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*Banche cellulari
–
European Collection of Cell Culture (ECACC)
www.ecacc.org.uk
–
American Tissue Culture Centre (ATCC)
www.atcc.org
STUDI POSSIBILI CON COLTURE CELLULARI
o MECCANICA
- Risospensione del reperto in soluzione salina con antibiotici e riduzione
in frammenti da pochi mm3
o ENZIMATICA
-Aggiunta ai frammenti di tessuto di una soluzione contenente un enzima
o un coktail di enzimi proteolitici
- Incubazione a 37 °C in agitazione
- Filtrazione del campione
-Lavaggio delle cellule per centrifugazione con soluzione salina o terreno
di coltura
-Risospensione e conteggio delle cellule
ENZIMI UTILIZZATI NELLA DISSOCIAZIONE DEI TESSUTI
H 2O H+ + OH-
H 2O + H 2O H3O+ + OH-
L’acqua pura
trasporta la
corrente elettrica
sotto forma di
ioni H+ che
migrano verso il
catodo e ioni OH-
che migrano
verso l’anodo,
con un’ elevata
mobilità ionica
derivante dai
cosiddetti salti
protonici.
La posizione di equilibrio di una qualsiasi reazione
chimica è espressa dalla costante di equilibrio,
Keq.
Per la reazione
A+B C+D
Dunque:
[H+]= √ Kw = √ 1 x 10-14 M2
Ovvero:
-log = pH
Essendo Kw
costante, al
crescere di [H+] ,
diminuisce [OH-].
Il pH di una soluzione acquosa
può essere misurato
approssimativamente usando
indicatori colorati (tornasole,
fenolftaleina, rosso fenolo),
che cambiano colore in seguito
alla dissociazione di un protone
dalla loro molecola.
Misure accurate di pH 7,4
vengono effettuate in
laboratorio mediante un
elettrodo di vetro
selettivamente sensibile agli
ioni H+. In un pHmetro il
segnale viene amplificato e
confrontato con quello
generato da una soluzione a
pH noto.
Acidi e Basi
La conducibilità elettrica dell’acqua pura è molto
modesta (resistenza = 18,2 MΩ) in relazione al
suo limitato grado di ionizzazione all’equilibrio: a
25 °C solo 2 su 109 molecole di acqua sono
ionizzate in ogni istante.
Per la loro capacità di condurre la corrente
elettrica in soluzione acquosa, Arrhenius ipotizzò
che le sostanze definite dagli alchimisti acide
(con caratteristiche organolettiche aspre e
pungenti) o basiche (in grado di neutralizzare
l’azione degli acidi) producessero specie ioniche
libere.
Acidi e Basi (Arrhenius)
B + H 2O HB+ + OH-
NH3 + H2O NH4+ + OH-
Acidi e Basi (Brønsted e Lowry)
HA + H2O A- + H3O+
CH3COOH + H2O CH3COO- + H3O+
B + H 2O HB+ + OH-
NH3 + H2O NH4+ + OH-
HA + H2O A- + H3O+
CH3COOH + H2O CH3COO- + H3O+
Si formeranno
l’anione derivato dall’acido
che è potenzialmente in grado di legare uno ione idrogeno per
ritornare alla stato di partenza e perciò si dice base coniugata
dell’acido HA;
lo ione idronio
che è potenzialmente in grado di cedere uno ione idrogeno per
ritornare alla stato di partenza e perciò si dice acido coniugato della
base H2O.
Nella reazione
B + H 2O HB+ + OH-
NH3 + H2O NH4+ + OH-
Si formeranno
il catione derivato dalla base
che è potenzialmente in grado di cedere uno ione idrogeno per
ritornare alla stato di partenza e perciò si dice acido coniugato della
base B;
lo ione ossidrile
che è potenzialmente in grado di accettare uno ione idrogeno per
ritornare alla stato di partenza e perciò si dice base coniugata
dell’acido H2O.
L’acqua partecipa a entrambe le reazioni acido-
base comportandosi una volta da base e l’altra da
acido.
Le sostanze che a seconda delle condizioni
possono comportarsi da acido o da base sono
dette anfiprotiche.
Un acido e la sua base coniugata, così come una
base e il suo acido coniugato, costituiscono una
coppia acido-base.
In una reazione acido-base partecipano due
coppie acido-base che si scambiano ioni H+
B1 A2 A1 B2
CH3COOH CH3COO- + H+
Un acido (o una base) si dissocia in acqua
HA + H2O A- + H3O+
secondo una specifica costante di equilibrio
Keq = [A-] + [H+] = Ka
[HA]
Ka = [A-] + [H+]
[HA]
quindi:
[H+] = Ka . [HA]
[A-]
dunque:
Il maggior
potere
tamponante
di una
coppia
acido-base
coniugata è
situato in
prossimità
del suo pKa
Il pH del plasma sanguigno è tamponato in parte dal
sistema del bicarbonato/acido carbonico, quest’ultimo a
sua volta formato dall’anidride carbonica disciolta in
acqua.
Per mantenere costante il valore di pH
nel terreno di coltura, le cellule sono
mantenute in incubatori con una fase
gassosa contenente il 5% di CO2 e
terreni contenenti NaHCO3.
In soluzione acquosa il bicarbonato tende
a dissociare e rilasciare CO2.
La CO2 presente nell’incubatore tende a
controbilanciare questo aumento,
mantenendo così il giusto pH del terreno.
Per avere un indicazione visiva del pH, i
terreni vengono addizionati di rosso
fenolo, un indicatore che ha un colore Incubatore per la coltura cellulare.
rosso-arancio a pH 7.3, vira al giallo- Costo € ~ 15000
arancio a pH acido e al rosso viola a pH
alcalino.
L’incubatore inoltre mantiene la
temperatura costante ai 37 °C
mediante una «camicia» di acqua
termostatata che riempie
l’intercapedine tra due pareti
concentriche.
Il volume di liquido
nell’intercapedine che sovrasta i
16 quadrati sottolineati in rosso
è pari a 0,1 mL.
Ispezionare
Contare
Condensatore
Campione
Obiettivi
Piano
dell’immagine Telecamera
Oculari
Stativo
Obiettivo
Campione
Condensatore
Condensatore
Campione
1 mm
Occhio umano
100 µm
10 µm
1 µm
Microscopio ottico
100 nm
Microscopio elettronico a
10 nm
scansione
1 nm
Microscopio elettronico a
trasmissione
1Å
Risoluzione del microscopio ottico
formula di Abbe:
d = l / 2n sen a
d = l / 2NA
d = potere di risoluzione
l = lunghezza d'onda della luce impiegata
n = l'indice di rifrazione
a = l'angolo sotteso da metà dell'obiettivo misurato dal piano del campione
n = indice di rifrazione
Il valore viene calcolato dal
rapporto della velocità della NB:
un obiettivo a
luce tra il vuoto e il mezzo a immersione in
maggiore densità che si olio ha maggiore
risoluzione
vuole considerare.
L'indice di rifrazione è in
relazione alla lunghezza d'
onda della luce (l): è
maggiore per l più corte
(luce blu) e minore per l più
lunghe (luce rossa).
Gli obiettivi sono l’elemento di maggior pregio in un microscopio ottico