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TRANSCIPTION
-35 -10
BETA-INDOLYACETI
ACID TRIPTOFANO
trpA
trp PROMOTER
TRANSCIPTION
NO
-35 -10 TRANSCRIPTION
IPTG
tac PROMOTER
TRANSCIPTION
-35 -10
(trp) (lac)
PROMOTORI INDUCIBILI
• pL: promotore di sinistra del batteriofago lambda
Controllato dal dal repressore cI del batteriofago lambda.
Mutante termosensibile del repressore cI, cI 857.
Crescita a 28-30 °C = cI impedisce la trascrizione diretta da pL.
Crescita a 42 °C = inattivazione di cI
COSTRUZIONE DI PLASMIDI
(VETTORI DI ESPRESSIONE)
VETTORI DI ESPRESSIONE
P
E. coli EXPRESSION SIGNALS:
R P= PROMOTER
R= RBS
T
T
STARTEGIA GENERALIZZATA PER ISOLARE
PRESUNTE SEQUENZE PROMOTRICI
IN VARI ORGANISMI
Selezione per
resistenza
ad un antibiotico o
per saggio
colorimetrico
METODI PER AUMENTARE LA PRODUZIONE DELLE
PROTEINE: COSTRUZIONE DEL PLASMIDE pCP3
CRESCITA DELLE CELLULE
(E. coli) RECANTI IL PLASMIDE pCP3
PROTEINE DI FUSIONE
FOREIGN GENE
P R
T
• SVANTAGGI:
PROTEINA
“TRIIBRIDA”
A) ASSENZA DI
TRIPTOFANO
B) PRESENZA DI
TRIPTOFANO
ESPOSIZIONE DI PROTEINE ALLA SUPERFICIE:
Sistemi specializzati di proteine di fusione
1. FACILITARE LO SCREENING DI
GRANDI GENOTECHE DI cDNA
• LIPOPROTEINA ASSOCIATA AL
PEPTIDOGLICANO (PAL)
POTENZIALI VACCINI
ESEMPIO DI VETTORE CON SEGNALI
TRASCRIZIONALI E TRADUZIONALI
Codon Usage Problems
DEGRADAZIONE PROTEOLITICA
SEGNALE DI DEGRADAZIONE
MANIPOLAZIONE STABILITA’
GENETICA PROTEICA
OVERCOMING OXYGEN
LIMITATION
• MODIFICATION OF FERMENTATION
(AGITATION, AREATION)
• BACTERIAL HEMOGLOBIN
- USE OF VITREOSCILLA HEMOGLOBIN-LIKE
MOLECULE IN E. coli
Secrezione di proteine con attività
specifica maggiore
INTEGRAZIONE DEL DNA NEL
CROMOSOMA DELL’OSPITE
• PLASMIDE-------SOVRACCARICO
METABOLICO
• PERDITA PLASMIDE
• RIDOTTA PRODUZIONE PROTEICA
2 POSSIBILI RIMEDI:
- AGGIUNTA DI ANTIBIOTICI O DI METABOLITI
ESSENZIALI (SU SCALA DI LABORATORIO)
- INTRODUZIONE DIRETTA DEL DNA
CLONATO NEL DNA CROMOSOMIALE
DELLA CELLULA OSPITE
INTEGRAZIONE DEL DNA NEL
CROMOSOMA DELL’OSPITE
• RISOLUZIONE PERDITA PLASMIDE
• DNA STABILE
• ASSENZA DI AGENTI SELETTIVI
ESSENZIALE:
- IL SITO DI INTEGRAZIONE DELL’OSPITE NON DEVE
APPARTENERE A UN GENE CODIFICANTE
ESSENZIALE
- PROMOTORE REGOLABILE DEL GENE ENTRANTE
- OMOLOGIA DI SEQUENZA (ALMENO 50 NT) TRA
DNA ENTRANTE E DNA CROMOSOMIALE.
DUE MODI DI INTEGRARE IL GENE
NEL SITO CROMOSOMICO
IL GENE CLONATO E’
INSERITO NEL MEZZO DI
UN SEGMENTO
CLONATO DI DNA
PROVENIENTE DAL
CROMOSOMA OSPITE
IL GENE CLONATO E’
INSERITO IN POSIZIONE
ADIACENTE AL DNA
CLONATO PROVENIENTE
DAL CROMOSOMA
OSPITE
Selectable 0
Integration
Systems
• Integrate selectable
marker into target
site
• Integration of cloned
gene into target site
by double
recombination
eliminates marker
gene
• Choose marker gene
carefully….
0
• Maltose
Binding Protein
secretion signal
insufficient so
entire gene
used as fusion
component
• Xa cleavage
site added
• Cloned Gene
(IL-2) released
by cleavage
IL CARICO METABOLICO
VARIE CAUSE:
• AUMENTO DEL N. DI COPIE DEL
PLASMIDE
• LIMITAZIONE OSSIGENO
• SOVRAPPRODUZIONE DI PROTEINE
ESTRANEE…………
0
Metabolic Load
• Replication of high
copy plasmids
• Oxygen
consumption
• Charged tRNAs
• Export apparatus
• Product interference
with endogenous
processes
CONSEGUENZE:
• RIDUZIONE DEL TASSO DI CRESCITA
CELLULARE
• ESAURIMENTO DI AA SCORTA
E LIMITAZIONE DI CERTI
AMINOACIL-tRNA
RIMEDI
• UTILIZZO DI VETTORI PLASMIDICI A
BASSO N. DI COPIE