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Glicosilazione (stabilità)
Fosforilazione, acetilazione,
carbossilazione etc… (attività biologica)
GENERICO VETTORE DI ESPRESSIONE
EUCARIOTICO:
CARATTERISTICHE PRINCIPALI
MARCATORE
SELEZIONABILE
EUCARIOTICA
UNITA’ DI TRASCRIZIONE
EUCARIOTICA
SISTEMI DI
TRASFORMAZIONE/TRASFEZIONI DI
CELLULE EUCARIOTICHE
LIEVITO:
- FORMAZIONE DI PROTOPLASTI
- ELETTROPORAZIONE
CELLULE ANIMALI:
- ELETTROPORAZIONE
PREPARAZIONE E SCREENING DI
GENOTECHE
COMPONENTI ESSENZIALI DEL
SISTEMA YAC
MARCATORE SELEZIONABILE DI E. coli
(AMPR)
ORIGINE DI REPLICAZIONE IN E. coli (oriE)
CENTROMERI (CEN), TELOMERI (T), E
SEQUENZE A REPLICAZIONE AUTONOMA
(ARS)
MARCATORI DI DI SELEZIONE
AUXOTROFICA COME TRP1 E URA3 PER
SELEZIONARE IN LIEVITO
SITI DI RESTRIZIONE UNICI
SISTEMA DI CLONAZIONE YAC
IL COSTRUTTO
FINALE RECA
DNA CLONATO E
SI PUO’
MANTENERE
STABILE IN UNA
CELLULA DI
LIEVITO OSPITE
Ura- E Trp-
ESPRESSIONE DEL GENE ETEROLOGO
DELLA SUPEROSSIDO DISMUTASI
UMANA IN S. cerevisiae
Cu/Zn SOD
COMBINA L’O-2 CON H2 H2O2
Crescita in LEU-
Espressione
costitutiva di
Cu/Zn-SOD
acetilata in ALA
all’N-terminale
ESPRESSIONE DI PROTEINE
RICOMBINANTI IN S. cerevisiae
LIMITI
3. NO SECREZIONE PROTEICA
RIMEDI
-LIEVITI ALTERNATIVI:
Kluyverommyces lactis
Schizosaccharomyces pombe
Yarrowia lipolitica
Pichia pastoris
Hansenula polymorpha
Pichia pastoris
LIEVITO METANOLTROFICO
COLTIVABILE FACILMENTE ED
ECONOMICAMENTE IN BIOREATTORI
DI GRANDI DIMENSIONI
COSTRUZIONE DI VETTORI DI
INTEGRAZIONE PER EVITARE LA
PERDITA DEL PLASMIDE
VETTORE DI ESPRESSIONE CHE SI INTEGRA
IN P. pastoris PER PRODUZIONE DI HBsAg
(scopo vaccino)
oriE: DERIVANTE DA
pBR322
INTEGRAZIONE DI UNA PARTE DEL VETTORE
DI ESPRESSIONE NEL GENE 1 DELL’ALCOL
OSSIDASI DI P. pastoris
TRASFORMAZIONE
DI UN CEPPO DI
P. pastoris HIS4-
RISULTATI
IN PRESENZA DI METANOLO IL CLONE
RECANTE L’UNITA’ INTEGRATA DI
DNA SINTETIZZA GRANDI QUANTITA’
DI HBsAg
• LOSS OF POLYHEDRIN
GENE
• ISOLATION OF VIRUS
“VISUALIZZAZIONE” DELLE
PLACCHE SENZA OCCLUSIONE:
PCR ASSAY
STEP IV