ANALISI SEMI-QUANTITATIVA

DEI GENI SMN MEDIANTE DHPLC

PER LA DIAGNOSI MOLECOLARE
DI ATROFIA MUSCOLO-SPINALE
 ATROFIA MUSCOLO SPINALE
(SMA)
• Malattia neuromuscolare a trasmissione
autosomica recessiva
– Incidenza: 1/10.000 nascite
– Frequenza del portatore: 1/35 – 1/50

• Caratteristiche cliniche:
– Progressiva degenerazione dei motoneuroni
della spina dorsale → denervazione del
muscolo scheletrico → atrofia dei muscoli
volontari prossimali → insufficienza
respiratoria e morte infantile.
 International SMA
Consortium classification
• SMA tipo I (malattia di
Werdnig-Hoffman)
• SMA tipo II (forma
intermedia)
• SMA tipo III (malattia di
Kugelberg-Welander)
• SMA tipo IV
• SMA Adulta (Sindrome di
Kennedy o atrofia bulbo-
spinale)
 IL LOCUS GENICO

Nella regione 5q11.2-13.3 sono stati identificati due geni

correlati alla SMA:

SMN (survival motor neuron)

NAIP (neuronal apoptosis inhibitory protein)

Questa regione di 500 kb è caratterizzata da una duplicazione

invertita, per cui il gene SMN è presente in duplice copia,
una telomerica (SMN1) e una centromerica (SMN2)

Il gene SMN1, quando mutato, determina la SMA di tipo I-III.

 I GENI SMN
• Il gene SMN1 (9 esoni di cui uno non
codificante) codifica una proteina di 38 KDa,
ubiquitaria e con alti livelli di espressione
nei neuroni motori spinali.
• La copia centromerica, SMN2, differisce da SMN1
per soli sette nucleotidi, la maggior parte
localizzati al C-terminale.
• La variazione di un solo nucleotide nell’esone
7 di SMN2 causa, in più dell’80% dei trascritti
derivati, l’“exon skipping” dell’esone.
• Durante lo splicing del gene SMN2, quindi, si
ha l’esclusione dell’esone 7.
• Il trascritto che ne deriva produce una
proteina tronca che risulta instabile e quindi
inattiva.
“EXON SKIPPING” dell’esone 7 del
gene SMN2

• Per entrambi i geni, SMN1 e SMN2, possono

essere presenti più copie per genoma aploide,
sempre nella stessa regione genica.
 PATOGENESI MOLECOLARE
DELLA SMA
• La maggior parte della proteina SMN in un
individuo normale deriva quindi dal gene SMN1.
• 94% soggetti SMA → perdita omozigote almeno
della copia telomerica (SMN1) nella zona
ripetuta
• 6% → mutazioni puntiformi di SMN1 o
conversione dovuta a fusione/ricombinazione dei
geni SMN.
• Negli affetti c’è solo una piccola quantità di
proteina residua che deriva dal gene SMN2 (20%
dei trascritti derivati).
• In assenza del gene SMN1, copie aggiuntive di
SMN2 correlano, quasi sempre, con una minore
gravità della malattia (SMA tipo II e III).
Diagnosi molecolare di SMA
Mediante l’analisi di RFLP è possibile individuare solo
i soggetti affetti, con delezione in omozigosi
dell’esone 7 di SMN1.

188 bp
SMN1
149 bp
SMN2

SMA N

La gravità della malattia e la mancanza di un efficace

trattamento rende di estrema importanza l’identificazione
dei soggetti portatori della delezione/conversione del
gene SMN1 (1/50 della popolazione normale), anche e
soprattutto per un corretta consulenza genetica nelle
 Diagnosi di
l-time quantitativa portatore
per il dosaggio del numero di copie dei g
SMN2

e sonde fluorescenti, specifiche per SMN1 e SMN2

• Analisi semi-quantitativa mediante dHPLC geni SMN1 e

SMN2

Non richiede sonde fluorescenti

Vengono amplificati, mediante MULTIPLEX-PCR, l’esone 7

(300 bp) dei geni SMN e frammenti di due geni di
riferimento.

7. KRIT1, autosomico (200 bp)

8. CYBB, X-linked (100 bp)
 dHPLC
Denaturing high performance liquid
chromatography
E’ una tecnica di separazione cromatografica basata sul
principio di ripartizione in fase inversa ad accoppiamento
ionico, che separa ed eluisce le molecole di DNA in base
alla loro dimensione.

Inoltre, nelle condizioni sperimentali in cui si opera, la

dHPLC separa le molecole di DNA sfruttando la differente
velocità di migrazione nella colonna cromatografica degli
omoduplex rispetto agli eteroduplex.

La molecola di eteroduplex è più instabile rispetto

all’omoduplex in quanto, ad una certa temperatura, mostra
una “parziale denaturazione” nel punto in cui è presente
la variazione di sequenza, che ne rende più debole il
legame alla fase stazionaria alla fase stazionaria.

Gli omoduplex possono avere Tm sufficientemente diversa da

poter essere eluiti in tempi diversi, a parità di peso
molecolare.
• Per la nostra analisi, i campioni sono stati separati in
base alla diversa forza di legame dei vari amplificati
(SMN>KRIT1>CYBB) con la fase stazionaria.

• I diversi tempi di eluizione dipendono dal loro peso

molecolare.

• A parità di peso molecolare, la separazione di SMN1 e

SMN2 si ottiene applicando al sistema la temperatura di
semi-denaturazione calcolata (52°C).

• Nelle condizioni semi-quantitative di ampificazione,

l’altezza dei picchi di eluizione di ciascun amplificato
è proporzionale alla dose genica

CYBB KRIT1 SMN2/SMN1

Abbiamo analizzato 117 campioni di DNA

• 22 appartengono a soggetti affetti da SMA, con

delezione in omozigosi dell’esone 7 di SMN1.

• 33 a soggetti portatori certi, in quanto genitori

di pazienti affetti da SMA da delezione.

• 22 a soggetti probabili portatori, perchè

appartenenti a famiglie con SMA da delezione.

• 40 a soggetti con sospetto clinico di SMA, ma

senza delezione in omozigosi dell’esone 7 di SMN1.
 Cromatogrammi rappresentativi dall’analisi dei prodotti
di amplificazione dei geni CYBB (X-Linked), KRIT1
(autosomico), SMN2 ed SMN1 di soggetti affetti da SMA
Paziente affetto con rapporto 0 : 2
CYBB
KRIT1
SMN2

N°
SMN1/SMN2
pazienti
0:2 15
0:3 5
0:4 2
Paziente affetto con rapporto 0 : 4
SMN2 Nei pazienti affetti da SMA,
omozigoti per la delezione,
è stata confermata l’assenza
CYBB KRIT1 del gene SMN1.
Non tutti mostrano lo stesso
numero di copie di SMN2.
Paziente portatore certo con rapporto SMN1/SMN2 di 1 : 2
♂
CYBB

KRIT1 SMN2

SMN1

Paziente portatore certo con rapporto SMN1/SMN2 di 1 : 3

SMN2
CYBB
KRIT1

SMN1
Paziente con familiarità e rapporto SMN1/SMN2 di 2 : 2

CYBB
SMN2
KRIT1 SMN1

Paziente portatore certo e rapporto SMN1/SMN2 di 1 : 1

CYBB KRIT1

SMN2 SMN1
 RISULTATI
• I risultati ottenuti dall’analisi dei soggetti
portatori certi, evidenziano che il genotipo
SMN1/SMN2=1:1 è il più frequente (54%).

• Bisogna ricordare che, nella popolazione

normale, circa il 4% delle persone sono
omozigoti per la delezione del gene SMN2.

• Il genotipo 1:2, che ci aspettavamo essere il

più frequente, è presente nel 30% dei portatori
certi.

• Il 36% dei pazienti analizzati per familiarità

sono risultati portatori, tutti con rapporto
1:1
 RISULTATI
• Il 45% dei pazienti con sospetta SMA, ma senza
la delezione in omozigosi di SMN1, è risultato
con genotipo 1:1 e quindi almeno portatore
della delezione di SMN1, in eterozigosi.

• Questo risultato suggerisce la possibilità che

questi pazienti siano compositi eterozigoti per
delezione e mutazione puntiforme, combinazione
più probabile rispetto a eventuali mutazioni
puntiformi in omozigosi.

• Pertanto, l’analisi semi-quantitativa dei geni

SMN, oltre che per l’identificazione dei
portatori sani, si può estendere anche ai
soggetti affetti ed aumenta la sensibilità del
metodo per la diagnosi di malattia
 CONCLUSIONI
• Abbiamo presentato un’analisi sensibile e
veloce per la rivelazione dei portatori SMA.

• Questa analisi può essere utilizzata per

quantizzare i geni SMN1 e SMN2 nelle famiglie
SMA e nella popolazione generale, per
identificare i portatori e per conoscere la
frequenza dei meccanismi di
delezione/conversione genica.

• Inoltre aumenta la sensibilità del metodo di

diagnosi molecolare di malattia perchè
identifica i pazienti con sospetta SMA che
presentano almeno un allele con delezione SMN1.