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SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI

PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE


RICOMBINANTI
A cosa possono servire le proteine ricombinanti?

-PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi,


insulina, ormone crescita).

-PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (ENZIMI).

-PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA


PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E
MONOCLONALI.

-REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA.


SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI
PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE
RICOMBINANTI
 QUANDO? – Quando le proteine sintetizzate
nei procarioti sono instabili o perdono la loro
attività biologica.

 PERCHE’? – Perché dopo la purificazione le


proteine ricombinanti sono prive di
contaminanti (composti batterici tossici o
pirogeni).
- Perché una serie di modificazioni sono
possibili a livello post-traduzionale:
 Corretta formazione di ponti di solfuro

 Tagli proteolitici della forma precursore

 Glicosilazione (stabilità)

 Fosforilazione, acetilazione,
carbossilazione etc… (attività biologica)
GENERICO VETTORE DI ESPRESSIONE
EUCARIOTICO:
CARATTERISTICHE PRINCIPALI

MARCATORE
SELEZIONABILE
EUCARIOTICA

UNITA’ DI TRASCRIZIONE
EUCARIOTICA
SISTEMI DI
TRASFORMAZIONE/TRASFEZIONI DI
CELLULE EUCARIOTICHE
 LIEVITO:

- FORMAZIONE DI PROTOPLASTI

- TRASFORMAZIONE CON ACETATO DI


LITIO

- ELETTROPORAZIONE
 CELLULE ANIMALI:

- INCUBAZIONE CON DNA


COPRECIPITATO CON FOSFATO DI
CALCIO O DEAE-DESTRANO

- ELETTROPORAZIONE

- VEICOLAZIONE DI DNA DA PARTE DI UN


VIRUS
SISTEMI DI ESPRESSIONE
BASATU SU S. cerevisiae
 VANTAGGI
- Eucariote unicellulare - Secerne poche
- Ben nota la genetica e proteine
la fisiologia - GRAS organism
- Crescita rapida (Generally
- Identificati promotori Recognized As Safe)
forti, plasmidici (2µ m) dalla Food and Drug
naturali Administration degli
- Modificazioni post- Stati Uniti
traduzionali
PROTEINE RICOMBINANTI
PRODOTTE IN S. cerevisiae
VETTORI BASATI SU S. cerevisiae
1. VETTORI PLASMIDICI O EPISOMALI
 ADOPERATI DIFFUSAMENTE PER
PRODURRE PROTEINE ETEROLOGHE
 INSTABILI IN CONDIZIONI DI CRESCITA IN
LARGA SCALA (> 10L)
 RIMEDI:
- ALTERAZIONE CONDIZIONI DI CRESCITA

AUMENTO DELLA STABILITA’


1.VETTORI DI INTEGRAZIONE
 POCO DIFFUSI PER BASSA RESA
PROTEICA

3. CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO


(YAC)
 CLONAGGIO DI LUNGHI SEGMENTI
DI DNA (100 Kb)
 ALTAMENTE STABILI
UTILIZZI DEL SISTEMA YAC
 MAPPATURA FISICA DNA GENOMICO

 ANALISI DI GRANDI UNITA’


TRASCRIZIONALI

 PREPARAZIONE E SCREENING DI
GENOTECHE
COMPONENTI ESSENZIALI DEL
SISTEMA YAC
 MARCATORE SELEZIONABILE DI E. coli
(AMPR)
 ORIGINE DI REPLICAZIONE IN E. coli (oriE)
 CENTROMERI (CEN), TELOMERI (T), E
SEQUENZE A REPLICAZIONE AUTONOMA
(ARS)
 MARCATORI DI DI SELEZIONE
AUXOTROFICA COME TRP1 E URA3 PER
SELEZIONARE IN LIEVITO
 SITI DI RESTRIZIONE UNICI
SISTEMA DI CLONAZIONE YAC

IL COSTRUTTO
FINALE RECA
DNA CLONATO E
SI PUO’
MANTENERE
STABILE IN UNA
CELLULA DI
LIEVITO OSPITE
Ura- E Trp-
ESPRESSIONE DEL GENE ETEROLOGO
DELLA SUPEROSSIDO DISMUTASI
UMANA IN S. cerevisiae
Cu/Zn SOD
 COMBINA L’O-2 CON H2 H2O2

 PRODUZIONE DI ANIONE SUPEROSSIDO


- INFIAMMAZIONE
- RIPERFUSIONE D’ORGANO

 POTENZIALE AGENTE TERAPEUTICO:


- OSTEOARTRITE, ARTRITE REUMATOIDE,
SCLERODERMA, SPONDILITE ANCHILOSANTE
CLONAZIONE DEL cDNA PER Cu/Zn
DISMUTASI UMANA IN LIEVITO
 Trasformazione
di un ceppo di
lievito LEU2-

 Crescita in LEU-

 Espressione
costitutiva di
Cu/Zn-SOD
acetilata in ALA
all’N-terminale
ESPRESSIONE DI PROTEINE
RICOMBINANTI IN S. cerevisiae
 LIMITI

3. PERDITA DEL PLASMIDE

5. IPERGLICOSILAZIONE DELLA PROTEINA


ETEROLOGA ALTERAZIONE
ATTIVITA’ BIOLOGICA E
IMMUNOGENICITA’

3. NO SECREZIONE PROTEICA
 RIMEDI

-LIEVITI ALTERNATIVI:
 Kluyverommyces lactis
 Schizosaccharomyces pombe
 Yarrowia lipolitica
 Pichia pastoris
 Hansenula polymorpha
Pichia pastoris
 LIEVITO METANOLTROFICO

 COLTIVABILE FACILMENTE ED
ECONOMICAMENTE IN BIOREATTORI
DI GRANDI DIMENSIONI

 COSTRUZIONE DI VETTORI DI
INTEGRAZIONE PER EVITARE LA
PERDITA DEL PLASMIDE
VETTORE DI ESPRESSIONE CHE SI INTEGRA
IN P. pastoris PER PRODUZIONE DI HBsAg
(scopo vaccino)

GENE AOX1: ALCOL


OSSIDASI E
REGOLATO DAL
METANOLO

oriE: DERIVANTE DA
pBR322
INTEGRAZIONE DI UNA PARTE DEL VETTORE
DI ESPRESSIONE NEL GENE 1 DELL’ALCOL
OSSIDASI DI P. pastoris

TRASFORMAZIONE
DI UN CEPPO DI
P. pastoris HIS4-
RISULTATI
 IN PRESENZA DI METANOLO IL CLONE
RECANTE L’UNITA’ INTEGRATA DI
DNA SINTETIZZA GRANDI QUANTITA’
DI HBsAg

 ASSEMBLGGIO DEL PRODOTTO


PROTEICO ANTICORPI ANTI-
HBV
PRODUZIONE DI PROTEINE
RICOMBINANTI MEDIANTE IL SISTEMA
DI ESPRESSIONE DI Baculovirus
 AcMNPV: VIRUS DELLA POLIEDROSI
NUCLEARE MULTIPLA DI Autographa
californica

 LINEA CELLULARE: Spodoptera


frugiperda
- SI ESPRIME MOLTO BENE IL
PROMOTORE DELLA POLIEDRINA
PRODUZIONE DI Baculovirus
RICOMBINANTE
 STEP I
TRANSFER VECTOR CONSTRUCTION
E. coli -BASED PLASMID
PROPAGATION
 STEP II

TRANSFECTION OF CELLS WITH


AcMNPV DNA + TRANSFER VECTOR

• LOSS OF POLYHEDRIN
GENE

• ZONE OF CELL LYSIS

• ISOLATION OF VIRUS
“VISUALIZZAZIONE” DELLE
PLACCHE SENZA OCCLUSIONE:

 IBRIDAZIONE DEL DNA

 PCR ASSAY

 GENE lacZ DI E. coli SOTTO IL


CONTROLLO DI UN PROMOTORE DEL
BACULOVIRUS
 STEP III

INFEZIONE DELLE CELLULE DI INSETTO


CON BACULOVIRUS RICOMBINANTE

 STEP IV

RACCOLTA DELLA PROTEINA


ETEROLOGA DOPO 4 O 5 GIORNI
ALCUNE DELLE PROTEINE RICOMBINANTI
PRODOTTE UTILIZZANDO IL SISTEMA DEL
VETTORE DI ESPRESSIONE DI BACULOVIRUS