru
(l"n ~ntalc concos1oncddLI B,o.Jlad labor.iton~ t,Zntmg,mo qiunuù t:Ttsant1 d, veleno di ~rptntt. carnp,ont vengano fam correre contemporaneamente su fogh pru larghi L'acetato d1 ceUulo~
viene dapprima imbevuto del tampone dJ elettroforesi (a pH 8.6 per I c.imp,oni d, siero),
qumdi 1I campione ( 1-2 mm') viene applicato su una striscia larga I cm, posta approssrmau
vamente a un terzo dcllJ lunght-z.za del supporto Le estremità dell,1 ~tnsc1a e.ano m contatto
...ompJetA, le corrauc \'JCOC llU.arott.i e 1~"mpo del · con le vaschette contenenll 11tampone clcttroforeuco tram11e uno stoppino d1 ~arta da filtro,
...., nc:ntJ campione vengono elu1tt mediante
una valvola poita alla bue della colonna ln altema11va l'IEF che viene sovrapposto ali e~tremrt.ì della stnsc1a dr .1cetato dr i:cllulo~a. Lelettroforesi viene
__. • preparativa può e~re eseguita
su letti d 1gc-,granul.lre,come'U~haJcxG-7.5(p;ir 11.8.2)
condotta a 6-8 \"cm' pa circa 3 ore Dopo l'cJettroforrn, la stn!.lta viene colorai.i per ev,dcn
zia re le proteine (par. IO. 3.7), decolorata e le bande vengono co~• v1sual11z.1te. L'nJ caratteri ..
l O.J.5 Elmrofomi bid,mmsionale su gel di poliacrilamm,de ~llca ~parazrone delle proteine del ~,ero mo~tra circa ~e, bande pnnupalr Questo profilo, tut
t.ivia, cambia m molli StJII pJlolog,...1e 1I medico puo co~t ottenere 1nformJ11on, ,ullo st.ito
Questa tccnia combma I If F pruna ~ O l l t ) eh
• e 5epara 1e proteine d1 una m1\cclJ rn
b.tsc aJJ.,. ClnC:l{plJ. con I ~DS PAGI s«onda di clinico del pa.11en1e, mila ba>C del profilo Jlterato Sebbene ~,a an...ora frcquentemi:nte utrlr 7
mcnsione), ndlJ quale la separazione aw1e· z.at.i per l'analm del \!ero, l"'clettroforc~, ~u acetJI<> d1 cellulo,a ~,a per c,~re ,opp,antata dJi
 4'>6 BIOCJI Il ..Ar ll!OLO( U MOl.l• 111.ARr
Tlf~I H llFTTllOI-OIUll H 457

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_,,,,.. 2 3 5 6 7
•
Il• ' • • •• r1gura IO 10 flcttroforc<,1 d, un c.amp1onc d1 siero umano ~u gel d, ag.trO\lo. I ponclll 2 3, 4 et, mmtrano

• :-~• ...
2o.,..; profili pro1t1ct dJ 11ero normale, mentre I po=tll I, S e 7 quelh d1 paz1cn11 aff,111 da m1cloma, u,c ..ano
• •
1dcn11fica11 d11J'c.;ccss1v.1 prod1monc d1 un pamcolarc anticorpo monoclonale tro,ato nella lra11onc lgC.
( Per gentile concc»1one d1 Charlrs Andrcw• e N1chola, Cund) Edgwarc Gmcral Ilo,p11al london l

15-'
• ;. ~
I
1(>-
• •• • tensit.ì raggiunta dopo un tempo dettrmrnato è un,1 m1sura ~em1qu.inuu11va delfa quJntnà
dcLLJ proteina. Cosi, per e~mp10, st può far correre su un foglio d1 grandi d1mens1om un ek
valo numero di campiom di siero, effeuuare l'an.ihs1 mediante anucorp1 e 1den11fic.ue hvclh
aumentati di una specifica proteina, in determinall camptont, in base all'aummtata mtemllà
ftgu~ 10,'I 11piru gei b1d1mt'ru1oruk Il campione .appl1<ato era coi.tituito da 100 µg di proteine totali, del colore sviluppato propno in questi camp1om
u
;;;r11:,e d~ un \'ffllriw~cudto norm.ale d1 aM pnnu d1mm,1onc e ,tata ot1rnut1 i.u un gd per 1soc·
tro o.:a ILUZlollC'a P 4•7, 1«0nd.uu un gtlvcnlC.l.leal ll'l. m SOS-PAGll li pattern~ smo vuuahz
zatud~roloruron..-ad •rpto I~ gmttle cuncnilQne d1 Mon,qur Hm1kt e l)r Mii-e Duno 1>1vmon of
<_..ar III oraa.: SuJEnr, lmpcrw <..olkgr Sd1ool of M"'11c1nc, Hcan Sc1mcc Ccntrc, Harc6cld, UK.) 10.3.7 Rivelazione, stima e recupero delle proteine da gel
li colorante ptu comunemenle usato per rivelare le proteine net gel~ 11 Coom;m1e bnlhant
blue R- 250 (CBB), un colorante tne1tlammmo ~olfato. La color.121one viene e~egmtJ u,ando
gd di il~rosio, che !Wlno rtjuJUtt Simili, m;a hanno uiu migliore nsoluZJonc. Un 11p1co cscrn· CBB allo O.I% (v/v) m metanolo, acqua e acido acetico gl,male (m rapporto pem:ntu.ik
pio ddl aru&list dd ilero su ~n ~J d.t 3 garm.10 e riportato odi.a figura IO.IO. Profili s1mtl1 s1 ot· 45 15:10 m volume). Que~tJ m1scel,1 d1 arnlo e metanolo ag1~e come denaturante per preu-
tengono an~he utilJ.ZUI1Jo I a,ctato d1 ccllul°"- pllare o fissare le proteine nel gel, m modo da impedire che le proteine vengano a,port.ite dal
Andle gh 011Jm1 possono c:ssac facilmente nlcvat1 no campioni ~ttopo~ll a elettroforesi gel durante I.i coloraz1one Per la maggior parte dei gel la coloral.Ione mh1ede c1rc.i 2 ore e I.1
,u ilCctllto tl1 ~dlulosa, uuhzundo I.a tecnici dello ztmovram La · d d Il detolor.monc, che nch1ede solitamente una notte, viene condotta mantenendo 11 gel m legge-
Iosa, tene p<»ta ,u una .st~ d1 carta da lilt •-'----o d ma. stnsc1.1 1acetato I cc u- ra agnazione odia stc<--.a ~luz1one di acido e metanolo, ma IO a~cnza d1 wlorantc Il color,m-
ro u=ut.t t t.tmpone conteneme tl sub\trato.
Dopo un opportuno periodo da mcuba.uone,leMnsu,engononm~e la carta viene trana• te C..oomasMe è molto sem1b1lc; una banda poco inten,a su un gel d1 pohau1IJmm1dt• ..om-
ta tn modo d.t C\1dmmre 11 prodotto dclla ~ spondc a carca O.I µg {100 ng) d1 protema La colorazione con CBB non ,iene uuhn..a1a con
,1_ ., onecnllmatic.a, è qumd1 pomb1lc ns.1ltrc .illa
pomronc ur11 alll\1ua cnz.unat1c.t su!Li strtsaa o Un · l'acetato di cdluJosa e nemmeno per le proteine wttopo~te a blot) IO quanto tale ..olorante , 1
1 _ ,1_ nguuru approccio altcrnat1vo per I.i r1k·
,'lllonc e"' udenrumwonc scnuqu.anut.itiva d 1 / lega molto Mrcttamente alla caria. In questo caso le prottme vengono dcn.uur.itc mediante
, IJUO suu, prolclna ,ull:i stn~ consiste nel
u-attare qucs1 uhmu come I cqw\.ùrnte di un blot e nd r ,._
_ _ ,1_
I •
1~~,carc a proteina IO esame uu Il·
J una breve 1mmcr,1onc della ,tn ,eta IO acido tndoroacetico al 10% (,/, ), qmn<l1 1mmer,c 111
<.,UlUU anucorp1 pnnun e, ,uccom,mcntc ant,corp ••
'
_,1_
1 ...co,...,.n coniuS.ltt a cn11m1 par(
una solu110ne d1 coloranlt ..ht non s1 leghi al makria.le <l1 supporto, per cscmpm Proc1on
10.J 8 li COIore ·"ilupp.ito dal aubstrato md1ca I.i p:rt1enn d )' blue, Amido h)Jck o Prooon 5.
...... t un.i par11col.trc prott ma e in·
458 ftlO( IIIMlc.\ I BllllOGIA MOI IUJI/JU. TtCNl(lll I UTI IIOFOIIJ neIIE 45'.I

:-;-.,nost.i.nte la coloru1one con Coom.15:>ic )l.l molto ~m1bile, molti m.ercatori nece~~ttano una p11.cola "camera o~ura': a sua volta collegata con un.a fonte d1 luce btanc=i o ultravioletta
d1 un.1 -.ens1b1ltt.'1 ,upenore, wme qudla offerta dalla colorazione ad argento (~,lver s1a111111g). (tram1llum in.i.ture). Le: immagini det gel pos~mo essere arch1\•1ate nel computer, ~ necess.i.
Que,.,to tipo dt 1.oloraziom ~ono ~te su tecniche sviluppate per l'istologia o su metodi basa- rio mtcmific.i.tc e ~tampate a nch1e)ta con una slòlmpante term1~-a, elrmmanJo co,1 lo)' tlup-
li sui proc.:ess1 fotogr;afici In entrambi I asi, glt 1oni argento (Ag) sono ridotti ad argento me- po in un bagnfl rivelatore, posto tn una camera oscura appositamente costruita, come aw1e-
talltc.:o 5ulJ.i proteina, dove l'argento s1dcpo)1ta formando una banda nera o marrone. La colo- ne nel caM> della fotografia tradizionale.
rwone ad argento può e,,)Cre u1thzza1.t 1mmed1atamente dopo l'clettrofores1, o, m alternati- Sebbene l'elettrofore,1 su gel ,,a mat.t generalmente per scopi analtttet, può oscre ut1h1-
va, dopo la colorazione con CBB. Con quot'uh1mo .tpproccio, le bande prmc1palt possono cs- z.ata anche per separare le proteine su gel al fine d1 purificarle. Per ottc-nere I dau sulla l.c-
...ere identificate sul gel con CBB, mentre le bande meno intense, non evidenziate daJ CBB, quet11..a, le bande proteiche poswno venire ntagltate dat blot e cancate ,u un ~uenz1atore d1
po-.sono e~re identificate usando la coloraz1one ad argento. La colorazJone ad argento è al- protcme (par. 8.4 3 ). Le bande proteiche colorate po~~no t">scre ritagliate dat gel e la protei-
meno 100 volte p1u ~ns1btle della colora.ztone con CBB e rivela le proteine fino a una q uantJt.à na può essere recuperata estraendola dalla .;e-Lione di gd mediante elettrofore~1 (clcttrodu1-
mm1ma. di I ng. Altre colorazioni con stnule sensibilità mcludono le colorazioni fluorcscenll 11one). In commercio sono d1Spomb1li numcrose celle di clcttroeluu1one d1 ttpo diverso, ma
con Sypro orange (30 ng) e con Sypro ruby(IO ng). probabilmente 11 metodo p1u scmphce cons1)te nel porre il pezzetto dt gel all'mterno dt un
Le glicoproteine vengono tradmonalmente rivelate sui gel mediante coloru1one con aci- i.acchetto da drahs1 contenente un tampone, e nell'1mmergcre il '>.lethetto nel tampone tra
do periodico (PAS, PmodicAc1d-Sd11fJ) Questo tipo di color.mone permet~ di distmguere i due elettrodi. Per effetto dcll'dettroforcs1, la proteina fuonesce dal gel, ma viene trattenuta
componenti d1 una miscela di glicoproteine. La colorazione PAS tuttavia non è molto sensi• dal sacchetto da d1al1s1. Dopo l'clettrocluiz1onc, la corrente viene mvc--rttta per pochi se-condi
bile; moltre, produce bande di intensità molto debole, d1 colore rosso-rosato, d1ffic1lmente per consentire alla proteina eventualmente ad$0rb1ta alla parete del s.1cchetto d1 stac1.ars1 da
osscrv.ibth sul gei Un metodo molto p1u sensibile, impiegato attualmente, constSte nell'ef- essa; infine, s1recupera la soluzione contenente le- proteine all'interno del sacchetto.
fettuare ti blot delle proteine (par. 10.3.8) e nell'ut1ltzzare lectme per rivelare le glicoprotemc.-
Le lectme sono molecole proteiche che legano i carboidrati; si è scoperto che lectine d ifferen- / 10.3.8 Blo.t ting delle proteine (western bwttmg)
11 sono speafiche per dtfferentJ tipi d1 carboidrati. Per esempio, alcune lectme riconoscono rl
mannosio, il fucos10, o la glkosamrnina termmale presenti nella catena laterale di carboidra- Benché .sia essenzialmente una tecruca ,mahttc.a, la PAGE provoca naturalmente la M:para-
ti delle glicoproteme.11 c.i.mpione da anahzz.,re viene fatto correre in un.i sene di corsie in un .zwnc delle proteine di una nusccla durante il processo di clettrofor~ t po~1bùe ~fruttare
SDS-PAGE. Se ciascuna corsia sottoposta a blot viene incubata con differenti lectine, qumdi questo frazionamento per esaminarc ultenonnen te le singole proteine separate. li prJJllo p~
lavata e nuovamente incubata con anttcorpi anh-lectina coniugati con perossidasi di rafano .saggio conslSte nel trasferimento (blot), delle proteine separate, dal gel su un foglio di mtro-
m presenza del substrato della pcr?~stdasi, nei puntt m cur te lectme st legano appaiono ban• c;dlulosa..Tole metodo è con~uto comeprMi-m bloumg Ctra~rimcnto delle proteine). o.11T-
dc colorate
. In questo modo, saggiando un campione prot•tco ~
cont ro una sene · "~
· d"I Iectme, sttrn /1/ortmg per analog1.1 con ti Soutl,ern blottmg (par 5.9.2), laJecmca utiliuat.a per: iJ recu-
posstbtle non solo deterrrunare
. se una protema t gticostlata , ma h · ,.
anc e o tenere 1niormaz1om
1 · · pero dei camp1om. di DNA dai gel dt agaros10. 11 trasferimento delle proteine dal gel alla ni-
suI upo d 1gJ• 1costi azione trocellulosa. st può realizza.re medi.inte un.i. tecmca nota come clettroblott1111 nella quale un
.lnfonnaz1oni dt llpo quintitauvo (cioè misure delle quant ttà rcuttve -•- · d 1d 1f~,erenll prote1- sandwich di gel e nitrocellulosa viene compresw in un app~1to contenitore e imme~. m
~e in un campione) po~sono ~re ottenute mediante la den\1tometna a scansione. Esistono tam__pone, tra due c:lettrodi par3llcli (F1g. 10.11 - Nella direzione perpendicolare al gd, viene
in commercio d1vers1 ttp1 d1 densttometn a scansione che 51 b u1J • d ll fatlòl passare corrente, provocando la m1grauone elettroforeuca delle proteme, che fuonesco-
Iuce trasme~ qu.mdo un raggio lummoso (laser) viene ( tt asano s a mtSuraztoneI e1 a no cosi dal gel e \t trasferiscono sul fogho dr nttrocellulo<,a. 11 foglto d1 rutrocellulo5-a su cui si
a o p~re attraverso unge co o-
rato. S1 ottiene
. _una rappr~ntauone grafica
_ delle zon•~ contenenll proteine (p1cch1• dt• assor- '>Ono trasfentc le protcme viene. m genere, qu.im.i.to "blot" Una volta tra:.fcnte sulla nitrocel-
banu), m funzione della <fol.lna . d1_m1graz1one • e si può,.,
- coIare l' area de1 p1cch1 per otte- lulosa, le proteine~para!.C possono essere ultertormcnte C\J.minate. Crò nch1ede I Jnahs1 del
nere dati quint1tallv1. Quoti, tuttavia, devono essere interpret 1- I' blot, ~olttamente uultu.ando un anticorpo per nvdare una spec;1fica proteina. li blot viene
_,, d' . • a I con caute1a, m quanto m-
ter.=o I conccntrauone prote1a per ti quale è vahd• I l · - dappruna wcubato in una solunone proteica, per escmpto albumina di siero bovmo al 10% •
• • e a re azione 1meare tra assorbanza e
concentranone è lim11.ato. Inoltre, non sempre quantità .1: d . . (pcw/volume) o latte m polwre ~cnza grassi al 5% (peso/volume) (la cosiddetta tc..nia "biot-
.11 d ugu,w I proteine diverse si colora-
no .....o stesso mo o con un dato colorante, per cu1ti confronto tra le _ to ), m modo da bloccare tutti i rimanenti s1t1 d1 legame 1drofob1co sul foglto di nrtrocellulo-
teme può cucre !>Olo =iquantJl.ltivo. quaoutà rclauve dt pro sa. li blot ,,1ene qumdi incubato in anttStero dùu1to ClnttCorpo pr 1mario) diretto contro I.i
Un metodo alterniti\o, e molto p1u economi·co p 1 protewa di interesse. Qu~t.t molecola d1 lgG s1 lega al blot se ncono~c il suo anugene, ,denti•
• cr o tenere: questi da1·t consiste neI n ta•
ghare le b.i.nde colorate di interesse• eIuue 11co1orinte mediante a · ficando co:!J Ja protema di mtcres~ Per v1sual11:ure questa mtera21onc, il blot viene succc,,1•
un volume noto dt una s.oluiione d1 d' _, . gitu1one per una none m ~.imente rncub.ito m una soluztonc di W1 ,mtt<.nrpo ,c,onJano, Juetto contro le lgG ddla
pm ma,.. 50% e m1rnrare con r, t
quantttà ùt colorante rilasciato. Recentemente, sono stati messi a uno spctt_ro otomet_ro a specie che ha fornito l'anticorpo primano. Per ~mp10 ,e l'antacorpo pnmano è nca, ato J.1
cumc-ntazioM dei gel, .. he stanno soppt.1 t d I d punto molti s1stem1 d1 Jo• coniglio, l'anu,orpo secondario SJrJ diretto contro le lgG Jt coniglio. Que,to anu.:orpo ,.--
n an o a cns1tomctna a . Q - .
Ja ban-.o comprendono un'unità 'lltdeo di SC<1n~1one. u~t1 s1stem1 conJario viene opportunamente mar..ato, in modo che la su.i. interazione -.on I'anll<.orpo pn-
,magrng (collegata a un computer) conne~sa con
 li WI 1111

r-1-Spugnt sd,hcnc.: i;h c1wnu ~umo I muc,11111 1Jr u Ocomun~ prr ~h ,111t1wrp1 sc,onJ,m, po ono
l,~rn 1111hn;i11 ,111.lu.• 1h1111urcaton ,1kun1 ~unu cl.11, 111 d, ,rgmto
• Arlllc °'I''
s, (<1111/,1r, 1111,rc.111 W/l I. 11 ks~mc I blot \ lCIIC mduhl p, I mct.70 dr IIUIUI ,1d10
gr.ih.i(par 1123)
A11t11il'711 fluori-.u 11t1 111,111111, t(HI Jl11or, turn 11/llrth r,111,111,, qursto 111.iru1torr lluor~cntc
, 11:uc I t\'el.ito mcd1.mtc c,po~111onc ,1IIJ lulc ultr.i, 1011.'ttll
1
• / n>tr11111 A 111,ir«l/,1 w11 /• la protcma A, pu11fì<~ta il~ \111pl11fo10C1US ,1111't'II), ,, lq;,1 ~pcCI
1Ìl,1mcnll' ,111.1 rq\mn,• I, 1kllc molclol,· dr lgt~ l..i rrotc111,1 A 1nar,.11.11.1111 I, iene 4u111d1
ulÙI, /,llJ .Ù pu,tu ddl',11111wrpo sc,ond.11111 e 11 lc-g.tm,• al hlot put\ csscrr mcl;ito mcJi,mll'
.u1tor,1J1o~rJl!.1,
• -A11t1wrp1 $Url111/,1n IIIClf<tllr f(III t1r11; !,1)1111 d1,r11mb1h 111 \\lOHllCr,10 i.llllll(ll(\I SC,OIIÙ,trl
Fogh di piutic. porou (,11111 lg{,) mc,1111 d1 mmu!><.olc p.uti,cllc d'<uo Qui:,1r Mlll!l \l\1l11h <lm:11.1111cnt1·, 111
N,t,occllulou ,1u.i1110 J umo un.i ,olor.i1to11C' 111,-.a <ju,rnJo k,:.mo I .inll1,.orp.., pr1111.1rn1 ~111 blnt
Gel lii pt0taln1
• I ,t b111t1nJ ~ unJ, 1111111111.i a b,h',(l reso 1110!.-x,11.u,· ... h..• M lct,t.i
,\J1111Mp1 ,t·w11,/,1r1 /111111111/1111

I ,gura IO 11 ~hC'ma J1 tlrttr\>M11lt111j!, li r;d ~ ~u1111rortt a hlu1 \lfllt p,,.111 u1 un• ~pui;n, ti&1mllt'\\1111h
umroM Il toi,1111 J, mtro,tlluln-. ,"kne qmnJ1 •1'1"~1•111 •ul i;cl l na l('(u111J.1 ~ru11ntni 1ml'f,111a eh
um1,on<' ,1mt 11m1a '"I''• 14 mtn,.tllulo\l l~1t•umh,1<h". tenuto 111\ltmt Ja ,lut' h•11h J1 rt•,11,~ J'<•n>u
ng11b kg;i11 J, Jur ti.i 11,1. mnr 1•111 I'"'"' 1r• ,tu,· rlcttio,h, • ~• r,ualkh.111 un i.c"rh.atmo um 11 t•m1><•1n
t ,,rnr trna p.A\l.lre la «>11cn1t l\,:,hé 1111td<' pn•tr1nc h•nno um1 ncg,1tl\"a, 11 $,lll1l.. 1d1 ,le,< tsJCre )lllt
malo w moJo d1c 11 mczw u11m11hJ1mint< r1111.111g;i tra ,I~ r I aM,fo ~• 1&d J1 ~I l'I puha, ulam1111J,,
molto foncmcntc 111.1 protcma dl'll'uu\O il\ 1J111:i (I,.IO )11 ). li hlol, 1i:11t' 111u1h.11n um
I ,mll1,.ntpo ,crn11dJm1 h1otmih110, <jlllnd, uhi:11111 meni e in.. uhJt11 ,on ,I\ t(ht1,1 ,nmugat.i
.ili l'll1111\J Pollht numno~ mnlc,olC' d1 hio1111.1 ~li1~,0110 lq;.ir,1 a una $1111.1,0IJ molr,olJ J1
,llllt~Ot po, molte mol"ole J, "' 1J111.1 ,omug.,ti: con l'cnmn.i pn\~11110 k-g.1r.s1 a una ~rng11l.1
mok•rnlJ d1 antilorpo h101i111l.ito, gc11c1.111Jn ,o,ì un '><.'gn,dc p,u mtcmo. l,h cn111111 ut1l11
1,111 ,ono '>Olrt~mcntl' IJ ILhl.a~1.ikahn.A o I.i pcro\\tJ,N d, rJfono

..
rp.11111 poua t'\-.crc \ 1iu.ihn.11.1 ~111 Mut Suno 1,1)rrth1h 111 ,11mn11·1, 10 mole~1•lr J.i i.it. t)ll1 Prodono
)rt(I~. c,m Ullll ~,dt.1 Jt m,11'\.,atori <ltHN J C\\t' lq;Jll l'no dei mrto<l, d, rn·clJ11onc p,u CQ Subatr&to ~ tcoloretol
munt ,01rn5t,· ndl \1t1hn..in: 11n .1nu1.mp11 ,,:um1lm11 ,omui~to o un cru.uua (htt 10.12 ). ln
411rjt,1 c.u,1. Jopo ,l lf.itUmdltù ,ou l\m11c,1rro ,c,omfano marcato 1.on l'enum.1, 11 blot
, 1c:nc 1n..ub11u 111 un.a .w.1lu111.1nc u1mcn,nk tl 1ub~tr.1to Jcll'fnlml•, 1.he ,omrrtc ti ~ub~tu
"~""'~
10 111 un pwùNto u1lor.1to 1molub1ll• .. hc prc.JptU ~ull.t n11111..dlul01.U, 1., pr~n,..& J1 unt
hand• coli r,lla. 10J11.,1 q11111,h. Il p11,1tmn.- Jdl., 11ro11:uu J.t 111tc1~c. Contront.wJo attcnt.1
menh 1I Mt1t "'" un sl'I u1lor.1t,1 dcllo )lc)..\O \.4lllpion,.. '" r1otema .t, tnlt'rl''-'>C può ~rè
1Jcnt1tì,.11a I'c:112101.t ull\lU ,110 .ill'ant1<11r1"111 5«ond,ino r ,ohtamcntc la fch(at11\I al~1n..1,
•
Ji, 1.,m,cllc ti uh~tr.iln 111,,1lor, '>-hwmo 4 doro,111Jolìltml.1tu (O( li'} 111 un p1<1dottu <l1 A_ Anticorpo pnm1,10 lprodono ,n conogltol
rnlorc hlu oppure IJ rcromd.u, J1 ral.ino, ..hc, utÙllLln<lo 11 O ,urne ~ub~lr.itu o,s,d., 1I \-
11mnllnu -9•chlairb.unl,1 111 un proJu11n tn\\1luh1k mul\1ne oppur, ti I doro I n.1ftolo 111 ,A P101em1 <io 1nter1SM
un proJoth1111~oluh1I, hlu
l n app10.:c10 .ah,;rn.itl\o J'('r b rnd.111on<' Jrlll p,ro~,,d '" dr r:tf.tnu e rappre,, nt.ito d.1I
f Anticorpo enti lgG do coniglio leg110 111'1n1,m1

mr111do dcli.i d11:m10l11m111r..c nu 111trnuh,a1.i (I < I, J 11/ru111rcl ( /1r1111Lrm11111 ,r111 l'). In

pr~nu <li pcrnu,Ju J111ln11,cn,1 e Jcl mb tr.1111 l11m111r)..·nw h111111111ln (I ,g. IO. I.\) la p,•.
ro~ 1da I d1 r.1fJn11 o~,1.t.i 1I lununolo -1111 ,onc111111tantc pr0Ju11unc 1h lu... r 1.1 ,m mtcn,,ta ,.
uumrn1a1.i J1 1ooo \'Oltr g1,111c 1111• p,c~,nz.i J, un 1111rn,1h«ll<•rc ,h,m11 o t 'n111\1.t11m· <l1 lu•
cc può l") crr n,~IJtJ <"SpournJo cl hlo1 ,u un:a 1.uua hitusr.itìru S11nn di , 1111 tluh ~uh,1r.1ll
1
,urruponJrnu pu I• I LI. d.t 1111huau1 <un a11h,\1r r•m.tr(;llt ,11n t11~1Jt.i~, ilk,ihn., li pr111
<rr10 \I ,ur I h.t a I u o 1ltgl.1.1ntt,01ptc1111111g.iu ,(In 1111,1111111.1, l'(r m, IJrl"gh allllS<'lll nd
hlot , molto &1m1k Il qurllo utihu.110 11c1ilos.igs11mmumlt1111mntll1( p.i r 7.7 \)
P101tln1 lntrll ptr 11 ulura11on1 dtt 1111 Hptelhc, tpor H albumina d 1le10 d, bovino)
I • 8 • Proti n1lrHf1ri111ull1 n,uocellulou
I rgm• IO il l 11hl.l'1• J1 ~11tt,orp1 kx,,nd m wn111g,t1 1\lii cn11m1 ncll 11n111un1111,-cliu,111c dd blol pr.•t<1
" 111,mlnicn1r, I •nh,orJ"' pnmJ1111 11uniu111 J\fr C'M"m1110 ,I~ un coiugho) rkt11101,{r I• rr111c1na J, 1111
" ,r nel hlnt Sm cct,t\llll< ntr, i:h ~nhwrpt anll 1~1, ,h t<•n1rJ111,, m t l,,;.111 un cn nna 11<onn.,uno I •n
tt(1>r/>01•r111unn lnhnr, I •i;srnnl~ Jd •uh,11.1111 ,Idi <'1111m• JJ lungo a 1111 pmJ,,uu 1.olor~h1 eh,· •I drl'o 1
l• "' Mnt, ll{lla I'" moo1< uw t 1•1oc11tc IA I""" m• J1111tcr~
 BI()( tll\lll ~ t Bl()l(lGIA MOI f COLARl
Luce
I
lntens1ficatore
o molecole di DNA a doppia ehca formano bastoncuu relauvamente ng1d1, e non è ancora del
~OH
yYOH
._!!_tardata dai pon. I movimenti laterali possono diventare p1u importanti per il DNA a doppia
NH2 O el.u:.a..molto piccolo e per il p1u flessibile DNA a smgolo .filamento. Risulta ovvio, da quanto
Acido ammlnohallco
Lum,nolo
~ o di d1mens1oni delle molecole da separare. I gel che contengono lo 0.3% d1 agaroMo !>epa
Figun IO I J lmp1'80 dc~ chcrniolumin~cnu mtens1fìcata per rivelare la pero~1dai.1 d1 rafano.
Oltre all'uso di anttcorpi legatJ a proteine, vengono util.iz1..ate a volte altri upi di sonde. Per
esempio, il DNA marcato radioattivamente può essere utilizzato per rivelare il legame DNA-
proteine su un blot. li blot Vlene dapprima incubato in una soluzione di DNA marcato radioat-
tivamente, qumd1 lavato effettuando poi un'autoradiografia. La presenza d1 bande radioattive,
melate all'autorad.iografia, identifica sul blot le pos121om delle proteme che legano il DNA.
10.4 Elettroforesi di acidi nucleici
10.4. l Elettroforesi del DNA s11 gel di agarosio
Per la maggior parte de, campiona d1 DNA, la separu1one elettroforetJca viene condotta su
gel d1 ag.iro~10. Infatti, po1ch~ la maggior parte delle molecole di DNA e dei loro frammenti,
che vengono abitualmente_ anal1zzatt, sono considerevolmente più grandi delle proteme e
non pot~ebbero pcne1rare m un gel dì poliacnlamm1de, nectssitano di pon di maggion cli-
mens1oru. come quelli prcsentJ m un gel di agaros10. Per esempio, un pl.lsmide largamente
1mp1egato come pBR322 ha una M, pan a 2.4 " IO". Anziché utìhnare numeri cosl grandi, è
piu conveniente rifenrs1 alle d1mcns1om del DNA in termm1di numero di paia di basi Sebbe-
ne, ongmanamcnte, c1 \1 riferisse alle dimensioni del DNA m termina di paia di basi (bp base-
• pmrs) o d1 m1gh.11a d1 paia cli basi fkbp, kzlobase-parr,), ogg1la nomenclatura comunemente
aca:uau .ibbrev1a kbp ~mphcemente in kb, quando ci s1 nfemce a un DNA a doppio1 elica
Dunque, pBR322 ha dimensiona pan a 4.36 kb. Anche un piccolo frammento di rcstrmone di
l kb ha u~a W pan_a 620 000. Quando ~1 p.irla d1 un DNA a singolo filamento~• preferisce de
fin.ire le d1me~Mom m termm1 d1 nucleotidi (nt). Poiché la c,mca per unità di lungheua (do·
n1ta a1 gruppi . fo:.fato)
. . è l,utc,\.l per quals1.1.,i frammento di· D"' .• quando viene
.~n, · app11c.1
· o un
1
campo elettno:o tutll I campioni d1 D:-.:A dO\ rehbero muo\crsi \-cr,o !'.modo con la 1,tcwa mo-
bilit.1. l.a ~parauone su gel d1 agaro~10 ,iene tuttavia ottenuta ~fruttando la re.i~tenu al loro
rro,ICll[[UTnOFORrnCII[
◄63
movimento dovuta alla matrice del gel. Le molecole pm grandi incontreranno maggiori diffi-
coltl a passare attraverso I pon del gel (le molecole molto grandi possono anche non muover-
si affatto), mentre le molecole p1u piccole nsulteranno poco ritardate 01 conseguenza, la mo•
b1lità delle molecole d1 DNA durante l'elettroforesi su gel dipende dalle d1mens1oru, con le
molecole p1u piccole che s1 muovono p1u velocemente
li fenomeno è analogo a quanto aV'.iene per la separanone delle proteme nei gel d1 polia-
crilammide in presenza di SDS (par 10.3. 1 , sebbene l'analogia non sia perfetta m quanto le
tutto chiaro come esse passino attraverso il gel (è probabile che le lunghe molecole d1 DNA
passino attraverso 1pon perpendicolarmente al loro as.se maggiore). Mentre passa attraverso 1
pori, una molecola di DNA sub1ra un effetto setaccio, per cui piu è lunga la molecola, più ~rà
dello, che le concentraz1om dei gel devono essere scelte m modo che siano adatte per l'mter
.reranno molttole di DNA a doppia elica d1 d1mens1oru comprese tra 5 e 60 kb, mentre gel al
2% sono usatl per campioni con dunensioni comprese tra O. I e 3 kb. Molti laboratori utilizza-
no abitualmente gel allo 0.8%, adatti per separare molecole d1 DNA nell'mtervallo compreso
tra 0.5 e I O kb. Poiché I gel di agarosio separano il DNA m base alle d1mens1om, la M, d1 un
frammento cil DNA può essere dcte.rm.uuta dalla .sua mobilità elettrofoul..lCa. facendo correre
una sene di marcaton d1 DNA standard aventi M, nota sullo .stesso gel Ciò può es"ere facil-
mente ottenuto utilizzando un campione del DNA del battenofago À. 149 kb) frammentato
con un enzima di re:,tn z1one come EcoRJ. Po1cht la sequenza delle basi del DNA del fago À è
nota, cosi come sono noti I s1t1 d1 taglio d1 EcoRJ, questa procedura d.ì ongme a frammenti d1
dimensioni perfettamente note (Fig. I0.14)
...J..gel per il DNA vengono sempre faru correre m orizzontale. completamente immern nel
tampone (s11bmar111e o submergnl gel). L'agaro,,io, sciolto nel tampone del gel mediante bolli-
tura, viene versato su una pi.a.stra cli vetro o cli plastica, circondata da una parete di nastro ade-
sivo, o da una cornice di plastica, m modo che s1 formi un gel di circa J mm d1 spessore I poz-
..un1 d1 caricamento vengono formati pos121onando un'apposita sagoma di plastica, o un pet-
tine, nella soluzione del gel e nmuovcndola una \"Olla che questo si è :.olidtlicato. li gel \'lene •
posto nella v:aschetta per l'elettrofores1, coperto con il tampone e I campiona vengono cancatl
u,iettandoli direttamente nei poz.zetl:L I campioni Yengono preparati saoghendoh m una "°
luuone tampone contenente saccaro~•o.. glicerolo o Ficoll, che rendono de~ la <,0luz1one e la
fanno depositare sul fondo del pozzetto. 'sella sohwone del campione viene moltre incluso
un colorante come il blu d1 bromofenolo, che facilita la v1suahzz,mone del campione che !>i sta
cancando e agisce come marcatore del fronte elettroforetlco. Per I' dettroforcs1 del DNA non è
nece\!klno un gel d1 impaccamento (par. 10.3. 1), m quanto le mobil11.ì delle molecole d1 D1'.A ,,
sono molto magg1on nel pouetto che nd gd; d1 conseguenza, tutte le molecole m1ettate nel
pouetto s1 1mp1lano contro il gel pochi mmutt dopo l'applka1ione della corrente, formando
all'm11 10 della cor,a un.1 ,trett.1 banda I gel u,;all sohtamrntc ~ono lunghi Circa 25 cm e IJrgh1
12 cm e sono fatti correre <..On un gradiente d1 \Oltagg10 d1 cm.a I 5 \ cm per un' mtcra notte.
Un voltaggio pm alto provocherebbe un e<..cc..:.1vo n~...aldamento Per 1nah\l rapide, che non
richiedono un'elevata \eparazione ddh.• molecole d1 D1'A, ~ono comuncmcn•c 1mp1cgat1 011 -
m-gcl lunghi meno d110 cm,,on I qu.,h i n~ultau possono cs~crc ottenuti 111 2 ~
 IIIOi 111~11<'-A I BIOWGIA MOL1UllARf 465
464 Tf0'1<.lll LU TTilOIOn.Tl(IIE

<J151,rn,abile. Quando \I uulizz,1 lulc ultra\'loletta i: c,,enz1ale protcgger,1 gh o,lh1 mdcMJll•

do appo5ltl occh1ali Se l'o,,cnaz1onc del gel deve c,-.e" protratlJ per lunghi period1, e neln
~no llldo,,are un,1 ma\chera d1 plastica che copra l'mtl'ro viso, per e,·11.11<.: \COttJlurc ,1mth .i
quelle prodotte dai raggi solari

• 10.4.2 Gel per ,I sequenziamento del DNA

Sebbene l'elet1rofores1 del DNA su gel d1 agaros1O sia la tecnica d1 u,o p1u comune prr ti
biologo molecolare, quando deve e!»tre de1crmmata la ,cquenu del DNi\ e nccc5'"1no 1mp1l'·
gare una tecuu:a clettroforeuca differente. Qualunque metodo s1 adotti per il -.cqucnz1.1m~nto
del DNA (par. 5.11 ), l'anal1S1 finale soluamente con mie nel scp.irare molecole d1 DNA J ,m •
golo filamento (dJ lunghezza mfenore a circa 1000 nudco11d1) che s1 J1fferenzmo m lunghl-Z
za per un solo nucleotide. A tale scopo, è nec=ano disporre cù un gel con pori d1 pu:colc d1-
mens1om: per questa ragione vengono usati gel di acnJammtde, mvece d1 gel dì agaro\lO. Per
esempio, gel d1acrtlammtde al 3 5% sono adat11 per separare ti DNA ndl'intavaUo comprc,o
tra 80 e 1000 nt, mentre gel al 12% mol\'ono frammen11 compresi tra 20 e 100 nt Nel c,1,0
debbano e~ere anahzzau frammenti aventi lunghezze molto d1\erse lra loro, è ~pesso com e
mente utilizzare un gel m gradiente, per esempio dal 3 5 al i 5%. I gel d1 <,c:quc:nza vengono
fa111correre m presenza d1 agenti denaturanti, come urea o formamm1de. Poiché è nece~'-Jno
separare molecole d1 DNA d1 d1mem1om molto simili, per m,m1m1Z.Zarc la ~cparaz.ione rJg
.gwnta..1 .gel per il ~equenuamento del DNA tendono a ~re molto lunghi {1.irca I00 cm) Un

---- figura IO.I◄ fotografia d1 quJttro con1e di un submarme gel allo

Oll'ltl d, .1guos,o li gel e (lato fano correre a 40 V 1n un lampone
Tns,horatolEDTA p« 16 ort, colorato con bromuro d, eud,o e os·
servato con luce uhrav1ole11.1. ln ogni conia i.ono \tali cantati circa
OS µg d1 cimp,one d, DNA. Corsie I e 2 DNA del fago À ( 49 kb
corsu ): DNA Jcl lago À uglwo con l'enzanu froRI per generare
frammen11 d, dimm,ion, Jnn a 2180, 7.52, 5.93, 5.54, 4.80 e 3.◄ I
kb,cors,a 4 DKAdcl Cago>.. 1.1glt.1to con Hmdlll per generare fram•
uptco gel per 1I sequenuamento del DNA viene mostrato nella figura 5.38
Come è stato descritto I.Il precedenza, l'elettrofores1 su agaros1O può essere 1mp1egata come
metodo preparativo per ti DNA. Le bande d1 DNA dr mtere~e po~sono e<.sere tagliate dal gel e
ti DNA recuperato: (a) mediante elettroeluiztone, (b) macerando tl pezzetto dt gel m tam po•
nc.-:centcifogandn ~raccogliendo il surnatanle, (c) sc10gliendo .il pezz.cuo d1 gel..:.e viene u11 -
lìzzato agarosto a basso punto di fusione, e diluendo con wnpone In ngru caso, 11 ON.\ \ iene
lllff111 d, 23.70,9 ◄6,6.75,4 26, 2.26, 1.98 kb. (Per gentile conc(Ss1O
alla fine recuperato mediante prec1p1taz1one del surnatanle con elanolo.
4 3 2 1 ntd1~tcphm Boffcy, 1,;n,vernl\ of Hertfor<hhire.)
I 0.4.3 Elettroforesi s11 gel a intermittenza d1 campo

I metodi per 11DNA che uuhzuno ~I d1 agaro~1O dc:5cntu sopra sono w grado d1 M:parare
DNA fino a u.nlunne superiore d1 !{o kb..L'introduz1one dell'clc11rofort".1 ~u gel ,1 mterrn1t1cn
.,Yna volta ,hc il .su.tcn.a e s1ato fatto correre, si procede colorando e \llsuahzz.indo ti DNA
..e,_d1campo {PFGE, P11lsrd-fteld Gel El«rrophores,s) e 1I ,ucc~I\O s,ùuppo d1 varianti della
nel gel. Il reagc:nt_e p1u utJ_lllZ.ato e il bromuro d1 etid10, un colorante fluorescente li gel viene -
tecnica d ì base permettono oggi d1 separare frammenti ,tventl lunghe7.Z.i fino a 2 > IO kh C1O
1mmcno .:on dd1cate1.a 1~ una soluzione d1 bromuro di eudio (0.5 µg cm ), quindi le bande
,engono v~~aliv..ue grane alla luce ultravioletta (lunghezza d'onda pari a 300 nm ). )I bro• comente la separazione mediante clcttroforcs1 cù m1cn cromo,om1
uscnzlalmente, ti metodo consi$tC in un clc11roforo1 ~u ag.iro~10, nclla quale due campi
muro J1 c-11d10 è una molccol.t ailica planare :;be si lega tr~ le coppie di b.isi del DNA Icioè.si
ntc:rc.w) (par 5.i.4). La conc~ntrazmne d1 bromuro di eudio, pertanto, r~ulta aumentata in elettnc1 vengono apphcatl alternauvami:nte, con c.fae~1 angoli, per periodi d1 trmpo dcfim11
(per e'-Cmpto, 60 s) L'att1vaztone del pruno collllpo ektlnLO provoca uno ~tiramento ,ul pi.ano
cormpondc:nza delle: bande d1 DKA e qu~te ultime, "" =Ione d eua Iucc uItra\'IOJetta,
"'tto J'••·
onz1ontale delle molelole avvolte, che cominci.mo a muover~ atlra\cr~o 11 gel L'mtcm..wone
emettono una tluorcs.;:cnu d1 ,olore ~-uancio li limite mfenorc della quantità di DNA
che può c:s54:rev1sualtzzata, u,mc: una banda d1 I lm di l•rgh- ,. · IO ng. occorrc ,o1• d1 questo campo e l'apphc.mone del ~econdo, for1..1 le molecole a muoversi in un,1 numa d1rt'•
• a " 7 a, arriva a
tohnearC' che un c-spos1nonC' prolungat.i ali.i lu~e ultra,~ulptta ~one. Quando una molecola formata Ja una lunga cah:na vtc:ne sottopmt.i a l"amb1ament1
, • , puo comportare un d anneg_c,1;1• conform,1Z,1onah in un campo elenm.o. avviene un knomcno di ril;b).lmcnto d1pt:ndcnte J.JI.
mento delD~~ per rot,tura del lìl.amento o per d1mmu..mone delle coppie di ba\i Ciò non
ha conseguenze se il D:-.:A nel gel de\'e ~sere solo o,scn~to m-nt Cl' ~e s1 d ~1 d era recuperare 1)
la lungheua I p1u piccola e la molecola, ptu vdocc.:mcntc .si ri.ùlmcJ 1.on il n umo l3111J'O cd è
0 ,

Ll!I!, dal gcJ (u \cd.i p1u a,-;uiu), O\'\Witente I OS5Cl'\'VJonc d~, h

,

- c~~rc ri d olla a I mmuno

· capace dt muoven.1 attrav(f,o ti gel). :'1.lolelolc ptu grandi nl"tC~~llano d1 un tempo ma~toll'
m·
 n 101 WTTROfOIUTICllf

10.1 1 Elettroforesi d, RNA

Come per ù DNA, anche I elettroforesi dell R.'\A vien<- -.oht.1mente condottJ ~u gel d1 aga·
ro\lO e 11 prmc1p10 della scpar.u1one bJ\JtO sulle dtmcn, 10111, è 11 medc,1mo Sp~,o I r"cr,a
ton hanno la ncuM1t.t d1 ncorrt:re a un metodo rJp1do per rnntrollJre l'integrità dell'R-..:A
1mmed1Jtamente dopo l'estrazione, pnma dt decidere se processJrlo ulteriormente Quc\to
puo t:)sere facilmente ottenuto, m circa un'ora, ncorrcndo all'clet1rofores1 su gel d1 agaro)to
al 2%. Gh R:-..A nbosomah ( 18 Se 28 S) vengono chiaramente molti e quals1a)i degradJ110•
ne (o,<,ervab1le comi." una ~s1mc1ata" ), o cont.imma11one d.1 DNA, può es~cre fac1lmcn1e m •
d1viduata. Tuttavia, quando v11."ne nch1~1a una maggiore nsoluz1one per aument.ire la \cp.i-
raz.ione occorre utilizzare un gel d1 acnlamnude, ,wente pon dt d1mens1om mferion Per
oemp10, per separare glt RNA transfer (4 S) dall'RNA ribosomale 5 S è poss1b1le uuhz.z..ue
un gel d1 acnlamm1de con un gradiente dal 2.5 al 5%, mediante una corsa della durata d1 una
notte In entrambi questi metodi viene uuhnato R"'IA nella forma nauva. All'interno della
molecola d1 RNA è qu,m certamente presente una pomone d1 struttura secondaria, denvan•
te d.l!la prescm.1 d1 legami idrogeno (s1 veda, per esempio, la struttur.t a trifoglio del tRNA;
F1g. 5.6). Per qucst.t ragione, l'RNA natJvo separato su gel può essere colorato e v1sualuuto
con bromuro d, etJdio
Tutta\ia, se l'obiett1\'0 dell'indagine è determmare, 01ed1an1e elettroforesi su gel, le d1 •
mensiont dcli RNA, quest'ultimo deve essere completamente denaturato per prevenire I.i
formazione dì legami idrogeno all'mtemo o tra i polinucleot1d1, che mfluenurebbero la mo
b1hlà elettroforeuca. Esistono tre agenti denaturanti (formaldeide, ghossale e 1dross1do d1

,
·-------------·
whlllX:n ~ di uro O{Il di Cl'OmOklau di lintto ampsom btt1 c.on..-rc nel!.- 13 ror•
I l •1~,
mettlmer...--urio) compatlbtb sia con l'RNA sia con l'agaros10; uno qualunque d1 CSSI può e)!'.C
re mwrpor.ito nell'agarosio e nel tampone elettroforetico; qumd1 ù campione viene dcnatu
rato mediante mcaldamento m presenza del denaturante, prima dell'eleurofore5t. In )egu,to
alla denaturazione con 11 calore, ciascuno d1 questi agenti forma addotti con I gruppi ammt •
D nici di guanm.i e uracile, prevenendo cosi la riformazione dei legami idrogeno a Lempcratura
banaiabg,:, l. 1camrioru d1 ri!cnoxn10., ldJ", Mino odi.- due cors1C' Ult-
diflmUD maw do liad.latcL ara 43 S lbuono ruo!u 20 binde fino11850 J..b. Lt d,mcn• ambiente durante l'elettroforesi !: necessario ricorrere a gel denaturanti anche quando
260. ?90
aom0101D1 dJ br,,to 1ilOO r,a1I a;
amanitontdat.hrpl llt::1-n, l o!Midupn.
,10
~ SM;!JOO. 700. 780,820 RSO U, (rcr gm1Jc
'
!'RNA deve essere souoposto a blot (norrhern blot, par 5.9.2), per essere sicuri che la ~uen-
za di b.1.)1 veng.i ncono~1uta dalla sonda. L'RNA denatur.1to viene colorato molto debol
mente dal bromuro d1 et1d10; per tale ragione per visualizzare l'RNA nei gel denaturanti, vie-
ne solitamente USJto l'aranCJO di acridma. Va tuttavia ricordato che molti ricercatori utihna-
p r r ~ In quntn modo, mrdwnrconunue 1m.i:ruoru Jcl campo. k molecole piu rie• no RNA marcato radioattivamente identificando le bande mediante autorad1ografi.i. Un
cok allonwuno eh gudk P u grandi e 1 ~rano a l«Onda delle duncIWoOJ. La figura esempio d1 elettroforesi d1 RNA è mostrato nella figura IO 16.
I O 15 mostra h sq,annone d cromosomi di hn-1to con d1mrru1om var 1abih tra 260 e 850 kb.
N o.: rn ~;ìwl~c che I pnnapi fi ia w cw '1 basa h progettauone di un .Abttma l 0.5 Elettroforesi capillare
PFGE CQlnl'lb\J e che uhmu amu DW!ler'0$1 sviluppi dtffrrenu ddlo stesso schema
dJ banno onpmso ampu smima di tcaudie com-late. La des.:nnone dettaduta d1 Per indicare questa tecnica sono muso d1\erse detìnmonr dcttrofore.1 cap1llart" ad alt11 n
tccrudlc n ohtt scopi di qunio ceto, tunavu I nomi di alcune d1 esse indicano t soluzione (HPCE, H,gh Ptr[om1,111ct Ct1p1//ary Electropliorcm), elctuoforc 1 ,ap1Uart uinalc
panap:16Uall61basaoo.f'a ~n:rcm:lral .t. .I
o A F.. Ckd:;-,,rnntd J!.1ltlrn.:wri con.,, rr.anu d1 campo ortogon...e (CZI.:, Cap,llary Zone [/ectrophousis), tle11roforcu lJr1ll.1rc III soluzione libera (F5CI., frcr
G e l ~ , dett.roii 01 &u sei con 1mcmone Solut,011 Cap1l/ary El«trophoresis) ed dettrolores1 c.ip1llarc (CF., C11p11/ar> I ltctropl1orms);
dttt I altcrrurwi d1 .im qu~t'ultuna t a11ualmente la prn d1flus.1, la n.itura m1croscop1•.i d" cap1ll.1n u11hzzat1, ,01
ti Gt:I • c1ett ~ ro1 con ampo quah \engono consumali dall'analm solamenle pochi microhtn d1 reagc-m~ e 5000 nch1es11
OiEF. Ccnw.u danrpcd Honwcmrous Elrcmr 50)0 nanohtn di campione, m~1eme alla po,~1b1lttJ d1 una I1\ela11one m tempo reale (011 Ime
RFE. 1 Fldd flrnrophorrru). con una sensibilità, m alcuni C.I\J, dcli ordmc delle fc:mtomuh ( IO moh), ha roo da molti
 111\lClll\lll \I lllUllll,MMOIHOIAJJ
468
Figura IO 16 Flcuroforffi d1 AAA ,u gel all'l .4% d1 ag,uos10. Cor•
\Il I· RN .i. totale dJ piante d1 ubacco denaturato con gliossale
pnrna della cor;a, cor.11 2. stesso campione, ma ,enz.a denatura
11onc, le due pnnc1p1h bande con mobilità maggiore sono gli
R.'\A nbosomah 18 S t 28 S u b1nda piu lenta è D1'A nuckm
Cor~1< 3 e 4. 1t1ndard d1 DNA con (3) e !.Cnu (4) trattamento con
ghossalc k d1mcm1on1 dei marker sono: 0.24, I .4, 2.4, 4.4. 7 Se
9 5 l.b. S1 o~m che. per tutti I camp1on1, I.i dcnaturu1one com ·
porta una minore mobilità dn componenti ( Per gentile conces
l!Onc d1 Dcbb1e Cook e Robcn Slater, D1v1>1on o( 81ol,.(1ence>,
2 3 4 Un1>ersitv of Hertfordshire.)
anni l'elettrolore,,1 ,apillare ti metodo di elezione per molte anahsi cliniche e biomediche.
l 'dettrofore-.1 cap1IJ.1re può t\Serc 1mp1cga1a per <,cpJr.irc un'ampia varieu. cli molecole biolo
g1Lhe, induM gh ammmoa,1d1, 1pepttd1, le proteine, 1frammenta d, DNA (per esempio gh oh-
sonudeo1td1 smte11C1) e gh a.:1d1 nucle11.1, come pure qutl-iJ:>i altra tipologia di molecole or·
gamLhe, ù>mc larmau e 1001 me1.al11,1 (s1 \OOa oltre). li metodo è stato applicato con succeli~O
ancheallascp.iraz1one d1 moholc1.h1rah (par. 11.5.5).
Come sugg.:r,~e la definmone, l'elet1roforcs1 capillare conmt.: nel condurre l'ckttroforc:·
~ , ,
M dn camp10111 m tuh1cim molto r.ott1h (a\cnt1 rn(itam•nt• un d1amc ro mtcrno d 1
I ' 50 µm e
uno e~tcmo d1 300 µm ) Lno do ,-;in1.i""I oo dcli uso •
u1 cJpi ' llar 1" r.ipprcscntato a a n"d u11·0 ·
,. d li
-109
JIO,I< l ii tU TTroR>RI llll!(
ne dei problemi connc,s1,1llo sviluppo di calore Grazie al p11.1.olo diametro dl·1 tubi, mfatll , il
rJpporto ~uperficte volume ~ alto, aumentando CO\ t Ja dis\lpJ11one del l alnrc Quc,to illlllll
J elmunare sia le correnti com·ct11ve, ,,1a l'allargamento delle bJntk dovulo all'aumcnlata
d11Tu!>1one cau!>.lta dal riscaldamento. Non e quindi rn:ce\~no mcludcr.: n.:1 1uh1 un m eno
stabilizzante ed è consentita J'elettrotores1 m fa\C hbcrJ
Le basi teoriche dell'dettrofore~1 capillare danno luogo a due 1mport.1nt1 cqua.1ion1:
L
( IO 4)
,,v
dove I è il tempo d1 migrazione del r.oluto, L la lunghcua del tubo,µ la moh1htà c:lettroforetka
del soluto e V ti voltaggio applicato.
L'efficienza d1 separazione, m termm1 d1 numero totale di piam rconc,, N, e datJ da:
pV
N- ( 105)
2D
dove D rappresenta 11 coefficiente d1 d1ffus1one del soluto.
Da queste equaZ10111 emerge, mnanZl tutto, che la lunghezza della colonna non ha effetto
sull'efficienza di separazione, ma che essa ha una no1evolc mfluenz.a sul tempo d1 m1graz1one-
e, d1 conseguen:i:a, sul tempo d.J analisi, m secondo luogo, alte efficienze d1 separazione vengo-
no raggiunte attraverso l'uso d1 elevau voltaggi (p e D sono paramctn relativt al solu10, quindi
non sono facilmente modificabili).
Dunque, la scelta ideale parrebbe consistere nell'apph= tl voltaggio p1u aho possibile al
capillare p1u corto possibile. Esistono tuttana alcuni ltm111 pratici a qutl.to approccio. Man
mano che la lunghezza del capillare viene ndott.l, la quantità d1 calore che deve es~cre d1"1•
pata aumenta a causa dell'aumento della resistenza elettrica oppo)la dal ,ap1llare Allo ste~o
tempo diminuisce l'area della superficie d1sponib1le per la di~1paz1one del calore. A un certo
punto, qumd1, gli effetti termici diventano s1gn1fic.at1vi, ponendo un hmlle prati,o al valore
minimo della lunghezza del tubo. Inoltre, quanto maggiore e il voltaggio apphl'ato, tanto
maggiore è la corrente e, d1 conseguenza, il calore generato. In tcrmm1 pratici è quindi richie-
sto un compromesso tra 11 voltaggio impiegato e la lunghezza del ,ap11lare. Abitualmcnte,
vengono uulizz.111 voltaggi compresi neU' mtcrvallo 10-50 kV, con captllari di lunghezz.i v.i
nab1le tra 50 e I 00 cm.
Nella figura I O 17 è riportato lo ¼hema d1 un apparato d.J base per l'elettroforc" c::.1p1llare.
Una piccola quantità d1 soluzione del campione (generalmente 5 30 µm ) Viene introdotta al-
l'~trem1tà ,modica d1 un tubo capillare m stlice fusa contenente un .1ppos1to tampone. L'Jp .
plicaz1one del campione può ~ere t'ficttu.1ta con due modalità differenu: mediante un'tnte•
1ione con alto volwgg10 o ad alta prc.:~1onc
• Jmez1011t con {l/tO voltaggio. A voltaggio ,pento, il scrba1oio contenente 11 tJmpom· nel qu.1lc
pesca l'elettrodo po~ittvo \ iene rimp1anato da un ,erhJto10 contenente 11 camp1one, e una
p1t1.0la quantità d1,oluzione del campione (per csemp10, 5-30 µm d1 unJ ,oluz1l1ne .t\ c.:nte
com.entrazione I mg llTI 1) ncne introdotta nel capili.tre, applicando brC\cm.:nte un alto
volt.iggio. li \c.:rbatoio contenente il ,ampionc vi.:nc quindi nmo,,o, ,o,utuuo ,on qudlo
del tampone, e \i ,tpphc.:a nuovamc:nt.: ìl voltagg10 per 1ni11are la ,t"para11onc.
 ll<l< 111\tlC:A l Bl<lU)( ,l'-MlllfA.:OIAl{t
Raccolta
dei dati
Tubo capdlara
R,~ala_to_ra_.__.,
lnQl'Ol$0 del;.-===-•i="""'-="""'-1
~plt.11
Tampona
alenrol,tico
.._________ Generatore •--------•
Catodo
o
Figura IO I"' ~ di un upico arp.,ralo ~rdrttrofom.1 capillare.
• Imr:ront III prtssiont. Il apillare 1.1ene rimosso dal serbatoio anodico contenente 11 tampo-
ne e mscrito attraverso un tappo a tenuta d'ana nella soluZJone del campione. Un secondo
tubo fornisce la pr~ione alla soluzione dd ompiooe, che spinge il campione stesso den-
tro 11 capillart'. Qu~t'ulumo viene quindi rimosso e nposiz.1onato nel tampone anodico. S1
appha mfine il \olt.1gg10 rer m1m.re l'elettroforesi
\ iene qumd1 itpphciltO un voltaggio elevato (fino a 50 kV) attmerso ti tubo cap1llare, lun-
go 11 quale le molecole del campione nugrano a d1fferent:1 vdoc1t.l. La m1gr.wone elettrofore
tKa determina ti movimento delle molecole c mche in soluz.1one verso l'elettrodo d1 carica
llppo~u.. A aus.i d, t.ile mtgr3Zlone, le molecole postttve e negative del campione migrano
con \elo"ù di,er~. Tuttil\ ,a. ~bbenc gb anahtt ,eng,mo separati dalla m1graz1one elettrofo
retica, ~1.sono spmu tutti ~erso 11 catodo dall'elettroendosmos1 (par 10. l) li flusso~ piutto•
\IO com,~tente, po1c~t lii ,doot.1 dd flusso dettrosmot:Jco ~ sohtamente molto più grande
della ,eloc1t.1 elettrolorcuca degli anahtt, quindi tutu gh 1onì, mdipendentemente dal segno
della loro canea, e le specie neutre sono trascmatt ~erso ,I catodo. Le molecole cariche pos11t-
vamente raggiungono 11 catodo per pnme, m quanto la combmaz1one dt m1gra11one elettro-
tor,mca e flu~..o elettromdo~mot1Co le fa muo,-cre p1u velocemente delle altre. Giunte 10 pros-
Mmttà dd c.itodo, le molecole 1.C:p.uate devono pilS~re attra~erso una finestra dove sono nle-
\'ate d.& un n,elo1tore ne!J'ultr;1, iol~to, che trasmette ti segnale a un rcg,,trato~e. a un integra
ton: o a un <Omputer. Una up1ca separu,one dura tra, 10 e 130 minut1. Un carattenst1Co elet-
troferogro1mma d1 un.i elettrofore)1 cJptllare e mo~trato nella figura 10 18.
Questo metodo in ~hwone libcr.i e 11 p1u ~mpl1~e e 11p,u largamente uuhzzato per con•
d I elcttrotores1 cap,llare Tutt.lVJil, anche <,e la tormazione di gruppt 1oniu.it1· su11,1 pare te
durre
d capill.tre e vantaggiosa m quanto genera un flusso dc:ttrocndo,mottco, a volte può anche
rappresentare uno wantaggio Per csemp,o, l'adsorbimento di u na protem,1 ~uIle p.1re11 deI ·
-·-e trii I grupp1 catmmc1 ~uIla superficie della proteina e
captltire può aV\-enuc mediante il 1"-ti""
1sil.tnoh mm1.zatL Questo può provocare uno Mscod.,mento d~lla ~ prmcuu d urante II suo pa,·
saggw nel capillare riconosc1btlc da un ;llan>~mcnto del pi co O I ~
·o- < , • evenrua 11. ancora r~•o
nom lii lUTTltOFORiìlCIIE 471
3
2
'
jJ_
i i I I I I I I
15 16 5 18 19 5 21 22 5 2, 25 5
TemPo(m,nJ
Figura 10 18 Elc1troforcs1 cap11iarc d, cinque pcp11d1 correlati strutturalmmte u lunghezu ddb colonn,1
era d, 100 cm e 11 vohagg,o d1 ,cparaz,one di SO kV I pcpt1d1 sono s lall nlC\at1 m ba$C ,1lla loro assorban1.1
ncll"ultra\1olmo a 200 nm
Pcp11de
I Ly, Arg•Pro-Pro-Gly Phe-St°r•Pro-Phc-Arg
l Mel Ly, Arg Pro-Pro-Gl) •Phe-Ser-Pro-Phe-Arg
3 Arg Pro-Pro-Gly-Phc Ser- Pro Phe-Arg
4 Scr-Arg Pro-Pro-Glt Phc ~r- Pro-Phe-Arg
s Ile- Ser Arg Pro Pro-Gly Phe '>cr Pro-Phc-Arg
(Per gentile concc)\1one d, P~tnck Cam,llcn e Gcorge Obfo. GSt-.., L1d )
re, I.i completa perdita della proteina dovuta al totale adsorbunento sulle pareti. Akum riccr
calori uttll.U3nO quindi tubi rivest1t1, nei qual, è stato ut,hzzato un gruppo neutro dt nvesti
mento per bloccare I gruppi s1lanohci. Ciò naturalmente cl,mma il flusso elettrocndosmotico.
Durante l'clettrofores, m c.ip,llan rivest,tt, le specie neutre ~ono qumdJ 11nmob1lt, mentre le
specie acide migrano verso l'anodo e le specie basiche vcN.o il catodo. Dal momento "hc I.in-
leva1..1one avviene solitamente a una ltOla estrem1t.ì del cap,llarc, in un'analisi condotf.i u11l11:-
zando un capillare rivestito può essere rivelata una sola specie 1omca alla volta
Esiste anche una sene di van31.1om d1 qut'!IU tecnica d, base Per e.empio, come descritto m
precedenza, nell'elettrofore~, capillare normale le \pecie neutre non s1 lteparano, ma migrano
tutte m una smgola banda La ~parazione della molecole neutre può essere tuttavia reiltuata
includendo nel tampone un ten,,oattl\O come l'SDS. Al d, sopra d1 una certa concen1n21onl',
alcune molecole d1 tem,oattl\O aggregano formando 11111..clk t.hc, \Otto l'effetto del t.tmpo
clettnco, migreranno, erso l'elettrodo appropriato I ~olull mtcragiranno con le m1ccllc e \<.:r
ranno npart1u tra d1 e,-.c Se un ,oluto intcrag1scl' fortemente, raggiungerà 11 nvcl.11mc- p1u
tardi mpctto a uno che 1ntcr,1g1\ce p,u debolmente. Quc-sto metodo è noto ,omc clettroforc 1
e.ipillare 111,u Uare ciel t rocmc:t1Ca (i\1 I CC, \t1u/111/11r El<, 1roA111t•11r G1p1/l,1ry Electropl1ort. ,s)
Poichc anche 150luu 1001c1 m1graanno sotto l'arnmc del C3mpo clettnso applicato, la ,c:para
Ltonc: ottenuta rnn la :\11 CC e dovuta a una combma11one d, ell'ttrofor..-s, e c.ronwtogr,1iÌJ
 Bl<X Il MIU I i1oux.u •lllU(.Ol.u.r ◄7i
4 IT NI lii UJ TTltOR)~l TIOI

Jn ongtnt' si• SYiluppi dcli rlt'llrolort'SJ .i1p11brr 51 t'rano cmKultr.111 sulla ¼'p.ir,mon(' di
pq,ud1e pruremt', m, m anni rra-nu quota ,emica t stato apphca1.1 con ~u,,~\o ali.i ,cpara
noni.' di una \',mrt.'I J1molecok biolt>giche 1)1 ~u1to wngono lorn111 akum l"M'mp1.
• In p;iwro, t nnal"' d<.-i ~ud, ,-rno~ dltttuata ab11ualmcntc: u11h1undo l'HPlC m f,bc
m1,'t'n.l, ottmmdo Li St'p.Jraziont' 1.11 b.ut' ,tlle d1ff<'rc11Lc d11drofobK1là tra I ù1vcrs1 peph•
d1 LI i,cp;1nmone tli peptidi anche mediante de11rofo1t'SI c,1p11lare e or.i cffcttuat.i ab1
11.wmmte C'd ~ p;iru,obrmentC' uulr, ~ esemprn, lome ~trumC"nto J1 controllo dell.i
qu:1lità lpurrzu) J1 peptidi e proteine pro<loll<' mediante IIPLC prcp.iratl\a. I 1 figur.i
IO 16 mostr.i l'c:le\-ato grJJo J1 S(paruione ~hr può e),ere ottenuto <.0n pept1d1 a\·tnt,
1tru1turn molto ~•male.
• Ohgonudro11J1 '-UIIC11c1 J1 ckvar..1 purea.i sono nece»an per numero~e apphca11oni. tra
le qu.ah l'u1thzzo come 6<inde d1 1bml.u1one ndl.J d1.1gno)t1Ca e negli C)pcnmentJ d1 do
nagg10 d1 gm1, l'uw ,ome 1.11111•ton {primrr) per 11 ~uen,umrnto del DNA e nell,1 rca-
l.lOM a e-alma dcli• polimera~, (PCR, p.,/rmerast CJ,11111 Rcaa,011) 1'1mp1ego nella mut:ige-
no, ,1to-duetta e l'u\ll trrapeut1w l0me sequenze .inllS(nS<t. ~cr esempio, l'anahs, da un
ohgonudNllde anuse-mo lungo lii bui ( 18-mer), contenente frammenti cont.1mm3n11
(da 8 mcr .a 17-mcr), può eutrt' ottenuta m sol, 5 mmuh
• MC'di.tnre el~trofom1 ,Jp1ll.ue po~no c.~re 1dent1fa~te mutu1oni puntiformi del
D!\'A, come quell<" ,he \1 r1Kon1r.1no m \'arte patologie umane
k tutte qu..-~I•' tern1.:hc d1 rncl.t111me olhono clc\ata :,em1b1l11ò, pr<."5{nt,1110 ,,1ra1ter1stichr
rdeah per l.1 mm1.11unn.a11ont•, hanno un W\lu mnlto h.1~~0 e 501111 wmp,111h1h con le tecno
logie ,1\,1n1.itc d11111,rol,1\or.uion•· e n11~rol,1hbn,a1Jone Jntìne, 1I ~oltJgg10 r 1d11e\to e J1 po•
chi volt, chnun,mdo la necn\1ta dcgh ,1h1 ,olt,1gg1usali ncll'clcuroforC\1 cnp1ll,trl·
I mkrolh1p ,ono prodotti ,11travcl\o un prou~,o d11am,1to m1,1nt.ihbr1c.111ll11C, ,hl" ~orn-
porta l'mu~1one da e.1nah prec:m e nprodu,1b1li,~1m1h J c.ip1llari (norm.ilm{ntc lunghi <;o pm
e: profondi IO µm, lcggcrmen1c pau p1cwl1 d, un capdlo um3no), sulla superfic-u: d1 lamine d1
quar20, vetrd o pla~u..a. Un ,e,ondo foghttto viene qumJ, fmo al d1 ,opra del primo, tr.a~tor-
mando le mc,s10111 m micro)(op,~, ,an.th d11u~1 per flu1J1. J.1 fine d1 ,1a,cun ,.male è collcgatJ
a un serbatoio attravrr~ 11 quale I flu1d1 \c:ngono rntrodot11 o nmorn I ch111 pos!>l.mo cs,cre
p1ccoh fino a 2 cm In W\tanz,1, ù microchip form...-:e una ,,sterna clcttroforellco s1m1k al-
J'elct1rolores1 c.1p11larc ma maggionncnt~ flcss1b1le.
Gh attuab sv1lupp1 da quest.i tccnic.i prevedono l'mtt·grallone d1 d1fleren11 .apphc,111om, ol•
tre alla wla <.epara11one nel chip. L'estra11one e la concentra11onc dd c.1mp1onc prima della
~ara11onc, l'amphfica11<\lle da camp1om dt DNA mediante J>CR uulin.1ndo un pro,e,w d1
termoc1cl.111onc mediato da 'raggi 111fraro\S1 le,tru1one da molecole sep.irate urù11.1.inJo m1-
crocamerc legate a fas, solide, sono tutti esempi d1 u.ltenon apph,az1om mc-.~ a punto an un
mtema elettroforcuco a microchip t ,tata anoltrc svùuppat.i un'mterfaccia per clettrofon:\I
su microchip e spe1trometm1 di m~ ( MCI:. MS, MicroCh,p Eltrtroplwrw. 'Jas> ~pr, tromt •
Il)') ut1h1.L1ndo la quale 31cum farmaci \Ono stati ~arali mediante MLE c. succc,~avamcntr,

• l 'dettrofor~, c-.aptll.are puo essere u1thzuu ~r quanllficarc il UNA. Per e!>emp10, l'analm
mcd1.1ntr cletlruforrn ap1ll.ll'r d1 prodo111 d1 PC Rd.il mm HIV-I ha ~rn1~ J 1dent1fì-
c::121one da un nu~ro da p.irt1,clleV1r.th compr~ tra 200000 e 500000 per centJJnetro cu-
bo di 51Crtl.
• I <ompost1 ,h,rah possono '-'SC'l'e nsolt1 mediante elettroforcs, cap1Uarc Molte ricerche so-
no stllle condotte in sohmone h~r,1 ut,lllLlndo c1clod!.'}tnne comC' M:letton chirali.
• Onerse pau.ole mokcole, farmici e mei.bohll pos~no es.tre nusurata 111 liquidi f~iologi-
"• quaù urin.a e &Jero. Questi mdudono ammmoiodt (nell'unna ne \0no ~tali trovati oltre
50), nudcotrJ,, nudcos,d,, bnì. a.moru come dorun e solfati (NO e NO pouono essere
1iCp.1ra11 nel pl.imu urna.no) e ,auonr come Ca e Fc
10.6 Flettroforcs11u microchip
tdcnuficatJ mediante MS
10.7 Suggerimenti per ulteriori letture
AL1-.iA, K. D. Cap1ll11ry Ekaropl,ortSu G111tlt Bool Humil.114 Pr~\, Totowa NJ 1996
D1scuu1one dettagliata della Icona e ddle procedurt prauchc per l'an.tlm ddle proteme, dc-gli ,md,
nuclem e dei mei.bol111
HAMIS, B. D e R1cK\\U0I>, O Gd Fla:trophomas ofPrott1ru: J\ Pract1(JI/ J\pprO(lth, 3' ed Oxford Um\tr•
\IIY Pm.s, Oxford 2002
Trattu1one dettagliata della 1eoru1 e delle procedu~ pratiche per l'elcttroforrn ddle proteine
WAU,n:. J. M Thc Protem Protocols Handbook, 2' ed. Humana Prts.\, Totowa, NJ 2002
D1\cuss1one dettagliata della tcon.1 e delle procedure prattche d1 numerose tccnllhe elc11roforct1lhc
e d1 procedure da b/omng.

L'uitrnorc mmiatunu.uione dei \Ulerru elettroforttici ha portato allo ~vtlu ddl'elct·

troforai .su m1Croch1p, ,~ presenta num ppo
__, ero11 ,-ant,1ggi rupctto a1 metodi elettroforl.'trc1 con•
\"CtlZlonal1, coruentc:ndo ToOC!ll da ana!u, molto d I I
........_ .,, cva e: con 1mp1c:go d1 qu.1nt1t.1 molto pu,;•
~ W Clffip!Ollt' Pn c::semp10, l'anms1 mediani h1
nulle un'ekttrofortsi ,u s:C:~.::::'
(klJ ordine delle declllC cli

Sll.'m1 da rivelazione com Li Il

, e microc P puo esst~oìiipletata m tempi
:leurofol'C5a capillare può avere bisogno d1 20 m1•
cc~1t.1 d1 almtno due ore U111,nando nuovi M·
• e UOrCSC'enu indotta dJ lasc:r può b
cWJc p1comoh alle attomoL (IO,. li d • C'Ml.'re 01tmut:1 una semi 111t.à
qudb ottenibile mafhnte detr f,mo • caotlb ' alllll.'no due ordm1 d1 grandcu.a m.aggiorc: d,
ro OR:s1 api re: comenz1onale 5 ,._ d ,_ d
lccole non auore:scoiu includono t d ••.. 1111 1 uvc... uonc: 1 mo•
• m--eIa on tttrodum1ca (p.u 11.3 3) I I
" c:trKa 11ntt.rnu11rnu PAD Pulstd Am , .1 m'r auone ampc
Pffllmttru: Dn«tion) e b ,oltammc:tna smuso1da
CAPl10l0 13

Tecniche spet troscopic.he II:

spettroscopia vibrazionale
e risonanza magnetica

13.1 Introduzione

Nel capitolo 12 ~1 e Vt\to che lo \peltro clcttromJgnetico è un intervallo ,onllnuo d1 fre-

quenze che \'anno dai rJgg1 Yad .alta cnerg1,1 d1 onc, ne nucleare, alla rcgmne delle r.,.L ,frc-
quenlc cautten11.1t.1 d.a .1lte lunghc,u d'onda p., ùndo Jall.i rc-g,one ad .,hc frcqucnu a
quella a bas~ frcque01e, I energia ,I\\O.:tJta con lo ~peltro d1mmu1scc, m au.ordo wn le re-
gole dc:ll.1 teori.1 qu.1nt1st1CJ Non es1\te, qumd1, .alcun punto logtlO d1 dem;trc:111on,~ m cui
que~to continuo di energie po~~ e~..cre d1v1w u sudd1vNonc .1do1tata m que.to volume~
~tata introdotta per '>t:mphce comod11a, h.i una giumfic.1z1one pur.1mentc pragm.1t11;a cd è
b.1!>Ata \Ulla "pr.itka comune':
I m.ercaton ,he operano nel campo della biologia o della b1omcd1cm.1 dopo a,cr isolato
un ~nuovo' cornpo)tO devono poterlo idcnt1fic.mi. Prc)upponcndo cht' ~•a \tJto ottenuto
m.itenalt' suffiett>ntt'mentt' puro, tra le tecnkhe ,pt>ttro-.copiche e ~rcttrometn,ht> d1\pontbi-
h, lc pnme procedure anahllchc d.i u11hwre potrcllbcrt, ~re pruprio I metodi de~ritt1 m
qu~to capitolo.
I.e ragioni d1 questo approccio ~no due:
- mnanzi tutto, ,1 puo nCJ\ore un.i note\'Ole quantità d1 mformaz1oni da un'unica analm;
- m ~e~ondo luogo, quC\tc tecnache non sono d1\tru111,c.
In questo modo sa po~,ono ~~-suare, in numero~• ca~a. anahst ripetute per m1ghorarc: i
rapporti segnale-rumore, e: ~i po~~no an,hl· rlxupcrarc campioni preziosi per )Ottoporli a
ulteriori indagini anahttche.
Nel capuolo 9 -.ono \tate trattate: le tccmchc d1 ,pe,tromctna J1 mas.:,.1, e sa è \·i~to che for-
ntStono informazioni d1\·cr,;c e: rnmplt>mcnt,1r1 ri~petto a quelle ottembah con le tcc..mche
$pettro\Cop1lhe, po~\c:dcndo, inoltre, 11 vantaggio di c,,rre notevolmente pau \en~1h1li. Spe~-
!>O, 11 ricercatore d1~ponc: per le m11urc ,pettro,,.opache d1 quantita minime: di campione, ed è
perciò costretto a ut1hu,irc l.1 srettromctn.i da ma>~-Tutt.1v1a, e l~!l('n7talc riconos.:erc.- i;he
le tccm,he 5pcttro,cop11:hc consentono l'acqu1,1z1onc da informaz1om che non potrebbero
n~crc ottenute e.on la i,ola ~pcttromctna d1 massa. In .1gg1unta, uno ~,antagg10 d, quest'ul11-
ma l' cos1ttu1to tfalla sua natura d1>lru111,·a, lhc c..omporta la perdita d1 una p.artc del la111p10-
nc durante la pro,cdura an.tliu,a, ,cbbem:, con I mtl·m1 pau ,e1h1b1h .ittu,1lmcntc..· a dispo,i-
11one, tale pcrdna sia probabilmente: imagmtìc,mtc; b:hll consiJcrare lhe, m molti C3st, la
quantità J1 campione dbtruna dur.tnte l'anah~• è mmorc da quella che ,,1 perduta dur.intc ti
trasferimento del campione ~IC>W!
 Tl(t;l(lll ~~OSCX)PIUll li ~rrll1!0lU)pi~ \>IIMZloxw I llSO)IA..;ZA NAGi.m,.... 585

Tabella 13.1 Alcunt• frequc:n7 c fondamrntah assodate ,on le vabra1Jona ncll'alctaldc:1dl'

Gruppo funnonalc Tipo c1t •lbr~10nt frcqucnu (cm')
liii Pi'l?mcnto 1460
1'65
.e-e SIUllllC'llto llbS
.e.o ~tarammto 1no
.<., 11 (In Clii) \l1ra111cnto 2960
ia~o
J igu,. I 3.1 \ 'ibraziom J"W
ibib ndb mok,:.ol.i d1 .,culdctdc

-
C·HfanC!IO) ~llr.immto :?"20

momento da d1rolo, cioè un c.imb1Jmcnto nellJ d1~1nbUZ1ont di anche. Al contrario, St' c't
LU Spt'ttrmcopia nell'infrarosso e Ramm una ,·.m.u.1onc nella pol,1r111ab1!11.1 dcli.i moklol.t, un.i p,trtc- dcli.i radiazione dtffratt.i JHà
una frL-quenta d1v1:r~ dJ qudl,1 della r.id1a11onl anc1dcn1e. Qu~te frcquen:u- J1vcrsc costllut•
lJ.Z. l Prinnpi generali scono lo spettro Ram.in Va <,0t1ohnea10 ,ornc un m.igg1or numero d1 mfonmwom 5ulle
o\C1lluJom nelle molc..ole si pov,.i ottenere andando ancora ohrr, nclb regione delle miao•
, rod ).a rH•one Jtllo spettro dcttromagnctico, .:he \'a JJ1
Comc: g1l accennato neli ml uz1onc, •cr onde, e u11hu..ando la 'fll:ttro,cop,a J microonde
. b" (O 1-800 nm) contiene frequen7C' dotate d1 energia ,uf.
r.i~• y 3Jl'u!LU\ 1olct10 v1,moI I I\I ue • • Le frcquen1e londamcnt.1'1 O\\ef\.llc \ORO .:ar;atterisuche e ~rcc•fi~hc-dc:1 grurp• funnonah
fi1.iente per 1.--au~re tumu1om CK' •·ttron••-~• 1ra.,.,,.,a più alt.i energia <\Ono a~1Jt1_ alle Iran
.,., cormpondcnll D.t ciò dcm-.i 1I termine fi11g, rpm,t (unpronta d1g11;1le) per I pattern ottcnun
siziom nucIcan. l>&li .i regione de 1,,c,no infnro\-O m .ivanu non,, è energia \UOK1entc per
nc:l1'111!raro,\o Nelle molecolt p1u complesse.Jll'aumcntarc del numero dei gruppi fun11ona-
· dì
l'C'.lhn..ire 1ransmon1 upo e , J•ttronico Nella
•, pomone d1 ,penro dcttromagnct1co cuntenu
h, le bande d1 J\Wrbunento nell'mfraro~so dncntano pru difficili da :u~re Tu11a,·1a,.\1 ot•
11 ncll'mtavallo o 8-25 µm )
1 fenomeno coin\'olgc \ 1br.u1om J1 lq;amc Quc)ta dcfin111onc \,1 tengono gruppi d1 frequcm. che aiutano .i i.cmplificarc l'm1erpn:1.111une I gruppi J1 que,tC'
con\1dcrata in 1crmm1 P1U . .,.
o-ncr•li• , r".-tto alle wlc osetUu1om uniformi, e comprende ,in ,
Y.. bande compaiono regolarmente, ~mpre m pro,\1m1t~ della ,tc'>-\J lunghe-a.ad onda e po,,o-
che le dcforma1111m d1 piegamento (bt11dmg). no L~rc a~gnJtl a spccific1 gruppi molccolu1 bitlamente com, catt ,romtofon ,. --orbono
nelle reg1om dcll'uhra11olc110 e dd ,mbllc QuC'\11 gruppi d1 frcquc.,,e ,ono e.tremamentc
lnfraro~\O e Raman ull.h nelle an,d1,1 strutturali \.i mohre wnohncato che ncgh spettri 111fraro,,1 che ~no ,pet-
Qu~tl due metoJi )p(ttroscop1a 1,0no complementari e forniscono mforma.z10111 s111111ì, tn 1·1bra11onah, t consuetudine utduurt k umtì dr frequenza, hcru Hz r1uttos10 lhe le
sd>bene le ba\i tronche dei due fenomeni \WlO d1\'cnc. \',1 anche .igg1unto che nel ca.,o d, umU d1 lunghc-ua d ond.a.
molernle :as1mme111.:he, gh asM>rh1men11 daranno origine a entr.imb11 t1p1 d1 spettri, d.i1 qu.l11 La frcqucnu .t!>S0<'1a1a a un dato gruppo varia lcggermrnte a au~ dcli m!lucnu del m1•
, 1potranno ottenere leste\~ mformu1om Tuttavia, per molc:cole s1mmctnchc con un centro cromtorno della molcco)J. C.1ò t otrcmamcntc uulc ncgh ,1ud1 d1 hlll~h,m1ca struttur.tlc m
J 1 \tmmctria, le frtqucnz.c fondamentali che comp.i1ono nello ,pcttro Ranun non compa1on<1 quanto rendc-pos\1btlc d1'<.nmmarc le nbraz1om C- H dt·r gruppi meulc:mci (-CHJ cl.i quelle-
ndlo 5Jl('ltro infr.uosso. e ,1,e1'C~: 1due metodi wno 1<tramcn1e .:omplcmentan dei gruppi mcuhci ( CH Set prc><:nte un doppio lcg.ime ,1 ha uni drmmu11one della lun-
l<' r.ig1om d1 queste d1fftrc-n1e s.,no correlate a1 d1l'Crs1 mc:cc.;m1sm1 alla base dei due 11p1 di ghe71,1 d'onda e un aumento della frcqucnz.1 di ,11rarncn10
,pct,roscopi;i. Entrambi sono md1u11 ndla figur.i 13.1, ncllJ quJ.le s1 prende come c:.emp10
wu 5,Clllplia molecola di acttaldndt Ptr lo scopo d1 questa 1ratw1one, i lcg,urn tra gh atomi
13.2.2 Stn1111e11tazìont
poMOno essere ,ons1dcnu i1m1h a mollt fles51b1h, ossia gh .itonu wno m co\tante moto \'I •
branonalc, La molccola non t fissa nr ngJd.i La ~orgentc p1u comune è una )pirate cli muomo (unJ lcsJ d1 na,hcl e cromo) ris<.1IJat.a a
l lcgam1 possono CS5Cl'e stm1u o dtform.1u t, i.coondo l.1 troru, se una molc-,ol.i contiene n mcandc\Ctnl.l' mf.ttt1 quc,tJ regione dello ~peltro elcttromagncu,o ,omprcndc le rad1amm1
atomi, \'l sar.inno m totale 3n-t, ,,braz1om fondJmentah. 01 quc\te, 211 5 cau~ano deforma• 1crm1Che t ump1om solidi vengono preparati m pol,·crc o ,o~pc~• m oh mmcrah, come al nu•
noni Jd lq;amc e n I ne causano lo 1uramcnto Nella t.ibcll.t 131 '><>no clenc.11c: le p1u 1m· 10I, e ~trauficall tra due d1\Ch1 s.il1m, lome :-.:art, oppure prc,'111 in J1:.<.hi d1 KBr, Come con-
porun11 frtqUcnzc fondamentali osscn'1b1h ndle molccolc- d1 acetaldeide. ttnllon per 11 (Jmpionc e: per le pJrtl ottiche )I Je\'ono U)Jre materiali pnv1 Ja legami cova-
la rq;1one dnlo iptttro elt1trormgnt1100 ,~ d.il lurute del ros\O, nd ,,s1b1le, alle m1,roon• lcnll, o,s1a matcn.,h tra,parcnu nell'anfraro~:.o
dc. l'c:ner&JJ viene ,mmC'S$3 m.i.dwido nclb rc-g1onc appropn.it;t mcJ1,1nte un.i r.1d1az1ont I rivdatori ,ono 1crmo~n\1b1li l:.& lclla C,0),1\' rc-g1s1ra l'energia che VtCOl' ~sorbii.i me-
dtttronugnc-uca. li cntcrlO ptt onencrc uno spettro infrarosso~ che v1 ~•a un.i 1:ara,uione del diante l'espansione d1 un sa~. o d1 un hqu1do, m essa contenuto S1 possono unhzurc- .inche
 BIOCHIMICA [ BIOIOl,IA MOUC-HUI\.I
51\b Jll";l( 111 \PI TTl<O'>( OPI( 111 Il \l'fTI RO'I< OPIA \'IIIR!l7JONAI.U RIIOl'l'INZAMM..'IITICA
587

melatori tcrmtCt l0me Je 1ermcxopp1c. l'mtcrferometro dt Michebon permette di e,q:u1rc 70

la ~pcttn»uipta mfr,,r0\>3 lll tr.,,tormata d1 Fouricr (FT-IR, foun~r Tmmform 111/rarcd Spr1
rroscop~·). Questo ~trumcnto utilizza ,pe.:.:hi fi~• e rotanti che d1ndono m due 11 raggio tnl1
110
dente I due raggi ,cngono rilombmat1 dopo 11 p,magg10 attra\'erso 11 campione ma, CS\cndo
1due cammini otttct di,·er,i, \I formeranno pattern dt mterferenza che possono e~~re an.ih1
1,111 con I.i trasformata d1 Fouricr (par. 13.4.1). L.i legge dt L.imbert-Beer può c~~ere appl1tat1 so
m tun1 t la,i tranne che per mi"ele compi~. per le quah sono necev,.irie analisi matemat1
cht' piu arttcolatt'.

13.2.3 Applicazioni

La ,pcttroSlOpta Raman e mfraro\\3 viene utthuata principalmente nella ricerca b1och1

20
mica, per molt'Cole d1 d1mens1oni medie quah farmaci, mtt'rmed1 me1abohc1 e substrati. Alcu
ni esempi di applicazione ~no l'1denttfic.u1one d1 so~tanze come la penicillina e I suoi denva
ti, p1.:coh peptidi e inqumantl ambientali. t un metodo ade.ile e rapido per misurare alcuni 10

contammantt negh ahment1; inoltre può Nere accoppiato alla gas cromatografia (GC IR)
utilizzata frequentemente per l'analm dei metabohtt dei farmaci (par. 11 .9.3). La figura 13.2 o
mostra le bande pnnc1pah dt uno spettro FT IR del farmaco fenacetma. L'anahst dei gas è ra
'000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
pida, soprattutto per misurare d1\'erse concentrazioni di gas come CO., CO e CH CH (aceti
Numero d onda
lent') nei camp1om b1ologm. E. part1colarmente uule anche nello studio della fotosintesi e del-
la rcsp1ra21one delle piante, ~oprattutto per 11 metabolismo della CO
Fenacat,na

13.3 Spettroscopia di risonanza di spin elettronico

16
r-~ , . •-<:-40

13.3.1 Fenomeni magnetici

Prima di entrare nella trattazione dettagliata dei metodi della risonanu d1 spin elettronico
( ESR, Electron Spin Rtsonanct) e della ri\OnJ.nu magnettla nucleare (NM R, N11cltar Mag11tttc
~\'/"-
1eeo s 3280 I 3050 • (-C-H)
740 b (1nellol
1240 I

RtS{)narrce), è nec~\arto ~minare i fenomeni generali comum a entrambe.

E 1mportJnte ricordare ti s1gmficato e l'ongme del magnetismo. Tutte le sostanze sono ma·
gneuche e 11 magnellsmo denva dal movimento di parttcelle canche. Questo movimento è
controllato da forze interne al ~•sterna e, per glt scopi d1 questa csposwone, il contributo pnn·
c1pale al magnetl~mo nelle molecole e dato dallo ,pm delle particelle cariche.
S1 puo considerare quanto accade nei legami ch1m1ci di una molecola, dove gli elettrom
(canch1 neg.itt,amentel possiedono proprietà di spin controllate da rigide regole quanu,he
1~ mamer~ \emplificata, s1 puo considerare ti legame chumco come costttullo da una coppia
d1 dettrom ~o~ spm oppos~ 1: \ero che m molti sistemi chimici gh clcttrom pos~ono e,scre
del?'~•zuu, ciot perdere I assoc1az1one con un particolare atomo; tuttavia, anche m quc~tt
"a~• ~• può affermare che, negh orbttah molecolan, la coppia di elettroni deve avere spin op·
posti (,c,~ndo il princ1p10 d1 e\clus1onc di Pauli, infatti, due elettrom non possono avere tut ·
ti I numen quant1u 1den11c1). Ognuna dt queMe cariche elettromche in rotazione genera un
~fletto magn~uco, ma nei doppietti clettromn l'effetto in gran parte~• elimina da si: Mentr•
in g~ncrale, I_ approc.10 matc:mattCo non \t puo applicare con multati v,llidt alle molecole,
negh awrm ,1 può c.ilcolar~ un \'alore per la suscettt\ita magnetica che nsulta dell'ordine di
hgur• 13.l Spettro ~7 IR della fcna,etma 'ìono mostrate le bande alle frtqucnu appropnatc (,m 1), ind1-
uodo I lcgam1a ,u1sono .t.\S<Xlatc e il tipo d1, 1brviont (s, mrarnmto b, p1rgarnento o dcform~11onc).
-10• g I Questo è 11 d1amagnetL,mo, po>~eduto da tutte le ~stanle contenenti minuKoh
magneti, cioè gh elettroni li di.mugnet1smo t md1pcndente d;illa temperatura.
Se con,1dc:namo un elettrone ,pa1ato non v1 è controbìlaoc1amento, dovuto a uno ~pm op-
posto, e la ~uscetttvtt.ì magneuca è nell'mtcn·Jllo tra+ 10 1 e +10 • g I In queslt Ca!ot, il d1ama-
gne1t>mo di fondo è cosi piccolo da poter ~re tra~ urato, mentre l'elettrone libero da origi.
ne al pJt.1rr..,~nett,mo.1:.lettrom ,p,11a1t M poswno trO\.Uc m molti s~tenu, in particolare nel-
la ,truttur.i dt alcum metalh come ferro, cobalto e mchcl Questi mctalh rappresentano un ca-
<;o e)tremo dt paramagnetismo, chiamato I,, r,,magnd mo, e <,ano I matcnalt con lUt ,1 pro-
ducono j magndt permanenti, che tutti cono\Cono. Al.une ~trutture lrl>talhnt' permettono
l'cmtenza dt elettroni hbcn, ma probabtlmcntc 1 ~1,tem1 p1u 1mportant1 nelle nccrlhc b1olo-
giche ,ono I rad1cal1 hhcri (mole.:ok contenenti clettmnr ,patalt).
 IM()(Jlllll(l,\f NOIJ,)(;JA ~IOUt:ot.ui
fl ,,uct\PfTTUJICOtlCHIU ~ \

li ,"nmptirt.amrnto d,llc wstanzc in pre-cnu d1 un ,ampo ffiJgnl't1,o orcmo p~mellt cL IJ.J.J Pnncrp, ttor,c,
~ p.1r•m.a.,ncu,mo Un matcrt.1k p111magoc11,o è attrauo da
J 1\t111gu<"rr t ra J iamJgnc I1,n10 , • o
un ,.unpo magnc1i.u Ncrno, mcnnc una w-.tJnU d1Jn13goc1tC.1 ne e rt')p•~t.i. Qm"!ltu pnn li quanlo d1 energia nch1e$to per ....
~u
~re 1i condu di
,1p10 e~ Ull1IZ7,l1O ne li J bIWJ•~
•·-~• W.,. C,oll)'• che ""rmcllt' I.a qu.anuficwonc degli dte111 magneti ,IJII cnc'l!clt,1 IO un cspenmcmo Ll>R ò Jonr monan1.a e LI lnruwooe tra gli
r· pu OJCTe quanlificato comt:'
,
1
Il riatto Ji una btl•n,,a t ~i-pe,o tr.a I poh d1 un Jd.ttto clcttm?'.igoctt (cht produuino iJ
,.ampo magnetJCo oicrnu) 1., '-0\Wtza in c~mc ,·iene pc1.tt.1 odi aria e con ,orrcotc \J'C0l.a In =,gf}/1
•u«c\,I\Jmmic lo ,t~w ,.amp,onc \ICOC pt\.JIO una se<onJa volt.a a ,orrcntt J,,, ~. il mul-
nll
tato :,,1r• che unJ ,o1,t.anr.t p.1r.am.1gnc11~. ~ppJrcntcmcntc, ~ d1 p1u, mentre una d1am,1 Jo,e g è 11 IJllurr $J1Cllro!olop1co d, SCJ>.Ir.a,
l'elettrone dello nugnctonc B.,hr) , •onr 1unl(osr.1n1c ),tle il momento m.1goe11co dd-
gncllci,uppJrcntcmcnte, pc>.1 J1 meno. c 11 e 1ntcnrn:i dcl ca
I ,1 frequen1.a della radiumnc ndlc m d rupocstemoipp11c.ito
I.e ~l('.\)C ,dcnll<he ,onsidcrumm pow1no ~,ere falle nguardo ,11 nudc1 .itum1C1 O\'\1 Kroon t' .auorbua è f unzmnc de"' l'· spcor p,uam:i •
unct1<a /J e ddl'10tcn~11.t H d I
mrn1e, 1n questo ,aw le p.articdk c.an,hedot.a1c d1 ~p111 non wno gh ckttrom, m.a le p.an1Cdlc r·· t campo nugnctico applit.110 l
C'lltr.1mlx· pos,ono c",·r,· ,-ar,,i d c:qu.1zionc I,.\ I J C10 md,c-.i che
,ubnudc,m In scnsomello (.a ,':IUSJ dcll'101cl'(.imbial11htl) è 11 numero d1 nudeom (proloru e per Jre IO ~le.IO dfoto I 'b 1rb d I)' è
~1ra10 come un pKlo nello ,peltro L\R __,~md d l'· \l imenio e cocrgi.a !Tgl•
p1u nc:utronr) d1c dc1crm10a il p.1r.amagncM111u oudcu, d1 un.i specie bulJ dJgh ,rnp1 J1 • cu .- 1,auvo e .., proau.a d1 un
gnclu:.a Lare.i -ullc, 1 .ti pt<rn e proporz ,,,n.1IC' Il .1 spc,1c- p.aran1a•
quc-t• tratt.u.ione 10J.1g.1rc le r.igion1 del cmnwlgtm<'nlO de1 nc:utrom l<he sono neutri, non J a conccntnwonc ddl.i ,pcoc prcx1s:imm1c
,ar"hi, p.ir, l ◄ .1.1 ), lì.ull o,~l"-are che, 10 oru mt•k.:ol•, gh ,11om1 d1 idrogeno mos1r.1no un al numero d 1)PIO eIe11ron1t1 ,p.11.111 La e.tlihra, d Il · '
ione C' o ,trumcn10 con sl.tn<Urd 11011 per•
nugnct1rn10 nude.tre rt">1duo e)(' ,1kun1, o 1u111,n·ogooo ~11tui11 con deuterio, non \I o~\tr- mclle d 1<•IcoIare I t cun.:entr,monc Mlin ht il - I d
· ' ,on runto ~1.1 alleo 1bi.lc-, lo ,1.andJrd contt•
va r1u ma~octumo f '1drogcoo \0nt1cnc un wlo proronc, mentre il deuterio conucn\ un pro nenie un numero•0010 •
d1 ~J>lll, dC\c d.irc on<>•nc
o-
a un r
ra,,1Jto a,m1c Ia ,t~ fornu del cam•
tonc e un ncutwn< , due nudconr, un numero pan). li carbomo 12 ( 'C) conuene \Cl pro1on pione 10cogn110.
.
"'cum CM·mp1 d1 ,unda 1J ~no rappresc11u11 da wluZ10111 J1 pcn1~qlamm1•
p1u s<1 ocutrom· un numero pan, per cw ouo po)S1cdc alcun magncll)ffi0 m1duo. Il '(. con na d1sullonato o d1 l,l•d1fonù-2'-p1mhdm,le (DPPli) w lIJo Lo ~tanJard soI1do conuenc
tiene i.ci protonr (pe"hc è un ,uomo d1c.arboniol e !>Clic nwtrom, un numero d1~p.1n d1 nu- 1.53 x IO· ,pm sp.11JII per grammo .allo ,1.1111 puro e può c\"rc dtluuo per miscd;monrcon
nerofumo .id.tre con(.(otr.111001 p1u b.1\>e
dcom, pcmò p~ntera un m.sgncusmo nucleare m1duo
Per un eknrone ddoahu.ito (come akum r.1J1 , .at, l,"'-•l ....-, , g •, tlO''
• ,, mentre nd ,a~ d ,
dct1rom locaha..iti, per e-empio qudl, deg.11 a111m1 d1 meulh ti, tran,121on~.g t Ylt1.ab,lc e ,I
I J.J.:! Condizwn, d, nsona,w, suo ,alorc formsce 10form,11on1 ,ull.i n.1tura del lcg.imc ncll'mtumo dell'deurone ,p.11,110 In
:-.clic 1ccm,he [SRr 1'~1R \pJr 13.◄), m pr~oz.1 di un campo magneuco e)tcrno,~1\10• cood111onr d1 monaoza, 11 p1u.o d1 aoorb1m<nlo subt"-C un al1Jrg.,men1o a .-aus:i ddlc mtcu•
no dut poS5ib1h ,r.au cncrgct1~1, \l.& per d magnetismo elcttromco ~•• per quello nucleare 1Jon1 ,p111 r.i,,olo. CIOC delle mttr.1110111 dcli ckuronc ,p.11.1tt> .:on i.I l('!,t0 della molc,ol.a.
Quf$IO fenomeno forms.:e ulrcnon 1nfurm.izll1111 )UIIJ ,1ru11ura della molt<ol.1
• uno sz.110 a liaw mtrg1<1 E, d campo geocr.ato dalle particelle ,.,n,hc 10 rot,monct p.iralk-
l,,1_lCWIC.t LSR ad alu moluz1onc put\ C\\CTC C)fgUll.t c).lnunJodu ),1 molu11t>ne tpcrfinc
lo ~ campo cslc:rno,
dd picco d1 .as~orb1mento, cau'l.lla .ùll'1111cr.111onc drll'ck11ront ~p.11.a10 ,on, nude, adt.t
• i,no stato ad a/14 mrrg1,1 fz, 11 cunpo gcneuto dalle parucclle canche IO rota11onc è anupJ ccnll b~ produce 10forma,1on1 ~ulla pt1s1Z1one ,p.u11lc degli a1om1 all'mtc1no dcli.a mok•
r.tlldo al <.'llmpo esterno cola. I.a molu11one 1pcrfinedd pro1ooc( H) 1ic11 r.id1oh hoo1 ,, ,•mfi,.1 ncll mtrn:.illoo ••,
LI condtrJonc d1 rnon.anu e ~Juf.&tt.a qumdo aV\ ime la tr•osu1ooc dallo 5talo a bas\.& x IO" tc,la ( I tc\l.t = IO' g.1un e rapprcscn1a un.1 m1,ura ddl'mduziooc 111agnct1,.1, IO rdi•
energia a quello .1d alta cd e ventic.11.a l'tquu1onc 13.1 (veda-.ono) Allincht que)l3 tr.am1110 11unc lineare con 1'1111cn\1là del \"Dmpu rn.ignw,o), e lonmu di11 an.i.Jogh1 a qudl, dte M 01
ne 11n'tfl~.a. dC'\c essere .a™1rh110 un qu.antu d1 energia, o hv (dove h e la co\tantc d1 Planck tengono mediante N\1R .iJ ah• mt•lul1onr lnta111 è J>th,1b1lc ottenere un com1Jcrc,olc m1-
In pr<:Mnn d1 .appropn.111 QJOPI m.agneuu ~tCT01 s1 può dimostrare c.hc la frcqucnu dcli• ghoramcnlo nell., molu11onc cfld11,-a J, uno ,pturo r\R ullhuando JJ tC(m,a della ipel•
rad1anonc applKata, \, cade odi.a rcg1onc delle m1m>0ndc per I.a tccruc.i L<iR. 1.ih'oh.i chta• troscop1.1 d, dupp1J rhnn.an1.1 clc11ron1'.1 e nude.ti'(' l "l;DOR, F/(1 tron ,\"m /c,1r D,1111il, R,-so•
11a11u) Con que-ta mctod,~.i 11 c.1mp1ooc viene 1rud1atu wn1e01poranumcn1c: con micro-
mata nson.:uu.1 dcttroruGJ parJmagoc11Ca (EPR, El«tron Pi1r11magntt1< Jkwn.,11ct ), e ndl.i re•
g1onc ddle r.1d1olrrqucnzc per LI tc..ma NMR, uhuha ch1anuta ru,,nanu nu.k:uc po1r Jma onde per LSR e ,on Rf r.1d1ofrcqucn1c-) per ;'l;MR li ~gn.i.Jc RJ \ltnc ~m•to per un punto
gnct1ca In c:ntr:imbc le 1«n1chc:, ,·1 $000 due ~1bl11u per determ10.irc l',1\sorb1mt'olo d1 fhw dello ~pcnro E\R li ,,:gnalc m usc:11.1 t I altcz1.i Jd ~o.ile l \R in lun11uoc dc:ll.1 ,·.1ri.1•
mcrgi, clct1romagoct1,.a (al punto d1 monanuJ: zmnl" d1 Rr ouclc.irt Que<,ta tc,111,a muli.i par111:ular111mll" ulllc IO prc1enL.1 d1 un.a granJr
\-.rict.t d1 livelli nuclcJn cht' fa all.irg.arc la normJk l10ca dt monJn1..i clcttrom,a Una terni ,
• , iene 1mp1cg.atJ un• frniucnu unl•ntc ,,m.ando 11 umpo magneuco C'itemo,
e.i an.alogJ, m,1 d1~1101a, è I.i dopp1u15onm1.a clcllronica (11 l>OR Ilct1rcm l>oulolc Rrso1111n-
• Jt us.i un camp,:> nugnctKt> olcrno costante e s1 \',m.a l'appropn.tt.i rri;1onc dello ,pcttro ct), ndla quJle 11 campwnc viene 1rr.1d1a1u con dut." frcqutn,c nelle m1croond<' tJ 11.1 c: 111ll11-
Per rag10111 tecmchr, I.i pnmJ opz1onr è I.a p1u comunemmte ultluuta, anche ~ ~• ,tC\,1 u1.1 J'(r l'o~scn-.umn<· del )("gn•le I ,R 111 akun1 punii dello ~peltro, mcntr,• l',1hra, 1rnl.' un
multali 51 011mchbcro anche con l'.ahru mctodo piegar.a per )ond.1rc Jltrc p,irll ddlo \J'(IIW. In qut'lolo rnodt> 51 111os1r:111 ~c:gn1k I <;R come
 lllOOI \IICA r lll >IJXIA MOU
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,..,ucnzc ndk n11,111onJc la 1<-c111,.11-1 DOR ~ \~ntaggm~
funzione dd)J d11t, rn17J J I J uc tr•.., ~ .,
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per ..ep.,r;arc ~~In Jr muI11r~J IWIJ..,
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JJ 3 4 Stromtnto:,ont
i
la hgun 133 e 1101 raN•rt1en1Jraonc .,.hcmJlt,1 dei .::OmJ">ntnll pnnl1p.ih d1 un J1spou
i
urn P,R le mlcn,at.l. dd campo gmcr-.ato dJgh ckttrormgncl1, Jl(hM>no .indire di SO a 50i)
"· I <',pero1tener( un ••)c\llO .,•rJd<.l d1 prn:u1onc· ..ano ne<:,~,;,anc v u1J1u1n1 10fcrton a
nurntc,,
I ,u Hl" u rad1,nonc monocrom,11,.a nelle m1rn.>e.1n.k ',cnc prodon• J.a un o-...,lbtor, Kh
stron d.a lunghc:zu J'onJ• tddl'ordmc J1 3 10 m 19000 \tH 7 )
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thongcbh 111 .uoto liquido In gmm: u ripon. in grJfi,o. m fun,1onc d1 H, I.i dcm.ata pnm.a 11'-e
Jdl a,>0rhrmcnto (d,\/dlll ç non À S1 0111cnc: qu111d1 un grafico ,mule l quello nport.tto nd
La figur.a I.? 9· qu~I.HunHim(' Jcfim~ un1 •1111c,• m ,pettro.cop1.a f SR. Gcnenlmentc n
0&111 m<>l«ola sono prr-w:nll rd.111, imcntc po,;h1 elettroni ,p.11.tu e, qumd1, )I ottengono mc
no d1 d1.x1 hnte non troppo raV\ 1,m.11c tra loro
Polo ,o1o
f1'119'191100 rlllQinftlco
IJ.J.5 Applic,wom

Mttalloprotcine
l.a ,p, nro...opu ESR e uno lk1 mc1oJ1 p1u 1mpo1un11 1mp1eg,1u nello ~1ud10 delle mcullo
protC'lne, in pJrti<ourc qudlc contcncnll mohbdmo (untma o,,1d.1)1), rame (crtocromo o•
s1d.m ed ffl.l1m1 blu ,ontcn<'nll rame) e rcrm (ci1ocromo.fcrrcJ0'>$in1 • Sia il rame \1.t ti ferro
non aruni,-o. ,hc non "~rl>ono ndlc rcg,om dclrultr.i\.1oletto/\'lsib1le, pmcnuno pKch1 d1
U$,Orb1m(nto bR in uno d~1 loro )UU d1 o,"dazionc Quindi ),1 r-cg1strJ11onc ddlJ compaN
e dd~ Komparsa dc, loro ~n,1h IO [<;R t un mcuo p<r .cgu1re la loro at11v11.t ne, s1,1cm1
mulucnz1ma1"1 d1 m1to,;ondra e d1 cloropl.uu ,nt.1111, oomc pure negli cnmm isol.th l'-ellc
mctalloprotelOCl"USlc una uruuur,1 ,1cn:och1mrc:a ,pt.x1fka per md10 dcli, qu.tlc un numero
can11crn11.:o d1 hg.indi (I~~ ,1mm10oaod1 dclù protcin•l -ono ,oorduutr .al metallo Glt
,tud1 ,ondo111 con b tec111-2 FSR !unno m'tLlto ,hc l.1 geomctn.1 strunuralc è 'J)CS>() dl\·crs.
di quclu dc, ,,,tcrru modello e b distor,,onc può ~re corrcl.a11 alù funnone b1olog1u
I 1sun Il .I h11iwrun,d1 uoo~UOITl<tro I ~Il CRO.O!cll°"'or,o• rags-,aiodi..1.
p1dl! attr.1,cr$0 I.i mcmbr•n.t A ••le . .
opo l1 può proxcJcrcm due modi (1) con<entr.tndo I h
p1d1 m.tl'l.111 IO una rcg1on< del Jl1p1•101tuh1, oppure (11 l m,orpor mJ<>h c.l\u,1hncntc, dt ,uh-
10 in mcmbr.1nc modello La J1f1u>1<>nt Jc1 m,r,Jton J, ~m h t• \ffllrt m ,ont.111 0 l'uno ,on
l'altro t cau,;a un .i.ll1rpmcn10 dcUa hn,a neUo ,pcuro l'n .altro m.an·11ore us.itu per \IUdurc-
il moto de, hp1d1 ne, doppi \tr.111 è :!,2 6,b-tclr.1mculp1pcnJ1N•I oxik (11 \1POL) L.t m,1,.
c.11ur.1 dc, losfogh,cnd1 con quc-10 ,ompo1to permetl( d, m1\uruc b ,doutl J1 p.h~gg1o
d.a.11• superlìl1C! interni .i qudl.1 C$1Crna (/1,p r.itt), ,-omc pure u J1ltu\100<' Ltt,-r.ik

Maronon dr spin (ipin labcl) Radiali hberi

I m.il'l;aton puam.t!_;nct1,1 \Ono rad11:.ah lilxn n.1b1l, e non rca1u, 1uuhu.111 come ~pp1
rq,oncr o cnmc 50ndt'. L.a pro.:~ur,1 della muc.itur• p.1.rimigncuca conmtc ntl legare qu<'
stc sonJc :1 mokwle b1ologich~ pmc d1 elettroni \p,11a1t. li m,1rutt1rc può =re legato IJnto
• un .u~u..10 qu.into .a un h~nJo. Spe;.w 11 m.arc.atore ,on11cnc una pomone ù>)hlu1t,1 d1
0~1do nur 100 Qu,°$11 m,rcator I ptnncllono dr studiuc gl1 evcnh ,hc s1 mamfcst.1no con un.i
lrcqucnu ~ IO • IO , Se 11 m<>Hmentu è hmtt.110 .ad •lcunc J1renum. t po"1b1le studi.tre
solo Il mo~ mmto an, 1, 1 mO\ 1mcnto ncll• Hcu.a d1rc11onc), per ~pio nd ~.t\O di
muaton r,ir.1m1inet1<1 J, mc10br1nc ng,dc m doppi )IHII hp1d10 In quc,,to ca\O 11 nurc.i
torce a1ucuto m moJn <hc 11 gruppo NO gum1 p.1r.alklo l!l'a1)( del hprde
'-1 poswno oucrv:trt e mr\ur.1re I mo, 1mm1J mtumol«olm C! I• diflmmnc l,llcralc del h-
Lo iprn trapp111g e un prost">O per mcxw Jd qll3!c un rad1,alc hbc-ro mst•btle .1cqu1 s.:c
l1.tbtl11.\ reagendo ,on un compo,to <Cime 11 S,S-J1mct1lp1rroh •· I 0\\1Jo (DMPO ~1 ns,cr-
\,ano nsoh111om 1pcrfiru <hc dipendono d~ ,1Jtur.1dcl ud1c.dc R'
Con la ICl111CJ ~R ,1 po,...,1110 ,1ud1uc Jnchc molC<olc nello stato d1 lnplwo I to,forc-.;cn-
lc) p.ir 12.5 I) Que.l m.ill\l produ,, d.all compltmmlJJI • qudh ot1cnu11 ndl.a regione
s~11rale dcli' uhrJv1olc110 o del 1 "1b1lc Ptr e-empio, rad1...il1 hbcn duvutullo ".tto d1 tnplct•
todd triptofano 1oOno \t.111 o,~nm nd rn,1JJ11no .alleno di c.a1.1r.1~
I radu:.ih l1ben s11ro1.ino III molte, 1c mctJboll(hte,, torm.ino ndl.1 dcgrJd.11Jon~- d1 far-
nu" e IOS\lnt' I mc,c.umnu d, tr.a\lt-nmcnto clcttromrn nei mllo,onJn n"' doropl.u11
,oinvolgono 1pcc1c p,uJm.agnc11,he, per =mp10 1ctnll'I I e S Altn prore,", • ,.,Ju111,1
 59'

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SU mrtodKL U K'glllk r.:ont 2.00,tUM)I.Wll J'fl1'Clpalmcnte&1 m to.nndn, m.l 11
lul.m dl\-cnc: pmcni.ano uiu dJvm;a 1111nwu dd ~ Il ftnomcno f wolt1" d,xi1dll;o,
d.tlk> mto mcubobco f.atmn d>t a11111C11UllO I atti' ti mcubolzc;,a (ilfflJ'L~ m.:hc un •
n1c-nto .td iqµialc del r.idt,:.dcorpnlCD. ,Molu snida IMO IUll condotta wl radiulr libero
polimero da mcbnuu e •ul radiale- a,corhlc- qunt ulumo 11 ~ n\'d.tto uuk pn uudurr i;L I t4 Sp<'llrmcopu dJ 'UOJWua .....,.,....,...c...
dkm di alruru bffll,1,a .wlù nuturwoor ddlo apmna.
I.a ,.an«rogrnCSJ t un ara dJ n.-ma an ,w aradialJ libcn 11 5000 nw:bu pan1mLnmrntt u tt'ON &1u bbt-dd _ ~ -
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dn'.aU nq;h ~tr.all supcrfki.tl1 pcn1rnu non n«rolKI r11Jl(lt0 alle rqi:aom ptu tnlC'rll<' dd tu
mol't', f onn.11 accertato dlc I rad1ul1 libcn ~ 1odulTC' ~ • r ti .iato :.tudu10 in
che lo S\1lurpo d, tumon tmrwiuu ntt IOpl. In molu cua IOIWUIC churud1e cane~ 13 4 I Prìnnp,
sono usoculc con la prodlWOllt di radll~I bbai. ~ ewmp<>. sono .UlC' condottc nccrdic
,ull.a ,an~crogmicu.1 d, akwu tdro.:ubun polic~-i Gli idrowrbun pobadk:i 11 formano 1.a rc..-nK.a N\tR rr~
d.ll kgamc UICCC'MI\O d1 anelli bntwua lun90 I matgllll dàfandlo. dando OJlglll(' D comro u11h1.t.1 I "4•1opo H J,J
ili C"OIIlC' d rafwmc (due andL), I .antrac.cnt e il ktwllrmr tre' anelli \ la \"t.1 dtc l>I ~nto
J.f.ltnm, Rl"St'fllm.T t u ~
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no 11d aggiungere 1l1n anelli L, $1:rvltur■ divait.1,nnpn: pnl ~ l'otdte quau cum
pom powcdono ar•ttrrc 1uomatKO. aummrmo lt ~ c h e - I ckttronc lìbcro del r• La ,ondwooc di
d,,.ak venga cklo,ahu,.to, ,o1 mul~to di rmdrrfj piu 1t,bd1 t, qwnd1, con trmp, d1 m.1 r1u ntnno dt dt\"rnt ,ffltmaJa
lunghi, l,1 pcrwtm1.1 l1 rmdc pa,ticowmmtr dannou. Mok1 pr«uuon J1 queu r.ad1CA!J 11 ma, roondc ron un, I
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um .ano m sorgmu oa1ur;al1 come il ..atramc, il l1lmo eh llibacco, altn rn,docu ddb combu
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suo11r, am gr.1v1 mdu ptt I ;&111btnttC'
Un'.1 hr, Sl>IJ('flh" d, r:ad.uh hbnì t rappmniwa dallìnadlmont di nutcrwt bwlogirn, lh'ak=d1,a
f'(r 1'Kmp10 wo raggi T 1\-r c,tmpao, ndk procctnt 11tpm1 crouau ~ <; JIMSODO ~ r roolt(ow-r dd
1J.-n111ì,,111 111cd11ntc 1rr.tdw1onc; l'rkuronc tpaUIO dd r•clìulc hbtto prodotto muha l,x1 ttrilatOml'tJ
lffOO,~ I
liu.110 ndb rq;1onc -S S l:n ahr.a lmportanll' lpplic;aDclM d1 queiu tttnKa t I aiullii dcr,11
ahmtnll 1rradu11 ptt indi\ 1dua"' nm11,w1 r■diah lilK-n tttedw ~ t«nia può CUCti' uu'.1 ' " ipi»lunrnto
11t dal'- IO a
u1a anchr prr subditt K un ahrnmto rnnknODIIO t .,,o 1rracbato l n 1rrl1C,mont' btomc
d1,.a/,1111h11.-nt.ilc .1nJlctga <om1,u ndlo ,1ud10 d1111111nw1 lwolop:1 COl1l( OtA •1 dcnu (Jwn amro md."1Uo t
pcu alto, aflliK':hi-
do qunll m.i1rna.h so11on1,osu, UN r.lid1UIOIIC.' 1on1ZU111C',unm.puU1aOo rnaiµ, ,htpuò
<hr Iuogo ll1La fonmmonr di radiai, libera. Oiwlfflffllr, I f..SR pub n.crr 1m11icg,1a ptt ml' ~~'
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m11~i.1oncd1 radw,oni oudari. arropo
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~1.Jlu •ludi ~.iboht1 sono St.111 bua11 •ult. l«mu LSR In pirltrnl.alt' l!UOO 1t.1IC' rondol
le m.crùlr sul mttabolumo do ••~•. w• procn11 ~tic a.-vnip,no 11C1 ma..rosorm cr.1111,1 ,u1
IOCCLllll>llll ,h pcnl:,.\ldnrnnc e \UI r:adl(,1.h hbcr1 prodom J.ill'u~no I.A wpno.u1do d1 dur
smulll" rhmm.11 rad1ul1 hhC'n u>11nr»1 ,on l'°"'alCl'o (wpcn'IAlliol t l' 1,ht Mll'lt• ,t111 au,,1 1..
a.au, per CM'.mpm. ali mfiamm.monr r ali 1mT<duunm10 L 06lldo nitn,;o '1:01 ~omc mu dan~
tà md1prndrntc, lungt ,l.1 m~ggtru fim>logiro d1t r'1(ILa I Wlfflll ~uso. 1mmw1olop'l) o
e: urd111\-a'k:olarc f· ii.io ch1Jm.110 m UU\;11 nrlk, ~i.1Ctt1<.Y1 (tou.iro I, ndl 1rcnnw,,nc: ne! lpll
wlpo a1>0plr111w e ndk 111a!J111r ocurodtgr~rall•'t \tt,bmt NO pirla:1111 .di.I normai, tra IIIC'no
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1ccmc.1 con I rap1diss1m1 metodi .i 1mpuhi-arnu I •. L d I'
. -.-wnone tr-.uiormata I Fowter pa acquw
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w.c1ta ~ ,malm computttiu~ta med1Jntt tr,ulormau d1 Founcr Quoto approcoo ha ong1•
1 e», nato un ampia va net• d1 prcxedur(' ,hc permettono Lz prodUZK>nc di spcrtn multulutlfflsw•

_;J}\--------~- nah (a quutro dimcnSJOnt ne-gli CliJ'fflmtntt p,u oomplc:ua), spcttn :,;MR di "Ce di altn uo•
topi dup.1n, e fa dctcrmuuzrone d1 1mm.1gtm a scanst0nc
Come m lullc le altre tecruchc >pcttr05(op,cbc- già lrattatc. l'cncr-gu , ,mc immc»a :sotto
{om1a dt rad1u.ionc dettrornJ,:net1ca, promuovendo iJ p,uuggio dì <ktamanalC'•m,,t.à• da
5 l)lll&manto
,tau mergct1c1 mfenon a ~tat1 ,upcnon Lt"mulà" )Otlo rappromtatt'd.a clmrom ndle 1c,;:-
d,IQMpOH n1Cht ultrav1oletto/vmbtle da osc1lla11ona e ddormanon1Jn 1cp.mt ndk ttcrudic ncU'm•
!bi fr.uo)SO, nel R.aman e nelle microonde e d.a oncntalllfflll dt'llo spin nugnctKo ID f.!>R e m
TMS NMR. Tutll quesu prcxc:u, ~ono le ngtdc r~lc qu.int1c.hc ga.i. dn.:T1tte Chur.unentc,
dopo un cerlo I.uso d1 tempo di norm, bre\·c) le entità, ID prccedmn promo= .igh ~tau
più alu. pol>SOno ruornarc allo ,1.110 mm.ile Ques.10 rroc= prende il nome da nb$.samm
lù. Un esempio molto .cmpltcc t o,~rvabde nelb r~one uhra\loletUJVUJhdc, do~,, rro-

i
ducc uno spettro dt a\\Orb1mm10 quando ,1mc ,mmc~<' U60rb1ta mcrgia e uno ~p<ttro dt
em1.-1onc quando 11 ,utcma s.a nl.u..a

I 'Mcfodt II impulso/■cquù12iont' in trasformata di fountt

i Esistono dl\eTS1 appro.:ci p<r produrre ~pc-nn. aoche se le mctod1dle adottate p,u sposo
5panMnCnlO
-----<► dalcampoH
Figun 13 • ~ , o NMR ddl'al..:ool dw..o (a) a baUI moluuont e Ib) ad alt• n'°lu11onc. ll «<ondo t rn
51 l>m ruolro oolo ,a Qmpion, molrn purL TMS, tcu1111t11ù1~no
co Gh spt"lln !1;~1R "'no dJ irandt 1mpor1.inz.1 nello \tudio delle \lrullur<' c.h,michc ~• po,•
sono ottenere anform wom $11 qual1ta11vc ~,a qu.io111.au~c e b ruoluz1onc 1pufinc forn1s..c lll·
formazmm sull'amb1t'1te urcostantc al nudro u maggiore potcnu da calcolo da cui ogsi li
d1spon<' ha r(')O pouib,li mo!te tra le tecniche NMR pau .iun.utc- Sq;n.ili ddmh p<l\S(lno es-
sere pol('llZJJt1 ocgucndo mollC' sc.uu1om <' .a,cumulJndo I dJII, 11 rumore d1 fondo, che è ca-
suale, tende qw11J1 a s.ompanre. mentre 11 scg1ulc r<'ltlt aumenta. Qua.lo metodo. lhc ace re•
sono due Ndla ~pcttr())Copu •,om·=n.aJc• l'mcrgu1 dcttrom.ignct1,a ncnc fumna, .bila
50rgcnte, -.otto forma d1 frt"qum1.1 , .arubik su un lllhT,allo spcttulc pr-ock--zionato u n-
spost,1 v1t11c m-cbta da un dispos1t1\0 adcgwto e non è 1mporuntc .ub1lìre K b K.Jn~mnc
avviene dalu lunghc:-zu d'onJ.i p,u brew .a qudl, p1u lunga f.:1ot d.alù fr~umu maggiore a
quella m,non-), o \.KC\cr1>a li punto essmz1.alc è ,he il ,m1bt.1mcnto è ~tante e rcgoluc tra
hm111 prefi,!i.lll L'.altcmall\'2 .:onmtc ndl'u11mctlCTC 1u1u l'meri:ia, ,10<' tutte k lrequcnz.c n-
sonanu tra I hm,11 prcfi,..iu, ncUo ,1~50 tst.ante Questo ruwtato ,1 ouu:nc 1rr1J1anJo 11 ,":1111•
pione con un 1mpuho a banda urga da tuttè queste frequenn: m ~ •'Oha wb. t; ,hi.uo me
.tnchc il Kgnalo: m us..11.a nene m1)ur.1to ,·untcmporane:unmtc t il n,uluto in genere è un
p.ittcrn J1 mtcrtcro:nu mollo romplK.110 l-or1un.1tamentc,quc:s11 r,ittern po>-><lOO ~..n-c: .1n.1-
lir.zat1 con I metodi b.i-.111 ~ulla tr.1,fomuta d1 f-ouncr, dic rnnustc tn ~,-Jure m.atem,111,he
11bb.i)tanu complCS!,(' ma da tao.le CS('(UZtonc {gr.wc alla potmu Jn modcnu ,omputcr),
che non generano probkm1 per l'utthzutorc
'11 d1\ttnguono, ;m .tppr,x-a a scwnd.a della t('(m,.i ~rcnro"°pta Com.- mdi.aro nel p.i
r.igrafo 13.2 2. I.a tccm,-a Ff IR u11h,za 11 metodo ddl m1crtcromctn.a I' ntcrtcmsramm.a 11
•ultantc e b.uato ,ull'o)SCr\'anonr drllc fn:qucnic che p.u,ano allr-a,crso al .;.impmnr e non
,;:ngono assorbite ~d ,aso J1 Fr-N\IR il riJc,a la C0$1dd~ta Fr« ln,tu.rwn I>«m (H l>) o
 11100 IC , I IIOUX,U MilU
',96

d« d1mcnlo hbno 1kll mdwont (.Jurl-t'ulumo è ~unik allo ~pcttro di cm,~ ionc I CU111 t . z
I.111<1 r, I<11mcn10 nei mct oJ I nell
'ultrniolctto vi-ibilc, m qu.tnlOII pm<iucono SJ>c{1c CC<llatc
cht t mc1t<>no nuovamente k hcqucn1, tu,10rb 1 < 1
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,1a11,1ic.t d1 Boh,m.mn ~• può dmto~tr.arc ,hc. qu.an o I m I
m.agnctl<O c,t,mo, all 'cqu1h\\no 1am1<0 s1 o~naà un leggero ccccs50 d, spm. 1'"" ddt"\11
• I -1 hc qucsu è b ,:1.md1Z1on,: normale a ha1
<t ~pm, .alhnr.,11 o p,r,llth .iI ,-;impo. \ uotto '"•• 0 '
J'<) )f.
,. •
~ energia, po1J1t lo ~mo ad .ilta cn(~ t pm-ogJu,a Jc, fl 11111 anupualldi Cso J.ì ongmc
.il, cuore di m.tgnctuuzsonc m.a,n»copsc.i M , che per conH"nnoOt' gu.c 1ull auc z dd >lii~•
m.1 d, ,oordmatc ,.,rte~silnt 1nd1mc n<.1on.1lt, nscndo l'.ts-c:: ~r.ùklo alla dirc11on1 dd, m
~'ti mJgncuco c\Cemo l'mduziont" mJgncll,.a dcl c.impo olcrno t mdtl.llll come B !>1,oru1-
z
da, or.a un ,mpuho di r.1di.111onc d1 frequenza approprul.t nelle r.1d1oonde ( Rf ) O.:uim n•
~
cord.tr-c che si tr,m.a dt un.a udr.uJ1-ne clc.-nrom.agn,:ua ,omprcndc.-ntc un wttorc.- clcttn,'O e
uno m.igncuco. li vcnorc m,1gnc11,o dcli.a rad1aZJone RF h.a un ,-ampo m;spittlco ~ 1.110, 1,
cui mdw1onc nugneuai poo c»ert mJ..:at.i com, li Se le bobine che u·aimcttono I 1mpubo
dcli.i rad1.monc RF sono d,spo,tc m modo che B \1.1 pcrrcndlwl.uc all 'nsc: lungo cui g1.act
Y-?Ì~-·-
M , allor.i M puo ~re ruo1.ttod1 un .angolo 8\U)Oil p~noX·)' li \-;alorcdi Od1pcndcdall lll
tm\11.l del ampo B e d.i.11.i durai.a dcllimpubo.
l~ 1·,gun: 13 "i,1 e b sono un.i upprC)ClltJ.11one ~hrot111c:a d1 qu~o proccs~ m cui 11 è
·J
~-- ~---
cllas~
po,to 8 = ,c/2 per ,cmphcst.i (jlCr ulteriori sp1tga710m, ,1 ,ed.i il paragrafo dedicato alla l«m~
J, ~MR mulud,men\lon.,lc). Gli ~pm ,he fomw10 M non sono r1u parallch :al u.mro ma- I 1guri 13.S Ro1muntd&. rNptUm:xa
gnc11<0 <-,,terno, cioè M non g,.a,e p1u lungo l'ob)(:. In nun.;anu d, un ultenorc impulso d1
r.id1.1.11onc Rf 11 ,1,tcm.1 nl.nscn e M torner.l lungo I .us.::. Que.to ntorno o ri.Ln.samcnto,
che h.i un andamcntoC'.<ponrn11ale d1 primo ordsnc,.U ongmc al Fil) e I d.1u 'Vengono a,qu1• una ,ingoi.a FID I ,omplt,.111 p.ttcm di uunfettn:u ('ZnCnt1 HO pos:iODO nscrr ac--
s1t1 dur.mtc ti periodo da dt<adtmcnto Come d=nuo. si potrebbe con,1dt"rart qu~ta pro.:.c- ~r .111 nelle loro , omponcnu scr,o e ~ cblI' d.t Fauna e tnsfonm tra doamu.
dura come un scmpltcc cspcnmento d11mpuho •acqu1mmne l'uuhzzo d1 impulsi Rr mult1- u tìgur.a 13 7 nport~ la tmfonnata dt un onda, eh( Cllll4!1:cndt ln' ®dr mJ111Clldalh d.a
ph, pou 1btlmentt' ad ,1ngoh d1ffcrcn11, rende po,,1b1lc un gr.ande numero d1 cspcr1mcn11 dJ. \"tru lrcqutn1a l lllll'•etu
vcrn , che pcnnenono di acqu1sirr dati t>trcm.111lt'flte mterna.inll Due pnxcs.\1 dt ril.usamen Il gr.\lÌ"1 nel J onnmo del 1<1npo r:irprtsmwitc la AD di ma QJ'ut~mt, ""MR Jak-u
10 \Ono 1mport,mt1 m 1'\1R e nelle: tccm.:he .a,.oc,atc. ll Jcç,1J1mcn10 C)p<>ni:nn~c d1 pnmo rcbhc hcn pm <-omphlJl\'1. in .:i1.11.nto ,-omprm,datbb,: ,m numero molto~ di n& K-
ordme o,..a-vato ndl.1 flD è uu!.lto d.alla d1...s1p,mone d1 cni:rg1.up1n rcllullo o n~mcnto no e ,oscno Qu~ tc potrcllbcro (1.Strt ~tnnc tr.astun::nur nel domuuo &-cqurnzr e n
long1tud1n.tk In qu~u. \llumonc l'cncrg1.1 s1 disperde \'Cl'SO I.i m.llrlll" (.imbtcnte), li peno port.11c u>1m pK,h11n uno ,pcttro.
do d1 tempo ncc~no per quc:,.10 pro,~so t 111d1c.ato con~ t•n ;iltro ftnomcno t 11 nl.t».1• Nd p.u •gralo l \ 1.2 r sl.&lll 111lc.-nnato cht gb 'JllD o, nudo .&DOQmpt
mento ,pm ,pm o tr.is,·cr..ale, <On pcnodo J1 tempo r •do\'C l'cn,rgia vm1c d1u1p.11.1 tra gli nugncll<1chl" po»ono otrndcrt La loro acllumn ann,= lo ~

spm p1ut10\IO -.hc \ 'tl'\O J'amb,entc:. r, t !>tmprt nugg,orr o uguale a 7,, per pi.loie molc..ok tono d11 ,111.mcnte d, quota mOumu lmomcoo noto ,omc ~I
ori:;intchc &1 sono ugu.ih utà ,Id ~ nak d1 una rt\.Orunr;i (llffibu qw.ndo lo suto dci ""-tnt ...-o~•rnm (bi
1'.anJII\I dct1.1gh.1t.1 del metodo dcli.a tra~form.tta d1 I ouncr c,,ula dagli l><.Opl d1 qu~to te l'cqu1hbno, allora 11 ,1a a~rutmdo o un C'SCl!ll"'' dcli u..J ~ O\,-rrl\2titvr l'-
,10 I:: ,uffi.1cntc \Ollolmc.-arc che I.a prtxcdur.a m.11cm.a11ca tr.1\tomu un sctnJle nel domm , dritr Owrl11111s.-, I tT<Yt ~UC$l<1 dTctto t fond.tmcntalc ptt la ltcmxh
dc1 1rmp1 nel •pt<•o· cormpondcntc nd dom11110 dclk frcqucnu l'cr un ond.a ~111u,01d,1lr mt'fl~11m,lc dcUc molt<-ole mo.ime le mflumzr magncuJic trai,.- nclhn ed
<Ontcncnt c una sola lrcqurn1J, d 17 (och ptr $C(Onòo ), l <1do e n portato m lii- ~lond1 In
gcncrc un"ond.1 ,1nu$01d,1lc è mo,1 rat,1 nel domm,o dei tempi wme una 1>or11one J1 un, ,do
polare ,1 tnumcllono llllfi\'t'nCI lo •rwo ,u IIIU d =~
hnulilta. r ra
,11nu tr.t I nuclei dt"'C' =rc di ru,a O4 nm o mia,~ Chwamcntr quoto, nrolo ~r.anak
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mlimto d1 o,c1ll.1lt001 d1 .unptl-V,l co,tantc I.a frcqucn.u app.arc come un ptl(O ,ingoio nel
domm10 ddlc trequc111c, an<h'c,'° d, .1mp1cu,1 tì\sa I.o figura 13.1>.t m"'tr.a l'efk tlo ddu
pcnnenc J 1ottmt>rc mfomunom ~ulb cmmetn.1 1ndutmw<1nilc ddb mokrob 1n
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tr,Hform.i11onc tra I due dommi per unJ Mng,11.a onJ.1,muso1d;1lt' e I.a liguri 13 <>h quella per memo •1'111 ,r111), dovute llll mt«a ione ,u leplll( dlururo.
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~~l a 1.>mh-112 t+ b ffrl'~Dmttlfll>liinp IWQ.tlnnc ~ a dn1on1onc 1ncdun11• truknmrnto di pol.anu.m,,nc (IJI l'J 1>,m,mo"IL'"
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-.,,, ,, ,--'- •~c o Rt'g,lln'C', u1p.:11 rn11
• 90'" bs.,-u.nd,;, Il tm:po J'C'I I ~umane Jc,g11 •~in Jr protone ..hc: cnmw~•no k d.tl numero d1 prulom d1rctt•rncntc l~u al nudto .i, c.arb,imo. Per csc,npao, IO un npcra-
.,.,,.,.,..,,,,...,,, 1-1 H c:bc danno onpM .a lnlt'!UlllG&llOOI Jl,:t)I l~ucnJo un., ,c._ond.a 1rr:aJaa 11\ffllo Df:YI-1 15, Cli t' < Il Mino cntrimu1 pos,ttv1, mentrc Cl I ,. nq;.itl\u r: ,hwchh«: un
• aa panto ddJo tpt11ro d:swut dii quabìaY fnquau.;a ruo1un1e, arr.idi.u1011c- fuon uruco opcramcnto lJEP1 l'.\S ruoastrc suih,tcnlc sc non wno pre5,tnll gruppi mwhc, I ,c.
, • • nza ro,y,,,=-"':e ~ 1.1 il"!"• ano •pc:uro Ji '°ntrollo (non u rroduu alcun gnalt Df'.Pl per gli atomi d1 c.ub<,mo pr111un,",01.J.ara e IC'rll.m ,1u1, prr-..:dcnlc-mcnta:, uta•
,-. [ dlc- pu0 aaae .ottutto da qudlo pnndcntCl116)k" :a.:qumto m qUCSIO modo u <>lllf'- e•
w:undo impulsi .1 '4~ 90", wno J'Oilll\1 o ugu.ah a 1,·ru
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- di ""O .u:w;i~io C' ù metodo utihaato t <.hWJUlo apaunmto l'\:\tR multidimcn\mn,lc
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cw metodi 1 1m('lilic,acqu lJQIK'. tr.ufomata di k>u Tornando ai pro{~ drs.:ru11 ndl.t tigur~ 13 ~ -d, 11 ''Ctlurrd1 magnctmallonr ,'\f I:: un•
molb t .allo I\WPJ)() di lIU!;nt'la 11d al10 .:am iµnu1.1mmtt- a!Lmc.-,uo lungo l'.i= z <' pu ,licio mpc1tt1 al campo magncha> ntcrn,, fl.. St,
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mu:mrù dd KpWC' umo t;roffalmmtc b,u• lunso !Frt, U.S.a, b) A pa,h 11 procow d1 d«.ad1mc-mo, <jUnto •'l:ttort: ruott:ri nd p1.anu ,
pu1t' dn cn1 glupntn NM R ( n r ~~no I ai.sex (I ,g. 13 Sci con 1111.l frrqumza c.arattcrutic-a, I.a lrrqucnu da Larmor,duramc
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,.alo~ di I Piu gra.n<kt r. nuworo: s.1rà L:i eomponcntc \,Jn <i11.1nto M ~• ~r.1.av,1cmato J1
r•u II quo! = AprhClll'ldo ,mpuhi D suu=•' 1 d1 Junta I ao.;cnto:, \I produce una
mpruxlll<' ~ dJ nugnctizzuionc cd t possibile m1suTIU\' e rq;utrarc st"p..trat.imcntc :il com
putcr uiu = di flD Le ,omront1111,,:: non ,on<> m1)ur;al>1h Q~to accumulo d1 Hl> d~
luogo il una ~ond.i Jimrns.ionc nel dmrunio Jd u.•mpo, ,1,n.;un.a Jdle quali può c--snc tr.a
CIIO

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1..,1t p,:ttn bwunc:mtonali \'t'llgoDO, uu.alul.lll ,omc- dugr,unnu dcllt! Ime!! d1 h\'dlo. I , a
ton wJh dugomk rnrr~ono, per nnnp10,agl1 ,po,umcnu .:hm11,1 ,hc )I '>Jr,bbtro ot
1mut1 m Ull npcrammto monoduMrumruk. Le infornu.n<1ni u1mmctnchr. ,1ot qucll<' che
non i.1 tfU\-aDO iullJ diagonale ~no q\ltllt nu1ne (Junu Jau ,~ngono formll J.ùl.a <()rrclJ
,ne <kJI, mttnz on1 di a..~umrnro trJ I nu.:lc1 i.I, JnlJ!lillO pnnup.Jk ç.Qn,utt nel t~n,,
<be- le mtonDlllOlll wno 1ullc raccolte ,n un umro opcr1mcnh1, nsult.ato ,hc d1pcndc tnl<'r4 •
mrnu- dalJ uuhno dcll «.:1tu1ooc ,,,n p1u 11npuh1 t... .:orrd.u1onc J'f'Olt'>nc rrotont dì un - Polo Unita
...-gll4lf ,OO d1 -zamen10
gmc aJb 'J'('tt=opr.a d, corn:unon<' umonudc.irc ( l O~ Y, H,11,u,1111, lr<1r C,•rrd,11,on SpCt rrc, del campo
, mcntl'C' I.i conel.u1on<' pro1om:-c.1rb,1nio dl luot:•• .ul.:i ~pcttro),opu Ji ,orrda11<>nc
ctaunudca.rr di ~ t o ch,m,u.., hctcn1 <..05't o Hl i(;l)R Jl.-u-ro1wcl<J1 01m11,a/
ì <:..,rm.i11on ::;p«frCSCOf'J l
Il grado J1 ntfl.Il&ta:D,W pot,nr.wc,m rJgtt1unto d~• C\J'('rtmenta ,hc uultu.ano SMR,
t unorJnuno. m qwanto quou tC',n1c.a pc-rn\C'tt<" J, uti!IZZ.lre 1pdln a due J1mm~1um e l1J11r• I l.l Rapprncnwmntod>cm.l11.;.a
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:ra Qumd• , lCl1<' apph,.ato un tcrz11 1mpuho a 'IO° CM proJun m.ignt"ll.UVÌonc, cht' può~ • t>craumcnte l'™>topo pcuntt' dd cubomo ,n punu p.art1cola.n ddl.a catena dr .a1om1 da car-
i;crr muunu R..r.pr(CnJo I.J K"ql.lC'TILa Ji 1mpuhi ..on vwon d1n•ru di t "ottengono e.ambi.i•
bon,o, in modo d.1 i11U0.:1arlo ~ pJrt1colm 1drogcm ,ahfauc1 ~• 1r..1u in ,o,t.tnu <11 ,ombm.arc
menu osscn.ibilJ durante I unruL.o a 9(f' rin.alt' li multato è un t pn-1ml!nh> b1Jim.:ru1onalc, ire esperimenta b1dtmcn\1onah separ.tll, nei qu.tla le-diverse intcraz1om ono H 'fl, ' H 1'C e
dle pcrmcttc u nknzmnc dc, 1'01::, noto ,omc ~pcltroS(ùp1..t a dlcllo nu, k •Jr OwrhJu;cr H <>N E mtcrC\l.ill1tc notarc <.he, nel ca o delle qu.anro d1mcm1om. b m.tmpolv1onc det da•
....;or:s, ~~r Owrlun,sn C/J«r ~m,sa,prl Qum~ 01ctod1c"3 pub es~...- ultt!normente
u, generati mcdtantc potenti tecn1d1c computrnnatc, produce come ruult1to una r1\0luZJo
nuglìorau 11.tUdJ:mdo a 6:nomcn1 nel iu,tcma di cuordin1.tc rotanti, p1uno~to che nelle rnurd1• ne m1ghorc, senza 1mplte.trc un comspondcntc-aumento d1 complm,tà
rutr , ~ ~ Tk •"SpCl'IITifflto II b.u.a ,ull.a spcum,..opu .i dictto nudt',m: {)\crh.iu-
Kl' il ~~nz.J J.i ne: ROL\,, Rt,:,iturg Frartt<' ~wlror ()n,rh,n,,,, LJJe.-r Sp«rro$COf'J l 13.4.Z Strumtntaz,onc
l'n pTObkma 518J111ICII~ t cbt, per trarti! v-~ntzwo J.alla H -...;1.)1:.',Y \, \1R. tutti I NOE do•
\ bbao CSKTt" nsob1 :-.:dio uudao ddlc mxromo!ccok-lno~.. h, ,1i> c.l1vcnt.1 '>CmpTI! mc• I componcnu fondamentali d1 uno )trumcnto \;\1R \Ono mostrali ,chm,auc.amcntc nella
n o ~ quanto p u .aumaiu Li nuss.a mokrnl.ur I 'uulazro d1 ~ucnzc d1 1mpuh1 tripli figura 13 8 S1 può m'ol!rn11: ..hc lo schrm.. i;,nt'nlc t "milc-a quello d1 uno strumento ixr
trt Ql'ù~ ~ a m ISSO< YZXl"C con una ~u= Cl>~Y o :-.OL',\' produ.;t" uno E.SR. l!Ccctto che ili po,to d., un os..7lbtore KI~,tron, uulauto ptt i::cncrarc ml(ruondc, ,unu
p=t• dut! gruppi d1 )pirati, un tra,mctu:orc e un mc\ltor~ u~II mpct11,.1mcntc p,.-r I.a gc•
spc:ttro ~ di forma cubi<:.a. s ~ .i.lb SO-.Tappowtone da spt"ttn badlfflcm1ona •
h O«otff sot mcart ~ iu tr11tu di un arwop;l, p1u1tosto ,hc di una scmph1.c proct'duru d, ncruionc e I.i ncatonl! dcli appropriali& rad1ul~Ut'DZA I c;amp1om ltqu1d1 ~ono wmcnuta m
smr.spposmont Pff r.1ggtungtn"ulrr tJIO tne.."5>Jno mwrpor.arendl.a anolcc:ol• ,n ts.:1· tubi u~Uau, che \cngono ruoW1 rap1dammtc ndld gv1!à per dunm3re nrcgolzntà e: 1mp<r•
mc un oudro man.ato , ~ i r coillt' "C o N In quntc oond1~n1 ~ poss1bik ottc• fCZJom, m questo modo, oli r;&d1omC\'ltorc viene nfl,...-o un ..-gn.1lc medio e uniforme pc:r n•
ltl'C r<'gl~Lrato e an;alin.ato Le tcxm.:hc N\tlt uuto '>Obdo ud .tlto c.ampo )()00 quclk p,u re
l1CR' aftn di m!ff.uwn1 tra H do N l'cr Mtl!ncre I Viltlt.q;,p d1 risolunom: del
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r,in lllkrioff I01JO IDOlll.W ,:11 ~ ID p.p.nt t ,ano Ìndla!J I prolOnl <OlmoltJ.11 ra,;co a I l
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ro Tra I gruppi di mnm1 1tudu!J IOIIO comprru chunotnp1ma, l llJ'ltru. ('-lp;ima, rq,uiu.
&mnolwna, adcrulato, acatmm, ~ puuvito chuw1, foifat.ua aluluu, ATP•si e n'bonudc2$1
r,u 15 4 7J Uhcnon ncmpi IOllO I, glarogroo Co$fonwi b dudrofol,10 m!utrnr r I.i 1110
s.ofos!no IIOIIlCflll
 BIOClllMICA I 8101.()(,IA MOIJ ( OlARI no,: fllESl'll'TIIOl,(0PIOU Il Sl'llTltOloU>l'IA SAlfl NCTI A 605
604

Acidi nucleici
(aJ
Le applica11om agh acad1 nude1C1 includono non .-.olo studi i.truuurali da l)!'-1A e R.--:A, ma
L.J
• • • • .,... 1➔ .-,-..,-m.....-➔-T"..,....,.........,.-....-..-r,......,..,.....r-i',:,.C
anche uJternm mdag1m ~ulle mteraziom tra un fannaCt e D:--A e tra quC$t'uh1mo e I( prottt·
8 7 r, ne dt legame Sono Mate anche ottenute le assegnazioni delle ~quenze negli ohgo-.a,cand1;
tu11av1a. ù lavoro \uJ]e ghcoprotemc mtatte non ha portato a ruult.au rÙe\-anll, wpr.111utto nel
caso d1 NMR mult1d1men~10nale, a causa delle: difficolt.a nella decomoluzmne dei da11. Sono
ci state osservate anche le mteraz1oni tra le proteine e I doppi ,trau hp1dJCi nelle membrane;
o o '-
inoltre, la struttura da alcune prott'me di membrana e stata coll~t• alla loro p<m1bil.: funzio-
o o '- ne biologica. Esempi dt queste proteine sono la gr.i.miadina A, la batteriorodop,ma e la ro•
dop5ma, le proteme del capside det fagi e la alamelt<.ma..
11'1
\ Metabolismo del fosfato
"'
.. L'tSOtopo 'P dà luogo a spettn ~\lR ed e ,tato .unpwncnte utihzuto negli studi del meta-

r-
o ~
bohsmo del fosfato. Con que-.t.a tecm.... ,, po,.sono studiare la con,entra.uone relativa e I cam
biamenti di concentrazione da A~1.P, ADP e ATP e, quindi. il loro metabobmo all'mtcrno da
.., cellule e te~utt. Anche le concc:ntraziom intra(ellulari ed extracc:Uulan d1 fosfato moq,:an1co

~- t\l ~
possono essere misurate nelle cellule e nei tessuti poiché lo spoMamen10 chtm1co del fo~fato
inorganico varia con il pH.

~ o~~I
o j t_

Figura 13.10 Gh ,pcnn l'-:MR b1d1mms1onah ~nu ~ raffigurati comc una forc,ta vista dall'alto,
dove tutt, gh ,11lxn (che r•pprncnt.tno, p1cd11 ddlo ,pcttrol ,w,u •t•U ta.glwta ..Jla >IC',>a altaz.a /1. una <U·
ta •hezu, gh ;ilben ptu .alll a\nnno tronchi r1u spc,s'1- l tqwvalcnre '°"o, contorna p,u Luglu che dcerwano
da, r1cdl1 p1u mtm,1 nello "J)dtro munodimC11>1onale .

: I !: ::z l l
(b) (a) l>pcllro NM R condato (CO~YI dcll.t fcm,crm.i che mo,tn. le intCT"J.l.l0m omonudcan I H- 1H I ,mgoh
,pcun luogo ugm ~s..- >llno 1dcnt1O e 1.:ontorm lungo b dJ.lgonale dclu mappa bidimenMonale r.appre~n-

:
;io:, ',&; I
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140
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! lMlo •1.t V1>t:a a volo d'uc,dlo~ d..-1 p1.-h1 l"PLIIL I ,ontorru chc non e.dono sulll diagonale, sunmetna-
mcnrc distnhu,11 c.:ime un 1mma~1ne sp«U.Ure 11>1,)dlo ali• d1agon..Jc, rapprucntilllo k mformazmm ag-
gtunll\'C Comr ~empio dell'anterprctazmnc, ,,,1cmarc un nghello onzzont.ilmentc, nella posoZJunc com•
spundmtc a J l p.p.m. dcllo ,pcttro di dc.tra (tnpleno ), e un altro nghello •ertaoùmente, nella pom1onc d1
4.0 p p.m dello ,l'('ttnl malto (quadrupletto). 1'cl punto di inter>C2Ione dei due nghdh \I e un ,ontomo
chl' rapp=nta l"mter~1one tra I protoni loahIZ,1t1 in gruppi adiaccnu -CHr· e -CH
(b) ~p;:nrod, corrdaz,onc cteronud~arc •'C-'H I contorni nella mappa,b1d1mens1onale rapp=ntan~ m
ternioni tri I magneti nude.in dt l'(: ,on I protoni a\\()<:t.lll Lo ,peltro H giace ,cru<..llmente lungo I as"'
dt dt°'tra e lo ,pt"ltro , e gia..c onzzontalmcnte lu~ la p,ortc superiore. Le po)moru dea contorni sono lo-
calu,.ite come descntto m (a) e 1,alon di p p m e le uitcerua<>n1sono elencate da ~to.

p.pm
IJC IH lntcra.11onc
I◄ 1.3 CH1· (htde-O)
24 2I CHl (/\,cule)
63 4.0 CH. cl.uk-OJ
115 6.8 Anello C. (l:.t1k-OJ
122 7.4 AndloC (-N-HJ
132 /\nelloC (::.S-H1
• 156 Anello C. (Eule-O)
167 e-o
78 !'1.-H

• r al lorofomuo m1duo nel 101'-cntc

ln lnplctto os~rvato a 7.7 p.p.m è J o,uto '
 JIOU IU.110, l PIOl.l.lGIA MOU lAI!. 'J1('1'i Hl wrrniO'lUl (Il PI
60~

lmogmg mcd1.1ntc n\Onama magncuc.1

-•-nu po\wnu ,~\(re ntc,e .tll c1mh1to dmtlO
-
l ( appIIGIZIOnt n•l t 1 he Je\\.nttc in pr,.xcu,
.l • I l
I' na il sangue e iI fl u1Jo ccr,bro,pm,1k p<l'-\000 e· .Cli: ~tudiatt
~,tJnn· lì1mllogKhe come un • . d "'te biop,i.i po,wno c,\Crc ,otton,i
, d1 tc~uto, prc1c\Jll me 1'"' · • r-
d1rt ttamcntc \n, I\C c.imp.on1 , h o..humct, per c~mp10 e J'<l\\lbtle
., I l \ 1 \enoono O'-~r\Jll ,enomcm •
,11 ad an.u1,1 n quc, 1 e.i " - " d . li 1 .1wc.-nto dcli.i tcwoloPia
-. d1 metJbohll in viti ~p«liKt ci 1,,,u "
ml\ur.1r, Ie conuntr,111on1 . h con~lllo I .1pphwz1ont d1 quc-,.tt mc
Je1masnc11 ,uperu1nduttun t J1 altre 1nno•.\1tOm a . .
, I -h dotte ,u 1ntcn .imm.ih d1 p1c,o!J taglia e ~u 11 uomo I
todiche alle md.1gim ,nmaco ogic e con . h
po,,1b1lc dctcmun.tre II meta,,.,.,,mo .__,.. dl'II' ·\TP in md1v1du1 ~m e m.il.iu, noni; l 1 <..tmh1a
menti che" vcrifìono dur.lnle l'.1tttnl.l fi~1'J . d-'I dI
TuttJv13, la pnn,1pak ,pph,.wonc eIm1,.a wrc ~, n.i ~ r.appre~ntau ;u a Iorm •11one e Il
·
unnu~m1 , mr,1g111g1 ',for1un,1tamcnte. -
J CJU\..l delle tran,IZIOnt .1 b.b,a energia nella regione
delle r.1diofrc:qucnlc dello )pcttro tlct1rom.1gnd1e<l. l'N~tR e una tccn1cJ rdattvamcntc: po,o
\CllSIbIIe (. I Ò r.ipprc,cn l,l un '·mite
u •~ 1·.1ttenz1one dei nct"rcaton ,1 concc:ntr.i C'.¼l~1vamcntc
, ull.i 1ern1c.1 che uttl1iu 'li per ottenere m11n.1gm1 da monanl.1 magnetica (!\IRI, \fngm·11,
Rl."$0m lllll' lmagm,d . I nu111, l· dI qu~t.-i ~<•I" .,,no due m pnmo luoso ,I protone e uno dei
"' "'
nuclidi piu ,cn;ibih c. 10 sc,;ondo luogo, è prC<oentc nc:1 \1,mn1 b1olog1C1 1n con\1dcrevolc Jb
bondanz;i TuttJ~IJ nun tutll 1llp1 d1 protom, m turu I cont~U mok.;olan. )I pr~,tano .1 quc-
,to ~me. I protoni che contnbu1~ono p1u dcgh .ahn ill!a mpo~t.a 'l'~tR .ippartengon.o a
composti IO rapido monmcnto. In tal ~n\O, 11 composto d1 gran lunga pm importante~ I ac-
qU.J, ,he conttlne due protom cdl 11 co,111uente pnnc1palc dei s1\lcm1 h1olog1c1 In etrco~tanzc
,peùah . .._, po-..sono nmurue contnbut1 minori d1 protom d1 altre )O,tame. .,
In "IMR, la frcquenu d1 r150nanza dd nudidc che contnbu1-.cc J!lo ,pm magnetico è pro•
pomon.ilc al1'10tens11.ì del ,a.mpo nugncuco esterno applic.110 Se viene .ipphcato un gra- Ìi!IM idollo ..
ltltittung1to ,
diente dd c;unpo magnenco ~terno. ~1 può o~rv.ire un mtcrvallo d1 frequenze di nsonan1..1 }t.

, he mptc,h1a la d1~tnbuL1one ,pm.ile ck1 nuclei. Gh approw prmc1pali. largamente ut 1lm.a-

tt, ,ono tre e n,ultano m (t, mo,tnmonc della pro1e-11onc, (11) lomlmonc d1 immagm1mc-
di.intc trasfom1ata J1 Fouricr e (111) formn1onc d1 1mmag1m ecoplJnan Per un• tr.itu11onc
dcttagh.it.i d1 quc~tc mctod1,he s1 rumH tesu p1u ,pec:1ahsuc1 (p.u. 13 5).
Un vantaggio par11,olare dcUJ ~fRI ~ rapprcscntato dalla flc,\ib1htl nella sult.1 della pro
pncta fis1Ca da tr,ldurrc in tmmagme li numero d1 spm m una par11co!Jre. definita, regione
sp.u1ak rtndc I.i dcns1tl d1 ,pm un parametro m1Surab1lc. Quc,ta determm.monc può c...,~rr
combmata con IJ m1rnrazionc d,i prmetp.ih trmp1 d1 nfas~mcnto ( T e 7 ), per ottenere n
,ultau p1u ,1gmtìc.111,·1 L'im.1~111i: del Ou~,o. sia comple.,1vo ,1.1 hmttato ali.a d1ffus1onc loca
hmua, aumcnt,1 con)1dcrcHllmcntc le op11on1 d1,pon1b1li. Per quanto nguuda l.1 -.can,1011e
dell'intero corpo, ul'1mmagme glob.ile• v1cnt ncmtruit:a d.1 1mmag1m generate 1n )C 10m
uinttguc; perciò <JUò t.1 tecnica JcH· molt1"1mo .11 progrc"1 nella ,apa,11.\ d1 cl.ihorazmne,
oltre che nell.i tccnolog11 della mon.1n1a m.1gnet1ca L.l molummc e 11 ,ontr.isto Jcl1'11111nJ•
gmc w no l.itton 1mportant1 per qu~t,1 tc,m,.a, ,oggctt1 a continuo "1luppo 11 .:l,sto ddl.i
strumcnuz10ne e il tempo d1 .tcqm~monc dei dati ~ono ,dtn dut 1mport.intt par.1mct I che
10flu1srnno ,uno )Yìluppo d, MRI
l'ur d1 )tnhucndo,1 m modo d1YCr:.o nei van tessuti, 1'.1u111.1 co,utm)<.c m mcd1o1 1155llo dd·
la mas!>a , nrporc-.1 totale d1 un ind1\1duo adulto. :-;c11c,H1ll molh, l'JlqUJ rJpprn ent.i 11b0-
~0% dcli.i OIJS'-l tot.ile li d1,crso contenuto d'acqua ddla m.1tcn,1 ~crcl't1alc b1.tnla e gr1g1.1. e
t,iura Il t I ~ ione '<rll,.ale lon~11ud11uk ddJ.a l<'ru ttmuu oClmuta m«!witr lonm.DOMdi ~
d1 nson,m,..i m •sn.:11,a (MIO! lc.:a~nm,tichc rnnarali MlDO idmllfi.:.atr~ nwta:t DOnO>Wllt ak,ux
=
ram .:omc la i;hund<.1 1.a p11u11uu e I 1rot.1WDO WDO arrm,a ,-wt,ùi. Modlfiaui ~ llll.l MRl
J'('l' gentile wn,~,1onc Jcl ll1rar11mmto .h ~J,otopa dello ~lllt: Hill Hosriul. 5lod.pon. (hah1.tt
k dllkrcnze tr.i I tC})llt1 nornuh e la rmi,:s1or r,ute d,llc torme tumorali scncrano un contra
\IO ,uttì,1cntc per produrre 1mmag1m ad alti n1o0hmone La 6pm1 13 11 ~ una !>Yn}1onc
\IRI che mt·ttc IO ev1dcnz.a una M'Z.1011t' \Ull,.ilt' l,,og11uduu!C' Jelb testa e Jd -~~Ilo unu -
no Nel tt-s,uto adiposo, ,1 puo llll)Urare 11 x-pl,tlc H dei lipidi e le d11lcrtnzc Ji spostamento
<h1m1co per I grurl'• -UI sono lah da d ,tmgutrh dall a,qua. Lz f~n 13 I.:?, formata ci.a
><an,1om MIli ,h p.1Z1c1111 so,ur~ e m.tgn, ~m1e1tc un ,onfronto ddl.l distribUZJo~ del
t~,uto ad1pmo In qu~to ~pc11mento ù r.wc-ntr- m1po npprò<.'nta ,1 '-OQlctto d1 controllo
È nwltrc p,N1l't1le J1,tmgum:- le d1Ymc prupnt'I.I d1 rtl.l$$.Ull('nto L:ilequJ ,'llntt'nuta nei
tcs,utt , 1comporta m modo J\ll~anu d1\1.-rsc., djJ) a,q113 pura. In lm~a gencralcc, 11 nbssa-
mrnto tr.h , tr,alt', 7 , non 1-<-guc un um,o pl'OC($.«:> J1 de...1d1mcutoòponcnz1alc,a d1ffcren2.1
dd nlJ~samcnto long1tudtnJk\ T I ru.t"'1mtnu T ptw,ono e,.,crc ~udd1,1s1 m illmc-no ,lue
dt'l.ad1111cn11 c:,poncnuah. d1e h.rnno un \-;ilorc caratten,11,0 di 20- 100 m, Ptt I dc..--11J,mcn11
f. l'intervallo è rnmpr(>O tra 100 e 500 m, QuN1 ,'llon sono sigmfìcau,.imentc mfmo11 n -
 BI II M ,.\( P 01.0GIUI
608 TI0/1 lii SPITTl!OSCOPI Il[ Il SflTTRO'>C()l'IA \1BIIAZIONAU I RISQ);ANZA MAG1''TTl(A
609

\petto a quelli dell'acqua pura; una sp1ega11onc d1 tali d1ffcren1e può e,-.erc la prc\cnZa dt ma•
aomolecolc 1drofihche all'interno del tes~uto. ~el ca~o dei tumori, comunque, 1valon di T,
,ono elevati rispetto a quelli carattenstic1 del tC'S\Uto normale, 11 che aggiunge un ulteriore 1m•
portante fattore d1,crimmante, M:bbene l'mnau.unento sia meno marcato nei tumori umani
rispetto a quelli sviluppai! m laboratono Gh svantaggi d1 questo approc.:10 .ano la ,o, rappo-
s1ZJorn• dei valori e 11 fatto che tempi d1 decadimento T, ekvat1non sono ,pec1fic1 per I tumori,
ma s1 trovano anche m tessuti normali che s1 stanno rigenerando rapidamente. Occorre tenere
conto anche d1 altri parametri NMR e della diagnosi d1fTcrenz1ale dell'o~rvaz1one dell'im-
magine d1 n,onanza magnetica. Quando s1 effettua la d1agnos1, forma, d1mens1one e po,1z10-
ne dell'1rnmagme abnorme devono ~re analizzate dal radiologo.
Oggi esiste un insieme d1 opzioni quasi sconcertante m termini d1 differenti sequenze d1
1mpuls1, protocolli di scansione, spostamenti chimici e m1,ure d1 dal! del tempo d1 nlaMa-
mento. Le procedure sono apphcabtli alla formwone d11mmagm1 tnd1mcns1onali e po,sono
=ere ottenute da porzioni contigue dell'intero corpo o dall'anatist d1 organi specifici (come
testa, torace, addome, fegato, pancreas e rene) e della muscolatura scheletnca. L'uso d1 agenti
di contrasto ha permesso d1 studiare le "funzioni degli organi': come la fun21one renale, se
l'agente viene eliminato con l'unna. Se questo agente st presta alla somrn1m,trazione per ,1a
endovenosa, si può esaminare 11 flusso sanguigno, la perfusione dei tessuti e il trasporto altra•
verso la barriera ematoencefal1ca, con la poss1bilita di ev1den21are dtfett1 dell'anatomia vasco-
lare Gh agenti d1 contrasto utilizzabili m MRJ dovranno avere propnet.1 paramagnetiche Ov-
viamente, come m altri metodi invasivi, essa devono essere non tossici
(a) NMR e MRJ offrono al b1och1m1co anal1uco e ai climc1 una varietà impressionante di pro-
cedure. Entrambi i tipi di apphcaziom continuano a sfidare quasi tutti gh approcci alternat1v1.
Chiaramente a ogm tecmca sono associali dei pencoli; tuttavia, questi metodi basali sulla ri-
sonanza magnetica sembrano, sulla base deUe conoscenze anual1, relauvamente sicuri, soprat-
tutto grazie all'assenza d1radiaz1oru 1omzzann.

13.5 Suggerimenti per ulteriori letture

Ev,\J,.s, J.N.S B,omol«ular NMR Spectroscopy. Oxford limvm1ry PrCM, Oxford 1995.
Cont.Jcne diversi eccellenti caplloh sull'apphcaz1one della tecnica NMR allo studio dcgh enz1m1
R.uo, D.G. Protem NMR Terhmquo. Humana Pro., Tota\\'a, NJ 1997.
Contiene alcum ottimi esempi dcli applicaZJone della tccmca NMR mono- e mul1Jd1menS1onale al-
lo studio delle proteine.

tr,15,·e~ (pomoni contigue) .attraverso le regioni addominali d,

Figura t3.12 Scansaom MRI di senoru (b) 1 dcpomi adiposi sono mdi~-all dalle reg1on1 bianche m
un soggetto <ovrdppéSO (a e di uno mag:m dei groppi metilcmc1 degh mdi gr.a,st a lung.a catena (Per
teni('; laconcc1S1one
i;ent1le monana vien~ prododtlta ddai~r~ bohsm Group,Jl:uflicld Dcp.i.rtment ofQm,cal Medicine, Um-
dcli Oxfor 1p1 , e .a
verntv of Oxford.).
CAPITOLO 14

Tecniche radioisotopiche

14.1 Origine della radioattività

14. I. I Struttura dell'atomo

L'atomo è costituito da un nucleo con canea elettrica positi\'a c1r~ond..to da una nu\'ola di
elettrom canch1 negativamente. La ma-.sa delf atomo è concentrata nel suo nucleo. anche se
questo rappresenta solo una piccola frazione del volume comples"vo dell'atomo stcsw. I nu-
clei atomici sono formati da due particelle pnnc1pah, 1 p , toru e inc, '.: on~.
I protoni sono particelle canche positivamente, a\enn una m~ d1 circa 1850 volte ,upc-
nore rispetto a quella di un elettrone. Il numero di elettroni d1 un atomo deve c,;sere uguale al
numero di protoni presenti nel nucleo, poiché I atomo nel suo complesso è elettncamente
neutro. Questo numero viene defuulo numu,1 .. :, ,m11., (2).1 neutroni sono partJCelle pn\e di
c.1r1Ca con una massa approssimata\'amcnte uguale a qucll.1 d1 un protone La somma dei pro-
tome dei neutroni viene definita numero d1 m,1'.."1 (A). Quindr

A=Z+N

do\e N rappresenta 11 numero di neutroni.

Il rapporto tra neutroni e: protoni determina la stab1ht.ì d1 un particolare elemento (par.
14.1 2).11 numero d1 neutroni presenti rn un nudeo non è in rd.u1onc con il numero atomi-
co, quindi e<i\O non ha mfluenz.i ~ulle propnetà chirnichc dell'atomo. Gli atomi dt un deter-
minato elemento non contengono nece.sanamente lo stc"'° numero di neutroni. Atomi c.h un
dato elemento con numero di ma~a d1verw (cioè con diver,o numero d1 neutroni) ,ano
ch1amat1 L,M,l(''· Ciascuna specie nucleare viene rappresentata dal simbolo dell'elemento
preceduto da un numero 10 basso che indica il numero .1tomico e d.i uno in alto che rappre-
senta il numero d i ~-Per ~empio

'!C .,O o
Per maggiore praticità, si prefcri,ce scri\'cre solo 11 numero di massa (per c,empio 14C). Il
numero di isotopi di un detcnmnato elemento può vanare: e,i~tono tre i-.01opi dell'idroge-
no, 1H, iH e 'H, sette del carbonio, da Ca •e inclu,;i, e venti o piu d1 alcuni clementi a clc\'a-
to numero atomico.
 IIU< lii.MICA[ 11101..0<..lANOU<DJAl!l nC~ICllf 11.ADIOISQlUPKIIE
612 61.3

14 I : ,uibi/11.i atomic.J e nuiia=ione D«adunento per emissione d1 positroni

In ~cnk. il rapporto tra naitroni <' prot1,n1 nel nudco detcrmm.1 :.e un 1wtopo di un d.!
ID demmto è abh.tsta!\l.l s1;,.b1le d.i i51Slett m n,uuro1. Gh 1so1or.1 ~~.hili. per gh dcm1.-nlJ a b.u-
.w.numao a11.lmlaJ,.trnJwlo ad a,-ne un u~I numtm J, n,·utmni e protom, mentre l.1 ,ta•
bùui dcglielcmn,tt ad ;alro numero atomm> e a~'><xi.1t.1.1 un r.ippono neutr.mt/protom m.ig-
'IQ"-' d, uno. Ch isotopi ,ru.1ahll1, o rawoootop1, ~no <~so prodotti artìficì.ilmente Jn1.hc-
K" f'!Kllu iQno ~ I l .m..hc m n.itura..1 r.1d101,otop1 emettono p.i.rttlclle e/o rnd1az1one elet-
tromag.ncti..~ m ~ t o a Yllr1.u1om ddl.l.)truuur.i del loro nuJ.-o atomico. Que~to fenome-
llQ, ~ (lrmdr 11 nornr dJ dcadimcnto rad10:1111,o, conduce dtrt:ttamcnte, o attrave~o f,1>1
t p ~ di disintegr<111ont, ali.a proJuzion<' di un isotopo )t.ibile.
14.1.J Trpi lii tha,,Jimmto raJioartM>
\kum 1!,0top1 de.:adono emettendo p.1rt1ce-lle J} cariche posmv;imc-nte, ch1.1matc posnmm
(~ ). (.JO av\.1cne Q\l.lndo un protone s1 tr~rma m un nrotmne:
proton<'-+ ncutronr t pmuronc
I ~troru ~no ~trem.uncnte mst.ib1h r.- h,mno un'o1stenu tram1ton.1: una volta d1~1p.1-
u L1 lom roerg1.1, mkr.igis.:ono con gli elettroni e- \engono anni,hihu I.a ma~'>,) e l'energia
Jdlr.- due parucdlc 51 trasformano in due raggi yemem a 180° l'uno rispetto all'altro. tenome-
no noto come err I ione baci u ba À.
Come multato dcli cm1sswne d1 un ~1trone, il nucleo perde un protone e guadagn.1 un
neutrone e 11 rapporto "J/7 aumenta IO quanto Z dam10ui~e di una umt.l e A nmane cost.an-
l<'. Un esempio dì i~topo che decade con em~1one dJ poO>itroni t il z:Na:

uistono numerou up, dì dcadimento rad1~tti,o, qui verranno con~iderau solo I piu
1mp>nanu ptt la m:c:tell b1och1m1..:i; la t.ibdl.a 14.1 riporta una smtro delle- loro propnetJ.
O«.adi.mcnto J)ff nniaonc di oepllOni
In qunio aw un nnitrorw t trasformato m un protone med1.1nte l'emhs1one dal nucleo d1
un, ~ni«lb 1-xta (j!) canu ncpt1V2mtn~. chwnata n~•ronc- 1tl ).
m"Ulront' - ~ + Dq!aln>ne
Un nrptroor ~ a tutu gli dfe1t1 un ckttrone, m;a si prc-feruce usare il termine oc-gatroru:,
~ Jl()II Kfflprt', J)ff sottoliMare I ongmc nucleare della partiulla. Come risultato del
fffl11SUOnc: di un ncptrone. d nudco pndc un neutrone e guadagna un protone O rapporto
~ ~ qumdl, d«tt;SCC ~ Z awnfflta dì I e A nmane C'OSUntc.. t,; n i~topo utilizzato fre-
qunltmlrntr odla ni:rra biologia. che decade cnvttendo negatroni,~ 'C.
~-~♦,
J ; ~ di ntptroru e molto ~.ante ao biodum1C1, in quanto molu dei rad1onu ·
.cbdt c,imt1D(JDalk u1ilizutt dcadono C0IJ qua&o m«anwDQ PCT esempio H e 'C poçM)•
no axre anpacpu per ~ ~ c o m ~ orpmço• "'Sviene usato per marcare ~
~ J J l illldi 1wII.umu::M ~ c . ~ WK> JùWDfflto molto \-alido in biologia .mule·
cobre e vknc l.1IlJ'KPO per marcare gli aad1 nudc,a.
f;Na ➔ ~e ➔ f3
J>cr deterrrunare l'em1~1onc di positroni s1 utihzuno gli )t~i s1rumc-n1i impiegati per n-
vcla.re le radiazioni y. I pos1trom vengono uhliu..11i IO ampo b1olog1<.o con buoni muJtatr
nella (omografia pu.an1s~ìonc.d1po~1trom ".Pos1tro11 E.t1usno11 Tomogr<Jplry·, o PET scannmg).
che permene d1 identificare aree atuve e m.1ttrve del cervello.
Decadimento mediante emissione di particelle alfa
Gli isotopi di dementi ad alto numero atomico spes.w decadono emcnendo parti,cllc alfa
,J_a). Una particella a è un nucleo di elio. cifJt consiste da due protome due neutro?• t_◄He7 ).
l'em151,rone di partiu:lle a caLISòl un considem.ole alleggerimento del nucleo, una d1mmuz10-
M del numero-atomico di due umt~ e una dmunuz1one del numero d1 ma.».1 dr qua1t10 umtà.
Gli isotopi che d«adono emettCDdo particelle a non vengono usali frequentemente nell.a n•
cere. bJ.O!ogica 1J radio• 226 ( Ra) de.:ade. emettendo panictUe a, a rado_n -222 ( Rn), che a
,ua volw è rad,oamvo, dando cosi m1Lio a una comple<,1,1 ~ene d, du.id1men11 che culmina
nella form:uione di Pb
~➔ 'He1" -t";Rn ➔➔ --+~Pb
Gh ,.otopi che emettono p;irtJCellt' a ~no e>trtllWJlente tm,i,1 'i<' mgeritJ, a ca~ della
grande m.u.sa e del potere- 1oruzunte dcli.a pm.icdl.utomu:a.

D«adimento per cattura elettrorua

Tabdla 14 I Proprieù dd clnttii tqn di radw:ionc r d I d et.Jd 1mnto un prot.unc auur;;i un dettroncdallo ,trait> i-: p,u mtcrno.
I n qUC'lota ,orma
....., _ Pnlpricù
,\Jb
P.rtxdlr aodtt paantl; plà laalQ di alur lonnr cb rwuiOJK";
protone t elcttron('-, neutrone- t rar,81 X
DOapmr:tnnk
lwu .-.-...nn vi.mc m i ~ nidmuone dtttromagncllu ( raw X). Per
Plr'lmkancbrlcgrn,;"-aù~all,nchmosr~ Il protone d,~enta un n.. u,w
per u la pmctr&ZIOlk' •-aru la ,orgmtc C'\t'TJlp10·
MadmYJIII' annar:=_.'f;tl.~1.io:a11r
po eh -
I ➔ '1e + raggi-X
 lllOOflMICA f IIIOL<lGU MOl.f.COLAU TF~ICJIE RAl>IOl~OTOFll llf
61~ 615

Ot'._.aJ1mmto mcd1ant<' emh)ione di raggi gamma 100

Al ,ontnmo Jcll'<'mwionc d, r,uti,<'ll<' a e ji, l'cm1umnc y coin\'olgc un.i radiu.ionc e_lct-
tromagncu..-:a )tmilc 111 r.iggi.\, m.a ,on un.1 lunghcu.i d'onda p1u wrt.1. Qu<'~t, raggi yderi\'J •
no~ una trasforma11onc Jcl nudco JcU'.itomo, al contrano dei raggi X che wno cmcu, 111
~uuo alJ'c,,,t.uJone d, clcttrom. e spn50 .1...::omp.1gnano l'cm~1onc d, p.utic.cllc a e p,
~rcscmp10·
I ➔ k t tJ +y
I '=onc: di raJi..uione y non comporta a.mb1.amenti né di numero .atomJCo né d, m,h·
'-1.La rad=ne y h.a un b.uso potere 1on11Zante ma è molto penetrante. Per esempio, l,1 r.1•
di.wone y OJl<'>S,1 Ja '"Co nCS4:e a pcncturc 15 cm d1 aml.lo. ~ pericolosità della radiazione y 25"-
e '1mik a quella dct raggi X. ~r C$Cfflp10:
--;- - 2 3
Numero di emM te
'\. l-1.1.4 Enrrgiatklthcadimentonulioottivo
J 1gUJ'a 14.1 lùpprntntaaone gr.ific, ddb tUlur.a t'>puncnnllc dd dcuJimcnto r.adm.tllrvo
l '1,1J.Ul,iàJ.m&MUa Uiil&.I per apnmett i livelli energetici llSOCiati al dccadimcnto rad10.1111-
\'0 ~ l'qcttrom-ull (un clenton\!Olt,~V.è l'cn«Jla acquJ5ita da un elettrone quando viene acce
laillo ,mraVttM> una ddl"amu di potenziai, di 1 V cd è cquivakntc a 1.6 , IO'' J). Per la
in termini di tt:mpo d1 d1mt.>11.imento (t. J, definito come ,I tempo ncc;e~sano pcrchè l'att1v11à
ma~r partc Jqh n,otop,, I'cnct:1ia di emissione è ddl'ordine di un m,honc J1 clctt rom oh o
decada da un valore qualsia~, al 50% d1 questo (F1g. I◄. I). Se nell'cquaaone 14 2 N, è uguale a
mcp dcun.,nw,h (MeV). Gh 1SOtopi che emettono pamcclle a sono normalmente quelli do
metà di N., allora t s.irà uguale al tempo d, dime,umento dcli' isotopo. Pcmò
&mdi rnagg,orc energia (-4.0-8.0 MeV), rnffltrc quelli che emettono particelle p e yposs,edo-
no gmcralmcnte energie di decadimento inferion a .3.0 MeV.
In À.l,n (1 ◄ .3)
2
14.1.S Vdocit4l di d~cllilimmto nulioottwo ( I◄ 4 )
oppure 2.30.31og()/2) - Àl,
Il dcc-.adimcnto r.ld1oitt1vo ~ un processo spontaneo che aVVJcne a una velocità ben definii.i
e anttcrl5tJa per 1."lUCUN sorsmte. Quata vdodtà segue lmlptt una legge esponenziale;
oppure r, =0.()93/À (14 5)

pertanto, al numero d, atoffll che dcadc è. in quawuì momento, proporzionale al numero d1

0 ( valori di,, variano molt1~~1mo, dai IO" anni per 11 p,ombo-204 t''''Pb) ai h.10 ' i.e,ond1
a&om.J U-1 dcll 1M>topo J!'C'lmh in qud momcnio (t). ln fonJll matematica, la curva csponcn
~r il polonio-212 ( ' Po). La tabella 14.2 riporta 1 tempi d, d,mcZZJmeato d1_alcuni 1sotop1 dr
2:ìalt- (Fìg. 14.1) comspondc all'cquanonc
comune impiego ncUa ricerca b1olog1ca. S, noti la mancJnz.a d, due elcm~nt, 1mpo_rtan11, o~~•-
d.-.: gcno e uoto. La ~picg.iZJone è che 11cmp1 d1 d1mczumcnto dcgh J$010p1 r;tdio.1tllv1 d1 qut"<,ll
•N due clemcnll sono troppo brcvi per la maggior pane d~gl_, studi biologi~•(' O ha un t 1 d1 2 0.3
ds
minuti e "N di 10.00 mmuu). l vantJgg1 e gh S\Jnt,,gg1 d1 lavorare ..:on 1sotop1 .l\Cnll d1fft'rcn-
d.'4: ti temp, di dimezzamento sono riport.1ti nella tabella 14 ..3.
oppure
dt ( 14 I )

Tabella 14.2 1è:mpi di emivita di alcuni iwtopi utilmat, ncgh 5tud1 biologiL1
do\-C À. è la (; .antc- d, dcudnnmto, canttcrlltJC.i per OMCun rad101sotopo e delinit.1 come I.i
- - - -Isotopo Emiv11J1
~ n e d1 LSOIOpo che dcadr pn wut1 d1 tanpo (t ). Integrando l'equazione 14. I, ~i otticn<'
un cq=onc m forma log;antnuca:
leotopo
--- ---
c i.; 12. t0ol'C'
'H 12 2tianm
H(' 57601nm
•ea l65g10m1
"le 45 giorni
(1 4 21 !'.a 2 58~nm
I I 60gk>rm
• p 14.20 giorni
I
dO\"l' N ~ t1 numero eh atom, radJoi1t1\1 prt1att1 al kmpo, e N. .1 d" J t •p 25 tpom1
I 8.05g1om1
• e u numero , atomi ro ,oa • I I q 7 0ll."
u~ 1 prt'St'Jlll al tempo zero In pratia è pau convcmmte ru..nme la d d d '1'i 87 20giorm _
-,- re costant<' , C(."3 1mffl10
 0)6 1110< !UMICA I ~ltl~IA MOUCOU.,u TI(SIOU RAl>l01$1l!OPICIII
617

Tabella 14 '\ hutop1 ,on mtJ\ ila br~e; \'llnlagg• e ~vanla&b:.__ J4.1 7 Intaa;:1011e della mdioatt1V1ta con la m11ta,a
\,1nt.tgp - -s~antagg1
-,,so1opo d;:;dc dur.ant<' IJ Jur.. t.i Jdl'c:s~rm1mto P11rt1celle o
Lalt,Ultt\llhpc-.m,.1fpar 14 ).•O rende
I apaUIKnto prn ~wbtlc dtlCTmmandu d1lllwh.t da progn1Jr1onc
Quc,k p.11 IKc:lle po~\1cdono un.a wn\lJCrl'.\olc cncrgt.t (d.1 3 a 8 Mc\'), tutte le partm:llc
1 piu ..-mph,c cd n:onomico da umltll't <..o,to dtl nutcn3lc per ultcnon a~nmcnll provc:nt('nll d.i un Jch:rmm.110 botopo hJnno l,1 ,tc,'-1 energia fuse mtcrag1scono -.on l.1 m.1•
f f ~ k l'utùuzo di dOSJ p1u b~ Biwgn1 ~J'C"O c.akolarc l.t <JU.tnllt.l da alll\111 r~Jw tcn.1 m due moJ1, In pruno luogo, pos.'.>0110 ,aus.ire «rnwonc· m qu~to proCO'>O l'cnerg1a
(per tvmpt0 nn 1o1 ciugnmt,.;1 sugli uomm1 I viene lf.i~ft'nta dalla parucdl.t « aglt cltttroni degli atomi vi.:m1, fJccndolt p,w,are a orbitali
,uperiori. 1..1 parti.ella CJ wnunu.i 11 ,uo cammino ,on un'energia ndott,1 d1 un.1 quota leggc:r•
mente ~uper1ore a qudl.i 1rasfcnta .ill'clcftrone L'elettrone r,ut.1to alla fine ricade nel \UO \la•
ESll.llCPIO I to d1 p.1rtcn1a, cmc:llcndo cncrgi.11,1.1110 forma d1 l<ttl•ni d1 lunghcu.J d onda nel vis1b1le o VKI·
L'effetto del tempo d i emivita no al, mh1le. In ~ewndo luogo, le p,ut1,cllctt p<w,ono caus.irc la 1nniu..u1onc dcgh .itom1 c.he
mcontr,mo sul loro c.immmo Qu.1ndo ciò a\'\ 11:nc, l'dettrone dcll'orb1t~e hcr,agho v1cnl· ri•
OO)BNOA
mo,M> eomplet.amentc, L'atomo d1,cnta 1oniu..1to e torma una ,oppi.a t0nic.a, co,111u1ta da
~ d , , che In(.\'/ .V l = ÀI e ,hdl tempo d1 d1meu.amen10 di P t di 14.2 giorni, uno ione e.i.neo po,1t1\'amcntc e da un elettrone. A cau~ della loro d1mcn\1onc. dcUJ b.1-.~ ve•
qwanto tempo on:orr<' pcrcht una solUZ10M contenente -42 000 d.p.m. d1 '"P decada locuà e dell.1 doppi.i c,uica po~1ma, le.- parllu:lk o col11dono ~~\O con gh atonu po\ti \UI loro
fino a 500 J p.m?
cammino. Pcrt.into e\~ provo.;ano mtcn\.t 1onuu11om: cd cc<1tai1one e la loro energia viene
RJ l'(. TA d1ss1p.1ta rapidamente Cosi, nono,tantc la loro ,om,dcrC\ole cncrg1.1 11m:1.1lc, le p.trtH.dlc n
~• utùixu I eqUUJone 14.5 per cakolatt il valore di À. e s1otucne un valore di 0.0488 non ~no molto penctranu
g1om1 :>1 uuhzz.a poi l'equu.ione 14.2 pa c:akolare ti tempo necessario per la
dimmuz10n(' dd oontcgg1. In quesu equat10ne N. = -42 000 e N, = 500. Negatroni
:» omcne C0$1 un ,-alore pn , d1 90.8 giorni. In confronto alle par11celle o., 1negatroni \Ono molto ptccoh e molto mobili, dotati J 1 una
~ingoia cane.a negativa Es\1 mtcr•gu.:ono con I.a matcn.1 provocando 1on1zza.z1one cd ec:c:1t.1•
.t1one esattamente come le p.irt1cclle a, I u11av1a, a uu~ dcU.1 loro velocita e delle loro d1men-
\lom, hanno minore probabtl1t.i delle p.uucelle a d1 interagire con la matena e pcrdò '>Ono
14 /,6 Unrtd dì misura della radioattività
meno mninan11 e piu penetranti un·.i11r,1 d1tlcrcn,a tra particelle a e ncga1ron1 è che, mentre
~ndo il ~1....1emJ ln1cm.u1onalc delle umu d1misu ra <il J l'unirà di radioatllviù è il be,
1
per un J.ito •~otopo tutte le parucdlc o h.1nno IJ \t~ energia, 1neg.itroni h.mno un'energia
qund lBql; I Bq corrnponde a una dmnt~rai1oor. per -x·,ondo {I d,p s.). li cune (C1) t van.ibile compresa entro un detcrnunato mteo.illo, m~ 1miio1sotop1 che emettono ncg.ttro-
un'urut.1 d1 misura p1u ,~ch1a non presente nd 11s1ema SI ma anwrJ utiha .ata. E~ e defini- m pmsu:dono uno spettro cncrg<'ll(o carattcrn11co (T 1g 14 Sb J li ma»1mo li elio cncrgct1~0
ta com(' la quantità J1 materwc rad1oa111vo con uo numero Ji dmntc.-gr.a11om nucleari per~- (I.,,...) "ma dJ un Ì'>Otopo all'altro. p,m.ando da O 018 MeV p(r ' Ha 4 8 I ~te\ pc:r a. u d1f•
condo pan a quello d1 I _g d1 ,:adio. ooè 3.7 lO" {Q 17 GBq; Tub. 14 IO). In umpo biologi'oo. I.erenze nei• vaIon· dI G..,
r.· •~o la cap.10Y d1 r·
de,,ermin..,, ""netr.a11one della rad1aLJOlle. I•• particd-
~do questa umti troppo grande, l i usano 11 microcurie (µC1) e il m1llicune {mCi) F im- le~ eme~ da 11 po\-.ono per,orrcre wlo j>\),h1 mtllunctr1 ndl'.tri.1, mentrc quelle emei,)C da
porumte rteordare che LI cune u rifens.:e al numero d1dmntrgra,1om che aV\mgono dfcth· P pO\\Ono ptnetrarIa .anehe.,. n,or Wl metro· L.a raa,onc
.,. per l.t qu~e I negatroni d1 un dato ISO•
,-ameni(' m un aimp1onc (cioè d p.,.) e non alle d1sinttgraz.1om misurate: d,1 un contatore d1 topo M>no eme\~t a energia \,r1.•b11- , fu \rw<>ata
, • .,. da Wolfgang P.auh nel I 9' I, quJnJo
• postulo
radJoattn1tà, dette conteggi o ,onte (cioè" p.s.), che m genere rappresentano solo un.i p.1rle h
ceogni<>ventora10a1 ,-A•i-ne,on
d Il \o •••• un energia cqul\alente a~._.. ma che I energia
I viene
ddle dismtegF.Wom che hanno lu~o cffcttwamcnte. ·
np.arttta tr.1 un negJtronr e un n,-ulrmo La propomonc.d1 energia totale 3U<Xtata a neg.itro-
~htnncnte, negh esperimenu con r~101wtop1s1 aggiunge un isotopo ~t.ahile dell'dcmt'n· ne e .il nrutrmo v,ma --dunenro· t ncutnm wno praH d1 carn::a, hanno ma~
· per c1a\<'.un J e,.
lO dl\'enu pac1ò nece.su10 ~rune re 11 qwmtJt.i J1 rad101sotopo prCS<'nte per unita d1 ma\• trascurabile e non mkr.igiscono ,on I.a materia
a Quou ~ I •tu,11;1 ~ u . che può O)('re espressa m dl\en:1 modi, tra I quali ,·docitJ dt
dcaduncnto d.p__., od p.m.), ,-cloaLÌ d1 conteggio (e p..\ o e p m J o cune (rnC, oµ< i) p<r Raggi ye raggi X
unila d1 IIlUSòl ddiol nu~d.a (normalmente espressa m moh o gnmm1) Un metodo altern.1u n (·' 1n "'" ch1a111a11 C(1mPl•-
"'uest1 rJgg1 ua qui ,, h
=
-•i,-amcntl" ra••r1 ypcr M:mpltata) sono radia
~carie.a nf m.issa RilI.tm('ntecoU,dono lon ato-
\'O per apnm<'tt I atllnLI 6pcofica, pcrallro non uuhuato frequentemente, è I ' ~ d1 per rvrcib non anno n.-
11oni e1i:llromagnellche, 1·· d ,, pa- tutta l.1 loro energia (~1no. c.1oè, al
"11tu.ii<' .a m u, ddimto come ti numc:r.o dJ atomi rad1oa111v1 per I oo atomi Jc:I composto. d d \tanze rruna , i1.,.,, "
m,, rl·1111 e perwrrnno gran 1 1 na m ,ari 111001 1 tre pm 1mport11111 dei
Ndb uhclla 14 I O v1a1e fomna un;a lisu delle defm1ziom e ddle umtd di misura di unp1tgo .,iscono , on 1a ma11: •
p1u comune m rad1ob1olog1.1. tamcntr pwetr;mu) Lss1 mtcr.i.,. _._ che: 8 loro mila cau~no ero112.1011c: e 10-
•
quah provocano I cm1)~tone I e d lettrom scconu.an,
 ilOOIIMI< A f ll!Olt)(,IA 1'1011 WI.ARJ Tt,0(10 1 AADIOl~m,:'"c,11[ 619
618

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fìguru I ◄ 2 R,ikv.u,onc~t.1 ~ulla 1on1=ionc

l'olenz..i. applicato

Figura I◄ 3 H f~to del ,oluggl(l ,u) llusw d11mpubl.

n1ZZ.u1one. Nell'.issorb1mt'nto fotodeunco, raggi y a b~sa energia mterag1scono con gh elet-
troni a cui trasferiscono tuttJ la loro energia. Come rìwltato, un elenrone viene emesso come
fotode1tronc, che ~• comport.:a poi come un negatrone. AJ contrario, nell'cfll Ilo Compton,
c.:aus;ato da raggi y d1 med1.1 energia, solo una parte dell'energia~ trufenta all'elettrone bersa ,
~lio, che \ iene emesso Il raggio y viene dcVlato e continua a muoversi con energia ridotta D1
nuo\O l'elettrone emes~ s1 comporta come un negatrone. La proJulione d1 curp1c avviene
quando un rJggio yad ahJ energia mterag,i~ con 11nucleo da un atomo e tutta la sua energia
\ ~ne conver11ta 10 un po\1trone e m un negatrone
Qu,mdo m,11enal1 contenenti atomi ~nu assorbono particelle I} ad alta energia, emet-
tono una rad1.u11me ~econdana, un raggio X ch1am.1to Brcmsstmhl11ng Per questo motl\'Ogh
~herm1 protett1v1 per' P usano ruatenah .1 ba'>SO numero atomico come Perspex.
14.2 Ril~amento e m isurazione della radioattivi tà
1:.sl)tono tre metodi comunemente uuhnati per rivelare e quant 1ficarc la rad1oat11v1tà Es-
!>1 wno b~u. n,~nivamente, ,ulla 1omzz.u1onc dei gu. sull'ecc1taz1one d1 sohdì o di solu-
z1om e \Ulla c.iparnà d1 un composto radioatt1\0 dj 1mpress1onare un'emuh,one fotografic.1
(auto• radiografia).
I 4 2.1 11,fctod, basati sulla io11izzazio11e d, un gas
Effetto del voltaggio sulla ionizzazione
QuanJo una rarttall.1 cane.i pasw attravel)() un g~. 11 ~uo c.amro elcttro~tauco nmuovr
elettroni dagltatom1 che incontra nel ~uo cammino e provoca la loro iomn.mone (Fig. 14 2)
La ,ap3ut1i d1 mdurrc: 1oniu.a11onc dC'Hl"SCl" nel modo seguente:
a p Y (10000 100 . 1)
Di c::on5<'1:UmLI, le part1<.el1C' al' Ppouono ~re r1velJte con metodi dt mnu.z.u1one d1 un
J;,J~. mentre pc-r le raJ1az1om y1.1ò non e poss1b1lc. Se la mnia.aimne .wviml" tra una coppia di
elettrodi ali interno d1 una vamrra aJatta, \1 a, ra un p.i-gg•o dt 1.orrcnte, la cui mten\11.1 di-
pende dal pott:1121Jle apphl3IO e d.u numero d1 p.irt1Cellc che entrano ndla camera. La figura
I 4 3 tllu\lr.i le vane 'rcg1oru del potenmlr, che \.lranno descntte d1 ,;egu1to
In ogni rei1onr della cun"J nella ".uncra Ji 1on1ZUt1onc c1~1.una paruc.ella radioattiv.1
produce una ~ola coppi.i 1orua per ogm 1..011.monc, qwnd1 le corrcnll ~no~ e ~no no.:c~
r..in stromrnt1 molto \Cn\lb1h per poterle ffil\Unre Qu~to metodo e pc,co u~to nelle analm
quanut.111ve, ma d1\ers1 11p1 d1 ekuro-..:op1, che opt-nno m ba'-C a questo pnne1p10. ~ono uuh
nella d1mo~tranonc dellr propneu della rad1oattl\ 11.\ A un \Oltat:&10 p1u clev.ito d1 quello
delle scmphc1 camere d1 1omua11onc, gli elettroni proJ0111 dalla 1omZZUJone '.>J muo\'ono
, rrso l'anodo molto piu rap1damentc, pro, oc.Uldo \3 1omu.1Z1onc sccond.uia del g.1Jo ncll.1 w -
mera, qumd1 la produ11one d1 elettroni ..ewndan che: determm.1no ultenon 1on11.z.a.riom e
così via Perciò, m \cgtJIIO a un \angolo evento mw.tle una CrJ\C.tla <li elettroni raggiunge
l'anodo. Quc~to t 11 principio dcll'ampltfiuiionc ne1 g3\ noto comedtcno lo" n~nd, dal no
me d<'I ~uo s.:opntore. In (.onscguenu d.t tale: amphfiuz1onc, la corrente reg1\tr.1u l.lrà molto
p1u de\at.l. Come ~1 può o~nare nella figura 14 3. nell.1 reg1onr del contc~10 prop,orz1on 1 -
lc:, il nomc:ro d1 coppie 1omch.: m1\urate è dirett.1mente proporzion.ile al \Olt.1gg10 .1pphc.:ato
fino a un certo "alore, raggiunto 11 quale s1 ha un p!Jtcau Prima che quc!>tO \c:nga raggiunto v1
è I.i co\1ddett,1 regione:~ propol"Zlonahtà lumt.iu, che c=do '>C3r..tmentc: u~ta nella m d.1-
11one e ndl,1 nmura della radioatll\'llà non ~l. qui d1)(u,\.1
U principale ullonvcmcnle dei conl.iton co\tru111 per op.:rare nella re&1one proporz.1onalc
è che: richiedono un voh.igg1o mollo ,1ab1le, m qu.into an,he ,,1cc:ole flu1tua21om d1 I.ili'.' p,1r,1-
mttr.> pro\'01.,rno \Jrla/lOnt \1gmlicat1,c d1 amphlìcaz1onc. I contatori propon10n.1h ,ono
pilrtu.o);umente uuh per mdarc e mmirare ~• emctuton d1 par11cclle u, ma rdauvamentc
podu l\Otop, di quC>to 1ipo wno u11h1a11mh1olog11
Ndla rcg,ione- di (,eigl'r Mullcr tulle k parucellc r.1d1oat1t\<•, mc.lu~c le dc:huh p.irt1cclle (!,
cau~no la 1.ompleta mmn..tnonr dd ga\ nella camera, pertanto la 1.orrcnte prodoll.1 non di-
pende piu e.lai numero degli 1Om prm1an prodotll Po1c.lic m quc~la regione s1 reaha.a I amph
 BIOU Il "1(;,U BIOUX.IA MOI I< O1.ARJ 1H ~ICIII P.Al). >150T0PIOII
620 621

ficai:i.ane m,1i;1,11na, l' inten,1t,1 del segnale 1n u.,.;ita d.ù rivelatore rimarrl la ~tei,sa per un am- <a)
_p10 mterv.illo.d1 valori d1 voltaggio (.ilcmuidetto pl.lli:.iu di~-:hl.u.11:r). Con quc...t.o.M.\lc
ma Sl n11\ura ti numero d1 eventi rad10a1uv1 e non la loro energia, per cui non è pos~1b1k d1- i n BnGilolau
scnmmare tra J.Wtop1 differenti uuliu..mdo q~to tipo di <.onutore
Po1che le coppie 1omche impiegano un tempo determinato per raggiungere gh ele11rod1
altre particelle 1omaan11, che entrino nel tubo durante questo periodo, non provocheranno Supe,flCla
ioru.z.uaone e.non. vcrcanno per~nto md.ate, riducendo qumd1 l'effk1enza del conteggio. ca!oda
mMalliZZ.ata
Tale periodo, durante il quale s1 ha una riduzione dell'efficienza del conteggio, VJene chiamato
Anodo
tempo mono del 1ubo ed è nom1almcnte pan a 100-200 µs Quando gh ioni ra_gg1ungono
l'elettrodo vengono ncutrahuau, ma 111ev1tabtlmente alcuni sfuggono e producono la loro ò Sletetta
d, -.o
stessa 1on1U.1z1one a v.ilanga Pertanto, \C non controllato un tubo d1 Ge1ger-Muller tende a
F,-.tem,male
dare una ~nca continua Per ovviare a questo problema, il tubo VJene smorzato aggnmgen
do un gas ad.mo, che nduce l'energia degh 10111. Tra 1 p1u comuni agenti d1 smorzamento ull-
hzz.iti, vi sono etanolo, formiato d1 etile e gli alogeni
(bi
• Ragione d ecara continue

P01e11Z1~ soglia

~HIPIO 2 Platuu dJ 0.,ge, M.i!Je,

Effetto del tempo morto •
i: fc,ra, 300 voll

D0\tA!\DA
Cosa pensate che ~ucceda all'efficienza dt conteggio d1 un contatore di Ge,ger-MOller
8
...'0,.
_g
l'o11N111&le
d,e,erdz10
"-
P0111f1llele
di rottura

all'aumentare della velocità d1 conteggio~ ~

Poteruiale dJ pe>tenza

L'effic1enu d1mmunà po1ch~ v1 s.ua una maggiore probabilità che due o piu particelle ji o Yoltagg o epphcato
entrino nel tubo durante 11 tempo morto.
I 1gura 14.4 (a) Contatore J 1Gc1gcr-Mulkr e lb) ttlttto dd w h•sg111 apph.ato , ull.a ,~loolJ d1 contq;g1o

Strumentazione L'1ncapa<..1tà dc1 contatori a fincstr.1 terminale du1n:Jarcdcboli cmctlltori 13 co~t11u1,cc un

.problema nenc b10SetC!ll<' m qu,nto ' Ht un rad101wtopo uuhzuto molto frequentemente.
I~ p~to, 1contator1 basai.i sulla 10nu:zauonc di un ~ costttu,vano il principale metodo
I:mconvcrucnte può essere ~upcrato uuliwm<lo un C011d<kito-conta1ott pnvo d, lìn~stra nel
1mp1egato nella misurazione dei radi01S0ton, r- nei campioni biolog1e1 An uaImente, t· lOill11on
quale" ut1hna un flus,o dì g.as. Qu~ strumenti sono pumo~to mgombrant1 e dC\'ono es~e•
a s.:m11lL111on,
. han.oo
. preso
. . il sopravvento (pa~· 14·2·2), anche ~ quasi tun1· 1· 1aboratori usano re ~postali su carrelli s1mih a quelh u11lmau sui c.1mpi d,l iolf Sono uuh p<"r determmJrc la
p1ccoh contatori portauh b~tJ sulla 1omuaz1one d1 un gas·, il t·po 1 pm comune .-'- queIfo a fi1• contamma71one ma\su;cia di amb1cnt.1 d.i li, ma raramente vengono unp1cg.iu per m15ura-
oe,tra termmale (F1g. 14.4_). Questi contatori presentano una •~tt = 11e fi nestra d.I aIlummto
· ;i
aom di routme. Gr.in parte dei laboratori valuta regolarmente la contamma11one da ' H me-
~na estremità e poS)()nO nvelare radiaz1om, sia da emettitori ad alta energia ( "P) ~13 da cmct
<haote ,I tc~t dello stmc10, che consiste nello mLSOafC del t~uto, o dei batuffoli di <..Otone,
Il ton a b,\\:,3 energia ( 'C), mentre non (ODO m grado di rivelare rad· ' d a 'H, per-
hé d 1;1z1001 emc~~e sui banconi da lavoro O sulla strumt·nta11one e nel ~alutatt la contanunaz1one d1 questi con
e. que-.ta ra 1az10nc non puo penetrare la finestra Per la st .,5 · 1 ffi
c11:nt1 nel nvclare rad1az1on1 a. . e a ragione non sono mo to e ,. un contatore a ~cmt1llwone
I ,ontalon a finC',trJ tcrmmale vengono .:omunemcnte 1mp1ega11· ne, Iaboraton lll cuu1_
ut1IIZ7Àno M>stan1e rad1oatt1ve, per controllare eventuali cont
-'- -
·
Il
a.w: m que e )1tua11om ~penmcntah m ru1 occorre acccrtJre 1
h ·1
o.:1ta,, p1u1to~to e e 1 )UO valore ;w,oluto per c-.cmn 10 n.• f
•
ammaz.iom r-~" \Ono 1111h an-
3 presenza o meno d1 rad1oattJ·
· '
14.2.2 Mctod, basati sull'ecdtazione
Come è già :.ottohneato nel pJragrafo 14.1.7, gli 1sotop1 rad1oattin mtcrag1,cono con lii
• ' ,. r r are un r3p1do screening d1 gel ekt 51
tro1orc11" r.id1oatt1v1 pnma dcli autorad10.,ralìa oppure per ven lì1c.ire la pre,;en1.a d1 compo mat•r d d' ·•ndo 1·onizzaz1one fenomeno che è alla ba-e dd funuon.uncnto
o , 1a m ue mo 1: cau- • 1-.. , •
ncnu marcate nelle fr.uioni cromatografiche. dnl d G "ull r oppure «L1tu1one \JUCSt ulumo effetto comporta I c:m,~-
~ contatore I e1gcr-,-, e ,
 BIOCIIIMKA l lllOU:X,IA >.tOU1 o T[(Sl( lit RAl)JOIIOTOPIClll
622 623

Otnodl che aUOfbono gli elettroni ~elocl e creano 111 Crtstallo fluorncente,
un numero p,u elev1to di elettroni lenti per OMmpoo N1I (Y)

f
/

~ Sorgente
1·
=: _-•r_____..!• '
l :I: J - r "

• I
. .
H . .M
. ..

,.,.,.Alto volte1Hj10 che

T accelera gh elltttroni

Superl,cie fotosensibile
f all'1ntemo del tubo ~
Con11tore del fotomolupl,catoro
che emette fotoclettron,
d• 1mpul11
I
Al,mentllore Conu,tore Alimentatore Contator.
dt 1mpulsl

•
ad alto volteggio ad atto vottegg,o d1 impulsi
Registratore
~ +
Reg,strau,r• RegtStrat0t•

hgura 14.6 lllu~tra11one ,.;hcmau.:-a da mttod.i J1 c:on1.-gs10 pc:r ..antillwone \Ol1J.i (a) e hquiJ1 (b)

Con tatori a scmtillauone

~,stono due t1p1 d1 contatori ,1...:m11ll.u1onc (F,g 14.6 ~cl ..ontci;glO a ~.. mullu1one \olt-
J,111 campione viene po~1z1on3to a,canto a un cmtallo d, maten.ilt' fluorescente. Pt'r gli i!,OtO•
pi y, il cristallo normJlmente u~to e lo ioduro J1 '>Odio. menttt per gli emetti ton a~• preferi-
scono crist.tlh di \Olfuro d1 ,mco e per gli emctuton ~ ~unul.Latoo org.uuci come l'antracene I
LC1stalh a loro volta sono posti vKmo al fotomoh1plt-catore, coUe-gato a un altmentatore ad alto
Energ,. &Pii. rad11z1on• r,n MaVl voltaggio e a un contatore d11mpuls1 (F1g. 14 6al 11 ..,,ntatore a scmullanone ~hda è partico:-
o amp,,aza dell',mpulso del fotomolt,pl~tore larmente utile pi:r gh 1sotop1che emettono rad1.mom yc.he,come SJ è ,uto (par. 14. 1.7), )Ono
Figura I◄ S ( .1) fun11on~10 d1 un fotomolt1PIiatorc-; (b) •pcttro energetico d1 un 11p1co c:mett11orc: ~ d1 natura t'lettromagneuca t', qu1nd1, collidono raramcntt' con glt atomi arco~tanu per pro- ..,
durre 1on11zaz1one o ecci1.111onc In un ,mtallo gli atomi sono molto v1aru e ciò rt-nde la col-
!J5ione piu probabile Al wntrano, 1 contatori a scmt1IIJ11one sohda. Ul genere, ~no madatt1
~,one d1 fotoni da parte dei compo t1 - ( h per m1\urare emt'ttllon p deboh come 'H e '(,, perché anche I negatroni a pm alta energia,
-
=~
s.a
..
mcl,11..1 e quanufìcata
, · Il
) e"cllatt c 1amat1 fluoroforì). Quc:.Ll fluore~cenza può
fenom
\lene n, elal.I d a un ,otomolt1phc.it
è
eno noto come )CJOt 1lla11one e quando la luce emes
•
t'me,s1 da tah 1)()top1, non hJnno qu.1~1 mJJ energia )uffic1t'ntt per penetrJre le pareli della fia ,
la di con1egg10 m cui è contenuto 11 campione Po1ch~ molu 1sotop1 Us.lll nci d~..:gi railioun-
54:inullaz ,, 1_ . 1 ore, queSt o proce~)O costituisce la ba~ del con1cgg10 a munolog1e 1(par. 7. 7) ~ono cmetuton y, 1contatori a \C1ntillaz.1onc ~ohd.l sono frequentemen-
ione. ..,,mpuL>U e ettr1co, che deriva dalla . . • .
t:nergia clc:ttn~.i nel fotomolti hca or . comerston e dell energia lum1~os.i 1n te 1mp1egat1 nella ricerca b1olog1ca
radioatti,oongmale Quest p t e,~ diretLlmente propomonale all't-nerg1a dcli evento !'-:t-i contatori a sc11111llaz1one hqu,Ja f1g 14 6b), ,I campione v1t-nt' miscelato con una so-
· o rapprc~nta un _g d .
m nuanto )ignifì"-a che du ,L ran e ,antJggm del conteggio a sc1n11llaz1onc, luLJone che conuene un solvente e uno o p1u \,:1111111.iton Qut':,to metodo è parucolanm:ntc
::i e, 0 anUJe p1u 1sotop1 p 0 ·
,1,ur.111 all'mterno dello si ' ''-<>no e~sere rivclJII :.eparatamentc e m1 utile per misurare t'me111tori ~ deboh ,ome 'H. '( e S. f~quentementt' us.it1 nella n"erca
~\o "amp1one pur hé bb" fi
cientementc dl\crst (:,i\ ·da olt •) li f ' " a iano :,pettn encrge11e1 d1 em1ss1ont' ~uf ,. b1ologica. e,011 questi t\otop1, 1 contaton a !!,int1lla11one hqu1da sono 11 metodo di contt.-ggio
< re • unzionam •ntO d 'I fi
mente illustrato nella figura 145 _ e un otomoltaphcatorc ~ :,chemJlllJ· p1u comune Pertanto a que-;ta te(ni,a s.trà dedicata parurnl.ue attennone, ~eblxne \ada ~ot-
In smtcs1, ti conteggio per scin11ll.1z1one forn d . tolmeato che quanto detto , 1 applica anche a1 ~ontaton a scmtilla11one solida usati per la de-
l~e Ut' tlP.J d1 mformJLIOlll"
• qu,intrt,11,w, ,J numero d1 scmt1lla t • tt'rmm.iz1onc degli emetutori Y
c.impmne et~ alla quanu·• d d .(tom proporzionale alla vcloc11à d1 deLadamt'nto del
• ..., 1 ra 1oattiv11à· Trasfer1mento di energia nei contatori a scintillaz,one liqwda
• qual11atn·~. l'mten,1ta della luce an •
pomoru.le all'enc-rgia dcli.i radiai.ro;;,1• e qum d1 Jd segnale del fotomoh1ph"atorc, è pro· l n ptCcolo numero di ~oh·t'nll org.1111c1 diventa Ouorc...:cnte qu.tndo v1 nt' hombardato
con sorgenti radioatti\c. La luce emc,-.a h.i una lunghezz.i d 'onda molto conJ F1g 14 7) e
 BIOCl!IMK.A E BIOI.OGIA M0I.LCOI.Al!
62.f ;ti! l(Ai110iSOTOftt H
62.5

Sensib11 dlii •t• d.a tenere presente t che alcune mucdc sono i e per camp O '° altre per cam
Solvente PPO POPOP lotomoll1pllcatore pmm .a<equo~• (queste m1SCCle con no m1.ull;roriantr come per esnnp al dckrp:nte
•
o Tnton X -100 ). t importante utilaure la i rmu.laxmr piu .adatta.
~
\'.antagg1 dei contaton a s.cinti.lJuione
lo
E '\ L'ampio utùiuo, nel ,11mpo dcli.a rtenu bio a.,da onuton a s.:=~......~nc md1u che
o
~
o"t>
' \
\
\
c),1 presentano numerosi vanuggi rupctto ai conu
no md1cat1 d1\tgwto.
a lOlUZUZIOn(' di

1.0 ' \
\
\
Po1chf 11 decadimento della Ouor~ 10 e pau rapido dd trmpo mono d un
;; \
contatore Gc:1ger-Muller uo◄ ~ son ~ ,-doau dJ contq;gao molto PJU alte
e
• '' • J.:cffiacnu d1 co.n.tcggw è.molto r u d(-\;iu, sopr.muno con ~ 1 n p J1 ~ ClCrp.:i:
lii

250 350 450

'' c;Qn 1 contaton a \Cmt11Lu10~ t molto comune un effiomu del d.tc p.ub uurornt;m:
lun ua d !\da (nmJ oltre tl. 90"u per cmdUtonad alucncrg~uò t dm1ltQ. m ~ al fan<> eh<' a ntptrom,
non dovendo~ 1-l&Slarc aura,'t"'4.1 I ana o ~~n- attnl\"t"nO h fincstn d1 un <ont.atorc Gri
Figura 14.7 S~un d, mus.sione d, ~u, fluoroton m rapporto alla sc:nsibiliu dc, fototub1 ger-Muller td1,!>1p;1ndo -.--0.,,1 gr,m .r,ane d ;a loro mnp.a prmu di -.ausare b aon1ZZ,1ZJOnc- ,
mtc:r.igisrnno dtrettamentt -.-on lo -...,ntalbtore: pc,1,mto b perdita cL cnrrpa pnma che
l'evento ,1a ,oot.tta ~ nunuau.
non viene rilevata 111 modo eflìetente dalla maggior p.irtc dei fotomolt1phcaton lùttav1a, se s1 • Ne, cont,n on a -..:int1ll.1z:10~ ~'-"'°no e~= allosgi.au ~paom d1 ogru upo, st.ano ~,1 h
scioglie nel solvente un composto m grado d1 accettare l'cnerg•~dal 'iOlventc e d i emettere qwJ1,i.olid1, '-O~pnNom l'gti
OuorC\çenza a un:1 lunghena d'ond.a p1u lunga, la lu1.e potrà essere rilevata in modo più t ffi
• La prep,ua1K'•~del -.ampi.)ll(' è s=,.~ ,.anplicc l ,.:Ji wtrc
c1tnte, Un composto d1 questo tipo ~ noto come JluQroforo pnmJrM, uno dei piu utihLL,111 t 11
2,5-difemlossazolo {PPO). Purtroppo, la luce em~sa da PPO non sempre ~ rilevabile con effi• • Er.o~,1b1ll· ,ont :ul! sep.u.itffl1ffllt' di_,ffl..llifilQpJ ncllo.staw ca.mpwm. pcrQÒ s, l'Q'-SOno
c1e.oz.a molto alta (ciò dipende dal fotomolt1phcatore u~to come rivelatore) ma que<;to mta ~1:.Kuirc- opcnmmu J1 docr.ia mar,atur.a ,'Cdi oltre
colo può essere superato indudendo un Ouuroforo ,~ ond.mu o mod1fìca1ore d1 lunghena • .J.rnnt,uon a i,u.nllllazwru: ~ cnmpktam_entt autom.auz:zau, ..mtmll13 da cunp1oru J)()~•
d'ond.1, per ~ c-mp10 l.4-bis(.S-fcnilossa.z.olo-2-il1-bcnzene (POPOP). Pertanto, 11 processo dr \Imo c:--.<re lOntau ,1utom.111,umc111c e I romrutcr prt'M'nta ne, dìsp<mtl\"I ~ n o esegui-
trasfenmento d1 entrg1a diventa: •r•
re dJHr.i t ,h an.tltii Jr1 &te per Ck'Tllp'O u)rTUl(•M Ja n•ultau tn base all'dfiocnza d1
com~o.. rcahzu.Llonc J..igraii.a e .ukolo dt'1 do~ssi rad101mmunolog1a.
Solvente Ecc1ta10 Scmtrllatore
Radi,mone-. ( ~ ? \ { \econdano I\ \vantaggi de, contatori a ~ intilluione
\i ) ~ . . ~ J - . Luc,
Ecc11.ato Scmullatore J &1.1tato Dopo ,l\cr e\ 1J~·nziato 1,,mt.isg1 do:1 -.'Ont.1ton a i.;mulbuon<', ~ opportuno md1 ..11me an•
pnmano
che gh )\'anta~•; fvrtun.itaruc:nte,u. wg;ior putc J1 qut'$h è ,tata superata ,on un.a mts}iorc
A que)IO punto occorre ~p'.cgare perchf \1,mo necessari uno scrntillatore pnmano e uno rrof.l'tta.z1one J egh ~trwnc:nh
(>1:1.ondano, qua~do solo quest uh1mo emette lu,e alla lunghezza d'ond.1 pru mdu:.ita per la r1- • :-:cl conteggio .i ~intrllwonr il ,o,to pcr -.-amp1one è ,1gmtì..at1vo; tutta\ 1a, ra la nugg1or
leva11one. La )p1cgaz1onc ~ \Cmplke ti M>hcnte non può trasferire la propria energia dirclla· parte delle: apph1.lllom, alm fatton ( tri I q1uh h r~uhta, M"m1b1hu, facahtà e a .... uutau)
mente al fluoro foro )l"condano. CQffipt'n',\01) Ul larg<l ffil\U[,l ~Ul">lll \\ antai;g10 ('Cl\num1.:o.
PPO e POPOP sono stati tra i pnm1 Ouorofor1 utihzz.atr nei lOnt.aton 3 \Cmtill,mo nc hqm·
• -.g I ..11 \'OIt.1gs1 appliIC,l u "'
.a I . , ·• to'"""oluph-.atorc"
,....,.. ,-enfi-.,mo C'\1.nll clettrom-.11.h<'
• non d1
d.l e rimangono tuttora quelh prclcru1. I u11.w1.1 compo\tt wme 2-(4' +buulfcnil 5 ( 4 •-d1• ' e ,hc =ntnbuc,copo a un clc\'ato rumore d1 tondo nd conkg-
P<'nd ono d alia rad10.1111\ 1I• ,.,
fc:mlil)- 1,3,4-o-.sadi.uolo (BU n ·L-PBD) \Ono fluorofor1 pnman nughon, ma piuttosto co· •
stoM e mflucn7...ill d.1 valori estremi d1 pi f (:10 Quc~to knomeno e 1.·h1;1m•to
• rumOrl' Jd totomoluph,,uore e può O:.Ct'c , parz.ialmmtc
_,,d
n d otto r.illrcu .in o d ti d li\'"
1,po\1 ,.,. Poich, la tcmp,:ratura mtlu1s1.e sull dliuc:nz.a d1 1.'0n•
I...i_ m~ggtor pJrte dei l,1hor.1tor! acquist,, m1~cele dr ¼mt1llazione già prcpJr,lle; m com· • fiì ,.., nti •ne cmtantt la tcmpc:ratura, n~ult,mdo co~1 molto utile
1~ 10, al ra rl-.., 3amcnlo m.a ,._ ~ nd -L-
mcr.:io si tro, ano produttori e ml'cclc dive~· LJ c:oncorr•·n,a - l O mmer1.1aIe e Ia magg1or~• •-- •
•..,no ~t.111 mc-.,1 a punto .1.111.uc
-'- lotomol11r,hcaton a b,i,--4> rumore J1 ,o o, ,ne i;uantisco
b
- .. hanno d etcrmmato I' in tt<> •
..onsapevolea.1 dc:1 ns.:h1 per la '.>.tlutc e delle norme dr ~' llUr•·u~
no una ffiJ<Y<'IOre \tJh II!Id IC[ffiKo
, in app.1rat1 ~hc bmrano • tcmpaatur.:i Wll ,entC'. ln<1l
<lu111mc: dr composti dt s.:mtill.111one M-m11rc meno 10~~11•1 e 1•11fìa hI U
mma 11, n u111010 pun
10 •
00
d !tau degh impulsa. quC'SII possono esseri." tarali m mndo
tre, ~e M u~no anahu.aton • 11 11
 626 BlCJC.HlMIC,H IIIOlOGIA MOU(OL~ ITCNICIII 11.Alll0l~PIOII
627

da eliminare dettromcamente la maggior parte degh 1mpul,1 d1 fondo a bas~a energia (ta
;::_tur,1 .1 ,ogh,l o .1 har rier.i). Lo )\'antaggio t che, ,on questa tc:cnKa, vengono chminall an- Isotopo T
che gli 1U1puh1 a bassa energia c.iusati da dismtcg,rauone di emctuton deboli. (come 'H ).
Un altro modo per ridurre il rumore d1 fondo, uti.tiuato nella maggior parte dei c:ontaton a
M:inlJUazrone, è rapprc,,entato dal contcsg10 m ..omcidrnza (temporale). In questo caso 11
u!,JnO due fotomoluphcaton, collegali m modo tale da laM:1ar p~)arc: ,olo gh 1mpub1 che
s1 verificano contemporaneamente m entrambi I tubi La probab1htà che un impulso ,au-
\ato da un evento rad1oatu,·o s1 verifichi contemporaneamente m entrambi I fotomolt1pl1 -
cator1, durante il co,1ddetto tempo d1 molui1onc del sistema i comunemente dell'ordine
dei 20 n,), è molto maggiore che non per il rumore di fondo. In generale, questo sistema ri-
duce il rumore del fotomoltrphcatore a un hvdlo molto ba~o.
• Lo s, antagg10 prmC1p.1le dei contatori a !>Cmtillaztone è il q11t·11cl111JWmon.amento), che s1
manifesta quando avviene un'interferenza nel processo d1 tra,fenmento deU energia, de-
scrmo in prcadcnu. La correzione d1 questo fenomeno dctcnrun.1 l'aumento del costo
Energ11 c:JegU lmpuls,
della strumentazione. Il quenchmg può o.w-ed.t tre t.1p1.
Quc11d1111i ottico. S1 ,erifica quando s1 usano fiale d1 scintillazione: inadatte o sporche, che figura I ◄ .8 D1agr~ma cht ilha1n I pnnap, <kl ,1>nltgg10 d1campioni coo dopri.a maratura
i_ssorbono parte della luce emes\.1 prima che questa rawunga il fotomolt1plicatore
-_Quend1111g da colore Nella ricerca biologica, lbl luoiO quando il campione è colorato e la
luce cmes5a viene assorbita dalla soluz.ione d1 scintillai.ione pnma che lasci fa fiala Nel scenza d1 esaunrs1 Attualmente molli \lrumenll ~ono m g1ado di rile'\'arc (: M>ttrarn: la
caso il quenchmg da colore rappmenti la difficoltà principale, M può ridurre il fenome ~hemìolumìne~cenZJ oppure d1 mdtcar!.i nel sralko dei multali.
no intervenendo come descritto m seguito.
• La fo,folumines~en,a è mvC'Ce dovuta a11•~..orb1rnen10 e alla nemi,;)1onc- di luce dl parte
- ..Q1m1ClmJg clr'!!!1co. ~i verifica q11.1ndo qualche componente del i;ampione rnterfcma dei componenti <lei campione, mdu;a la lilla. O1\eNm~nte dalla chem1olum~~nu,
con il tra~fcrimento di eneri)a dal solvente al lluoroforo primario O da questo al fluoro• fenomeno che ,i vcntìc.i una volta sol.t, \Ì o~r,.t fosfolummes..-enza a ogm cspos1Z1one del
foro secondario; è tltipa diquenchmgpiu difiì.c:iled.durunare. Jn una sene di camp10 campione alla lu,c (amplllni p1gment.tt1 hanno maggiori probabilità d1 pm;entare fo~fo-
m omogenei (per esempio "CO ribsciata durante ti metabolismo di ( 'C)-glucosio e tCl>CCJUa In pre~enza di tale problema. 1,amp1oru dC\ono e,..cre tenuu al buio pnma dr ef-
adsorbna su alcali, aggiunti poi alla miscela d1 scmttllazione per il conteggio), 11 qucn '
1cttuarc: 1I contcgg10 e il ,·onterutore del ,.imnione
r dc~e essere mantenuto chiuso durante le
chmg ch1m1co potrebbe non variare molto da un campione all'altro. In que~t1 casi~• opcr,mom <l1 conteggio
pos'>Ono confrontare d1rett.1mente I conteggi relatiVl, utilizzando il conteggio del cim·
pione per min~t~. Tuttavia. nella maggior parte degli esperimenti biologici che ut1hzz.1 Nono,tante tutte Ie compI1,azion i d~"-nttc \Opr.i, 1.:ontaton 1 -...:mt1llaz1onc liquida ~ono
. t dt b ..._ cnic Ciò~ don110 al fatto che que,,11 strumenti ,o.
no rad101sotop1, 1 camp10111 non l>Ono cosi omogenei e ti conteggio relativo (conteggi sempre pre\cnll net d 1parurnen 1 10 1 . ffi d' I
per minuto, c.p.m.) non è sufficientemente accurato. In questi casi <><:corre usare un JP no dotati d1 \1s1em1 automauaat ·I pt·r la dctcrmm:mone Jell e K1en1.1 1conteggio; m a tn
·

p~opmto '.11et?do d1 standardizzazione, che nchicde la determinazione dell'efficienza 1ermm1, tutto 11 l,wom p1u .1mpegna11,o ' .1ene svolto dagh ,trumenll.
d1 cont~gg~o dt ogm campione e la trasformaZJone dei conteggi per minuto 111 conteggi
.
Uso del conteggio a scmtilla21one per. ca mpiom contenenti due isotopi
as\olut1 (cioè dmntegraz1on1 per mmuto, d.p.m .), come descritto in ~eguito. 51 tenga
prc,cnte che 11 quenchmg non rappresenta un problema rilevante nei contatori a ~,inul . . d1 ullaztone ~ che l'm1en,11à dell'1mpubo dettn.:o, pro•
laz1onc solida. Una ,arath.:nstt,a del proce.so ¼tnl I 'otomolttnhcatore è d1rctt.imente com:-
<lotto d,1lla tra~1ormaz1one ell'cncrg1.1 ummo!>a
r . d
.
ne i, .,. '
Po1Cht I diver,1 emct111on d1 part1cclle I}
• Anche la ,h~minlumm=nza può causare p obi · I d . . d Il'
Iata aIl energia e even . to rJd1oa1t1\'0 ongmano.
r cmi net contatori a \cin11llaz1one 1qu1 a. 'hil detenmnare separatamente due 1sotop1 in un
Questo fenomeno, dovuto a rea11om chimiche tra I compon-nt· d h d .1 d10 ·rentt ~ po,~t I e
1 I • , 1 e1 camp10111 a ~o ttopor-
d anno spettri I energ• • ' d
I
rg a ,iano ,uffiocntemente d1,cr,1 Ira le coppie
r~ .i contn;g10 e a mt-.cc a d1 ~ mt1Uazionc.produce emissione che non è dovuta all'ccata· singolo ~ampione, pur,hé i loro spclìttn enc t~ dt\'Chl \1 ,,mo: ' H e 'C., li e ''i, H e ' P, "C
ci ,ut wcntemen ,
_zione per effetto della radioa111v11.1 del ~•~tema l>Oh "ntc/ll
•
r L' • • d· I , gc
uoro1oro. em1ss1onc I ucc, d1 •~topi con ~pcttn energc1I li nell.a figura 14.8, Jo\'c ,1 pos,ono ,edere gh
neralmente, avviene a ba,sa energia e i1 elimina configu d I Id) del 'olo . . Jel metodo è t u~1ra10 bI
- J ran o a rog11a (11ire~110 L1
e •·P; S c. P. Il prmc1p10 gono solo paniJ.lmcnte f _po~,1 1 e separare
mol11p 1,atore ana Iogamente a quanto accade ""r ti ru d , d h mio T) che s1 ~o, rappon
,., more 11ondo. Qu,m o 1,1 e e spettri d1 due 1,otop1 S t "'lt\re di mtC'mtt.\ m modo da ,,eludere tutll
arando un ,ma1J,.,...
lurrunesccnza rappmcnta un problema. $I può O\'\·iar. . do ·allo completamente I Jue •~otopt t gl t ugu.ùc a X) e quelli d1 energia ,uperiore a 'I
d1 rcmpo prima <l I eIliertuarc 11 con1l"<lo10 dei c.imnio e :upcltan per un certo •1Dtcn I ne· , • a x h o 1.i po~ a
gh 1mpul,1 con energia 1mcriorc ·
'"" .- 111, per permettere ali.i chenuo umi
 IIIO(lllMllA I lll(ll.(X.,IAMOI fl l)LAKI no.1n11 RAIJIO SO'TOPIOtf
b28

(!ìnc5tra).) e anche per escludere quelli con enrrg1a mfenore alla liOKha A e quelh d1 mcrg13
t 't \Il < I
,uramre 3 n, fìnestr.i R) t;n an.1luz.·11ore d1 mtcn~nà comprendente una ,ogha e:- una fìnC'~tra
Metodo dello standard 1nttrno per il calcolo drll'dficu-nu di conteggao
per un d~h:munato a,otopo è detto ,anal!; (ni;r c,emp1O e.male 'H).
I contatori moderna operano wn 11,o,1ddetto anaJ11.Utme mulucanale, hJ!>.llO su un (On• OUMAM;A
vcrlltore analogico d1g1talc In tale d1'pos1ttrn, 11 ~nalc clenronit.-o pro\cnic:nte d.1 un loto Un c.1mp1onc spcnmenule di 'H w uo filtro di cuu unnxno wa hqmdo per
moltiphwtore viene convertito in -,cgnale d1g1tol!e, memorizzato m un computer In quc,to scm11llaz1one ha dato un contq;gw d.i 1450 c.p.m. m un COIIUtart' 1 a.:1nu.w.uu
modo ncn, anahu.1.10 i.1multanc:amente l'inkro \pettro d1 energia, cio rendc molto ptu age• liquida Dopo a,er n mo»o il filtro e &\ff agpw1t0 SOt,4 d.p.m.. il ampaooe,
vole ,1 .:ont~io mulu 1~top1co e pcmtette d1 ~aiutare adeguatamente l'effetto del quc:nd11ng ricontJto. Nel nuo,-o oontcggao SJ ottmp:ioo .?BTS c.,p.m. Qmh ermo lr d.p dd
nel ,ontq;gio det due 1..otop1 . campione spenmenule?
L impiego d1 tecruche d1 doppia marcatura ,1 è dimoi.trato utile m molti campi della b1olo Rl'i , ' , I '
g1.i molecolare (per C.)CDlpio 1'1bndazionc e IJ tra..crmone dcgh ac1d1 nucleici), negh studi \W
Prr calcolare l'rftìC1rnza dd contqpo. s i ~ utiimm I tqUmODr 14 6.:
mctJboli,mo come la \intesi degh ~tcro1di) e ndlo s.,iluppo d, nuovi farmaci.
effiaenza del cont~o = I100 (1678 1450 :3064 '-'
' Detc rmin111ione dcli' efficienza di conteggio Dal calcolo s1 olllene un ,-alott di !8~ Tale- ,':llore pub~ milm:no p e r ~
Come detto in pre,edenza. 11 problema pnnctpale che i.i presenta quando s1 u~o I cunta · il risultato ,nwalc, ••*-
ton a scmt11la71one è rapprescnt.11O dal quenchmg, .:he rende ncco~rio dctemtinare I d 1
( 1450/28.2) 100 = 51-41 d.p,.m.
..u.:.nl.l d1 contegf.lO d1 akum campioni, \C non di tutti, m un particolare ~perimento. Questo
controllo è realtZL1b1lc con d1vcm metodi J1 stand,1.nhzzazione, utiliuab1h con contatori a
'><:mtillu1onc sia sohd.1 s1.1 hqu1da, anche se qui ~i dar~ pu1.1..olarc rilievo a questi ulUDlJ
è lo smon.imento. p1u pn,nu1K1.1to risulta il d..•,:remento dello~ ~1 5frutta questo feno•
mrno nel mt:10<tu del r.ap~,n,, tr.11 ....w.w, --- .,. re,- Jcttnn1ruin- L1 nmun ddl cffincpza dd con-
S1111ularcl1zzaz1011e mtema Il campione vtene contato (e dà un certo valore, A c.p.m ), tolto ,_ prer,.t,r.&ZklllC di··~•
t~o Tale- metodo rn'\"N< .. ,.._ <:uf\2dt ...:ilibruionebal.aumJ•ont,.....,m
-tv'
dal cont.1tore e addmon.ito d, una piccola qu.1nu1a dt un matcrì.lle ~tandard. con un, aJort'. d1
d~mtcgra11oru per mmuto noto (8 d.p.m.). Qumd1, \I 'oOttopone nuovamcntl" 11 campione a
cont.1 (C. c.p.m ) e \C ne calcola l'effidc:nz.i di cont.cgg1O come::
due Còlrtali, ~lte .-orrom1 rq;1oru Jdlo 'l'Cttro di,"'™ ml m
pione~ i.morlJlo, lo ~~•ttro ),I 'll\l:-.11 ..ra
'"""° rane-
Jiulm<:ntc
"°'~ili.~~ c:am•
rcp:iw a DUDQl"C' mni;ia, UC\CTml•
J om.ah. p.,- 11~,tt b CW'\-a di calihnt-
n,Utdll una van.u1onl' Jd rapj'lnto ,j(1 oont~ ne:, ~ ad ,.
(14t,)
• j; d.trJdlsmnrr.·11nerito roi.:htbqw,nt1tld1r ~lll'\1til:ISMl-
lklflé',M nll\Uf~ un.i -.ertf Y1}Wl \ ,_ "•ta ••- ' ' - -...
Iuta è not.a, I •dhucnu
"
dn-1
~,,ntt{:gl,l m """I-.,.. ':anale ruò CS.~ UC:-lCT1lll,- ... wu, •'"
Con quc,1O metodo è ovviamente nc:c~~no usare uno &tand.i.rd interno (sp,k) contcncn•
te lo stes,o •~topo presente nel campione Bisogna anche ass1curar\l t.he lo \t;mdard , te\\O
non agisca come fattore di smor:umcnto. Standard adatti marc.111 con "C \0ll0 I"C)-toluene _Senzaagc:.
e ( ·C) c~dccano; per 'H gh standard ~no acido I 'H)-bcn10ico e 'lf O (.todo benzoico e ac d amorrr.nento
qua ,ono e~~• ~tes~• agenti d1 quenching e devono quindi c!>serc usati solo in picl.ole quantit.\).
1...1 :-.tandard111..1.z1onc interna, <,cmplice e ;attend1bilc, corregge m modo ad~.ito tutti i llpt Ji
~morz1mento. Se e'<'gu1t.1 com:llamcntc, è 11 modo p1u accurato per lOrttggerc 1I quenc..hmg .
..D'altro c.into, nch1cdc che lo M,mdard ~•a Jgg1unto con (:)trema prec1\1one e nl-..C!>S1ta di mol-
to lempo perché ogm campione dC\'e c~sere contato due volte. Ciò Mgnifìc.a anche che, m c;iso
dJ errore, il campione non può e~\crc contJIO di nuovo perchc t \lato l.Ontamuuto d.1ll0 \tan•
J.ird. lnline_. nel tcm~1 mterwrrcntc tr,111 primo e 11 :.ccondo conteggio," po"ono vcrifk.tre
v.ma11oni nelle carJttCrÌ\IÌche di à.mor2.1mento del campione che po!>SOnO portare a notevoli
inaccurateuc:. TuttJ\ 1a, r.1ppre:.c:nt.1 la prou:durJ con cui sono cahbrat11 due metodi ~uenll.

Rapportll tra , ca11al1 Quando m un co~tatorc a scm111l.111one un l.lmptone è ~mor1.llo, 11

proc~~o d1 \Cllltilhmonc: risulta meno e1!1c1cntc~una minore quantità di luce, iene prodott 1
da un quanto d1 energia della rad1JZmne Pertanto, lo ,peltro energetico di un e3mpiom.•
1mol'Z.lto è piu bll!,\O mpctto .a quello d1 un •arnpione non ,moruto ( f ,g. 14,9). Ptu mar.:.ito
 BIOCIIIMICA [ IIJOIO(,IA MOl lCOI.AR[ Tl<M<lll llAl>IOl~lTOl1< 1U
630 631

10 blMPIO 4
Calcolo dell'efficienza del rapporto tra j canali
DOMANDA
Con un contatore J \Cmllllaz1one a due can.&li,A e B. e stata dctcrmin.ua un'efficienza
.,
,:::
d, conteggio d, 100 000 d.p.m. per una solunonc d1 I 'C)-lcucma, unmersa m un hqu1do
e
~ d1 scmllll,mone contenente quanllta <re\ccnu J1 cloroformio
• O5 5ono ~tat1 ottenuti I seguenti datL
!:
o
t: Cloroform,o (cm) c.p.m A c.pm. B
&
Q.
«•
o 48100 54050
I 31612 42 150
2 17 608 28400
3 7 400
15 000

Un campione mcogmto di 'C)-leucma ha d.110 1'>(.'gUenti ulon

o 50 100
Elfacenza d1 con1egg,o nel canale 2 1%1
I ,gura 14 IO Cun.~ d1 corrt'11onc ddlo srnun.amt'nl0 ba~u sul rapporto tra ca"nah
Per co,truirc I.i curva st.tnd.trd, si riporu in un grafico il rapporto tra I canali contro l'effi-
f.knu d1 conteggio (Fig. l◄.10). Nclfa tabella 14 4 sono nportati dati carattenstm per un m·
sierne d1 ,tandard d1 ~morumento contenenti ''C E,mport.mte tenere pr~nte che una.curva
~tandard si può utilizzare solo per cond,rioni definite (nelle quah è stata costru11a), cioè per
un duo rad101<,0topo, per un determinato ~trumento e per un certo hqu1do d1 scmt1Uaz1one
l 'na \'olta alles,tita la curva standard, s1 può dctcmunare l'dlìc1en1a del conteggio in cam-
pioni ~pcrunrnt.ah. I c.1mp1om vengono contati m entrambi I canali e s1 c.alcola 11rappo rto tra
1canali; nportando sul g!:atico di c.t!Jb.rUJonc J.i valore del rappc:irto s1 ricava quello dell'effi.
dcnza !'l:ella pratica, tutti i dati vengono J.ID.lllt.S,Sl nel computer del contatore, che fum1sce au
tomatlamente I valon corretti.
canale A 1890 c.p.m"
canale B 2700 c.p"m
Quanta rad10.1tt1Htà ~ presente nd ..:;impione m<ogn110?
Rl ~l'O\I \
Si riporta in grafico ù rapporto c.p.m A/c.pm. B ( <IOC 48 000/54 050; 31612/42 150
eccetera) contro l'effic,enu del can.ùc i\ o B per t'S(mp10. 48 000 x 100/100 000
o 54 050 >< 100/100 000, qumdi 31 162 1001100 000 o 42 150 x 100/100 000 eccetera)
contro S1 calcola e p.m A/cp.m B ixr si campione mcogmto (1890/2ì00). ,, mdi, 1dua
1I ,-;ilore ottenuto nel grafico e s1 l~e il ,orrnpondcntc ,alo re d1 cflk1en1a O.il grafico
del rapporto dei canali 111 furu1one dcll'tflì<tcnu nd canale A. ,1 ott1cnc un'ctficicnu
del 26.5%. S1 corregge il valore di c.p.m nel canale A o B (a ,clonda d1 qu.Llc \t sceglie
per calcolare le effi~1cn1e) con l'efficienza mavat.t (cioè 1890, 100/26.5 se" u'>J 11
canale A ) l. po..s,b,lc traLCIJre I due grafiLI 1cfficrenz.a daA o B contro c p.m A/c p"m. B)
e calcol.tre la n \po~ta u~ndoh entrambi In ogni caso 5i dm rtbbe ottenere 7110 d p"m.

lìabclla 14.4 Radioatthiu registrata con \morzamcnti cr~enti gradualmente 10 un contato

re :ucintillu1one • dueCllllali 1contatori a \C1nt1Ua11one multKan,ùe opcr.1no -.cll>nJo i:h ,tc\\l princ1p1, ma con\cntono
c.p.m. -
Rapporto
Efficìcnu del contrggio
in aggiunla da an.1huarc J,1 lorm.t completa,. la po~111one dello ,peltro. In queMo ca,o , 1cn~
lorn, to un par.imel ro d 1g1·1.u·'e eorr•·l
• •to ~l'cfficienz.a del conteggio I e vane ditte produttr1c1
M " •
Campione Canelc I Canale2
'>!md.ud 1'<.: (:?03 600 d pm
non smorzato
171 QJO IIW 250 O93 --
Can" l:Can. 2 nel canale 2 (~)
90"5
-- - at.triliw~cono nomi di,crs1 3 quc)lO p,uametro per c-.c:mp10 I KB hl\trumcnt, u":11 c..prei.,m•
"
ne A11tomat1L "'ucnL h e·,ompcn- ·~t,on•mcntr• P,1d:ard lo defims<:c: AutomJllc I ll1L1enn { on•
.,
I rn1• Q u~t1 M~tcm1 pO\\ICu 0 I10
un• prc:<1s10nl maggiore rispetto agh ~trumcnu a due GU1,1h,
SwidMd I'(, ( 203 600 d p m ) 1◄6610 168840 O 87 •
M
I I l'mtrro ,11cttro Il metodo del rapporto dea <-1n.1h è adatto
829
ron 1morzammto 94 240 13S090 O 70 poteh~ per I ,m.t11s1 viene uu 1uJ o
cracmtt' 66.3 . . . 1 . quJnJo quc,to è molto cle,ato. lnuhrc." po,,ono LOn •
52 260 102 0,0 051 per ogni t1p0 d1 ,morzamento, a1K 1c
50 I wn J,Hri,1 (;mah, qmnd, ,1 h.i un notC\ok r ,p.1rmm d1
160}() 58JW 027 tare 1..ontemporancamcnte , amp1om
28.6 . d d d diu.tzllllll' intern.1 o c,tema In pr,1t1• 1 e un metodo per
5920 J◄ 740 O 17 171 :mpv n,petto a1 mcto ~ i ,t.sn ar con un grJdo di prco'1one a<1.etti1h1lc. pur<ht la rnn.t
2060 20270 O IO 99 terminaH· l'cllÌC1cn1a I conll't;Sl<l \l.l è not,1 la ~u,1 ,car~ .iccunllcu a a ba,,<. ,clocuà
1130 13260 008 t, ':i d1 calibrazione sia alk,uta con Lur.i Tutta '
632

"'RA
fi T-•-·I I '"'
c.,np1011e
Contatllnl
d impulsi non~muruto
SUmùrd 'C: (203 600 d.p
con $ l l l O = t O
UO(ffllC'
♦ $pctUo di uno standard ~

• ~ ncin.-1,aloff l,QP: t ..do la

C,,mc rs-r ti metodo dd

ccuano m1sur11n- una ..a,
.lo{pdlro produuo m ,1
hgun 14 11 ',tanchrd ntcrm per la stima Jdl n1icar:nu dd coni~ u 10rgm1c cstrm11 trrudu il aam stru1rt' una <.UT\~ J1 -.al
pione Il con1a1nrc ,1nahzu lo ,pe1tro, ..he" ,po~u •-rno cntr~ ptù ~uc ~ ti ,amp,onc t 1moruto. li r.a omp1om llhllf::Olll \\"1\S() D
ramctro d, ,nmrumcnto ddlo ,tanduJ ntcrno, ~Ql'1f} pm'O d1 urutà di muura SI nrava Jall use ddk ClfflU Jall.1 curu d1 ca! hrmonc e a:,>rre13,'rin®
mtrgtc rd t corrd.110 ali rnlltà ddlo ,n10rumrnto. ~~re ~ lo =oru=to nd camp on<' p1u tuuo t
i!valorcdi ~p(I ) emmorclcti1.:icnuddcon1q;gio(1ab I ◄

I tPto '\ l
d1 conteggio, ctò è dovuto al tauo che: I urorc: nd wntcgg10 rc:r mmuto ~ alto e: questo i• rtllct (.alcoli dcll'cffic1cnu uttlillando gaod.an5 ntc:ru
te m un errore: c:IC\ato nd rapporto tu I cuw,, osc:ndo 1alc: rapporto cal,olato d,1 ,.ilort dt't
,ontt.-gg.t per nunuto dei due: cuul1 Inoltri.', è poco illcura1n per umpiom mollo smorzali l'u 00 A"iOA 5CUlt
L:dfte1mu d, con~ del l'C m un latore 1
quc,tc ragwm 1.i pro,cdur.i scelta wn m.1gg11,rc: frequenza è J,1 sto1mbrJ1naz1onc ~lern:1
dc:tmnmata ronando un ampKIOC' di " sundud con
gradi d1 ~oru.mcnlo con ù mdL-.do ddlo mm,o:
~111n1l11rrl1ZZ11:1011t wa11a la. qu~11, C'il'.'O nel ...onutor,. ,1 .sunttlluiont' ddk, ,1rumcnto è
montato uno ~tand.ird c~tc:rno che emette r,1J1wom y. '>olio il conuollo Jcl 1..0nlittorc:, ottili cp..m ~p
c.1mp1onc d.i !-Ottoporrc a conrcggto è cspt1510 a quc.,t.1 lonte r,1J1~tt1va cstcm;i, 1..hc ,1 ~pl>\t.l 8 ..51 0}10
;iutomatKamcntc d.i uno s.:hcrmo J1 pmmho .ili. Qmcra dt rontt~o Lt raJ1.u:1onc y p<nl" 62'61 064
t r-1 all'mtc-rno della fi.il.1 cd ccc11.i il hqu1do dt SC1nt1llauonc. Lo speuso che ne ruulu ~ cuatt<' ..~ 220 O4ò
muco per ogm fonte e notc,olmcntc d1,cT\O d.1 quello proJ0110 dal ,amp1onc ncU.. ~ La 21014 021
fonte: d1 r.1d1.111onc y ~,m.1 in fwu ,,ne delle ur.inc:ruuùir di ubbncauonc: dello :1trumcn10 anJard di Mll(XUlllCfllO.
(per esempio Cs. Ba o Ra) Lo sprttro oltcnuto con Ra t mom 11 to ndl.l figura 14 11. SQP è ti parametro '1 -alorc dJ SQP d1 052
_, h.1 dato 20,6 e r-,m con un,
Agcn11 smorzanti rr~<nt1 nel fluido d1 s.:mt11l.tz1om.- m1lu1k--ono sigmfi..11t,,.1ml'ntc \ullo Un C'amp,on(' spcnmcnt;uc l •

~peltro ottenuto Lo strummto anahzu t.llc sixttro e gh .aucgna un parametro J 1~morzamC'n Qual è la rc3lc ,doatà dJ contcggto
to li metodo J1 an.tltst usato dipende~ <.OStruttorc U:B lnstrumcnts la nfmmmto ;a un pa· ~ 874 1 l00/I050 1 ,controSQPSiorucnc
r.amctro dJ smorummto st,md.ird rc:r I.i sorgente c,tcrnJ, SQP( E), ,ornspondcntc a un pun1,1 !>1 nporta m un grafico I cflì~ienU tale che I util (l('r co il 'al re
sull'.1~,;c Jdl'c:ncrg1a (I 1g 14.11) Altri produttori utth.zuno mctoJ1 lcggcm,cntc Jl\crn, 111.i ti I effio~nu (48%) Jd campione ~pcnlllffldo 4221 d p.m
prmcip10 è lo stesso In sprnro d<'llo stand.lrd c,tC'rno ,·.ma m funuonc del grado dt smom· -~ 2026.0ttertCll
delll' c.p m mlSllratr, 1.t=
mento ndl;i fi.tla e, an.ilogamcntc, ,-aru I cffiaffll.l del <."tlntcgg10 dcl campione m esame
 IIJOOtlMIU C lllOLOGIA ~IOU C01.ARI TIO ,iOtC RAOl(m o10r11111
635

li metodo ddlo )tand,trd C$terno è ormai una t«-01,a con~ucta nella maggior parte dct IJ un cmul\1onan1e ,ome 11 Tnton X- 100 <: powino mglobare fino al 50% dt acqua (, lv), tutta•
bor.1tun. Rt)pcllo al metodo del rapporto tra 1.:-3nah, ha 11 vantaggio d1 c,,cre affidabile pl'f via, all'aumentare del lllntenuto d1 acquJ, ,, , cnfic.1 una 1ransw one dt f= da uno stato a
campioni con ba\,e, dolll~ d1 conteggio; tutta\'la, non è privo d1 w,1nt.1gg1 lnfatu, per ogni una \Ola fa~· a uno .i due fas, oppure allo stato d1gd ':,e I a mp1on1 sono m uno st.110 a due
gruppo d1 e~p,:nmenll t nc.:e-.1.1no allcstm: un.1 curva )t,mdud , come nel metodo dd rap flit non t: po,\1b1k cflcuuarc un lOnll'·gg10 a,curato In commcrc10 sono di.spomb1h molte
porto tr.:i 1\;anah) c l'u11hu.11ore puo caderc IO un falso scn~ d1 \1curezz,1. Il s1stcm.1 è lO)t al- ml\,ele pronte per I u\o, accomp.ignate da t\lruZJont Jc11agl1at<: per l'u11hzzo con d1ffcrmu
tamente autom.1111uto eh(' e fa..:tlc perdere d1 vista I prinltp1 d1 ba)e e dimenticare che qur:• upi d, camp10ne
~to mcroJo non è sempre 11 p1u appropnato Un e)Cmp10 d1 quc,11 po,,1b1h problemi è r.ip
pr..-.-cntato dal ..:ontegg10 con la scm11lwione liquida d1 'H precipitato ~u tìhn. li metodo dd- \'o/11111e de/In misu/11 d, sc111t1/lnz1011e Ocrnrrc souolmearc che l'dlic1mu del umleggto a
lo ,t,md,ud ct.-rno c.ikolerà il gudo dt smorumento dovuto al fluido (che probabilmente \C10ttllazione vana lOO 11 volume dd camp1or e, )ebbene questo non co,111u1s..--a un \'CfO pro•
rt)ultcr¼ molto ba~). l1l.1 non terr.a conto ddla ~sa penetrazione, nella )Oluztonc dt SCIO blcma per I e.onta ton attualmente in U\O. Ciò nonostante, " dm reblx prestare attenztone af•
11lla.zmne, delle p.uttcdl.:- ~ em= Ja 'H provemenll dal filtro. \I ottengono cosi efficieni,e finche il volume dt campione nelle fiale d, una data ,mr d, conll"ggl st.l semprr lo ~tr,,o e: af-
artifidalmc:ntl' elevate. finché ogni cahbra21one dello ,trumento venga e,egu11a utilizzando gh stc,M volumi dci
In tutti i ~ m cui s11mp1tga una proo:dura automa11.zu1a è preferibile ,ouoporre al con• campioni ~pcrimentah
tegg10 .1lcum campiona d1 cui sia noto tl contenuto IO radioa1m11à.,
f/1111mnz1011e dr/ ,111f'11cl1111g da colort ~ 11 qucn,hmg da colore co,tttuLSCe un problcm.i, ~
Prepuvfone del campione po\~tbtle decolorare 1 .:amp1om pnm.i del ,ontegg,o. O.:corre tuttana fare attenzione, in
f: 1mpo:.:.ibile, IO quota sede, docnme dettagliat.unentc tutti gli aspetti della prep,1rwo quanto gh agenti decoloranu, come 11 pcro,,,do d1 idrogeno, ('<l~S<mo dar luogo a .:hc1111olu-
ne dd campione per il conteggio a scintillaz1one. Di seguilo s.iranno ~mmat1 1 pnncipah m10C)Cem.1 c.:on .ikunc miscele J1 ,,10ull.mone.
per t"t-rntuah .1pprofond1mmt1 si nrnanda ,11 testi coiuighat1 nel paragrafo 14,7.
Solub,1,zznz,om• dt, !()51/ll I ,ampiom ..._iluh, ,ome 11c,,u11 \l'gt'talt e: ammah, s1 po™mo mi-
Ftak per 1/ c11mp1011r La preparuionc: del campione per 11 ,ontc:ggìo con scmttllaz1onc wlida surare m modo otumalc dopo )olub1lwa11one con 1mmme quatCTnanl' come 11 St1lub1hu.J-
tor1: ~ CS O il \olucnc Ovviamente, ljUl'1,lC -.ohwom -.ono e,1rc111amcnte to~che e ,anno,
t facile e: consiste ~mphcemente nd trasfmre il campione m una fiala (o una proveua ) di \'e•
tro o d1 plast1ùl, compatibile con il contatore. Al contm10, la preparai.ione del campione per qum d1, mancgg1ak con gran de l..•ut•·I• , " li campione \"1cnc il""IUlllO
"° .dia fiala d, contcggttl con•
l
tenente un.i pt(coIa quan •., ,l ' di ,,11ubihz1,11ore e )t la,0,1. pro~cdcrc la d1gc\1tonc Quandohla
il contl-gg10 a mn11ll.u-1one hqwda t p1u complessa e comincia con la scelta del tipo d1 fiala da · Iet.i,". agg,ung<. I•.. 011...,da d1 scmullwone e ,1 misura 11 c.1mpu111c Anc e
utìhzure. La fwa può ~ d1 \'C'lro, a NSSO contmuto di pouss1o (un ba™> hvelJo dt · K n d 1ges11onc è wmp
--• n•. può ocncrare problmu rnn I compo,11 uuhuatt per
du,e 11 conttggio di fon_do), oppure d1 pohetilme. Queste ultime sono ptu economiche, ma m que!>IO c3so,. la ehcimo Iummc....e ... "
non possono CS)Cte puhte e nutilizute, mentre quelle di vetro poMono essere utihaate p1u solub1Ltzzarc i te,5ull
\'Olte, pur~ho! accuutamente lavate. Le fiale d1 polietilene possiedono un miglior coefficiente U id iltcrnalt\'O mpcllo .ilb dc.:,)k>ru,onc dei ramrmni o
d1 trasferimento.d1 energia lummosa cd effiamze dt conteggio leggermente superiora, ma Metodi pt·r rom/1wt1om· In mctlt oli, n• I campioni vengono bruc1at1 m atmo,fc:ra J1 o,\1•
tendonll a dare pm fosforescenza delle fiale di vetro. Rtcentemente si è affermata la tendenza a alia d1gcs1tone det Ie.,,uu è J com ,u~ o •· ·h poS-)()no tro,Jrc rn commerc10 McJ1,mtc
w.are m1mfwe, che 1mp1tgano volumi ridotti ddle costose miscele dt scmlill,mone I contato· geno, soht.imcnte IO appJra 11di ~ombu,tmnc l e s1
. t 'ormm 10 ••CO chr, iene raclolt.:i $U un
_ t ncnlt ••e vengono r.l),, .,.
n modani wno IO grado di acutUrc d1vns1 ttpi di fi.t.le; per limitare i costi e IO cons1dcr.u10- combustione I campioni ..on e . d d O e I m,)urata lnvl"Cc I c-.1mp1om con11:nen11 H
agente assorbente, come ,dro~ido .so ' po 1 1
ne delle problcmatJCh~ amb1entah, i~ quanto I hquìdi per santill,mone wno tossicl\i, " do
nebbe ug.rc (compattbilmente_con 11 volume del amptone) la fiala piu p1Ccola po))tb1k Al· sono converllll IO '11 O e poi mi~urau.
:ntU 'oOIO h a\pctlt p1u import.inu della prtp.1ra210nc dei
~una apparecchi sono progC1U!1 ~ campioni molto ptccoh, che vengono inseriti m ,pccialt Come .mttcipato, ,ono S!Jlt d~ 1i gè bene ricordare che quJ)t tutti I tipi d1 c.1mp10•
contcmton d1 pohettlme ,uddtvm m una sene di compartimenti; questi \lrumenli sono par· . dcttaoh ull,W13, - d
cimp1om. o,enz;i entr.ire nei " ·. o\'enicnll da ,rom.1togr.1tiJ i.u e.irta oh1tn 1
11colarmente u11h, rc:r oemp10, per I laboratori delle industrie farmaccuuchc, che effettuano R :ompre,1 nt.ig1I pr
ni ,untcncnll emetuton .,, l MIO scmulluJonc hqu,da seguendo uno o
un gr:mde numero d1 dosaggi dJ legame ai r~on. 1arau per i1lOn1e"'° 3 . d
mcmbran.i, po~sono c:,,ere pre1 . . lt• di ptu la ,cr,auhta e I 1mport.m1.1 1quc\l,1
· ò ,·1Jcn21.i una ,o "
l'altro dct metodi dc...:ntll:" e ...
- di IoIuene S<>no Ie ptu e rt·1C1enu,
M1salr (cocktail) d1 s..,ntillaz,onr Le nuscele 3 b~•- · m..• non .• .
l~ntC'J per la quant11tcazione e
d li.i r.1d1oatll\ 11...
possono cnere ut IlIZlltc con amp1oni acquost, m quanto acqua e toluene $(>no 1mm1~ll . bIIte
M produce un quenchmg constdere\'o)e. S1 po»ono U"
• -re m1sce1e a ba)e d 1· 1,4·d ,ossano e Conteggio lcrenJ..ov ,. n~~u aura\'erso una ~1,;tanz.a con unJ
naftalene, che pouono anglob.ue fino al ,0% (\'/v) d' . . ndo una paru,c1.., " -
- • acqua; tuttavia, sono ~1.11e quasi l 001 I' ·Il ll (_ ~enkm· M \"enfica qua h ·er~ la ~tessa sostanza Se un emetutorl' p
plc:~mente abbandonate a causa della loro tossicu~ , - b d
.. LC m&e1e a uc I agenlt emu sion..
I •nit t " '-' e li della luù: l ._. anru,
sono le p1u trequc:ntementc u11hu.a1e per ti conte"'" d ono vclnrn.i ptu alt.i mpctlll 11 quc 3
...,.o I c=amp1om acquosi. !~e conteng
 tt0.1CIII ~ l0 1'>0TOPKlll
t,37
1U xin~u t IIOlflGlA MOU 1;ow1

Tabclb 14 6 Al...um ,sotop1 a&m per il contrggto &cm:m

"-dtllo •rct1 ro Effiucn:u
ddcont~•. •u
< M.ratore
leg■IO
M•rcato,e rad oatuvo
libero

·~
w pn-1ore
~ .....------
1_ ('l,o) ' ,,,,
t.,tr~l 105 \\~V
Radioootapo
-CJ
o~, 30 IO
)O Encrg111uorbìta dal meuo
I \9 t,O non &1 genera luce
:,.~
80 40

~~~
'IO kO
c..-:

pouicdeun cncrsu d, d~uncnto ,upcnorc ,1 O.S Mc\', prtwoa I'cm1i,1onr .:u p.tnc ddl'.i, Sferen• 111mol11• • emettere luce
qw di uru \u«- b1-AD~o.azzurrogno~ detta luce Qn-nkm. [; p<l'>\1h1lc nk,;m: quc~l.1 lu,c utt- igura 14 IZ Con,ctlo ali.I t,,1"' drlli 1«n1<:a \PA Rirrodouo l'(f cunc<:iiKtnr d, Amcr,h;un 810\<1cn,n J
1
hz.u.ndo un upi.:o conuturca ~in111Lmunl' hqu1J.1.
POlch~ non sono nKCS\lll solvc:nll org4nio e fiuorolun, que<.ta tc,m,. è rd.1t1,1mcn1c:-
cxonomia, La pttparlllont Jd c.&mp1one è molto .cmpli..c e non \t pone il problcm~ dd l 4.2,J .MC'tod, basati sull'espos1t1011t d, e11111ls1om fotograficl,r
qumdung dùiruco. La tabella 14 6 dena .tlrun11sotop1 che •t pmtano a t,-.cre m,~ur.itl ,on
ule metodo. La maggior p.1rtc delle apphc.anom è bu,lla ~u P, 1.ht ha 1"80"ii dello .,pcttr,, d1 ,nnte ,ll'l¼C' su un emulsione fotografica produccndll un',mmagme la-
1,,a rad1.111onc 1001.........., o {i - !>òlr una ~or
ellC!"gU wpcnorl' alh ~ Ccttnko, e che può ~rc ri.11'.\-.ilo con un'dlk1cn1.1 dcl 40% rn- a.iw alb lu<C n.,,bik Per ottenere una fologra 1.1 wno nccc< ,
tmtc in modo ogo .i1 rod nun.igmc e un cmuh,onc lotografic.i
a. o~ tabdla 14 6 si puo ~ i m ~ all'.iumcntatt dd~ proporzione Jdlo ~rcttro d, I
gente d1 r.1d1,moru. un oggcno ~el qu e np ::/ente di r.iùi;woru .r.idJo.&ll1,1t.\) <.hc
~ ,upcnon: a O.S McV, aumenta anche l'cltìucnu di rwcl.i11one.

l>oaggio buuo ,ulla scintillaz.ìonc d, ~rrutì

Per cffettu,ll"C' un'autoud1ograha, 0<.corronolcu
emetta cull'interno del m.UCO.ùc di ,w~ vu~e :::~o! l'Ull1ll.tgmc: (or.getto) e un·cmub.wnc
dl cmtilh di .ilogenu.ro d ~ w
scns1bllc. Lcmuh1onc ~ ,lhlltu11.1 da un gQr.a d l'cncrg1a del m,1tcn.ilc r.1dio1mvo VICll.C: W..\
O
li dosaggio buato wll.1 santill.uionc ,J1 pro'>um1tl (SPA. Suntrl/nt,011 Proxm11t)' A»a,1-) _è dust rn u~ f.uc.silidi wme b gdatm.t u.m ~I.i un.1 cinc..1 n~ll\.l e, u;nc ndotto ad
un apphaz.iont dd contq;po di santillu:ione che fa..,tiii I .1utomu.1one e l'cs«unonc r.1p1- s1pa1a nell' cmuls,one, l'alogenuro d'=h~cntc dl puu,ola10. Lc :,olt.u..ulOJ fotogufi
d& di un gran numcro d1 opcrunmt, Risulta. qwnJ1, parucolarmcntc aditto per la nccre2 argento metallico, torma.udo '°" un uh d ugento .:ome un .1nncruncnto sull,1
ddl attmù bialopa d1 nucm f:amuci. Il pnnc1p1O della Lccmca ~ illu,trato nella figuri che di 5' iluppo permettono d, mo~1rare questi S.r.i_~ gcm;ro d argento. In tal modo ~1 otuenc
l mmano I ,,~es~ u1 .uo .
14 Jl Le sfcmte utiliu.atc m '-P.:\ sono ...c»t.itullc d1 poln,t1rme (o altn materuh t conten- pdhcol.i, mentre 1{i1ssallln e 1 • Jcll'C\cnto r.1d,0.1111vo ongm,llc.
gono w un ~no di lr?mc per la mo1cco!a ca analil.Z.lrc, sii uno 'iCmllllatorc Occorre ricor- un·,mmagme pcrmanentc dcli.i locahzzul,one è n\olt.o '>C1mbùe e , iene utthzz.1to in un.1
dare che alcuru up1 di nduzìonc non percorrono gnnd, disunze, m put1Colue le p.irttcdlc Q uesto processo, noto come ·1utora\ 1ut'.rJt,.1,..,. ""r,mcnlt mfoedono d1 tnd.IVI J u.uc I.i
b I ci A,o1lt' \iW e,, -
v,
~ di cmctmon a ~ energia come 'H t -C. Se m .alunonc sono molecole che contengo- p.indc ,.1rirt.\ di c~pcnmcnt.1 io l'SI iom b1olog1ci J, dl\cr-O ltpo Per ocmp10, ~• ,,uò lo•
no questi radiouotop1 UlSlcmc am una sosptrwonc d, sferette SPA, la rad1az1one non sumo• d1.Stnbu11one dcli.i r.1dio,1tt1v1tà IO amp I rpo di un .w.mial,e d.1 ~,pcruncnto po~1-
ltrl lo santilht.ore l'fC'Sallr "1lle Ucrrtk e non potrà cucrc m-cut.1 m modo efficiente J,1 un cal,,.ure un f.irmJco m.1r,,1to r.1dlo.&lll'"_"~~:c ne ":,o conwllo ,on un·cmuh1onc ~cn,,b,k.
conUtort' a iCJ.fltillanonc Al contrario. se d rad10ootopo s1 lq;a alla ~fcretta, allora ~rà abba • dcll'arnw-uc .i ~tre J 11 I
z.ionando scz1om del corro Ultcro odo d, c-.po)u,on~. lo ,, 1luppo e " .utr.1
~ nc1no d2 mmobtt lo $Clllllllatorc an ~ contenuto, CO\I clic ,crr, cm~ r.1J1uionc come una la~tra per raggi "" t - ., Do"'' un ccrtO p.:n d oh or".im in cw cr.i prt\Cnte .1 r,\d io.1 ti 1~ 1•
. I
11. c dc• 1~u11 e c.,, .- Il h
e I t s a ~ ,nrà nvd.ato mostrerà un'tmma(\mt dc.... \Clton I M:p.&r.lU e.on tc.m<llc ._,om.1101,:" I. ,: o
,. d o.imv1 ,so all e
QU(5U tcc:nologu UOV1I molte applia.rioru. per c:scmp,o I dougg1 cnZ1mauc1 e ti lcg.imc a, tà. An.illlgamcntc, meubouU r.i i ' es~ tocahrull in un crom:itogr.amm,1 o
d eubolJ._1 po!',;01\0
n:utton c. m generale, quiliwì cspcnmcnto dovc si ,-ogt~ studwe l'mtcrazione tra Juc mo· ~Uloforcttchc durante ~tu m I
ka>k. S1 DSl<kr-1, come c:scmpio, il lcp.mc ai rccctton In questo caso un recettore per un h•
pndo JW11C01.uc c:omc un farmaco oppurc un ormone) è attacato alle rlerctte SPA. 11 hgan· d1 son111lavonc d1 pro~s1m1tl
do vacnc marcato nd,o:inn-ammtc e mischiato con le d'crctte Ogni ligando che s1 lega al re- 1 ahclla l 4.7 Vantaggi dei ~gg, lslUI upo dt 1111moonc molcrol.ln-
i.1ue1 rrcttton e qua
mtott unokri lo 1.::mtilh re e wrri contq;gaato Se si wogliono '1ud1are composti ch1m1Ci \rnauh uuhno LOn PSllJ rn.t1n ' r •H •-C. '>t 1'P ,
apaa dt mta'lcruc con questo lcg;imc qucuo è iJ rmcanismo d1 llZlone d, molta farmaci), Funziorwlo con 'an 1JOtop1 appwrciau, ,oni csnnrio <kl ltpndo iiM,, ,u qudlo lrsito
pcmono OlffC agpunu a amcmtruJ0111 m:scmu per studtarnc I effetto e, per om,p,o, Non o.:,orrr un p»~gpo Ji i;cpJrUIODf (perldÙ
detcrmuwnc il doAQ,io onunalc SI \'"CCh anche 1! pu 16.3.2) MUIOl"c numpowionc ~. qUJodi ndotU IOS!
t1 nto do ,.ntagg1 offeru ddu te-enologia SPA è nportato nella tabella 14 7 Scmpl1« Ili a111onu~ - --~ - ~ - - - - - - -
 638 810UIDUU. C BIOUX.IA MOUC OVJU TUSIC'IIL R,\J) 0150T0Pll1ll

un clettrokrogramm,, e le macchie rad1oat11\'C po,,ono c\:.erC' ~u"n~1\-am,ntr recuperate per

11conteggm e 1'1dcn11fic.u1one.
le tc..ruchl• .iutorad1ogr.1fic;.he (F1g. 14 13) h.iono recentemente acqu1,tato maggiore 1111
porun.u, m ~egu110 allo ~viluppo della b1olog1a molecol.ire (c.&p1wh 5 e 6). 01 ,n:u110 \crran-
no de\lrltt1 in mJgg1orc dett.tgho akum 1mponan11 a\l"(tti di que~ta tc,nica.

(,otopi appropriati
n
In gentralc I\0lop1 che emettono rad1.1z1ont a b.:tSsa energia (per c~mp10 'H. "C. e' S)
~no I pììi .tdJIII \oprJttutto per cspcrimcnu dt locahu.u1onc m cellule e te"-utl. Qul~to per-
chc-. a cau~a del b~ contenuto cncrgc11co de1 negatroni, le trao.le 1oni11..ant1 dell'1\0lopo \tl
no p1u brcn e d.wno qwndi un'unmagmc bt.:nkfuut.1 Ciò è di fondamentale 1mportanu_
quando s1 de\'e locahuarc la rad1oatt1v11.1 J\',Q(;Jata a 01ga11c:ll1 ,subcellulari. Per questoL11 ra-
dio1\0topo ptu md1cato e U, poiché tutta la ~ua energia" iene- dm1p.11a rapidamente .ili'mter•
no d.cll'emul\ionc-. L.t m1crmrnp1a cku.conica può qwnd1 es.sere utilizz.ata per !Q(.1hu.arl'

=~
l'unmagine ~ulla pellicola S\ ilup_pata Per la localiuazmne m un mtero organismo o in 1~11.
,1 P.(>ssono utilizzare ~ '-C che- Hnso1op1 a energia maggiore t per e~mp10 PJ ,ono meno
adatu perché I loro negatroni a energia p1u l'levata produ,ono trac~c molto p1u lunghe ed.in
oo come multato unmagm1 meno defimte, non sufficientemente d1s.:r1mmanti per la loc.1h1 f1gur1 14 tJ Tre ~utor~d,ottr&fic dic mo.trano I ut = di ,.m raJ,oootops per b
D!l:A 1•1...nopo a energia p1u alta ( P dctCTllllDll ~ m o ~rq;paR' ~ u ~ ~ cb
1..uione mitro\.:op1c.1. Al contr;mo, P e utile per l.t loal1u.wonc di bande d1 DNA su un gel nuu111rmn11t" e fa app.mrc k bandr del D~A r•u 'llffll' cb ~":1':.,a eWlJl.lnpl&lll A Pltd.A L :,.m
clettroforcù,o; m queqo caso, i negatroni 'li a ba,\,l energu d1S1iip.1no la maggior parte della )) dà I.a rholullone m'thor~ I R1pr1-..lott,l .:oll autoru:i::wont RilJru. 2' cd
loro energia :ùl'mterno del gcl (e ncU'mvolu.cro in cui è ~ohtamcntc nc:u:~no aV\Oll(l'rl' 11 gel momh 1nJ () \\ 1lh~m~ /1111tro bbclhng ol nudn.. a.:id> and l'n.ltC'lll> m ,. •
R I \latrn ( rJ ), l hlord t ru,cr~n rm,..Oxtooi !00~
per C\'1tarc che contamm1 l'cmuls1onc:}, riducendo in tal modo la \CD$ib1htà a livelli molto
basil..AJ contrano, 1ntgatrom " P Jd alta energia lasceranno il gel e produrr.inno un 1mmag1 •
nt mten..a. Se s1 preparano gel molto sottili,~• possono rivdarc 1mmagmi prodotte d.l Se 'C
con un alta w,oluzione, per e\cmp10 nei gel per il ~equenz1amento del I>NA do, e s1 u'>l! !) w · Rumore di fondo
• I , 1tz.Ldl p.uu.:obn..mianz~ ~h1m1w nd ampio-
mc marc.itorc 1 c~r.o" ione . ",dentale all~l~M', ,q ri:sc il Jd delle:fialc~c ~ l'«x=i,.
neAla n.itur:tk rad11i.1tt1\1tàdl b.t:.c lwriilllullll ,_ ~ \~ont' ddle nrll·-1- -~,,-ono ciu
Scelta dell'emulsione e del I.a pellicola •I ntnllWIOnC' (' IJ ,on!-Cn..... iJc!!!l-1'!5..Ll~
pr~1.>nc ,1J>phc.11,1 dura-1ill .a ma 1--:ll1lllUSU1" l.at•utel $Ulla pdJ.i.:al.i.M:tlupJl,lli.._Cì;II ruò
Sono attu,ilmcnte d1\pombd1 molti upi di cmuh1om c;on dm:r,e ~ar,1t1cmtiche di den\11.1 .)oUC un.t \ d.uur., JdfonJo_ (alh: un 1 •• ~~ in.ili n-oluZ1one (per esempio quelli
..urrrcsent.ire un probicm.t• ~i•c,;1almc11tc.\ V(I ~ • odo d;1 num-
dei cmt.tlh dJ .ùagenuro J'acgcnto. Occorre però fare attenLtone a \,cghcrc l'emuls1onc: .1da11a • .,_ ~ lllJi;roi.WJll~..,.pcr ,u1
è n~r,~ 110 orcrare mm
h
e e comrortano un m.....i;inc unJ.> t,ndc -.cmprc .aJ .awnaiwc .:on li LempQ.di ap,mi•
per gli s.cop1 dcll'e,pcnmento. po1lhé la su,1 <.cm,1b1ht.i ha mflucn1.1 ~ulla moluLionc 51 de\0•
111111..arc quc,u clkULll rwuoic c.lJ.f, b
no coruulurc 1<Uti formtJ dalle~ produttrici. ch1edcn.do com1gh m c.1w di dubbul l..l pcl· • I1
ZIOnl', che dtwrà qum d1 ~,l'f<' il p1u hrc,e po,\J e
liool.t per raggi X è ~eru:ralmcnte adatta per I campioni macroswp1ci, come ,eziom del corpo
.!!!.lero d1 p1ccoh mam~1fcri. nonché per I campioni uom,11ografic1 e I gel eh:umforctì6 . . . . po dcli• pdlicola
gu.ando i.1 u11hn.J la m1cros.cup1.1 0111~,1 o elettronica per n,cl.uc I.a posmont dcll·,mmagmc Tempo d1 c~pos111one e\\ 11up . Jd ,amp.lllJlC. del h\tlla.ddl'.lru\,tà,
.3 tunru.>ne tkll u.otopo.
ndl'cmub1one t)ocahn.mone della r.idmat11vu.1 a li\cllo cellulare o .subcellulare), è ne.:~• · li tempo di np<NtJ<lnC' ,-an ,n , , uncnto Lo~~ \'.&le' rC!. In mlur.po._dtlla. pclhcu
no 1mp1cg.1re pcll11;01l· molto ~mih1h, PQ~te a $I retto cont.1110 con 11 l,Unpione In quc~t• ,:.1~1 dtl tipo d1 pl'lh~ola l' dello ,.:oNddl c~p,!f ~ aie il pioccJ1men10 de\-e ~,,crr uJattato
, e In hnc-a SC"l1• 1 •
i1 può us.irc la tec01ca ddl'emul\mnt a itrapro nell.i quale la _pdlKol.i, fornita legat.1 J un la per l'ev1dcn11az10JlC dcll 1 ~ • -••n molti tenr..aun .::darou pruu.uh.uggwn•
o\Up~ino, v1cne , tr.tppata da questo e apphC'Jla dmttarnente al campione. In .ihcrnJll\'a, ,1
.
~ropri ob1ctlln; trcquc.-ntcmt ~ntc ~no nc..~-
po_ssono prep.uarc ernub10m hqmde, faccndo fonderl' ,trÌ\ce di cmul\ionc mc:diante n..c-.ilJ.i- gc-re le condmom otumah.
mento a nO °C c1rc.i. Cemulsumc viene N>• \-Cr:.ata ~ul campionl' oppurt l)Ul',t'ultimo. tì,>.1to
a un iupporto, , 1rne immerso ncll'emulmme. ~. 1Js.:1a quindi ~ohdifìl.UC J'cmuhlOne e ~• Autoradiografia diretta 1· I one N"f rass1 X.\ 1r11e posta t1 r•u pth\l•
procede ali css1,c.11nento Questo metodo, ~hiam.ito tc-c111ca per unmemone, \ ll'nc prdenta 1liC1.•la O emu si r ·· lì
•
1NeIl au1ora
di"oorafia darctt.a I.a pc 1. ' ..,_ , nrodu,uno_l.ll)masm1 quanutall\-e mo
awr.t piu aiulta. 1 ,,
quando sono ntcessane pdhcolc molto .sott1h. «>"
bile \'Ktnll .il c.imp1one•.1lu iemper
 THNI< HLl!Al>IOl'.;OTOPIOII
BlòOll~IICI\ l l!lOlOGIA MO U l 01,\1:J' 641
MO

a ~ndo n-0n viene r..1gg11mt.tl.uaturazi.one. Questa teaui:.iè urauenz.zata da un'aJt.a molu-
1.1one, ma posMcJe una l1m1ta1a sensih1htà, moltre richiede isotopi con energia uguale o ~upe-
riore ,1 quellJ di "C. (E..."' O 156 MeV)
Fluorografia
.Molu dcunecod1 auu.ùmcntc plu popol.m m btologiJ molecolare comportano la )Cp.lra-
i 1one dJ macromolecole.o d1 loro fr.lllOm.mcdJantc clettro!orc:)1 su gel lpar IO ) e 10.4). ù:
macromolecole, o le fra11om cosi separate, formano sul gel elettroforctrco bande che devono
o scre localtzzate Ciò s1ottiene. spesso, mediante marcatura rad!oan1va delle m acromoleco
le con 'H o 4C c. autorad1ografia del gel Po1cht t.tli uo10p1 sono emetllton Il deboli. la mag
.....gi.or pilrte della lo.ca energia viene d1ss1pata nel geLqwndJ sono ncces.s.a.ri t.cmpì dì ~ posizlo-
ne lungh1ss1m1 anche quando s1 uttliuano emettitori ad alta at11V1tà specifica. Tuttavia, se si
fa penetrare nel gel un fluo.roforo (per csemp10 PPO o silicato d1 sodio)~ essiccando il gel e
ponendolo a contatto con una pellicola pttcspostt (vedi oltre), ~$el\S1b1htà nsulta aumen-
tata d1 diversi ordm1 d1grandtlU, Ciò avviene perchl I negatroni emessi dall'1sotopo provo-
c;ino l'ccat..wooc del fluoroforo, che qumdi emetterà una luce m grado di 1mpress1onare la
pellicola. Pertanto, 10 fluorografia si sfruttano sia gli effetti d1 1on12Uzione sia quelli d1 ecci-
tazione delJJ rad1oatt1v11.à
ne:arc. la '>tns1bihtà d1 un'emul\1onc può ~ uimcntata dall;i .r--,~•~·fl..,~ f.P.rrtla·
~11111g). Ciò richiede un I.unpo dtlucc di un muuccondo prum di mc:tteff IO COD~tto b pdli-
.,ola con 11 ~.1mp1onc. Qu~ta t~ca ~'lCilC uniuq:au ipCSSO quando è nccosan:i un'denta
~ n~1b1lit.ì o qUJ.ndo occorre qu;tnt,ficare I ruultau.
Quantificazione
Come si è avuto modo d1 o~\en·are ID prc:ccdcnza gcncr:almcntcluccruca~rafi-
CJ viene uuh,zata ptr locahture la rad10.1nmt1 p1uuos10 dJ,: .pc:r .qua.nuficu:la E tuttaVla
possibile ottenere anche dau quanut.tll\'l, direttamente dalle autorad1ografie sn'\i:ods:m. d•
un dcns1tom~tro che .rcg1,tn l'lDlCIUllà..dell'!!!!!DJPnC' Q~JUUA..mit.l. è--'!!._rrdata alla
quanutà d1 rawoa1t1v1t.a pr-ntc nel Qlilp1Q11e origmaao ~no d1,P-Qn1tnh numerosa mo
dclii d1 dcns1tometro, e la "cita d1p<r1dc dagh ob,ettm dell'cspmrocato La QlW!_t1fi..n1one
non è accurata quando \I ut1huano tempi d1 ~po,mone bn:,19~•p1.1CC lunghi; aò è do\'UlO.
ru pett1vamcnte, ali.i fa~ lag (.:u>è ;ill,1 rewone d1 fonJq, de....--ntt.a in prcc~cnu)..c alla-"tu-
n.2.1onc. Per b~1 hvclh di rad1o.iu1,·1ù. tutta,u. q\lesto problema S1 può risoh-ere medi.ante
la combmaz1onc della prc-c.spQ}ll10ne ,on la fluo~afia o CWlf,Ùs.::hcrmt lfttms1tìc.n11; an
quelilO ca)(), mfatu, tuuu fotom ~ontnhu1!><:ono an ugual misura alla formazione dell'1mma-
gme sullJ lastra prc-c:.po\11,

Schenni intensificanti 14.3 Altri aspetti prat1a dc.-Lla m1sunwone della radioattì" ìtà e dell'analisi dei dat1
Quando s1devono l<><;alizzare c.1mp1om marcatt con '·Po con isotopi y (per ~mpio I P)-
DNA o frazioni d1 proteane su gel mar~ate con ' ·'I), s1 presenta il problema opposto a quello 14.3. 1 Carnttcris1icl1e dr , conlaton
che s1 pone con gli 1sotop1 a bassa energia. Queste particelle e ques11 raggi molto pm penetran-
ti frovocano u~a ~rsa mmpre~1one della pelltcola m quanto l'attraversano complet.lmente, Conteggio dcl ~egnale d1fondo
- Eoducendo un immagine debole. St_può ottenere un' immagine piu intensa posizionando, sul
Tutti I contaton di r.id.to.1tt1Htà reg1)trano -.cmprt un conteggio, an1.hc m a_=za d1mate-
lato opposto della pellicola rispetto al c.1mp1one, uno sposo .Jit-rmo mtemilic.rnte costitu ito
riale radioattivo nello )trumcnto. 1.ale fenl)meno può ~re dovuto a fonti come rad1az1om
~a fus.forQ rolido. 1 neg.atroru che penetrano nell'emulsione provocano la Ouorel.cenza e
I emissione d1 luce da parte del fosforo• che produce un'immagme · su Ila -n; , _ s1 O)scn·a
co~m1~hc, rad.taziom naturali, scner-aton d1 raggi X nelle vKman,e e/o rumore clcttnLo del
y~cow. circuito. M~iantc I mdodJ g1~ de-.cnt11 e una .... hcrmatura ,on piombo, quc,ta llldtuiom: di
quindi un aumento della 5ens1b1li1à, cui però s1 accompagna una n d u21onc de Il a n ~o1uZ1one
dovuta alla d1ffimone deUa luce che cm.i.na dallo ~ermo. fondo puo C\stre considere\Olmentc ridotU, anche ~ 11 ~uo ,·.ilore dcvc c:.-.ere !>empre rc-g1-
strato e tenuto in considervione 111 tun1 gh C)pcnmen11. ln akum \trumcnh ~1,tcnt1 m com-
Esposizione a basse temperature mcrc10 é poss1b1Jc sottrarre automaticamente 1I fondo
Se l'energia della rad1a.ztone 1omzuntc viene convert I I
r,_ nl, 1 a m energia ummosa (per esempio Tempo morto
con Ia Ouorograua o con bU schermi mtens1ficantt) s h
quale l'emulsione viene impr~sionat,1. La I • I a una vana2.1one della cmetlCJ con la Nc1· contatori· d I Gc1g
· .... r-,,
•1ull"r
.. •• velocità d1 conteggio elevata, viene per~ una parte degh
, ucc t eh b~ mtcns1tà e può aver luogo una. rc.1-
h
z1one mversa c e cam;elJa 11mmasmc latente che 515 t fi d , . e venti a cau$3 deI tempo morio d.."i tubo · Sono d1\ponib1h ta,ole di corre11one che do, rcbbe-
peratur.1 (-70 "C.) rallenta quC)l,l a orman o. Le\poswonc a bass.a . tem- - · conl...,"I pe~1. r-:cl contq;g10 a ,;cmttllaz1onc, mvece, ti
rc.wone inversa e garanhSçe u btl tà N ro es,cre utl I1Z2.1te per corregge" 1 ~oo
vi è invcc:e alcun vantaoo, 0 nell'est l' na sensi 1 maggiore. on tempo morto non rappr~nta un problema,
_. guue autoradtogr.ifia a bas~ t d eh I
netk a con cui viene impr~on,ua la .,,.11 1 d il cmpcratura, ato e a Cl·
r 1co a e 1versa Inoltre no aJ gl
mento esponendo pellicole pre-~po\te 1,. ·dJ n s1 ottiene cun nu 1ora·
e SOiio) "'boliSJ temperatura Geometria
tilizzando l.Ontaton • 1oninaz1onc con fine.tra, LOme
Prc-esposi11onc I
Quando s1 confrontano camr10111 tand,udizzare
u ••
la po,111onc.- dc.- I campione mpetto aI tu-
1 tubo Gc1gcr -Millle~, è im~rtante s e~ che , 1 entra può ,:mire, mod1fic.indo I.i m1-
Come dt"-,ntto in pre~eden1,a, la mpo~ta di un'cmul bo, ahnmcnt1 la fra11onc d1 rad1az1onc cm
lmearc, m~ &0!Jlll.mentc l l o~n-~ una t:><-. . sione fotografica all,1 rad.Jano nc.- non è
~ m1z1a1r lenta {I ) Il _, fa , egu1to unJ fase h- . \ Ura della rad1oatt1v1tà
ag a a qu.ue
 RIOOfOCICA E 6101 ()(,IA .t.lOU 01.ARJ T[C',1011 RADIOJS(ITOPICl!E 643
64.2

Chiaramente, quando )I d(.')tdcra confrontare c:imp1om di,crs1 e, m parucolare, qu.ind,1 51

14.J .2 Caratteristiche del cn111p1one e dell'isotopo
,·uole dimostrare che due camp111m contengono dl\er:.t" quantJt.1 dr radioa111v11.1, è ncco,Jno
con~1dcrarc gh a\pctu )tJll)tic1 dd cont~io. fortunat1men1e le: rcl.11Jom matcm.iuc.:ht' di
Autoa~~orb1mcnto
Po1!>~0n rendono quoto compito rdau,amentc: semplice, m quanto
l -.1utoa,\orb1mcnto \i pr~nta con gli ememtori 13 a ba~sa cner~11a· IJ radJu1one ncne a~-
sorb1ta d.il campione \t~\o. Co\11tu1~ un problema seno nel conteggio della rad10Jtt1ntà J
bassa enc:q;1a per meno J1 cont,llon a ~mt1ll.u1one, se 11 campione è formato da part1allc op o f 0111~1 totali ollcnutt oppure: (14 7a)
pun:-, ix-r c~cmp10. <,.C ~i trova mdu,o m filtri a mcmbrJna.. S1 deve porre molt.1 atten11one nel
l'a~a,urar..i la comparab1hu dei camp1om, pcn:.hé i metodi d1 5t.1ndardi7.Z,mone descnt11 m
prc...cdcnz.i non tengono conto degli effetti dell'autoassorbimcnto. :-:cl ca.w non sta poS5ibùc vcloc.:1ta ,.h conkggw )
(J = ( 04 7b)
ottenere campioni u111form1, quc...ti de\ono cs,cre digcnu o ~olubihz.zall prim.1 del conteggio. tempo
Vauio.1.,sorb1mento co~t1tu1~e uno dei problerm p1u ~n con I cont.iton Gc1gcr-Mullcr, m
quanto nduce )lgmfì~auvamcntc la scmibwtà e l'attendibilità. Con que~to tipo di contatori e Pertanto, per una misura wn un grado di prc:,b1onc del 'J5.5%:
molto dilfic1lc m1$urare m maniera attendibile glt emettitori a b.iss.t energia; mfutu questo è
)taro uno dea motiva pnncipah ,hc ha indotto ti pa~gg10 a1 contatori a 5.Clnt1llaz1one. conteggi tot.111 + ' V,on1egg1 tl,tJh (14 8)

Tcmpo di dimezzamento Per esempio, se sono stati rcg1s1ra11 1()()() .:ontcgg1, ti valore ottenuto può <:'>~re e-,pre,,o
x 11 tempo d1 dime7nmen10 di un LSOtopo (par. 14.1.5) è breve, è nccCSS.Jrio tenerne conto come 1600 ± 80. Qwnd1 e<,1ste una probabilità del 95.5% che 11 valore re.ile"' comprew tra
quando \I effettua l'analisi dei dati. 1520 e 1680. Quando I dati sono c<>prC))1 come J p.m o c.p.m., ullhzzando nuovamente una
probabilità del 95.5% \I oltlcnc:
Sutistica
I cmm1onc della radioaniv1U è un pr~~ Ca!>ualc: ciò può ~re dimostrato f.ac1lmcntc wkx1t!I d1 uintcgi,:10 )
(14.~)
dfettu;mdo una SC'nc d1 misure dcll'atuv1U d1 un ~topo a vita lunga. ciascuna per un 1denu- errore \U!la \.:locllà d1 ,on1cgg10 1 V tempo
co pc-nodo di tempo. I contegiµ ottrnuti non s;iranno mai gli ste~,. ma varieranno in un m
tcrvallo da v.ilon, con un.& frequenza maggiore al centro di cale intcr.-allo. Se s1 effettua un nu- Considerando lo stes.\O c:-,cmpio. se m un minuto ,1 ottengono I òOO \.Ontegg1:
mero ~uffi ... acntemente grande d1 conteggi e sa riportano i \·alori ottenuti m un grafico, ~i ottie-
ne una curva d1 d1stribuzJOne normale. Con un smgolo con1cgg10, qumdi, non s1 puo ottenere
un valon:- \C'l'O: ~i presume mve.:c che Lt mcdi.i di un numero elevato di conteggi .~1a molto v1
cm.i al valore ,ero. Tuttavia, l'.u:curate1u d1 questo valore medio dipcnder.ì dal!J denaz1one
errore ~ullJ w locat,\ d, u>n1cgg10 = 2 J( 1~} = !IO
standard (o) d1 quei dati. Secondo la teonJ \t.iristac.a, in una cur.'3 d1 distribuzione normale,
comt' qudfa OI0)tr:ttJ ndla figura 14.14, il 68.2% dei ,alon cJde nell'intervallo ± I o, mentre il cqumd1 l600 c.p.m.±80c.p.m . ,
95 5% rientra ncU'mtcrvallo ±2 o d.tl valore medio (x) (par. 1.6.3). Se i 1600 conteggi wno stati ouc:null in 1Ommull.

r---7

-, ✓I '10
A
errore sulla vchx:11.\ d1 conteggio o0)=s
.· -h l'errore~ paccntualmcntc lo ,1c~o. C.1ò dcma
.e e qumd 1. 160 c.p.m. t 8 c. p·m · S1 o,~n •ero
\. edelle misuraLiom, owero d1. .,;ontegg1, e Io \I< ,,o.
.l! dal fatto che nc:1 due cspcnmcnll 11 n~m I ninuto•allora:
f t~111munsoo1
Se si fo\scro reg1str.1u I 60 con -oo

errore sullJ vc.-1001.\ da ,ontc:gs1t

,:s,- ~ ( I ) -·,i;
Medi ►
Vetoc.u, d, conta
figura 14 14 Distn'l>unoncdc:lle,1:looùcLcontcggao1t10moalnl~--•· J .,. d
u, • 111~0 l' cvtmone sunu.1r , o e quindi 160 c.p.m. ± 25 e p.m.
 etOOIIMKA E BIOI.OQA MOUOOI.U:
nona, a.,JllOtSOl'Opt m
644 MS

/4,J.4 ANmta specifica

D1 seguito \Ono nport.itt aItr1· scmp lic• ~empi rel.1uv1 a una sene d1 \.Ontcgg1 cftcttuau m
un minuto. I'a111v1tà sp«tfica dt un rad10ootopoddinGcrb sm ndiomn Li nspmo alb quanutl di
contcg__~ I 00 qumd1±10% d1 t'Trorc per una probab1bta del 68 2 mJtcnale (per ~mp10 Bq mol , C, mmol o d_p.m. µmal Lr dmr produuna mettono m
commercio compo)II con diffcrmn ulon di uunu ~ ~ , oomposu am
conteggi I 000 o ~1000 qumd1 ±3% d1 errore p(r un.t probabiht.t dd t>S 2% .ltl1v1t.ì ~pcotica p1u clC'\-aU sono qudl: pw .:ostoSl. Latiluz.o di un rad10nucbdc am attn'ltà
spcc,fia molto .1lta offre I f>C'SUCOll \"mtaggl.
conteggi -1 O 000 0 = ~Io 000 qumd1 ±I% di errore- per una prob.1bdit.\ del 68 2
• poi.:.ono ottcnert' prodoru di reazione am ~~ llttM1I spcafia u:s.indo un pm..,u--.orc
\t
marcato (per ~pio sonde per D~,\,par 5 IO
Jn conclu~1onc, i conteggi per minuto dll'cntano tanto p1u accurati quanto p1u C' ~Ira la it'-
lootà d, conteggio elo quamo p1u /11ngo t ,1 tttnf'() d, conteggio. Nella pr:tuca comune I c:amp10_- • s1 aggiungono '-Olo piccole qu.mtill eh compom mm:a:i, qumdi I cquilibno ddle concm
trwoni dei metabohu non \"lmie ahtnto;
ni vengono contali fino a che ~i ottengono l O000 conteggi oppure per un tempo d1 I O mmutt,
qualunque dei due eventi ~,a p1u bre\·e, !>l:bbene per velo..:1tà d1 \.Ontcgg10 molto bUSC" ~•ano • il calcolo della quanuu J1 so.~unu ndncsu pcr pnpararc b ~ ra.dJo.ittlQ oon a.tt1-
ne..~san tempi d1 conteggio lunghi. v1tà specifica nota e ~pbfi.:ato. m qumto il amtnbmo alla <XJPCmtrllZIOnC' d.lto cblla ~
lu:uone madre rad10.ltll\':IC ~ l-echo!trc
In .tlcu01 cui, tutta\U, non e n~-a'>UlO a..--q~ il composto a:m I anr."lti specifia p1u
elevata disponibile.-. Per ~rio. 1dosaggi de&li mzinu m nn-o nducdono UN cono:nt.r.wo-
t ,, ~11•10 6 ne del sub~trato relau\ ...mcnu alta qumdi. in qucsu o r ~ s.i poò opcnrc con ann"lti
Accuratezza del conteggio )pcci fica piu b~ ~1 (0~1Jcn l'c,.cmplO nroruto .:h sc-gwto per ~ ddìrn7!01'I ddlc uruu dt
m1 ~urJ, ,1 veda la tahdl.114.101. ~
OO M Alì,l>A
t \lata .1,qu1~tata. ( H}-leu,ma con unattMU ,pc..-ifìa di 5.55 TBq mmol cqun ente a
Un campione viene cont.Jto per 10 minuti e fornlSCC 564 c.p.m. Qu.tl ~ l'accuratcna .,O 2..i;o mm ~no llC'\.--CS·
150 C1 mmol ) e una ,on,mtruionc d1 o.,,__'5 \tRA •"i -"'50 nun "'50
-
della misura a un hveUo d1 confidenu del 95.5%?
~ n I O, m' d1 una \OIUZlùnc 250 m\l e 3.- ~ .:m O I Jll-..1 an ). ~ \'lffle prq:,.uau con la
kI t l \
-cgucn1e pnxcJur:a· d
Per cakol,u e l'errore del conteggto, occorre utilizzare l'equazione 14 9:
• 10cm' a 3.7 kllq ,m .:mrt,p,.lndono:a'.r Ll\q I µCi,.qumdibisopl,ilaggrunc~
errore del conteggio = 2 ~564/10 = 15 -.oluz1011c madre del rad11,t--0top.., ID um pn>\'l"tLI rtt CS)trC ptù accurati, --i,•-·~.,.,,_
aggmni;ac I 00 mm 'd I una __ , JOnc'dilwta 100,'llltrma,-qw),
,....Ul
qumd1 J'm1crvallo di valon del conteggio .ti 95.5% di confidenza~ 564 ± 15 • "au1ung,,no 25 ,m' d1 una soluzmnc m.idrt I mM di lcu..--ma non mu,11.t.a c 61 port.a u
volume a 100 ,·1111 ,on a,qua disulut:a.
ideratt b quantlù di kucina non marcalll ncl~ prt'pl •
In qu~to e-.cmp1<1 non ,,--corre .-on, t.à b1ls<.--urabtk m con..-cgucnu Jcl.
111nl \ ,1 tr.att1 d, una quan1• •
14.3.3 Acquu to, conserva.zio11t t purezza de, composti marcati radioattivamentt r.umnc dt l H I leu,1n.t. in '-1 " no ( omr ,,uando si uttur.uno wlU11um
, • 1i i.a ~ t~-c" nC°re'\;l
)~
' "t
ldcvata att1\ltà ~pn1h.:a uu:a, •· btkapph.:-arel.i~mtefonnula:
Molle a11ende producono c.omposti marcali r.ld10a1uvamentc, tu. qu~te le prmc1pah ,o- cun un'att1, 11à 'l'«IIÌ<-"ll rclatinmmtc h,i,..a ' pow
no Amer,ham R1os.::1cnce\ pie , Du Poni, NEN e ICN Solitamente queste dme produttno I 14 10
forn1\cono 1~1ruz1001 dcnaghate Circa le m1ghon cond1z1om per la con,crvazmne dei m.ue \\ Ma (li/A') (I Al]
n.1'1 e mform,mom ,u1 <.ontrolli dt qualua c,egui11. Quc>to perché po~~ono "trtficar,1 d1, cc,, 1 non m,n.,to (m mg)• Af ~ ,-•u&ntltà d1 r:ad.io.ttUVtÙI rr~nte
11p1 d1 decompo)inone per esempio può a1•c:r luogo un.i dccumposmone intero.i rmiltantc do\r W ~ L1 m,1-..~ dd ._omro, 0 A l'atuntà ,pccUk."'1 del composto marcato (m
(in MBq), a il r<"° m• 1t....01 re dd ,.,mhrosto.( n \t= mmol )
da dccad1mcn10 rad10Jt11vo come "C. ➔ •~. oppure una dc1.ompo\1zione ~terna dmc altre
MRq mmol ')('A, l '.atti, 11.• ,,n.-;:1fia
-- n .. ,c,t.a t "'I
mokwle radioattive aNnbono la rad1aL1one eme~s..t cau~ando 1mpurcue. L'entità d1 que,tc
dccompmlllom dipende da molti f.inori, tra I quah la temperatura, l'energia della radiazio•
ne, la c.onLen1r.1L1one e 11 tipo dt prcpara11one del composto L qumd1 mdl\pcn)<lbtlc- con,cr- 14.J. S Scelta del radionuclide d1 ndc d.ùlc car:attcmt1<.hc dcl-
varc I rad11motop1 "eguc:ndo le btruz.1om dcll.1 d1t1a produt1n1.e e mantcncrh m c;ond12.1001 u. uonc ._-ompk~..a che pc
di slcnhta Se nc<.l:$~rio, è pornbilc u11J1u.ire pr<Xedurc uomatografi1.hc pcr wntrollarc la I.a scelta del rad1onud1Jc ~ Ull.l q ~~ bclb 14 0 sono ekn.:a•~ akune cualtensudte
purcu.a dt'1 compo,11 mar~au. I•c~renmcnto ~hc ~1 uc\'C
I
t
•ffrttU.lfC :-,;ell.t la ol
t·'·-·U m campo tu ogt,o
pnnc1p.1l1 dei rad101S(llop1 ,.,muncmcntc u WUA
 H llOC. H-IOU:COl MU T[(-.llll AADIOl~1Cll1< III

14.4 Vantaggi e limiti degli esperimenti con tra,.,· · d' · ·

~ 13 n 1Ira 1oatt1v1
t llel'ffl 7
Pnperuionr d1 una 10lu,ionc ad attività nota Probabilmente il princ11JJle VJIHag,.,o
rn de, mctod , d1 anali~,
· che utrhn.ino
•
_ • • r tracc,anu radio
attl\'I, n~petlo Jglr altri metodi chimru e (Ì\id, e IJ I<,r0 ,en~,b'I p
1 1t.1. er t'SCmpro, pn un com
"""'prcparan I litro dì
'\ H unduu 100 µmol ~m ' con uM raJioattt~ 1t.1 Ji 50 000 ro~to maT(Jto con I'H) M .può JrrivJrc ,1 un lJttore d1d1Iuu1one di 10 , M:n1.a "ompromcucr
tm Se unquono tutte lr muuramma m un cuntatore a .,;mulluione hqu1da, ne la rrleva,ione. t· quindi po~,rbìle rilevJrc mctabolit1, norn1Jlmente pr~nll nei tt-SSUIJ, a
un t del'°' u1 tu a daspom10nc unuoluz1one madre d1 I Hl•uridina conccntra11onr
• . • co,1 bas~e d.i non ef>,ere determanJbrl, neppur.e con I metod IC Ium,~, • p1u~ns1-
un .i $pt'(lfio J'AM a 20 C. mol , comt' il prq,.ira l, 110lu11ond bilr. L t! ~ecomlo grande vantaggio de, rJd1otracuantr è quello dr permettere lo 1aud10 rn vn-o
NB Af undm.:t 2•H , I Ci 221 10 drm con un aflì<lab,lrt,\ , upcrrore J qualsia}r Jltr.i tcrnrta.
~ 11.ili>la tn bc..--quttd. ._,falg~Jdo que,ti v,intagg, ~igmficatrvi, octorre com,derare anche alcuni lrmrtt. In pnmo
luogo gh ,~otopr, sebbene vadano incontro alle stb~e rea.noni, possono farlo a \'Clocuà dJITe-
Quoto prohlrma t unulr I qudlo ~U'ncmpao pm:cdmte .ulla lnmna. Corrt"g8ffldo rcnt1. QUl'Sto fenomeno è noto lOmc effetto 1,otop1co. Le diverse velo",u sono aprromm.ati•
pa un dfi.:-.cnu ~ 141~ SO 000 1..p.m '°"°
11.5 000 d.p m Mohaphando quoto vanu;nte propomonalt allJ diffcrenZJ di ma~ tra gli isotopi. li cJSO e$!remo ~1ha per gh 00•
top, '11 e 11, mentre l'effetto è minore per ' Ce "Ce prat1c.imente trascurabile per • p e • P. Jn
nklrr per IO per rurnru I un litro, 11 onamr un valott da d.p.m. cquanlmtc J1 56.J
pC I z_, I O'ilU Io 56.J µCì) l>.au 20 Ci mol , ..-akt>wc le moli prncnt i ...-condo luogo, la quantità dr w,tan,.a radioattiva impiegata deve l"isere La ptu pkcola po~ibi .
56. \ p(;i St..:JJ. IO" 211 5 µmoli). In un litro oo:orrono 100 000 J.lfflOh d1 le, comp.1ub1lmcnte con una misura Jttend1b1le d1 rad10Jt11vità nei campioni d.1 .mahzzare,
undtm; ddb nwu mo&«olarc quatr 10M 24.4 g. Le l .815 µmoli provmimta dal altnmcnt1 la radiJ7ione dal tracciante può provocare una rnpo,ta da parte ddl'org.anwno
rompoilO r.-dio.uu.o cormpondc,no a WJl1 O615 mg. qUAnlltl trucurabìk. Pertanto la ,tud,ato e co~ì distorcere i risultati. In ter1,0 luogo, sommim,trando il tracciante,~• fa aumcn•
tilpOlta t 56..3 pU ( !.OI MBq)dl ('H)-uridìna piu 24.4 geli widina. tare nell'organismo il ltvello del composto , tu<liato rispetto at v.1lori normali. I ri~ult..ati vanno
qurnd1 .sempre sottopo,u a un'analtsi critica.

Tahdla 14.3 Priodpal.ì ,:.auttrrutkhc ckgl1 nntttitori I' piu comunnnmtc u~h 14.5 Aspetti riguardanti la sicurezza
!lo-anugi
11.u.Qfllì:.-
JOCnD- -di
,,,_
r ~-"&ltlffl
--lO--- - - Il piu grande svantaggio pratico nell'utrhuo dc, rad101sotopi è rapprt"SCnt.ato ci.ali.a loro
n:,~tllll di ll'Ul'
toss1c1tJ., m quanto producono rad1az1om iomzzanll. Quando vengono aswrhite, le r~1oru
~ 150!0plu) oon l'ambirnll'
•.t?J fflmU spcàoc.a c.iusano la ioniz1.azione e la forma1ione di radica.li hberr; qu~11. a loro volu, interagendo Clln
r.J[C'ftl) isotor,co
AmpM IM!.adipmulOIII le macromolecole cellularr, provocano mut,17ionr del DNA e idrolm ddlr protnne. L.a t~1et-

-~
lltl«JalFOlbClfPIU'I t.i della rad1az1one non dipende w lo dalla qu,mtrtà pr~ntr, ma an...hc dlii.a qllllnlltà assorbì-
K.:icb=omolrocknu
la d.all' organismo d.t.11'energia della radiazione a,-.orb1ta ed.li ,uoì effeni b1ologi..1. Per ddim•
re qu~ IJ parametri cs1!>tono umtà d1 mrwrJ spec1fìche, Ongm,mamcntc, I.a pencolos1tl .klle
~
Ampu.atta4',--- udL.1210111 veniva nu~urat.a rn terminr d1c,posmone, una grandau chr csprrme la qw.nutl

-~
dilrsu:ratt.nDO~orpnk•

IJ'ld!n TmlpQ di d1ma.umenu, br~

TffllPO di dilllal.amffltO
della iomn.,11ionc nell'Jna. L umt.l d1 m1,ura <ldl'e,powione è il rocnq;m (R), d1e rappl"C'
~nu la qu,mt1tà dr rad1az1one che produ,e l.61 ,, 10 coppie iontLhe kg d1 aria) (oppure
2.58 >< IO• coulomb (kg di aria I ).
La quantità di energia ncc:ess.irra ~r produrre una corri.i rom,.a ncil'.ina ~ 5 4 >< IO • Joule
bdogia, ~ 111.ngo ( I), per e UJ I.i <1UJnt1tà di cnrrgia a,~orb11.1 cl.ili .11 ,a 4uan~, viene ts~isu a I R corrisponde a:
Anmtli ipfflfiu pni balla dJ p
MaoKmi,ik•g>
(LalOfl)
1.61 ,, 10 .., r; ◄ .. 10 u 0.00869 I ,lo.s J1 aria l

Nonoitante ,I rotnlgcn lii 61.ato u1,3to come unna di muura della ~ncolosua delle radua
I tcnpo di ~ brcw condiriona il casto
, la ~ d d l npcrl.mm 7Joru, oggr i: ,onsiderJtu in.idrguato f'<'r Jue rag1on1 Ul prrmo luogo. ,ame dcfimto in nten
• n ,....-..ndo lunf'f) 1a ,olUZUZJOnc o 1cncrgu r
Prr ~I r CUtlm mento aol.amcntc 111 1aggi X Io JJ r11gg1 Y, 1 ,..... - o-•
Ima FIIIClilU%IIDl!lr m 1uwnchop;if11 " 1- d
.. J t rial• ,
hl... u.1 •~n.1 tipa I mar: , , , 0 mpm• 1 tessuta ~"J,-mtr, t con ogm proNlnl ll a Id ,ng
- - - • 4'· • e ava ,-,ra,,t.:r,;n::,__-:, . . I_ d. quella ddl'arna
 lllOCllrMrCA I IIJOUX.IA MOU OOL,ru TI0.1Clll AADrlll'i OTOPIUII
643 649

rn- 0V\'lare a queste lim11ar1om t ~,.110 introdotto 11 concetto <l1 Jo~ <l1 rad1ai:1one assorbi
t.i (rad, rad,at,crn adwrkd ,io~) Il rad ,rene dcfinuo come la quant1ù d1 rad1,mone che pro- Flusso (nu~,o d part,ulle m., 1 •1
ltnv~rwmente propomon1le al quadreto della distanza)
duc-c un usorb1mento dr enngia rari a O01 I jkgd1SO)t.ant.a bsorbcntc 1 , questa unità J1 mr-
5ur.a t' ~tal.a mod1fi,ata e attualmente ,1 uttlrua 11 gra)', unuà d1 fflt)ura 51, che rappresenta l'as•
Klrb1mentodi I Jkg (aoè IOOrad) So=ì~!:
BqoC1J
/

~ ;g
Pur css.:mlo un'unita dt nu,-ura utile, 11 gra} (Gv) ,mcora non de!>Cnve adeguatamente la
Dose equ,valente (misurata ,n rem o 1,evertl
pc.-n,olo)tU delle radi.wom pn- gh organr,m1, nc:nu, m quanto 11 grado d1 pcncolos1tà b1olo- lespnme, d1nn, per l'uomo!
gt.:-a e dtpc'ndcntc dal tipo J1 rad1u1onc. S1 t r~ qumd1 nec~~no introdurre un fattore d1
corrl'Z1onc, noto cume wnghun~ factor (W), che ,iene ,alc.olato confrontando gh dktll b10
logici d1 quahllit uro d1 r.aJw1one ..on quelli prodotti <bi raggi X l 'un1t.1 d1 dose assorbu.1,
..hc ttene ..onto an,he dt quo10 fauo~ d1 c..orrc11onc, e 11 s1~.:rt (Sv), definito ,mchc do•.c:
C'Q\11\";llcnte In quoto moJo

(14. 11 I
- !~\ Dose AUOrb<ta (misurata ,n remo 11evert.1
l11pr,,,,. l'_,g,a 11S1,0rb,1a da qualslas, materiale!

I.a maggior parte dcgh l)0tor1 ut1h1u11 m campo biologico emette ra<l1.1z1on1 IJ, che pro
du,ono elktu b1ologict molto umili a quelli ca~u dai raggi X e hanno un wc1ghtmg factor ligura 14 15 La rebnonc (n rJd1oat11\1Lldella sorgmtt ed~ =rb,u.
uguale a I. D1 c..'O nSC'gUenu, pn- le r.1diu.iom I}, G\ S,· I.e part1ccllc a, dal maggiore potere
mnizuntC', sono molto p1u towc..he e hanno un "'e1ghtmg factor par, a 20, qumdt, per le r.a
d1wom a.. G,·::;. :!O 5v Dal momento chele nostre conoscenz~ degli effetll b1olog1c1 delle di dovrebbe la\'orare all.t do~ hmue p1u b~ po'>Srbtle, che ,1.1 raggiungibile m modo ragione--
"'C'TSC forme di uda.uione M>no m conuniu t'voluzione, t probabile che m futuro cambino 1 vole Quando l'operatore esegue C\pcnmenll che po,~ono c.iu~re l'assorbimento d1 rad1a.z10-
fanon d1 corraione do di\~i 11p1 d1 rad1.11ione. La dose assorbita da fonti note può e~re ru m misura superiore a un terzo o un dc~1mo della do~ lm111e, ~• devono uul1Zz..1re aree op•
calcolat.a conOKendo 1.t vrloc1ù d1 decadimento del r.1d1onucl1de, l'energia e il potere pcne- portunamente predisposte, dette .aree controll.1tc o -ol"\'cgl1ate. ~ella pratu:a. le ncerche m
tnmtc della radiuione e I.a distan,..a fra la sorgente e l'operatore Po1cht la rad1az1one viene ambito biologico raramente provoc.1no l'av,orb1men10 d1 una do-.c m1rnrab1le nell'operatore.
m1ou da una sorgente radioan1va m tutte le direzioni, 11 hvello d1 irraggiamento t in rda- J..c aree sorveghate wno comuni ne, laboraron, ma non ,cmpre nc<.cS-sa.ne (per esempio per
none .di aru d1 una 5fer:a, -4,;r . Cosl, I.i do~ assorbita è tn\'er$amente proporzionale al qua glJ cspenmt:nti con li e •e Lc aree controU.ite \Ono necc-,-..in~ 1.010 m ~as• spec1fic1 per
drato della dlst.anz.a dalla sorgente (r): m altn terrnm1, raddoppiando la dJ\t.1n1..a tra la \or esempio nell'immagawnamento e nella comerv111onc Je1:h 1sotop1 o ndl 1mp1ego di com-
gntlt' e l'oper.irorc I.a dose d1 radiuione ~orbita diventa qu.tttro volte più bassa. Una for posti rad1oatuv1 contenenti 1od10
mula utile è l.t ~entC': liuttav1a, un probiema mOlio ,eno in ambito b1olog1~0 è 11 rcncolo. d1 rad1u I'lnc ntem,1.
r
Q uesto ,enomeno "' t dall•• r•diazione che ,rene 1mme~\J ali mtemo dc corpo, per
e causa o p
dOSt" duunz.a dose dlSlanza (14 I~) , onc assorbimento artra,·c:~o la cute o percht c1 SI punge Ciò
esempio per m alwone mge,1r • dd
r d I wprattulto quando ~• l.i,·or1 con 1e co~• ctte sorgentt
rapprc-,cnta una ,onte I pcnco O d I' I d
La rcl.uJonC' tra luorgmre rM11oattm1 e I.a dose ass(Jrbita è illustrat.t nella figura 1415 ,• r parte d-'• espcnmcnll, in b1olog1a nch1e e ull 1uo 1
.1p, ·e c1ot hqu1d1 e gas..... m.igg,o 'I>' ~
La ,-do..,tà alla qwle una dose ,iene m i ~ viene ddìmta ,-c:10\.,tà di dose (dose rntr) ed è hqu1di r.1d1oatt1V1 Per 11 controllo della c..ontammmone n~cs~no:
espressa m :'>v ora • Quoto parametro~ pu akobre la dose totale. Per esempio, se una
• segu1re le regole local1, redatte da un uttltll.ltore;
sorp:nte r4d~tuva libera IO µ.Sv ora I t' l'operatore Ll\t>ra con quota sorgente per 6 ore, l.1
dose totale multa ~ 60 µSv • comportaf)1 cosc1cnzio5Jffi<n1e m Jabor.itono,
Attualmente I.a dose limne per ~-oraton espou1 alle rad1az1oni t 15 mS\· per anno per l'm· • •ottopors1 regolarmente J.J controlli,
tC'ro orgarusmo, ma quoto hmitc '1Clle raggiunto raramente dai biologi percht I hvclh di ra-
• adottare misure d1 contcmmc:nto.
dunoru US3te sono molto baui butono a-..L.1 11 J fi •
e muu spca 1c1 per cia.scun organo. I p1u 1m
"- ·ul.l in seguito a mgcst1onc: dr un r11d101sotopo t
porunti sono quelli per le mani 500 mS,· anno ) e~ r~- rJ erlSuWJOO
•.11 d eIl'occh"10 ( I 50 m Sv an· Il c.1lcolo della dose dt r.1di.wone rlu.e, d0 ..ono pubbhcate d.tlla lnkrnattonal Com-
no I,,: dOSI lunIle sono cosuntrmentc sot•- -rute a \'Cnfiche e, sebbene si.tno st.all fi,:.all dCl
r
c..ompIt, o ln1orma11ont
dettagliate a nguar
,azioni per c-.cmp10 m mc:rtto a c:,pcmncn-
nlon ~13, è contrano alle lmce "Uid.t con .,_ I . I I Protc:ct1on mentre va1u •
0
cor....te a 1n"C:llo rntcmaz10nale la\or,uc a quei 1• m1~s10n on Rad10 og1~a ' d I Nauonal Radwlogrcal r1otcct1on Bo.ird Tutta
vdl1 dJ ~mone, aot supporre che ,u , ffi l n..1ssono ottenere
u iciente non superare quei hm1ll per n~pettare t
1su vo ontan um.1m, \J ,.. hu: t udlo r.ipprcscnt,llo dal hm1tc annwiIe d I n un
a
tutte le regole dJ SJCUraU Al contrario bttn<,n, I I via, un eone.etto rdo111v.imcntc )COlP q
-o-- .app 1care I pnnC1p1 Al.ARA, secondo I qua 1~•
 anx.111~11(".A C BIOI.OGIA MOlH.OI.AIU
TI <~IC lii AAl>IOI\OTOPIOll 651
1150
,·1a deipento\O tosfa11. S~= sJ1 org.imsm1 o I tC'SSUU possiedono gh mz1m1 nc.:cssan per cn-
labdl.a 14 9 11m1t1 annuali rcr l'a~!oOrbimento (Al I) d1 alcuni 1.SOtopi di ~mu~ tr,unbc le vie: c..· interessante itah1l1rc il loro contributo rclat1,'0 ali ouu:L11.1onc: dd gluo.1'10.
Suilick - ALI (M8q) - ---N~ ALI (M8q) Entrambe le vie mmportano la completa oss1dwonc: dd glucosio :ad an1dndt carbonica, ma
•<C .H l'ougme di quc:st'uluma, m tem11m dc:1 SCI atomi d1 urbomo dc:I sJuc0$10 t dl\-crsa no due 1..-a-
'Il ◄80
t.3 \l (almeno nelle fa,1 mmah ddL, rc:sp1ruionc: dr substrati esogeni agg1unu) Co)\, e po~tbilc
I'
racco~here mediante un.\ trappola I arudndc: cubomu hbc:ratas1 durante la rcsp1razwnc d1
gluw,10 marcato m pmmom •1><-c1fichr per ocmpio t,. 'C)-gluCO$IO oppure ( I 'Cl•s!U.:O·
uonc (Al l,Amrn,i/ 111111 , ()/ Im,,lc, L ini:nuonc dt I ALI corri~pondc Jl1'as_,un1ionc:, dJ pJr- )IO, m cut gh .1tom1 C-t, o C-1 sono radì03ttr\1) e,'3!u1arc d contnbuto d1a.ucuna ,·,a ali ossi•
tc: J 1un.1 ra-.on,1, dt'IIJ do,c hm1tc pt'r 11 ,orpo intero o per un organo ~pc:c1fico. Alcu~• ulo• du1onc: del glucO)IO
rt di Ali ~ono dcncall ndla t.thclla 14 9. La gc.,11,,nc dell.1 protc:110111: da rad1.u1om e: )IOlllc: L ut1huo dei rJd10N>top1 nello studio dd tunuon:uncnto del ciclo d1 Kte~. o nd.la ,-atu-
nelLl m.1ggior parte dt.~li 5tall :-,;d Rc.-gno Unito le normo:sono regolate ~al R.,,11, '·"' ,,e: ~ub• t,1nonc: delle vie del catJhoh,mo del glucosio, co,utuiscc solo un ocmp10 dr come essi po~.,;i-
itanc.c, J\ct ( 1993) e d.11 lonmng Rad1,1tions Rc:gulauon, ( 1999) Ogni 1~111u11one nc:cc:~~1tJ d1 no trovJre applicazione nello studm delle ,,e mc:uhohchc:. l'ltcnon dettJgh su questi e altn
una cert1fiC11ionc, controll.at.1 d.tll'Ennronmental Protc:ction Agen,, ncgh L.SI\ o dall'l n\'i• ~empi, compre\e le: mcrodi.:he d1 doppia marc-.itura. s1 ~,;ono tro,.itt nCJ t~tl ,on\1ghau
ronmcntal .-.i:ency nel Regno Unno, e dC'·c: ~umere un rc,pon~b1le della ~icurczza (R,1d111- nel paragrafo 14.7.
11t1n Prc>lcl rrot1 Ad1·1sor).
Quando ~i uuhn,mo r,1Ll101<otopi, è ne,~no: Tempi di turno,c:r metabolico
• mantenere la maggiore dt~tanza po:.)ìb1le tra l'operatore e la sorgente; I radioisotopi rappresentano un ,trumcnto part1colarmc:n1' adatto rcr muunrc il tempo
mimm1u.are 11 tempo d1 C)posi,ione; di turnover di compo~II p.1rticol,m Come oemp10 ...uà ,on,1dc:r.ito il turno,n- ddlc: proteine
•
nel ratto. Un gruppo d1 ratti n,c,c mc:d1.1nti: 1mCZ10ne un amnunoa,1do marcato r:ad1oat11, a•
• uuhz:urc: una \<:hcrmatura protett1,a per tutto 11 tempo di ~po)1zione.
mentc: e viene lasciato a npo:,0 p,-r -'4 ore (pc:nodo ' ufli' 1c:ntc ,..,.rcht
·
,• l3 ~1or p.irtc: dd-
•
A opportuni mtc:nalh d1 tempo.,, -.acnh•
l'amminoac1do venga incorporato ne:Ile protnnc }•
14.6 Applicazioni dei radioisotopi nelle scienze biologiche • I.i r.awv.at
"''"'" li•' 1tl n- 1
c.ino gli ammali e )I drtcrnmu q.,1 or"'"'
,.,-- e: nt'I IC'SUtl ,hc mtc:rc:ss.ano JInI
-'utarc I• ,cki..ilà dr tumo,-cr mctaboh,'O ddlc proteine (onero e
quc:)tO modo e: po1>S1b1Ie \ .u
14.6. l Srud10 dt!l metabolismo •)• e n qu('.to metodo" è xopcrto c.he le protcmt deI ,,egato
tempo con cui vengono ~,~11tu1k • e1
~ · lc protcinc dc:Ua pclk e dc, mu-.coh d1 8-12 ,ctumanc: e 11
hanno un turno,cr d 17- I ., g1orn1,
\'ie metaboliche coll.igenc una ,doot.ì d1 turno,,:r mfcnoreal IO% all'anno.
I rad101~top1 ~ono spcs~o uuha.ati come tr.1cd.1nti delle: vie mc:tJbohche. In genere la
proccdura prevede: l'asg1u!lta d1 un tUb)tr,uo radioattivo, I• raccolta d1 c,1mp1oni del mate- Studi di a~~orbìmento, accumulo e trasporto
,tudio dl"I mC(,anwn1 e Jdk vclocna d1 a.,,or-
nalc: sperimentale a \UI ttmp1, l'C1trazione e: la -.eraruione per cromatogr.1fia (o con .1ltro 1r,1 d IOl)Otop1 tm,.3 no l,1...,
·o0
1111n1ci;o
•
nrIlo .
n ir<'am,1 ,iJ nelle p1.1ntc <.1.1 nc:gh an1-
mrtodo) dr1 prodotti. I t1\d,11ori d1 rad1oatt1v1t.'I ro~)Ono C1\Crc collcg.1ti a un ~istcma ero· bnnc:nto, ;ic,umuIo e: tr J\~'Or O t d1 ,ompo\11 org.im,i e: 1 < " '
d mrh e c..«uuonc e po,...1m1 i111.hc for-
matogr.ifico gas-hqu1do, o .i un HPLC, per rc:~1,truc: la rad1oattiv1t1 m uscita dalle c..olonne, . . d t "" $tlllO m i;<-ncrr • )(' c.
mah. fapenmcnu • quc,to 1,·- di '°mulo di molecole: d1 mtc:i-c,s.c b1l1logico.
durante la ~.uaZJone. In altemall\-a, la radioatt1v1ti può c:~'>t'rc nlC\ata ,u una la~trJ per nrrc indic.uimll \Ulla na d1 mgr~-,tl ,: sw ~• 11 a,~
crum•togr.ifia ~u c:irta o su ,tr.ito sottili: mediante un radmden~uomctro Gcigc:r-Mulkr o
un'autorad1ografia. In quc:Jto modo, uultzzanJo I rad101sotop1 ~• può confermuc.· )rc:nmen-
Studi farm:acologic1
talmentc: se un determinato compoito viene: met.iboh,uto attra\·c:no una parucolarc: , 1a • •nipi.imcnte uuhu.au e lo )Viluppo dr nuo, 1
dioi..otop1 ,on0 •
metabolica Per esempio, e po~1bilt prc"cdcrr 11 dC1t1no dei ~mguh ;itom1 d1 carbonio d1 Un altro \.ilmpo neI qu.1 Ie I r.t ·omph,ato pc:r,hr oltrc.•J d1mostrJrc sh c:lkt·
. ru«>larmcntc • •
("C)-acetato nel etdo dcgh a.:1d1 tm.1rbos.-,ihc1, o ciclo d1 Ktc:b). Sono \t.tti m~~• a punto farm.1,1 Quc:,to è un pro,n~ P-1 Ji -ontrolh prima d1e po~ c,'>Crc 1mp1c:
"""'1IIC una ..aie ~
mc-tod1 p<"r isolare gli mtermcd1 del Ciclo e dc:term1nuc la d1stnbuz1one dc..-glt atomi di carbo• li po,111vi d1 un farm31..0, o.:,orrt e,-c,- J ono dcic:rmmarc: 1s111 d1 ac,umulo del farrna-
mo 10 Oll<."Uno d1 ~s•. Questo proccdunc:nto prende: il nomr d1sp«ifirlalidlmg p,11tcrt1. ~e: il gato nel tratt,1mento chmc..o. P.:r e\eanpro, si C\. • ~uoi prodMII d1 dcgr ad.wonc I r,,dmtr a1.•
. I mctabo11smo e •
Mpattc:rn• trovato spcnmentalmentc auncrdc: con quello teorico, M ottiene: una dimostraz10- co, la su,1 vclo.:11.t d1 a«umu O e ,. nrnubib m tutte: quc:str arcc J1 studio. Per
nc c.he sta operando ù ciclo d1 Ktc-bs. dJ,nttur.i mw~t ~-- •
e.tanti 1,ono molto ullh, se non a d iali JA utx,ratum> (p.1r. 14 2.3) fornisci: m-
mtcrc 1amn
Un altro esempio dell'uso dCJ rad101K1top1 per lo studio del funaonammto di una v,.1 me- ~pio, l'autor.1d1og1111ia d 1~~•0111 entri.' le tccm,hc u.-.itc..· ndlo ~tud10 <lei mt•·
t.t d1 J,,umu1o, m d
tabolka, t quello del caubohsmo dd glucosio, chr può cucre ouidato attraverso d,,·cr,e vie-. fonn.12Jom sul SJtO e su IlJ ,·eIl "1 1 ..:ta e I prudo tu d1 dc:gra az1o!le
~IJC: 13\C:OC•
Ncsl• orgamsrm :aerobi, le due ,,e p1u 1mponant1 sono la ghcohs1scgmta d.tl cido di Krcbs e la Ù
tabohsmo ros\Ono cssc:rt ut I per
 BIOCHl~IIC.A I BIOLOGIA t.lOUC.01.\Rl TJCNICIII AAl>IOISOTOPIOI[
653

14.6.l .Appl,caz,0111 ,mal,t,clrr I ,1 \!PIO 8

Studi enzimatici e di legame
Come g1.l ,011ohnc.1to nel p.1.ragrafo 15.2.2, uttl1a.1ndo un rad1otracc1antc s1 può \cgu1rc
praucamcnte quah1,1~1 re.1Z10nc c1111ma1ica, purché sia d1,pomb1lc unJ form.i rad1oatt1va del
sub,trato. I do~gg1 degh cn11m1 ba~ti sui rad1otracaan11 -.ono p1u co,to,1 dt quelh 1.Un\'cn-
1wn:ih. ma \J)C~O oftrono 11 ,antaggio d1 una maggiore ..cn~1b1l11.1. I rad101~top1 sono d1 l.1r
go 1mp1ego anche nello Mud10 del mcccam)mo d'azione degli enzum e delle modaht.l d1 kg.i
mc Jc, hgand1 a re..etton d1 membrana (par. 16.3. l l
Analisi per dilulllonc isotopica
Moh1 compmll prc<.cnll negli org.1msm1 ,·,venti non poi.sono CMcrc dctcrmmall acc:urata
mente con le tecniche conven11on.1h, poiché sono presenti 111 qu.i.ntit.l troppo basse e 1m)cela
Calcolo della diluizione isotopica
1)0\H,l>A
Per dcternunare la qualll.ì nutrwonale delle proteine 111 un alimento 3 t,,1,e di 5.0l.t,
è ,t.ito detcrmmato il contenuto di hsma mc-di.ante analm per dilumone IM>top,...i
A un 1drohs.lto ac1do della protem.1 ( I mg) s1 aggiungono O:5 µmoh d1 ( I IJ-li,111a
( I C1 mol ). L'n c..tmp1one d1 lmna t stato purificato da.11'1droh~to mcJ1ante
cromatografia e l'attMtà spec1fka è st.ila dctcrm1nat.1111 un contatore a M:mt1llaz,onc
con un'effic1enz.1 del 25%. S1 è ottenuto un ,alorc d1 :?Oi'I c.p m. µg-•.
Qual è 11 contenuto %(\\ 'w onffQ pc>01pcso) d1 ~111,1 delle prolcme dl·lla \OJ.1?
NB: 1 Ci= 22.2 x IO' d.p m.;M, li~illJ = 1-1!\
lll!,1'1>, J \

ti con compo~ll ~1m1h. l'anah,, per d1lu111onc 1sotop1ca rappresenta un metodo accurJto e
con,eruente per r~olvere quc.,to problema cd evitare la nece~s1ta d1 isolare questi compo,11 m
modo quant1ta11,·o. Per esempio, la detcrmmallone della quanrn.\ d.t ferro m una preparazio-
ne protc11.a può c~rc d1ffic1Je con I metodi convcnzionaJ1, mentre è pos~1b1lc se è disponib1k
una ,orgente d, ·r c. S1 nmcclJ quest'ultimo con la protcma, qu111d1 si isola un campione di
ferro $W quale ,1 dctermma il ferro totale e la rad1oattiv1ta.
Se l'attl\ità \pcc:tfia d.t partcn1.a era 10 000 d.p.m. ( 10 mg) 1 e l'ani,,t.\ ~pccifica del tcrro
c~e e ,tato isolato è d1 9000 d.p.m. ( IO mgJ 1, la d1fterenu è do\'Uta al ferro presente nella pro·
tema (xl, c10c:
Per la ~luz1one d1 questo problema boogn.1 applicare l'equazione 14.13 Poiché
l'efficienza del conteggm cr.1 '°lo dd 25%, 11 conlCliSIO o,\Cn·ato ,·a moh,phc.ato p1:r 4.
0.5 µmoh li,ina = 74 µg. Quindi, u11l11undo l'equa110nt' 14.13 ~• 01111:nc-.
(2071 < 4)/1 = (22.2 X 1011 X O5 X JQ~) / (7-1 + X)
do,·c .\'. è il contenuto d1 h,111.1 del amp1onc Da que,,t,1 equu1one s1 ottiene:
x = 60 µgo al 6% del mtlhgro1mmo d1 Qmp1one proteico anahzz.ito.

9000 10000
IO IO+x (J.I.P) dalla depos111onc. Co)1, ,e il tempo d1 d1meuamcnto dd raJ101!>0topo è d1 un milione d1 ,m•
m, il campione a, rà due m1hom d1 .111111
qumd1x= I .I mg. Per una datalmnc >U lunghi penod1, 0ll0rrono 1sotop1 ,on tempi d1 d1meuamento !un
Que)ta te..nic.i viene ampiamente utilina1a per esempio n li tud d g1 I ghi, come 'U, 'LI e• i-., mentre per un.i d.ita11one a tempi brevi nene largamente utihn.ito
senti
111 tra,..t!. ' • e o s 10 e I e emenll pre•
"C. Comunque s1 deve sottolineare che le .1ppro!>)1maz10111 1mphcne nella r.1d1odata71one; ~-
no notevoli e che pertanto le et.a ~n.itc J;u palcootolog1 e dagh antropologi a, loro reperti
Do~ggi radioimmunologici
,ono sempre ~oggcttc a un certo grado d1 1mpm:~1one
, . Uno dei progrc)\i
d dp1u ~1gn1fica11111,
. di quC\11 ulum1ann1·, n•llc
~ IecmcI1e b10ch muc
· he.,,. )tato
w messa a punto Cl 0"1gg1 rad101mmunolog1Ci Qu~t t · ,.
ì.7,.tl qu.ile s, nmanc:b. ,1 «nJCa "stata d1scu\:.;i nel paragrafo 14.6.3 Altre appl,caz,om

Do1ta1ione con isotopi radioattivi Tec111chc di b1olog1a molecolare

I rcccnll sviluppi della biologia molc:colJre, che hanno portato a un noltvole progrt-..,o
Lln 1mp1cgc .111.il11ico del tutto diverso dei radio150t0 nella mampol.uionc genetica ,ono d1pe,1 111 gran parie d.111'1mp1cgo ?c1 rad101_sotop1 nel~-
(a~ I.i dc:tennmazione dc:ll'c:tà) diroc f, P1 ~ 1'3ppre~entato dalla data11onc:
cc, on11I e scd1men1 1 I11 h qucnliamcnto di D1'A e R~A. nella rephc-u1one e traS<m1one del D:-.A, nella ,intesi d1 l>N,a.
la propor7Jonc J, un elemento natur·'m t d' · questa tecnica ,1 a-.~ume e e
"' en e ra 1oa11ivo 13 I Al lOmplc:mentarc, nella tecnologi.1 Jd O:"\.\ ncomb111an1e e 111 molti ~tud1 ;1n,1logh1. Molte d,
momento della fo'l.\1h1U1ionc, 0 del dc:pos·t . ' ~cmprc a stc-s~ nel tempo.
I o, m111a i1 Jec:1d1m. t d 11•· d . qucqc kcnJChc ,ono di~u,,c in Jc11,1gho nei l.lp1toh 5 •· b.
Detammando la quantit.ì di radioisotopo cn o e 1,otopo ra 1oa111,·o.
nmanc:ntc (o d
dotto d, dc:1.ad1mento) e: conosct"ndo ,I tempo di dim misuran o I.i quantua del )U0 pro-
ne: Pt-r cscmp10, se 1I rod101SOtopo COStlluisu czzamento, e poss1b1lc datare: 11 camp10· D1agno!.i clinica
n.sult.i che d campione nt" contiene lo O •sn~ normalmente 11% dcll 'clrmento e d.111 111al1S1 . t~ uuhzzall 111 mc:d1cma, soprattutto ne, te,t d1.1gnostic1 li
I , aJ 101sotop1 sono amp1,11ncn • . ,.
·- w,M può afft-rm
are ehI." sono tr,"cor-.e due cm1v1tc
. d f I
t(\1 1 un11on,1htà po monare \lt·ne c,cl!UIIO
.
"
J1 mut111c u11l11.z.indo Xcnnn-133 ( Xl') l'<l è
 6S4 III0OIIMICA I IIIOUX.IA MOUlOUIU no11c11r RAPI0OOTOPl(II[
655

1abda a.a IO Umi• J, misura comunem.:nlr u11liu..itr per la rad1oalt1\1tl Sterilizzazione di alimenti e attrcu.iturc
l natii Abbmriujonc Ddinj7jone
------- C,lt emettitori Yad aha energia sono oggi largamente ut1hu;i11 ndJ'mJustna alimentare per
C.Ontq;ga pa mmutu ... p.m \doc11li rrgutrat,1 d, d,:ocad1mtnto la stcnhu.111onc d1 ahmcnu confc11ona11 come latte e urne :--=ormJlmente ~• u~no "Co o
o ~ !loCOOndo e p>. u·cc:; in akum casi ocwrre ,1cccr1.u,1 che qucsu 1rauamenu non abbiano elfett1 dannosi sul
Dumttgnnoru p('r n11nu1u dp.m \'cloatl ,t1e111va da dccadnnmto cibo ste~~o. Pertanto la do\< d1 rad1oatunt.t dt\C Spes!IO essere ndotla a un hvc.-llo al quale l.1
opa=ondo d.p.s. stcnhn,1z1one non ~ completa, tuttavia, anche m qul')te condmom si riduce notevolmente 11
UUk" (.a Numero da d p.s. rqul\,tlcnt1 • I g d, radio depenmenro degh ahmenu 'Co e 11 Ce sono largamente utdiuau anlhe nella stcnlizu11one
!3.7xl0 dp~I
di allmz.-iture m m.11enalc pl,bt1co, come cap~ulc Pctn e ~innghe. e nella \tenlìuazione d1
Millu:un~ mu C1x IO' o 2.22x 10• d.p m. farmaci m1ettab1h
Mkm..-une µ( I Cix IO •02 22xlO'd.p m.
lk,:qutttl Iun,t.t !,I) lltj Id pi. Mutageni
Tttab«qUttrl ( unitl ,11 Tnq IO 8qo27027C1
I rad101sotop1 possono cau~re mutwom, m particolare nei m1crorgam~m1 In molti ~tud1
Gig.ah«qUC'rcl ( umt.l \I I (,Bq 111'8q o2ì 027 mG mterob1ologici, ~peCie in mterobiolog1a mdum1ale, s1 devono produrre mutanti. Per esempio,
t . ~ I (unat.t '>IJ MBq IO· 8q o 27.017 µCa la mutagenesi mdotta da rad101sotop1 ~ 11np1ep1a per ottenere nuovi ceppi d1 un m1cror~.m1-
Ucttrom-oh t\' f nrrg~ .icqu1,1la cl.i un elettrone a,,dcrato smo, m grado d1 produrre un parucolare metabolita m1crob1olog1co con una re$.) maggiore.
aura~™> u~ d1ffn-cnu d1 polennile
da I \',~u1,.tlmtea I Il xlO 19 I
Rocnti;m R Quantità da rad1.v1one che produce
I blxl0 'copp1e1on1chel.g 1
1
14.7 Suggerimenti per uJteriori Jetture
R.iid rad Dose d, r.td1wone ,hc de1cm11n,1.
un worb1mcnto di mcrg,a d1 O.O I I kg 1 BIIUNG'TON, D. JAN)S, G G., MAI 81 p J Rad101.w1opn. 810s Scttnufic, Oxford I992.
Gniy Gy ~ d1 udunone che dttermm.i Dcscrl7lone dca pnnctp1,• d•IJ•
• , •,11 pla,v1om nelle b101<1mze. adauo
· a studenu e nceratun
I\' ~ HHSC. J.ttd
un as10rbunen10 da energia d, I J 1-g 1, a,~-soR, K.J., Mcw,,oo., I s Radrauon Pr<>tt<11"" HamlbookJor La1>arato'}' or . s
quindi I Gv =100 rad 1994
Rml mli Dose d1 r.id1uione che determina •1 I U pcrch1 o.,..ra in laboratono.
r. anua csu as1curezz.i r· I .• Moll'lularB,o/og)·andMolccular.\1cd1nnt.MYUS
un 4S<>rb1mcnto da mergia ndl'uomo S1 \J I Jt. R.J *Rad1oisotope$10 Molw1lar 810 ~ 1n
p.,n • I rad da raggi X R • ( d) 209 219 VCH New York 1996.
•n., e , • PP· • · ' rlla baolo a molecolare.
Stnm 'w Do~ da udwwne che cktcrmm.t RiaS5unto delle apphca11on, dei ra~ioa~ ~ / Annro!'h. 2• cd. o~ford Uni\·cn11) Prc:,(, Oxford
un aM<>rb1mmto d1 m~ ncU"uomo !>I.Ali R, R.J. R11dro1J-Otopts m Brolog> • A k•l rr
pan a I r., da raggi X, 2 2
00 . Il l.tzaone e ddl'uuhno della rad1oatu~1t.l nd campo ddu
qumdt I Sv = 100 rem De.cnZtone molto dct1agl1ata dc a numpo
ricerca b1olog1c.1
p.irucob.rmmte urik ndb diagno$1 J1 d1~funzmm della ven11laz1onr polmonare. I trst di fun
nonaLlà renale basau ,ull'aodo I 1odo1ppurteo sono 1mp1ega1i per la diagnosi di mfe11om
rmali,dt miuffiaenza rmaleo d1 $<]u1hbno della fun1mnr tra i dur reni.
Anche dfrcn1 uperu Jdl'orunologia s.ono Muduti ricorrendo ai rad101sotopi: tr.1 que~ti,
per cscmpm. la viu medi.a ddle cellule del 5,;1ngue, 11 \Olume ematico e il tempo di circolaJJO•
nt, tum p;irametn <ehe pomno ,,m.ire m particolari rnndwom clm1chr.

S1ud1 «.<>fogici
I r.ad1otraccw111 sono unp1q;.au soprat1uuo m campo b1och1m1co, diruco O farmacologirn,
ma poi.sono trm.rc apphQZlone am:.he tn sctton dJVttS1 come l'ccologta: m p.uucobre, po~·
sono cssc:n: scgu1u con rad101raccunu I m0\111lt'Jll1 m1graton e I modelli <.omport.unmtah d1
moltt- q:,«1e arumal1 t:n altra appbc.auone m campo ecologico è lo 6tudm delle uucne ah·
mmtan mfatu. rmdmdo radtoattm I produttori primari (fornendo loro composti mare.lii),
'1 può srgwrc al percorso della rad1o.:ittml1 nei ,uccess1, 1 anelli ddb atma aJunentare
 CAPITOLO 16

Recettori cellulari di membrana

J6.1 Recettori p er la trasmissione del segnale

Per c~ordinare fu,nzroni esscm:1al1, come la c~ta e il diffcrenz.iamento, e per rispondere

ai camb1ame~t1 nell ambiente circostante, le cellule di un organismo multicellulare devono
poter comunicare tra loro. Il contatto fh1co conl>ente alle cellule di interag.re ,1,;ambiandosi
piccole molecole attraverso pon situati nelle giunzioni di collegamento; ma s1.: le.: cellule sono
fisicam~nt~ separate .(fino a1 C.t.')i estremi di piante e animali) hanno bisogno d1 un !>istema di
comurncaz1one efficiente. Questo sistema utilJUa il nla:.c10 di molecole di legame.: che tra-
smettono il segnale, da parte delle cellule segnalatrici, e il ncono~cimento !>pecifico d1 questi
ligandi da parte d1 recettori prote1C1, c.he poS.)()no ~~re situati a c.ivallo della membrana cel-
lulare, o inglobati all'interno d1essa, oppure lcx-aliuati nel ato~l delle cellule bcnaglto. Fre-
quentemente, ù ligando è solubile m acqua e non puo diffondere attraver~ l:i membrana cel
lulare; quindi, s1lega a un sito di legame sulla superficie e,-1racdlulare del recettore. Il legame
scatena una serie d1 eventi, comvolgendo m molti Ca!.1 interazioni proteina-proteina all mtcr-
faccia della membrana, che c.au~ano una nspo~ta cellulare. Esempi di qul>sti tipi dì hgandi m
dudono ammme, ammmoac1d1, peptuh e proteine. Tuttavia, alcuni ligandi sono "°lubili nei
lipidi e possono diffondere liberamente .1nra,er-o la membrana e legarsi ai recettori del cito
sol. I complesM recettore· hgando po-.:,ono poi diffondere attra,cr~o I.i membrana nucleare e
accumularsi nel nucleo, dove modulano I.i trascrwone del DN .\ per questa ragione tali rccet
tori sono chiamati re,etton nude.in. Tra i hgandt ,he ag!,,cono con que!itO meccamsmo sono
compresi gli ormoni stcrcoidei (proge:,terone e,trogeno, testosterone) e glt ormoni non-ste-
roidei (tirossina, trnodotironina).
Un ligando che agisce su un recettore di membrana nene ~pe~o chiamato primo mc--~ag-
gero, dato che nel caso dr molli recettori di mcmbrJnl 11 legame non determina direttamente
la risposta cellulare desiderata. Pmtto~to e,,o provoca l'atti\'az1onc della regione intracellulare
del recettore che può SU\:Cessi, Jmcnte·
• iniziare una sene d, proce~1 di att1,az1one di proteine mtracellulan Lhe culminano nella
risposta cellulare, oppure
• interagire con una seconda proteina legata alla membrJna, che~ ~ua \'olta promuove la sin-
tesi, 0 il rilasL1o da parte di depo~1t1 mtraccllulan, d1 una o pm.molecole che _includono
cAM p e Ca• , chiamate ~econd, mc,!>Jggtr1, che diffondono e rcag1-.cono con ,-.u1e proteine
bersaglio, modificandone l'attività e stimolando, qu111d1, la n:,po~t.i (ellulare

In cntramb1 1 ca~1 una serie di r"..aziom mdKate nel loro msicmc come c.,scat.,, è co1m·olt..1
 BIOOll~IICA U810lOGIA MOI H 01.>.RI ~H IflllRI l I lll'IARI 11I MlMRRAN,
712 713

ndl.a tr.isdu onc del ....1gn.ik muialc, nce,'Ult) d.il rc,ettore, nella ri\p~~ta cellula~e finale. Uno (al 100~
do \';l.Jlt;igsi J 1un mtem.1 .1 ,.i~.ita ~ ,he s~ncra una forte amplifailZlone della mpoMa ccllu 0
E
urr, nspctto a quella che potrebbe c-,,sre prodotta dal \Olo primo mes~ggero (p~r ulteriori ..E"'
iii

dettagli sa ,'t'\h il p.tr. IS.5 3). l'uni,o ruolo fi,iologico del hgando che trasmette 11 )egnale è
;;;
promuO\"t'.R l.t ,'\lstJ1uz1one Jdl.i ,onform.i,ione at11,·a del _reccttor~. Per due delle tre clas.s1 o
:::
pnnetpab dì re,etton, il ,,,mple-..,o rndtore•ligando \'iene mternahzza'.o p.er endoc110s1; ciò
prm-o..a, ndle ,ondlllom a,1dc che prt:\algono nelle vescicole d1 endoc1tO)I, la d1ssoc1az1one ..
8.
.:
501-

"l-.
del lipndo. Il Tt\.'tltOTC' libcro puo e~re nc1dato o degradato (par. 16.6.2).
..
'iii

16.:? Aspetti quantitatiYi del legame recettore-ligando

..
8.
cc
o~::T::::::::~5,'!.J____...__.J
101 10 I 10 7 10 • 10 &
16.1.1 Cune dosr-ri,posta Concentraz,one d, agon,st1 11e111a logantm,cal

Obietti, i farmacologici
- Eff,cac,a crescente del farmaço
Da pnmi ,1u,.h '>UI legame recettore-hgando, molti sono Mati condotll su prepara1ioni d1
1mut1) isolato, per quMJtifk.ire e caratterizzare la risposta cellulare in funzione della conccn-
tranonc- dd hganJo. Lo \COpo prindpale d1 que\ti studi era rappresentato dalla ricerca di
hloccanu (l,gand blo,ker), c1~ composti che potes~ro mimare il legame del hgando fis1olog1
co. 5t"IlLa pero indurre una rispo,ta cellulare. Poten21almente questi bloccanti potevano essere
utìhzut1 in ,ampo farmacologico. !',/egli .mm Se~nla si ,ominciò a comprendere che, -eque-
sti bloccanti foSS(TO ,tati ~ufficientemcnte selemvi nel loro leg.ime, \3rebbero stati m grado di
distJ~uere tra le v.irie '>Ottoda!>.\i di recettori, di cui si ~ospettav.i l'es1sten1a, ma non erano ..
lii
ancora sute identitìate. L'ohtcnu di \OttodaS>1 d1 recettori avrebbe consentito lo sviluppo li..
d, bloc,inti effica..:t come agenti terapeutici, capaci d, interagire selettivamente con determ1- cc
n&tJ tipa d, tessuti e di mdurre una rispo~ta ~pedfica, mimmizundo quindi gli effetti collate-
rali ,ndesadtrau. Fu prupno )U quote basi che Sir Jame~ Black condusse i suoi studi pionieri Concentrazione d11gon,s1a lscal1 logantm,c.l
,taa wa recetton ~-adrenerg1C1 e ,ui recettori H. per l',stamma, che portarono allo sviluppo
del ~bloccante propranololo, usato contro l'ipertensione, e della cimetidina, agente bloccan- Figura 16.1 Curve dose-nçpo~t.1 (a) Andamento ddl'dfctto b1olog1Co (% mpetto illla ri>po,ta ma\s1ma)
~ del ~ H della 1«rmonc gutria acida, impiegato nel trattamento delle ulcere ga- riipetto alla con~ntr.izione J1un agom\ta, riportato mSe.Ila logantm1ca Un agonista pamale equipotente
striche e duodcnalL Comt 5i fflirà piu detuglialamffltc, questo metodo d1 classificazione dei P<l"iede un·efficacia minore mpetto a un agom\ta complc10:~ non puO rasg1ungcrc urisposta ma~una
nemmeno quando tutu, rrcetton d1spomb1li sono =rati Il valore d1 E4a rappr=ta la conccntrai1onc
reccnora, UAaDC alle nume ttcnichc di clonaggio e di identificazione dei geni cod1ficanta, ha di agoni!>la che produce ,I 50% ddl'effrt10 mmuno. (b) Cune do~•rnp<»t.i p~r qu.1ttro agom\t1 d1 potrn
pmnmo di admbfiarc per gran pane dei ttcettori numerosissimi sottotipi. u dive~ ma con uguale eflkacia (Riprodotto~ S R.J. Mm-di and 0.J. \\~b (1999), Rcccptor fon-
ction~. Mtd,m,r, 27; 5-9, con ,I permc-.,o di"The Mcd1Cme Pubh,hmg Company . )
Cww doee-rilpolta
La mJ'O'U dà recettori di membrana, m IC8llllO all'csposirione a concentrazioni crescenti
di hgando (do.cl. ongma una curva con tre regioni distinte: .d · I t , un dato re,cttore, condott1 usando ligand, con varie ~trutturc:
St ud I ose-nsposta re a 11•1u . • . • •
. I · h
moIeco ari, anno 1mo~trato che 1· reattori po,!,Ono legare hgand1
d . d1vm1 da quclh fi,1olo!_(i-
• una~ ìnwalc, al d, sotto della quale ~i auttva una mposta minima O nulla; . . . . .
camente attivi• • h · t , tale legame è vanabile. Come multato d1 qu~h ~tud1 , hgand1
• una f.uc crnccnte, durante Li quale la risposta aumenta rapidamente con la do~ e c e 1a nspo~ a u
dei recettori vengono cla~sificati come segue. .
• una f.&se ndb quale dosi crescenti prm-ocano wu ru~ta mmima e, infine, una rispo~ta fi- J d roducono tutti la ~tc,:,J mpo)IJ ,dlularc ma,,,ma, ma
nak nussanu. • Ago11ist,co111pltt1 Que~ll igan . ~ a ·r ra iungcrla (Figure16.I e\6.2).
1

diffen~ono tra loro nella do~ nchie)t pe gg

• Pmdit questi gnfia, da norma, promtano vanazioni nella concmtruione dd hgando del• . h ~ •ono \olo una mposta pamak an,he 11uando sono
I on:lme deOe cmtuwa di volte, com iene espnmerh 1n forma $Cmilogaratmica ( 1-ig. 16.1 ). • Agonisti parzmli Ligandi' e pri ~;,ire<.dtunwnoo..,upatdl1g. l6.l, 16.:?).
pre~cntì in largo cCU'.\\O e,quindi, tu
 RII fTIORI crilllL\RJ DI M L \ ! ~
~IOCIIIMIC.' L BIOU>GL, ~IOU:C.OIARF
714
71S
(al
• A11t,1go11ist1 S1 tratta di molecole che non producono .ikuna ri,posta: ne ~ono ~tate iden •
tifica te tre sottoclassi:
· competrtn·,
· · • revers,"b1/1: J'antagonis
· t a compete con l'agonista per lo ste~o sito Concentrazione e,
I . antagonrst,
di legame co,l che l'eftctto dell'.intagoni,ta può e,sere annullato aumentando la concen -.
"-nte d1antagon!Sla

trazione dell'agonista (Fig. 16.2);

2. a11tagonist1 revt•rs1b1/1 non co111pet1twi: l'antagonista ~1lega al recettore in un sito diverso
da quello dell"agonist.1; quindi il loro effetto non può essere annullato aumentando la
.:oncentranone di agonista;
3. a11tago111st1 competit1v1 ,rrevembi/1: l'antagonista compete con l'agonista per lo stesso si-
to d1 legame ma l'antagonista forma un leg.ime covalente con il sito di legame, cosi che 1I
suo effetto non può essere annullato aumentando I.i concentrazione d1 agonista.

Come conseguenza di questa dass1ficazione, è poss1btle caratterizzare I ligand1 sulla bai.e

dei parametri elenca li d1 seguito. o = --=:e::=====--
10~
.t::::::;~::: I I
10 10 7 10 t 10' 10 •
• Attività intrinseca Misura l'abilità cli un agonista di mdurre una rispoMa da parte del re- Concen1111z1one di agonista esca•- 1og
cettore. \'iene definita come la risposta massima dell'agonista analizzato rispetto alla rispo· "' antnucaJ
sta massima d1 un agon1Sta completo che agisce sullo stesso recettore. Per definizione tutti (bi

gli agonisti complelì hanno un'attività intrinseca pari a I, mentre gh agonisti parziali han- 100
no a111vità intrm= < I.
o
• Efficana (e)
!..
M1~ura l'ab1lìt.\ di un agon1s1a di 1niz1are una risposta fis iologica m seguito al •E Agon,sta completo
legame al recettore. L' inizio di una risposta è correlata all'abilità dell' agonista di promuo- • agonista parziale
ii
vere la conformauone attiva del recettore. Sebbene tutti gli agonisti completi debbano ave- o
::
re elevata efficacia, i loro valori non sono necessariamente uguah, infalll I valon d1 e non
hanno alcun massimo teorico. Gli agonisti parziali possiedono una bassa efficacia e gli an-
.X so
.:
1agonist1 hanno efficacia nulla.
l
•
;;
• Pote11::a f. una misura della concentrazione d1 agonista necessaria per produrre l'effetto
massimo: quanto più potente è l'agonista, tanto minore sarà la concentrazione richiesta. La
..8.
ci:
potenza d1 un agonista è correlata alla posizione della curva sigmoidale sull'asse logaritmi- o
co della dose. Viene espre,sa con varie grandezze, una delle più usate è la dose effelliva o
Concentrazione d, ag<>nl5ta !scala logan1m,ca)
,onu·ntrJ✓U>nc per ottenere il 50% della risposta massima, ED~. o EC,,.,. Nel caso di un gra-
fico ~emilogantm1co, s1 ottengono I valori di pED~ o pEC,,., (cioè - log,.ED.,.). Quindi un "!gura 16.2 ln1eraziom re.:euorc•hs,indo. (al In p~nu Jì unmtai;orusu, la ,1.ma do~•mro-1.1 dell'ago•
agonista con EC,. uguale .i 3 x IO ~ M avrebbe un pEC. di 4.8. n1~1a complcto s1 spmla ,erso d1'Stra po1.:.he l',8')m,ta ,om~c per il lrg.ame .ù ~,eno~. P1u alta~ I.i con .
<tn1raz1one d1 ,rn1agon1sta, magguirt i: lo ,po,1amen10. (b) In pmcnu di un agom\ta paro.ile, la cun·a Jo -
• Affimt,l bpnme la con centrazione di ligando necessaria per produrre il SO% di legame. ~ -n ~pos1.1 dell'agoni~ta c.1111b1.1 fonnat \l .1po,1.1 ,·mo dc-,tr.1. R1prodouo cl.a S R.J. !\la.xwdl and D.J Wcbb
Quc,to è l'unico parametro che può es.sere utiliualo per caratterizure gh ant.igomsll. ( 1999), Rcccplor FunlUOm..\lnf1, mr; 17· ;,-9,,on il pmncsSO di "Tht !\lcdJCJnc Publishmg Comp.in> ':
Come ~arà moMrato n el paragrafo seguente, l'affinità dipende sia dalla velocità di J\SOcia-
rione del ligando con il recettore, sia dalla velocità d1 dissociazione del comple)\O nsul-
t.inte. La velocità di associa,ionc, a sua volta, dipende dalle interazioni trid1memionali tra Meccanismi di funzionamento dei recettori
i due, mentre la velocità di dissoc1.111one riflette la forza di legame del complesso. L'affini L'csisten,a di agom~ll e antagoni,ll fu originariamente ~piegata con la Icori~ a due $lati de1
tà può e~~re cspre~:,a da una costante d1 affinità o d1 legame, K., ma è piu comunemente relettori not.1 anche come modello C.1stillo-K.111. Il modello a~ume che I recettori occupali
e-.pres\3 come costanle d1 dis~oc1az1one Kd, del comple~o recettorc-hgando, dove K è P0!.Sano ~sistere m due forme 111 equllibno tra loro, una matU\a ARI e una .itti\·a (AR• );
ugull· al reciproc.:o d1 K,.
-
d
_,. AR·
A + R ...- ~ \R
• \eh-N11•1tà :O.li,ur~ l'abi(ita di un ag~nista di discrimmare tra i vari sottotipi di recellorc. ra:cuorc re,;c·1orc
agoni\ta rcccu,,re
Quc,to parametro e part1wlarmentc importante dal punto di vista terapeutico. ma111,o •lt1\l>
111au1I0 om1p.110
libero 1,.;rupato
 BIOCIILMl(;A l BIOWGIA MUUCOLARl RfC ITIORI Cllll'l,\RJ DI >.!!Mllll,,..,_A
71C,

Fu 1pot1Z2.1to che gli agonisll potcs,ero rapidamente indurre un cambiamento conforma mento dell'equihbno tra i due ,17
z1onalc m R, generando cosi lo st.11Oattivo R• e spostando l'equilibrio totalmente verso AR• so hmue e si ottiene qua d sia11 del receuo~ ,.
, n o 1 \'al d " e ~1de111 h
mentre gh agonisti parziali dovevano avere un.i minor capacità d1 indurre il cambiamento e, I agonista induc.i la confor1n . on I K e K sono I e e e il modcllo a due ~tati t un~
a1ion moto p1 li Il --
quindi, potevano spostare solo parzialmente l'equihbm,. Gli antagonisti non potevano indur comportamento ricordano e altl\'a del recetto I <Co . modello non richiede che
h - Wmodel!
e angeux p iuttosto che il mod o SllllJnetnco d1 allos re recenor eh
re alcun cambiamento. Tuttavia, la scoperta che alcuni recettori sono attivi anche in J!>Senza d1 I e mo,trano qu~ to tipo d1
agoni.sii e pos~1edono atti\ 1tà cmtitullva, ha portato a sviluppare un nuovo modello chiamato Recettori con attimà cc,•t I eUo d1 fii indouo pr tena propo,to daMonod \\\man e
. , 1 ut1va 54 °posto da K hl '
d1 ,dez1onc conformammalc, nel quale si ipouua che nello stato d1 riposo (cioè in as~enza d1 nel ca,o d1 recellori accop ia >no si.111dentifìcau fn o, a_nd (p.u. 15.5; F1g. J~. 11 ).
quah1asi agonista) 1 recettori siano m equilibrio tra un insieme d1 forme attive (R· e inattive p lJ alle proteine G I ,anali ion1e1 controllatt da hgandi e

(R), che possono rapidamente mterconverlirsi. L'equilibrio può essere totalmente spostato 16.2.2 Parametr, del le
verso lo stato inattivo oppure può emtere una quantit.\ significativa di forma attiva, che spie game recettore-1,gando
gherebbe cosi l'att1vtrà costitutiva osservai.i. Secondo questo modello, gli agonisti si legano li processo generale dd I
preferenzialmente allo stato R•, stabilizzandolo, spostando qumd1 la posizione d1 equilibrio e rigand o frmo alla superficie del
egame d1 un I d
r igan o il un rec.,nore comi .. . . .
causando un aumento dei recettori nella conformazione R*. In modo simile, gli agonisti par- attraverso una serie di e Il . ccrttore proteico. Qw d !io, d ne,~ <On I.a d1ffus1one del
. . o LS1on1 C3s"·" .,..n o >1 pt1,1z1on.a J d I
ziali possono legare entrambi gli stati Re R•, con preferenza per R·, dando ancora come mul- in male può coinvolger. """con la suptrfi<ie Jd >u MIO I egame
tato finale un aumento della percentuale di conformazione R', ma comunque minore di quel- generalmente formato ~:mminoac1d1 che non iOno pane in:«;~ore d1~emb_rana. 11 legame
lo indotto da un agonista completo. L'1den11ficaz1one d1 ligancli che riducono J'attantà di re- lato nel modo seguente· pochi \J)eClfic1 amm1n~cid1. Il 1..,.,!e ~~~del \Ilo d1legame finale,
• -.,.. 1 e può CS-.(re rappre-.en-
cettori con att1v1t.ì costJtuttva ha fornito un supporto per questo modello. Poiché s1 nttene che
gli antagonisti non siano capaci d1 combinarsi con lo stato attivo e non producano alcun cam-
R + L
biamento diretto nell'atti\ltà del recettore, questi ligandi sono anche chiamati agonisti inver RL
s1, m quanto hanno attività opposta rispetto a quella degli agonisti; essi infatti si legano prefe- recettore hgindo ( 16.1)
COtllplCSM)
renzialmente allo stato R, stabilizzandolo e spostando l'equilibrio m suo favore. Agonisti in-
versi pamali si possono legare a entrambi gli stati, con una preferenza per lo stato R, quindi
reccnan~
diminuendo l'attività costitutiva. Ligandi che hanno una st= affirutà per entrambi gli stati do~e k ., rapprese~ta la costante della \do..1ta d1 as.'°'·
loc1tà d1 d1ssociaZJone. amonc, mentre k , t la co~tante della ve-
non sposteranno l'equilibrio e sono chiamati antagomstt neutri Tenendo conto del fatto che 1
recenori possono avere attività costitutiva, molti composti, che erano stati classificau come
antagonisti, analizzati nuovamente sono risultati degh agonisti mvers1. l',;aturalmente questa Studi di saturazione
nuova valutazione è possibile solo nel caso d1 recettori che mostrino attività costitutiva e, al Se nelle cond1z1om d1studio del legJme la cc,ncentraz1 i .
momento, essi rimangono una minoranza. La tecnica della spettroscopia d1 risonanza pla- giore rispetto a quella del re.:ettore (I . d ,, i ne totale del hgando t molto mag-
a ,o,i etta CODwZIODe d1 saturaz · b.
smomca (par. 16.3.2) si è recentemente dimostrata in grado di distinguere tra queste vane nella concentrazione del ligando. dovuti al l~m il ione ' I cam iamenti
classe di ltgandi. m t I -,,-..e con rccenore, p0\Sono essere ignora(1
en re e vanaziom d1 concentrazione del recellore libero (non legato.) '
li modello da selezione conformaz1onale .i~ume che le varie forme del recettore ( R, R•, AR, trascurate. Qumdi se: non po~,ono e~sere
AR') siano in equilibrio, cosi che le loro proporz1om relative risultino determinate dai valori
delle costanti di equilibrio associate: IR.J è la concentraz!one totale di recettore che determina la capacità ma!>Sima di legame
IL] è la concentraZJone d1 hgando libero
(inattivo) R R' (attivo) (RLJ è la conc..:ntraz1one dd ,omplc-<0 l'('(ettore-ligando
+ + allora IR,J- [RL J SJrà laconcentraz1one del rMttore libero.
L L
. All'equilibrio, le vel()(1tà delle rewoni diretta e tn\eN per il legame e la d1,sodazione del
K. ', ltgando (equa11one 16.1) '>Jranno uguali:

(in.1tt1vo) LR LR' (attivo) J. 1(1R.1-1RLl)( I ]=J. (Rl]

K,
di con,eguenza,
~ caratteristica importante di ~uesto modello è che il ruolo del ligando (L) è qudlo di le-
garsi a una particolare conformamme del recettore, stabiliznndola e cauc,ando uno sposta• ([R.J-IRLJ)[LJ
= Kd= = ( 16.2)
kI K, :Rll
 RfLITfORIC I I I l L\RI UIMI MBR.\N.\
"l(,OIIMIC.\ [ 11101(\(,IA MOI OCOIARL

719
doH• K.•4 rapprc.enta la co!it.lnte d1 d1'110,i.mone
- per I·1 compI· - RL_e K è la coHante d1 a~o-
e~~~
cwmne o di aftìmtà. Riarrangiando I equazione in altro modo s1ottiene:

(16.3) .!...
(RI
fll

Determinazione di K.i
Figura 16 3 G
L'equazione 16.3 r.ippre~cnta un•ipcrbole rertangolare, dalla quale si deduce che, man ma- s11J k: • rafico dì 'Ka1cha rd ( )
\"Ju nu coopttatl\11.l,, b) due per a un <l.llgofo gruppo d1
no che la concentrazione dd ligando aumenta, il legame recettore-hgando r~gg1ungera u~ va- · < un stngolo ru gruppi di Slll ~ cooperatJ-
lore hm1tl'; quindi, il pro.:~o d1 legame al receuore è un processo che arnva a satu~z1one. (d) un singolo grupi lpo di Sili con cooper.n1vitl positiva e
i su, con cooperativu.-1 negativa.
L'equazione pre!ienta l'!i.lttamentl' la stessa forma delle equazioni 15.1 e 15.2, che defimscono
il legame dd sub~tr.1to al suo enzima in termini d1 Ka, e V....,. Per la determinazione sperimen- Come alternativa ai grafici di Se
tale d1 K;, conviene tr.1sformare l'equazione 16.3 in forma lineare; mediante una semplice atchard, si puo
G rafìco di Lmcweaver-Burk - ncorrereai seguenti:
modifica dell'equazione 16.3 si otuene l'equazione d1 Scatchard (16.4):
I
1RL) ,R.) [RII - = + K.i « -
,:: ( 16.4a) B B,,,.. Bm.i, ILI
ILI K.. K.i (16.7)

Questa equazione predKe che riportando in grafico [RL]/[L) in funzione di [RL] s1 otterrà Grafico di Hanes
una lint'a retu dt pendenza 1/Kd, che comente di calcolare Kd. Tuttavia, in molti studi la
ILI
massa molecolare relativa del recettore non è nota e, quindi, non si può calcolare la concen- =
trazione molare d1 [RL]. In questi casi è accettabile esprimere l'intensità del legame in qual- B
{ 16.8)
,..iasi umu disponibile (8), per esempio pmoh (lo• cellule) ', pmoli (mg proteina)·' o più sem-
plicemente rnme una variazione di fluorescenza {AF) m condizioni sperimentali ben defini- _Nella pratica, i grafici di Scatchard sono quelli il
te. Po1chè 11 legarne massimo (8.,....) s1 avrà quando tutti I siti del recettore sono occupati, cioè po1chè la vanabile sperimentale B co ptu ut JZZat1, sebbene siano soggetti a errori
· J' mpare sta ne1 termia • • .
R] 8,_, l'equazione 16.4a può essere scritta nella forma: s10ne tneare di questi grafici sovrastuna sia K B Ix s.1a m quelli y, cosl che la regres-
chc quando i siti del recettore sono saturat d s1a à ~ Dall equauone 16.2 s1 può dedurre
Questo è analogo al caso m cui S = K i pder me~, aoè quando B = 8_,_/2, allora [L) == K,i.
(16.4b) . à d. m quan o v, - V /2 (par 15 3 I) Q . di
Untt I misura la molarità. ,..., · · · · um Kd ha come
La derivazione dell'equazione 16.2 si basa sull'assunzione che . .
Quindi un gr.1tìco d1 B/[L) in funz10ne d1 8 darà una retta con penden,.a - 1/Kd e intercetta cettori omo · h . VJ sia un unico gruppo di
'>ull'a,-c y uguale a 8.,..,/Kd (Fig. 16.3). Qualora la massa molecolare relativa del recettore sia
. ~ene1 e c e non VI sia cooperatività tra loro nel legame delle
1 1 . re-
In pratica esistono però altre due poss1bil1tà: pnmo, che vi siano due ;;o eco e del_ligando.
nota, l'equazione d1 Sc.1tchard può essere espressa nella forma:
re~ttori, ci~cuna con costan11 di legame d1l'erse, secondo, che vi sia c:0;~~1:1:::~:nte d1
ali mter~o d1 una singola popolazione. In entran1bi t casi il grafico di Scatchard sarà ga7e
( 16.5) neare (Fig. 16.3). Se si ipot!Zla la cooperauvit.i, questa dovrebbe essere confe t non 1•
un grafi d . Hill il J U rma a attraverso
1co I qua e, ne a sua forma non cinetica, è rappresentato da:

L: )
dove" è il numero di '>iti di legame md1pendenti sul recettore.
L'espressione B!Bmu rappmenta il numero di moli di ligando legate a una mole di recetto-
log = /dog IL] log>.d
re. Se quc!>ta grandezza viene espres~ come r, allora: ( 16.9)

r n r oppure
= (16.6)

In questo caso un grafico di r/[LJ .:entro rdara d1 nuovo una retta con pendem.a 1/Kd, ma log (;3 ) mu B
= J, log ILl · logK,
l'mteHNta :.ull'assc delle xsarà uguale al numero di ~iti di legame, 11 , ,ul rcletton.·
dove Y è iJ grado di saturazione frazionale dei \lii di legame (da Oa I) eh è la ,ostante di I hll.
 810C HIMICA l BIOWC.IA MOUCOLARf RH.f TI llRI G.!UJL,\IU DI Ml \1811.\!>'A
720

Per un recettore .:hc abbia \iti di legame multipli ,he fun11onano in modo indipendente, Quindi riportando in g • 721
,, 1 1
rallologR
h I, mentre per un re1.ett.nc con siti dt legame mult 1ph interdipendenti, li può essere sia "> I 230
. ·' ,; . ' te permette d . contro d tem
(coopcra11,1t.\ pos1tha) ~ia < t (,oopcratint.\ nega11,·a). Grafici di S(atchard che mostrano . La co~tantc <l1 a\,ou.i:;~~:a;c k . po, \1 otterra una linea retta di pendenza
dut' fasi, .i 1.ausa della multi, alenza dd hgandn I cio~ siti d1 legame multipli) e non perché v1 11 metodo ddl'approuio Il'• ,.~prcs~ in lmol dm", t 1
si.i ..oopcrat!' 11à tr.i i re-.ettori. sono 1.1lvolt.1 interpretati nel modo ~gucnte. Le due regioni continuamente fino al .i equ~ubno, con d quJlc 111 ' cmpo ' si può Mimare utilizzando
• raggiungi . egame del li d
.ippro~,imat1vamentc: hnean, poste alle e~tremità dei grafici curvilinei, rappresentano siti ad (,ondmoni di p\eudo p mento ddl'equihbno . d. gan ° viene monitorato
lllta allimtà (alto rapporto legato: libero a bas~a concentra11one d1 legato) e a ba~sa affinità nel tempo mentre ' LI r1nmoord1ncp1Uttostochl"dcl ::cncoJn 1zd10111 n_ellc quali Lj » IR,J;
• m.1ne costa t l 1 ~ on o or me in o d • •
(b~w rapporto legato: hhero ad alta rnncentrazione di legato). Le tangenti a queste due por secondo l'equa,ione· ne • I legame del hgand •. cui "•I unmu1s,e
. o aumenta in modo ~ponenLiale
210111 dd gr.ifid po,,ono e~ere utiliuate per calcolare i valon di K. e B .. In realtà questo
pro,cdimento non è c:orrctto, in quanto i valori e~tt1 possono c~ere ottenuti solo attraverso lo B,q ) - ,
l'analisi dei dati d1 lcgaml' con un'attenta analisi matematica, in genere utiliznndo program• g ( B,q-B, - - 30l(k IL)+k,)1
mi informat11.1 d1sponibih in commercio. ( 16.12)
quindi un grafico di log 1B '(B 8 I
(/,, (L] 1,, ) d "' 'Il ,J contro 11 tempo
f.sperimenti di legarne competitivi ' + • ove Brq e B, sono il h •ando le . I.J~a 1meare, con una pendenza di 2.303
Conoscendo k (ottenuto con il metogdo di'>Cugato all equilibrio_ e al tempo ,• r1·spett 1vamente.
L:n metodo altcrna11,o per la detcrmmazione dei valori d1 Kd per un hgando spenrnentalc,
lato dalla pendenza della retta. sso '>Opra) e ILJ, 11 valore di k può essere calco-
,on~1ste ndl'ut11ino del ligando come inibitore cornpctillvo d1 un secondo ligando, normal-
mente l'agon1st.1 fa1olog"o, la cui Kd è nota. Ciò permette di calcolare per 11 ligando 111 esame
un valore d1 k . che è numcnc:amente uguale al suo valore d1 Kd.11 metodo p1u comune consi- 16.3 Tecniche per lo studio del leg .
ame recettore ligando
ste nell'u11huare l'agonista fisiologico marcato radioattivamente, variando la concentrazione
del hgando sperimentale e mantenendo fissa quella del hgando radioattivo. S1 riporta poi m 16.3.1 Progettazione deg/1 esprrimentì
gr.ific:o la pm:entuale d1 legame del hgando radioattivo contro il logaritmo della concentra
1ione del ligando che s1 stJ analizundo. S1 calcola poi il valore di IC. (concentrazione nchie Problemi sperimentali generali
)l.t per inibire il legame del ligando fis1olog1co del 50%) per il hgando analizzato, Conoscendo
11 Hll1re d1 IC,., ~i può ,akolare K, utihwmdo l'equazione d1 Cheng-Pru\off: La velocità e la percentuale del legame recenore-ligando t influe . .
mei"'a_h _come temperatura, pH e forza ionica. Inoltre bisogna cons1d;r:~aa1:u~:r;:~~; spe~-
IC,., s10 ogici. Per esempio se s1 usano ceUule intatte come fonte di recettori è fondame tal cmi '.-
K=- (16.10)
• II+(fl )IK,i)I mizzare gh effetti dovuti al tra(Jìckingde1 recettori (par. 16.6.2), altrimenti il nume~o d~ :~:::
ton potrebbe ~anare durante l'espcnmento. Questo problema si può superare in vari modi:
Determinazione delle costanti di velocità • eseguendo I esperimento a bassa temperatura, m genere S •e,, m modo da mirnmizzare i
processi d1 traffickmg;
Per dctcrrn111m: la co~tante di d1~1azione k, (tempo') si lascia formare parte del com
pl~o_recettore-hg~ndo (B ), usando 111 genere hgand1 radioattivi. I recettori non occupati so- • includendo nella m1'>lela d'incubazione un 1111bitoredel 1raffick111g, come os.\1do di fenilmina;
no po'. bloc,all, a~mnge~do un e.:ce\so d1 almeno I00 volte di agomsta non marcato O dian- • utilizzando recettori 1solat1, o frammenti d1 membrana, piuttosto che cellule mt.tttc.
t~godm\~a1 co_mpdcut~vo, e s1 ~ e nel tempo la d1m111uzione della frazione legata (B,). La velo·
Storicamente il metodo p1u ut1hZ1ato per\CSwre la formazione del legame recettore-hgan-
cttà 1 n ascio el hgando r.1d1oatt1vo dal suo MIO <li legame è data dall'espressione:
do è stato l'1mp1ego d1 hgandi rad1oatun e la misura della rad1oatt1nta assoliata con la frazio-
dB ne d1 ligando legata al recettore. Tutta, 1a, questa tecmca non permette una facile determina•
= I.: B Ztone delle coManll di ,doc:1ta ed è molto costosa -.e s1 devono anal1ZZare un gran numero di
dt
ligand1 contro recettori orfani, CIOC quei recettori I cm agonisti naturali sono sconos1.:1u11, per
e 11 rilascio \egue l'ei.pres)tl>ne: e~empio ottenuti da hnee geniche clonate. Per tali rag1oru le tc,mche fluorimetriche sono di-
ventate molto popolari e per rag1o111 "mili sono ,tau sviluppati \Jggi di legame di ligand1 mi-
niaturizzati ba\ati sulla tecnologia dei m1aoarra~ d1 proteme par. 8.5 e 16.3.1).
quindi:
Preparazione dei recettori
log B, log B 2.303k r
( 16.I I) l ,.~ prepara11om dI recettori· utili"'le nrr Dh studi di kgaml' p0\1.0no e\sCre ottenute la-
,_.,,. r - e, •
scia d • I h r. distru"~~ndola con conseguente nlamo del recdtore; il
n o mtatta a mcm rJna oppu t :-<
 i10CtnMK.... E BIOLOGIA MOU COU.Rf RH.E'TTORI Cfl.llJU.RI DI t.lDfBIW;.,.
722
·
ass1curars1 · che abbiano le t n3
secondo procedimento può essere realizzato con o senza conservazione_ d1. frammenti dì s esse carattenst1ch f
membrana. In alcuni casi sì pos,ono formare vescicole con orientazione vanab1le dei recetton soprattutto, controllare che tali e u1121onali dc:i recetton nat· • 1, •
h recettori siano d.i IVI. e importante,
e diversi meccanismi di controllo. Un ulteriore possibile problema, derivante dalla d1struz10- e e, per esempio, la protema rccettonale su t an t1 incontro ai procb,1 po~t-traduzion:i.h e
ne della membrana, è che questo processo può esporre recettori che inizialmente non s_1 trova- Il metodo migliore per ~e s ata comttamente gh,o~ilata
. à d. d gu1re studi aneua all .
no nella membrana cellulare, causando quindi una sovrastima del numero d1 recetton dispo- c1t in 1v1 u_ah è utilin.are t•..~:nIl·he dI patcb ·)a O :..:opo d1 determinare le cost•n.;
a u
d"I VC10-
nibili. Questi recettori potrebbero essere quelli soggetti a endocitos1 (par.16.6.2) oppure a sin- erron dovuti alla diffusione del hgand _, • mp (par 16.3.2), che con,entono di e\itare
tesi e inserzione nella membrana. ton nei· tessuti. intatti
. si può,.__,, o 41 recettore·...,.
, - determma.uone
. del numero da re et•
.
bilmente uhhzzando un antagonista. -"wlft lllMcando I recett '-
In assenza di fosfolipidi, le proteine recettoriali di membrana presentano scarsissime pro- on con marcatori rad1oattiv1, preferi-
prietà di legame o non ne mostrano alcuna; perciò, per gli studi di legame, un recettore pro- l'autoradiografia quantitativa Un codmpealtit1,o irre-.ersibile e ricorrendo alla tecn11.--a del-
. meto o tematno I
teico purificato deve essere introdotto in una vesocola di materiale fosfolipidico. Le prepara- emettitore d1 positroni [per esem C) con,15te ne marcare I recettori con un
s1one d1 positroni (PET). pio e applicand0 la tecnica ddla tomografia per emb-
zioni di recettori piu comunemente utilizzate comprendono:
• sezioni di tessuto, generalmente spesse 5-50 µm, tagliate con un criostato e fatte aderire a
Ligandi
vetrini ricoperti di gelatina;
• cellule isolate ottenute mediante distruzione meccanica o enzimatica (collagene o tripsina) La tecnica certamente piu utilizzata per lo studio ddl .
ne quella che prevede l"utilizzo d1 li di e mteranom m:ettore-1,gando nma-
dell'intero tessuto; 1. G al gan marcau con ~topi radioatu,·1 come H 1c, p s e
1. e~er mente viene utilizzato un bgando ,he abbia un·devata atti\ità s~cifica. ar
• colture cellulari (cap. 2), avendo cura che non siano contaminate;
14.1.6) m modo_da ~1mm~ 1problemi don111 a legami non ,pecifici h edi piu avanti~. li
• preparazioni di membrane cellulari ottenute applicando una serie d1 tecniche diverse di di-
metodo alternativo p1u efficace e rappre-;enuto dall'utihzzo ddb ,pettroscopia di fluorescen-
struzione cellulare, seguite da centrifugazione differenziale; za, discusso nel paragrafo 16.3.2.
• preparazioni di recettori solubilizzati, ottenuti mediante impiego d1 detergenti per la di- Per lo studio delle mteraz1om hgando-re.:ettore che av,engono su una,~-•- di· tem · · fi _
struzione delle membrane, e purificati con cromatografia di affinità, usando un antagoni- · · al ili' . . ~.u.a p1 in e
non m 1secondo, b1,ogna util1ZZare te...,uche )pe.:1ali per assicurare l'arrivo del ligando al
sta competitivo come ligando immobilizzato; recettore (vedere i metodi a tlu~ interrotto r a ,morzamento nel par. 15.2.3). Una di queste
• recetton ncombmanti, ottenuti utilizzando linee cellular1 trasfettate con geni clonati d1 re- tecniche part1colan utilizza I co,1ddet11 .-.1g;-d comp,.11111d. Questi compo,ti non hanno pro-
cettori, sempre più spesso di origine umana. prietà di legame; tutta,1a, a ~110 dt fotoh,1 indotta da una luce la-.er a una lunghezza d'onda
specifica, si ha la rottura istantanea di un gruppo protetta,·o. die maschera un gruppo funzio-
Le seZJom di tessuto costitu1Scono il preparato migliore per studiare la distribuzione e il nale fondamentale, e il nla,c10 del hgando attivo.
numero dei recettori mediante autoradiografia o spettroscopia di fluorescenza. In questi pre-
parati lo studio delle cinetiche d1 legame è complicato a causa di barriere alla diffusione.
Procedure sperimentali
l recettori presenti su cellule integre isolate vengono utilizzati per numerosi studi biochi-
mici, tra i quali le modifiche post-traduz.ionali, il meccanismo di inserimento nella membra- L'approccio ,pertmentale generale per lo ,tudlO della cmctKa del legame recettore-ligando
na, la regolazione negativa (down reg11lario11) e lo studio dell'accoppiamento recettore-rispo consiste nell'incubare il preparato contenente il recettore con 11 ligando, in cond1Z1oni di tem-
sta. Tuttavia gh studi di legame condotti utilizzando cellule intatte presentano una serie di po- peratura, pH e forza 10m,a ben preci~. per un penodo da tempo sufficiente a raggiungere
tenziali problemi: l'equilibrio. f: nnportante ncordarc la necNII.Ì che il \btema raggiunga la cond1z~one di equi-
librio, m assenza del quale le equazioni 16.1- Ib.9 non ,'algono. Uuhzzando un appropriata
• le cellule possono contenere enzimi capaci d1 metabolizzare il ligando che s1 sta studiando,
procedura anahtlca, vengono quannficate le molecole d1 hgando legate e quelle non legate.
riducendo quindi la sua concentrazione effettiva;
Questa d etermm,1z1one puÒ rl.chtedere la separazione delle . .
fraz1om legata e non legata. Tale
,.
• il traffico recettoriale e altri processi intracellulari possono influenzare il numero di recet- . d . t.l .. •ndo diwrse concmtraz1om del hgando nell intervallo 10-
tori e, qumd1, il legame; Proce ura viene ripetuta u 1t...... .. . _
9on- d. trazione di l't(ettore fis'>.l. l multati che s1 ottengono, cngo-
.,,o I 1egame massimo, a concen • d 11· il d
• può essere presente p1u d1 un tipo ~ellulare, anche se l'utilizzo delle tecniche di clonaggio . . . . d I equaztoni 16.4-16.9, ncorren o ,pe!.so a aus 10 1spec1fi-
no qumd1 analizzati app11can o e
ed espressione in una determinata lmea cellulare consente di superare questo problema.
ci programmi informatica. dei hgandi ..ono stati e,egu1ti manualmente, ma s, 1lupp1
Le pn.11araz1om d1 membrane cellul.in sono sperimentalmente utili come fonte di recetto- Storicamente, gh studi di legame il . aggio di <'cmi hanno permcv,o lo "1luppo
recenti deli,l b 10Iog1a mo1ecolare' soprattutto ,.1on
d ·lmonc, " per
, il gran numero d1 recettori
ri, ma sono pnve delle componenti citoplasmatiche che potrebbero essere coinvolte nella re-
golaztone del legame del hgando. d t I d al11 ·on •krat~ ,-apa.ita i "
l ecn1c 1e. veloci 1 an ' • L < , • )OJ amente potenzialmente mterc,sanu. o\ku -
" r . ., . ta ma iam1a,o1e"'-
I relettun ricombinanh sono sempre piu utilìuati per .,
'-'h •tud
• 1·d1' I,...game, ma è necessario
· oriam, d1 funzione sconosciu u prohlem• '>Jranno da,cu,,c piu a,anu .
ne delle tecniche utihuate per ri..oh·cre qu~
 Bl(l(~L\11U I 8101.(X.IA MOlffO~Rf R[(J;TIORI CfUUURJ 01 ML\IBAA.~~

725

Legame 1011le

Membrana
r-------
-----
Recenore • logandc)
R•L •• RL
sem,permeab,le ------ ---- ------ All'equilibroo. la conrentrazlone
d, logando non 14111110 6 la atlttW
_ _ _ _ Legame specifico L1g1ndo 1n entrambi gli ICOmpana ~I• celle

Vigura 16.5 Studio del l"'>mc r• _ 1

•.,.. ''" ore-11guido I R L) -"··
· m,w.ontc la tc<"n,ca della dial~t alrtqwhbrio.
Legame non $pec,f,co
s1, il più 5emplite dei quah t> la centnfu .
te la frazione di hgando legato ,,·a I gallone. 8\5ogna fare attenuone che il pellct contenen-
, J\oto per nmuowr 11 d I
lav~gg10, ve~ga minimizzato il proces\O di dt,'>OCI e 1 •gan ° non egato e che, durante 1}
tod1 alternat1v1 includono la diali51 11. b ~•one del ligando legato dal recettore. Mc-
a equi1I no e I ultrafiltrazione.

ug1ndo 16.3.2 Procedure ana/1t1c/1e per lo studio del legame recettore-1,gando

Figura 16.4 Lq;ame spcc1fico e non specifico da un hgando a un recettore da membrana. u curva relatava al
legame ,pt.-ofi,o normalmente t apcrbolau e mostra satura11one, mentre quella rclatrva al legame non spc-
c,fico ha anchmenlo lineare t non t facilmcnlt saturabile.
Ltgamc non specifico
Indipendentemente dalla tecnica analitica scelta per separare il ligando libero da quello le-
gato al recettore, un problema che spe= si presenta è il legame non \pcc1fico del ligando, il
quale può mtcrag1re anche con s1t1 diversi rispetto a quello specifico. Questo legame non spe-
cifico può coinvolgere lipidi di membrana e altre proteine localizute nella membrana o rila-
~iate dalla procedura di isolamento. La caratteristica del legame non specifico è che non è sa-
turabile, ma ha un andamento approssimativamente lineare rispetto alla concentrazione tota-
le <ld lìgando. Di conseguenza, il legame che si os!>Crva è dato dalla somma dei legami specifici
~turabili {iperbolici) del ligando con il recettore e dei legami non saturab1h (lmcan) a siti d1
altro genere. L.1 componente di legarne specifico s1 ottiene solitamente in maniera indiretta,
cond~cendo studi d( lega~e in prese~za d1 un ecces~o di ligando non marcato (agoimta O an-
i.agonista), nel ca\◊ m cui venga ~t~h_vato un ligando marcato. A causa della presenza di un
cc..esso d1 hgan~o no~ marcato, •. s1t1 d1 legame specifici non sono disponibili per i) ligando
marcato, che q_u_md1 s1 dovrebbe hm Ilare a legarsi a siti non specifici (Fig. 16.4). Nella pratica,
\I do:rebbe uuhzz.are una concentra1ione di ligando compellt1vo pari almeno a 1000 volte la
\Ua K.4, cer~and~ d1 \aiutare~• n~llc condmoni sperimentali utilizzate, quello che si sta stu
d1Jndo
. sia eff<'tt1vamente 11 sito d1 legame non 5pecifico• A tale ....
uopo ,~3 rebbe necessano ut1-
l111a:e un certo numero di hgandi competi11v1 differenti e strutturalmente diversi, 111 grado di
fornire una ~t1ma accurata del legame non 5pec1fico.
Procedure che richiedono la separazione delle,__,
mwoni. 1I.bere e 1egate
D,al,s, .all'equi/1brro Il recettore e ù hgando. c~uno m un tampone con lo 5te~,0 valore di
pH e d1 concentrazione, vengono po,11 nelle due met.l opposte di una cella di dialisi. La cella,
c~e generalmente ha un volume interno totale pan a mc.a 3 cm·,e comtuna di materiale pla-
stico trasp_arente come ù Per5pex ed~ d1rn,a mdue met.l ~parate da una membrana semipcr-
meab1le ~• acetato d1 cellulo-.a o d1 nitrato d1 -cllulosa, montata 5u un supporto merte. Sono
d1sponib1h m commercio numero~ vananll, alcune delle quali costituite da gruppi fino a sei
celle. Un termo~tato controlla la temperatura della cella, che nene ruotata lentamente m mo-
do che il sistema po~ raggiungere l'equil1bno. Le molecole di hgmdo, piccole e capaci di dif
fon_dere, attraversano facilmente la membrana finchè la concentrazione di molecole non lega-
te sia uguale su entrambi I lat1 della membrana (Fig. 16.5). 11 recettore è confinato 111 una metà
della cella. Ali'cquil1bno, da cmcu.na porzione della Lella vengono prelevati campioni da ana-
lizzare rispetto al ligando.11 campione prdc1·ato dalla pane della cella contenente ù recettore
darà la somma delle conccntrmom d1 hgando legato e non legato, mentre quello contenuto
nell'altra metà darà umcamentc la concentrazione del ligando non legato, che sarà uguale a
quella presente nell'altra metl dellacellacontenente 11 n.-ccttore
Per ottenere multati affidabili, e ne.:ess.mo che 11 legame alla membrana ~emipermeabile
del ligando e della proteina !>la m1mmo e che la conccntrwone 1ontca totale 111 ciascuna met.\
della cella 513 la stessa, 10 modo da minimizzare ogm poss1b1lc d1fferenu d1 canea nei due
compartimenti, che potrebbe influenzare la distribuzione del hgando (efk to Donnan ). I li-
miti di questa tccmca sono rappresentali da.I penodo di tempo rela11vamentc lungo nece,,!>ario
per raggiungere l'equilibrio e dal fatto che tale sistema non può ~,ere applicato qualora 11 li -
gando sia una macromole,ola come l'tmulina, dato che essa non potrebbe diffondere attra-

Separazione del ligando libero e legato vcr~o la membrana.

Gh studi di.legame lht ut1h1t.1no hgand1 radioattivi richiedono Ia separa11one

· deIle fraz10•
· "I ,., 11· ando in una ~oluzione tampone vengono po)ti in una cella
u, tra,,1traz1011e Il recettore e 1 •S ,
ni d1 hgando libero e legato al rc,ettore. Questa separazion•, 1
· può t · t . ll C eredi volume pari a 1-3 cm ),contenente una mcmhra-
· ,• o tenere con metodi d1vcr- ermostat1camcnte contro ata tn gen inerte che funge da ba,e. Dal momento che, per ù
na \Cm1permeab1le posta ,u un supporto
 Rf.U ITORI tD.UlARJ DI MlltllllA.'li.,
BIOOIIMICAE BIOUluU MOLLI O IARI
726 rn.1
• aumento o d1mmuZJone deU
raggiungimento dell' equilibrio, non è nch1esta alcuna diffus1~ne attravaso la membrana, tntens1u della Ouo
caus.i d I cambiamenti nello smo rcscenu (e qumdi della~ quantica. Q J a
questa condizione s1 può realizzare m tempi relativamente rap1d1 (pochi mmull, ma que~t~ l'Umeoto dovuti aJ l""'am J ··' li d
• cam biamento dello S""ttro d fl . .,. e a ga.n o;
dovrebbe essere controllato spenmentalmente). Una piccola quanlltà d1 campione ( 100 mm ) r I uorcscm,u ùot
corte oppure piu lunghe; • spostamtnto ~-er~o lunghezze d 'ond.i pià
viene spmta attraverso la membrana, applicando una pressione gassosa o, più semplicemente,
ponendo la cella in una centrifuga a bassa velocità e centrifugando a nrca 3000 g p er p o.:h 1 • cambiamento nd tempo di \ IIJ d ,,.
. eu.i 11uorescenz.a, T,
minuti, e poi raccolta dalla parte opposta. Analizzando l'ultrafùtrato ( che conllenc solo hgan • cambiamento nella ~sibiliu d I fl f,
do non legato) e la miscela d1 reazione (contenente il ligando legato e non legato) è possibile luce polari.aata. e uoro oro all'md uzione d1 fluorescenza da parte della
studiare l'influenza della concentrazione del hgando sull'entità del legame. li Yantagg10 d1
questo metodo consiste nella sua rapidità, anche se è importante controllare la formazione di
eventuali legami dei reagenti con la membrana e accert=i che il volume dell'ultrafiltrato ven-
L' analisi del legame di hgandì a re ett
stazio n an o (misura singola) 0
vallo dt tem po) m gene
ltt'
ò
i°"
pu t"';serc dfettuata mediante m isure m stato
ruo hne tempo misure multiple in un determinato intet•
ga mantenuto al livello più basso possibile, per mm1mi:u.are la possibilità che la procedura di re con tecru, e ;a flimo mte 11O ( d (I
(quench-flow) (par. 15.:?.3 ). rro ,toppe • ow) o a smorumento
campionamento sposu l'equilibrio. Come per la dialisi all' equilibrio, neppure questo metodo
è applicabile allo studio di hgandi macromolecolari Le misure d1 spettro">Copia di fl
seguenti effetti fisici. uorc:sctm.1 an stato ~onano '>Ono hasate su uno dei tre

Tecniche per lo studio del legame non richiedenti la separazione delle fraz.ioni libere e legate
• Cambiame~ti delle proprnù ,pe1tro~p1che ,oeffidente d1 e\tinnone, lunghezza d 'on-
Saggio d, scint11/azione di prossimità (Scintillation Proxmuty Assay) In questa tecnica il recet· da di emissione) del fluoroforo, mdotu da camb1amen11 nel ,uo mi. roamb icn te ddermi-
tore presente in un frammento d1 membrana viene legato covalentemente a sfere di scintillan- natl dal lega.me del ligando. e o altermom neUa diffu,1one del recettore nella membrana
te e il ligando è marcato con emettitori deboli di particelle~ come 'H o '' ·J. I reagenti sono mi- come con,eguenza diretta dd l~amc del hpndo. Cambiamenti dcll'inten~ìt:i d i fluo re-
scelati in una cuvetta fotometrica. Quando il ligando si lega al recettore, le particelle ~ provo- scenza ( ~ \engono u11hzu11 per nusurarr al legame del lig,l(ldo, ,tudiato in fun zio ne
cano l'emissione di luce da parte dello scintillatore. La luce emessa è rivelata da un fotomolti- della concentrazione di lii:ando ( uuhz:z.ando I F,rafi, 1di $.:.ai.hard o Lineweaver- Burk p er
plicatore e quantificata, permettendo quindi di misurare il ligando legato. Il hgando non lega- calcolare I valori d1 K4•
to, distante dalla superficie delle sfere di scintillante, non causa l'emissione di luce, dato che le
• Induzione di ani\Otmp1a d1 fluorcxmu (l'am'>Otrop,a e la uriu1one d 1rezion.ile nelle
particelle~ a bassa energia, emesse dal hgando non legato, sono assorbite dal mezzo di reaz.io-
proprietà o ttKhe - ìn que,10 ,a-.o la tlUttre,,cnu - lungo l'a~ paralldo e perpend1colare):
ne circostante (par. 14.2.2).11 legame può essere seguito in modo continuo.
in questa te..:nica ~1 mdu,c tluo~<'llza utilizzando luce (blu) polarizzata , u un piano. Le
Spettroscopia di fluorescenza Recentemente, l'utilizzo di tecniche basate sulla fluorescenza mole..:ole d1 tluoroforo onentate p.ir.illdamente a qu~to piano ,aranno eccitate in m od o
s1 è diffuso sempre più; queste tecniche, infatti, sono ultrasensibili, non richiedono la separa- prcfcre nzi.ile. '>e akunt' J1 que,te nll,le.:ole ruot.ino dopo l'as't0rb1mento della luce, m a
zione delle frazioni di Iigando libero e legato e permettono d1 studiare il legame di pochi li- prima <-he an cnga la fluore ,,cnza. un.i pJrte Jdl.i fluor~cnza m ultante -.arà depolanzza-
gandi, o addirittura ligand1 individuali, e singoli recettori. I principi generali della spettro- t.i (lioè no n ptu , u un ,ingoio piano). L'mten,1t.1 di que,to fenomeno può ~ere utùizzata
scopia di fluorescenza sono stati discussi nel capitolo 12. l metodi sono basati sulla fluore- per dedur re m formanom circa le J1men,1om, la forma e la fl~~1b1lita della proteina che
scenza mtnnseca dei recettori oppure sul fatto che al hgando o al recettore è stata attaccata porta il fluoroforo. Può .mcht• c,,cre ullle per ,cguire il legame d1 un ligando alla pro teina.
u~'adeguata molec~la fluorescente (fluoroforo). li fuoroforo viene generalmente legato chi· L'intcnsu .\ di fluore,ccnz.i, 1ene nu,urata pJr.i.lldamente (,1oè ,ullo ste,,o piano) al piano
m1camente a gruppi funzionali, per esempio: ammine, uoh, alcoli e carbossili. Tra i fluorofo- dell,1 Ju.;e polan z ata .1,-,orbit.1 e a un angolo retto mpctto a esso. Da que, te due misure s1
ri comuni sono compresi fluoresceina, rodamina e il colorante Fluo-3. In alternativa, .ii re può calcolare il grado di dcpùlanzza21one d1 tluore,(e_nza e, qumd1, I a111~ trop1a d1 fluo re-
cettori si possono attaccare, con tecniche di ingegneria genetica che non alterano Ja funzione <
,ccnza . Entrambe Ie gran u~ '~ne -ono
•
c:,pre,~·
come differenza tra la fluore~en
.
za parallela
.
normale della proteina, la proteina fluorescente verde (GFP) da Aequorca \'lctoria O la protei- · d Il I
aI piano e a uce po an I ·71a 1a a~l1rb1ta e quella a h'O perpend1.:olare; la differenza viene
_ . . .
na fluorescente rossa da D1scosoma striata. Il vantaggio principale nell'utilizzo di una di que . e della ,omma della fluore¼enz..i nei due p1Jm
espre~a co m e una tu nz1on ·
ste due proteine autofluorescenti è rappresentato dal fatto che non è richiesto alcun cofattore · d , di cnt"' a di fluore....enza per rnonanza FRET 1. Que<,ta te..-
• In d uZione e1t ra,u:nmen o 1 ·< , . •
per ottenere em1ss1one d1 fluorescenza; quindi i protocolli spenmentah ~ono relativamente I re •cuore proteico d1 due fluoro,on (m tnn'-Cc1 o e~trmse-
nica s1 ba~a 5uJl.1 pre,enza en t ro 1 '
semplici. La fluorescenza intrinseca delle proteine è dovuta alla presenza di residui di tripto· al h lo ,pcttro di em1~,1one d1 uno e o spettro I ecutaz1•o ne
• 1 d •
fano, 1 quali, essendo idrofobici, sono normalmente nel domm1o interno deU t · I c1), m po\lZIOnl dis11nte, t ilc:. e te ·ond1Lioni la lu.:e eme5!>.1 da. u n fluoroforo puo es.,c-
· · · 1•· · d fl a pro ema. n dcU' alt ro SI Ml\-rapponnano. n que~ ' '
e parte della ,ua em1\,1onc. Que,to proc~,o
tutti I casi mtens1ta I uorcscenza, che può essere dovuta a un• m d fi · :, .
• • _ • u o 1 1caz1one in un am ò e--..ere eme-sa <-0 m
mmoac1do nel sito attivo, e non direttamente al triptofano, è sensibile all'intorno chimico re as~orb1ta da li aItro e pu .mz.t. la ,ua intem1ta è proponwnale a 11R'
. to di energia per nson ' ,
del fluoroforo, così che anche p1c.:oli cambiamenti conformazionali indotti dal le ame del h è i:h 1amato 11 .istcnml'n , . Ieg.ime del hgan<lo al rec:.:-ttorc pml mdurrc cam -
..1 .
11
t· · due tluoro..in. ro, oc.ire una, an.u1one d1. R.
gando p ossono caus.ire: g dove R è 1a w , tanza ra I
000
b1ament1 con forma1ionah che P0'' p
 B!OCJIIMJU E BIOLOGU MOLEClll.'.11.E RtarnuRI CU l.l LMU DI l.!t\lBAA.'-A
ns
~.,9
minare i dati emetici Qu ,. •~
Ll ,pettrot,..up1a di fluorc~cenza ri~olta ne:I tempo ( fRFS) è basata sull'uso_ · di
. un fluoroforo
d l' . t."S.., tecnica e 5
legato all'europ10 e permette lo studio dei tempi d1 vita (da m1lb!,econd1 3 minuti) e~ 1s~all ton prc~cnt1, 1fcnom d d lald ...11l122ata h
t•ru I esens ~nzz.iz anc e per ,tud1are il numero d1 r«:et•
ecciuti del fluoroforo. Può distinguere tra il hgando libero e quello legato e può fornire imd · cflomc pulrle ll'int~rnahu.i1Jone Dopo'a,er :~netet I mteraz1one con le proteine G e le arre,t1ne,
portanti infomuzìoni sui camb1amenu· con,ormaz1ona
e · dotti nella_proteina dal legame e1
1·1, m u,so ce u are in goca I 111 uato IJ m1,ur ,. .
, o me e raccogJierde ll a.zione, e po,,1b1le ~uddi\ldert' il
bgando, e sul processo di dimenzz.u1one dei recettori sia m i·rvo Sta III i·llro ( par. I 6. 5.2 e tro,tat1camente e ,postando!
- e an un uecoghto d
,e ule d1 un determinato tipo e d
an.:an o1e e1et-
··
16.5.3). S1 tratta d1 una tecnica sempre p1u utilizzata neIl'an a1·1q• au tomatizzata rapida d1 com- tecn1_ca chiamata sep.u.uione di et _~tare I frazioni Su questa pro.:cdura è fondata I.i
posti per genomica e proteomica (par. 8.5) _ . scrnu!-Act,vated C~l/ 5onmg ull atti, z1one d1 Ouorcscel12ll ( FAl.S, Fluort-
Una delle \mutazioni maggiori di molte delle tecniche usate per lostudio d~l le~ame recet-
tore-ligando è che possono essere utilizz.ite solo per studiare la posmone dcli equihbno fina- Sprttroscop,a d, rrso 11a11Zil pia
. ,momca d1 suptrfic,r I"PR I
le, e non sono adatte per analinare le costanti d1 velocità per la formazione e dissociazione del esame viene 1mmob11i1..uto sulla ......r. n que\ta t«nka il ~ettore in
• SUr-rnUC d1 un )(Il -
complesso recettore-ligando. Questo svantaggio, insieme al fatto che molu d_, quem_me'.odr su un vetrmo, tramne forni.anone dI ~re, per esempio uno str.ito di idrogel
1 1
sono lenti e difficilmente automatizzabil.1, h rende inadatti per studi npellhvt d~lle c1~e_t1che mento cov_ alente uin rea<>enu qual comp ~ biouna-a\ldma oppure mediante a~..:oppia-
fi1a d I affi ntta (par, 11.8.2)., i anunmeo tmh s1md1 cli. I
del legame recettore-hgando. Sviluppi recenti nel donagg10 genie~ hanno reso dispon_ib~h re- (Ftg. 16_b,tJ La con,m · a qu I uu 1ua11 nella cromatogra-
cettori clonati, anche con funzione fisiologica sconosciuta, da utilizzare come potenziali ber- te uulinata è 1-5 Il!: mm Il _ tranone superficiale d1 recettore tipi.:amen-
~ ~lbOre lonn. uno SITTto · • Il .
sagli per nuovi agenti terapeutici nell'industria farmaceutica. Ciò ha stimolato lo sviluppo d, una soluzione acquo'>.1 del I d m una ,e a a n11uoflu,~o e qu1nd1
igan o puo Nere pompati m modO
tecniche automatizzate, per lo studio delle mterazioni b1omoleco\an, che non utili~o mar- perficie del recettore immob,lizz.ato F conttnuo attraverw !J 5u-
166
catori fluorescenti o radioattivi. Pemò sono ora disponibili in commercio strumenti dedicali gando sulla superfic·1e ,,ene mantmuu Il,: a un,~
bl. In qu~to modo. la con,cntrazione del li•
ta eh
per questo tipo di studi; i quattro tipi pm ,mportanl! saranno discusSt qui di seguito. la concentrazione del hi:.mdo ,ucol21ttc. \'arub°:_e ,os nte, e può t"<..Sere ,:3nato al_terando
, w co~ temperatura, pH e torta 1on1ca !.Ono
accuratamente co~trollate, come pure la durati dcll'e,.po,wone del recettore al hgando So
Citometria a flusso Con questa tecnica si eseguono misure su cellule individuali mentre flui- stlt~endodla soluzione del ligando ron una ..ohmone tampone, e pos:.ibile studiare la d;s,o-
scono attraverso un gruppo d1 rivelatori. ln genere le misure si basano sulla fluorescenza, uti- c1az10ne el hgando legato.
lizzando I pnnc1p1 discussi precedentemente. La tecnica era stata sviluppata per permettere la Il legame del ligan~o al re.:enore detellTIID.l un aumento d1 m<b-.a sulla supcrtì.:ie del sen-
separazione di una popolazione mista d1 cellule, ma è stata poi adattata per_ pem1ettere _lo stu- sor~, mentre la diswc1az1one del l.i);ando .:au~ uni ndunone di ma,~ , u\la superficie. Que~te
dio di vari aspetti della funzione dei recettori, tra cui anche le interaziom recettore-ligando vanaz1om d1 m~ sono re,pon'1b11i di cmibiarnmu dell mdice d1 ntru1onc del mcuo sulla
sulla superficie delle membrane cellulari. li grande vantaggio è rappresentato dal fatto che s1 superficie del ~en:.ore: ~no que,,t1 runb121t1,-nu ddl'ind1ce di rifrazione che vengono misura
effettuano misure su cellule singole con velocità fino a 10000 s , e ciò permette d1 calcolare m ti, dato che il loro, alore dctmmna la ,-do.:1tà di propa1,:mone della radiazione elettromagne-
modo accurato i dati della cinetica d1 legame. hca in quel meuo La nmur.1 ,1 ttN ,u un lrnomcno chiamato nsonanza pla,moruc.i di ,u
Esistono due configurazioni di base dei citometn. Nel modo a miscdamento coassiale, P<'rfì1.1c (SPR) e ,ul pnnc1p10 della nl1.-ss1onr mterna llllak (TIR) della luce. OI termine pla-
per spostare I reagenti al punto di rivelazione nel eliometro, si utilizza un processo noto co- smonico 111d1ca un 1m1eme d1 clettrom d1 condunone in un metallo o m un semiconduttore.)
me focahuaz1one idrodinamica. Man mano che entrano nel c1tometro, che è essenzialmente Quando la luce polanuata è totalmente ntl~ mtemamente a una interfawa che ~epara due
una cella a flusso, getti separati d1 reagenti sono portati nel flusso coassiale per meno di me1z1 con d1vcr~o ind1,c Ji nfraz1one, ti raggio nONo emette un ,.unpo elettrico, chiamato
iniettori. I getti di reagenti attraverso 11 citometro sono circondati da "pareti" d1 terreno tam onJ., d1 1.ampo l'\Jnc,Ct"nlc, nel mruo,on mJ1,ed1 nfr.uione minore (in quc~to caso 11 liqui-
ponato, che s1 muovono pm velocemente e fanno in modo che le cellule fluiscano come una do contenente ìl rc,euorc) JO\·e c:~..o de.:adc rnn ,cloc1tà C">poncnnale e percorre wlamente
fùa singola e che il flusso non sia turbolento. Nel flusso coassiale I reagenti sì miscelano per una Mngola \unghenJ J "ond.t <,e .i.llintcrta,m fra i due mezzi è pomionalo un ,ottile strato
d1ffm1one. In alternativa, i reagenti vengono iniettati, con siringhe azionate da motori con di oro, t., sua nu,ola ekttrom,a può entwc in risonanza (da qui ,pettroscop1a d1 ·monanza")
trollau da un computer, simili a quelle utthzzate nella tecnica a flusso mterrotto per lo studio per interazione con \J componente polarizzata ~ul piano dell'onda ev;mc,;cente Que,ta SPR
delle mteraz1oni en71ma-substrato (par. 15.2.3), in una camera d1 miscelazione e successiva aumenta il campo dell'onda cvanc!>(entc \F1g. 16.6b) e, contcmporanc~mente, ca~!>a unJ d1
mente nel citometro per mezzo d1 un'altra siringa. Anche qui il flusso di reagenti m1scelat1 at• · ·
mmuz1one e a Iu1.•e polarÌZlata nflcs:.a planarmcnte
ne li'"mtens11à dli . (F1g. lt>.6b).
. .L:angolo
,. del_
traverso il citometro è circondato da una "parete" dì terreno tamponato. • . - ta SPR din.•nde da dtvm1 latton, uno dc, quah è I tnd1Ce J1
raggio 111c1dcnte a .:u1 an1cnc que. F" .
li c1tometro contiene una o pm sorgenti luminose (generalmente co~tituite da laser a lun ·r .
n razione nel quale ~1 propaga on
I' da evan~ente Come precedentemente ~piegato, 11legame
· . - f · · d Il d
ghezza d'onda fissa, m grado di far fluorescere la sonda attaccata al ligando) situate a 90° ri- . biamento d1 md1ce J1 n razione; qum 1, contro ,m o
spetto al flu~so e focalizzate sul flusso delle cellule. Una serie d1 lenii, filt n e fotomolt1phcato• del hgando al recettore cau,a un ,am - trallonc continua in tempo reale del lega-
l'angolo al quale ,wv1ene la SPR si otttcne una rcgis
ri permette d1 analizzare la luce fluorescente e rifless.1 a 90° e 180° rispetto alla sorgente lumi-
nosa, entro 100 ms dal m1scclamento. Modificando il punto di misura è po$Sibile variare il me recettore- hgando. , ma di cuneo mdmzzato ,ulla ~upcrfic1e del
tempo di miscclamento, mentre umb1ando la concentrazione del ligando si possono deter- S1 ut1 IIZ7J un raggio dI luce polmaatal,iton
a ,or ' .
ddla luce rlfk"a. Controllando m c<1ntinuo
\Cn~ore (Fig. 16.6b), e un gruppo di me
 RII 1:TTORH llUI.ARl l>I MI AIIIRANA
BIClO{l)II~ l ~1,>UX.IA MOUCOl ~R[ :73 I
l'angolo SPR m lunzmne del kmpo e m
Fig. 16.6b, e) e lOO un,1 ap I I\Ur,mdo 11 ,cgnale d1 risonam.i (il uicnsogr:imma" m
I rnpnat.i Lahbran one I • .
calcolare le cost,lnll di lcganie e le lO - e m~ure po~ono essere uu11zzatc per
• L 'angolo SPR è C\prn\(l d Slanu di ,d0<1ta per l'mtcraz1one recettore-ligando.
· 1n unita I r1>onam..1 (RL' d
L..--~-- Oestrano a un cambiamento di m
. d f;
I, in mo o tale che 1000 RU cornspondono
ass.1 aIIJ ,upcrfiue del ~n:.orc d1 circa I ng mm 1. 1vantaggi dellii tcc-
I
nica nMc ohno neò atto che non richiede d1 m.1rcarc le molecole con :.onde fluorescenti o ra•
• - - - - Anehta
d 1oatt1ve, e e pu e~~ere usata n.-r stud
r . 1arc piccoIe moIccole fino a un minimo d1 100 Da) e
che può ~sere u~ata con solu11om colorate Oopa ·he Olt I d ' d ila ·
tica delle intera/Ioni recett ,I .' re a permettere o stu 10 e eme•
. ore igando, questa k,mca può e,\ere uuhzut.a anche per studiare
le mteraz1om . ,rnllcorpo-anllgcne e proleina,proteina, Ia tra~m1ss1one del segnale fra cellule e
- oro
per idenufìcare danni al DNA. F: ampiamente utihu.ata nella proteomica e nella ricerca e .svi-
luppo di nuon farmall Oggi e anche pO\\lb1le accoppiarla con la ,pettrometna d1 massa
MALDI-TOF (par. 8.5)
L.i spcllroscop1a ù1 n,on. 1u plasmomca a 1da d nda PW R, Plam1011-h'avtgu1de Reso-
11a11ce) è \!rettamente correlata alla spet1ro,lop1a SPR. In que\ta tec111ca lo strato di oro o di
lntens~[
Sorgen:.~
argento è rivestito con uno spesso strato d1 s1hce che s1 comporta come una •uida d'onda (un
Cbl
lumlnoaa# } "1i
~
Angolo
...
apparecchio per la propagazione della radia11one elcttrom.ignctica) . li vantaggio di questo ~i-
stema è che le rison.mze del metallo possono es¼'rc indotte sia dall.i luce p-polanuata, nella
f Seonele d:,..--- quale I vettori clcttnc1 sono polann..1t1 perpendicolarmente alla superficie risonante, si.i da

Sonsorecon
strllto d'oro
•:ri Tem~
luce s-polarivat,1, nella quale i vettori elettnCI sono polarizzati m modo parallelo rispetto alla
~uperfìcie risonante. C1ò permette d1 studiare le proprietà anisotrope delle molecole -.1cme al
lo strato d1 silice e permette dt dedurre informa11om sui cambiamenti conformaz1onali indot
Sensogramma li in queste molecole, per e!>tmp10 come conseguenza del legame del ligando. E un.1 tecnica
piu sensibile, rispetto alla spettroscopia SPR, e può essere utilmata per ~tud1are cambiamenti
conformaz1onali m doppi str.ill lipidici L'n singolo doppio strato hp1d1co è deposiuto sulla
superficie risonante e 11 recettore viene mserito uSJndo una ,olu21one d1 solubi~i~1ione con-
tenente detergenti. Sullo strato ,,ene fatta pass.ire un.1 solu11one contenente 11 h~ando, p_er-
Segnale di mettendo COSI di studiare il processo d1 legame Studi d1 questo upo, con recett~n accopp1_at1
rtsonanza IXRUI alle proteine-G, hanno dimo,trato ,he si pos\ono fa,ilmente distinguere agomsu, agonisti m-
Id 18
• versi e antago01st1, m b ase a1cambiamenll conforma11onal1 che mducono nella membrana. In,
· I · · t mverM aumentano lo spessore della membrana (gh agomsll p1u
Otssocl■done part1co are, agonisti e agonis 1 .
. ) d. un allungamento del reLcttore, mentre g1I antagoni~ll non
deg1I agomstl mvers1 a cau~ 1
R,gencrazoon• provocano alcun cambiamento (p.ir. 16.2.1).
I Quc~to metodo per lo \tud10 del k-game rc:cettore•h•
Tcrnolog,a de, m,cro,irray 11 prot<"'."l . . h t I uano piclole qu.mtità di moiel.:ole
Concentr■none . o che sistc1m d1 ana1is1 e e u ' '
gan d o è basato suI principi b ( e ettore) pt"~ono c~,erc p1u sens1b1h
d 1· I . à d1 molecole er~g1io r l
1 1gando e picco e quanlll dt volte piu dc\ate. In quc~to ~i~tema mm1atu-
de1- s1~tcm1
. . h .. ,,uantttà ccn1ma1a .
e e ull11nan0 -, . ,la sui•erfiC1e di una fase ,olida, m genere
ob1h1.uto ,u un.i p1lu
rinato, il ligando viene 1mm ~ multanti il hgando e lOntcnuto a un'alta
100 200 300 .coo 600 600 . ... •Ile 'm1cropo,171om '
un vetrino denvat1uato. "e lt pie :ola li ,'ttnno, iene ,ucle~,l\amente m
TernpoW . )
d t·n~1tà (1.onccntranone , ma In qu,1nl1tà mo o ' ·
sonda nuorc,ccnte, e akunc delle molcco-
cubato con il recettore, m gencr
. e marlato cim und om coprono una superh-ic - I I
mo to p1c.1,;o a.
1W1L1 pu on1 a duupafi 1e (a) ',uperfiC1e Jtt •clup• Kn I' 'eh~
1 k ffillropm1n I I
mb1.1rr1nt1:o d 1 ta ddl.t I e nfleua in fon ione ddl angolo d1 in le ben,aglio \crranno legate. 0 ne delle molecole bersag 10 ne camp10
dia conc<ntraw> I C ,._
dJ r n:uu..a ..omc fun210ne dd tempo. (cl S<-n-.o· nnn M , e rifila ,tk una v,ma11one 11 ba,...i e I altinll~ d1 legame .i la 1ò" vcro
re AB.Up~ s~ u web 1 ,,rww hucore com I ne J1 partcnZJ slJ
ne, anche 4ualora la conccntraZIO
 Jlf,CETI ORI Cl li l I ARI DI Ml MBI\A1V,
RIO< HIMll.A I BIOLOGIA MOii( Ol '°'RF
732
733
pur.. hè meno dt O I K.i delle molecole di ligando Mano legate nel complesso ( dove KJ è la co- La differenza tra questo e il 1
, . egame totale d il
vaIore "' sono vane po,\ib I
stante d1 dissoaa21one del comple~so). Il complesso ligando-bcrsaglio viene poi quantificato
medi;mte metodi fluonmetric1 e la procedura ripetuta con una serie d1 microposizioni di d1-
ara legame s
tl legame speCJfico del liga~~~ !'er valutare I dal!. La p,u !:' ;;;~ ~;a
fì
volta noto qu~to
menstom crescenti (aumentando qumdi la conceotrmone del ligando), ma tali che la densi- accurati ~ono quelli basati ~u IO:unnone del legame totale del 1· rrtarc IO gr_atko
tà delle molecole di hgando rim.mga costante. Se dopo ogni incubazione il recettore in ecces- 16.4) e tl grafico d1 Linewcave~rBa '--~ 1,1nean come il grafico d1 s~!~~aord.~(1etod1 _r1u
il fi d H·11 • ur._ equaz I - • c:quaz1onc
so viene lavato, il complesso rimanente può es~ere analizzato con spettromctna di massa gra ico i i (equazione 16 9) mne 6., ). Inoltre è po, ibil il
·d · · per otten ' e ut IZUre
SELDI (Surfaa-Enhanccd Laser Desorption and Io111zn110n). Nella pratica, le microposizioni I d ah envati per ognuno·" ere una ,11mi della co tant di H Il h
w qu~u tre grafi ' e 1 • •
sono immobilizzate sul supporto solido io righe, permettendo l'analisi simultanea d1 cenll- tCJ sono mo,tr.th nella tabella V<'<
,-.,uente:
naia o anche rrugliaia di campioni. [l.tgando 1nMl
-1-0 60 80
Pntch clamp,ng Questa tecnica risulta particolarmente utile per studiare la cinetica e la l:!O 500
Ligando legato 0.284 0.365 1000
struttura di recettori coinvolti nell' apertura, attraverso la membrana, dei canali ionici attiva- pmol ( IO" cellule) • o:4; I 269 2.1-17 2.190
ti dal ligando o dal voltaggio. Tale tecnica prevede l'utilizzo di una m1cropipetta di vetro, la
Legame non 0.054 0-068
cui punta ha un diametro dell' ordine di pochi micrometn, contenente un elettrodo ad 0.0S-4 O 142 O 243
specifico (Bml O621 I.Hì 1460
Agi AgCI, della soluzione di Ringer e, quando necessario, il ligando in esame. La punta della
pmol (106 cellule) ,
microp1petta viene portata a contatto con la membrana dJ una cellula e viene qumd.i applica-
to un leggero vuoto; ciò determina la formazione di un sigillo con resistenza elettnca elevata Legame 0230 0,19- D..337 o405 O 513 0.648 0.ìOO 0.ì\0
specifico (B,)
( 10' ohm, da cui sigillo gigaohm), che isola elettricamente un'area di circa 50 µ m2 • La posi-
pmol (1 ()6 cellule) '
B,/[LJ X 101 5.i5 .f95 4.21 33; 2 56 1.30 0.ì0 0.43
dm' (100 cellule) •
ESE\t PIO 1 1/B, 4.35 3S 1.9i 195 1.5-4 1.-43
Analisi dei dati di legame 1.37
pmol (l06cellule) •
DOMAP\OA 1/[L] (nM) • 0.0250 0.0.-0 0.0125 0.0083 0.0050 0.0020 0.0010 0.0005
Il legame di un agonista al suo recetto re d1 membrana in cellule intatte è stato studiato 18,_ B_) 0.52 0.45 0.413 0.345 O.B, 0.102 O.OSO 0.020
come funzione
d" della concentrazione
. di ligando in presenza e m assenza di· un Iargo pmol ( IO" cellule) 1
eccesso I un antagonista com petitiv~ non marcato. In tutti gh esperimenti la quantità B,/(Bmu B,) 0.44 0.bt> 0.816 I i-4 2.11>4 b 35 14 00 36.50
dt hgand~ legato era tal~ da non '."0?1ficare m modo significativo la concen trazione
totale d1 hgando. Quali mformaz1om quantitative sul legame del hgando al r 11 · log B,!(Bmu B,) 0.356 O.ISO 0.08l> 0.070 0.335 0.803 1.146 IS62
· ·d • ccc ore s1
possono dedurrc d a1seguenti au? log [LI I t,0 I.i8 I 90 2.08 230 l.iO 3.00 3.30
[L,g.i.ndoJ (nM)
li gr.ifico iperbolico consente I.i stm1a del leg.une ma~1mo d1 hgando, B,,,... Tale valore
40 60 80 120 200 500 1000 2000 ~ circa 0.75 pmol ( 10 cellule) . Qumdi ~1 può ~timare K4 risalendo al valore di (LI,
l 1gando totale lrgato 0.284 0.365 0.421 0.547 0.756 1.269 2.147 2.190 che dà un valore di legame del l.tgando ugu.ile a 0.5 Bn "Ctot 0.375 pmol ( 10 cellule) 1_
(pmol (IO• cellule) 1)
ln questo modo si ottiene un v.ilore appro~1mato per K.i d1 100 nM.
L1gando legato 0.054 0.068 0.084 0.142 0.243 0.62 1 1.447 1.460 Un grafico d1 Scatchard ottenuto mediante regr~1one lineare fornisce un coefficiente
in presenza
d1 .1ntagonista d t correlaz:ione, r, di 0.996, B__ d10.786 pmol, IO' ,cllule) e~ pari a 97 3 n~i
comp<-'ttt1vo Un grafico di Lmewea,er-Burk d.ì un coefficiente di com:lmone, r, d10.998, B ...
(pmol (IO•cellule) 1) di 0.746 pmol ( 10• cellule) e K,i pari a 90.5 n11. S1 noti che,; sono delle ,.uiaz1om
fra i tre gruppi di valori calcolali e che quelli ottenuti con il grafico Lioewea, er-Burk
RIWOSTA sono prob.ibilmcnte 1 più corretti potche I grafici di Scatchard tendono a ~ovra~timare
Per nsolvere questo problema occorre mnao1i tutto cale0 I 1- en trambi i valori, quando i dati di legame sono ~oggem ad analisi con regres~1one
ligando al recettore (B ) L'utilizzo di· u 0 1 _ are 1legame specifico del lineare. Il grafico di Hill basato su un ,.ilare di B ,il d10.75 pmol ( 10· cellule) , ha dato
' • · argo eccesso d1 anta · .-
marcato permette d1 misurare il legam• fi
~ n 0 n ~peci co.
gomSla com petttJvo non un coefficiente di correlaz.ione dì 0.998 e una prndenza d1 l 13. Que~to, .ilore (OtnL1dc
►►
con la costante di Hill, h
 1110<.IIIMII..A I BIOI.OGIA M<lLU.:01.UE RLf.[l"TtlR! ClUL'L\1111>1MUtRlA)';~
i34
735

1- -+-i~o
Osc1lloocop10 l_
Elettrodo Temp0 - --~--
• pipetta Amplificatore çMtch c/amp figura 16.8 Un Nmptodicomea ,
le ,.1lta fra due ,·alon meJ1 uand rsarc 1attniUd1un WJgolocan~, ncll'
della corrente e dell'ordm..~ 1 ~ can~ 11 apre Un'tllo •nknorc), ~, eh~7o~10. Il lh~llo d1 .:omn•
mfunzionedel 1tpod1c.inJle ip,coampcrce~safadtt1cm tcn 11·'u' i,c osuper,ore) laKil.a
Elenrodo ,nsento
to Pmch Clamp E/wropl-,,Ho~R,rprtlllotto da A ~lollemao 1200J[ Pa,;h
• •
~m!
dc, m1/ll1\C\:ond1,>«0nJ1,
, con ti Ptnneuo di lohn \\ il . J _ "'r·1lf: an nt10d11e1ory Guùi~
~ an Son, Lt<l)
nella soluzione che
bagna I• cellula

Fìgura I b.7 Dtagramma per un app.nalo d, p~t<h d.imp m modahtà d1 voltaggio Il potenziale fra un del•
tmJo J1 ntenmenh>e uno d, ml\ura, iene confrontato con un pot(n11~e d1 riferimento Vi.,w. La corrente è
1ntrodott.a attr.an:rw un cm uno d1 .1hmenta11one fino a quando 1due potenziali sono uguali li flu~~ 1001 Agente perforante presente
co .aun ,cN>la membrana è quindi rappresentato d.111.1 corrente msent.a, nec~na per mantenere 11 \'.alorc nella soluz,one 111"1nterno
dt \ bolJ tri, due ekttrod,. j R1prodo110 con il con:.<nso d1 A Molleman. Um,er"t) o( Hcrtforilihire.) della p,pena
~- - -- ►

(a) Area anaccata alla cellula

lbl Ar11 perforata
zione della puntJ dell;i pipetta viene controllata con un microscopio. La soluL1one salma
contenut.1 nell'elettrodo è conne~'MI, allra,-cr,o la giunzione Ag/AgCI, a un apparato che con-
sente la registrazione della corrente, controllando contemporaneamente il potenziale (l'olwgc

'~--
clamp) o, \iCe\a-..i. la registrazione dd potenziale, controllando la corrente (curri:nt clamp ),
a liH:Uo dell'area della membrana (Fig. 16.7). La prima op11one viene utthzzata più frequen-
temente della ~,onda, m quanto l'att1vit.ì d1 molli canali ionici è determinata dal potenziale
d1 membrana. St I arra di membrana .rnahzzata contiene solo uno o pochi canah ionio, e • distacco
lei Cellula intera
po),1b1le rtg1)tr.tr< le rnrrenti ionic:he attraverso i smgoli canali l'm1ens11à di que~le corren-
11. che permangono per pochi m1crow1.ond1, è dell'ordmc d1 alcuni picoampen: ( IO A). Le
trac~e ottenute dallo ,tudio d1 canali singoli mostrano i caratteristici salti i\tan1ane1, che rap-
A$p11az,one
prc,cntano la trammone tra lo ~lato "aperto" e quello ~,hiuso•· del canale 1omco (F1g. 16.8).
l'n grande pregio d1 qut~la tecnica è r.ippresentato dal fatto che sono p0~\1bili molle confi-
gur,m oni (Fig. 16.9 ), ognuna con i propri vantaggi. tra le quah \cegliere m funzione degli
oh1e11i, i ddlo \tud10. I a configura1ione 011w,ie-our è la più adatta per lo ~tudio dell'intera-
11one d1 un gruppo d1 hgand1 con la membrana. I: anche po,sibile studiare l'effetto III si111 di
una , ingoia moklola.
lei Area recisa della mem brana
'>ludiando l'intensità e la d1re11one della corrente, in funzione dd gradiente di concen1ra- Id) Area recisa della membrana con ,I lato esterno rivolto
11t,m• 1on1ca. ~1 può dedurre 1'1dcnu1à degli ioni che llui,cono attraverso il canale. Per e\ctn- con il lato interno nvollo verso l'esterno
verso l'esterno
pw. una LOrrenlt' di I.O pA attrJ\eN1 il canale per I nh è equivalente al movimento di circa
r, di ul, dmnp In tb), (.) ed (cl~ m= ,ul b10 <Xlmellu'3~
7800 a1om1 d1 , ud10 per canale plT nulhsccondo. Gli ,1ud1 d1 platd1 .lamp hanno dimo,1rato tgura 16.9 lonfigur,wont per tc,.11J,hc poi mb1.1to durante una regis1rwunc :,.,'dia ,onfìgurmonc
che ti numcro dr tao.ili m ugm membrana tdlulare è ba~50.
(d) ti l,ito 1111r.1celluluc puo rsserc mampo
t
della membrana cht· ,1 sta ,tuJ1Jndo può ~,ere wnliguruiont (al, (b} l.i_S<.7ano 11 c,lopl,nma rclau,a
;'t,d~
\loUcman, Unn'tl'SII~ o( Hcrllon:lshm: )
mente mta1to.1 Riprodotto con 11 pcrmn-o 1•
 NO< 111~11<..A I 81< )I ()<,I\ MOU:COUR~

ligand1 puo indurre 1J fen 0 '137

. meno dI d
16.J.J Dati relativi al legame recettore-ltga11do fenomeno verra descritto CSl:ns1bt1iz.z.a
in seguito ( Zlone. 11 mec .
par 16 6.J ). cam~mo su cui s1 basa questo
Occupazione dei recettori, numero di recettori e valori di Kd, k II k , Sottoclassi di recettori
· ttori ai loro agonisti fis1ologic1, Studi d1 legame condottI
I , alon <li K.t generalmente osservati, per 111cgame dei rece . . d Uh111iand0
,:mano da 10 • a 10' M, md1cando una maggiore affimta rispetto a quella carattenSltc!. egh voIe eterogeneità di molti r. sia agonMi s .
.b tcctton di la antagoni:.ti h .
enzimi per i loro substrall. Le cormpondent1 co)tanti d1 velocità k , sono_comprese nell mter- ton, asata su quCl>ti studi . rnernbr~na La 1 fi anno rive1ato una note-
, non e pm d' e assi caz1one d li od
vallo 10 IO' M mm e I valori di k , nell'intervallo 0.001 -0.5 mm . Studi con recettori accop- di cond urre studi paralleli b a I arnb1guita edI . e e sott a.ss1 di recet-
asa11 \Ul cl 0 controver-1>1e ed evid · la
p1at1 alle proteine G, che formano complessi terziari (AR'G), hanno dimostrato che queSt1 ul- mche ha confermato l'esiste d nagg1ogcnico l'a 11 enZJa nec~ità
1
timi pos)iedono una maggiore affi.1111.1 per ti ligando rispetto a quella ~~l complesso bmano d,
tamma o serotonma) Una ~:; 1piu d1 una dou,na 11 p;d: ~ne dJ entrambe ques~ tee
(AR•).L'affinità del recettore per il suo agonista è influenzata anche dall mteraz1one del recet- presentata dal fatto che e attermica mterc~sante d1alp re~ettore 5-HT (S-1drossitrip
\51 non '>Olo - cune sottoclas,i d
tore con vane proteme adattatnci presenti nella membrana intracellulare. Questo argomento sono anche mdurre risposte celi I . P0\\tedono carattcmtKhe di I .' recetton è rap-
~rà discusso più dett.tghamente ìn seguito. . attivati da adrenalma e norad ulan contra.!.tanti. Per e~mp10 . egame differenti, ma pos-
d . rena ina. fa1\ton O • i recetton P-adrenergic1 sono
n calcolo del numero d1 recettori presenti sulle membrane cellulari, a parure dai dati otte- 1versa compos121one amminoacrdica d pero tre sottoclassi, p p e p che poss d
nuti dagli studi d1 legame, è relativamente semplice e ha fornito valori compresi nell'interval- logica. I recettori ~ adrenerg d • iversa affinità per gh agonist'1 d.. . " . ie ono
• ICI me iano le O\ e 1versa rtSposta fìs10-
lo 10·- 10- per cellula. Sebbene questi valori possano sembrare elevati, essi rappresentano in c1. sono comvolt1 nelle funzio d Il J><hle a lnello cardiac0 1
re-altà solo una piccola frazione del numero totale di proteine d1 membrana, il che spiega m • m e a rnuscolatu h , recettori p.-adrenerg1-
C1 mte:"engono nella risposta metabolica :\ r~ -.e eletnca e liscia e • recettori P-adrener i
parte per quale mottvo le proteine recettonali siano talvolta difficilmente pur1ficab1li. Cono- no facilmente tra questi tre d · gom5t1 sintetia come 11salbut d . .g
scendo il numero di recettori e 1valori d1 Kd per il ligando, è possibile calcolare il grado d1 oc- ivern sottotipi d1 recettori. amo1o ~nmma-
cupazione d1 tali recetton, in condmoni di concentrazioni fisiologiche del hgando. Di conse- Mobilità dei recettori
guenza, è possibile valutare come l'occupa2Jone dei recettori, e la risposta fisiolog1ca associata,
~1 adatteranno ai cambiamenti nei bveUi circolanti dell'agonista. Quanto piu bassa è l'occupa- La capacità dei recettori dJ interagi al
Ie per 1·1processo d1 trasduzione del re con
al
tre mo! I
eco e assoaate alla membrana, cssenzta-
z1one normale dei recettori, tanto maggiore sarà la variazione percentuale della risposta a tali
cambiamenti. Ciò può essere osservato dall'andamento della curva dose-risposta, nell'ambito liberamente nel doppio strato hp1d1segnQ e, nch1ede che il recettore sia in grado di diffondere
delle variazioni fisiologiche della concentrazione del ligando. È chiaro che, se il livello di occu- tecmca '°·
· d eI recupero d1 fluore-.ci:n d UNa ; mobilita dci· recettori può essere studJata con la
a opo 1otode.:olorazt!l FRAn F/
p3Zlone norlThlle dei recetton è alto, la risposta a1 cambiamenti di concentrazione del ligando ter PItotobieachmg), per la quale è ne r, uorescenct Recovcry A[-
. aJI'. nec~o marcare il re ·ett fl
sarà ridotta. In queste condizioni, la risposta sarà maggiore se il legame recettore-hgando è un marcatJ interno di una piccola porzi . I ~ ore con un uoroforo. I recettori
. one cmo are della mcmb ( 1 10
processo cooperativo positwo. esposti a un mtenso raggio laser attenuai h rana • µm ) vengono poi
o, e escoIon,.;e 1rrever.1bilm t fl
Gh studi dJ legame hanno rivelato che alcuni agomsti possono stimolare la risposta mas- scent1. Il successivo aumento di fluoresc d en e I recettori uore-
~1ma da parte di una preparazione d1 recettori, con solo una p1ccola percentuale d1 recettori scolorita è dovuto alla diffus enzalla' ipen<lente dal tempo, all'interno d1 questa area
' ione m que zona d1 molecole d t fl
occupali. S1 è quindi introdotto il concetto di recettori d1sponib1h, che sono indistinguibili
dai recetton occupati S1 ntlene che I recetton disponibili esaltino la sensibilità della cellula
agh agonisti disponibili. TuttaVJa, considerare i recetton d1spon1bili come dei recettori in ec-
t1po di studi ha eVJdenz1ato che un dato m:enore
cellula in un tempo ,,mabile da~ minuu a 7 ore.
p::.::~
lori te e viene, qumd1, rile\'ato per poter calcolare la v I . i rece ~ore uorescenu non sco-
d1 dìffus1te dei recettori. Questo
avcrsare mtera superficie di una
cesso, rnpetto ai fabbisogni fis1ologic1 della cellula, non è corretto; in questo senso, il termine
non è appropriato. I recettori "m eccesso" sono una componene intrinseca della strategia
16.4 Struttura molecolare dei recettori
della cellula per assicurare una risposta massima, a una bassa dose di agonista, e facilitare
una rapida risposta positiva o negativa. Tuttavia, studi di legame hanno anche dimostrato
che il numero d1 recettori presenti m una membrana varia col tempo: tale numero è soggetto 16.4. 1 Natura molecolare del recettore
a una rei,:ol.wone pos1t1,a (11preg11lat1011) o J una rcgolanone negativa (downrcgulat 1o11 ) a se-
conda delle necess1t.1 della cellula. li controllo del numero d1 recettori è cserC1tato a van livel- In teona, l'ambiente ideale per ~tud1are la struttura mole.:ol,uc di un recettore, e il suo rap-
li, che vanno daUa tr,1scrizione e traduzione, all'mternalizzazione per endoc11os1, con conse- porto con la trasduzione del segnale, e rappmcntato dal m:ettore inglobato nella membrana.
guente degradazione da parte degh ennmi connessi all'ub1qu1tma (par. 16.6.2). Studi di Tuttavia, bassi hveU1 d1 esprcs,,one e la pre.enza d1 altre proteine all'mtcmo della membrana
marcatura hanno dimostrato che, dopo il processo d1 endocitosi, alcum recetton possono es- possono complicare quesh studi Nonostante queste difficolt.ì ~ pos\1bile studiare I rcccttorì
sere remsenu nella membrana nell'arco di pochi mmuti. L'em1v1ta del recettore per l'insuli- all'mterno delle loro membrane cellulan ,ia n~llo stato nau,o. sia utthzzando recettori punfi-
na è d1 9 ore. In akum casi è stato provato che l'esposizione prolungata dei recettori ai loro cat1 inseriti m hposomi (membrane arnficiali) o v~..icole umlamcllan g1gant1 (fino a 100 µm
dt diametro). Alcune tecniche imp1l>gate per quNc rierche sono clen,atc d1 ,cgutto.
 n,
ddb hm:
• lof1t1111«Dpt11 dmnmìa ,I, ~ a,npto ({ra8 ,tram,rr)La pnxrdur.a pallX'ttr dj
,-aluwr lo stato oligomcnco del rcccttOIT ndb membrana e di ~ d numero t k di
111mM0111 ddJc a - ~ traiumrmbrana..
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. d q J i . . .cmaRv,ict
La CjllllaircWtaaa.:tarbra.oclil
• .Min-oKop111 onim Comtntr di 51wfiarc, Il' ,docnl di diffUSJOnt di 6lngok molC"U>k dJ rr ÀOOlk
Cll!tlGft oàll mcmbnna 8uid.a. "-MR r lii~
• ~ • riJOfllUIU di ,p,n tkttronu:o t f:5R) Uu!azando un nwatorc- dì iJ>lD e.on plitlF C,pll;I U
un gruppo nitromk attaccato a un roiduo di ast0m, 11 può midare il ragpo dfettn-o paitudu ~ e: padit lr
della pn,trina t la sua rotaDoM nrlll membrana umlnodd ll--.t.__
• AnhnJrJ'I antr•r«mort Sono 1t.t11 imptcpb pn nudJ.:ll"C alrum urrttl ddh b1oc:h1mia fiau od fOadrla'lllb:ftldì
~ r«rtton, tra i quali la loro local1zz.anoM cdlula!l' t b lo,•.hz.uuonc dn tali d1 lt-gamr (uncmìddc, F-it:~~itrd,
nd ~ore. Gli anticorpi anti-recntott pouono o.scrr Qltcnuu utilizzando mx11on lt' trr, r che ,, t ~
pti a cdluk o a mc:mbranc, rtatton purilkau o tt..---ctton nrombUW111. Uno do problmu dm11tu /cld ~di•
U$0CUÙ con l'UIO d1 anu~orp1 antt-re«"tt<>n tdcn'UtOal fatto cht i l"t'Cttton poswt(lono'1• m:etton IIJeO
curamcntc p1u di un cp1topo, t alcuni d1 quoti po5IOllO ~ loalizz,at1 ali 'mttmo dcl!J protnca. i ruta F:Jlldai.~41
mnnbran.a o sul l.'lto mtr.ac.cU~rt ddb mcmbn.m, piun06Ul dlt' 5UI lato d1kpmC' dtl fj. qio•~
a n ~ ddl
wtiPule:Da(A,
gando drlu mcmt>mu. Quindi, anticorpi anu-rcttttorr ì1 J'O'IOIIO ltprr a Atl dn--eni, ri•
'f)ttto a quc:U1 fismlog1amcntr riln-anti pn I lig.and1. t JK-100 anc:ht 1ndum-~ o-
1ttt1lnÌ fra iUtJ llln
:rt01WJ, cht facilu,
~,,w,m • al

nr dti rcettton a au~ Jdlr loro carattCT~cbc- mu!t~n. L'uso di fnmmmu JJ anll• U\'O~·oli. l
wrp1 monovJlenti fab (par. 7 1.2) può OStrt d'1usU10 ntl confcrnw-r .e" m rnlmmk' ipÌtga.ndo cuw ('\
studiando il t>ito d1 leg.imt dd lipndo
JI rt~<"'llorc puo tSS<'rc isolato <Wu .u.a mcmbruu trattmdolo coa dclaptJ t purifa..--ato 16.4.2 Dommi d 1 ~ Jn mr.r.,n
""On lccnichc com cnz 1on.tl1, 'J)t'O&lmt'111t' b cromatografia di affuuta am l«tl.JK'. la cromato•
grafia d1 affinità, util111..1nJo un anta&OnljU mmt llg&Ddo immobiliz;r.ato,oppurc la.:-rom.110• Lt- stnlrpc- ~
gr;itìa d, mtcruiont iJrofobi.:a. l~ protnna coo punfi..--ata. m una IIC>lunont d1 &tagmtr, c~ttori 1>0no mohl' 1 qurlr-

può ('S5('K studiai.i con \'Ult' tecnkhc. 1111. lA mar,atura cL ,E , fii!

cldl'IMulma. ~ m.fflQff.. • OUJIIII J'lct d m.rnorr
• l.lltra«ntrifugazione analm(a La procedura ddu ltdinvntaz.aont all'equllibno (par
3.5.3), cht' ~ inJiprndtntr dalla l<>nN ddL, protru11, pmntttr d, -itudiart lr dunffluon1
dd rtlC'llorc C' la 1trchlllmttria t lt tr1tcraZJon1 In k IUt' tubun1ll. Una proadun alk'rnltt•
aubuniti Il (ma~ moln, - L - 0

......~
41 di wfrofohl, ttA iw 6.4 t h&noc C'\
80 la nvmhnra t ~ r ~ oéb
• ......
...Q llllllr. -
..- ..: lr dìlr:
a mllW aalro.:ùrr M lll, f c!--Jt>
tr.amc Cù:il\l'r'l,Q cùdfurn
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va, l'anati,i ddla ,'C'loaù d1 .t«linlentlltOM, ptrmettt d1 valutare la purtUI cxl C'IJIV!IOnt
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rcccttorc.1 unav1a, 11 lt-gamc dcllr molcco~ d1 dtt"Jfflk alla J"OlelOI p0IIOIIO complic•rt ... COmt lllU,.iltOtt dJ k)to;lftllllci t tlJtl 11Dp1C'pU Il 4 mdt 1 ~ l?UWl!u
l'mtcrprct.1z10nc dc:1 dati. Dopo <be t.l m&!Utort .i f kpt,) Il ~ 4 t l \Xlm:~liO M: IDarJIOrt
'WlnW' nJ'-1510 a tu.:.:· 11ltmlL-irtu. ..ht mdr ■ dir wtrp flOI a,.
• Crumau,grafia a r.sclusmnr ,,,o/r~rr Tronamtntr qu~ t«nica permNk d1 1ttm1tt I,
WlllmtmlCD[l' Ili '1to dJ kp:N f RO ~ llO dir ' Il lega a una
massa molr~olarr rei.uh.a, 11111..1,'t'I la &edt.a drllc pwtc1M d1 cahhrwont pub raJ'l'l'('Wllll G. La rt"gmnt' I'\ tmrunak. dawc. --~-'
rl' un prohlrma.
flGW cb(, pm,mu an1WpC' lDII WIO
• tlrttroforrs, su grl Ru:orrmd,1 ali.a l<'l."lllul che util11.1a 11 Coomauit bnllunt hlUC' JJ può ~ dcli rpadmnidt: t f
sumart I.a pul'C'ZU e li m;u,y molecolart rdat1\,1 dd rtt:e1torr l'.àuono dut" -rrro-,.,1 modcml alk dn damim di lrpmt' d c ~ o pnmo
Un.i volt.i puntìcato, 11 r('(t'ttorc può C'SiC'tt lmulliuato t la ,ua 1truttur1 dc1trmtnau wn Q>nmtr ndl mwprt b ~di.l!a :n.'rttl.1ff llOCJ cL 1,cgmv, u:ihmrdo poi b
cnst.1llogr;1tì.1 a raggi-X. l utta\ 1a, ~ molto piu frequmtC' ut1l11.Urt pmtnnt nromhmanu per ~ ruuttura; spcc.1hd.U \Ul ~ rooltuJian :;.::mm pC'f dcdum , dc!
questo gcn('ft' d1 studi cd~ )lato po"1btlt dctc-nniiurt la struttura at1t1llm.il di nn rC'\."ttton, 4lrf donuruo di lcpmc' l i ~ .;pro..i.ic ~ I analai ddla &truttun llllllliuu dd n:-
wmc- quc-lh pC'r mdopsma, glu11mm;ito, inrulma t il rrcc-ttol't' m<-ot1mco J'lt't' l'k"rllkolmi (;(' ~ tn p~rw r m as:~ dd lipnttl fudopn E.ntnmbt lfP'll'D pouooo rum
,trutturc <nstalhnt- hanno fnmllo una ~p1cgnione dn mrcunwm mo&a--ol.trt rcsponsat,Jli lltqr,Ut con ~tudi di m u ~ wto ~1:IK.I ,br pmncttoD0 iL art .. diu\r
lff donumo d1 lq;amt ~...,Jo ~ mttodi,..hr aDo $l1Jd!O dn m.-enor, cldLt
 1tta:rroRI <U.Wt \RJ DI ML\lbRANA
BKX !UMICA I BIOLOGIA MOL[COLAJU:
740 741
• Dominio cxtraccl/u/arc Q .
chirubi è stato po!>S1bile identificare 20 sortoda~i carattenzzate da d1vcr\i domini extracellu- ucsto s1 protl'lld dal!
. ' · · lu · ·H,tema• del tipo lg o del u- contiene tutto, o in parte il sito di I e a superfiae esterna della memb
lan cont~nh nptegamcnll comuni, che possono essere ncc m ~ ' (game dd 1, d rana e
• Dom,1110 transmemlmma E gan o.
po fibronectma lii. _. . _ msento nel do . .
La scoperta che i recettori possiedono una discreta mobilità, e che vana~o o.;ostantemente contenere numero~ region 1 h pp,o strato hp1d1co della membrana "
. d. e e anrave~no n e puu
tra conformazioni d1vem:, mdu:a che il dominio d1 legame deve essere flessibile e non ngido ~• sene I anse. In alcum lasi qu-t. ~ petutamente la membrana, formando una
" e an:,e ,ormano al ( h
quindi. che I.a sua forma e la sua dimensione sono in qualche modo determinate an~hc dal h- per II passaggio deoh
<-
. Ia n1tmbr un can e e e può essere a=rto
10111 attra, <f\O ,,. o chiuso)
gando. Ciò spiega perchè, nel caso di alcuni recettori, ligandi strutturalmente d1vers1 possono anse formano parte del sito d1I .ma, mentre nel caso di altri recctton queste
egame per il l1gando.
legare con affinità simili. • Don111110 111tracellulare Que t
' a rl"'lone .:ito'>OI d Il
extracellulare del ltgando per 111 " J Ila e a protema deve rispondere al legame
ClaAificazione dei recettori della superficie cellulare • . . mare • pro..:e'»O d1 tr a.duzione del segnale.
Les1stenza dei tre dommi nei r--ett .
L'applicazione delle varie tecniche analitiche appena discusse, per lo studio della struttura '' on n 0ette 1a loro nat fi · •
forma un recettore possiede regioni dr 19_28 ammi ura an . ~allea. Ogm protema che
e della dimensione dei recetton, msieme all'analisi del tipo di trasduzione del segnale mdot- rali non polari, e altre regiom idrofili -h noacidi idrofobia, contenenti catene late-
to dai recettori, ha portato all'idenuficazione di tre principali classi d1 recettori della mem- g1oni 1drofob1ch_e, generalmente con~te, cnon,1~tdent1 ml catene laterali polari e ionizzate. Le re-
brana cellulare. . • ru ura a a -e rea '>0110 le r~; · b
sente nella porzione idrofobica ncca d1 .di , • .,,om transmem rana 111
• Recettori de, mna/11ot11ci controllati dal /1g1111do Sono responsabili del movimento seletti- r 'd' d li b ' ac1 gra~, a catena lunga, pre:.ente nel doppio \trato
vo d1 ioni quali Na , K e Cl attraverso la membrana. Il legame dell'agonista provoca l'aper- 1p1 ico . e a mem rana. Al contr,mo. le rcg1om idrofilKhe del recettore sono~ ste v
superfici mterna ed esterna della membrana do,e mteraoiscono e b' po e™> le
tura (gtHmg) del canale e il movimento degh iom attraverso la membrana. Questo movi- 'd
1
fil' La • • "' on un am 1ente acquoso e
mento ionico rappresenta una risposta rapida, a breve termine, che causa la propagazione ro ico. _necessità cl.i una regione 1drofobtca che Jttra\'er,1 la membrana è una caratteristi-
dì un'onda d1 potenziale di membrana. Essi possono essere eccitatori, e causare la depola- ca cosi pec~hare d,e• recettori che è poS1>1bile 1denufi,are le regioni tram membrana semplice-
rizzazione della cellula (per esempio il recettore mcoumco per l'aceulcolma e quello iono- mente ~ed1ante I anahsr ~ella sequenza ammmoacid1ca della protema. Le superfamighe dei
tropico per il glutammato), oppure essere inibiton d1rett1 o indiretti (per esempio il recet- recettori p~ssono essere nconosllute dal numero pre,;1,0 d1 regioni transmembrana che cia-
tore per l'acido y-ammmobutirrico, GABAA, che stimola l'ingresso del cloruro e qumdi scuna po~s1ede. La pre~enza d1 vane regiom tran\membrana può ~re la conseguenz.a della
provoca la npolariuazìone della cellula). Tutti I recettori di quC!>ta classe consistono di natura ohgo meri ca del recettore e m molti ~.c.1, la lun11one del recenore è collegata a questa
quattro o cmque subunità oligo- o eteromenche. La risposta prodotta da questa classe d1 natura oligomerica (par. 8.4.3).
recettori avviene m frazioni di secondo.
• Recettori accopp1at1 alle proteme G (GPCRl.) I recettori d1 questa classe sono collegati a Superfamiglie di recettori
una proteina G, tnmenca. L'attivazione del recettore attiva la sua interazione con una pro- Recettori con singolo do11111110 trmm11t'mlir,111a (JTM Appartengono a questo gruppo 11 re-
tema G, risultando nella sost1tuz10ne di GDP con GTP in una subunit.l; quest'ultima si dis- cettore per l'in~uhna, il recettore per l'EGP e quello per 11 fattore d1 crescila delle piastrine
socia dal trimero causando l'attivazione d1 una molecola di effettore, come l'adenilato ci- (PDGF, Platclt•t-Derwed Groll'tli J-rrctor), ua¼uno dei quah possiede att1V1t.\ urosm chmasica
clas1, che fu parte d1 un complesso insieme di meccamsmi dt segnala21one intracel\ulan. La mtrinseca.
rhposta prodotta da GPCR s1 ha nell'arco di minuti.
• Recettor, co,r atttv1tà protem cl1111as1ca Tutti questi recettori sono soggetti ad autofosfon- Recettori con due domrm tmmme111bm11,1 (2T.\f) I membn d1 questa famiglia hanno 111 co-
laz1one nella regione mtracellulare M1molata dall'agonista. Questa fosforilazione mnesca mune il comvolgimento di ATP· d1 comeguenza, sono spesso md1cat1 come recettori P2. Esi-
l'att1V1tà chmasica ctiretta verso proteine mtracellulari. La maggior parte dei recettori chi- stono due sottotipi di que~ll recettori: P~\ e P.'!ì. 1pnm1 '°no canali 1001C1 attivati dal hgan-
nas1c1 attivati catalizza il trasferimento del fosfato y dell'ATP ver~o il gruppo os~idrilico dt do, 1secondi sono recettori a"oppiatt con proteme G. In tutt11 ca.si v1 è un solo loop 111traccl-
una tirosina nella proteina bersaglio. Tale processo di fosforila21one controlla l'att!Vità d1 lulare e le estremità N- e C-termmali sono locahznte al dJ fuori della cellul.i.
molti processi cellulari fondamentali. Un sottogruppo di recettori hrosin chmasici trasfcn-
s,e il gruppo fosfato dall'ATP a un residuo di senna o di treonina mvece che di tirosina. Ree<'tton con tre d01111111 tr,111s111em l)m/111 (JT\1)
•
Questi recetton sono tutti canali 10111c1, atti-
~mpi di _recettori t1rosm chmasici sono rappresentati dai recettori per l'msulina e per vat d l 1· mnimoaodt neurotrasmctllton eccitatori come L-glut.un-
1 a 1gando, e comvo1gono a ,
I EGF. Le risposte mdotte dai recetton tirosm chmas1C1 avvengono m un intervallo di tem "" Gl' d ·1recettore per l'NMDA (N-met1l-D-aspartato) e 11 recet
...ato. 1esempi piu ~tu tali ~ono 1
po che varia da minuti a ore. tore per l'AMPA (a-amnuno• - d "t·S-mcttl-4-1sosazolo prop1onato). Contengono un
3· 1 ro.,,,
I I.J regione :-.l-termmale è extracellulare, mentre quella
Studi strutturali e te1.m,hc di clonaggio molecolare hanno nvelato che tutti i recettori della oop mtracellulare e uno extrace11u1are. di uesta classe ~ono omo- o cteropolimen e n
membrana cellulare po.,s1cdono I tre \egucntl domim d1stmt1. C-termmale è intracellulare. Tutti I rccettor1 q d - ..
d d e mole<:oIe I agoms....
eh•edono, per l'attivazione, 11 legame I u
 112

:ltlmam tal q,illtffa "-81 .tran.smnn1mmo (4TM> Qucs&ì rrattOfl iODO tuttJ amb IIOlllO
~ Il r m
,rns:odlt
attivui da lapndJ c.orrdatl al reccttorr nicowuco ptr l'acdilcolim, aJ rt"CcilOrr pala ICJOCOm

~~mowa.-
adlUOJr,6t' ~Eaiu,àam,.
u (S.HT.l,al RCCUorr prr i. glicina e ai m-.ctton pa l'aado T-ll!1ll!llffl)buumro
GAJ$Ac). la hlW I aa le csuaniù N- e C - ~ sono atractllulari. Solo l a ~ TM.
<.,AB.",.! ax:mbna a, a,Tt'&. coa m..----.
IICgl(llllad
praa.a una arunura ad u-dia. raia ag -=hra fi-thme Il,. Lr
Crlrmdaur,psm:r:i
R«.mon co,i KJ aom,m tn1,u-,,,bra,ia (6TM) Al momento~ unnglu di m:ttton t lml'WD.
molto picrok. Due esempi, m1ramb1 canali aooici atuvau d.s bprnh. sono il rr'écttorr attn.ato ~IOlu..
Studi di
•-ww.-.
a..::ca:nwil
da lnoaitolo tnfosfato (IPJ f pmente ndla mffllbr.tiu mtracrlluw-r) e Il r«ettott \,mùlmdr
cDatochr.t ICit!..Uat:lllalit.
aam&o da capaicina. Ogni reccttott possiede tn- loop tntracdlulm r d~ r.xtract'llulm td
IIIUcmtmtC' fibr-:HUli haw..
entrambe le estrnniti N- e C-aamuuh wno atraccll~n
mtagnn_ ~ d i . . .ain
Reattori '°" Mttr domini rransmrmbrurra (ml) Questa~ la ptu ampu e diwnifiau fra lr lrpmcdc
diaffiiw.mìifDMdo
~aroébr111t1•
auperfanù~ di rcatton. Numerosi appartmmu a quoto groppa. ma non tutti, iOno a..--rop Uo
ICUIQDI . . . . . . .
piat1 a proteine- G. 01.-eni rrinu ~ggen 1000 :wo..'Yll con qua.t., &migliA d1 ~ n , .:o danoLa
~--- ndolt(OB
me gli 10111 (Ca ), gli amnunoaodi (gJut.unmato), le amnunr (atecolammint), k purin<' mmtR' b
blÙ!Wlill&,
(ATP). i lipidi (pro5tagunJmel, gh ormoru prptidìci {bradichuuna), ncuropq,tid1 (U.:hidu drltpmr I chriìb
ruM), chinine ( 1nterleudliru-8) r ormoni gbcoprocriò (OllDOIK' 5timolantc I, tuulcX', onno • qur

~.IIOI
L.Wrddit-oa
ne 1tunol.tnte I folliwl1). Ogni recettore h., tre loop atrxellulan e trr intracdlulari. l..a regio• Ima, mnfcmu!ldo dillC'mlro,
ne N-tn-minale t atracdl~. mentn:qudLtC-tmnmalcè mtncdl~. ra di affiruu con e::.;;;:::::_ r di 1J11rQtv
dd Ligmdo ai loop ---r---
ddlrgunr,
16.5 Meccanismi di trtiduzic>M d e l ~ O prnentl Ul .&!llllmnoa.::
rn-at1odlc ,
16.5. J Trasduzior,e dt'I wgnak ~di,mu "'""'' iott10 11ttrwm tlol lipndo I:.t[WJ:sJ
DO dcttnm dJ :, dd}orp
I ~.mah ion1~1 dltl\'all da hgand1 rapprcsmtano uno &i mccaruwni ptt il controllo dd arttorc-. li e lffl/7'\lolU)r dd "'
movimmto di wm attraveno u mcmbrilD.a, tn f ~ dd loro grad1mtc di concmtruione, b:a ,UIJM\Tmn
tr~ddb
rì~ultante in un ,ilmbaammto dtl rotmnak d1 mtmbnna TAie controllo dtl mm•uncnto io- tlqo \ IIIOA
ll'•ngl'O&l e do M ,\
nico t bag10 sul tipo d1 tonr (aruonc o c.atx>nrl, Mdl.a anca e aulk ~ ckUo ione. Il CU I rt' andh. LO
lbhue1 d a ~ AmlJl!D(:.a...ll:b..
legame del liganJo al rc.:dtort nello '1.ato d1 npo.o induce m qunt'ultuno un cambiamt'nto
llmlh,-,.no ~~
dai.henu dir
confornuzionaJe, che aiw I apertura dtl umk e, qwndi, il J>Uil8KIO dql1 ioni. li canalc n &nll?Uno&.:ufu.' t
mane aperto fino a qu.indo Il hgando Ylfflc nrnoao, oppurc fino I qu.ando, pur anoora r«'• ... COftkml.aU dJ
5l'lllC 11 hgando. ti rect'ttorr 11 c.onVttte nd AJO &t,to dcvnA'bdllUtO Dtl mommto che qunto
Studì di p.atdi dmap deliOMud.i~dd
meccanismo J1 truduzmnc l' md1pendente cLt quam.as1 altra compoll<'nU d1 membrana o caaaltllllll"\u --.--~-k~~~w~
molecola intra..dlulJrc, lii mposu ddla ceUub è qi.w, 1$1.\nUna In qucaa , ~ iOllO rom
presi molti recettori comvoltt nella tr&1mm1onc drl ~ tn neumm, tra ldluk glt&I, t'
neuroni e tra neuroni e cellule musro~n A +R .... Aa••
Utìhl1.llndo una clilssiliG11JOne h.uata sul num<'fO d1 Kgmtrttl tnnsmnnbnna flft'Sfflll tn
ogni subunuà (2TM, 3TM, ◄ TM e bTMJ, sono ruu 1denufiatt quattrc.1 M1pnfam'3llt' di u
nal1 10mci uttm,11 d.1 hgand1. I.a um1gha ◄TM t- qutlla studiata J'IÙ m &1t.it0 uno dn n1tnt _ . A rappmmu ra.:rtxoima r R rranm,::=.:nc:ut1rdllt11lldi lrpme po I aaucoun.a.
bn piu imponan11 J1 quest.1 dusc l' Il rtLettort' nKot1n1rn prr I •cetlkolnw lnAChR) l'f0n1 - , Ml ogt\l suburuU CL
IC' m gr.indc qu.intlll neU'anguilb e nelb riUU tlcitnu Qucoal1 rcce11on s,ono prnmll an...h(- I,a rmsunnone &.ne , Wt, 1-d.x,u pn ~ m-m: ba 6t'
ncne g1unz111m wicletnc:ht ncuromuscol.an dn mamm1fm, louhn.111 1ulla mrmhr•n• &-lb 111.Dibntr d \'l'kx u pn I apmm1 dd t IDIIIP1" &lit di fflout1 per rro
cdlub posh111apt1ui adiacente al llffirone sirwrucn, e ,ooo ,'"Olmolt,ndL, <ontr.ailOnC' mu "-> ID\'ttSO l ~ iJ (amblamc:: \ffiO La ~ pa b --~"-''---'""'
KOl.3.fC' I.a tossina a-bung.irotoS&tna, prodona da .alcuru attpmt1 fflmou," 1tp ln nwurra . . lllolro:>ta dJ !do d.all, L ;:rmW0W t ptl Y ~ dalJo mJ0 lpC1'tO 41
'->allo suto d....,.,,cu.....~-~ (.amt,~, K!DOmolllnmlldi apcrtur, rduUKU1

n JJOCJIIMI{ 41 Bll>llX,JHl<ll I( <'IARI
dd canale. pnma della LranSllhlne allu ,uto dcscns1tiiliznto o prima della dim><.taz.ione di
una mob."Ola d1 hgando d.11 :.ito d1 legame. W'interno ddl\1ttività dì apertur,1 e chiusura, il
ttmpo medio tn cw n \Qil{ ÙI To~ nmane aperto~ 3.0 ms e 11 tempo medio m cui~ chtu-
10 ~ lM ~ li rtttttottdrsttsibtl1zi.ato (R•• ), infine, torna allo stato dt riposo chiu,o (R).
b dtKmlbilitDnunt' può ~sserc ,oll~ata alla fosfonl,mone Tutte e cinque le subumtà
contrngono'P(ltmmlt Mli d1 fosfonlaziom:, Jocaliz1.1tt tra le regioni TM3 e TM4, ed è stato
dlIDOStnto che la fodortl.u1one del re1.t'ttore a\"\·tcnc ~u due res1du1 d1 serma, su ciascuna
ddk rubunità y e o (.us,;un gruppo fo(l.tto introduce due atomi dt 0SS1geno canch1 nega11-
\~tc. .:be possono indurre 1mportant1 ,amh1amenh conformaz1onah nella struttura del
UCfttore t>deserwbihzzu1one. Da (ludi d1 mut.igcnes1, condotti su qucM1 residui di serìna, ~
emnio che la loro ~tllllllonc con rl',idu1 ammmoa,1d1C1 non polari riduce al mimmo la
suscrtttbilità dcl r1:cettorc .ili" desl'n\1bilirzazione indotta da accttlcobna. Al contrario, la so-
SUUUlunc do rcs1dw d, ~erma 1.on re>idu1 d1 glutammato, che conttenl' gruppi carboss1l11:1
candù n~tn-amcnte,dcseruib1liT.1a in modo permanente il recettore Tali soslltuziom con
Glu e Ala rapp~t.lno una tecnica largamente utilizzata nello studio delle proteine chinasi.
Que5ta mòduluJ<\nt' della tunzione del recettore indotta d.illa fo~forilazione viene riscontra-
ta in molu altn llpi di proteine d1 tra~porto di iom, indicando la presenz.a d1 un meccanismo
comune; tuu,n;., non e ch1Jro ,e la fo~forila1ion<' s1.1 un prerequi>1to per la desensibil1vaz10-
ne Jd rettttore (par. It,.6 I
,1udi stnmurah \!mili a quelh per nAChR \Ono stJll eseguili anche con altn canali 10mci
oontrolùt1 dJ hgand1, m paruwlarc (OO I n:cctton per GAB.\. e per la glicina. Questi studi
hanno fornito 111d1.:aziom ~u (trutturc comuni per I c.1nali e per I meccJnism1 di controllo del
la ~cttr\1tà JOm,;a. In Jc.:orJo um quc)ll J.111, ~1 osserva un.i con~1dernolc conscrva11one d1
itqumz.e d1 ammmoac1d1, in regioni spe.:ifiche delle mpctt1ve ~ubunità. Tuttavia, non tutti 1
rec~ton ,;o\legall a canali ionici !>Qno at11va11 d1rctt.1mcntc da hgand1, ma p1utto\tO comvol
gono protrinr G come intermedio tra il pnx~o d1 lc:g~ne del hgando e l'apertura del c.inale.
Un t"Semp10 è rappr,;~ntato d.11 reccttMe muscJrin1co cardiaco collegato a11.analt per il K .
16.5.2 TmsJuzio11e dtl Yg1tale mediante rumori accoppiati a prorei11e G
Al contrilflo dei rl"(.:tton collegau a1 can3li mmci del llpo nAChR. nel quale 11 legame dcl-
l'agorusta ~ dircttamcnte colk~to all'.1penura del canale, I.i gran parte dei recettori richiede
un'altra protoiu ~r accoppare il legame dd hgando con la tr.1sdu1ione della risposta cellula-
re 11:clla llllli;gJOranza dei recettori dclla ~uperfami~lta .:tm sette domini transmembrana
(ffi1 quesu connessione n-.1cne attraverso un gruppo d1 proteine aSMll1ate alla membra-
na, note come protemc G. rosl chwn.ate pcrchè legano GTP e GDP. f. stato stimato che il ge-
noma umano coduidu piu d1 1000 GPCR, rnd('nztando CO)J la loro con\idcrt:vole importan-
u. In qu(StO gruppo d1 recettori, u mpostA cellulue al legame dell'agonista e conne~sa alla
formvJone d1 un complesso tcrrurio AR •G. sebbene rc,ettori con attiVJtà intnn~eca possano
agire attr3\TfSO 11 comples50 bmano R·G (par. 16.2.1).
Struttura dei recettori TfM
TuttJ 1 GPCR possiedono una struttura tcmaria c.he con\iste di sette eliche transembrana
colkgatt cxm loop alterrati\-.unente mtracdlulan cd cxtrJccllulari, con una estremità N-ter-
mmale atracdlulare e con una regione C.termmale mtracellularc (I-1g. In. I O). Sebbene que-
U:Cl!l11.IRI l flJ.l!iARJ OI MUIHR.\l;A
745
G,
SH3
.....__ _._ POZ
Arr
SH2
Figura 16 t O D1Jgrarnma d1 un ipo1 I
regioni generJli d1 interazione del re e lto rc,wo,t accopp1a10 a una pruicma G
(j,), PDZ, proteine con dommi SH2 ~~•~{' con lhr( pro1cmc cdlulan, Ira lt qu~\~~RC) Sono md1ca1t le
na (Ardr),:«cllon lhm.1.11e1 accopp1a11· a p;:r:~~~1~c ~h~;O<l,ficano l'a111~11a dri mcu:r::', ~;{~((,;_e
e I s111 1,o,lorila11onc che porwno a di\d. ' l. '"Il per la d1mcrul.l/lonc con ;i(t . • re• •·
JltlVI potrebbe e,M're considerato un t <:COJJ)lamcn10 e ,n1crnaha,111one IP). Ognun d o GPCR (DJ,
dei loci o;.;: I r\Plr\<1onc dcUa furwonah1a. l..t figu,: t ~~~t1 proc~,
gcner.i(e ,an per le IOllTa11u;1
m molli c,rn, C))1 non )ono ben carJllrr~u ',~r. "::i
non rapprr1tn1a una lo..J11u.t1Jonc accura~~~e
pkd receptor) ,\'111ure Re,·,mi Vrui: /Ju,o.,,, t\o/:•;oda T ynakm (2002). I:fficao at G-pro1cm-sou:
• • . ' con i ~rmcv,o dt Macm1llan Magazine:, ltd )
sti recett · bb ·
on a iano que)ta carattens11ca strutturale ìTM m comune, i loro d . .
presentano una notevole vmabd1tà. Nel ca~ d1 p1ccoh agonJSIJ (per esempio oadmtn1ald1 legame
mma dopJ · ren ma, J)ta
• mina, ~erotomna), 11dominio e parualmente inglobato all'interno della re •one
1
,;:nsmembrana con strutturna elJC.i mentre nel CJ'-0 d1 gro'>SJ agon1)1l, come I neuropcp~di e
hemochme, ti dominio puo C\tendm1 sui van loop extraccllulan o e~sere Joca.h7.z.ito vici
no alla _regione N-termrnale Questa vanab,lita nella localizzaz1one del dominio di legame cn
~allva il fatto che devono cmterc d1vme modalità, ~r mezzo delle quah I'agom)ta può stabi-
zzarc la conforma11one .itt1va. LJ regione C.-termmale conucnc dei domini chiave n,~hi di
prohnc, con I qualt il recettore attJ\O sa accoppia wn le proteine G.
I GPCR sono ,tatì dass1/ìcat1 nelle !>l."guenll tre famiglie.
• Fam,gl,a A (c/a5se /) ECJrattcnz.zata dalla prc,cnza d1 d1\·er-.e reg1om conservate nel loop
TM e dalla pre.enu d1 una mtema ~,enficata wn un gruppo paln11tÌLo nella (Oda C-t~r-
minale ha tutti i membri della fanugha va e una omologia da \Cquenza del 1.5 20%. Quc:-
~to è il gruppo piu grande e comprende I fl"(etton per rodop,m.1. 1rimJ e tachichmma e
1rc1.ettori adrenergico, dopJmmergico e 111u-.caru11w.
• I"um,g[w B (classe li) EcaratterinatJ dJ unJ lungJ coda N terminale conkncnte sci ci-
steine comcrv,tte, kgate con ponti J1solfuroe ,om\'oltc nel l~ame dd ligJndo. Sono in-
clusi i recettori p.:r il glufagone, ]a ,ak1ton111a, IJ i.c,rctma e I ormone parat1101di:n f.\SJ
attivano tutti l'.idenilJto cidJ)I e ,onu accopp1Jt1 attmerso la ,tt,~ protnna G1•
 746 BKlOIIMICA E BIOIOGIA •tOU COLARE llECEITOJU <:o.i Ul.AIIJ Ili .~f.Mf!aM~
.,

• Fam,glui <..; (cfa,st III) , membri di que)ta das~e legano il glutammato e il ~ABA oppure efficienza nella
propaga110 d 747
sono ..o,molu nel metabolismo dd Ca· o nel gusto. Tra gh appartenenti vi sono alcuni trasm1ss1one sinapt ne cl segna]
rea. Le p e. <:.rratte · h
de, rccetton metabotrop1ci per il glutammato (mGluR), di cui otto sono stati idenuficat,, ne proteina-proteina, fr :Oleine Shitnk O<,s nstrc e particolarmente im
~~~::~~~
0
ognuno d1stnhu1to in una regione specifica del cervello. li legame del glutammato provo•
!~::::~;~i.:nen11 lJro~:~u:0~:~~::: SH2~Src~:~; :1:;;;~;:~~ ';involt,
ca la produzione di un !>l:condo me,<,;1ggero, che modula l'attività del recettore per 11glu· nosce I a tntrmseca, (par 16 5 questo include anche al • • e nconosu e lega se-
timmato, caratterizzato da apertura diretta (ionotropico). I recettori mGluR contengono e ega sequenze ricche d .3 e il mo11vo SH cuni recettori con atti\'Jlà r;
un sito allo,terico .:he rappresenta un potenriale bersaglio per farmaci utih nel trattamen- scere e legarsi a quest i prolina. I GPCR 3 (Src homolog}' dom.1.1 3) h ~ o-
. 1van mo, -(F' , qumd1 p d n • c e neo-
to della mafatt1a di Parkinson (mGluR4), nella schtZOfrenia (mGluR5) e nella dipendenza ne allostenc_o. Nella g ,v, ig.16.JO "· ' oss1e ono domini capa d -
è rdn parte d . 1;.:,s1 sembrano h " • ncono-
~ droghe (mGluR2). un potenziale bersaglio per nuoe1'. cas, l'ident1t.1 d1 questi mo:nc e avere un sito d, regolazio-
E,istono diveN dati sperimentali che indicano che 1 GPRC interagiscono per formare 1agcnr, terapeunci. ulaton è sconosciuta, ma il sito
omo- ed eterod1meri e oligomeri Nel caso dei recettori delle famiglie Be C v1sono dati che Struttura deUe proteine G
mostrano che la funzionalità dei recettori è collegata a queste forme mult1menche, ma nel ca- Le proteine G sono er
so dei recettori della famiglia A questo legame è meno chiaro. L'unità fun11onale dei recettori (40-45 kDa), p (36- 40 kD:;:tn~t.'n, formate da una copia d .
mGluRI e GABA8 , della fam1gha C, per esempio, è un omod1mero. Studi d1 cristallografia a della membrana cellular y kDa che sono debol I ciascuna delJe tre ~ubuniU; a
p e attraver od mente attaccai ali
raggi X del recettore per 11 glutammato hanno indicato che il recettore cs1Ste m equilibrio di- -e y sono legate fortemente tr I ~ e e lipofiliche presenti suU be a superficie mteroa
namico tra due conformazioni, una Maperta e l'altra "chiusa': e che il ruolo del glutammato giunta al suo d1 legame pe I ab oro, mentre il legame con I be su unità a e y. Le subW11tà
a su ururà a~ -- d bo
ne e -terminale del recetto I . ""' Ia subunita a possied
consiste nello stabilizzare la forma chiu\J atuva. Al contrario, il recettore GABA8 è un eterodi- r a su un1ta R
. piu e le. In ag-
mero, che coinvolge due recettori della famiglia B. . re, ocaluzato • . e un Silo di legam
game per il n udeot1de guan i1cmo alla sua e:.trem,t • N . e per 1
-a regio-
L'atuvità molecolare e la specificità dei recettori della famiglia B sono collegate alla forma- . . ma che po ed .. -terminale
contenga il suo di legame il ss1 e anche a1t1v1tà GTP ' e un sito d1le-
21one sia di d1men sia di oligomeri. In alcuni casi la forma1ione d1 oligomeri coinvolge intera- al dimero py. Stud, dett per_ recettore, il legame awìene solo as1ca. Sebbene la subunità a
zioni recettore recettore, mentre in altri richiede l'associazione del monomero del recettore state identificate 20 d - aglia11 hanno ril'elaro che le proteine Gquando la subunità a è legata
. ,verse subun11a a, 6 b sono molto compi
con un membro di una fam,gha d1 proteine che modificano l'atllv1tà dei recetton (RAMP, Re- versi tnmen fun21onah G ~ . a
su unJta e I.? subumta Q - . .
a ye potellZ!almente molto grande
esse; sono
y. umd1 ti numero d1 di-
aptor Actw1ty-Mod,fy111g Prottm). Al momento sono stati caratterizzati tre tipi di RAMP
(RAMPI, 2 e 3 ). FS!>e sono proteine relativamente piccole (RAMPI è formata da 140 ammi-
Sottogruppi di proteine G
noacidi) con un smgolo dominio transmcmbrana, un ampio dominio extracellulare e un pic-
colo dominio intracellulare. Gli eterod1meri RAMP-recettore determinano la specificità della Sulla base della lo fu
'ù . ro nuone sono stati mdil'id 8
proteina funzionale. Per esempio, l'associazione d1 RAMPI con il recettore per la calcitonma pr unportant1 sono' seguentr uatJ sottogruppi dr proteine G I
• • Cl~~
(CL. Ca/c,tonm-rcaptor- L1kc) forma un recettore con alta affinità per il peptide correlato ge- • sottogruppo G., che stJmola l'adenilato crdasr,
neticamente a.Ila calcitonina (CGRP, Calc,torrm Ge11e-Related Peptide), mentre l'interazione
del rc~o.ettore CL con RAMP2 o 3 dà origine a un re,ettore per l'adrenomedulhn.i. Dati ottenu- • sottogruppo G., che inibisce l'adenilaro c1das1 n· al
ti .:on micro\copia confocale indicano che questi eterod,meri si formano nel reticolo endo- fosfat1dilinositolo 4,5-bifosfato (PIPJ; e a Ila cum canali per d K e l'idrolisi d1
plasmatico e nell'apparato di Golgi e si conservano durante il processo d, ei.ocitos1 ver~o la su- • sott~gr~ppo Gq, che accoppia i recetton con la mobih
perficie della membrana, durante il legame del ligando, durante l'endoc1tos1 e durante la de- sfohpas1 <;i, che genera I secondi zzazione del calcio attraverso la fo-
gr,mone controllata da ub,quitma (par 16.6.2, (DAG)·
" •
mess.1ggen mos1tolo tr1fosfato (IP ) d ' il
' e rac g1Cerolo

Comple'-Si recettore-proteine per la trasduzione del segnale • sottogruppo Go, che riduce la probabilit,1 d1 apertura d1 alcuni al .
dal voltaggio e coinvolti nel nlas.:10 di neurotrasmettitori· can I per rl Ca'' controlla11
Durante gran parte del tempo, i GPRC nella membrana cellulare esistono come comple¼i • il sottogruppo G,, che shmoIa la fosfod1esteras1 .in seguito•alla stimolaz• d U
o.on prutemc per la trasduzione del segnale, pmttosto che come proteine libere. Questi com-
da parte della luce. ione e a rodopsm,1
ple~si sono ~tahilinat1 da proteine ado1ttatrici o di impalcatura, che possiedono funzioni ana-
logh~ m.i d1ffor!''-~no per alcuni dettagli. facmpi di proteine adattatrid includono le proteine
StudiodeUa trasd uuone
· . G
attral'erso le proteme
mult1-l'DZ, la IJmrgha d1 proteine Shank e le proteine Homer. Come indicato dal loro nome
le proteme mulu-Pnz poS5iedono dl\cr~, domini l'DZ I PSD-95, Dig e Z0-1/2), ciascuno dei Per studiare le proteme G, e la loro mter,1z1one con_ recettori ed effettori intrac-'luJ · • ,
quali puo lega r~i alla regione C-tcrminale di reo.cttori diver)I e a proteine effettrici coinvolte f.atto · . _ "' an, s, .,
ricorso a una quantità dr metodi d11·em D1 seguito ne sono riportali alcun 1.
nella trasduwme dr un dato ,egnale. Il complcs.,o proteico che ne risulta as~icura velocità ed
• Ut~izzo d1 analoghi del GTP, che s1 legano alla suburutà a ma sono scar\Jmente idrolizza.
bili, come I S)GTPyS.
 ll\JClll\llC.A t 8101.0CIA MOUCOU.llli lf.CETTOJII <.;J LUJt.u1 DI M ~
7•S
749
• ltnp1cgo d1 to~sine hatterh.he, come k 10,~ina del colera e della pertosse, che agiscono co- Stato d, "l>OSO
rm ADP-nbosil transferan, nimolando il tr.isfenmento della porzione ADP-nbosio del
~AD alluuhumtl a di proteine G.l\clla praoca si utilizza NAD marcato con ·P.
• l.::tilizzo di :--l-et1lmale1mm1dc come inibitore irreversibile delle subunità a che vengono sc-
lemvamente o.lchilate. l•l ~ ¾ • ~-:
• lluhzzo della te.:nica di marcatura per fotoaffinità, con 1'1mp1ego di analoghi del GTP co-
me 11 GTP-u1doanilidc, ,hc viene ,on\'ertJto a nitrcne dalla luce e lega covalentemente le
,uhumtà a.
• lmp1~ di anticorpi diretti contro ciascuna subunJtà.
I r- I
• Uuhz.ro d1 te..-nKhe di donaggio genico e dt mutagenesi suo-specifica, accompagnate dal- l•l ~ ~ l•l
l'~pr~1one det dom in O<Xtn di Xrnopu~.
• Produzione di m::ettori chimenct con tccmche d1 mgegneria genetica. p '
Idrolisi del GTP , /
• Smt~-.,i e utilizzo di d1,e~i analoghi del lig,mdo per identificare le caratteristtche strutturah Oinocìlllone della subun,ià
e cmeti.:he del legame rc,:ettore-ligando. L'mtroduz1one della chimtea combmatoriale, che (d)
con,;cntc I.i sinte,,1 contemporanea di un numero elevato dt composti strutturalmente cor- E2
rel.111, ha acc~iuto l'importanza di tale metodo.
s p
Att,vaz,one dell'effettore
Ciclo delle proteine G
Figura 16 11 Trasduuonc dtl al NI

~n~::(;,7~
Il legame d1 un agomsta al recettore mnesca il acln della rrotcma t, (Fig. 16.11 ), nel quale
consiste in una molecola di GD~ e m ••I.I dal.le protl.'lnc G di membrana. la) Lo stato~
po~\Ono ~re tndÌ\'Uati i seguenti passaggi.
• ~dio stato normale a ripo~. la proteina G tnmenca possiede una molecola d1 GTP legata
:;~t: ;:~,~:~c~~~~~;: i,~:~~
1 0
~;~:~~::~:~ca!:~~~~1i~ ~,:~~:rli;c::;~
c1a11onc della proteina G dal re.cuore e b~~lltuz1one di GDP con GTP (cl 11 ltgime dt GTP a1Ua ~ -
alla subunuà a. A questo stadio la proteina G non~ accoppiata con il recettore ma~ situata (d) li complesso aGTP s1 lega .U'effcttore moaaZJonc del complesso ,ubumti a GTP dal.le <uburutl f}y.
, tdna a CS)(). condo effettore (E2). (e) L'atUYlt.l GTPas,~a~ t
nd 0 11
· compi~ delle suburut1 pypuò attavatt un
dalb d1SatUnuonc e drnoou1one deU'dfcttore.~~;;::~ra c.ausa I rdrolw di GTP a GDP «compagnau
te:
• L'agont)ta ,i lega al recettore per formare il complesso attivo recettore-agonista, mducendo ma al suo stato d1 riposo. (Riprodotto da I R. H ler e •~socia con tl complcs.o py,npon.uido tl <~te-
.:ontcmpora.neamente un rapido cambiamento conformazionale nell'elica TM6 del recet- Scm,ces, 1992;17· 383-389, con iJ pcrmcs\O d; EJscv1,
Scte1;;; l G,lman. G-Proll.'lns. Trmds ,n Brod1nmca/
tore, che attiva 11 sito d1 legame per la protema G, localizzato nell'ansa mtracellulare. Il
comple)~O si spo~ta per diffusione e mterag1sce con un complesso adattatore-proteina G e
i;1 lega ali.a subun1tà a. ~ella membrana v1 sono più molecole di proteina G che recettori. Ognuno d1 questi cicli pro\'oca una grossa amplificazione del segnale ong.male
• li legame del complesso recettore-agomsta al complesso proteina G-adattatore induce un Una data protema G può essere attivata da numerosi recettori (fenom•no , 1nd1cato come
ca.mbiamento conformuionale nel sito di legame del nucleotide guamdinico sulla subuni- prom1s..-utt.ì ddle rro1cme C.), mentre un dato recettore può interagire con dive ·
/ d ·• . ~ proteme G
ù a. causando la dbso.::iazione dt GDP e la formazione dt uno vstato vuoton transiente. e o pro urre p1u d1 una mposta (fenomeno indicato come
. .
.. ) ,.
ore ... n re-
• li legame d1 GTP al sito di legame per i nucleotidi sulla subumtà a mnesca un rapido cam- cettore capace d1 a1t1vare p1u d1 un tipo d1 proteina G, e quindi d1 mJZiare p1u di una nsposta,
biamento conformaz1onak nella ~ubunttà a, che si dissocia lasciando le subumtà G py in Viene ?efimto r t pi 1otrop11. mcticando c~e ha varie esprffiioni fenoupiche ). l"n

forma d1menca. Sta la ~ubumta aGTP sia il dimero Gpy rimangono attaccati alla membran esempio è 11 rcceltore umano della calc11onma, che s1 può accoppiare con G G e Gq• Jt j

cellulare.
Accoppiamento protema G-effettore
• La suburutà aGTP e/o ìl dimero Gpy si legano a una molecola effettrice inattiva causando-
ne l'attmwone o l'mtbwonc. Ongmariamente s1 credev.i che wlo la subunttà aGTP potes,e interagire con un effettore
• L'1drolis1 d1 GTP a GVP da parte del sito con attività GTPas1ca sulla subumta u termina
ma ncerchc recenti hanno d1mo)tra10 che anche 11 dimero GPy può agire come trasduttore in:
dipendente. Due esempi importanti del ruolo d1 Ga-GTP come tra~duttore sono l'att1\'uione
l'atlJ\'UIOnc o l'mtbcione, invertendo 11 cambiamento conformazionale originariamente
dell'adenilato ciclas1, che con\'erte ATP in cAMP (che funZJona come secondo me<.-.aggero), e
indotto dal complesso agonisu-reccttore. Questo facilita la d1~~1azfonc della subumtà a
della fosfolipasi e, che ,;cinde 11 fo~fa1idihno~1tolo 4,5-btfo~fato (PIPJ, un componente posto
dall'dTcttorc e la sua nassoaazione con il dimero Gl3y, completando cosi ìl ciclo.
~ul lato c11oplasmatico della membrana cdlul.m:, nei due secondi me,..aggen, mo,1 tnlo 1.1,5.
 91<)Qru&I<-~ E 91,,U)GI.U,IOUCOUIU! uu:TI'ORI a.JJ.l/lARJ 01 MIMIIIW;~

750 :751
. del ruolo dJ tra~duttore svolto dal
tnlo~f.ato e diaolgliCffOlo. La maggior parte degh esempi . no mduM l'anivazione del re- [E]

u ~~ [l]:
. , · d . G eG Traque)ti~o
dimero G~ysono rollegat1 ali a111vaz1one J '

aml-at,d JnwtJrd~'JY!"' Porcw1um chantieO.

. . il . 1 er il K GlRK (G-prottm-
._ettore chmuico ~•adrcnerg11;0 (jL\RK l. la fo~fohpa~• A1 e ~ana e p
1ll S K•
. d-" ___. ·
Regolanone cua tn,-UZ1one m
tdiata da proteine G
eh . indurre attraverso ,,/4as P
. G I d rs1tà nelle mposte e po~on0 '

L'rterogeneità delle proteine e a ive . . dal punto di vista biodumico, in
il mtema di trasduDone del ~nale, offrono diversi 'c·antagg• complesso Ga-GTP che si lega,
part1rnluc; amplifiazione, con trollo e ~pecificità..ili ,ascun
. 1 . 0 al rilascio di molte molecoIe di
per~mpioall'adffliutociclasi,puòdarcongmed a~m eso1ste muluple (amplificazione) da
· ' delle quali può m urre nsp •
~on d I m~ggen, aascuna . aie esse sono collegate. Il controllo vie-
parte delle 'l.itrc componenti del s1st~ma_a cascata al q\e il le amc del complesso Ga-GTP al
ne escn:1tato a li,-eUo del recettore, m v1r1u del fatto c dg I n re per il ligando (au-
dell'affimtà da parte e rece o
rc,ettore determina una dunmUDone . r·d r di GTP a GDP in-
mento della K..), favorendo quindi il rilascio del hgaodo, mentre i ~o ~1 un gruppo d1 oltre
verte uei.to cambiamento di affinità. Il controllo vtene esercitato ,mc e a
20 p~teine cluamate pr .. 1, ,, R( S (Rtg11/at1011 of G-protei11 S1gnallmg) che ~7no esse;e
suddivise m cinque famiglie sull.1 base della omologia di sequenza. Esse poss~e ono tutte a
capacità di legarsi alla subunit.ì Ga-GTP in un domm10 d1 legame per RGS (Fig. 16-12 ), dove
determinano due effetti:
• riducono tl legame d1 Ga-<..ìTP all'effettore;
• agi5'ono come GTPasi, accelerando l'idrolisi di GTP a GDP di ohre 2000 volte.
Entrambe quote azioni causano la disattivazione dell'effettore. Ciò può causare la_sop-
pres\tone del !>egnale, m seguito alla rimozione dello s~1molo,_oppure u_n d1ve~o d1Tez1o~a-
mento del !>egnale all'interno di un network d1 i.egnalaz1one. Ci sono md1cazion_1 ~e proteine
RGS ~pccifiche regolano specifici pathway accoppiati a proteine G: Questa spec1fic1~à è deter-
minata da una combinazione di fattori, che includono l'espress1one cellula-spectfi~ ~elle
proteine RGS, la locahz.z.az1one intracellulare delle proteine RGS, la prese_nza d1 dommi_ag-
giuntivi mpetto al dominio RGS, che facilitano l'a_ccoppiamento con spenfic1 pathway ?1 se-
gnal.uione, e la capacit.l di alcune proteine RGS di ag1re come antagomsll degli effetton pre-
\'enendo co,ì l'a"oppiamento di una proteina G con il suo effenore.
~tudi recenu hanno mdicato che la fosforilazione può essere un importante meccanismo
di a nivazione per GPCR E. noto da molti anni che la fosforilazione è importante nel processo
di Jeçensibiliuwone dei recettori (p.ir. 16.6.1) e nell'endocitosi (par. 16.6.2), ma sembra che
~'"!,>,.) ~•a anche coimolta nell'accoppiamento d1 recenon con specifici pathway di segnalazione.
Per ~mpio, ricerche ~ul recettore muscarimco M, hanno dimostrato che esso viene fosforila-
to dall'enzima caseina chinasi I, in un ~ito diverso da quello che causa desensibù1zzaz1one, e
che qutl>l.1 fo~forilaz1one è e:.senziale per l'attivazione dei pathway d1 segnalazione extracellu-
lare regolato dalle: chinasi I e:! (ERK-1 e 2).
I6.5.J Trasduzione del segnale media11te recettori con attivirà protein chinruica intrinseca
Da oltre :!O anni è noto che la fosforilaztone, associata alla defosforilazione, rappr~enta un
mec..anismo importante per la regolazione dell'attivita delle proteine Sono state caratterizza-
•
1m =
"-• RGS
[E] ..
I ,gura 16.12 Le proteine rcgola1ric1 ddle .
gatwamentc il segnale donno allo \timol~1!r!"c G lRC.S, Regularors ofG-protein S1gnallrng) rcgolmo nc-
centro), l recctton cellulan per I ncurotrasm lt e protcorc G dei r«cllon sp«ifìci. Nello ,tato a riposo (al
teme G esistono come etcrotnmcn C.aj3yco~ ~~~ ~g 10"I;0m non sono occupati <bll'~orusta, e le pro-
ormoni che socomportano come a omsu I H egato a 3 subumià a. li legame al r«e11orc (sopra) d1
alfa ~ubumtl Ga e il nlas.:10 di c.13; Il 1I mwa lo ~mb10 del nucleotide, che faalna il lega.me d, GTP
lare l'a1t1v1tà delle proteine effe1tn~ ~~~i),~atll:f TP-su~unitl a e il dimero Gl}ysono h~ri d1 rcgo-
di substrato (S) m prodoru che <Ome cum can 11omc1 o enum1 che convertono molecole
l'attività GTPas,c;i mtnn~ d:if~~~~! ~t~-:i:~~eie;;!!·1~le1it:1v enc 1 r;r;~:•: ~ causa dcl-
~TP-subunuà a (on basso i e aument.mo notm>lmen1e l',m,vit.l GTPasic;i m~seca dena':i%S:n:t~•~
Jt
I.: 1drohs1 GTP da parte della subumtà a termina le mteraz1om subunou a-effettori e promuove la nuso-
c1az1one cl complesso GDP-subun11à a con il dimero Gl}y, il cui segnale viene blocc;ito. (Riprodotto da
J. R. Hcpler Emergmg rolcs lor RGS protcons mcdl 11i;n.tllmg. Tm1ds 111 Pharmurologica/ Srit11<N 1999 io-
376-382, con 11 permesso d1 El~1cr xicn~., ' '~ ·
te un gran numero d1 chinasi e fosfa1as1 mtracellulan , e la loro atuvità regola tona è st.1tai colle-
gata a cambiamenti conformaz.1onah mdom nella proteina bersaglio, come risultato dell"in-
troduz1one o della nmoZJone di un gruppo fosfato. La fosforilazione può essere studiata uti-
lizzando 'P-ATP. Il controllo dell a111vita proteica da parte del sistema chmas1/fosfatasi si ri-
trova in molti orgamsmi diversi, mdicando che questo proc~o si è evoluto molto tempo fu.
Es~ opera con un consumo netto d1 ATP, ma con considerevoli vantaggi in term1111di ~ensibi-
lìtà, amphficaztone e flcssibil1tà, che compensano ampiamente il consumo di ATP (per ulte-
rion dettagli si veda il par. 15.4).
Recentemente~ stato dimostrato che un gran numero dt recetton della membrana cellu-
lare possiedono un'attività chma~1ca latente, che viene atti,·ata dal legame dell'agom~1.1 Lat-
tivuà di trasduzione di questi rccetton ~ collegata a qu('sta attJvità china~i..:a. ll legam1: del-
l'agonista mduce l'autofosfonla1ione di uno o piu midu1 dì tirosina, serina o treonma all'in-
terno della regione mtracellulare del r('(ettore, im1eme alla contemporanea att1va1ione del-
 ltE(FTJ'O~lfllWIA~I DIMI Mft¼~
IIOCIIIMICA I NOlOGlA MOlfC0lAU
m VS)
Sottoci.... 1
1'1ttn11à protem chm:u1~ drl J,~1111m,1 mtracdlulart' del rr.;t'ttore Hr\O proteine •_ntrac~ll~- EGF-R Sonoc.11... ID
bn Sulla base .klla speo6Cllà Jdl'at11,1tà ,hmas1..a ,, ~no di)Unguere due tipi princi- PDGF-R
NH,
pali d1 rtectton ~hma~,a
0 Sottocl111e Ir
NH1

g
Dominio dr legame
lnaultna-R
Rt.:t1tori um atth ,ti tiro~in dlinuica
Sull.i b4}C delle strutture e1.1ra- e intra,cllul.ari ~i possono d1~tmguere 20 sottoclassi di re-
Dom,nio ricco di Cys 0) NH, NH,

0
g
Regron, npetute
,Ytton ttrosm ch1nu1ci (RTK).1re ddle \Ottoda~i meglio caratteriu.ate sono il recettore per Dom1n10 d1 legame 1mmunog)obutlne-s,mlli
l'EGF, e qudh rt'I' I msuhnae pt-r il PDGf (Fig. It,,l 3). La maggioranza dei recettori RTK ~no
proldne monomrn,hr in 11.~nu dd loro agoni~ti e d1merichc in 5CgllltO al legame dell ago-
Dominio ricco di Cys 0~
Un1tàQP Unità-a
Unili- . Il Il
Il •Unità-I!
nis~ Tuttavu alcuni, tra ,u, il recettore pt'r l'imulina. sono dc, dimeri; m ogm caso è presente Dominio i

un solo donunio trarumt'mbrana m ogni monomero. Alcuni dau indicano che, come nel caso transmembrena
Membrane
dri reCt'lton 1,corr1.1ti a protdnc G, le proteine chin,lSI interagiscono con proteine della fa-
Siti di autofosfonlaz,one
miglia dellt' protcmc- ,h.ank ancorate alb mcmbran.1. • dt legame per l'ATP Dom,n, d, 1nterit0ne
li ,ito d, legame dc:ll'agoni\ta nei recettori RTK è localizzato nella regione extracellulare e Il substrato che contengono un 1 ,10
per r1utofo1fonl111one
gh.:os1lata, mmtrt' ,ub1to dopo la regione transmembrana è situato 11 dominio con attività ti-
rum ..hmaska, li legame ddl'agomst.1 determina un c.imbiamento conformaz1onale che COOH COOH COOH COOH
pt'rtnette a1 re<"Cltori o.:cup.itl d1 interagire e, quindi, d1 d1meriz.zarc. Tale processo è rap1da-
mmtc seguito dalla mutua autofo\fonlaz1one crociata d1 uno-tre res1du1 di ttrosma dc, do- Figura 16 13 Rappresentazione schemat,
EGF conuene due dommi d, I ca delle tre 10lloclass1d1 rtecttori urosm h
m1m llr0$IO chin,lSl,i di ogni monomero, che dà mi1io alla loro attività. I siti atuvall legano due dom,m. I due domim ncc~~:a~::~~:do vrcmi tra loro, cosi che ,I li~ndo s~ 1~:~•u~ :~~~
gl., dfctton, causando la lt1ro fo,forilazione e att1v.u1one e la formazione contemporanea dei In seguilo al le~ame, sia le wnodass, d, rccet~o 'lt?zat, entrambi vicino alla superficie delu mcmbrar!
complcaì rttettore-~nal.itore. Per que~to aspetto, qumd1, questi rec.etton ncordano I re- intracellulare Urosm chmamo posiiede on s,a quelle d1 PDGF d1menzzano cc»i che il do • ·•
le forme monomenche. LI sottocJ.... duna magg1orr at11v1ta e un'affimt~ d1 l"">me .i~m..t• r .,,.nunlt_•,o
~ton a...:opputi ;alle proteine G. Anche questi complessi vengono stab1hzza11 da proteine m I ~~ 1recettori msuhmc è i
a, ~omc ne caso delle so1toclas11 I e lii c'è t
,. ..,.. - •••r
• ormata"" recettori effemvamente d1mcnci
o .u·
adatutm.,, la ..u, 1denut.a è pero diversa da quelle il!>~oliate con I GPRC. Qu~te proteine m- scgu1l10 aJ ~cgal me. I dom1m llrosm chma~1c1d~ll~~o;;t~l;::nca fral lc du_c mclà al} di ogni recettore~
omo og1a ,ra e tre sottoclasii. 1sono e reg,oru che mostrano la magg,orc
dudono Gab-1, p85 e Grb2. Gh eftetton e adattatori pos~tedono domini d1 legame comuni
per I residui d1 umsm.i .:he sono stati fosfonlau dall'atuvui ttrosin chinastea, che possono
essere s~ ,,cm, si.i lontani d.11 \Ili con attiv1tl chmas1ca, includendo I dommi SH2 e I domini
di lei;;amc pt"r fosfot1ro\ma (PT B) l'effettore può possedere de, domini d I legami aggi unuvt, seguito della d1menzza2ione e autofosfonlazione I
ai qu;ah ,1 ~wno legare altn ctfctton. Come conseguenza di questi dommi aggiunuv1, il lulan e operano come una normale chmas1 recett~r~a't:.csll ca~, essi legano le chmas1 intracel-
pnmo dft"ttore agisce come un ad.matore per 11 ~econdo effettore, generando cosi una rete di
. Come t recettori GPCR, anche• recetton protem chmas1c1 attivano numerose vie di trasdu-
pathway di Kg11al.111one, potc:nzialmente capace d1 formare pathway secondari per nspon-
zione del segnale. I componenti d1 questi processi d1 trasduzione localizzati 3 \alle c
dcrc alle nch.ieste della .,ellula. d~no le fosfohpas1 e le _fosfomos1t1de chmas1, che sono coinvolte anche nel StStema d::~;:::
'ZJone
h delèRsegnale mediato dalle
. proteine G. Uno dei numerosi effettori unici per Ie protcm ·
Rcuttori ~ • e trconina c.hinasici c masi as, una _proteina da membrana che lega la guanosina e possiede att1V1tà GTPasica
Oltre al gruppo di recettori con ani-.ità l!ro\in chinasica, esiste un secondo gruppo di re- mtrms~ca e partecipa a1 meccamsm1 eh crescita e sviluppo cellulare d1 tutti gli rucariou.
cctton protnn chmasl\.7 complementan, caratterizzati dalla capacità di autofosforilarc I res1- Per 11 meccanismo d1 controllo della trasduzione mediato dalle protein chma~i è d · .
dw d1 suma e trronina localu::z.ati nel dominio intracellulare del recettore. Questi rccetton se- · · J I' · d. , 1 1m
P ta. nza cruc1a e emtenza I un gruppo d1 fosfatas1 che possono disattivare Oatth·are que-
or
~ treorun.i chllUSlO sono specifu., per I membri della superfam1gha dei recetton per il fat- ste vie d1 trasdu11one del ~cgnale mediante defosforilaz1onc. Sono state identific.ite fo)fatasi
torc di c.~ata trasforrrumte (1 Gf)~~-che_~cgola la crcs.:ita, il differenziamento, la migrazione specifiche per la urosma e altre che agiscono )U senna e treonma come pure ~u uro~ina. Al-
e I adeswnc crllu.Lue. f...Ul sono dass1bcat1 m van rottogruppi in base alla loro struttura e, so- cune fosfatas1 sono esclusivamente cuopla)mauche, mentre altre sono ~•mih ai recetton e
prattutto. m funzione dd loro dom,mo scnna/treonina chmasico. Sono tutti recettori con un contengono un dominio transmembrana. Per ragioni che rimangono ancora da chianre, la
ungolo do1rumo transmembrana c. in seguito al legame del loro hgando, formano compl~si maggior parte d1 e~~e possiede due domini fosfata,ic1, ma la loro ~pl'Clfiutà potrebbe essere
~t'TO o!Jgoma10 fra ,,m llp1 d1 sottogruppi. Ciò stimola l'autofosfonlazione e l'attìva1ione correlata all'interazione tra que)ti due s111. l 'attività delle fo\fata~i ~embra corrdata alla lo-
ddl atU\ita scnna/trconuu duna.sia ,nso altre proteine otosohche, che fanno parte del pa- ~forilazione cui e~se stesse vanno incontro; molte d1 quc\ll: pre,entano un dommto Sli2 per
'™ar d tnsdUZJOne Akuru rect'tton per I fattori d1 cres.:na non hanno atti\ità china.sica a
11 recettore tiro)in chinasico.
 lt!CtTl'ORI CUlUIARJ D I ~...
&l<)CHl"'10. ! ai()IDGIA MOlLCOI.AR!
r54 755
• lnternalizzaz1one dei re .
cetton per formare un .
16.6 Dcsmsibiliu.uionc e riciclo dei recettori • Trattarn.ento mtracellula d li' ' ::i m121al o , , , ' osoma.
- re e endo
cetton sia a!Ja loro degradazione . soma che può portare sia al succe\sivo ridico dei re-
, tn seguito alla fu · d ,
16.~ I DtSensibìlizzazio~ dei recettori L'endocitos1 è il proce sione ell endosoma con un lisosoma.
.. . sso con ti quale m OI I
· · - ,. d tt · delle membrane cellu- clusi 1 recettori, vengono tnglob eco e extracellulari e proteine di membrana i _
l/na delle caratteristiche di tutti e tre I gruppi pnnc1pau I rece on . . ate nella cellul p . , n
lan è 11 f~omeno della d scn, ,. ., onr, caratterizzato da una ndU21one_ 0 interruzione stato studiato utilizzando tee h d. a. er 1 recettori, questo processo di u ·-•·- ,.
mc e I fluoresc p......: e
della nspost.a cellulatt, nonostante la presenza continua dell'agonista. Tuttavta, -~ _u n p~nto na verd e fl uorescente O con una . enza marcando il recettore con GFP una protei-
. . . ' sua vanante g '
. . . . d« li locità di desens1bilizza2.1one. d 1 recettori accoppiati alle prot G eneticamente modificata ( par. 16.3.1 ). Nel caso
d1 vista cmeuco, fra que5te tr~ classi vt sono inerenze ne a ve . . .. ,.. ,.. . . eme , il recettore d I · •
~d CtiO dei canali ionici attivati da hgand1, di cui nAChR è un upico esempio, la desensibillZ~ su 1sce ,os,on1azione ltgando-d'
b d opo aver egato il hgando e la proteina G
• . . ipen entcdapa I d' . . ,. •
ZatJone avviene entro pochi secondi dall'attivazione da parte dell'agonista, ~en~re nel~~ uno d. et complessi d, proteine ad tt .d r e luna GRK; ciò s.tunola I interazione con
• ,.. il' a atnci ella fam 'gh d li
1 a e e .,-arrestme. Questi adattaton et-
A
GPCR e dei recctton protem chìnuici la desensibilizzazione nch1cde mmun e, m tal~i casi, toso I1c1 ,ac 1tano la distruz,on d
. d' · "tà vi sono • e e11e utterauoru d · ·
ore. Que5te d,fferenu mdicano chiaramente che alla base d, questa perd1ta 1 atuvt mento d e1 recettori in im., n 1 e, recettori con le proteine G e il recluta-
mea:uusm1 d1vtn1. Nel caso di nAChR, la conformazione desensibilizzata del recettore pos- il recettore a una protema chia z1om
.
,tilt ( ,a, ' )r, · 11 d Il
e a mcm b rana, dove ess, collegano
mata c1atnna attrav
siede un'~nità maggiore per l'agonista, rispetto alla conformazione attiva con il canale a~~- mata AP-2. Questa protema mter fi . erso una seconda proteina adattatr,ce chìa-
to, e qu~t.1 maggiore affinità è sufficiente per indurre la transizione verso lo st~to d~sibt- invaginazioni rivestite sia il re lagttsce con osfomos1t1de e promuove sia l'assemblaggio delle
hz.zato, m.t non prima che tl can.lle ionico si ~ia aperto e chiuso molte volte._La n~~u~n~ del-
••
v1cmo all'estremità C-termutal d
' e u amento de, recett · · ·
.
u .
on att,vau. na regione Tyr-X-Arg-Pbc
. . e e1 recettore s, lega , · à d•
l'agonJSt.t inverte immediatamente la desensibilizzazione. ~ noto che alcuni canali 1oruc1 con- estremità s1 lega alla clatrina Le . . a un estrem1t I AP-2, mentre l'altra
troll.tti da ligandi ~ub1scono anche una fosforilazione in seguito all'attivazione e che anche datrina, localizzata sul lato. c1't1onvalgutaz,om nvesute sono regioni della membrana ricche di
P asmallco Le mva · d
questo può favorifl' la desens1b1hz.zazione, ma attraverso un processo cineùcamente più lento. un'area della cellula un pro · gtnalloni ten ono ad accumularsi in
• cesso noto come a• ••r· r 1 ( 1
Si ritiene che la cineùca lenta di desensib1lizzaz1one di GPCR e dei recettori protein chinasici fondersi. La clatrina consiste d. t "' f Jmento P111~ 1o11.11), ed eventualmente a
1 re catene pesanti e t t I
si.t collegata a una modificazione covalente del recettore dovuta alla fosforilazione in un sito - zare per formare una struttura . re ca enc eggere che possono polimeriz-
diwinto da quello di autofosforilaz1one - che è un elemento essenziale nel suo processo di at- del recettore La I' . o un reticolo a gabbia, che si collega all'estremità C-terrninale
tivazione. La fosforilazione post-att1vaz1one di un residuo d, tirosina, serina o treonina, nella zione delle c~ten:~/menzzaztone della clatnna a formare la struttura coinvolge la fo~forila-
regione intracellulare del recettore, introduce un gruppo fosfato polare che può indurre cam- d ' f, f, ~ere 10 d'.vers, Sili, probabilmente per intervento di chinasi diverse Tale
bwnenti conformazional1 deleteri per il normale funzionamento del recettore. Studi con
processo ' os o~1laz1one nch1ede energia e guida l'intero fenomeno dell'endocitosi Ioni eai.
GPCR hanno dimostrato che la fosforilazione da parte della chinasi attivata da un secondo m te~eng~no ne a stabiltzzaz,one della struttura di clatrina La rete formata da cla~a oh-
m~ggcro, come la chinasi dipendente da cAMP e la protein chinasi A, determina il disac- menca guida la deformazione della membrana e la gemmazione delle mvagmazioru riv~te
formare una vc~u,ola cndri,1toll,,t. Una volta formata la vescicola vi·ene il • a
coppiamento del recettore dalla sua proteina G. La fosforilazione può essere promossa anche d' I · • , perso nvesumento
da una famiglia d1 chmas1 contenente sette serina/treonina (GRK 1-7) capaci di agire su d 1 c atrma per azione d1 una proteina da ~shock termico" (hsp70) • Qu d' l I · r
m 1 e vesc,co es, ,on-
GPCR legate ad agonisti o dotate di attività costitutiva. ~ stato anche dimostrato che la fosfo- ono per ~armare un endosoma mmale o reccttosoma (Fig. 16.14). La formazione dell'endo-
rilazione dei m:ettori può innescare l'mternalin.monc e il traftìckmg (riciclo e degradazio- soma lascia la reg,?ne_c1toplasmauca del recettore esposta all'ambiente esterno. Oltre ad AP- l
ne) dei recettori. l'intemalizzauone può avvenire con vari meccan1Smi, quello conosciuto più e AP-2, sono state md1viduate altre molecole adattatnci e c1 sono evidenze che due di esse, AP-
dctt.1g)iatamente è l' .· .:< ,1tm1. 3 e ~P-4, poss?no ~gire m maniera md,pendente dalla clatrina. I dettagli molecolari del mec-
camsmo agomsta-md,pendente per l'internalizzazione del recettore sono meno chian. Sem-
bra che arrestine e GRK non siano rich1est1, ma che AP-2 e vescicole nvest11e con clatrina sia-
J6.6.2 Endocitosi e riciclo dei recettori
no essenziali per la formazione d, un endosoma.
L'intemahzzaz1one e il nc,clo ( traffickmg) dei recettori è stato studiato in dettaglio per i re- Una volta che l'endosoma è all'interno della cellula, la datnna viene depobmenzzata, pro-
cettori GPCR, in particolare il recettore ~,-adrenergico. Questi studi hanno rivelato che questi babilmente da parte di hsp 70, con la contemporanea 1drohs1 d1 ATP. Una volta all'mterno dcl-
proc~,i avvengono in tre fas,. i'endosoma, i recetton hanno due possibili desuru:
• Spostamento dei recettori verw ,iti di endocitosi ben definiti nella membrana. Normal- • defosforila21one ~eguita dal riciclo verso la membrana, con la quale si ha il ripristino di un
mente l'agon~ta è legato al ~uo Mto di legame sul recettore (m1,•r,,.,h11111one d1pcmh nk recettore funzionale;
daU agom a), ma in alcuni c~i questo processo avviene in assenza di agonista legato (m • proteohs1, che causa un decremento netto della funzionalità de, recettori d1 membrana, un
tcmahzzaz.10ne md1p~dente dall'agomst.l). Nel caso del proc~so agomsta-dipendente, il processo noto come ·/, 1r 1.111011.
recettore "'ene fosfonlato da un enzuna GRK prima dell'mtemalizzaz1one.
La scelta dell'una o dell'altra possibilità m seguito a endo~1tos1 (e11docrt1c sortmg) è deter-
 ~~["&IOI.C>GIAMOl.f(X)L,\&1 IIIOTTOIJ WWLu:l DI "'°41!1A11o'.A

.. '157
sembra ns1cdere nella lo
. ro regione e
una .proteina d1 segn~ az1one chiamat~ak Quest.t ~ione del n:ccttore tnttta~e C'On
li-o,, non occupa\J un lisosoma: la con~uente d1m . nexin I , che promuove la fusione dell'endosonu con
downregulation del recettort med:~07 del ~H nella \C><.-icola a un ,·afore dt 5.3 fa..1ltta u
downregulation di~ndt anche~ bp o~eofu1. \lcuni <bn mdi~o Lhe questo pro.:e-.so d1
mtma ha un ruolo an1, o t noto Int u ,chqu,LJDaZJone del r«ettore, un Pf0\:C1.1.o nel quale l'ar•
gradaz1o ne, e il proc~ so coinvolge d atti e I ub1qwt m.a • nurc.a• k proteine de,tinate alla de•
"-tori ,.,.rortlau
dapAltlldtGIIK
• Gran parte della ricerca t\ ent proteasom, (par. 15.5.4).
~UJ meccawçnu d Il' doc
e....-mbJ1t11n
v-.:ota madtanta •
•
(&) Riciclo dei
z.ando relativamente r nnrhi
-
re cttton GPCR e e en h CJto~i dei rc«tton. . ~ ~t.lta ~ , 111 ut·'IZ
.••.,_ u •
re per 11 fattore di cre.cua ddl d . poc I re..etton protem china~tLt, l"omc il recctto•

.-:~~ o·~·:
,,..,,_,ne• AP 2 ...uon d,reno
• • dal don"n10 POZ enducitost collegato alle clat epi emude (EGRl. ~on si A ancora quanto il men.'anlWDO di
121 Endod&tOOI lloelclo ~ • del , _ . , , . . . d . ll nnc suvalido ndca~d1 I ~,
t1p1 t cc ule. E, imece, churo che tutti g 1...tn tip, di recetton e dei divent
1
c~ton dipendono <b numerw opr0$_ione. I.a regol.mone e la d~nsibihnu1onf dei rr-

O V-,colo riVMtlta
Cendosoma 1n1111t1)
d1tnn1
c1epo4,,,,.nzzatt
do hop70

11-Arresuna
'
► Ub
V-.c1col1 non
"""1111
f•ndotomol
0egr..ia,1ont1 dtrwtta
da nn1n 1
,
(51 Fuaionll con un , _ ,
• it.grada,,one del rwcattora
per meuo dal prot..-om•
livdlo dell'mtttfaccia della ffltnl:rerw~roiema -proteuu, molte delle quah .iv-.engono a
conformuiorali cruoali nd
.
.
z1one rc-.er~tbile mulu~ito noi.
cctton. e lk1 loro effrtton.
ran.a P . altea, e che ogni 111teraz1one causa Lambi.tmenn
l'CCfflort e/o II loro .....0 1a1
torc alle richieste delle cdlule O dcll
intero orµnwno E _,_
f
'be un ruo1o ondmimwc l' ·

La varianone nel tempo dd numero di rrcetton

bili per il legame di li;andi t al nsuluto
,
..., on,~ 11c1.opp1a.re I attt,1t.l del re.:et-
· ugu,wuente C\ tdente .:he la fo~torila-
ne w n-goIu1one Je1I.atti, 1tà dei re-

presentt ~uta su~._,e cdlul.tre,d1spom-

dir•tt• d1 ub•qu1t1na ldownregu,.rron)
Figura lb.14 Meccanismi d1 mtemahZU11onc e ~rtrng endocttotico per I rccenon agonista-dipendenti ac-
coppiali a proteine G. (I) Jrecettori occupati vengono fosfonlau (P) da un recettore clnnas1co accoppiato a
una protrìna G (GRK) e ciò porta al reclutamento dcUc arrestmc. Queste ~nono come proteme adanatnc1
collegando i recettori fosfonlau con I componenti responsabili del tra.1porto, come la clatnna e le proteme
adattatnc1 AP·2, e ti loro reclutamento m mva~m.moni nvest1te di clatrma. 12) Qu~ll complessi, aiutali
dalla clatrina che forma un reticolo, "gemmano nd citopla.1ma e portano alla formuione d1 un endosoma.
!,1osservi che il domm10 c1toplasmauco del recettore nmane esposto al c1topl.t,ma m seglnto a endoettos1.
(3) La struttura di clatrina viene depohmerizuta e la clatnna ,·iene nc,data nella membrana mtema. (4) I
recettori ~no defosforilati e come multato dcli interazione d1 EBPSO con un domm10 POZ sul recettore, n•
tornano vcf)O 13 superficie cellulare, detcrmmando una rucns1b1hn.monc furmonale. Altemauvamente,
(5) 1recettori defosforilat1 vengono marcati con ub1qu1tma ( Ub) e seguono 1I pecco= che conduce allJ de-
grada11one. Qui"" mterag1scono con nexm I, che promuoH' la fusione dell'tndosoma con un lisosoma e
la degradazione del recettore per meno d1 \'ar1 proteosom1, un proce,so noto come downregulat1on. (6)
L'apparato d1 Golgi secerne molecole di recettore d1 nuova ~mte,i, che unno per c.ootos1 verso la superfi•
c1e c,terna della membrana li bilancio fra nc1do, degrada11onc e smtcs1 del recettore cd endocìtosì deter-
mina, a ogm momento, 1I numero d1 recettori fun11onalmente at11V1 pre~nt1 sulb membrana cdlulare
sìntesi d1 nuovi recettori, eh ;mpl~t\o del proa:,so d, nctdo dei re.:etton e della
minoac1dica post. all'inmo ~~:ime n rtucolo mdopl.umattco rugo~. Una ~uenu am-
J'appanto dt Gol1:1, do,e viene protema dc-tmnma ti ~uo ncono...,mento.e il trasporto nel-
~ ~h,OSJ.la~ unpi,dlett.tta tn \'C)(l._oJe e inserita nel!., membra
na per t "-cl 1• un pro.:CSM1 nel g~r Li datnna gux:a un ruolo fon<bmen1ale. ll bilancio tr:
smtes1, n ei o e d~ a ~ dt1 m,- ..on e ~etto a, :u1 mec, am,m,· d1 controllo. co.J che
. . ~
la dtspombi11t.1 d1 m:etton liben ndla ml'tllbrana e~terru t ad~uata ai bi~gnì fi~tologiu del
momento. Le' anwom nel tmipo dd numero d1 re,etton d1 mt mbrana ~ono tmporunu an-
che nella nspo,ta clim,a alla '°mmtru,trmone ,ontmiu dt tarm.a.i, ,hc: porta alla down~ .
latton del numero dt m:ethm, e m .:-onJIZIOru nruroJegenerat1,e nelle qu.ih ~ <.earcnte il ril.t•
scio ddl'agoni, t.1 fi, 1010!;1.:-0. c.lll.sJ.nJo una -.onaregolazion..- del numero di re,ctton.

16.7 Suggerimenti per ulteriori lettutt

minata da ,egnah d1 J1\tnbu11one ( ,.,,,,,,~ srg11,1/) . ll principale di qu~tl segnali sembra ns1e•
dere nella regione citoplasmatica del recettore stesso. Per esempio, per il re1.ettorl' ~ -adrencr
g1co un domm10 di legame PDZ. presenle nella regione C-terminale, mterag1sce con una pro-
tema chiamata EBP50 (E::r111-111oes111-B111d111g P/,05pl,oprotm150), detcrmm.indo ti mhw Jcl
recettore m un proccs~o che coinvolge anche l'am:stma e una proteina nota ..ome NS!! (N-
ttl1ylmale11111de-Sc11s1twe Fimo11 prote111) (Fig. 16.14). Chimere del recettore pme del domm10
PDZ vengono invece dirette verso la degrad,uione. I receuon drreui \cr~o il riliclo ,cn~ono
prima defosfonlat1, da una fosfatasi assoC1ata all'endo\oma, e pot mielati vcr~o la membrana
auraver~o ti comples~o d1 Golgi. Nel ca~o dei recetton diretti \erso la degrad,monc, 1I ,egnale
h )R.\tA, , J. L, IA\ ,, T cd T ~ of~ror Pharmal'lllog), 2' tJ CRC Pm,, ~cw )ori,; lC>O!.
Au1orevok ù1mrmd10 1ulb btolopa molc,.'Dbre Jet rt1:ctton, ,ugh upen1qu.,nutam I Jel legame
J d h~.1nJ1 e dc, ,1,rem1 d1 trusdunooe dcl ~ak Corrcd.tto d1 <'l>trrn1per gh Muden11.
H AR01,c,, f , CHOl :um 8 Z. cd. Prottm Lrgand lntm;cnons; ~tnirturt and Sputr,,scCJpy, 01.forJ
l nl\a,m Pre,,, ù\ford ~001
PartK,,larm, nle uuk per la trattazIO!lf Jclle appli,-.inom d1 ,·arie tcrni.he , pcttros.:op1,he nello
,tud1ll ddla ,truttur.i dei l't\:ttton e del l<'gJ.mt dtl ltgando
!\lot.LL\IA,, \ J\zt(h <.."lampms An lntrudu.t ry Guulr to Patrii Oamp ElcctrophJ wlog, \\ 11(1, lh1
~~ r ~J '
tìuida ,mll'1t'11 olla t,10fi,1,J deUt membrone, alla progtttmonc dc:gh ~penmenu, .ùl anal1,1 dei dJ
li< at problemi 1.:--n1-1 rei.imi al metodo p.it<h clampmg
758 BJOOtfl?JJCA UJOIDGIA MOl liCXll U!

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tlook. Trrnds ,n 8iot«hnology 2003; 21: 30 J -305
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Siti web utili

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< www.gpa.org> <www.cis.upcnn.edu/ ~kricc/rcccptor.htmJ>
Endocitoi,,i dei recettori
<www.q'tochcmistry.net/ccll-biology/rccend.htm> <cellbio.utmb.edu/ccllb10/reccnd.hun>
Tc,niche
<www.bio.:hem.ari20na.edu/tolhn/cpwr/pnncipl htm>
<www.b1acorc.com>
 L
a sesta edizione del manuale a cura d1 Ke1th W1lson e John
Walker conferma le caratteristiche di unicità e completezza
che ne hanno decretato 11 successo come testo d1 riferimen-
to per studenti e ricercatori L'esaustività nel riportare In modo ri-
goroso I diversi principi metodolo91c1 e gli aspetti sperimentai! del
le tecniche della b1ochim1ca e della b1olog1a molecolare ne fa una
sorta di vademecum che contempla tutti 9h aspetti delle b1osc1en-
ze e della ricerca b1omed1cale e b1och1m1ca. In ogni nuova ed1z1one
si è avuto cura d1 aggiornare e di approfondire 9h aspetti che risul-
tano cruciali per l' evoluzione seguita dal campo spec1f1co La nuo-
va edizione, in linea con questi princ1p1 di riferimento sI focalizza,
con capitoli del tutto nuovi, sulle tecniche che 0991 contnbu1scono
in modo decisivo alla conoscenza della funzione cellulare - le tec-
niche di colture cellulari. la microscopia, la spettroscopia d1 mas-
sa, fondamentale per 11 suo ruolo nella ch1m1ca delle proteine e nel-
la proteomica-, oltre che sull'analisi stat1st1ca, sulla bioinformati-
ca e sulla biochimica clinica.
Questo volume cost1tu1sce una lettura fondamentale per la forma-
zione nel campo delle b1oscìenze e della b1omed1cma.
Mirella S. Pilone
Loredano Po/legioni

Kolth Wilson o prof-11.nn1 omento di Biochimica

farmacologica od e stato direttore dal
dlportimonto di Biosclonze, preside dalla facoltb
di Scienze naturali e direttoro del Dottorato
di ncorca alla Unlversity of Hertfordsh1ro.
John W'11ker ò direttore e docento proaso
la School of Lif o Sciences e lo Scienco Training
Contro della Universtty of Hertfordshiro.

€ 104,00
I\lh I 603 Il

"W\\ rullaellocun1na 11 JJU1llm

 Indice analitico

Aberrazione cromatica, 134 Alcol deidrogenasi, 659,697 Ant1corp1, 287-340

Abmni,687 Amminoacido a singola citrna, )() I
Accopp1amcnto abbm.'la.11one, 342 amphfkanone dei geni ptr,
eteronucleare, 599 anahsi,311 300-301
omonucleare, 598 C-tmninàK',545 antITT«Uore, 738
Accreditamento (d1 laboratori cli- ionizzazione degli •.Hl ·3« biotmila11one degh,321·323
nici),63 N-tenninak,'45 cauliuc1, 649-650
Accuratezza, 31, 35-44 PTH,373-375 dumena,302
Acidi, ionizzaz1onedegh, 11 :A.MP (come effettoruHo~terìco), dm1ficaz1one degh, 289
Acido b1cinconm1co, metodo deU: 682-634, 704-708 fmnmcntanone ~ . 289-~91,
31,350-351 Ampaezu dèlù banda, s.t8 303-309
Acrilammide, 445-446 Amplicone,209 marcatura degli,315-32!
Adattamento indotto, modello Amplificazione, 707-709, 750 monoclonali,:95-302
deU' (enzimi),684 casuale di OSA polimoifko unwu,299
Adattatori, 227 (RAPD),203;:?10 pohdonah, 293 -29◄
Adendato ciclasi, 707-709, 747,750 enzunauc:a,707-709 primm,315
Adcnma, 166 Analisi prod1111onc degli, 293-294
Adenosina automanuata di enzimi, 53-56 punficaz1one degli, 303-308
monofosfato, vedi AMP (come biochimico-d miche,47--65 radiomarcatura dcgh, 316-318
effettore allosterico) digitale dtlle unmagim, 157 s«ondari,316
trifosfato, vedi ATP come effet- d1 rotrizione, 197 ,truttura degh, 289-~1
tore allosterico isotermia, 532 umaniuatt, 30?
Adiuvante, 294 295 qualitatt\'a (crom.uognfìa), 486 Antrgene, 288, 294-295
d1 Freund, 295 quanlltatl\-a (cromatografia), 486 Antisiero, 283, 293-294
Adsorbenti, 506-507 Anahu, 27-28 Apertura numerica, 137
Affinità,co~tantedi,672, 714 Analiznton- dtlfaltau degli 1m- A~nnma,658
Agar,311 puh1. t>'25-626 Ap~amcnto complementare del-
Agarosio, 31 1 d1 Frynte, 73 le ba~1, 169-170
gd di, 443-444, 462•467, 520· d1 mass:i, 403-419 Appawnento delle ba~i (DNA),
521 a quadrupolo, 403-404 168-170
Agenti a trappol.t 1omca, 404-406 Approccio al metodo d'equilibrio,
antimicrobict, 73 a ~tton- magntnco, 407-408 721
caotropici, 528 Analoghi ddlo stato dì transmo- Aptene, 294
dematizunt1Ch1rala, c; 13 ne, 686 Area relat1,-a del picco, 47, 480-482
Agglutinazione: dcUa lcdma, me- An~orags10 alla membrana me• Armad1rtto di ~teurnu, i l
todo per, 120-122 d1antc GPI, 379 Array, vedt \hcroarray
Agonista, 713-717, 720, 723-724, Anhpat1co, ,1s. 741 Arrhen1us, equazione di,685
~ ~o ~43,i45,74R-750,754 Anfohll 4;2 .~sorbanza, 54i
completo, 713-71 4 Anfotencma B,80 Assorbimento a raggi X a singolo
IOVCr\O, 717 Angstrom 4 fotone o a energia doppia, 546
Am-.otrop1a, 590 Atmosfera 1omca,8
ncutraJe, 717
Anncahng. 172 ATP (come effettore allo\teuco),
par1iale, 713-714
,r. • ,4., Antagoni\ti. 714 682-684,704-708
Agrobactt'm1111 rume1c1c1cm, - ,
Anu~oagulanu, 52 Attenuazione, 548
Ak1an Blue, 380
 D.DIClcAN'1 ITIUI

I C"..olonn, I cmru:u.opaib)

~-·
~ ar1Udi&41 ◄ I .Omr,lni, l i
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~~rww .. ...._ • .._.. aa. 11 411 ~ =:c!OlK IUDdard, 11CUran, 7◄ -75 Gromato{ooila- 517~11 Gromobv.™
~ "'-"--~ ~ I U ll • I& I uno.al ( ~ Cunr.&16.0C
~ 11111 .si.--..11» aubcolturr,al M I adUIÌOIK' ~~ fil Qutaddanip.7.M
l'rwo:ulrl 441 lt'CDJCM htttidit, 7!1 -u trmoncl. ~ 36S...r.'O. S18 c;mqc.«,J 4
(~UJ lrtpilfllZllllOflf, 8) m. ua c-w
Cdmcrlt ~1bhù ddk c.clluk, YO 91 a Kambio IOIUal, ~ Sl4 ~111 di alibrmlW .~~

elllaacraloCKidui,t.71 V>lumn n.,tclung,.490 b~ . "7 ~ 2 r:

duralr 511 su

...
e c.r.:,po di aibrrul Cmnnito wn tm:> Mli r~iovru
---~(..ul pairolosl Ad'1IOff (un, con lip o:!bU111. m m Oatson.5
11:ctia d <.di Ulhu u,nlmtr :9 [ )c:ad>ftld
mnur on Uu-,çrow l'llho
tt ~e IO gtm 4
da.d..~=:o.D-:SOI
 r,;mCL,r.llAIJ'TICO ll\'DIClMAUTJCO
i 68
i69

~ dnucnto catena - dd, 169 a tcmpofuso(cnnm1),66I Elettrodo

di puu...ilca,6U pH. effetto dtl,t>119
co,tante d,, 614 catena + del, 169 di Horchst 33258, i7-78 a calomdano, 19
EMTT,"wdi lÀlllgglo lllllllunol<>-
pu induz,om I.i~ 595.597 <ampkmentar.c, vedi h'brrne d, unmunolog,co, 323•3.33 ad atgmto/cloruro cfaq,m10, 19 rnr,ont • due •Db6lnu. fù7•
p:D l mu\t1~ fflZI• 682
post-so~te (spcttromrtna d, cDNA a molt1pl11:azionc enzunat1,a a o..,gcno, 2'4-26
mauca <tCT"<O,re,:1fi<ill,6Sl.
m35'1), ◄ 16'418 curva Cot, 174 (EMIT),SS di Ranlc, 24-26 Emootom,tro,
elettroforni, 19'-195, 462·•66 ampbficato,330-331 apH;tJ.23 tempo-arura. rtTmoddl.,,b85
r.id,oattivo,612·6 15 Endoc:itOlÌ.1St-;ss 61,9
srnedi,614 fingerpr1nting dd, 276 mediante 0uoresccma. 332 avctro,22
Endonutla.J di ~ . lii- vdocitàiaimlc.~
Deconvohmone, 149- 150 footpnntmg del, 270-272 medi.mie wbstrau fluornotn combllllto, 22 1119
forma A, 168-70 u omogéllO (SLFIA),333 d, rifenmmto, 18-2.J cl.u.,ficanone e "1i:lerldatura
Dtga.iaamento(~ l,499 Endo
per ampldicaz,OM dÌS.lOCWJO• gas-sensibile, 24 dtgb. 658-{)59
Del Castillo-K'aa; moddlo dt, 71 5 forma B, 168-70 Arg·C.l
forma C, 168-70 ne-dJPffldentr dalla ftuore• IOIIO$tM'UJ\'O, 23,55, 664.c,65 codiiéimledicomrollo-dri
DEI.RA, wdi D0&agg10 1D1muno- .\Jp',~
sccru:a dei lanwudi, 568 stancbrd a uirogeao, 19,21 ffuao. 703-704
logico pe1' aumento della forma Z. 168-70 Glu-C.
per aumento della fluore- Ekttrocl~ complcllli m ~ 101
0uoreKenu nurdah ~ bn- forma rq,lic.ativa ( RF). M2 459 l~'I-C,J
.anu ntardata da ~ nta- Elenromdoosmow,442 controllo. IJI m1> deil dnllù«-'
laDidi fusione del, li I
1bridu1one del, I72, 248-249 o.idi IDEl.flA), 332. 568 Ele11rofora1, 439-473 gb. 668-669, ìO I 7!O
DemturuioM Encrpa
per lepme ~Ubvo, 324• CoopttllMtà dcgl;,682
ckl DNA. 170-172 lpttVllrllbLlt, 173 b1damens1onale (2-0),~38&, bcTicn
. CO>tltutm,709
delle protmx, ~347, '362
tenn1u, 362-363
110lamen10 del, 190-191
librerie, 22 1-130
bg.wone delle mok<oleda, 222·
326
unmunomrtnco, 32&-327
mcdwik anucorp, marcan
454--4$S
cap.illare, 467-472
del DNA, 194-195,462-466
•
radioattiva, 614
d, rcstrwone Wdl Endooudea.,
damtrwone
Dnmù Enzima effcnon d~ b58
di ICIDIII&, 84,8'.,88 223 con OIZIIIII (ELISA), 326; dell'RNA,467 ad... uibltntitJ7"'82 rnccanW111 cataliuo ,kgb. 6~-
otuca, 5-48 awcatun del, 200-20 l 328-329 delle proteoe, 447-462 ~t,82,"'4 701
Denl1tometn, 4S8 mculaZlone del, 180 1mmunor.1d10111etnco (IRMA), elettroduaione, 194 .&ao~w ohgt,mcna,682
l>m>~UZ7.lllOOC, 490•491 nuaoarny. 277-278 326-327 mununoddtrofonsi, 3U e&uo~~ Siti tlll\'t dqb, bSI
~bilizzazionc dei reccl!OTI, m,croclup, 277-278 radioimmunologico,. 324, 652 1SOClettrofocall:m- , 4S1-454 mo4élaci~.a3. llb caL1htia dcgb,«>53
7« -745, 754 m1crosatell1t1, 172-173 Do.e isotacoforesi,«7 684 Unità lnternwonala, Jsa; 660
Daoesitdteouu, llis-170 minuatelbt1, 172-173 d, r.idi;woor worbita !Rad), rodcet,312 ClllidJa allo s t a i o ~- Erwmolog,a ~nòst1ca. x,-6l
~nuclea, l!I0-191 mck translat1ondcl,l02 6"8-054 su acetato dJ ctllu!OA., 455-457 na,~..tQ.661~ l:fl•l0p0;2a
Dcsoumliosio, 165-170 polantà del, 166 efficac.ie (concmtrmone), 714 sugd lllrlOdi basaù sul rau.u-. mappatun dtU', 331-3}2
Dmlnno, 492, 520-521 polimeras1, 178-180 eqwvalente, 648 a campo mtmruttrn11e,(Pul- to.668 l'.quilibrio, dùlì., ali, ns
Detcrpll polunortismo del, 182-IIJ,275- Dol blotting, 199 sed-lìeld giel ~ IMOdi a ftiwo .:onllara, '67 Equinkma. punto dì. 309
IODla,354 276 Down, sindromeda, SO, 173 SIS),465--166 metodi a thwo immoa.o.661 Equonna, mtemadcU;s;s
~™
Det«nuaante ant1gemco, vcd,
quantificmonedel,211-212
rq,licwontdd, 178-180
2-0 PAGE, veci, PAGE biclimen- a gnditntt da òmatunzione metodi a n u K ~ tapl· Erron,
Monale (DGGE),274 clo,661-(,6& alcalino (o dehod,ol, 23
EpitDpo nnaturmone del, 17L, 173-175 Dynomdl, 356 metodJ ~ I l rullo UIIOIU• casuale,30
differemìalc (DIGE),388
Dcvwione standard, 32-33 nparruonedcl, 180
dt poliacrilanurude m prarn- fflffltO. 6'7-t,6& drterminato lmt,mauc.o). 29-
DGGE, wdi clean,fms, su gel a ~ telbte, 172-173 Ead1e-Hobler, tqlllZIOne d1. 675, teauca dd silto cl., tanpcra.
aa di MXl10 dockolaolMto }O
padaentr di dcoalurniooe icquenzc q,crvanalnl1 dd, 173 678-679 tun,66& ipenmentale,27.-47
(SDS-PA<..E), 370, ..7-4-19
Diabsa all'equilibrio, ns scqllfflZlarnento dcl, 212-220, ECL, vedi Chtnuoliunmcsccnza allo .bUIO ~ o , ~tandard della mcdii, 36
"65 su miaoch1p,'4il-473 Qnetlc&
~ 587-588 Ec.ceuo da paca11ualt atomica,6 I6 t rasfmmeoto ( blottmgI Jelle 671-694 Error prone PCR. ?58
Daffmnti&I d15play, 267 SNP, 172- 173,283-2ll4 Edm&n, degradwone d1, 373-375 &du.woe del colorante, metodo
protemc, 459-◄1>2 concentnZJOM di CtWJM, ef,
DdfusioM sonde, 199-200,203 Effetto Elettrofm,one, 98 fcnodella.b84-685 di:90-91
dei vapon.381-381 strulluradcl, 165-172
coda (in cromatografia), ◄80 Ekttrohu, 7-8 ron,enln%IOnc di 111bltnto, Esoclunasi metodo della. ◄J-44,
leà>ndollaylciatl.SS6.S7J lfm)Xratura dt fusione cld, 171 Doppler, 545 59,b3-65,6ì0
dcboh,9-13 effetto dt:ll&,67l-ò77
DIGE, wdi elettrobat dtffettn- trascrwonedel, 180-181 1percrom1co, 171 Elfflropol'Ulone, 248 C O ~ di affuìità, 672 Esoc1to... ;57
mlcmsel t:rasfcnmento (bloamg) del, 198- Job,550 coot,aote di Mxhltb\, 672-ò76 Esoni. 185, I97
Dagationc, (con enum,) di fQtrÌ- 199 ELISA \"Ml l)oggg10 ,mmunome-
oone,225
nuc.Leart Overhauscr (NOE), lnco mediante ant1COrp1 mar- (l)lUntC di ,pcri6atì,677 w,.:umento al puotocnuco, 156,
DNu 1vedi Oaowribonudea.1 597,600 158
Dtluwone,7 cali con enZllllÌ grafico di Ead,e-Honttt, 675
Doppia dtlnu1one, 311 omotrop,co, 682 Estinzione molare, 547-~9
Diaalu1one,52 1 EUttttClt•. 569 gralk.odi Hmcs,675
Doppia ch,a, \~ &nchc DNA, 168 Effenon btrwonc
Duloc1ruoor Uldou.a da collisio- Elumonc grafico di Hill,b83
Doppia marcatur.i, stud, d1, 625, con 0u1da supercr1t1ct, 490
ne,40S,'4n degli enzimi, 658 grIDro d1 uncwm'tt-llurk,
627-628 in grad1cntc,479, S17
ctcrotropic,, 682 675 ron whente,488 4b9
Di.tnbllZ.lone normale (g1uma- Dopp11 nsonanu dcnromCo1, 589- ISOCrauca, 479,5 17
Efficacia, 714 grafico di M,chacbs-Mentcn, in fue hqu1da, 28
n1I, 32,482-483 590 non spcc,fica, 526
Effietenu quantica, 561 IO fl>e sobda, 28
D1uotr~10l0, 377, 529-530 Doppler,effetto, 545 per jflìmu, ~26-528 673
E.LAST vedi S11tcma d, amplifica m1b1ton, effetto dc-gli. 6119-694 ntudata, ◄ 14 . 416
D:-:A Dogggio spec1fìca, S26-527
uoncELISA metodJ &nahua di 1tudio, E.,trem1tl
amphfica2Jonc dd lPCR), 20'4· accoppiato (cnumi),661 sviluppo, 495
Elemento ARS, 2◄5 c,60-671 app,wco~ />tKkv), 18~. ill
212 a mtcmùlo fìMO Cfiited changc) volumed,,480, 519-520
numero Ji tumo,'tf, 676-t>77, coe,M, 188, 22:
analisi d, r«tnuone del, 197 (enumu,661 Elettrocromatografia Colpillare 504 . Em,ss,onc
505 ' 679 piatte, 223
ba,k lo back,613
 ISDICf ANAUTIC.0 IJl,_1)10: ANAUllCO
J70 ni

lctm~.364 Gradi di.hbcrl.il;3l,40-4~44 JDarcatura, l I S-3.22

Ft dtpolMlzz,uiunt,566·56.7 Gray, 648, 6S4 da g,,. me1odi basau ,uJJ.i. 4.18
[la dlla(P) 1JlllllUIIOlap.-o ,ubctlluluc, 119 120 con composti tluorCKenlJ del. dd1cai. ..fOO
fece mdw:11on dtav. 595-5116 Grupp1pCOS1CIJC~658 k,31Bc3l9
FxPA'Y ( Elq,ttt Pro1t111 :.Anal)·u• diamr,lll Guamna,166 di aciJi e bui deboli; lD· 13
otnnl<G, 562 frcnch prN, 356 COZltnallCI dclk, 319-32) pa de.orbirncnto
IDlllJUCQ,562
FRfT, vedi Fluorcs«nza. trasfm radiot1t1vaddk,316-3l8 al pla.ma,408
mento di entrgia per riso Hanes, cquauone d1, 675 produnonc ddle..292-302
FAB. ,..di Spntromrtna di maaa DUCl'Ukupla ama«rut 10. l 59 COI! bar Ullflll.l da IIl.ltJlo;
nanum Htndmòn-Hassclbalch, cqUUIO-' pwmazio11e e fniinmtAtaZJO"
p t r ~ CDII alo, ~m,lfl-144 395-396,408-416
Fronung, 485-486 nedi, 15 ne delle, 289-291, 303·309,
=ma...-:i ottfflumnto delle unmagm1 nel lpmmmuruU.29(
o Fwaldrick.371 H11J,cquaz10nech,682. struttun ddle,2,89-292.
Fiab'Jl, 291 tmlpo m I FLl!lt), 160
Histag,262
IRMA. ,cdi Dosaggio immunon•
M ( ~ Alll. . . 8-iiag), m:up,:ro dopo fotodcroloreo- Htst.40•42 vedi anche Ant1u1rp1 dlbmctnro
F'J'.JCRMS. fflli.SpcrtromcUia di hnRNA, ,'Cdi RNA etffl>gm,t0nll- lmmuno1Stodumia.33J 339
291 nr ddh (FRAPJ, 1S9,566,737 l5otlmrofouhz:w:iooe; .fSl -◄54
,FllcJdllla
....-.,-DIQa.· ruolta nd lmlpo, 7l8
nv$ton,S0l
IJWIII IW)IWlU di cidotrO•
ne 1n tl'lllonmu di founcr
dQl'C
Hotstart. 21 O
lmmunoproop11.ulone, llCIUChc
dJ.309-314
ISOfflllmi,57,347
lsoW:<iforcs1, 447
d, cl«llno, 89 smorzamento (qumdling) dd· Fusogeno. 91 l:IPLC, -ti Cromatogra&ltqoida lmpl'ttlSìone, 31 lsotoputabw,611

--
~.561-562,570-571 ad al~ nsolUZJOnC lmpnntmg rnolea,(j~ 523 l=i,1ct11.socnmni
Llls,88•19
trulmmmto dì eoagia per ri- Gu <Ollaltle00, ~ Hughes, pressa di, 356 lna1twuìo11e iMtnionalc, 2.H brcni,P]
lopntm1.:a fl
oorwm 111 (fllET.). U!l-1'0, Gauswoa. dlstnbUJ ,cmt, 32 lncubatonaCO;, 73-74.
FUI 566,727 Ge,gcr-Mlllkr, contalOllt Ali, 619- lbnduiooe lndag1m l»oclunucbe,J -2 lob. rifeno, 550
diPirk.lt,51S Ruorofon, 145-146 621 degli aadi .nudeio, l 7l, 248- Indice di controllo ddb rupin-
llplll."91,5Cll.so9 Fluorografia.6'° Gel 249 ZJone, 26-17 I....,,·cdi C-ostantt cal.lli.tica
OV,S31 FlUIIOo d1 un~to,447 di colonie, 250 lngcgncna protoca, 256 K.J ,fflli Co&tantt d1 duii:lciwoae
Fauort d r ~ o ettmmdoo• muwone, \'t'Cla CromalDgrafia di placche, 250 lrub1roriddlcpro1ra51,I07,l 19 Km, 'l'td1.M,d,ad,s,éostaJ11tdi.
di ...apaata,......1. "7. 536 ~442 ae i d - molecolare msitu,268 Irul,121oneC11ZJmaba K1ddahl,anali&J dJ, lSl•351
dacon---,(IIIIÌpllllJ"fac• ~IM!Na.fJ/41 . . .~ 4 5 1 m 0uoresunz.a, 145,268 compmtn,a. 69I Kohlrr,tllwrurw.ioncdi, 136
1or1,t.a Laminatt,71 nauvi,449-451 sottnttiva, 228 230 b-,691 t-oshlaod, mockllo d1 (amnu>,
clirilno,WWJ6 aclMOli<'o.703 Gel rctanlation, saggio da. 269-270 lbndom1, 295-299 panbolìca, 691 683-684
di l"llnDCIDr, -ti Riaottda ca• Folin-o-lreou, arcoc» da. 350 Gt.ndi ldràfob1citi, 367 costante ch,690
paati Fona a espreu10M ubiqwtaria (bou- profilo di, 378, 739 da prO<IOIIOnnale,694 Lambcrt· Bttt, legge dJ. S47
apclUOlmplm di. apa,wa.10nc, frwonalc, I03 odaoepangpmsl, 183 Idrossiapatite, cro111atografi• su, da submato,693-694 Lastt,581
519-(wdt..tw~) --,M IIIMIÌ cb mtiotlc dli. 391 507 mcompeùtìlla, 6ll3 Lat1a10 dcidrogcnu1, 58-59, 347,
F.:..291 i:o.-. cionaggiodli.Ul lgA,289-291 irm'ttSibile.689 659
F<d-baldi, wdi cohu~ m Nffll• alca-.62 dnn•NPODI.' da (bockout), IgD,289-291 nusi.a,693 L«tmc, 305,308,527-528
CllllllaMI folfo&unociwiMì. 612-6&4, 705- 273 IgE, 289-291 non compctitm,691-693 l..cg.unc
Faulmelil adfonilllaor-, ftd, lO] hbremdl,221-230 lgG, wdi, lmmunoglobul111u an• lnt~ton, ◄88 fosfòdicstmco. 166-167
l'MSE Foalonsunaa.561,562 mappalllUcm, 279°2'0 che Ant1corp1 lnteranonuca. 392- - - oonspcalìa>.72◄
FammlallOn:." ~ delle protanc, 430, IIIUCatlft(rq,o!1ff),2'19 IgM,289-291 lnterauonì pcptidico,345
~SI] 707-709, 750-157 IUJlbng. 272 Wununaz.,one m campo ,curo, 1, I proteùia-prolana;.392; spmliro,724.
Fidt.lcll'diM4 i.-toaom.1'2 VIC1IU COndab, RJGDdo ck1, Im.agtng spm•rdlCOlo, Sl9 Lente
fioobihp,oldlie. lll fotett&, 552 390-391 a m1crval.h di tempo (bDW lap· In1erfcrometna, 59S-596 a UJllDCBl()nC, Ll7
--•c6:aazapn,lparai• Folodecolorazia, wd1 Photo- Genoma, mappatura dd, 279-280 ie), 151 InteMllo uecm,137
CIIIMll>~IHEM),71 bltàing Gmomia aM!lliCO, 31 dd roodcru.itorc. l.34
m ◄ duoeru1oru, 152-153
~ i:-,541 libreria, 223 di confìdmu,35-39 ddl'ob1t1uvo, 134
Immunità
ddDNA.27b Folopolimaizzmoac,'45-446 10nda,2◄8·249 d1 nfenmento.◄9-51 Libttna
acquisita, 287
lpdlrOKOptCo.515 f ~ clumica cki le• GFP, vedi, Protew Auoruccote Intrappown.ento dl spm, 591 dJ DNA, 223-225,226,227
mnata,287
._
mti. -.edi Jbridizut.ionc In IÌlll ID pau pcptJdici.37S-316
Frunmcnt1 che lcpno l'anhgene
Veldt
Gbaiformc, 380
umor.ile,287
lrnmunoblotnng.322-323,459-462
lntrOOI, 185
lodogcn, 316-318
gcoonuca. 223
Lievito
Fiaaauvo. 139 wdifal> Ghcoproteme, 378-381 loru, 185 aomosorru.artifioalidi,245
Imrnunoclumidie, 1ccmche. 287•
F'md dlaasr -icmmu), 1161 frammadoaiatalhuabalc vedi Fc N-gik0$1~te,378
340 molccolan, 398 plurrude epl$0IDICO, 246
Fi:udumeuuy(enzuru),bòl Frammento atulfirr. 238 O-ghco~1late,378 rottura delle cdlule di. 355,356
lmmunodomma.ntc, 29-f parentali, 398
Flag.368 fnmUJaZJOM con sfere, 355 GLP, ~d,, Buone pratiche di labo• precursori, 398 SISttma a doppio 1bndo, 211,
F1idff prop-am."8ò-387 FRAP, >Tdi Fluora..ellll, RICUpcro lmmunocletlioforoi b1dunCllSIO•
ratono [omca, 1nnz,onc l•ccoppwnen• 392
FUM, vedi Fh1onaaau, ollml• dopo locod«.olormooe dc~ nale,313 LJgaodi (pcrao=tografia duffi-
Gluco,ìo dcidrogrnasi, metodo lmmunofluorC)Cenza to),8,SlJ.512
iMnto <klk 111111Uguu od Frwonamenco dcUa,671 ruù ), 525-529
micro;cop1a m, 144 146 lomuaoone
lffllJ>O con pobeukngh,ok: (<kUe pro• Gluco>10 o, >1das1, metodo della, a citi tr~pray, 400-402 Liguiont (DNA),12?-213
FIDOrnCfflla uo..-imato, li 9 lmlt),364 tccmdie d1,335·336 Limur
41 -◄4. 63-65, 670-671 a prm1oneatmmfmca. ,01
Auon:sama .:on Nh, 303,363 Y·Glutanul trJnsftra.i,!>2
Immunogeno, 287-288 ann~edi usunnomf di radio,
anootropu, 7Zi Immunoglobuline camera di, I> 19
ron &ol"1Cllti organici, 363 atuv11l ),1>49-650
a raggi X, 5-U-,5,f7 Gluuuune ,u ~g.uo•10 ( cromato• b1ouml.wonc Jdlc. 321-322 ch1m1ca, 400
mcdwiit prn1p1t.UIOflr L~ •
grafia d1 affin11.a 1,369 d.1 impano elettronico, 397-400 di ~-amento, 31
cla,.\lficanone delle. 2b9-~91
 o-DrCL -'NAUllU)
m m
~umilile \degli erwnul, 684 ParlJccllb
1111a !ll~ion!M. l.islt0 a lì1o<tllo dtlla, a,612 61 ◄, 617
cffcno coda del. 480, 4115 Progt'llo gmom" um= 2&2,,U)
cdlw.m CO). ll>S 315 mnmcrn.;o f degli cnmru). 68J &ontedd.-t.!15
p,6u..61ot Prugumnu F11wr, 316.387
dcTiviékl1-.◄11 \1.-tod, di anahu, nlid&zioM dc,. ModJficworu poat tndUZJOnalJ fuso I cromuografu ), 483
Putmonc per afliniu,524 Pr~rammatore d1 gradimn; 4.9'1
dJb.aw 1'9-4~ (delle proteine), 347-1'8, l!llUSSi.mo, 4C
PAS, ved, S.:h,ff-aado pcnodu;o, Prom1tcwta lddk plOlelllt),.]◄Y
runKn dclb;i4lll !lt~d• mon~K\ l!18 361\,430-431 P1pcture, 167 Promotore (tocquenu). 181,113
Molant.\,S·CI colorazione di Pirkle. fui di, 5 n
l.iaft atlliJlan ili cootauo. IO \hd...-,tOM.Ullew,672,676 Pro1 1mmina sollata,361•362
L,Rftml~ 8lirtt MicbMlil-Mmtm. equaz,aoe:dl, Moltmle rqeorttt, 145, 152,.590· Patcll d.unp dei canali 1omc:1, 723, PU"06eqoenu■mauo, 214,l 16
732-735, 743 Protcui, uub,ton dcile. 119
tqu$.II01Wd1.1!1.'!3. &71 592 pK., •'2lotidi. 342-344 ~rna,110
gralià.680..a I, ()92 M1,oplume.. 76..ìJ,'19 Molccular bt.amD's, 203 PCR(Polymcrasi.Own RractJonl, Pland:,conuete di, 4
204"212
Ptotema
l.llllo;o.,ll ITM/o~ dd,, 2W Mk.roarra,. 1n Momento d, dipolo, 584•585 Plaima,52-SS,288 A.369,461
1..,..rar.o-1.e diD>.A;l17 ~8 MonoaolllalOtt, SSl· 553 a estcns1one ddla SOYnpposi. Plasmacdlulc. 2s, C,, 744.750
u:-ima,3S41 di l)rotnae. 39~. 731 •7ll Monod, \\)man e Ch;inpsx. mo• z:eonc,257-259 PlamudeT1,247 Ouoraaru,,
L,~ di ,onfidaiili,9~ ~ 1106\IWJ,278 ddlo d,, 683-684 oon megapnmcr, 158 Plasaiidi; 232.-236 row;a. 145. 726
l«"''T},mdodoJi.)1.:l50 M"-=lettrode,17 ~~a::=:;;;;;: Mol$ba11tr, IJ)CtlMSCOpea di, s,s con ohgonucleoude alldc-spe- Pluraocm,.69 verde, 145,152,7'.h
l.u.:1frrU1,'SN--~7S,iib& !111,roscopea, 1!11- lM mRNAvcdiRNAmeuwro c6cn, 274 PMSF (fcnelmeul sulfooil011oru• Protc1ne
l.&IJIIIDnCfflZA, '~JOtOll"a~, ■dallo ~ J5',6'9 MS".405-406 con tnscnttas, uwcra (RT- ro),3S3 atllVIÙ 1p«161.ada!Je;J5J
663-664 a totom lriwlipb, 149 Mura.luge e Skoog, terreno dJ, 95 PCR),209 Polanù (del DNA}. 166 bloiung.dàlt. lll,340, 459-,4~~
UIQIÌDOll'lrtn.a, S7J,.,5711 a foru.,un111la, &61-162 Mu~ d'aprnsume,260 Polixrelammede, gd di, '4S,,449, chckganoù DNA "&lllp> fib
1 mteriaienl.a, 141 con PCR,257-259 crror prone, 258 492, 520-.521 mm10,l78
t.~'81 analisi d.igiwe drll,t munageru, diretta da ol!gonudeohdi, 257 hot ,tart, 21 O PolJlargmmaJ, 369 denaturu1Cllle ddl. :Mi6,,H7,
MALDl•rof,......,. Li, 03 157 111 ntro. 256-257 lDSetu,268 Pobctilmunmma; 362 362
u.__._.,.,,i:---c.35& a n&.lo1111 111trma tDtale. 161 Mvnox. 79 multepla, 274 Polunorfumo, m ~ ddb CICIOml ·
t.~ppA diCOIIIIJlllta Ic.oatig map), camp,onc per mutagcnm.con, 257.259 do. =golJ. nudrotidi (SNI\ l, lrulont, 349.352
m prcpar.wonecW. ll8-l39 NanOlpfay, 406-407 progcttanonc dd pnmcr, 208 172,283-284 detel'ìnUlnlont dtlla sqw:n.u;
~fua411,r-..m. colorwone O u - t r nelu, Nefclomctrea, 'SJl quant1t11JYa;2l1•212 PolinudeotJdJ, 167 372-371
280 151-1S2 Nepuoru.612,617 RAPD,208,210 Polistircm,m, s:w mediante 1pettmmctrL1. di
Man:aeon dJ toiO&lliniù. 696 conloc.alc. 146.1"8 ~rnst.cquwonedi; 18,21-22 rc1hune,21l-212 Polr.-uulcloruro, 520-521 ~ .376-377
t.brcal'ilh 1 desco rolàltc, 14&• 149 Neutrom,612-'fill termoadatorc, 211 Polivimlpìrrolidone(PVPJ,35J d1f1WOM.261-26),l61,~
Qsw,kd, W1 pnnm.202203 a seanaonc ~.146-148. 149 Nacktranli■tmn,202,204 sclroonc di librcne mtdemte, Pompa di mcmbruia, }53 354
di .,..$0--'91 dettroruca; 154.157 Netrocellulola, membr~ ds, 459 250 I po!UtaCO>WllC.499-500 drtuofp1a1dellc. 447,.tt,i
lft'IIUnAk dd D~ "- W1 -2112 I IC&IISIODe; 154 Nonhan blot. 199 seqoellZ1&ll'lt1ltO con, 216, 217 i!.ltcrmo,-a, 4'l9,500 fibros,e, 3-16
MarcatUA di aftlaill da .-ip&; a trU1111S11onc. IS4 Nuclaa,189 ciclico con, 216. 2.17 eia II\IOlO, 397 ·-~-~,-~~-- fo,fortluii)ne 4kllc,; 430. 707•
ll9-390,4k•4JS - C I I I O ■I pwllO qwco, NudC0$1de, 166 touchdown, 206 pmsullJU,.,. 709. 750.757
Mal)IM·-biamleat,..S,U, 156-158 ~ln Pcptede,345 Ponte ghcoprotc1nc, 378-lil
,.l.uA ~ r--. S, m, unmunoelduoea, 1S6-IS7,li9 Nucleobck. 166 nuppatura,331 332 disolfuro.345,377 378,431 globulan,3411
J69--3il unmWIOCIWlnalJc:■• 335 Nudeoticb p1nm1d1111C1, 166 profile dI rmssa, 386-'387 salme. 18 grado di. pun6..IZIOIIC dcllc.358
ddinwooe ddlai 5 en lluoracmza. ltJ• 144 Numao Pcpndeco, legmu:,345 Potenu,714 mwa mokcowc rda.u n dàk.
cktmnurwon<-, 126 UllqTl~IS7,IS8 atomico, 611 Peross1da,1-ant1pet'06S~•. tccn•• Potenmle 369-371
ottK.a. 133- I 46 di-.611 ca ddl~ 33S d, gumuone, 21 rnod,licwoni po$t -tndlwonall
ddcrmanazioM
aomatOpb-I -.-hllieoK
- 111 qnfiuorexmza, 141•144 d.e turn~,676-677 de°"1donduz,one(rcdoxl 18- cldk.347,.,)411,3o8
Penurbueone da solvmte.S58
~t70.Sl0 !111CrOKOp1 COfflp0flJ, 134-138 Peso 21 rcprtSSOn, 183. 184
SO>PAGE.570.ffl MeOOK.OplO Oculuc,137 standard, 18 reu ddle, 358
su peso.5
~uometrw di nwa, Jì'O, a (oioru rnulUph.149 Olwalu, frammmll di, I 79 Pot= prcchttÌl'O, 50 RGS,750
suvolume,S
.m cldlJOma,, 154•1S7 Olomz.una, 658 pH Oltemi!.lc ( per gh cnZUIU ), 689 Pm:ipem,onc mnu dcllc.4~7 459
~1216 ad alto woltagio. 1S4 Omogmeu:utore,3S5 con solfato d'munomo, Il, 364 struttura
Plugc desplar, tccniùit de, 2b3-265
Matna (UOIIIAtogl"~~ ), 4;6; 491 • & Ka!UIOM, IS4 ~ne.3S8 per affirut..1,524 <ktmninm~ddu. lb'HSl
Photoblcachmg (fotodc~olor.wo-
t'Jl,50&-509 Sl4 • trumW!one, 154 OmolOBia, nccrca de,390 Precc,1one. 31.JS prullAfLI. dtllc, l4S
nc), 146,149,159
~IIITUÌDIIC poti IJ'ltCJÌIIODlk, ro,-a.:uto. 135 OmougotKo (gene), 172 Prcesposmone (prdl»hmg), 640 quateman.\ delle, 34ò
,'Cdi anche Fluorescenza 11«0nd.aria ddk, 345
IU.IJ6 Me..ro,pcttroOuonmctna.567 Open rcadeng fnme. 175, 197 641
pi, vede Punto l)()C)cnnco
M.l.um e Gilbert.wq-to MicrotetoluJonc, pwue per, 28a Operone, 183.18,4 Presse (per rottura dclJ,t ccUuk), tcmana dtlk,345
di.218--~l9
P1as1ramcnto per rephca,234 wbumtadtlle,&411
~.L39 Organogeno•,% 356
Med11 -compulfflmta dei tran• M,nuru qu.adralJ lttgrC1.SJone li- Peatu teonce, 483,495,536 Proteonu,ID
Ù\crha~r. effetto nucleare, 597, Piatto, altezu dcl, 482 -486, 536 Mcssaggcn, 711 "12
llnlt1,S94-59S nearcJ, mttododre,45 {)()O PnnC1p1u UARA.648 6S0 Pn>tt0m1<a fu,uionale, Jll.l•l94
2 Mtrc.aptotUDolo,l52 M111mtcllitidcl DNA, 172-173 Ptcco Protomcr,. oftl 685
allarg.imcnto del. ◄80, ◄83 -485 Presm1, 1\48 555
Mocowncn10 po$1 colonna 490 Mu.urmoru biodumeche. 27-46 PAGE b1d1mm,1on;ilc, 385-388, Procedurc- open!J\~ ~tamùrd, 30 Proiortas11.~'l'I
Mnallammto rapido (mi.une), Mobilita cle1troforet1u,44 I altczu Jd, 486-488 P11Cudo111okcolan, •pcae 1om.:hc.
454 -455 Produ11onc J1 ,oppie.618
metodo•• 667 t>68 Modello Puamagnctumo, 587
arca dd,48(,-488 ~00
Profilo filogcnet100, metodo dd,
Moh,493 d1 ~ cooformJ.Z1onalc, arearclat1va del. 4111> 488 P1H a.min11a,ulo,37J•)7S
Puaprotcma, 288 3'Xl
u1mmctmo,4RS
 (t,;OIC.IH~!lllTIL'O
m
l><IllCli ,NWTICO
rn
a lunghezza d'ond.i vanabd.!, WIOnÌC0.514 517
!otrutturc mol«olan dii. ;1:w;: delle pro1rutc, 31>9.383
Pulwwl<liCÙi F rlccn111'homu. ~ppono 502 dcbole,516
ffl :.111, d11;a~,,1a, ,"t<l, FatD:>rc-d,oip• 742
a '>Cans,onc al lunglm:za d'on- fortc,S16
di Mu..ameGilbtn.UWl9
1ccnKhc per lo ilUWO dd lega · d, Singcr, 213
Nnto da, 502
~ f pi l,'4 l ''"
~O ( 16Dr ), melli.725 735
1e11ri1ck1duulllU,7-IS•J l6 a spe11romm1..1 dì uwsa. 503,
Scambio ,omeo, cromatografia a,
vedi Crornawgralìa a scam-
bddcr, 3n.tz7-U0
ptr termu:wio= dda - .
J1Q1Dn1co.'4l 2q7 534.5~5
1:1ro"na ,hmum. 752 b101onì.ro 213-2 14.
,~SSti ll'U.:&
tcudillloncdd scgnak,142-753 alOto-bforo,533 Sci1chard, equazione d~ 717 720 Shme-{h)pmo, -iumra eh. 186
11-~•.ilt6 1oÙU dtlttothlffilco, 502 Schank. prott1:ne d1, 746-747 Shock term1co; lli
Puriti.:ad<mr ~r affiw&.t \ mc,ci,Q, lùag,c,i1cd1 Rcg1onc/1
a proporoonahll bnulllt.t, 619 evaporativo a diffu1tone di luce Schermo mtuwlìcan~,640. Sicw=:a
lr «nlrifuplioM}. l:Z0.112 JIII (light-scanenng) 50l
Rnl,umc che de1mmnano la complemm Schtff-aodo ~odiw coloru,o- amudictto di, 7I
tanclà.2'2 fo10meuic.o a fiamma, 534 M di. 380.458 colturccclluLu-1,74-?S
Q 1m cii Ourun, '6-' ' Reannal,ng. 2 per cromatografia hq111da. 501-
cosunu dcglt antioorpl.297 Schliertn,~d,,109 1n laborxtono, b5-67
Qualitl, slllllrollu J~ 112'..S Reazione SM
d1 COOltgglO proponionalc, 6 I9 San1ùb1ore,624-625, 6'6 Sim).52-.53,"281
QuantttiazloM a <alma cklla
òa GeiFr-MUU.r.619 per gascroma1ografi11, 533•535 pnmano,624 d1 fe1od1bonno.8l
dd ONA;;ll l.a.12 • catena dtlla polimena. ftdi per spclUffllttria dunassa,4.20-
1pn-vu11bil1 degli anix:orp1, 292 Scmnllazoone d1bovlno.at
dcllRNA , 211 i12 PCR ' ~ ChlD Rr· 421
acuon) vanabw dtglunticorpt, 291 contJIOn a, 623-627 S1evtrt,648,654
ikllt~"57~ RNA mlSCde (codcwl ) eia, 6344>35
~ c. Rtgolammtworu ,a ulUk e, s,ru- Sigm2Clean,74
Qocd•nt (uno.-tal• .561 elt11rofortM ddf 467
:m...,621,Qa;UI~ l'alliolll rau m l.boralor10. t6-67 SDS-PAGE. , ~ Elc11roforcs1 su Silamlllllone 485,531
Rtgoln,one ctl"l'()gcnco nuclèarll (hnRNA), gel di poUacrilamnudc in S1l1cc,492.Sl0
doti colorr, f>lò, 6.?I. tiJ4.-J6 I ping-pong,
allostcria,683-6M. 70S,707 183 pre.1enu dì M>d10 dodec1I Sunmctnco, modello (dtgli CDII
<nietNil•u~-11- b1-b1,677,
di tipo c-1.e lnadom), '77, ntptM (down«guJall00.), 736, mt~tfercn,e (RNA.i), 273 solfato nu),683-6&4
ca} ft6""7 6òll
~I 757 oola~dcll; 191,193 ~IDlCIIIIZIODC Sistema
....,.G,1121;~
di llpo ..,..,....1~ onhnato, pOSllin. ( upregulalloD!, 736 messaggero, 176 alwule 126 Dam,180
~ di limàaai. SOS-504 677,680-681 a.gr_.., u-rit (metodo de, pohmenm, 180-181, 189 codliCl('lltCdi, L07,127-Jla di ampli60IDOnc El.1S,\ I EUSl1
R«fflOn mmuru.quadrall).45 quant1ficu.1onedell',211 ·212 cqu1libnod.J, 125 mterfcromctnO> di bylt.igh.
~ cii fondo.Ml
acanakioru00comrallaudalk, Rrm,648,654 nbosomalc (rRNA,.176 fronte Ji, 1:U. 109
Re<t::± ulelaoraapdltl,541• ottico,
pnda. 741-7'4 Rrphcwonie, origine di; 171•l 79 snRNA (small nudcarl, 176 ~ociUcla, 106-107,125
544 dìSchlat
bdliì1iaèri.:9111-!eJ aaa,ppiatì a11ia paDkma (i, 744• niasall, 232 sonde gcnorruchca,249 Segnale
750 "-cWle~.ass stMtuta a tnfos).u) ddl; 169-170 amphficwone dd.1(0. 7fJ7.;09 Urr,180
bdioelllMl6.'42-4H
, . . . U4' . . . . . 411111; ,,• • ~~757 RftllffllU mZJonak, 103 tradU2Jonedell, 186-187 tnsdUZlOlle dd, 71?, 737, 742· StSIO'lll

antqonlllÌ, 7 K ~orw,aulim eh, 197-198 tmufer(IRNA), 169, 176 753 apcm,94

641 di documcnWJone su gd. 458-
tiiiaai_ . . . .16 claMificanone dri, 737, 7.0-742 Rtocoll di diffnzionie,SS.3 RNA.I vcd, RNA mtcrfmna protome l'ff la tmdllZIOlll! del,
con anmù , - dian.ca Ribonucle»i A,61)8-701 Robustczza.32 74h-747'- 4S9
~ . 3 1 6 - 3 Il
mtrinsea, 750-753 Ribosonde. 240 Rocke1 1mmunoelctuofora11, 312 Sclct11Y1lt, 714 Sltlco,,238
~ di gruppo,s2,.m Sito
applicmaai clri.ffMU datod>Qi--da, 7S4 IWlaaione,IINllll:Db a. 555 Roentgen, 647
domini cki,740-741 Ritldlo~,4IM11 Rosso fanore ch,481,485-486 allonmco. 682
. . . . . . . .dll;6l6,WS
cndocltOII dei, 754-755 RiluwnmlO ("810 preswiona- SemJCdk1ndll:atna, 18-19 atuvo (o a.uhuool, 658; r,90,
••1rut64,Ai•G7441 fenolo, 80, 82
funn.-rnmto. no), aetlDdo di, 668 StncstfflZ&. 82 694-701
--· ,_,,.. dn.'"
~--..ii,
meual\lSllll dj
dn,715-717 RlmODOne, quoziaue spmmcn-
Tens,315,318-319
Roton I per anlnfugbt) Sensibù,Li delle analts1, 31 di kgamr al rtboloma (toquen·
moWiù dei; 737 tùtth, 37 manutmuonc e cura dei.113 Separatott di c:dlak (cdl corter) a z.aSbmc-Dalgarnot. 186
d«adimWo Ndieiaffl> dri. nmnOIClhùe per sequenza. 280
612~14 rucotiruo per l'acdilcohna. 742- RinaturwoM(dcl DNA), 171 s,curezn, 114-115 Ouoresccnza, ISS-159, 198,
clMpolidinia_,.,..,. 744 Ri.ioluZJone (cromatografia), 131, up, di, 109,J Il 567,729 SLFIA,vtdilaum10odoagg10m<•

I
occupwoncclei. 7J6.-7)7 485-486 Separmone spm-spm,593,595 d1ante aubstrxt1 Ouorelccnll
.....,.,clqlicnmlii-.652 rRNA vedi RNi'. nbosomale
orfun,721 Scpbacryl,5'21 OJ:DOgCDCÌ
IIDorograM.~ Riapolla RT-PCR, vedi PCR con tnnscnl•
pa 11 glutamma1o. 746 ,olidomle, 293 Sq,hadct.521 Slot bloltlllg, 199
-647-650 l.lSJuwcrsa ~monamtnto. vtdi Qumchong
Pff l'EGF, 739, 7S2-753 SOSISOSrq>a1r), 180 Scpbaro5e,S2 I
-· i ,_.., pa rm1uh.na. 7'9,/752 RlteDZJOne all1VUIODC COD CN13r, 306 snRNA. ,'ed, RNA
1rmpo cli d • - -1ri, Saggio Sodio wde, 353
642. 6l ♦,:6IS ,-iooupià.749 fa111n eia,fflii Fattore dì capaci d1 prote11one dalla nbonuclt:1s1 Scqucma
prq,anzlOl'IC dc,, i2 I •72) di Slunc-Dalgarno, 18& Sod1n dodeciliolfato; ,-cdi Elrtuo•
wdi . . . ~ Il

~---~
(RPA),265 fores1su gddipol~amm1•
lbgly, 111',cil:J.618 iir--chiauici, 702,752 tempodi,'4to-486 gel retardauon, del, 269-270 enbancer, 182 183
segnale, 263,3c,8 dr 1n prtWnu di iodio dodc•
Jtaa,X,61,-611 pn>lcinc chie M modifiaoo l'at • Rivditott Salto dt temperatura, mrtodo dd
tMù,746 Scqumze eh lcrtnllllllOIV. 18l • I 83 aJiolfalO
lpdlro ~~ k5-M6 acattun di ekttrom, 534 (crwm1),668
regoluionie ck1, 736, 743-744, afluor=,502 ScqutllZl.imento ~lunon•
Sangcr, scquc11Z1arncn10di,213 $l,llltbni; 40-U,,f 'I
dl, 109 750 a ,ndi,c di nf=ione, 503 Satcll1t1 d1 DNA, 172-173 conPCR.
ricidodci (u.fficlung), 754 757 Ctchco.211>,217 i,mponie.16 17
Random pnmn làNllng, wdi a mfraro,,, a san!o1one rapida Scamb1a1orc ,omeo, S14-S I i
ncomblDlllll.722 ryB diretto. 216.217 Solvente,
Mual1lra c-.lr 4i un pn• per lr.uformata d1 Founer, mdo.516 C\lral!IOOt -on,488 499
IDff - e lffQ!Una chmas1<1, 752• 534 amonico,514-517 Jcl DNA. 212-220
753 m 0uorucenza,2l6-218 pcrturhwoMdi.5Sll
Rank dnircidoacai(!JIIOdi.24-2.6 a 1on1uaz1onc eh fiimma, 533 b:lilCO, 516
 l"l>IU A!SAllTI( O
L"1>1Cl~"M.ITICO
m m
Temperatura lraS<.nttu1 m,ery,226
5WD \arw,u,33, ◄ 3
-.:onda
DNA 1911 l00.2tl
fturun«nt~,S62
m<>rutnr •'°
MALDI IDl,t-408•U'-ill
ddla commte
IOOloa tnWt, 419,;j20,5(1).
J, tnnm1one, ò86
ea:,.-S41-S4)
d1 fu~1one, 171
ottimale (degli en11m1l,686
progrimma11one della, 532
Tn~rmone. 180-186
f~tton d1, 181-183
,n •nro. 2~9
\'art.1LJnn1 conlunnu,onaJi. 127
1211
fond.unenti&le. 5-11 •543 \elo.,ti

~-·
gmlòi, 1•1'11.lO ""'5» tecnica del "1ho d1, 668 Tmduz,ont, 712, 737,742-753
riluuia.68J catahtKa,657
!)dDalidnt, ,,., m lllONID<1IJBIO erlèttM>
sw:ionano.oneuuo allo,671-694 Tempo 'lrasfcnmenlo (blotungl, dellaluce,4
ioru,43i,SOl,53'-2" d1 ntenz,one,480,485 del DNA, 198· 199
teso (mzuru allostcnal,683 di ck,"M11men10, 6I◄ 616
'MS",.t05-406 adatiato, 480
')cNtau8'1QCtM11tc;~
Stcreomicro!QOP,O, 151• I54. delle proteme, ◄59-462 eh do,c, MS
~ffUZIODC lllllllbita.l&l nallùllftY. S1okn, 1ea,tcb, 106 relativo. 480 ddl'RNA. 198-199
P9"bombaldamento QOll 81o' d1 flu,,o f cromatografia I, ◄M
\olloll\'dJI C!lffJnh.1 { ~ d1 rnlo (spcttrometna di mas Tmfezione, 248
im......:.,tj)() Stnngen-.1.e d, w,d1menta11one, 106,107,
t ,ibr&ZJOoali).~ l-5'1 C,1ructo (W"tpe - , . test dello. 621 ~) 396,408 416,433 Trasformau d, Founcr della •pct
MM~ma~407-408 125
SOUIMm blolting. morto troocop,a all'infrarosso, ◄ 18, m121ilk f cnrun,\, ò60-6ò2
tempo di llDk,. l616, .oa;4 l6, 'ilrultma
~l atnfogbo(RNA), 169-170 conta d1 Gcigcr-MUller, 619, 595.599 Vctton, 223, 236-248
morto ( CratNI 433 641
pngmdclkproi.me.345 Trasformanone, 232 battenofagi,1, 231>-248
pmpwmim, Spdll'OtCO ..__,. cldk.-,-ae. 346 cromatografia, 480 Trasm1ttanu, 547 rosm,dia.243-245
'>f'«•ht Cl'OfflallO • dlrno nucleatt Owr'-r. Teona Tnplcttc, 175
599~1 secondana dtrl"laUdi
Sp«chk>IO delle proteine, 345 de, due slit1 dei rec.cnon, 715 TnpSllllZUZlone deUe cellule, 83 fagemidi, 241 243
Sp«w dell'RNA, 16L 170 ,olvofobica, 510 tRNA, vedi R."IA tnnsfer •trus. 236 241
tftaJUcldl,eprotaar.~5 Termmaton, 181 Troporuna,I, 90 d, espressione, 254
Sr«ific Studmt (1-1.nt), lnl di. 36, 59-44 Terminazione, 180 Trypan Blu,85, 91 elctlno, 3◄ I
Studi clole-mpoelll,711,-1 17 Termol~ma,376 Turb1dimetra, 573 Mll,2◄ 1•243
• asequmzadin>I

-~-
Stuffcr,fnnunrnto da,231 Terreno 'Iynd.ùl, dfeno, 573 magneuo, 3◄ I
au,auca,576-580
Subcoltutt,82-M al uoglicolato, n n&\'ttta l,huule), 2◄7
COltanlr di, 6 77 d, uoorbimcnto.S71
Submannt fll.465 d, cresata completo, 82 Ub1qu111nU1one, 709-710, 755 per ù don~o, 223, 230-248
Spelllii di~.671,S18
di twnma;sn Subsrrato di Mur~hige e Skoog, 95 L1< NEQAS,62-64 \'oliagtclamp. 73◄
acbcb,70) HAT,298 UltrafùtJ'UJOne, 725•~26 \'olume
cr-.560 di 8uomunza.580
diffffcmì,le,S~ doAu,670-6n tnptone di 5011, 77 UltraVK>lctto l UV) molartd, unp,1dcak.4
di -,rbmwntO, 502 Teso, stato (enzimi allostena), 683
di MOl■baucr. 545 mibwonetla.693 assorbunmto neU,349 -350 ,uoto, ◄8
._......-.;676-S77
lpdlri cb...■t al. 558-MiO Th1mcr0$&l, 73 nvelaton, 502-50◄

~--- -,.-- .,.....

. . . . . . 5'8.560 4i tiroaalm.
•-m
~,\SC>-SSJ di 1f1U1 elcnroniu>, 586-593
Supporti
mKRlpOIOII...,,.
pdbcalari.W1
Time lapse, vedi lmagmg a mtcr-
valh d1 tempo
Timma,166
spettroscopia ncll', 547-SoO
stcnl12:UZJone, 72
Unità
Wtightmg factor, 648
WEQAS.62-65
Western blotung, 459 -462
... ..~ - - - - ~ 5195-609 Swdbcrg,umtà, 107, UB,710 Tomografia, mtemmonah (enzuni), 358,660 W1pe, test, ,'tdl Test dello nruc,o
s,..,-- piamon,ca a giida d'ond&.
n1 Sriuppo cr10-clettromca, 157 S1, 3
-.lìli al quaclrupola; . . . . .
plumoniàdi~ 129- frontak,479 Topologia, 506 Swdberg. I07, 128, 71 O X Prcs.,356
-ctitlamma.571 580
731 per affinità. 479 TosùfmLlalaml-cloromelJlchelone Uraale, 166
dì- Ya~ wdJ Lievito, aomo,onu ari!•
di cbmlmnocamr.. 5'9;572 pa eluwonc,479,'491,507, SI 7, (TPCKl,353
1,,.,. . . .,,"···••· c--n); 6115,
di fh>oracmu. 560-569, 7i.,. 526 Tot1potenu, 94 v.... 611 ficial1 d1
421-431
I I..,._, tllJ· 129 pcrlpOStaaml0,'79 Touchdown PCR.206 \'amnui virus, 263 YEp, ,..d,L1ev1to. pwmuk tp..,_
:,a,. ._.Jlldt■npo.7V .-lr. laomatografia), 478-479 Townsend, effelto d1, 619 \'il11daz1one de, mttodi di a,u,1,si, m,co
39.44
•-•cldalraic•n di lumlnacmza, 573-576;. b1>2 SWISS-2-DPAGE,386 TPCK, vedi Tosilfemlalarul-cloro•

........
. . . . . . . ..ii l'ourier,

a lallpO di IIOlo (TOF), 3%.

664
laN,,,tl
Ml vwbtk 547- 5'0
Swu..-Prot, banca datt di sequmze
proc.adic turopta, 387
SYBRpn,211
mcukhetone
Tr,1duzione,
bloccat,1 dall'1bndo,252
\'alutwone della qual1U, proce-
dutt per la, 62-65
\'an D«metcr. equwone di, 484
Zeatma,95
Zunogramma, tccm..a dello 456
l.oo bloltlng. I99
per nl.isc10 dell'1bndo, 252 Van't Hof[ equazione di, 687 z.,,,tt,none,3◄ 1
40&-416 ndl'in&uouo,SM-586 S)'llmll btology, 39-t
-~---.-..-
d«adimmlll ..........&tlllC.
traliormau d1 Founer drlla,
S9S-S96 Tailmg, \'Cdi Cromatografia. .ICO·
416-411 ndl'ultnvt01dto, 547•560 damcnto
.:-0,W-IIMOIIÌZla&IOnt ~!184-.Sl!lt T.., wd1 Tcmpcratura di fusione,
a1pi-.• '>po■Ummto Taq pol11t1erU1. 206
ddom-dàir ...Uffl, bltocroma,o,SS4 TATA box, I SI
z,rpn,t,rKhc....-.)76 <himicD,593 Te,ma
3n••2,_.10 1pncromico. 5St aKIIIQ, 75
clttuuspray. 400-401 1p,oaomico,SS4 della dopp,a monanz.1 elettro-

cstnz!Ollt nwdala,414
IOQI.UUJDIIC dwnic:a,.00
a o n ~ da ,mpmo dtt-
troako.l\17,-400
AS'1 ,qq
Standard nica nucleare, 589
ntffll<),488,6)2 Ttemche I 111,J .
mtffll0,46, 418,628 a ragg1od1dmd1.502
\11tuadlcd1popoimont,lS 1mmuno,h1miche, 287-340
 lfavole a colori

a)

figura 2.4 Colorazione per fr,elare la pre~cnia d1 m1copla~mi 'd nelle cellule.,(a) Nelle u:llule notl 1..ontam1-
nate, la colorazione di Hoech~t è ncgJtt\a: 1I co or,11lte e\'l cnm ,o1o 111)NA cellulart• del nuclro (O
I
1
scen,.a nucleare). (b) Nelle cellule contaminate,
· la colorallone
d Il li Id, Hoctfat è posttl\a'· 1color·•nt.
.. t C\Iduot<'-
en7ta
anche il DNA dei mtCopl ,mi J,ffu,1 nel citopta,ma e e cc u e.
~60 &tOODMICA EBIOLOGIA .iou COI./JU TAYOILA C:OLORJ

761

I ,gura ◄ I~ Immagini di superfici al m1crosco IO

\Cam1one (MLS) Le 1mmagiru ,a) e (b) s P Oltlco (Slerrom1croscop10) e al microscopio elettronico a
(e) e (d ) uUhlUndo il MES I a' O~rv;uiono state prodotte uttl1a.indo lo ,tereom1<roscop10 e le immag,m
·" .. <', gaster) su un'ala di farfalla I Pr«u coema) (b\
1110
1terrom,cro"op10 d1 un mosccnno {Drosophila melauo-
scermo con gh occhi rossi (e) lmmagine.deJ ~maf7e ingrandita per o~rvarc la regione cefalica del mo-

~ mento per osservare I smgoh ommatidi dell'C::,hi: Se m~,ic:nno ottcnut.i al MES e (d ) ulteriore mgrand,.
c-,,erc osservate con J colon rcah mentre quelle od• DOII cl e le immagiru allo stcrrom1croscop10 po=no
po,sono essere agg1unt1 alle unmagm, al ME solpr otte ucdu iz.undo 11 MES sono m scaLi d1grigio I colon
d :. ( I.e (b) amente m 1ante tecmche digttah
1mmagm1 '(e) e (d ) sono state cortesemente fornite da Grorg Haldcr J .

t :. 4 I.) Saìonammto ottico ~om ottiche prodotte ut1l11.undo la tccmca LSCM 'a b) e la m1cro-
lCOpL1 llll,IF,tt a fotoru mulupli (e - h) a ) Tripla maratura del terzo sudio di sviluppo del disco 1mma-
prulc d1 un ala di Drowp/11/a Le unmag,ru sono st.11e prodotte u11hzundo un lilSCr a cr1pto-argo da 25 mW
raffmldato aJ ana. che cmcnc a tre pnnc1p.ih lunghemi d'onda 488 Dm (blu), 568 nm (giallo) e 647 nm
rosso I m 6uorocrorru utilizzau SODO st.1111 la fluorC\«ma (cccitmoDe a 491> nm; erru\sione a 518 nm), la
lissamina rodunina (ea:1t.u1onc a 572 nm, cmus,onc a 590 nm) e la oamna (ccotazJonc a 649 nm; em1S-
11onr 1606 nm) Le unnugJm sono sutc uccoltc contemporaneamente come una singola se:nonc ottica ne,
canah dd rouo, del verde e del blu, nspctuvamtnte, e fuse per formare un'immagine a tre colon (ro5So/ver-
ddbhi) (\"Nii Fig. 4 11 ) L'"tmmagme mostu l'npr$1one di tre geru caratternuci dello mluppo delle ah,
vnugial (rouo), apterous (blu) e CiD (,crde) I.e reg1om d1 sovrappo~1zione dell'cspr~1one de, gem appa
1000 ntU unnugmt come colon =appom. (b) l\euroni pohcromaua marcali con una combinazione d1
coloranll lipoftb. (c•h) Immagine a due fotoni di tre embnom VIVI d1 criceto marcati con 11 colorante rruto-
condrialc rodamma \. M1totr.Kkr Le unmagm, dri tre cmbnom sono state raccolte nell'arco temponle di
:?◄ att. k munag1m d.i fc) a (h) sono rappr=ntatJve della .cne d11mmagm1 tunc-lapsc. Uno dei tre cm-
bnoru e •t.ito 1mp1ant.110 m una femmina adulta, che ha po, partonto •1.a~r• (i): una prova vtventc del fat -
to w I ump1o ru uuhzzall per ottenere 1mmagm1 a fotoni mul11ph nmangono vitali.
(lmmaguu cortesemente fomite da (a ) hm V.illiams e ~ Carro!, (b) Wenb10 Gane Jeff 1.tchtman e (c)
Javnc Sqwrrd e Bcrl'} Bavutcr.)
Figura 4.21 v,suahz.zazione del u.kio m cdlule \ltah L'n'onda di calc10 mdona dalla ferttluzu1one nel
l'uovo dt una stella di mare. L'uovo è ,1,110 nucrmmcnat? con il colorante fluore,,,nte scns1b1lc al calcio
fluo 3 e succernvamcnte fertihu.110 con sperma dura~te I o,1crvaz1one mediante mKro¼op1~ confocale 11
mc la se con una lente 40X a ,mmernonc m acqua. L na ~Lione otllc.a po,lllonata \l<ino ali equatore del
I'uovopè stata raccolta og01 •• •• utiliwndo la normale modahtl I dt sam1one
d d de accumulando
I due unmag1m ,
m ono state compcm.11e e norm,1.1va1e M cn o mearmente Ciascuna 1mma
succcss,vament~l1i'mm~ni: umc-lap,e per l'immagine m111alc pre-ftrt1l11zwone Le 1mmag1ni norma-
gme successiva e J seq ate m un montaggio e riprodotte mediante una lllbella m pscudocolon· le
ltzzate sono state quindi prcpar orti e b~i lhclh di caJC1o libero, le regioni \"<Td1 ,ontradd1'tmguono
reg1om blu rappresentano ba,-,i rafpPpreicntano alu rapporti e ah1!i,elh d1 calcio hbero. ~, noti che l'onda s1
l1vcllt 10tcrmed1 e le regioni rmsc r
muove attraverso l'intero ooplasma s , r)
,
( lmmagme cortc..cmcntc ,orru t, da \lC\'C tnc..c
•
 IIOCIIIMIC.' f llOUlCIA 1,101.!0)L\U
76l lA~U A C:OIOJU

763

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l 1gur1 I! 12 Una scmpl fi --114,1111
Prot ( d.a i cauone della figura 8 I I eh d •·"
( pereme s1 ve il testo per I dettagù).
gentile conces$ionc di &nno Sch··-'·-
· e I enw,ca le 1ntrrazion1 tra I gruppi funr n..J.i d Il
111 e e
Nature Publuhmg Gmup J """"•>4 Pttn- Uetz e Stwey F,elcu R.iprodo
• · ~ con il penntsso di

-~

J S.J I Un& mappa da mtcru1one dd protroma d1 liento, co~tru1u sulli ba'>C delle interazioni pubbh
ate (i1 veda il testo pn I detughJ.
(Per sentile concessione d1 Bcnno xhwu.o,.,,IJ, Peter Uctz e Stanlcy fieldi Riprodotta con ti permesso di
N.arun Pubhih,ng Group )