Sei sulla pagina 1di 72

LE COLTURE CELLULARI

La coltura cellulare è una tecnica di laboratorio che permette di


studiare cellule di interesse in un ambiente artificiale
controllato. I protocolli per la coltura delle cellule in vitro sono
stati messi a punto a partire dagli anni Cinquanta del ‘900.
Le cellule possono crescere, in sospensione o in un
monostrato aderente a una superficie plastica, in un mezzo o
terreno di crescita liquido.
Dopo un certo numero finito di divisioni, la maggior parte delle
cellule animali in coltura raggiunge uno stato di senescenza e
smette di moltiplicarsi. Il numero di cicli di divisione (limite di
Hayflick), dipende dal tipo cellulare, dalla specie e dall’età
dell’organismo dal quale le cellule derivano.
LE COLTURE CELLULARI

Cellule di interesse possono essere prelevate da un tessuto di


interesse, attraverso una disgregazione meccanica/enzimatica,
e quindi essere poste in coltura.

Coltura primaria: originata da cellule isolate direttamente da un


organismo e costituita da cellule normali coltivate in vitro in
presenza di fattori di crescita, per un periodo di tempo e per un
numero di divisioni limitato.

Linea cellulare: si ottiene dalla coltura primaria per la


trasformazione (immortalizzazione), spontanea o indotta, di
cellule che acquistano proprietà di crescita autonoma e
virtualmente illimitata, anche in assenza di fattori di crescita.
VANTAGGI DELLE COLTURE CELLULARI

Caratterizzazione e omogeneità dei campioni.


Controllo ambientale (pH, temperatura, pressione osmotica,
pCO2, O2).
Economicità e rapidità di risposta (basse concentrazioni di
reagenti; accesso diretto alle cellule).
Possibilità di archiviare le cellule congelate.
Disponibilità commerciale di linee cellulari*.

*Banche cellulari

European Collection of Cell Culture (ECACC)
www.ecacc.org.uk

American Tissue Culture Centre (ATCC)
www.atcc.org
STUDI POSSIBILI CON COLTURE CELLULARI

Adesione su matrici specifiche


Proliferazione
Migrazione
Interazioni tra diversi tipi cellulari
Tossicologia
Trasformazione neoplastica
Invecchiamento
Mutagenesi
Binding recettoriale
Secondi messaggeri
Produzione di molecole (fattori di crescita, enzimi etc.)
SVANTAGGI DELLE COLTURE CELLULARI

Perdita della struttura tridimensionale del tessuto.


Perdita delle componenti coinvolte nella regolazione
omeostatica in vivo (sistema circolatorio e nervoso assenti…).
Alterazioni metaboliche.
Perdita del differenziamento fenotipico.
Instabilità genetica.
Richiesta di sterilità, terreni, attrezzature appropriate.
Richiesta esperienza degli operatori.
ISOLAMENTO DI CELLULE DA FRAMMENTI DI TESSUTO

•Prelievo del reperto: deve essere effettuato in condizioni di sterilità e il


tessuto posto, a 4 °C, in una soluzione salina bilanciata (o in terreno di
coltura) contenente antibiotici (penicillina/streptomicina).

•Dissociazione del frammento tissutale:

o MECCANICA
- Risospensione del reperto in soluzione salina con antibiotici e riduzione
in frammenti da pochi mm3

o ENZIMATICA
-Aggiunta ai frammenti di tessuto di una soluzione contenente un enzima
o un coktail di enzimi proteolitici
- Incubazione a 37 °C in agitazione
- Filtrazione del campione
-Lavaggio delle cellule per centrifugazione con soluzione salina o terreno
di coltura
-Risospensione e conteggio delle cellule
ENZIMI UTILIZZATI NELLA DISSOCIAZIONE DEI TESSUTI

• Collagenasi: Proteasi con specificità per il legame *x-gly nella


sequenza pro-*x-gly-pro. Tale sequenza è presente in alta frequenza
nel collagene, una proteina diffusa nei tessuti connettivi che
sostengono le cellule specifiche. *x = un qualsiasi amminoacido

• Tripsina: proteasi con specificità per legami peptidici che


coinvolgono il gruppo carbossilico degli amminoacidi arg e lys.

• Dispasi: è una ammino-endopeptidasi. Idrolizza legami peptidici dal


lato N-terminale di amminoacidi non polari. Agisce tagliando legami a
livello della membrana basale
• Elastasi: Idrolizza legami peptidici dal lato C-terminale di
amminoacidi neutri con catene laterali alifatiche. È l’unica proteasi
attiva sull’elastina.
• Ialuronidasi: Glicosidasi specifica per acido ialuronico e
coindroitina.
HeLa = Henrietta Lacks
I terreni usati per le colture cellulari
(p. es. DMEM; RPMI; etc…)
differiscono tra loro per il contenuto in
amminoacidi e sali, e per la
concentrazione di glucosio.
La composizione dei singoli terreni è
formulata per ogni tipo linea cellulare.
Per la crescita, le cellule richiedono
un valore di pH del mezzo compreso
tra 7.2 e 7.4.
DMEM components MW mg/L mM
Amino Acids
Glycine 75.0 30.0 0.4
L-Arginine hydrochloride 211.0 84.0 0.39810428
L-Cystine 2HCl 313.0 63.0 0.20127796
L-Glutamine 146.0 584.0 4.0
L-Histidine hydrochloride-H2O 210.0 42.0 0.2
L-Isoleucine 131.0 105.0 0.8015267
Per la sintesi L-Leucine 131.0 105.0 0.8015267
delle proteine L-Lysine hydrochloride 183.0 146.0 0.7978142
L-Methionine 149.0 30.0 0.20134228
L-Phenylalanine 165.0 66.0 0.4
L-Serine 105.0 42.0 0.4
L-Threonine 119.0 95.0 0.79831934
L-Tryptophan 204.0 16.0 0.078431375
L-Tyrosine disodium salt-2 H2O 261.0 104.0 0.39846742
L-Valine 117.0 94.0 0.8034188
Vitamins
Choline chloride 140.0 4.0 0.028571429
Per le funzioni D-Calcium pantothenate 477.0 4.0 0.008385744
catalitiche delle Folic Acid 441.0 4.0 0.009070295
Niacinamide 122.0 4.0 0.032786883
proteine Pyridoxine hydrochloride 206.0 4.0 0.019417476
enzimatiche Riboflavin 376.0 0.4 0.0010638298
Thiamine hydrochloride 337.0 4.0 0.011869436
i-Inositol 180.0 7.2 0.04
Inorganic Salts
Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111.0 200.0 1.8018018
Per i gradienti ionici, Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404.0 0.1 2.4752476E-4
l’osmolarità e le Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 120.0 97.67 0.8139166
proprietà Potassium Chloride (KCl) 75.0 400.0 5.3333335
elettrolitiche (NB: Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84.0 3700.0 44.04762
pH) in soluzione Sodium Chloride (NaCl) 58.0 6400.0 110.344826
Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) 138.0 125.0 0.9057971
Other Components
Substrato energetico D-Glucose (Dextrose) 180.0 4500.0 25.0
Indicatore di pH Phenol Red 376.4 15.0 0.039851222
DMEM components MW mg/L mM
Amino Acids
Glycine 75.0 30.0 0.4
L-Arginine hydrochloride 211.0 84.0 0.39810428
L-Cystine 2HCl 313.0 63.0 0.20127796
L-Glutamine 146.0 584.0 4.0
L-Histidine hydrochloride-H2O 210.0 42.0 0.2
L-Isoleucine 131.0 105.0 0.8015267
Per la sintesi L-Leucine 131.0 105.0 0.8015267
delle proteine L-Lysine hydrochloride 183.0 146.0 0.7978142
L-Methionine 149.0 30.0 0.20134228
L-Phenylalanine 165.0 66.0 0.4
L-Serine 105.0 42.0 0.4
L-Threonine 119.0 95.0 0.79831934
L-Tryptophan 204.0 16.0 0.078431375
L-Tyrosine disodium salt-2 H2O 261.0 104.0 0.39846742
L-Valine 117.0 94.0 0.8034188
Vitamins
Choline chloride 140.0 4.0 0.028571429
Per le funzioni D-Calcium pantothenate 477.0 4.0 0.008385744
catalitiche delle Folic Acid 441.0 4.0 0.009070295
Niacinamide 122.0 4.0 0.032786883
proteine Pyridoxine hydrochloride 206.0 4.0 0.019417476
enzimatiche Riboflavin 376.0 0.4 0.0010638298
Thiamine hydrochloride 337.0 4.0 0.011869436
i-Inositol 180.0 7.2 0.04
Inorganic Salts
Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111.0 200.0 1.8018018
Per i gradienti ionici, Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404.0 0.1 2.4752476E-4
l’osmolarità e le Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 120.0 97.67 0.8139166
proprietà Potassium Chloride (KCl) 75.0 400.0 5.3333335
elettrolitiche (NB: Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84.0 3700.0 44.04762
pH) in soluzione Sodium Chloride (NaCl) 58.0 6400.0 110.344826
Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) 138.0 125.0 0.9057971
Other Components
Substrato energetico D-Glucose (Dextrose) 180.0 4500.0 25.0
Indicatore di pH Phenol Red 376.4 15.0 0.039851222
Le molecole di acqua tendono a spostarsi da una
regione dove la sua concentrazione è elevata
verso un’altra dove essa è più bassa.
Quando queste regioni sono separate da una
membrana semipermeabile (che permette il
passaggio delle molecole di acqua ma non di
quelle di soluto), l’acqua diffonde dalla regione ad
alta concentrazione verso quella a bassa
concentrazione, producendo una pressione
osmotica, che si definisce come la forza P da
applicare per contrastare il movimento dell’acqua.
P= icRT
Il termine ic è l’osmolarità della soluzione, il prodotto della
concentrazione molare e del fattore i di van’t Hoff
L’osmosi, i movimenti di acqua
attraverso una membrana
semipermeabile guidati da una
differenza di pressione osmotica, è
un fattore importante per la vita
delle cellule. Le membrane
plasmatiche sono molto più
permebili all’acqua che alle piccole
molecole, agli ioni e alle
macromolecole. Questa
permeabilità è dovuta in parte alla
diffusione semplice dell’acqua
attraverso il doppio strato lipidico e
in parte a proteine canale
(acquaporine) presenti nelle
membrane che permettono il
passaggio selettivo delle molecole
di acqua.
L’effetto dei soluti sull’osmolarità dipende dal numero di particelle
disciolte, non dalla loro massa
DMEM components MW mg/L mM
Amino Acids
Glycine 75.0 30.0 0.4
L-Arginine hydrochloride 211.0 84.0 0.39810428
L-Cystine 2HCl 313.0 63.0 0.20127796
L-Glutamine 146.0 584.0 4.0
L-Histidine hydrochloride-H2O 210.0 42.0 0.2
L-Isoleucine 131.0 105.0 0.8015267
Per la sintesi L-Leucine 131.0 105.0 0.8015267
delle proteine L-Lysine hydrochloride 183.0 146.0 0.7978142
L-Methionine 149.0 30.0 0.20134228
L-Phenylalanine 165.0 66.0 0.4
L-Serine 105.0 42.0 0.4
L-Threonine 119.0 95.0 0.79831934
L-Tryptophan 204.0 16.0 0.078431375
L-Tyrosine disodium salt-2 H2O 261.0 104.0 0.39846742
L-Valine 117.0 94.0 0.8034188
Vitamins
Choline chloride 140.0 4.0 0.028571429
Per le funzioni D-Calcium pantothenate 477.0 4.0 0.008385744
catalitiche delle Folic Acid 441.0 4.0 0.009070295
Niacinamide 122.0 4.0 0.032786883
proteine Pyridoxine hydrochloride 206.0 4.0 0.019417476
enzimatiche Riboflavin 376.0 0.4 0.0010638298
Thiamine hydrochloride 337.0 4.0 0.011869436
i-Inositol 180.0 7.2 0.04
Inorganic Salts
Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111.0 200.0 1.8018018
Per i gradienti ionici, Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404.0 0.1 2.4752476E-4
l’osmolarità e le Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 120.0 97.67 0.8139166
proprietà Potassium Chloride (KCl) 75.0 400.0 5.3333335
elettrolitiche (NB: Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84.0 3700.0 44.04762
pH) in soluzione Sodium Chloride (NaCl) 58.0 6400.0 110.344826
Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) 138.0 125.0 0.9057971
Other Components
Substrato energetico D-Glucose (Dextrose) 180.0 4500.0 25.0
Indicatore di pH Phenol Red 376.4 15.0 0.039851222
Ionizzazione dell’acqua

L’acqua pura ha una piccola tendenza a ionizzare


reversibilmente per formare ioni idrogeno
(protoni) e ioni ossidrilici.

H 2O H+ + OH-

In realtà, quando in soluzione si foma uno ione H+


questo viene immediatamente idratato, generando
uno ione idronio = H3O+ .

H 2O + H 2O H3O+ + OH-
L’acqua pura
trasporta la
corrente elettrica
sotto forma di
ioni H+ che
migrano verso il
catodo e ioni OH-
che migrano
verso l’anodo,
con un’ elevata
mobilità ionica
derivante dai
cosiddetti salti
protonici.
La posizione di equilibrio di una qualsiasi reazione
chimica è espressa dalla costante di equilibrio,
Keq.

Per la reazione
A+B C+D

è possibile definire la costante di equilibrio come il


rapporto tra le concentrazioni molari [M] dei
prodotti e dei reagenti presenti all’equilibrio

Keq = [C] [D]


[A] [B]
Il grado di ionizzazione dell’acqua pura all’equilibrio è
piccolo: a 25 °C solo 2 su 109 molecole di acqua sono
ionizzate in ogni istante.

La costante di equilibrio della reazione reversibile di


ionizzazione dell’acqua è:

Keq = [H+] [OH-]


[H2O]

A 25 °C la concentrazione dell’ acqua pura è 55,5 M.

Dunque:

Keq = [H+] [OH-]


55,5 M
Poiché la quantità di molecole che si dissociano è
molto limitata il termine (55,5 M) è una costante
che può essere inglobata nella Keq

Kw = (Keq) (55,5 M) = [H+] [OH-]

Prodotto ionico dell’acqua

Il valore di Keq, determinato mediante misure di


conducibilità elettrica dell’acqua pura a 25 °C
corrisponde a 1,8 x 10-16 M.

Kw = (1,8 x 10-16 M) (55,5 M) = 1 x 10-14 M2


Kw = [H+] [OH-] = (1,8 x 10-16 M) (55,5 M) = 1 x 10-14 M2
___________________________

Nell’acqua pura la concentrazione di ioni idrogeno


è uguale a quella degli ioni ossidrile:
Kw = [H+] [OH-] = [H+]2

Risolvendo per [H+] si ottiene:

[H+]= √ Kw = √ 1 x 10-14 M2

Ovvero:

[H+] = [OH-] = 10-7 M


[H+] = [OH-] = 10-7 M

Questo valore, che visto l’equilibrio tra le specie


[H+] e [OH-] definisce una soluzione cosiddetta
neutra, viene espresso nei termini di:

-log = pH

Il pH esprime quindi il logaritmo negativo della


concentrazione molare di ioni H+ liberi in soluzione
pH 7 = neutralità
pH <7 = acidità
pH >7 = alcalinità

Essendo Kw
costante, al
crescere di [H+] ,
diminuisce [OH-].
Il pH di una soluzione acquosa
può essere misurato
approssimativamente usando
indicatori colorati (tornasole,
fenolftaleina, rosso fenolo),
che cambiano colore in seguito
alla dissociazione di un protone
dalla loro molecola.
Misure accurate di pH 7,4
vengono effettuate in
laboratorio mediante un
elettrodo di vetro
selettivamente sensibile agli
ioni H+. In un pHmetro il
segnale viene amplificato e
confrontato con quello
generato da una soluzione a
pH noto.
Acidi e Basi
La conducibilità elettrica dell’acqua pura è molto
modesta (resistenza = 18,2 MΩ) in relazione al
suo limitato grado di ionizzazione all’equilibrio: a
25 °C solo 2 su 109 molecole di acqua sono
ionizzate in ogni istante.
Per la loro capacità di condurre la corrente
elettrica in soluzione acquosa, Arrhenius ipotizzò
che le sostanze definite dagli alchimisti acide
(con caratteristiche organolettiche aspre e
pungenti) o basiche (in grado di neutralizzare
l’azione degli acidi) producessero specie ioniche
libere.
Acidi e Basi (Arrhenius)

Acido = libera in soluzione ioni H+ (ioni idrogeno,


idrogenioni, protoni…) e anioni
(H2O)
HA A- + H+
CH3COOH CH3COO- + H+

Base = libera in soluzione ioni OH- (ioni ossidrile, ioni


idrossido) e cationi.
(H2O)
BOH B+ + OH-
KOH K+ + OH-
Acidi e Basi
La tesi di Arrhenius:
•non spiega il comportamento basico di sostanze
che non liberano OH- in soluzione acquosa;
•non è valida in caso di soluzioni non acquose.
Acidi e Basi (Brønsted e Lowry)

Qualche decennio dopo Arrhenius, Brønsted e Lowry


(indipendentemente) proposero un concetto di
scambio chimico tra l’acido (o la base) e un’altra
sostanza.

Acido = cede ioni H+ a un’altra sostanza


Base = acquista ioni H+ da un’altra sostanza.

Se la reazione avviene in H2O


HA + H2O A- + H3O+
CH3COOH + H2O CH3COO- + H3O+

B + H 2O HB+ + OH-
NH3 + H2O NH4+ + OH-
Acidi e Basi (Brønsted e Lowry)

HA + H2O A- + H3O+
CH3COOH + H2O CH3COO- + H3O+

B + H 2O HB+ + OH-
NH3 + H2O NH4+ + OH-

Quelli riportate sopra sono esempi di reazioni di


dissociazione rispettivamente di un acido e di una
base in acqua.
Nella reazione

HA + H2O A- + H3O+
CH3COOH + H2O CH3COO- + H3O+

lo ione H+ ceduto dall’acido viene accettato


dall’acqua che agisce come una base.

Si formeranno
l’anione derivato dall’acido
che è potenzialmente in grado di legare uno ione idrogeno per
ritornare alla stato di partenza e perciò si dice base coniugata
dell’acido HA;
lo ione idronio
che è potenzialmente in grado di cedere uno ione idrogeno per
ritornare alla stato di partenza e perciò si dice acido coniugato della
base H2O.
Nella reazione

B + H 2O HB+ + OH-
NH3 + H2O NH4+ + OH-

Una base acquista uno ione H+ ceduto dall’acqua che


agisce come un’acido.

Si formeranno
il catione derivato dalla base
che è potenzialmente in grado di cedere uno ione idrogeno per
ritornare alla stato di partenza e perciò si dice acido coniugato della
base B;
lo ione ossidrile
che è potenzialmente in grado di accettare uno ione idrogeno per
ritornare alla stato di partenza e perciò si dice base coniugata
dell’acido H2O.
L’acqua partecipa a entrambe le reazioni acido-
base comportandosi una volta da base e l’altra da
acido.
Le sostanze che a seconda delle condizioni
possono comportarsi da acido o da base sono
dette anfiprotiche.
Un acido e la sua base coniugata, così come una
base e il suo acido coniugato, costituiscono una
coppia acido-base.
In una reazione acido-base partecipano due
coppie acido-base che si scambiano ioni H+

B1 A2 A1 B2

NH3 + H2O NH4+ + OH-

Ammoniaca Ione ammonio


La forza di un’acido esprime la sua tendenza a
cedere ioni idrogeno = un’acido forte si dissocia
(ionizza) in modo quasi completo.

Se un’acido è forte (ha una spiccata tendenza a


liberare ioni H+), la sua base coniugata è
necessariamente debole (ha una ridotta tendenza
a legare ioni H+ rigenerando l’acido indissociato),

Gli acidi cloridrico, solforico e nitrico sono


completamente ionizzati in soluzioni acquose
diluite.

Quanto sopra vale anche per le dissociazione delle


sostanze alcaline: NaOH e KOH sono basi forti.
Particolarmentre interessante dal punto di vista
biochimico è il comportamento di acidi e basi deboli,
ovvero non completamente ionizzati nelle soluzioni
acquose.
Essi sono molto comuni nei sistemi biologici e hanno
funzioni rilevanti nel metabolismo e nella sua
regolazione.
Un donatore di protoni e il suo corrispondente
accettore di protoni formano una coppia acido-base
coniugata:
(H2O)

CH3COOH CH3COO- + H+
Un acido (o una base) si dissocia in acqua
HA + H2O A- + H3O+
secondo una specifica costante di equilibrio
Keq = [A-] + [H+] = Ka
[HA]

detta costante di dissociazione.

Gli acidi più forti (in ambito biologico H3PO4 e


H2CO3) hanno costanti di dissociazione più
elevate.
costante di dissociazione

Ka = [A-] + [H+]
[HA]

quindi:
[H+] = Ka . [HA]
[A-]
dunque:

-log [H+] = - log Ka - log [HA]


[A-]
poiché: Equazione
-log [H+] = pH di
Henderson &
allora:
pH = pKa - log [HA] Hasselbalch
[A-]

Quando le concentrazioni di HA e A- sono equivalenti


(metà dell’acido si trova in forma dissociata)
pH = pKa - log 1 = pKa - 0 = pKa
pKa corrisponde quindi al valore di pH al quale
metà dell’acido si trova in forma dissociata.
L’ equazione di Henderson & Hasselbalch ci
permette di dedurre numerose relazioni
importanti come:

•il valore di pKa di qualsiasi acido conoscendo il


rapporto molare tra le specie donatore e accettore
di protoni a un dato pH;
Alcuni composti sono monoprotici, ovvero possono liberare
o legare un solo protone. Altri sono di- o triprotici.
Un tampone (buffer) è un sistema acquoso che tende a resistere a
variazioni del suo pH quando vengono aggiunte piccole quantità di
acido (H+) o di base (-OH).
Il sistema tampone è solitamente costituito da:
un acido debole (donatore di protoni);
la sua base coniugata (accettore di protoni).
Titolazione dell’acido acetico
Un volume di acido in soluzione viene titolato con una
soluzione di una base forte (NaOH) a concentrazione nota che
viene aggiunta progressivamente fino a neutralizzare l’acido
(verifica mediante pHmetro). La concentrazionedell’acido
nella soluzione originaria può essere calcolata dal volume e
dalla concentrazione dell’NaOH aggiunto.
Mettendo in grafico la
variazione del pH in
funzione della quantità
di NaOH aggiunto,
ovvero disegnando la
curva di titolazione,
identifichiamo anche il
valore di pKa dell’acido
debole.
Curva di titolazione dell’acido acetico

Il maggior
potere
tamponante
di una
coppia
acido-base
coniugata è
situato in
prossimità
del suo pKa
Il pH del plasma sanguigno è tamponato in parte dal
sistema del bicarbonato/acido carbonico, quest’ultimo a
sua volta formato dall’anidride carbonica disciolta in
acqua.
Per mantenere costante il valore di pH
nel terreno di coltura, le cellule sono
mantenute in incubatori con una fase
gassosa contenente il 5% di CO2 e
terreni contenenti NaHCO3.
In soluzione acquosa il bicarbonato tende
a dissociare e rilasciare CO2.
La CO2 presente nell’incubatore tende a
controbilanciare questo aumento,
mantenendo così il giusto pH del terreno.
Per avere un indicazione visiva del pH, i
terreni vengono addizionati di rosso
fenolo, un indicatore che ha un colore Incubatore per la coltura cellulare.
rosso-arancio a pH 7.3, vira al giallo- Costo € ~ 15000
arancio a pH acido e al rosso viola a pH
alcalino.
L’incubatore inoltre mantiene la
temperatura costante ai 37 °C
mediante una «camicia» di acqua
termostatata che riempie
l’intercapedine tra due pareti
concentriche.

L’atmosfera dell’incubatore è satura


in vapore acqueo, generato da una
vaschetta di acqua posta alla base
del volume interno utile. La
saturazione in vapore evita
l’evaporazione di terreno dalle
piastre in coltura – che
determinerebbe un’alterazione (un
aumento…) della concentrazione
dei soluti.
Propagazione di una coltura
cellulare

Propagare una coltura implica la


rimozione del terreno esausto e
il trasferimento di una parte delle
cellule (che crescendo hanno
Densità differenziali di una coltura
occupato tutta la superficie della
cellulare.
plastica al fondo della piastra di
Petri) in una nuova Petri in a (appena seminata) > b (subconfluente) >
terreno di coltura fresco. c (confluente)
Caratteristica del pattern di
crescita di cellule in coltura

La crescita di cellule in coltura


procede da una fase di latenza
successiva alla semina, a una di
crescita logaritmica, nella quale
ha luogo una proliferazione
esponenziale. Quando le cellule
nella coltura aderente occupano
tutta la superficie del contenitore
ed esauriscono lo spazio (o
quando consumano tutte le
sostanze nutritive contenute nel
terreno) la proliferazione rallenta,
o cessa. A questo punto una parte
delle cellule deve essere trasferita
in una nuova Petri in terreno di
coltura fresco.
Propagazione di una coltura
cellulare

Propagare una coltura di cellule


aderenti richiede di distaccarle
dalla superficie del contenitore.
Questa operazione viene
tipicamente svolta attraverso
una digestione enzimatica
mediante tripsina: proteasi con
specificità per legami peptidici
che coinvolgono il gruppo
carbossilico degli amminoacidi
arg e lys.
Le cellule dissociate vengono
quindi fatte sedimentare in una
provetta.
Sedimento (pellet) cellulare
Per accelerare la
sedimentazione delle cellule in
sospensione si fa uso di una
centrifuga preparativa: le
provette contenenti il campione
vengono inserite in un rotore
metallico e la rapida rotazione
del rotore genera elevate forze
centrifughe che fanno
sedimentare le cellule. Per
impedire il riscaldamento del
rotore si utilizza la
refrigerazione a 4°C, perché il
campione non si degradi.
Tipicamente applicare 100 x g
permette di sedimentare le
cellule in 5 min
Centrifuga refrigerata da banco
Costo € ~ 15000
Cabina (cappa) a flusso laminare

Per manipolare le cellule in


coltura si utilizza una cabina
(cappa) a flusso laminare, che
genera un ambiente sterile
(garantito da un filtro HEPA) e
assicura la loro protezione, e
quella dell’operatore se il
materiale manipolato determina
rischio infettivo, grazie alla
presenza di uno schermo
frontale e di un flusso verticale
parallelo all'operatore.

Cabina (cappa) a flusso laminare


Costo € ~ 15000
L'apertura frontale ottimale (200
mm) è calcolata in rapporto alla
potenza del motore e al flusso
d'aria (in ingresso e in uscita)
per garantire che il 30% dell'aria
sia espulso (70% riciclato e 30%
aspirato ex novo).

Quando l'apertura non supera i


200 mm d'altezza si ottiene
un'efficace barriera d’aria a
protezione dell'operatore.
Il motoventilatore ricicla una massa
d'aria attraverso il filtro assoluto
nella zona di lavoro. L'aria che
passa attraverso il piano di lavoro
perforato ritorna al ventilatore ed è,
in parte, espulsa (30%). La parte di
aria espulsa viene reintegrata con
l'aspirazione di un uguale volume
attraverso l'apertura frontale.

Un flusso laminare è un flusso d'aria


unidirezionale formato da filetti
d'aria sterili paralleli che si muovono
alla medesima velocità in tutti i
punti, così da creare una corrente
d'aria omogenea senza turbolenze.
In un ambiente sterile così ottenuto 1) Aria espulsa (30%)
ogni contaminante libero nella zona 2) Filtro HEPA in espulsione (opzionale)
di lavoro viene trascinato lontano da 3) Aria contaminata
un fronte d'aria sterile. Le particelle 4) Filtro HEPA di lavoro
contaminanti vengono filtrate da un 5) Flusso laminare sterile (70%)
filtro HEPA. 6) Schermo frontale motorizzato
7) Aria aspirata (30%)
I filtri HEPA (High
Efficiency Particulate Air)
prevengono la
contaminazione
particellare e sono
costituiti da fogli di
microfibre di vetro
ripiegati più volte;
l’efficienza filtrante è la
capacità di trattenere
particelle di 0,3µ di
diametro con un’efficacia
compresa tra il 99,97%
Conta cellulare

La conta delle cellule dissociate


può essere realizzata utilizzando
un emocitrometro / camera di
Bürker / camera di Neubauer.
Conta cellulare

Sul pavimento della camera dell’


emocitrometro è litografata una
griglia.

Il volume di liquido
nell’intercapedine che sovrasta i
16 quadrati sottolineati in rosso
è pari a 0,1 mL.

Il n. di cellule contate x 104 è


dunque quante cellule sono
contenute in 1 mL del nostro
campione.
Visualizzare le cellule: il microscopio ottico

Ispezionare

Contare
Condensatore

Campione

Obiettivi

richiede l’uso di un microscopio ottico


Microscopia ottica in campo chiaro (set-up standard)

Piano
dell’immagine Telecamera

Oculari

Stativo

Obiettivo

Campione

Condensatore

Un microscopio con set-up standard si adopera per osservare preparazioni


biologiche sottili, tipicamente montate su vetrino.
Il condensatore è un sistema di lenti che collima la radiazione luminosa sul
piano del campione. Le lenti (multiple) dell’obiettivo e degli oculari
ingrandiscono l’immagine.
Microscopia ottica in campo chiaro (set-up rovesciato)

Condensatore

Campione

Microscopio ottico rovesciato


Obiettivi
Costo € ~ 15000

Un microscopio con set-up rovesciato si adopera per osservare colture


cellulari in piastre/fiasche, per poter avvicinare dal basso (senza
immergerlo nel terreno di coltura) l’obiettivo alla preparazione.
Questa configurazione permette inoltre una più agevole manipolazione del
preparato.
Microscopia ottica in campo chiaro

A un microscopio si richiede di ingrandire un’immagine e risolverne i


particolari.

Il suo potere di ingrandimento è il rapporto fra le dimensioni dell'immagine


e quelle dell'oggetto reale e dipende dal prodotto degli ingrandimenti forniti
dall'obiettivo e dagli oculari, misurati di solito in diametri. Per esempio, se
sugli oculari si legge 10 X e sull’ obiettivo 40 X, il potere d’ingrandimento
totale sarà: 10 X 40 = 400 X.

Il potere di risoluzione è un indice della ricchezza di particolari che si


possono osservare nella struttura di un'immagine. Supponiamo che una
certa struttura contenga due piccoli punti molto vicini. Se le immagini di
questi due punti si sovrappongono non li si vede più come distinti, ma come
una struttura unica. Se invece distinguiamo due immagini separate il
microscopio ha risolto questi due punti.
Risoluzione

1 mm
Occhio umano
100 µm

10 µm

1 µm
Microscopio ottico
100 nm

Microscopio elettronico a
10 nm
scansione

1 nm
Microscopio elettronico a
trasmissione

Risoluzione del microscopio ottico

Per il microscopio ottico il valore del limite di risoluzione è definito dalla

formula di Abbe:

d = l / 2n sen a
d = l / 2NA
d = potere di risoluzione
l = lunghezza d'onda della luce impiegata
n = l'indice di rifrazione
a = l'angolo sotteso da metà dell'obiettivo misurato dal piano del campione

NA = apertura numerica dell'obiettivo usato

Il potere di risoluzione è di un microscopio ottico si attesta su 0,2 mm.


Risoluzione del microscopio ottico
d = l / 2n sen a
d = l / 2NA
n sen a = NA (numerical aperture; apertura numerica)
L'apertura numerica è caratteristica di ogni obiettivo.
Maggiore il suo valore, tanto più ampio è il cono di luce raccolto dal
campione.

a = angolo sotteso da metà dell'obiettivo misurato dal piano del campione


Risoluzione del microscopio ottico

n = indice di rifrazione
Il valore viene calcolato dal
rapporto della velocità della NB:
un obiettivo a
luce tra il vuoto e il mezzo a immersione in
maggiore densità che si olio ha maggiore
risoluzione
vuole considerare.

L'indice di rifrazione è in
relazione alla lunghezza d'
onda della luce (l): è
maggiore per l più corte
(luce blu) e minore per l più
lunghe (luce rossa).
Gli obiettivi sono l’elemento di maggior pregio in un microscopio ottico

Obiettivo ad alta risoluzione


Costo € ~ 4000
Il contrasto nelle immagini al microscopio ottico

Una cellula viva, non colorata, non ha rilevante contrasto nell’immagine al


microscopio ottico.

Colorare le cellule richiede di ucciderle e fissarle.


Microscopia ottica in contrasto di fase
Microscopia ottica in contrasto di fase
Acquisizione e archivio di immagini al microscopio

Sistemi ottico-digitali (p. es. CCD) permettono la raccolta di un numero


discreto di valori di intensità per un numero finito di posizioni all’interno del
campo visivo. In un sistema a 8 bits si ha una scala di intensità pari a 256
(28) livelli di grigio.

Le intensità di grigio possono


essere restituite in falsi colori

La risoluzione spaziale digitale del sistema dipenderà dal numero di


posizioni –pixel– disponibili.
1024 x 1024 512 x 512 256 x 256 128 x 128