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MUTAGENESI MIRATA E

MANIPOLAZIONE DELLE PROTEINE

 SPESSO LE PROPRIETA’ FISICHE E


CHIMICHE DELLE PROTEINE “NATURALI”
NON SONO ADATTE ALL’APPLICAZIONE DI
TIPO INDUSTRIALE

 LA MUTAGENESI CONVENZIONALE E GLI


SCHEMI DI SELEZIONE POSSONO SERVIRE
A CREARE UNA FORMA MUTANTE DI UN
GENE CHE CODIFICA UNA PROTEINA
AVENTE LE PROPRIETA’ DESIDERATE
MUTAGENESI MIRATA E
MANIPOLAZIONE DELLE PROTEINE

APPLICANDO UN INSIEME DI TECNICHE CHE


CAMBIANO IN MODO SPECIFICO GLI
AMINOACIDI CODIFICATI DAL GENE
CLONATO E’ POSSIBILE CREARE PROTEINE
LE CUI PROPRIETA’ SI POSSONO
ADATTARE MEGLIO ALLE APPLICAZIONI
INDUSTRIALI E TERAPEUTICHE RISPETTO
ALLE SOSTANZE OMOLOGHE NATURALI
MUTAGENESI MIRATA E
MANIPOLAZIONE DELLE PROTEINE

ESEMPI:
 Alterazioni della resistenza al calore e/o
la stabilità al pH
 Modificazione del co-fattore metallico
necessario
 Aumento della resistenza nei confronti
delle proteasi cellulari
INGEGNERIA PROTEICA

ALCUNE STRATEGIE BASATE SULLA


MUTAGENESI MIRATA DEGLI
OLIGONUCLEOTIDI PER MODIFICARE:

 TERMOSTABILITA’

 ATTIVITA’ ENZIMATICA

 SPECIFICITA’ ENZIMATICA
MUTAGENESI MIRATA DEGLI
OLIGONULEOTIDI CON DNA PLASMIDICO

Inserimento
del DNA
bersaglio in
un sito di
clonazione
multiplo nel
vettore
plasmidico
pALTER
MUTAGENESI MIRATA DELGLI
OLIGONULEOTIDI CON DNA PALSMIDICO

I) Trasformazione
in E. coli e
denaturazione
con alcali

TetS
MUTAGENESI MIRATA DELGLI
OLIGONULEOTIDI CON DNA PALSMIDICO

II) Trasformazione in E.
coli e selezione

TetS III) Identificazione delle


cellule (90%) in
possesso della
mutazione specificata
nel gene bersaglio
(ibridazione del DNA)
TERMOSTABILITA’ DI UNA
PROTEINA

TEMPERATURA ALLA QUALE LA


STRUTTURA COMPLESSIVA
DELLA PROTEINA VIENE
DENATURATA AL 50%
AUMENTO DELLA TERMOSTABILITA’

IMPEDIRE ALLA MOLECOLA DI


PERDERE IL SUO RIPIEGAMENTO AD
ALTE TEMPERATURA

AGGIUNTA DEI LEGAMI DISOLFURO


(MUTAGENESI MIRATA DEGLI
OLIGONUCLEOTIDI
INTRODUZIONE DI NUOVI LEGAMI DI
SOLFURO INTERNI)
LE PROPRIETA’ DEL LISOZIMA T4 E DI SEI
VARIANTI MANIPOLATE GENETICAMENTE

Mutati in cisteina vari residui aminoacidici, testate:


 Termostabilità
 Attività enzimatica
AUMENTO DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

RIDUZIONE DEL NUMERO DEI RESIDUI


SOLFIDRILE LIBERI

ES: INTERFERONE β UMANO


MUTAGENESI MIRATA DEGLI
OLIGONUCLEOTIDI

TRASFORMAZIONE DI UN CODONE
DELLA CISTEINA IN CODONE DELLA
SERINA
POSIZIONE DEI RESIDUI DI CISTEINA E
DEI LEGAMI DISOLFURO DI
IFNα E IFNβ

Ser 17 (VARIANTE ATTIVA)


AUMENTO DELLA SPECIFICITA’
ENZIMATICA
MUTAGENESI MIRATA DEGLI
OLIGONUCLEOTIDI

ATTIVATORE TISSUTALE DEL


PLASMINOGENO (tPA)
STABILITA’ E ATTIVITA’ DI VARIE
VERSIONI MODIFICATE DI tPA
VARIANTE MODIFICAZIONI SPECIFICITA’
tPA

1. Thr (103)---Asn Permanenza nel


plasma di coniglio di
circa 10 volte più a
lungo della forma
nativa
2. LysHisArgArg(296- Enzima più specifico
299)---AlaAlaAlaAla per la fibrina rispetto
alla forma nativa
3. Asn(117)---Gln Attività fibrinolitica
tipica della forma
nativa