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MANIPOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE

GENICA NEI PROCARIOTI

- ESPRESSIONE GENICA IN E. coli

UN GENE PER ESSERE ESPRESSO


DEVE ESSERE “CIRCONDATO” DA
UNA SERIE DI SEGNALI CHE DEVONO
ESSERE RICONOSCIUTI DAL
BATTERIO.
- 3 PRINCIPALI SEGNALI:

- PROMOTORE: SEGNALA IL PUNTO DI INIZIO DELLA


TRASCRIZIONE DEL GENE

- TERMINATORE: SEGNALA LA FINE DELLA TRASCRIZIONE


DEDL GENE

- SITO DI LEGAME AL RIBOSOMA: BREVE SEQUENZA DI


NUCLEOTIDI RICONOSCIUTA DAL RIBOSOMA; IL CODONE
DI INIZIO TRADUZIONE E’ SITUATO A POCHI NUCLEOTIDI A
VALLE DI QUESTO SEGNALE
IL PROMOTORE DEVE ESSERE SCELTO
CON CURA!!

PICCOLE VARIAZIONI NELLE SEQUENZE CONSENSUS


DEI PROMOTORI PROCARIOTICI POSSONO ALTERARE
L’EFFICIENZA CON CUI UN GENE VIENE TRASCRITTO.

• PROMOTORI FORTI: CONTROLLANO L’ESPRESSIONE


DI QUEI GENI IL CUI PRODOTTO E’ RICHIESTO IN
GROSSE QUANTITA’ DALLA CELLULA

• PROMOTORI DEBOLI: CONTROLLANO


L’ESPRESSIONE DI QUEI GENI IL CUI PRODOTTO E’
RICHIESTO IN PICCOLE QUANTITA’ DALLA CELLULA
PROMOTORI INDUCIBILI

lac PROMOTER IPTG


lac Z

TRANSCIPTION
-35 -10

BETA-INDOLYACETI
ACID TRIPTOFANO
trpA
trp PROMOTER
TRANSCIPTION
NO
-35 -10 TRANSCRIPTION

IPTG
tac PROMOTER
TRANSCIPTION
-35 -10
(trp) (lac)
PROMOTORI INDUCIBILI
• pL: promotore di sinistra del batteriofago lambda
Controllato dal dal repressore cI del batteriofago lambda.
Mutante termosensibile del repressore cI, cI 857.
Crescita a 28-30 °C = cI impedisce la trascrizione diretta da pL.
Crescita a 42 °C = inattivazione di cI

• Promotore del gene 10 del batteriofago T7


Si inserisce il gene della RNA-polimerasi T7 nel cromosoma di
E. coli su di un batteriofago lambda lisogeno sotto il controllo
del promotore lac di E. coli.
Induzione con IPTG.
PROMOTORE IDEALE

PROMOTORE FORTE INDUCIBILE

CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE


IL GENE CLONATO SI ESPRIME SOLAMENTE:

• IN UNA FASE SPECIFICA DEL CICLO CELLULARE


• PER UN TEMPO SPECIFICATO

COSTRUZIONE DI PLASMIDI
(VETTORI DI ESPRESSIONE)
VETTORI DI ESPRESSIONE
P
E. coli EXPRESSION SIGNALS:
R P= PROMOTER
R= RBS

INSERT A FOREIGN GENE INTO


THE UNIQUE RESTRICTION SITE
P
mRNA
R TRANSORM PROTEIN
E. coli R

T
T
STARTEGIA GENERALIZZATA PER ISOLARE
PRESUNTE SEQUENZE PROMOTRICI
IN VARI ORGANISMI

Selezione per
resistenza
ad un antibiotico o
per saggio
colorimetrico
METODI PER AUMENTARE LA PRODUZIONE DELLE
PROTEINE: COSTRUZIONE DEL PLASMIDE pCP3
CRESCITA DELLE CELLULE
(E. coli) RECANTI IL PLASMIDE pCP3

• 28°C: il repressore cI, integrato nel dNA


cromosomiale di E. coli, è funzionante, pL è
spento> N. di copie normali del palsmide

• 42°C: il repressore cI si inattiva, pL è


attivo> N. di copie del plasmide aumenta
EFFETTI DELLA TEMPERATURA SUL NUMERO
DI COPIE DI TRE VETTORI PLASMIDICI

Il numero di copie del plasmide pCP3 aumenta di 5-10


volte quando si innalza la temperatura
del mezzo di crescita a 42 °C
SISTEMI SU LARGA SCALA
• Piccole colture (1-5 L): induzione facilmente
realizzabile o variando la temperatura o
aggiungendo un induttore chimico
• Bioreattori (>200 L): variazione di
temperatura (30-60 min.) e aggiunta di
induttore----COSTO ELEVATO

SISTEMA A DUE PLASMIDI


DOPPIO SISTEMA PLASMIDICO PER CONTROLLARE IL PROMOTORE
pL DI LAMBA REGOLANDO IL REPRESSORE cI CON IL TRIPTOFANO
CRESCITA DELLE CELLULE
• Mezzo non costoso: melassa e idrossilato
di caseina contenente piccole quantità di
triptofano libero.

• Induzione: aggiunta di triptone contenente


abbastanza triptofano libero da indurre
efficientemente la trascrizione

Sistema potenzialmente economico per produrre su larga


scala proteina da microrganismi ricombinanti
ESPRESSIONE IN ALTRI MICRORGANISMI

• E. coli: microrganismo non di elezione


per tutte le proteine
• Non esiste un unico vettore che
assicuri livelli ottimali di espressione
genica in tutti i batteri o, perlomeno, in
tutti quelli gram-negativi
• Molte strategie elaborate per E. coli
riescono utili anche per vari altri
microganismi
STRATEGIA
• Costruzione di una serie di vettori
plasmidici contenenti lac, tac, Nm (R
per neomicina) o S1 promoter (dal gene
S1 della proteina ribosomiale di
Rhizobium meliloti)
• Esaminata l’espressione della beta-
galattosidasi sotto il controllo di
ognuno di questi promotori
ATTIVITA’ β -GALATTOSIDASICA ESPRESSA DA
BATTERI GRAM-NEGATIVI PORTATORI DI UN
VETTORE PLASMIDICO CON IL GENE lacZ DI E. coli E
UN PROMOTORE ETEROLOGO
PROTEINE DI FUSIONE
LE PROTEINE ESTRANEE, NELLE CELLULE OSPITI,
VENGONO SPESSO PRODOTTE IN BASSE
QUANTITA’ DEGRADAZIONE

PROTEINE DI FUSIONE

COMBINAZIONE DEL PRODOTTO DEL GENE


CLONATO CON UNA PROTEINA STABILE
DELL’OSPITE
VETTORI CASSETTA PER LA
SINTESI DI PROTEINE DI FUSIONE
START OF
AN E.coli GENE UNIQUE RESTRICTION SITE
P R
T

FOREIGN GENE
P R
T

HYBRID GENE HYBRID PROTEIN


VETTORI CASSETTA PER LA
SINTESI DI PROTEINE DI FUSIONE
• VANTAGGI:

3. LA PRESENZA DEL PEPTIDE DI ORIGINE


BATTERICA NELLA PROTEINA DI FUSIONE PUO’
STABILIZZARE LA MOLECOLA E IMPEDIRE LA
DEGRADAZIONE DA PARTE DELL’OSPITE.

2. IL SEGMENTO DI ORIGINE BATTERICA PUO’


RAPPRESENTARE UN PEPTIDE SEGNALE CHE
DIRIGE LA PROTEINA NELLA GIUSTA
LOCALIZZAZIONE CELLULARE.
(ES. β-LATTAMASI SECREZIONE
VETTORI CASSETTA PER LA
SINTESI DI PROTEINE DI FUSIONE

• SVANTAGGI:

LA PRESENZA DEL PEPTIDE DI ORIGINE


BATTERICA PUO’ ALTERARE IL
FUNZIONAMENTO DELLA PROTEINA
IL TAGLIO DELLE PROTEINE DI
FUSIONE

TAGLIO PROTEOLITICO DI UNA PROTEINA DI FUSIONE


AD OPERA DEL FATTORE DI COAGULAZIONE
DEL SANGUE Xa
VETTORE DI CLONAZIONE DI FUSIONE

PROTEINA
“TRIIBRIDA”

ompF: SEGNALI DI TRASCRIZIONE,TRADUZIONE E SECREZIONE

lacZ DI E. coli: β -GALATTOSIDASI


ALCUNI SISTEMI DI FUSIONE UTILIZZATI PER
FACILITARE LA PURIFICAZIONE DELLE
PROTEINE ESTRANEE PRODOTTE IN E. coli
PURIFICAZIONE CROMATOGRAFICA PER
IMMUNOAFFINITA’ DI UNA PROTEINA DI FUSIONE
STRATEGIE PER EVITARE L’INSOLUBILITA’ DELLE
PROTEINE. ES. SINTESI DELLA PROTEINA DI
FUSIONE TIOREDOXINA-PROTEINA TARGET

A) ASSENZA DI
TRIPTOFANO

B) PRESENZA DI
TRIPTOFANO
ESPOSIZIONE DI PROTEINE ALLA SUPERFICIE:
Sistemi specializzati di proteine di fusione

1. FACILITARE LO SCREENING DI
GRANDI GENOTECHE DI cDNA

2. SOVRAESPRIMERE ALCUNI PEPTIDI


O PROTEINE
M13 Surface Displays

• Useful for library screening


FUSIONI TRA I GENI PER LA PROTEINA
BERSAGLIO E QUELLI PER UNA PROTEINA
DELLA SUPERFICIE BATTERICA ESTERNA
PARTNER DI FUSIONE
BATTERICA UTILIZZATI
• PROTEINA A DELLA MEMBRANA
ESTERNA DI E. coli (OmpA)

• LIPOPROTEINA ASSOCIATA AL
PEPTIDOGLICANO (PAL)

• PROTEINA F DELLA MEMBRANA


ESTERNA DI Pseudomonas aeruginosa
(OprF)
SOVRAESPRESSIONE DI
PEPTIDI O PROTEINE
INSERIMENTO DELL’EPITOPO Asn-Ala-Asn-
Pro DI UNA PROTEINA DI P. falciparum IN
REGIONI CODIFICANTI DI OrpF DI P.
aeruginosa

REAZIONE POSITIVA NELL’ESPOSIZIONE


AGLI ANTICORPI MONOCLONALI CONTRO
P. falciparum

POTENZIALI VACCINI
ESEMPIO DI VETTORE CON SEGNALI
TRASCRIZIONALI E TRADUZIONALI
Codon Usage Problems

• tRNAs corresponding to cloned gene codons


rare in bacteria used to express gene
OTTIMIZZAZIONE DEI CODONI DEL GENE CLONATO
Correcting Codon Usage
Issues

• Over express tRNA genes corresponding to the


required codons
• Amino acid production and/or charging enzymes
may also need to be modified in some cases
MIGLIORAMENTO DELLA
STABILITA’ DELLE PROTEINE
• TEMPO DI DIMEZZAMENTO
2. LEGAMI DI SOLFURO
3. Aa N-TERMINALI*
ES. β -GALATTOSIDASI
SEQUENZE PEST
SEQUENZE INTERMEDIE RICCHE DI
• PROLINA- AC. GLUTAMMICO- SERINA- TREONINA

DEGRADAZIONE PROTEOLITICA

SE FIANCHEGGIATE DA AA A CARICA POSITIVA

SEGNALE DI DEGRADAZIONE

MANIPOLAZIONE STABILITA’
GENETICA PROTEICA
OVERCOMING OXYGEN
LIMITATION
• MODIFICATION OF FERMENTATION
(AGITATION, AREATION)

• USE OF PROTEASE-DEFICIENT HOST


STRAIN

• BACTERIAL HEMOGLOBIN
- USE OF VITREOSCILLA HEMOGLOBIN-LIKE
MOLECULE IN E. coli
Secrezione di proteine con attività
specifica maggiore
INTEGRAZIONE DEL DNA NEL
CROMOSOMA DELL’OSPITE
• PLASMIDE-------SOVRACCARICO
METABOLICO
• PERDITA PLASMIDE
• RIDOTTA PRODUZIONE PROTEICA

2 POSSIBILI RIMEDI:
- AGGIUNTA DI ANTIBIOTICI O DI METABOLITI
ESSENZIALI (SU SCALA DI LABORATORIO)
- INTRODUZIONE DIRETTA DEL DNA
CLONATO NEL DNA CROMOSOMIALE
DELLA CELLULA OSPITE
INTEGRAZIONE DEL DNA NEL
CROMOSOMA DELL’OSPITE
• RISOLUZIONE PERDITA PLASMIDE
• DNA STABILE
• ASSENZA DI AGENTI SELETTIVI

ESSENZIALE:
- IL SITO DI INTEGRAZIONE DELL’OSPITE NON DEVE
APPARTENERE A UN GENE CODIFICANTE
ESSENZIALE
- PROMOTORE REGOLABILE DEL GENE ENTRANTE
- OMOLOGIA DI SEQUENZA (ALMENO 50 NT) TRA
DNA ENTRANTE E DNA CROMOSOMIALE.
DUE MODI DI INTEGRARE IL GENE
NEL SITO CROMOSOMICO

IL GENE CLONATO E’
INSERITO NEL MEZZO DI
UN SEGMENTO
CLONATO DI DNA
PROVENIENTE DAL
CROMOSOMA OSPITE

IL GENE CLONATO E’
INSERITO IN POSIZIONE
ADIACENTE AL DNA
CLONATO PROVENIENTE
DAL CROMOSOMA
OSPITE
Selectable 0

Integration
Systems
• Integrate selectable
marker into target
site
• Integration of cloned
gene into target site
by double
recombination
eliminates marker
gene
• Choose marker gene
carefully….
0

Engineering For Secretion

• Maltose
Binding Protein
secretion signal
insufficient so
entire gene
used as fusion
component
• Xa cleavage
site added
• Cloned Gene
(IL-2) released
by cleavage
IL CARICO METABOLICO
VARIE CAUSE:
• AUMENTO DEL N. DI COPIE DEL
PLASMIDE

• LIMITAZIONE OSSIGENO

• SOVRAPPRODUZIONE DI PROTEINE
ESTRANEE…………
0

Metabolic Load

• Replication of high
copy plasmids
• Oxygen
consumption
• Charged tRNAs
• Export apparatus
• Product interference
with endogenous
processes
CONSEGUENZE:
• RIDUZIONE DEL TASSO DI CRESCITA
CELLULARE

EFFETTI DEL N. DI COPIE DEL PLASMIDE


CONSEGUENZE:
• ALTERAZIONI POLISACCARIDI
EXTRACELLULARI

• ESAURIMENTO DI AA SCORTA
E LIMITAZIONE DI CERTI
AMINOACIL-tRNA
RIMEDI
• UTILIZZO DI VETTORI PLASMIDICI A
BASSO N. DI COPIE

• IMPIEGO DI PROMOTORI FORTI MA


REGOLABILI

• ACCETTARE UN LIVELLO MODESTO


DI ESPRESSIONE DEL GENE
ESTRANEO
STRATEGIA PER RIDURRE LA
PRODUZIONE DI ACETATI NELLE
CELLULE OSPITI
INTRODUZIONE
NELLE CELLULE
Acetolattato sintasi
OSPITI DI E. coli
DI UN PLASMIDE
RECANTE I GENI
PER LA SINTESI
DELL’ACETOLAT-
TATO SINTASI
(ALS)
Inibisce la crescita cellulare
e la produzione di proteine