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CLAUDIO ORTOLANI

DIAGNOSTICA
CITOMETRICA
DELLE
NEOPLASIE
EMATOLOGICHE

3
4
INDICE

Prefazione pag. 19

Introduzione “ 21

PARTE PRIMA – I DIVERSI ANTIGENI “ 23

Gli antigeni CD1 “ 25


Aspetti generali “ 25
Aspetti citometrici “ 25
Aspetti diagnostici “ 26
Neoplasie dei precursori T “ 26
Neoplasie dei precursori B “ 26
Leucemie acute mieloidi “ 26
Neoplasie delle cellule B mature “ 26
Neoplasie delle cellule T mature “ 26
Altre entità nosografiche “ 27

L’antigene CD2 “ 27
Aspetti generali “ 27
Aspetti citometrici “ 27
Aspetti diagnostici “ 28
Neoplasie dei precursori T “ 28
Neoplasie dei precursori B “ 28
Leucemie acute mieloidi “ 28
Neoplasie delle cellule B mature “ 29
Neoplasie delle cellule T mature “ 29
Neoplasie delle cellule NK “ 29
Altre entità nosografiche “ 29

L’antigene CD3 “ 30
Aspetti generali “ 30
Aspetti citometrici “ 30
MoAb OKT3, SK7/Leu4 e UCHT-1 “ 31
MoAb WT31 “ 31
MoAb T3 “ 32
Altri anticorpi “ 32
Aspetti diagnostici “ 33
Neoplasie dei precursori T “ 33
Neoplasie dei precursori B “ 33
Leucemie acute mieloidi “ 33
Neoplasie delle cellule B mature “ 34
Neoplasie delle cellule T mature “ 34
Neoplasie delle cellule NK “ 34
Altre entità nosografiche “ 34

5
L’antigene CD4 pag. 35
Aspetti generali “ 35
Aspetti citometrici “ 35
Aspetti diagnostici “ 36
Monitorizzazione dei protocolli chemioterapici “ 36
Neoplasie dei precursori T “ 36
Neoplasie dei precursori B “ 36
Leucemie acute mieloidi “ 36
Neoplasie delle cellule B mature “ 37
Neoplasie delle cellule T mature “ 37
Neoplasie delle cellule NK “ 38
Altre entità nosografiche “ 38

L’antigene CD5 “ 39
Aspetti generali “ 39
Aspetti citometrici “ 39
Aspetti diagnostici “ 40
Neoplasie dei precursori T “ 40
Neoplasie dei precursori B “ 40
Leucemie acute mieloidi “ 40
Neoplasie delle cellule B mature “ 40
Neoplasie delle cellule T mature “ 41
Neoplasie delle cellule NK “ 41
Altre entità nosografiche “ 41

L’antigene CD7 “ 42
Aspetti generali “ 42
Aspetti citometrici “ 42
Aspetti diagnostici “ 42
Neoplasie dei precursori T “ 42
Neoplasie dei precursori B “ 43
Leucemie acute mieloidi “ 43
Neoplasie delle cellule B mature “ 43
Neoplasie delle cellule T mature “ 43
Neoplasie delle cellule NK “ 44
Altre entità nosografiche “ 44

L’antigene CD8 “ 44
Aspetti generali “ 44
Aspetti citometrici “ 45
Aspetti diagnostici “ 45
Neoplasie dei precursori T “ 45
Neoplasie dei precursori B “ 45
Leucemie acute mieloidi “ 46
Neoplasie delle cellule B mature “ 46
Neoplasie delle cellule T mature “ 46
Neoplasie delle cellule NK “ 46

6
L’antigene CD10 pag. 47
Aspetti generali “ 47
Aspetti citometrici “ 48
Aspetti diagnostici “ 48
Neoplasie dei precursori T “ 48
Neoplasie dei precursori B “ 48
Leucemie acute mieloidi “ 49
Neoplasie delle cellule B mature “ 49
Neoplasie delle cellule T mature “ 49
Neoplasie delle cellule NK “ 50
Altre entità nosografiche “ 50

L’antigene CD11a “ 50
Aspetti generali “ 50
Aspetti citometrici “ 50
Aspetti diagnostici “ 51
Neoplasie dei precursori T e B “ 51
Leucemie acute mieloidi “ 51
Neoplasie delle cellule B mature “ 51
Altre entità nosografiche “ 51

L’antigene CD11b “ 52
Aspetti generali “ 52
Aspetti citometrici “ 53
Aspetti diagnostici “ 53
Neoplasie dei precursori T e B “ 53
Leucemie acute mieloidi “ 53
Neoplasie delle cellule B mature “ 53
Neoplasie delle cellule T mature “ 54
Neoplasie delle cellule NK “ 54
Altre entità nosografiche “ 54

L’antigene CD11c “ 54
Aspetti generali “ 54
Aspetti citometrici “ 54
Aspetti diagnostici “ 55
Neoplasie dei precursori T “ 55
Leucemie acute mieloidi “ 55
Neoplasie delle cellule B mature “ 55
Neoplasie delle cellule T mature “ 56
Altre entità nosografiche “ 56

L’antigene CD13 “ 56
Aspetti generali “ 56
Aspetti citometrici “ 56
Aspetti diagnostici “ 57
Neoplasie dei precursori T “ 57
Neoplasie dei precursori B “ 57
Leucemie acute mieloidi “ 57
Neoplasie delle cellule B mature “ 58
Neoplasie delle cellule T mature “ 58

7
Altre entità nosografiche pag. 58

L’antigene CD14 “ 58
Aspetti generali “ 58
Aspetti citometrici “ 59
Aspetti diagnostici “ 60
Neoplasie dei precursori T e B “ 60
Leucemie acute mieloidi “ 60
Neoplasie delle cellule B mature “ 60
Neoplasie delle cellule T mature “ 61
Neoplasie delle cellule NK “ 61
Altre entità nosografiche “ 61

L’antigene CD15 “ 61
Aspetti generali “ 61
Aspetti citometrici “ 61
Aspetti diagnostici “ 62
Neoplasie dei precursori T e B “ 62
Leucemie acute mieloidi “ 62
Neoplasie delle cellule B mature “ 62
Neoplasie delle cellule T mature “ 63
Neoplasie delle cellule NK “ 63
Altre entità nosografiche “ 63

L’antigene CD16 “ 63
Aspetti generali “ 63
Aspetti citometrici “ 64
Aspetti diagnostici “ 65
Neoplasie dei precursori T e B “ 65
Leucemie acute mieloidi “ 65
Neoplasie delle cellule B mature “ 65
Neoplasie delle cellule T mature “ 65
Neoplasie delle cellule NK “ 65
Altre entità nosografiche “ 66

L’antigene CD19 “ 66
Aspetti generali “ 66
Aspetti citometrici “ 66
Aspetti diagnostici “ 67
Neoplasie dei precursori T “ 67
Neoplasie dei precursori B “ 67
Leucemie acute mieloidi “ 67
Neoplasie delle cellule B mature “ 67
Neoplasie delle cellule T mature “ 68
Neoplasie delle cellule NK “ 68
Altre entità nosografiche “ 68

8
L’antigene CD20 pag. 68
Aspetti generali “ 68
Aspetti citometrici “ 68
MoAb FMC7 “ 69
Altri anticorpi “ 69
Aspetti diagnostici “ 69
Neoplasie dei precursori T “ 69
Neoplasie dei precursori B “ 70
Leucemie acute mieloidi “ 70
Neoplasie delle cellule B mature “ 70
Neoplasie delle cellule T mature “ 71

L’antigene CD22 “ 71
Aspetti generali “ 71
Aspetti citometrici “ 71
Aspetti diagnostici “ 72
Neoplasie dei precursori T “ 72
Neoplasie dei precursori B “ 72
Leucemie acute mieloidi “ 72
Neoplasie delle cellule B mature “ 72
Altre entità nosografiche “ 72

L’antigene CD23 “ 73
Aspetti generali “ 73
Aspetti citometrici “ 73
Aspetti diagnostici “ 73
Neoplasie dei precursori T e B “ 73
Leucemie acute mieloidi “ 74
Neoplasie delle cellule B mature “ 74
Neoplasie delle cellule T mature “ 74
Altre entità nosografiche “ 74

L’antigene CD24 “ 75
Aspetti generali “ 75
Aspetti citometrici “ 75
Aspetti diagnostici “ 75
Neoplasie dei precursori T “ 75
Neoplasie dei precursori B “ 75
Leucemie acute mieloidi “ 75
Neoplasie delle cellule B mature “ 76
Neoplasie delle cellule T mature “ 76
Altre entità nosografiche “ 76

L’antigene CD25 “ 76
Aspetti generali “ 76
Aspetti citometrici “ 77
Aspetti diagnostici “ 77
Leucemie acute “ 77
Neoplasie delle cellule B mature “ 77
Neoplasie delle cellule T mature “ 77
Neoplasie delle cellule NK “ 77

9
Altre entità nosografiche pag. 78

L’antigene CD27 “ 78
Aspetti generali “ 78
Aspetti diagnostici “ 78
Neoplasie delle cellule B mature “ 78
Altre entità nosografiche “ 78

L’antigene CD30 “ 79
Aspetti generali “ 79
Aspetti citometrici “ 79
Aspetti diagnostici “ 80
Neoplasie dei precursori T “ 80
Neoplasie dei precursori B “ 80
Leucemie acute mieloidi “ 80
Neoplasie delle cellule B mature “ 80
Neoplasie delle cellule T mature “ 80
Altre entità nosografiche “ 81

L’antigene CD33 “ 81
Aspetti generali “ 81
Aspetti citometrici “ 81
Aspetti diagnostici “ 81
Neoplasie dei precursori T “ 81
Neoplasie dei precursori B “ 82
Leucemie acute mieloidi “ 82
Neoplasie delle cellule B mature “ 82
Neoplasie delle cellule T mature “ 83
Neoplasie delle cellule NK “ 83
Altre entità nosografiche “ 83

L’antigene CD34 “ 83
Aspetti generali “ 83
Aspetti citometrici “ 84
Aspetti diagnostici “ 85
Neoplasie dei precursori T “ 85
Neoplasie dei precursori B “ 85
Leucemie acute mieloidi “ 85
Neoplasie delle cellule B mature “ 86
Neoplasie delle cellule T mature “ 86
Neoplasie delle cellule NK “ 86
Altre entità nosografiche “ 86

L’antigene CD38 “ 86
Aspetti generali “ 86
Aspetti citometrici “ 87
Aspetti diagnostici “ 87
Neoplasie dei precursori T e B “ 87
Leucemie acute mieloidi “ 87
Neoplasie delle cellule B mature “ 87
Neoplasie delle cellule T mature “ 88

10
L’antigene CD43 pag. 88
Aspetti generali “ 88
Aspetti citometrici “ 88
Aspetti diagnostici “ 89
Neoplasie dei precursori T e B “ 89
Leucemie acute mieloidi “ 89
Neoplasie delle cellule B mature “ 89
Neoplasie delle cellule T mature “ 89
Neoplasie delle cellule NK “ 89

L’antigene CD45 “ 90
Aspetti generali “ 90
Aspetti citometrici “ 90
Aspetti diagnostici “ 91
Neoplasie dei precursori T “ 91
Neoplasie dei precursori B “ 91
Leucemie acute mieloidi “ 92
Neoplasie delle cellule B mature “ 92
Neoplasie delle cellule T mature “ 92
Neoplasie delle cellule NK “ 93
Altre entità nosografiche “ 93

Le isoforme dell’antigene CD45 “ 93


Aspetti generali “ 93
Aspetti diagnostici “ 94
Neoplasie dei precursori T “ 95
Neoplasie dei precursori B “ 95
Leucemie acute mieloidi “ 95
Neoplasie delle cellule B mature “ 95
Neoplasie delle cellule T mature “ 96
Neoplasie delle cellule NK “ 96
Altre entità nosografiche “ 96

L’antigene CD56 “ 96
Aspetti generali “ 96
Aspetti citometrici “ 97
Aspetti diagnostici “ 97
Neoplasie dei precursori T e B “ 97
Leucemie acute mieloidi “ 97
Neoplasie delle cellule B mature “ 98
Neoplasie delle cellule T mature “ 98
Neoplasie delle cellule NK “ 99
Altre entità nosografiche “ 100

L’antigene CD61 “ 100


Aspetti generali “ 100
Aspetti citometrici “ 100
Aspetti diagnostici “ 101
Leucemie acute mieloidi “ 101
Altre entità nosografiche “ 101

11
L’antigene CD62L pag. 101
Aspetti generali “ 101
Aspetti citometrici “ 102
Aspetti diagnostici “ 102
Neoplasie dei precursori T e B “ 102
Neoplasie delle cellule B mature “ 102
Neoplasie delle cellule T mature “ 102
Altre entità nosografiche “ 102

L’antigene CD65 “ 103


Aspetti generali “ 103
Aspetti citometrici “ 103
Aspetti diagnostici “ 103
Neoplasie dei precursori T e B “ 103
Leucemie acute mieloidi “ 103
Neoplasie delle cellule T mature “ 104

L’antigene CD66c “ 104


Aspetti generali “ 104
Aspetti citometrici “ 104
MoAb KOR-SA3544 “ 105
Aspetti diagnostici “ 105
Neoplasie dei precursori T e B “ 105
Leucemie acute mieloidi “ 105
Altre entità nosografiche “ 105

L’antigene CD71 “ 106


Aspetti generali “ 106
Aspetti citometrici “ 106
Aspetti diagnostici “ 107
Neoplasie dei precursori T e B “ 107
Leucemie acute mieloidi “ 107
Neoplasie delle cellule B mature “ 107
Neoplasie delle cellule T mature “ 107
Altre entità nosografiche “ 107

L’antigene CD79 “ 108


Aspetti generali “ 108
Aspetti citometrici “ 108
MoAb anti catena alfa “ 108
MoAb anti catena beta “ 108
Aspetti diagnostici “ 109
Neoplasie dei precursori B “ 109
Neoplasie dei precursori T “ 109
Leucemie acute mieloidi “ 109
Neoplasie delle cellule B mature “ 109
Neoplasie delle cellule T mature “ 110
Neoplasie delle cellule NK “ 110
Altre entità nosografiche “ 110

12
L’antigene CD87 pag. 110
Aspetti generali “ 110
Aspetti citometrici “ 111
Aspetti diagnostici “ 111
Neoplasie dei precursori B “ 111
Leucemie acute mieloidi “ 111
Neoplasie delle cellule B mature “ 111

L’antigene CD103 “ 111


Aspetti generali “ 111
Aspetti citometrici “ 111
Aspetti diagnostici “ 112
Neoplasie dei precursori T “ 112
Neoplasie delle cellule B mature “ 112
Neoplasie delle cellule T mature “ 112

L’antigene CD117 “ 112


Aspetti generali “ 112
Aspetti diagnostici “ 113
Neoplasie dei precursori T e B “ 113
Leucemie acute mieloidi “ 113
Neoplasie delle cellule B mature “ 113
Neoplasie delle cellule T mature “ 114
Altre entità nosografiche “ 114

L’antigene CD138 “ 114


Aspetti generali “ 114
Aspetti diagnostici “ 114
Neoplasie delle cellule B mature “ 114
Neoplasie delle cellule T mature “ 115
Altre entità nosografiche “ 115

L’antigene HLA-DR “ 115


Aspetti generali “ 115
Aspetti diagnostici “ 116
Neoplasie dei precursori T “ 116
Neoplasie dei precursori B “ 116
Leucemie acute mieloidi “ 116
Neoplasie delle cellule B mature “ 116
Neoplasie delle cellule T mature “ 117
Neoplasie delle cellule NK “ 117

Le immunoglobuline “ 117
Aspetti generali “ 117
Aspetti citometrici “ 118
Aspetti diagnostici “ 120
Neoplasie dei precursori B “ 120
Neoplasie delle cellule B mature “ 120
Catene pesanti “ 122
Catene leggere “ 123

13
Il T cell receptor pag. 124
Aspetti generali “ 124
Aspetti citometrici “ 125
Anticorpi rivolti verso le regioni costanti “ 125
Anticorpi rivolti verso le regioni variabili “ 125
Aspetti diagnostici “ 126
Neoplasie dei precursori T “ 126
Neoplasie delle cellule T mature “ 126

La mieloperossidasi “ 127
Aspetti generali “ 127
Aspetti citometrici “ 127
Aspetti diagnostici “ 128
Neoplasie dei precursori B “ 128
Leucemie acute mieloidi “ 128
Neoplasie delle cellule B mature “ 128
Neoplasie delle cellule NK “ 129

La TdT (Transferasi deossi-nucleotidil terminale “ 129


Aspetti generali “ 129
Aspetti citometrici “ 130
Aspetti diagnostici “ 130
Neoplasie dei precursori T e B “ 130
Leucemie acute mieloidi “ 130
Neoplasie delle cellule B mature “ 131
Neoplasie delle cellule T mature “ 131
Neoplasie delle cellule NK “ 131
Altre entità nosografiche “ 131

PARTE SECONDA – LE DIVERSE ENTITÀ NOSOGRAFICHE “ 133

Introduzione “ 135

Neoplasie dei precursori B “ 139


Considerazioni generali “ 139
Rapporti tra leucemia linfoblastica e linfoma linfoblastico “ 141

Neoplasie dei precursori T “ 142


Considerazioni generali “ 142
Rapporti tra leucemia linfoblastica e linfoma linfoblastico “ 143

Leucemie acute mieloidi “ 144


Rapporti tra immunofenotipo e classificazione FAB “ 146
AML-M0 – Leucemia acuta con minimi segni di
differenziazione mieloide “ 146
AML-M1 – Leucemia acuta mieloide
senza maturazione “ 147
AML-M2 – Leucemia acuta mieloide
con maturazione “ 148
AML-M3 – Leucemia acuta promielocitica “ 149

14
AML-M4 – Leucemia acuta mielomonocitica pag. 150
AML-M5 – Leucemia acuta monocitica “ 151
AML-M6 – Leucemia acuta eritroide “ 152
AML-M7 – Leucemia acuta megacarioblastica “ 153

Leucemie bifenotipiche e leucemie ibride “ 153

L’immunofenotipo nelle neoplasie delle cellule B mature “ 155


Generalità “ 155
Dimostrazione di popolazioni clonali “ 155
Dimostrazione di fenotipi caratteristici “ 156
Casi particolari “ 159
Linfoma sequenziale e linfoma composito “ 160

Leucemia linfatica cronica a B linfociti (B-CLL) “ 161


Generalità “ 161
Immunofenotipo “ 162
B-CLL tipica “ 162
B-CLL “atipica” “ 165
B-CLL con differenziazione plasmacitoide “ 165
Sindrome di Richter “ 165

Leucemia linfatica cronica B a prolinfociti (B-PLL) “ 166


Generalità “ 166
Immunofenotipo “ 166

Linfoma linfoplasmacitico (LPL) “ 167


Generalità “ 167
Immunofenotipo “ 167

Linfomi della zona marginale (MZL, MBCL, SLVL, SMZL) “ 168


Generalità “ 168
Morfologia e immunofenotipo “ 168

Leucemia a cellule capellute (HCL) “ 170


Generalità “ 170
Morfologia e immunofenotipo “ 170
Forme varianti e forme morfologicamente simili “ 172

Gammapatia monoclonale di significato indeterminato (MGUS),


mieloma multiplo (MM), e leucemia plasmacellulare (PCL) “ 173
Generalità “ 173
Parametri fisici e immunofenotipo “ 174
Plasmacellule normali “ 174
Gammapatia monoclonale “ 175
Mieloma multiplo “ 176
Leucemia plasmacellulare “ 177

15
Linfoma follicolare (FL) pag. 177
Generalità “ 177
Morfologia e immunofenotipo “ 177
Osservazioni sul genotipo “ 179

Linfoma a cellule mantellari (MCL) “ 179


Generalità “ 179
Immunofenotipo “ 180
Osservazioni sul genotipo “ 181

Linfoma diffuso a grandi cellule (DLBCL) “ 182


Generalità “ 182
Immunofenotipo “ 182
Osservazioni sul genotipo “ 183

Linfoma di Burkitt / Leucemia a cellule di Burkitt (BL/B-ALL L3) “ 183

Le linfocitosi B policlonali “ 184


Linfocitosi policlonale persistente a B linfociti (PLBL) “ 184
Generalità “ 184
Morfologia e immunofenotipo “ 184
Linfocitosi policlonale persistente a B linfociti CD5+ “ 185

L’immunofenotipo nelle neoplasie delle cellule T e NK mature “ 186


Generalità “ 186
Dimostrazione di popolazioni clonali “ 186
Dimostrazione di fenotipi “irregolari” “ 187
Espressione irregolare di CD2 “ 187
Espressione irregolare di CD5 “ 188
Espressione irregolare di CD7 “ 188
Il fenotipo CD3+ CD4+ CD8+ “ 188
Il fenotipo CD3+ CD4- CD8- “ 189

Leucemia linfatica cronica a T linfociti (T-CLL) “ 190


Generalità “ 190

Leucemia T prolinfocitica (T-PLL) “ 191


Generalità “ 191
Immunofenotipo “ 191

Malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati (LDGL) “ 192


Generalità “ 192
Morfologia “ 193
Immunofenotipo “ 193
T-LDGL “ 193
NK-LDGL “ 195

Leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL) “ 196


Generalità “ 196
Morfologia e immunofenotipo “ 196

16
T linfoma intestinale (EATCL) pag. 197
Generalità “ 197
Morfologia e immunofenotipo “ 197

T linfoma epatosplenico (HSTCL) “ 198


Generalità “ 198
Morfologia e immunofenotipo “ 198

T linfoma sottocutaneo panniculitico (SPTCL) “ 198


Generalità “ 198
Immunofenotipo “ 199

Micosi fungoide / sindrome di Sézary (MF/SS) “ 199


Generalità “ 199
Immunofenotipo “ 200

Linfomi T periferici non altrimenti specificati (PTCLnos) “ 201


Generalità “ 201
Immunofenotipo “ 201

Linfoma T angioimmunoblastico (AITL) “ 202


Generalità “ 202
Immunofenotipo “ 202

Linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) “ 203


Generalità “ 203
Morfologia e immunofenotipo “ 203
Osservazioni sul genotipo “ 204

Malattie linfoproliferative delle cellule NK “ 204


Generalità “ 204
Neoplasie dei precursori NK “ 205
Leucemia acuta dei precursori mieloidi/NK “ 205
Linfoma blastico a cellule NK “ 206
Neoplasie delle cellule NK mature “ 206
Malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati NK “ 206
Linfomi extranodali nasali (o del tipo nasale) “ 207

PARTE TERZA – BIBLIOGRAFIA “ 209

17
18
PREFAZIONE

Questo manuale costituisce il sunto di tre lustri di attività nel campo della
diagnostica citometrica delle neoplasie ematologiche, e vuole essere un esempio di quello
che l’autore avrebbe desiderato poter consultare all’inizio della propria carriera. In questo
senso l’autore spera di aver fatto cosa utile offrendo qualche elemento di riflessione ai
colleghi che cominciano ora a dedicarsi a questa affascinante metodica analitica.
L’autore si rende conto che questo libro non sarebbe stato possibile senza l’aiuto
diretto o indiretto di tanti amici e colleghi; in questo senso, scusandosi per non poterli
citare tutti, vuole almeno ricordare il dottor Roberto Cibin e la signora Patrizia Ribaudo,
con i quali ha diviso e divide il molto angusto Laboratorio di Citometria dell’Ospedale
Civile di Venezia. L’autore intende anche ringraziare il direttore della propria Unità
Operativa, dottor Massimo Gion, dal quale, nel pur breve periodo di diretta
collaborazione, ha ricevuto un continuo e importante incoraggiamento. Ancora, l’autore
teme di avere involontariamente seminato un considerevole numero di errori, e sarà grato
ai colleghi che vorranno segnalarglieli. Infine, l’autore non può non ricordare con grande
affetto tutti gli amici e i colleghi del Gruppo Italiano di Citometria, con molti dei quali ha
contratto un debito che spera di pagare trasmettendo ai più giovani quello che crede di
aver imparato nel corso del tempo.

19
20
INTRODUZIONE

La diagnostica delle neoplasie ematologiche rappresenta uno dei più avanzati


campi di applicazione della citometria a flusso. All’operatore che vi si dedichi è richiesta
una solida esperienza generale riguardante le possibilità e i limiti della metodica, nonché
una conoscenza non superficiale delle caratteristiche clinico-biologiche delle malattie che
si accinge a studiare. A complicare la situazione contribuisce da un lato il fatto che le
conoscenze inerenti le neoplasie ematologiche sono in rapida evoluzione, dall’altro il
fatto che anche la citometria a flusso è stata recentemente sottoposta ad una rivoluzione
che ne ha modificato la filosofia operativa. Infatti negli ultimi anni la valutazione delle
percentuali di positività effettuate mediante analisi monoparametrica si è convertita in un
approccio multiparametrico, finalizzato ad esplorare in un contesto standardizzato e
riproducibile variabili complesse come i pattern di coespressione e le modalità di
distribuzione dei parametri esplorati [1]. Questa evoluzione ha velocemente obbligato il
citometrista a familiarizzarsi con il background matematico-statistico su cui riposano la
robustezza delle misure analitiche e la validità delle tecniche di analisi dei dati.
Nello studio delle neoplasie ematologiche gli sforzi del citometrista a flusso sono
fondamentalmente diretti a cogliere quattro importanti obiettivi, che sono:
1) la dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali;
2) la loro caratterizzazione, con individuazione della linea a cui appartengono e
del loro stadio di maturazione;
3) l’eventuale dimostrazione della loro clonalità;
4) l’eventuale evidenziazione di fenotipi peculiari, direttamente associabili con
una determinata entità nosografica, e/o utili per tracciare la presenza delle
cellule neoplastiche durante il follow-up successivo alla terapia o al trapianto.
Il raggiungimento di questi scopi è subordinato al rispetto di una quantità di
condizioni metodologiche puntualmente enumerate in diversi documenti di consenso
recentemente pubblicati, e a cui si rimanda per i particolari [2] [3] [4] [5] [6]. Non si
ripeterà infine mai abbastanza che è impensabile procedere a un’analisi
immunofenotipica senza il corredo di tutte le informazioni disponibili al momento della
richiesta. In particolare, dovrebbe essere sempre possibile eseguire uno striscio e una
colorazione standard del campione, e accedere a tutti i dati che permettano di tracciare
l’eventuale storia clinica del paziente.

21
22
PARTE PRIMA

I DIVERSI ANTIGENI

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24
GLI ANTIGENI CD1

ASPETTI GENERALI

Gli antigeni CD1 costituiscono un gruppo composto da almeno quattro distinte


glicoproteine, dette CD1a, CD1b, CD1c e CD1d, codificate per splicing alterno [7] da un
gruppo di geni presenti sul braccio lungo del cromosoma 1 [7] [8].
Gli antigeni CD1 pesano da 43 a 49 kD circa, appartengono alla superfamiglia
delle immunoglobuline, e hanno un ruolo nella presentazione degli antigeni lipidici e
glicolipidici [9] [10] [11] [12].
Gli antigeni CD1a, CD1b, CD1c e CD1d sono presenti sui timociti corticali CD4+
CD8+ e, a minore intensità, sugli stadi maturativi immediatamente successivi [13], e sono
stati dimostrati nel citoplasma di linfociti T maturi periferici dopo 24 ore di attivazione
con PHA [14].
Gli antigeni CD1a, CD1b e CD1c sono stati segnalati anche su di una serie di
cellule presentatrici dell’antigene, tra cui le cellule di Langerhans e alcune
sottopopolazioni di cellule dendritiche [15] [9], nonché sui monociti attivati in vivo [15] e
sui monociti trattati in vitro con GM-CSF [16]. L’antigene CD1d è stato dimostrato anche
sui monociti “resting” [17]. Mononucleati positivi per CD1a, CD11b e CD14 sono stati
segnalati nel sangue periferico di soggetti ustionati, e sono stati interpretati come
precursori delle cellule di Langerhans migranti dal midollo osseo all’epidermide [18].
Alcune molecole della famiglia CD1 sono espresse anche sui B linfociti. In
particolare l’antigene CD1d è espresso dai B linfociti nel sangue periferico e nella zona
del mantello del centro germinativo [17], mentre l’antigene CD1c è espresso:
i) da una sottopopolazione di B linfociti presenti nel sangue periferico
dell’adulto [19] [20];
ii) da circa la metà dei B linfociti splenici [19] [20];
iii) dai linfociti della zona del mantello del centro germinativo in proporzioni
variabili a seconda della letteratura dal 50% [20] alla maggioranza degli
elementi [19];
iv) dalla maggior parte delle cellule B tonsillari [21];
v) dalla maggior parte dei B linfociti del sangue cordonale (assieme a CD5,
CD23 e CD38) [22];
vi) dalla maggior parte dei B linfociti del sangue periferico dei neonati [22];
vii) dalla maggior parte dei B linfociti del sangue periferico dei soggetti
sottoposti a trapianto di midollo autologo o allogenico limitatamente al
primo anno post-trapianto [23] [20];
viii) dalla maggior parte dei B linfociti del sangue periferico di alcuni soggetti
in età infantile affetti da SCID [23].
L’antigene CD1d è stato dimostrato con metodiche di tipo citometrico sulla
membrana di T linfociti periferici attivati [17] [24], e con metodiche di tipo
immunistochimico anche nell’epitelio del piccolo e grande intestino [25] [15].

ASPETTI CITOMETRICI

L’evidenziazione delle molecole della famiglia CD1 con metodiche citometriche


è resa difficile i) dal fatto che in particolari situazioni l’antigene è evidenziabile
solamente nel citoplasma, e ii) dal fatto che in determinati casi il legame dell’anticorpo
con l’antigene di membrana risente delle condizioni sperimentali, avvenendo solamente a
temperatura ambiente, e non in campioni tenuti a +4 o a +37 C° [26]. Non va inoltre
dimenticato che le metodiche immunoistochimiche riconoscono la presenza degli

25
antigeni intracitoplasmatici, la cui evidenziazione con metodiche citometriche richiede
invece la permeabilizzazione del campione indagato. Alla luce di questi riscontri
l’interpretazione dei risultati riportati in letteratura richiede una valutazione critica delle
metodiche adottate.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T

Gli antigeni CD1 sono classicamente espressi sulle cellule delle neoplasie dei
precursori T correlati allo stadio di timocita comune [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34]
[35]. L’espressione di CD1a è stata segnalata anche in un caso di leucemia acuta T/NK le
cui cellule coesprimevano fenotipo CD2+, cyCD3+, CD4+, CD13+, CD33+, CD56+,
CD19+ e CD30+ [36].

Neoplasie dei precursori B

Gli antigeni CD1 sono stati segnalati in alcuni casi di common-ALL [37] [31].

Leucemie acute mieloidi

L’espressione di CD1a sulla superficie dei blasti delle leucemie acute mieloidi è
stata riportata in letteratura, e a seconda delle casistiche varia da isolate segnalazioni al
25% dei casi esplorati [31] [38] [39]. Secondo alcuni Autori, la sua presenza sarebbe
ristretta ai sottotipi FAB caratterizzati da una componente monocitica [40]. L’espressione
congiunta di CD1a e CD4 è stata rilevata su di un caso di AML interpretata come
leucemia delle cellule dendritiche di Langerhans [41].

Neoplasie delle cellule B mature

La presenza dell’antigene CD1a sulla superficie delle neoplasie delle cellule B


mature è stata postulata da alcuni Autori [31] ma negata da altri [19]. In particolare,
l’espressione di CD1a è stata segnalata nella HCL [42], ma è controversa nella B-CLL,
che sarebbe positiva per l’antigene secondo alcuni Autori [43] ma negativa secondo altri
[19]. L’espressione di CD1c è stata documentata sulle cellule di alcuni casi di HCL,
B-PLL e B-NHL [21], ma è controversa sulle cellule della B-CLL, che secondo alcuni
Autori esprimerebbe fenotipo CD1a+, CD1b-, CD1c+ [43], secondo altri esprimerebbe
fenotipo CD1a-, CD1b-, CD1c+ [19], e secondo altri ancora esprimerebbe CD1c
solamente su di una minoranza degli elementi [21]. Il linfoma di Burkitt risulterebbe
costantemente negativo per CD1c [19].

Neoplasie delle cellule T mature

Alcuni antigeni CD1 sono stati segnalati sulle cellule di alcuni casi di linfoma T
periferico (PTCL) [44] [37] [45] [46] [47].

26
Altre entità nosografiche

Gli antigeni CD1a, CD1b e CD1c sono espressi sulla membrana delle cellule della
istiocitosi a cellule di Langerhans (LCH) [48] [49] [50], e in un quinto circa dei casi di
crisi blastica di leucemia mieloide cronica (CML) [31].

L'ANTIGENE CD2

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD2 è una glicoproteina di 45-58 kD appartenente alla superfamiglia


delle immunoglobuline, ed è codificato da un locus presente sul braccio corto del
cromosoma 1 in posizione p13 [51] [52] [53]. L' antigene CD2 è una molecola di adesione,
e costituisce il ligando della molecola CD58 [53]. L’antigene CD2 è normalmente
espresso sui timociti, dove comincia ad apparire già dallo stadio di protimocita [54], e sui
T linfociti maturi [55], ma è presente anche sul 70-90% delle cellule NK CD3 negative
[56], nonché su di una quota di monociti periferici [57]. L’antigene CD2 è stato segnalato
su di una minoranza di cellule follicolari dendritiche [58], ed è espresso anche da una
piccola sottopopolazione di cellule B presenti nel fegato e nel midollo fetali [59] [60],
nonché da linfociti B di soggetti normali e affetti da B-CLL mantenuti in particolari
situazioni di coltura [61] [62].
Per contro è interessante osservare che nel topo l’antigene CD2 è normalmente
assente su di una piccola sottopopolazione di timociti, su di una piccola sottopopolazione
di T linfociti periferici, e sui T linfociti con TCR a catene alfa/beta doppio-negativi per
CD4 e CD8 associati alle mutazioni lpr e gld [63], mentre nel sangue periferico
dell’uomo sono state segnalate piccole popolazioni di linfociti CD3+ CD2-, caratterizzate
sia dall’espressione di TCR a catene alfa/beta [64] che dall’espressione di TCR a catene
gamma/delta [65].
L’antigene CD2 è responsabile della formazione delle rosette E tra linfociti ed
emazie di montone [66], e come tale è stato una delle prime strutture di membrana
studiate dagli immunologi e dagli emato-oncologi. Va osservato però che la sua
distribuzione non è ristretta ai T linfociti, e la positività per le rosette E non è un dato
sufficiente per l'attribuzione di una linfocitosi alla linea T linfocitaria. In questo senso
gran parte dei dati comparsi in letteratura prima della disponibilità di anticorpi
monoclonali verso antigeni T-specifici deve essere valutata criticamente; in particolare è
verosimile che una parte delle malattie linfoproliferative diagnosticate come leucemia
linfatica cronica a T linfociti (T-CLL) in funzione della capacità di formare rosette E sia
in realtà costituita da malattie linfoproliferative dei linfociti granulati CD3- CD16+
(NK-LDGL). Per quanto concerne poi la dimostrazione dell’inaspettata espressione
dell’antigene CD2 su B linfociti effettuata mediante tecniche di rosettazione con emazie
di montone, va sottolineato che in tali casi la positività per la formazione di rosette può
essere spiegata non solo con l’espressione di CD2 da parte dei B linfociti, ma anche con la
presenza di immunoglobuline di superficie specifiche per un determinante presente sulla
membrana delle emazie usate nel test; anche in questo caso i dati della letteratura devono
essere interpretati con cautela.

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di linfociti periferici con un MoAb anti CD2 dà generalmente


origine ad un istogramma monomodale suggestivo per la presenza di un numero medio di

27
siti leganti l’anticorpo pari a 24±7 E03 per cellula [67]. E'tuttavia frequente la comparsa
di istogrammi bimodali, soprattutto in situazioni in cui è presente uno stato di attivazione
linfocitaria. In questi casi la popolazione attivata esprime sulla superficie cellulare un
maggior numero di molecole di CD2 [68]. Stratificando la popolazione CD2+ in funzione
della coespressione delle isoforme ad alto e a basso peso molecolare di CD45, è stato
dimostrato che i linfociti positivi per CD45R0 esprimono più CD2 di quelli positivi per
CD45RA [69]; in particolare i linfociti CD2+ CD45RA+ esprimono CD2 in ragione di
21±4 E03 siti leganti per cellula, mentre i linfociti CD2+ CD45R0+ esprimono CD2 in
ragione di 55±9 E03 siti leganti per cellula [67]. In accordo con lo stato di attivazione
cronica caratteristico dell’infezione da Hiv-1, i linfociti dei soggetti con infezione da HIV
sembrano esprimere CD2 a intensità aumentata [70].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T

L’antigene CD2 è generalmente espresso dalle leucemie acute dei precursori T,


può mancare nelle forme più immature variamente definite “early T”, “pro/pre T”,
“T-stem cell leukemias” [71], ed è rappresentato con la stessa frequenza sia sulle forme
con TCR gamma/delta che su quelle con TCR alfa/beta [72] [73] [74]. La sua presenza sui
blasti della leucemia T linfoblastica infantile rivestirebbe un favorevole significato
prognostico, e sembrerebbe correlare con la probabilità di mantenere la remissione
completa [75].

Neoplasie dei precursori B

Per quanto concerne le leucemie dei precursori B, l’antigene CD2 è stato


segnalato in una percentuale di casi variabile dall’1 al 4% dei casi osservati [59] [76] [77].

Leucemie acute mieloidi

Per quanto concerne la presenza di CD2 sulle AML, è interessante ricordare che
l’antigene, segnalato in una percentuale variabile dal 3 al 16% dei casi globalmente
considerati [78] [79] [38] [80] [81] [82] [83] [84], è spesso presente:
i) in una percentuale di casi di AML-M2 negativa per t(8;21) [85];
ii) in un’elevata percentuale di casi di AML-M3, con particolare predilezione
per la forma variante (AML-M3v) [86] [87] [88] [89] [90] e con la
presenza del trascritto di fusione PML-RARalfa di tipo 5’ [91];
iii) nella AML-M4Eo con inversione pericentrica del cromosoma 16 [92] [93]
[90].
In 10 casi di AML CD2+ è stata dimostrata la contemporanea espressione di CD7
e di CD3 citoplasmatico, accompagnata a particolari caratteristiche, quali età avanzata,
presenza di linfoadenopatie, elevate conte periferiche di blasti, buona risposta ai
protocolli di induzione per le leucemie linfatiche, e basso tasso di remissioni complete.
Questi casi sono stati riferiti a un’ipotetica nuova entità nosografica dalle distinte
caratteristiche biologiche, provvisoriamente definita “AML con caratteristiche T
linfoidi” [79], e si sovrappongono almeno parzialmente a quelli di una casistica analoga
riportata da Ribrag [94].
La presenza di CD2 (come pure di CD4, CD7 e CD56) sui blasti di leucemia acuta
non linfocitica è stata associata ad aumentato rischio di malattia extra-midollare (sarcoma

28
granulocitico e localizzazioni cutanee, gengivali e meningee) [95], ed è collegata a cattiva
prognosi [79] [96].

Neoplasie delle cellule B mature

Esistono in letteratura sporadiche segnalazioni riguardanti la presenza di CD2 su


cellule di isolati casi di linfomi non-Hodgkin della linea B [97] [98] [99] [100], di
leucemia a cellule capellute (HCL) [101] [102] [103], di leucemia linfatica cronica
(B-CLL) [104] [105] [106], di linfoma follicolare (FL) [106], e di linfoma diffuso a
grandi cellule B (DLBCL) [106]. Dato che l’espressione di CD2 è stata segnalata sulla
superficie di B linfociti normali [62], è teoricamente possibile che i casi di B-NHL
positivi per CD2 rappresentino un’espansione clonale di B linfociti CD2+ normalmente
presenti a frequenze troppo basse per essere riconosciuti all’analisi citometrica; in tal
senso le neoplasie CD19+ CD2+ costituirebbero distinte entità nosografiche da non
assimilare genericamente alle neoplasie ematologiche di fenotipo “ibrido” [106].
Secondo alcuni Autori, l’espressione di CD2 (come pure quella di CD5 e di CD7)
sulle cellule di linfomi non Hodgkin della linea B sembrerebbe correlare con
coinvolgimento extra-nodale e con una peggiore prognosi [99], mentre secondo altri non
avrebbe particolare significato prognostico [106]. E’ stato osservato che in alcune
malattie linfoproliferative croniche B che coesprimevano CD2, il gene codificante per il
TCR si presentava in configurazione germ-line, mentre quello codificante per le catene
pesanti delle immunoglobuline si presentava riarrangiato, come peraltro atteso [97].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD2 è comunemente espresso dalle cellule dei linfomi T periferici, ma


può anche essere assente [107] [108] [109] [45] [46], in ossequio al principio che una
frequente caratteristica dei linfomi T periferici consiste nella mancata espressione degli
antigeni T-associati normalmente attesi. Un’aberrante espressione di CD2 è stata
segnalata anche sui linfociti periferici di soggetti affetti da CTCL (sindrome di Sézary e
micosi fungoide) [110].

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD2 può non essere espresso in alcuni casi di malattia


linfoproliferativa dei linfociti granulati a cellule NK (NK-LDGL) [111] [112].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD2, assente sulle mast cellule normali [113], è stato segnalato
assieme a CD25 sulla membrana delle mastcellule neoplastiche in corso di mastocitosi
sistemica o di leucemia a mastcellule [114] [115] [116] [117]. L’antigene CD2 è stato
anche segnalato sulla membrana delle cellule della istiocitosi a cellule di Langerhans
(LCH) [48] [118]. Va infine osservato che l’antigene CD2, assieme a CD4, è
generalmente espresso sulle cellule del cosiddetto “linfoma plasmacitoide a cellule T”
[119], entità nosografica un tempo considerata appartenente alla linea T sulla base
dell’espressione di CD2, ma verosimilmente costituita da elementi della serie
monocito/macrofagica [120].

29
L'ANTIGENE CD3

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD3 risulta dall’assemblaggio di più catene, costituite dalle catene


gamma, delta, ed epsilon, codificate da sequenze geniche situate sul braccio lungo del
cromosoma 11 in posizione q23 [121], nonché dalla catena zeta, codificata da un gene
situato sul braccio lungo del cromosoma 1 in posizione q22-25 [122], e clusterizzata
separatamente con il nome di CD247 [123].
I rapporti stechiometrici del complesso TCR/CD3 sono ancora speculativi.
Sembra comunque assodato che i rapporti fra le varie catene dell’antigene CD3 nei T
linfociti maturi diano origine a complessi del tipo epsilon/gamma, epsilon/delta e
zeta/zeta, [124]; il successivo assemblaggio con il dimero del TCR a catene alfa/beta o
gamma/delta produce il complesso CD3/TCR [125].
L’espressione delle catene delta ed epsilon è ristretta alle cellule T, con la sola e
importante eccezione delle cellule NK fetali ed adulte attivate, che possono contenere
catene delta ed epsilon nel citoplasma [126] [127]. Le catene gamma e zeta sono invece di
regola presenti anche sulle cellule NK [128], sia sotto forma di omodimeri che come
eterodimeri gamma/zeta [129]. Nelle cellule NK, sia la catena gamma che la catena zeta
sono associate con legame non covalente alla forma transmembrana dell’antigene CD16,
e trasducono il segnale conseguente all’avvenuto legame con il frammento
cristallizzabile delle IgG [130] [131].
L’antigene CD3 è espresso sulla superficie dei T linfociti maturi, mentre nei
precursori compare solo nel citoplasma allo stadio di protimocita, e poi anche sulla
membrana a partire dallo stadio di timocita comune [132]. L’antigene CD3 è stato anche
dimostrato con metodiche immunoistochimiche nei policariociti di Warthin-Finkeldey,
cellule multinucleate riscontrabili nelle tonsille durante la fase prodromica del morbillo
[133], e presumibilmente derivate dai T linfociti.

ASPETTI CITOMETRICI

La quasi totalità degli anticorpi monoclonali commerciali rivolti verso CD3 si


lega alla catena epsilon [134]. La marcatura di T linfociti periferici normali con un MoAb
anti CD3 epsilon genera istogrammi di positività dall' aspetto gaussiano con ridotto
coefficiente di variazione, ben distinti dal picco delle cellule negative, e con un canale di
picco indicativo della presenza di circa 57±7 E03 siti leganti per cellula [67]. Esistono
studi quantitativi che hanno messo in evidenza che il numero di molecole di CD3 epsilon
presenti sulla membrana non è eguale per tutti i linfociti, ma è particolarmente elevato per
i linfociti con TCR gamma/delta, dove raggiungerebbe i 116±15 siti leganti per cellula
[135].
Il comportamento dell’antigene CD3 sui timociti è diverso da quello presentato
dalle cellule T mature. In particolare, l’antigene CD3 è espresso debolmente sulla
maggior parte dei timociti comuni o corticali che coesprimono CD1, CD4 e CD8, mentre
invece è espresso intensamente sui timociti maturi o midollari negativi per CD1 ed
esprimenti CD4 o CD8 in modo mutuamente esclusivo [136]. E’ stata segnalata anche
una popolazione di cellule timiche coesprimenti CD4 e CD8 ed intensamente positive per
CD3, interpretate come una tardiva tappa di differenziazione tra timociti corticali e
timociti midollari [137].
Sui T linfociti alveolari l’entità di espressione di CD3 sembra ridotta rispetto a
quella presente sui T linfociti del sangue periferico, con particolare accentuazione del

30
fenomeno nelle cellule positive per CD4 [138]. Una ridotta intensità di espressione di
CD3 è stata segnalata anche sui T linfociti attivati infiltranti i polipi nasali [139].
In alcune situazioni l'
istogramma prodotto dall' anticorpo anti CD3 può apparire
bimodale. Nella maggior parte dei casi questo comportamento è da ascriversi alla
presenza di una consistente popolazione di T linfociti con TCR a catene gamma/delta, che
esprimerebbero un più elevato numero di complessi TCR/CD3 epsilon rispetto ai linfociti
con TCR alfa/beta [135]. Nella nostra esperienza il fenomeno non si presenta con i T
linfociti gamma/delta il cui TCR monta le regioni Vdelta1J1/3 riconosciute dal MoAb
deltaTCS1. In altri casi è possibile che la bimodalità dell’istogramma sia dovuta alla
presenza di una popolazione clonale di T linfociti che esprime omogeneamente l’antigene
CD3 con una densità diversa da quella dei T linfociti normali residui. Questo
comportamento è frequentemente documentato in soggetti portatori di linfomi T
periferici [140] [69].

MoAb OKT3, SK7/Leu4 e UCHT-1

Gli anticorpi OKT-3, SK7/Leu4 e UCHT-1 riconoscono le catene CD3 epsilon in


cellule transfettate con i geni codificanti per le catene epsilon e delta o per le catene
epsilon e gamma, ma non riconoscono le catene CD3 epsilon in cellule transfettate
unicamente con i geni codificanti per le catene epsilon. Questo comportamento
suggerisce il fatto che i tre anticorpi riconoscano un epitopo conformazionale della catena
epsilon dipendente dalla sua associazione con la catena delta o gamma, e non siano quindi
in grado di riconoscere le catene epsilon isolate [141]. La negatività della ricerca delle
catene epsilon citoplasmatiche eseguita con questi anticorpi non è quindi a rigore prova
sufficiente per escludere la presenza di catene epsilon isolate, e deve essere convalidata
con l’uso di un anticorpo specifico per le catene epsilon libere, come i monoclonali SP34
e APA 1/1, o come l’antisiero policlonale suscitato nel coniglio mediante
immunizzazione con un peptide della sequenza intracitoplasmatica della catena epsilon
[142]. Questa osservazione riveste una certa importanza pratica. Dato infatti che i
trascritti delle catene delta ed epsilon sono contemporaneamente presenti nelle cellule T
fin dallo stadio di protimocita [143], gli anticorpi in oggetto sono perfettamente idonei
alla dimostrazione dell’antigene CD3 citoplasmatico nelle neoplasie derivate dai T
linfociti, dove anzi si dimostrano particolarmente efficienti [144], ma è prevedibile che
non siano in grado di evidenziare le catene epsilon citoplasmatiche isolate in alcuni casi
di neoplasia delle cellule NK.

MoAb WT31

A differenza di quanto ipotizzato in origine [145], il MoAb WT31 non è specifico


per un determinante espresso sul TCR alfa/beta, ma si lega ad un epitopo
conformazionale presente sulla catena epsilon del CD3 [141], ed è quindi a tutti gli effetti
un MoAb anti CD3 [134]. L' epitopo riconosciuto è tuttavia particolarmente accessibile in
caso di contemporanea espressione di TCR alfa/beta, e ciò rende il MoAb WT31 idoneo
alla identificazione presuntiva dei linfociti a TCR alfa/beta, specie se usato in analisi
biparametrica assieme ad un secondo anticorpo rivolto verso la catena epsilon del CD3.
In questo caso infatti le interferenze steriche che si stabiliscono tra i due MoAb riducono
ulteriormente le possibilità di legame tra WT31 e la catena epsilon del complesso
CD3/TCR a catene gamma/delta, e l' anticorpo WT31 si comporta selettivamente come un
MoAb anti TCR alfa/beta, generando un istogramma comprendente nell' area dei negativi
sia le cellule non T che le cellule T con TCR gamma/delta, e caratterizzato da un picco di
positività monomodale comprendente le cellule T a TCR alfa/beta. La rimozione

31
dell'impedimento sterico ripristina la capacità di legare, anche se più debolmente, la
catena CD3 epsilon dei T linfociti con TCR gamma/delta. In un' analisi bivariata di un
campione contenente un elevato numero di T linfociti gamma/delta eseguita combinando
WT31 ed un MoAb anti TCR gamma/delta, il MoAb WT31 genera un istogramma con
due mode di positività, una di aspetto atteso relativa alle cellule T a TCR alfa/beta ed una
di valore intermedio direttamente riconducibile alla presenza delle cellule T a TCR
gamma/delta. Da un punto di vista pratico, il fatto che il MoAb WT31 subisca
impedimento sterico da parte del secondo MoAb rivolto verso la catena epsilon di CD3
consiglia di effettuare delle procedure di marcatura differenziate, incubando in un primo
momento il campione solamente con il MoAb WT31, e aggiungendo il secondo MoAb
anti CD3 epsilon solo successivamente.

MoAb T3

Il Moab T3 presenta alcune caratteristiche assolutamente peculiari. Mentre la


forma coniugata con ficoeritrina dimostra un comportamento non dissimile da quello di
altri anticorpi commerciali rivolti verso la catena epsilon del CD3, quella coniugata con
fluoresceina presenta alcune caratteristiche non prive di risvolti pratici [146]. Un'analisi
multiparametrica a tre fluorescenze eseguita combinando adeguatamente T3-FITC con
un MoAb anti CD3rivolto verso la catena epsilon (clone SK7) ed un MoAb anti TCR
gamma/delta (clone 11F2) dimostra infatti che T3-FITC non riconosce i T linfociti con
TCR gamma/delta peraltro marcati da SK7-PE. E'interessante notare come in questo
modello multiparametrico il comportamento di T3-FITC sia molto simile a quello del
MoAb WT31, che viene presentato per confronto. Il comportamento anomalo di T3-FITC
non è di facile spiegazione. Il ridotto ingombro della fluoresceina tende ad escludere
interferenze di tipo sterico, e l'
indipendenza del fenomeno dalla durata delle incubazioni
depone contro variazioni di affinità eventualmente indotte dalle procedure di
coniugazione. E'interessante osservare che, a causa di un diverso pattern di glicosilazione,
la catena delta del CD3 presente sui T linfociti con TCR gamma/delta possiede un punto
isoionico più acido rispetto alla analoga catena presente sui T linfociti con TCR alfa/beta
[147]. E'forse possibile ipotizzare che la coniugazione con FITC sia in grado di
aumentare la carica netta negativa dell' anticorpo T3, prevenendone selettivamente il
legame con la catena delta del CD3 espressa sulla superficie dei linfociti con TCR a
catene gamma/delta.

Altri anticorpi

Esiste almeno un anticorpo monoclonale capace di riconoscere la catena epsilon


in sezioni paraffinate [148], ed è disponibile un anticorpo policlonale di coniglio rivolto
contro un epitopo della porzione intracitoplasmatica della catena epsilon di CD3 [142].
Questo anticorpo è molto importante, non solo perché riconosce l’antigene in preparati
fissati in formalina e inclusi in paraffina, ma soprattutto perché evidenzia la presenza di
catene libere epsilon di CD3 in cellule che non reagiscono con SK7/Leu4 [149]. Questo
riscontro è particolarmente significativo, perché la presenza di catene epsilon libere in
assenza di reattività con SK7/Leu4 è tipica dei linfomi a cellule NK [150]. Per quanto
concerne le altre catene, sono commercialmente disponibili diversi MoAb rivolti contro
la catena zeta del CD3 [151]. I MoAb anti catena zeta riconoscono un epitopo
intracitoplasmatico, e il loro impiego deve essere associato a procedure di
permeabilizzazione delle cellule analizzate [152].

32
ASPETTI DIAGNOSTICI

L’espressione dell’antigene CD3 assume importanza strategica


nell’identificazione di una cellula linfatica. Infatti la dimostrazione di CD3 viene
considerata un “criterio maggiore” per l’attribuzione alla linea T, e riveste un’importanza
analoga all’espressione della catena alfa di CD79 e di CD22 nei riguardi della linea B e
all’espressione di MPO nei riguardi della linea mieloide. Tuttavia, allo scopo di evitare
errori, devono essere tenuti presente alcuni concetti:
i) prima di tutto va ribadito che nella caratterizzazione delle leucemie
linfatiche acute e in tutti i casi dubbi è necessario procedere alla ricerca del
CD3 sia sulla membrana che nel citoplasma (cyCD3) [144];
ii) va poi ricordato che la capacità di evidenziare l’antigene CD3 epsilon nel
citoplasma dipende dall’anticorpo usato [144]; in ragione di questa
osservazione, nella diagnostica della leucemie linfatiche devono essere
impiegati solo anticorpi sperimentati dal comportamento conosciuto;
iii) ancora, la positività per catene CD3 epsilon citoplasmatiche va
considerata con cautela, e non va immediatamente interpretata come prova
di appartenenza alla linea T, dato che catene CD3 epsilon citoplasmatiche
sono state dimostrate in linee cellulari NK [126] [153], e in linfomi della
linea NK [149] [153].

Neoplasie dei precursori T

Lo studio del CD3 è compreso nel pannello impiegato nella fenotipizzazione


delle neoplasie dei precursori T, dove è generalmente presente nel citoplasma di tutti i
sottotipi. Va ricordato che la sua espressione di membrana manca di solito nelle forme
“early T” e in una parte delle forme “T intermediate”. In una recente casistica l’antigene
CD3 di superficie risultava espresso sul 43% circa dei casi di T-ALL globalmente
considerate [154].

Neoplasie dei precursori B

L’espressione di CD3 è di regola assente nelle neoplasie dei precursori B [155]


[34].

Leucemie acute mieloidi

L’espressione di CD3 è sporadicamente segnalata nelle leucemie mieloidi acute


[156] [38] [157] [83]. In 14 casi di AML MPO+ cyCD3+ è stata dimostrata la
contemporanea espressione di CD2 e di CD7, accompagnata a particolari caratteristiche
quali età avanzata, presenza di linfoadenopatie, elevate conte periferiche di blasti, buona
risposta ai protocolli di induzione per le leucemie linfatiche, e basso tasso di remissioni
complete; questi casi sono stati riferiti a un’ipotetica nuova entità nosografica dalle
distinte caratteristiche biologiche, definita provvisoriamente “AML con caratteristiche T
linfoidi” [79] [94], e appaiono molto simili ai 6 casi di leucemia acuta con blasti di
fenotipo CD1- CD4- CD8- CD7+ MPO+ cyCD3+ descritti da altri Autori, e in alcuni casi
classificati come leucemie “mixed lineage” [158] [159]. E’ anche possibile che parte di
questi casi possa essere assimilata alla “leucemia acuta dei precursori mieloidi/NK”,
entità difficilmente distinguibile dalla AML-M0 e caratterizzata da morfologia
indifferenziata, espressione di CD7, CD33, e CD56, e talora da espressione degli antigeni
CD13, CD34, HLA-DR, cyCD3 e MPO [160] [161].

33
Neoplasie delle cellule B mature

L’espressione di CD3 è di regola assente nelle neoplasie delle cellule B mature


[162]. Sono stati comunque riportati in letteratura:
i) un caso di B-CLL che oltre agli antigeni normalmente attesi coesprimeva
CD3 e CD8 ed era caratterizzato dalla presenza di una traslocazione
t(18;22) [163];
ii) due casi di B-HCL altrimenti tipica le cui cellule reagivano con il MoAb
UCHT1 ma non con il MoAb OKT-3 [164];
iii) un caso di linfoma primitivo delle sierose (PEL) positivo alla ricerca
intracitoplasmatica di CD3 [165];
iv) una serie costituita da alcuni casi di malattia linfoproliferativa cronica B
che coesprimevano CD2 e CD3, e che a un’analisi del riarrangiamento
genico dimostravano riarrangiato solo il gene codificante per le
immunoglobuline e non quello codificante per il TCR [97].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD3 è comunemente espresso nelle neoplasie delle cellule T mature.


Tuttavia, in accordo con il fatto che una frequente caratteristica dei linfomi T periferici
consiste nella irregolare espressione degli antigeni T-associati normalmente attesi, in
diversi casi l’antigene può essere assente, o può essere espresso a un’intensità diversa da
quella attesa [107] [108] [109] [45] [46]. Generalmente l’anomalia dell’espressione di
CD3 riscontrata sulle cellule delle neoplasie delle cellule T mature consiste in una
riduzione dell’intensità, come spesso è stato riportato nella micosi fungoide (MF) e nella
sindrome di Sézary (SS) [140] [110] [166], nonché nella leucemia/linfoma a cellule T
dell’adulto (ATLL) [167] [168] [169], ma sono relativamente frequenti anche i casi
caratterizzati da un’aumentata intensità di espressione [69]. Popolazioni di T linfociti con
fenotipo CD3- cyCD3+ sono state segnalate nel sangue periferico in corso di linfoma T
angioimmunoblastico [170].

Neoplasie delle cellule NK

Il complesso CD3/TCR non è presente nelle neoplasie delle cellule NK. Tuttavia
va rilevato che la presenza di catene CD3 epsilon isolate citoplasmatiche in assenza di
CD3 di membrana costituisce un riscontro fenotipico caratteristico di queste neoplasie
[149] [153] [171]. Il fatto che in preparati immunoistochimici le cellule NK neoplastiche
reagiscano con alcuni anticorpi anti CD3 epsilon ha contribuito a far erroneamente
classificare come linfomi T periferici una parte di queste neoplasie [172]. L’espressione
di cyCD3 è stata segnalata anche in alcuni casi di “leucemia acuta dei precursori
mieloidi/NK”, entità caratterizzata da morfologia indifferenziata, espressione di CD7,
CD33, e CD56, e talora da espressione degli antigeni CD13, CD34, HLA-DR, MPO
[161].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD3 è stato segnalato sui blasti della cosiddetta “malattia


mieloproliferativa transitoria” (transient myeloproliferative disease, TMPD), che
compare in neonati con sindrome di Down [173].

34
L’ANTIGENE CD4

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD4 è una glicoproteina di 55 kD appartenente alla superfamiglia


delle immunoglobuline, ed è codificato da un locus presente sul cromosoma 12 [174]
[175]. L' antigene CD4 è una molecola transmembrana costituita da un domain
intracellulare, da un domain trans-membrana, e da quattro domain extracellulari simili a
quelli delle immunoglobuline [176]. Con i domain extracellulari più interni 3 e 4
l’antigene CD4 viene coinvolto nell’interazione con il complesso CD3/TCR, mentre con i
domain esterni amino-terminali 1 e 2 agisce da ligando per le molecole HLA di classe II
[177]. Il domain 1, il più esterno, funge anche da recettore per il virus Hiv-1 [178].
L’antigene CD4 è espresso principalmente da una sottopopolazione di T linfociti
con TCR alfa/beta, sulla cui superficie compare durante lo stadio di timocita comune
assieme all’antigene CD8. Nel corso della maturazione, i timociti CD3+, CD4+, CD8+
segregano in due popolazioni mutuamente esclusive rispettivamente di fenotipo CD3+,
CD4+, CD8-, e CD3+, CD4-, CD8+ [136] [54].
L' antigene CD4 è debolmente ma regolarmente espresso anche da cellule non
appartenenti alla filiera linfocitaria, come i precursori emopoietici [179], i precursori
eritroidi [180], i monociti [181], le cellule di Langerhans [181], i macrofagi [182], e le
cellule follicolari dendritiche [58] [183], dove però sembra selettivamente assente
l’epitopo riconosciuto dal clone OKT4D [58]. La presenza di CD4 è inducibile sui
basofili [184], ed è stata anche documentata su di una linea mielomatosa [185], nonché su
cellule B tonsillari attivate e su cellule di linee B linfoblastoidi [186]. L’antigene CD4
può infine essere espresso de novo da cloni di cellule NK infettati dall’herpes virus
umano 6 (HHV6) [187], e da T linfociti CD8bright+ attivati in corso di infezione da HIV
[188] [189] o stimolati con PHA [190]. In quest’ultimo caso l’espressione di CD4 è stata
descritta a un’intensità minore di quella evidenziabile sui T linfociti normali CD4+.

ASPETTI CITOMETRICI

La grande maggioranza degli anticorpi monoclonali commerciali rivolti verso


CD4 si lega a epitopi presenti sul domain 1 [191], che costituisce il domain più esterno
della molecola; in particolare gli anticorpi Leu3a e OKT4A riconoscono l' epitopo
coinvolto nel legame con il virus HIV-1 [192]. La distribuzione degli epitopi nella specie
umana risente di un polimorfismo geneticamente determinato, in base al quale una
percentuale di individui di colore variabile dal 4 al 20% a seconda delle casistiche [193]
[194] non esprime l’epitopo riconosciuto dal MoAb OKT4; è stata anche segnalata
l’esistenza di un soggetto apparentemente normale deficitario per l’epitopo riconosciuto
dal MoAb Leu3a [195].
La marcatura di linfociti periferici normali con un MoAb anti CD4 produce
generalmente istogrammi di positività dall' aspetto gaussiano, dotati di basso CV, con un
canale di picco indicativo della presenza di un numero di siti leganti valutabile attorno ai
50±10 E03 per cellula [67]. I timociti esprimono l’antigene a intensità minore [196], e
così anche i monociti, sui quali l’antigene CD4 è normalmente presente con densità pari a
17±5 E03 siti leganti per cellula [67]
In alcuni casi l'
antigene CD4 può essere espresso dai linfociti con densità minore
di quella attesa; questo comportamento è stato segnalato nei soggetti affetti da B-CLL
[197], nei soggetti affetti da NBS (Nijmegen Breakage Syndrome) [198], e nei soggetti
affetti da infezione da Hiv-1 in fase avanzata [199] [70]. In quest’ultimo caso la ridotta

35
espressione di CD4, peraltro non confermata da altri autori [200], sarebbe evidenziabile
usando il MoAb Leu3a ma non il MoAb OKT4 [199]. Dato che OKT4 è specifico per un
epitopo presente in un domain diverso dal domain 1 e quindi non interessato dal legame
con la proteina virale gp120, è possibile che la ridotta intensità di espressione di CD4
evidenziata con il MoAb Leu3a in corso di infezione da Hiv-1 non sia tanto ascrivibile ad
una ridotta espressione dell’antigene quanto ad un’azione di mascheramento esercitata
dalla proteina virale [192]. Per contro, sui linfociti attivati l’antigene CD4 sembra
espresso a maggiore intensità [196]. Il riconoscimento dell’antigene CD4 sulla membrana
di T linfociti precedentemente attivati con PMA per l’evidenziazione di citochine può
risultare difficile, in quanto l’esposizione allo ionoforo determina l’internalizzazione
della molecola; esiste evidenza in letteratura che, associando più di un clone nella
marcatura del campione, è possibile aumentare il rapporto segnale/rumore riportando il
valore dei conteggi a un livello molto prossimo a quello precedente la stimolazione [201].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Monitorizzazione dei protocolli chemioterapici

Lo studio dell’antigene CD4 riveste un ruolo importante anche nella


monitorizzazione degli effetti di alcuni protocolli chemioterapici. E’ noto infatti che il
trattamento con 2-Cloro-deossi-adenosina (2-CdA) induce la comparsa di profonde e
prolungate depressioni della quota di linfociti periferici CD4+ [202]. Nei pazienti trattati
con 2-CdA, il tempo medio impiegato dai linfociti CD4+ per ritornare ad un livello
normale risulta aggirarsi attorno ai 40 mesi dalla fine della terapia [203]. Un più basso
rapporto CD4/CD8 riscontrabile nel periferico di soggetti affetti da NHL può essere
dovuto all’adozione di protocolli terapeutici comprendenti questo farmaco [204].

Neoplasie dei precursori T

L’antigene CD4 è comunemente coespresso con CD8 e CD1 sui blasti di una
consistente percentuale di casi di linfoma/leucemia linfoblastica acuta della linea T, con
particolare riguardo alle forme derivate dai timociti comuni [29] [205] [34]. A differenza
da quanto avviene nelle neoplasie delle cellule T mature, nelle leucemie dei precursori T
la presenza del TCR a catene gamma/delta non esclude l’espressione di CD4 [206].

Neoplasie dei precursori B

L’espressione di CD4 è di regola assente nelle leucemie dei precursori B [207].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD4 è stato evidenziato in una percentuale di AML variabile da 24 al


53% a seconda delle casistiche [208] [38] [81] [84]. La sua espressione sarebbe indicativa
di appartenenza alla linea mieloide più di quanto non lo sia l’espressione di CD13 e CD33
considerati singolarmente [209], e sarebbe predittiva di anomalie a carico del cromosoma
11 (11q23) e dell’inversione pericentrica del cromosoma 16 [210].
Secondo alcuni Autori, l’espressione di CD4 sarebbe indipendente da un
committment in senso monocitario [208] [211], mentre secondo altri sarebbe invece
particolarmente frequente nelle forme AML-M4 e AML-M5 [38], con preferenziale
espressione nelle forme più mature [83]. In una casistica costituita da 495 casi di AML
dell'
adulto, l’antigene CD4 è stato evidenziato nel 45,9 % dei casi, e in particolare nel

36
37,4% delle AML-M1, nel 33,7% delle forme AML-M2, nel 35,4% delle forme
AML-M3, nel 65% delle forme AML-M4, nel 78,3% delle forme AML-M5, e nel 55,6%
delle forme AML-M6. La casistica comprendeva anche un caso di AML-M7, che
risultava debolmente positivo [210]. In un caso isolato di leucemia monoblastica negativa
per CD13, CD14 e CD33, l’antigene CD4 costituiva l’unico antigene espresso tra quelli
testati [212].
L’espressione di CD4 sui blasti della leucemia mieloide dimostra un’intensità
alquanto eterogenea; esiste evidenza in letteratura che i casi con elevata intensità di CD4
e bassa espressione di CD34 si distribuiscano preferenzialmente tra le forme a
committment mieloide, mentre i casi che coesprimono CD34 con elevata intensità siano
presumibilmente connessi alla trasformazione di un precursore emopoietico “alto” [210].
La presenza di CD4 sui blasti di AML è stata associata ad aumentato rischio di
malattia extra-midollare e a cattiva prognosi [95] [210]. Questo riscontro è
presumibilmente spiegabile con il fatto che la tendenza a dare localizzazioni
extramidollari è particolarmente frequente nelle leucemie della serie monocitica, che
appunto tenderebbero a esprimere CD4.

Neoplasie delle cellule B mature.

L’espressione di CD4 è di regola assente nei linfomi B periferici [99], ma può


essere riscontrata in casi sporadici [213] [106]. Esiste in letteratura la segnalazione di un
caso di linfoma splenico diffuso a grandi cellule B CD5+ caratterizzato dalla brillante
coespressione di CD4 [214]. In una casistica consistente di 68 casi di leucemia a cellule
capellute (HCL), l’antigene CD4 è stato segnalato su più del 20% degli elementi nel 12%
dei casi [202]. L’antigene CD4 è stato infine evidenziato nella maggior parte dei casi di
un sottotipo di linfoma a grandi cellule, attribuito alla linea B sulla base della restrizione
del gene codificante per le catene pesanti e della presenza di IgA citoplasmatiche
monotipiche [215].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD4 è di regola presente sulle cellule della grande maggioranza dei
casi di micosi fungoide, di sindrome di Sézary, di leucemia T a prolinfociti, di
leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto, di linfoma di Lennert, e di linfoma
angioimmunoblastico con disprotidemia [216] [217] [218] [219] [220] [221]. L’antigene
CD4 è espresso sulle cellule della maggioranza dei casi di linfoma T periferico (PTCL)
[219] [32] [69], ma è di regola assente dalla superficie dei T linfomi con TCR
gamma/delta, con un’unica eccezione riportata in letteratura [222]. L’antigene CD4 è
anche espresso dalle cellule di una minoranza di casi di linfocitosi a linfociti granulati T
“NK-simili” [223] [224] [225].
In accordo con il fatto che una frequente caratteristica dei linfomi T periferici
consiste nella irregolare espressione degli antigeni T-associati normalmente attesi, anche
l’antigene CD4 può dimostrare un’intensità di espressione diversa da quella normalmente
attesa; questa evenienza si verifica talora nei linfomi T periferici, ma è stata segnalata più
frequentemente nella micosi fungoide (MF) e nella sindrome di Sézary (SS) [226] [69].
Nel sangue periferico di soggetti affetti da sindrome ipereosinofila (HES) con o
senza iper-IgE sono state segnalate popolazioni espanse di T linfociti con fenotipo CD4+
CD3- [227]. Queste popolazioni, che presumibilmente sostengono la patogenesi del
disordine mediante iperincrezione di IL-4 e IL-5, appaiono spesso monoclonali all’analisi
dei geni codificanti per il TCR, e talora evolvono in veri e propri linfomi [227]. E’ quindi
logico ipotizzare che in una consistente percentuale di casi la sindrome ipereosinofila

37
costituisca in realtà una vera e propria sindrome paraneoplastica indotta da un T linfoma
non ancora sufficientemente cresciuto da dare direttamente notizia di sé.

Neoplasie delle cellule NK

La coespressione di CD56 e CD4 in assenza di CD3 individua un particolare


sottotipo di linfoma cutaneo suscettibile di leucemizzazione. Questo linfoma,
caratterizzato da fenotipo CD2-, CD3-, CD4+, CD8-, CD43+, TCR-, e da configurazione
germ-line dei geni codificanti sia per il TCR che per le immunoglobuline [231] [235 [236]
[1031] [233], è stato interpretato da alcuni Autori come una neoplasia dei precursori delle
cellule NK, e come tale codificato come “blastic NK-cell lymphoma” dalla
classificazione WHO delle neoplasie ematologiche [1321] [229]. Altri Autori lo
considerano invece derivante dalla trasformazione maligna delle cellule plasmacitoidi
dendritiche [237] [238], anche sulla base dell’intensa espressione di CD123 [1936].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD4 è stato evidenziato con tecniche immunoistochimiche sulla


membrana delle cellule della istiocitosi a cellule di Langerhans (LCH) [49] e su quella
delle cellule di altre istiocitosi “non di Langerhans”, tra cui lo xantogranuloma giovanile
[240].
L’espressione dell’antigene CD4 è stata dimostrata con metodiche
immunoistochimiche anche nel sarcoma a cellule follicolari dendritiche [241] e nel
cosiddetto linfoma istiocitico “vero” (THL) [242].

38
L’ANTIGENE CD5

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD5 è una glicoproteina di 67 kD, codificata da un locus presente sul
braccio lungo del cromosoma 11 [176]. E’ un antigene T-associato che appare durante la
maturazione dei T linfociti, ed è normalmente espresso fin dallo stadio successivo a
quello di protimocita, ovvero dallo stadio di pretimocita, detto anche timocita immaturo
[136] [54]. L’antigene CD5 è espresso sulla quasi totalità dei linfociti CD3+ maturi ma
non su tutti, in quanto non solo i T linfociti con TCR gamma/delta possono non esprimere
l’antigene [243] [244], ma anche il 5% circa dei T linfociti CD3+ con TCR alfa/beta non
esprime CD5 nei soggetti normali [245].
Secondo la letteratura corrente, l’antigene CD5 è espresso:
i) da una popolazione maggioritaria di B linfociti splenici fetali [246] [247];
ii) dai B linfociti del mantello del centro germinativo nel linfonodo [248];
iii) da una sottopopolazione di B linfociti circolanti [249];
iv) da una sottopopolazione di linfociti B splenici [247];
v) da circa la metà dei B linfociti intratimici [250];
vi) dalla maggior parte dei B linfociti che compaiono nel periferico dopo
trapianto di midollo autologo o allogenico [251] [20];
vii) dalla maggior parte dei B linfociti del sangue cordonale [252] e del sangue
periferico di neonati normali;
viii) dalla maggior parte dei B linfociti del sangue periferico di alcuni bambini
affetti da SCID [23].
Analisi citometriche condotte con tecniche ultrasensibili di amplificazione
enzimatica del segnale confuterebbero la corrente suddivisione dei B linfociti in cellule
CD5+ e in cellule CD5-, e deporrebbero per la coespressione dell’antigene CD5 da parte
di tutti i B linfociti. I B linfociti considerati tradizionalmente negativi per CD5 non
sarebbero veramente negativi, ma esprimerebbero l’antigene al di sotto della normale
soglia di sensibilità delle metodiche citometriche generalmente adottate [253]. Tuttavia,
alla luce del fatto che i dati attualmente disponibili in letteratura sono stati costruiti sulla
base delle metodiche citometriche standard, nel corso della presente trattazione si
continuerà a distinguere tra cellule B CD5- e cellule B CD5+.
L’antigene CD5 è stato evidenziato sulla membrana di cellule NK di alcuni
soggetti affetti da mieloma multiplo [254], e sulla membrana di una sottopopolazione di
cellule dendritiche [255].

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di linfociti periferici normali con un MoAb anti CD5 produce


istogrammi di positività dall' aspetto gaussiano, dotati di CV abbastanza ampio,
verosimilmente a causa di una certa variabilità nell' espressione dell'
antigene. Nei T
linfociti con TCR a catene alfa/beta il canale di picco è indicativo della presenza di 57±7
E03 siti leganti per cellula [67]. Il numero di molecole di CD5 è più basso nei linfociti con
TCR a catene gamma/delta, e ancora più basso nei B linfociti CD5+ CD19+ della B-CLL
[256], che lo esprimono tuttavia a intensità maggiore di quella presente sui B linfociti
CD5+ CD19+ normali [257] [258], dove è valutato attorno a un valore inferiore ai 2E03
siti leganti per cellula, [67]. I T linfociti con TCR a catene gamma/delta possono non
esprimere l’antigene [243] [244]. Sulla maggior parte dei timociti, l’antigene CD5 è
espresso con un’intensità ridotta rispetto ai linfociti periferici [136].

39
Nell'ambito di una popolazione normale caratterizzata da una ampia variabilità
nell'espressione del marcatore, eventuali popolazioni clonali sono contraddistinte da una
maggiore omogeneità nell' espressione dell' antigene. Da un punto di vista citometrico ciò
si traduce nella comparsa all' analisi monoparametrica di istogrammi dotati di coefficiente
di variazione inaspettatamente ristretto. La presenza di più popolazioni clonali
differenziabili fra di loro per il diverso grado di espressione dell'
antigene può dare origine
ad istogrammi caratterizzati dalla presenza di più componenti modali a basso CV.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Lo studio dell’antigene CD5 è particolarmente importante, in quanto permette di


quantificare i linfociti B CD5+, che sono aumentati in una serie di situazioni diverse, tra
cui la ripresa dopo BMT allogenico [251] [259].

Neoplasie dei precursori T

L’antigene CD5 è generalmente espresso dalle leucemie acute dei precursori T,


ma può mancare nelle forme più immature, dette anche “early T”, “pro/pre T”, e “T-stem
cell leukemias” [71].

Neoplasie dei precursori B

L’espressione di CD5 è di regola assente nelle leucemie dei precursori B [207].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD5 può essere sporadicamente espresso in isolati casi di leucemia


acuta mieloide [38]; in alcune casistiche l’espressione di CD5 riguarda il 5% circa dei
casi testati, ed appare prevalentemente associata con le forme AML-M5a [82] [83].

Neoplasie delle cellule B mature

La positività per l’antigene CD5 caratterizza la leucemia linfatica cronica tipica


(B-CLL) e il linfoma a cellule mantellari (MCL), che sono di regola positivi [260].
Secondo alcuni Autori - ma non secondo altri [258] - l’intensità di espressione di CD5
appare più elevata sulle cellule del linfoma a cellule mantellari (MCL) rispetto a quelle
della leucemia linfatica cronica a B linfociti (B-CLL) [261]. Non va comunque
dimenticato che è ritenuto possibile il riscontro di isolati casi di MCL e di B-CLL negativi
per CD5 [262] [263] [264], e che per converso è stata segnalata l’espressione di CD5 in
isolati casi di B-NHL tradizionalmente negativi per questo antigene, come il linfoma
splenico a linfociti villosi (SLVL) [258] [265] e i linfomi della zona marginale sia MALT
che non MALT [266] [267] [268].
La leucemia linfatica cronica a prolinfociti B (B-PLL) esprime l’antigene CD5 in
una percentuale variabile attorno al 70% dei casi [269], ma in alcune casistiche appare
costantemente negativa per questo antigene [261]; l’accuratezza di queste valutazioni può
essere influenzata dal fatto che molte casistiche accorpano ai casi di B-PLL insorta de
novo anche casi di B-PLL derivati dalla trasformazione prolinfocitoide di una B-CLL
pre-esistente.
Nei B-NHL non usualmente associati a CD5, l’espressione di questo antigene
sembrerebbe correlare con il coinvolgimento extra-nodale e con una peggiore prognosi
[99] [100]; in particolare l’espressione di CD5 sui linfomi tipo MALT parrebbe associata

40
alla tendenza alla disseminazione al midollo osseo e a varie sedi extranodali, nonché alla
leucemizzazione [266] [268].
In una casistica consistente di 68 casi di leucemia a cellule capellute (HCL),
l’antigene CD5 è stato segnalato su più del 20% degli elementi nel 10% dei casi [202]. Lo
studio dell’antigene CD5 nella leucemia a cellule capellute (HCL) permetterebbe la
caratterizzazione di un sottogruppo di casi positivi per CD5 [270], contraddistinti dalla
resistenza al trattamento con interferone alfa [271], ma sensibili alla cladribina
(2'-cloro-desossiadenosina) [272]. E’ interessante osservare che in un caso riportato in
letteratura l’espressione di CD5 era ristretta alle cellule capellute presenti nel midollo
osseo, ma assente nelle cellule capellute circolanti nel periferico [272].
Va infine ricordato che l’antigene CD5 è stato segnalato sulle cellule di alcuni casi
di linfoma di Burkitt in fase leucemica [273] [274], sulle cellule di alcuni linfomi B
diffusi a grandi cellule di primitiva origine splenica [214], sulle cellule di alcuni linfomi
B diffusi a grandi cellule intravascolari [275] [276] [277], sulle cellule di alcuni linfomi B
diffusi a grandi cellule derivati e non derivati da B-CLL [278] [279] [280] [281], e sulle
cellule della variante “floral” del linfoma follicolare [282]. L’espressione di CD5 è stata
segnalata anche sui B linfociti monoclonali presenti nel sangue periferico di soggetti
affetti da mieloma multiplo [283], e su linee continue derivate da plasmacellule
mielomatose [284].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD5 è comunemente espresso dalle cellule dei linfomi T periferici


(PTCL), ma può anche essere assente [107] [108] [109] [45] [46], in ossequio al principio
che una frequente caratteristica dei linfomi T periferici consiste nella mancata
espressione degli antigeni T-associati normalmente attesi. Un’irregolare espressione di
CD5 è stata segnalata sulle cellule della leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL)
[285], sui linfociti periferici di soggetti affetti da CTCL (sindrome di Sézary e micosi
fungoide) [110], e sulle cellule della malattia linfoproliferativa dei T linfociti granulati
(T-LDGL) [286].

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD5 non è di solito espresso né dalle cellule NK né dalle neoplasie da


esse derivate [287]. L’analisi bivariata per CD5 e CD56 è stata anzi usata per evidenziare
un particolare sottogruppo di linfomi CD5- CD56+, detti in passato “linfomi T periferici a
TCR silente” e modernamente classificati come linfomi a cellule NK [153].

Altre entità nosografiche

Una debole espressione di CD5 è stata segnalata sulle cellule di alcuni casi di
linfocitosi persistente a B linfociti (PPBL) [288].

41
L’ANTIGENE CD7

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD7 è una glicoproteina di 40 kD, codificata da un locus presente sul


cromosoma 17 [289]. Considerato un tempo un antigene T-specifico, l’antigene CD7 è
dotato di forte associazione con la linea T, ma è in realtà privo di una vera specificità di
linea. L’antigene CD7 è comunque il primo antigene T-associato ad apparire durante la
maturazione dei T linfociti, ed è normalmente espresso su protimociti, timociti immaturi
(detti anche pretimociti), timociti corticali, timociti midollari (detti anche timociti maturi),
e T linfociti maturi [136] [290] [54]. Va però tenuto presente che una piccola aliquota di T
linfociti periferici normali non esprime l’antigene CD7 [291] [292]; popolazioni di T
linfociti CD4+, CD7-, CD57+ sono spesso presenti nel sangue periferico di soggetti
sieropositivi per HIV [293].
L’antigene CD7 è presente sull’80-90% delle cellule NK CD3 negative [56], ed è
stato dimostrato anche su precursori linfoidi CD19+ in tessuto emopoietico fetale [294]
[295]. La presenza fisiologica dell’antigene CD7 su precursori della serie B è stata
confermata dal riscontro di questo antigene sul 17% dei precursori B CD19- CD79a+
TdT+ presenti nel midollo osseo normale pediatrico [296].

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di linfociti periferici con un MoAb anti CD7 dà generalmente


origine ad un istogramma caratterizzato da una distribuzione eterogenea dell’antigene, e
suggestivo per la presenza di 28±7 E03 siti leganti per cellula [67]. L’intensità di
espressione del CD7 sui linfociti maturi sembra essere inversamente proporzionale al loro
grado di competenza immunologica. Stratificando infatti la popolazione CD7+ in
funzione della coespressione delle isoforme ad alto e a basso peso molecolare di CD45, è
stato dimostrato che i T linfociti CD7+ CD45RA+ esprimono CD7 in ragione di 27±5
E03 siti leganti per cellula, mentre i T linfociti CD7+ CD45R0+ esprimono CD7 in
ragione di 14±3 E03 siti leganti per cellula [67].
Cautela deve essere osservata nell’attribuzione di CD7 ai blasti della leucemia
acuta mieloide. Vi è infatti evidenza in letteratura che le cellule HL60 si leghino in modo
aspecifico con i MoAb anti CD7 4H9 (Leu 9), OKT16 e T55, e dato che tale positività
viene completamente abolita da una preincubazione con IgG aggregate, è possibile che il
fenomeno sia causato dalla presenza di recettori per Fc di IgG, e come tale sia
riproducibile anche sui blasti delle leucemie acute mieloidi che esprimano tali recettori
[297]. E’ degno di nota osservare che tutti e tre i cloni 4H9 (Leu 9), OKT16 e T55
presentano isotipo IgG2a.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T

Lo studio del CD7 è compreso nel pannello impiegato nella fenotipizzazione delle
leucemie acute dei precursori T, dove è generalmente espresso in tutti i sottotipi [34]. La
sua regolare presenza può essere sfruttata congiuntamente all’espressione di un
parametro fisico per la definizione di un gate immunologico capace di restringere
l’analisi alle sole cellule patologiche [298].

42
Neoplasie dei precursori B

L’espressione di CD7 è di regola assente nelle leucemie dei precursori B [207].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD7 è espresso su di una percentuale di casi variabile, a seconda delle


diverse casistiche, dal 10 al 25% delle AML, con particolare predilezione per le forme
M1/M2 [299] [85] [38] [81] [300] [301] [82] [157] [84].
In 14 casi di AML positiva per CD7 è stata dimostrata la contemporanea
espressione di CD2 e di CD3 intracitoplasmatico, accompagnata a particolari
caratteristiche quali età avanzata, presenza di linfoadenopatie, elevate conte periferiche di
blasti, buona risposta ai protocolli di induzione per le leucemie linfatiche, e basso tasso di
remissioni complete; questi casi sono stati riferiti a un’ipotetica nuova entità nosografica
dalle distinte caretteristiche biologiche, definita provvisoriamente “AML con
caratteristiche T linfoidi” [79] [94], e appaiono molto simili ai 6 casi di leucemia acuta
con fenotipo CD1-, CD4-, CD8-, CD7+, MPO,+ cyCD3+ descritti da altri Autori, e
classificati operativamente come leucemie “mixed lineage” [158]. Probabilmente
correlati ai casi precedenti sono anche i 3 casi di “linfoma a stem cell CD7+” senza blasti
circolanti segnalati da Katsuno, in cui i blasti presentavano alla diagnosi fenotipo CD7+,
CD4-, CD8-, e che in un caso recidivavano con espressione di MPO e di antigeni mieloidi
[302]. Ancorché esistano opinioni contrarie [303], la presenza di CD7 (come pure di CD2,
CD4 e CD56) sui blasti di leucemia acuta non linfocitica è stata associata ad aumentato
rischio di malattia extra-midollare (sarcoma granulocitico e localizzazioni cutanee,
gengivali e meningee) [95] e a cattiva prognosi [79] [81], soprattutto nei casi
caratterizzati dalla coespressione di CD14 [300] [301]. L’espressione di CD7 sui blasti
della AML è associata ad alterazioni del cromosoma 5 [304], è correlata alla presenza del
recettore per la trombopoietina (TPO), e sembra indicare il coinvolgimento di un
predecessore particolarmente immaturo [305].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD7 è stato sporadicamente segnalato in isolati casi di malattia


linfoproliferativa cronica della serie B [306] [99] [100] [106], e in un caso di linfoma
primitivo delle sierose (PEL) [307]. Secondo alcuni Autori, l’espressione di CD7 sulle
cellule di linfomi non Hodgkin della linea B (come pure quella di CD2 e di CD5)
sembrerebbe correlare con coinvolgimento extra-nodale e con una peggiore prognosi [99],
mentre secondo altri non avrebbe particolare significato prognostico [106].

Neoplasie delle cellule T mature

Lo studio dell’antigene CD7 è molto importante nella immunofenotipizzazione


delle neoplasie delle cellule T mature. La mancata o irregolare espressione di questo
antigene è frequente nei linfomi T periferici [107] [108] [109] [45] [46], e tende a
costituire la regola nella leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL) [308], nella
micosi fungoide (MF), e nella malattia di Sézary (SS) [309] [110] [220]. Nella leucemia T
prolinfocitica (T-PLL) la sua espressione è invece costante e vivace [310], ancorché sia
noto almeno un caso di T-PLL caratterizzato dalla mancata espressione dell’antigene
[311]. Le cellule della malattia linfoproliferativa dei T linfociti granulati (T-LDGL)
possono esprimere basse intensità di CD7 [286].

43
Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD7 è presente in una quota variabile delle neoplasie delle cellule NK,
e la sua espressione sembra correlare con l’aggressività clinica [312].

Altre entità nosografiche

E’ stata proposta come entità nosografica indipendente una leucemia acuta


altamente indifferenziata caratterizzata dalla sola espressione di antigeni privi di
specificità di linea, come CD7, CD34, e HLA-DR, e da morfologia e citochimica non
conclusive [313] [314].
L’antigene CD7 è stato anche segnalato sui blasti della cosiddetta “malattia
mieloproliferativa transitoria” (TMPD), che può comparire nei neonati con sindrome di
Down [173].

L’ANTIGENE CD8

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD8 è generalmente costituito da un eterodimero composto da una


catena alfa e da una catena beta, ciascuna del peso di 32-34 kD, codificate da due distinte
sequenze geniche presenti sul cromosoma 2 [175]. Le due catene consistono ciascuna in
una molecola transmembrana contenente un domain simile a quelli delle
immunoglobuline, e assieme formano una struttura che agisce come ligando per le
molecole HLA di classe I [177].
L’antigene CD8 è espresso principalmente come eterodimero alfa/beta da una
sottopopolazione di T linfociti con TCR alfa/beta, sulla cui superficie compare durante lo
stadio di timocita comune assieme all’antigene CD4. Nel corso della maturazione i
timociti CD3+, CD4+, CD8+ segregano in due popolazioni mutuamente esclusive, la
prima di fenotipo CD3+, CD4+, CD8- e la seconda di fenotipo CD3+, CD4-, CD8+ [136]
[54].
L'antigene CD8 può essere espresso anche come omodimero alfa/alfa; in tale
forma è presente sulla superficie delle cellule T con TCR a catene gamma/delta [315]
[316] [317], sulla superficie di quelle cellule NK CD16+ che coesprimono CD8 [56] [316]
[317], e sulla superficie delle cellule di alcune sottopopolazioni di T linfociti con TCR a
catene alfa/beta [316], comprensive di quei subset di T linfociti intestinali intra-epiteliali
(IEL) caratterizzati dalla coespressione di CD4 e CD8 [318] [319]. La presenza
dell’omodimero alfa/alfa è stata messa in evidenza anche su cloni di T linfociti maturi
coesprimenti CD4 e CD8 [317].

44
ASPETTI CITOMETRICI

Gli anticorpi del commercio specifici per CD8 sono tutti rivolti verso la catena
alfa dell'eterodimero, con l' eccezione di alcuni cloni isolati, come 5F2 e 2ST8-5H7, che
riconoscono un epitopo presente sulla catena beta. L’impiego dei cloni specifici per la
catena beta è ristretto a casi particolari.
La marcatura di linfociti periferici normali con un MoAb anti CD8 alfa produce
generalmente istogrammi di positività dall' aspetto gaussiano, con un canale di picco
indicativo della presenza di 145±29 E03 siti leganti per cellula [67]. Oltre a questi
linfociti, detti anche CD8bright+, è possibile riscontrare linfociti CD8+ contraddistinti
dalla espressione di un numero di molecole di CD8 più basso e valutabile attorno a circa
39±10 E03 siti leganti per cellula [67]. Questi linfociti sono detti CD8dim+, e concorrono
a produrre una moda intermedia intercalata tra il picco dei negativi ed il normale picco dei
linfociti CD8+. I linfociti CD8dim+ montano un omodimero CD8 alfa/alfa, e
costituiscono una popolazione eterogenea dissecabile in almeno tre importanti
sottogruppi in funzione dell' espressione e del tipo di TCR.
Il primo sottogruppo, che costituisce quello di più frequente osservazione,
presenta fenotipo CD3-, TCR alfa/beta- (WT31-), TCR gamma/delta-, ed è costituito da
linfociti granulati generalmente positivi per antigeni correlati alla funzione killer naturale
[320]. In particolare questi elementi risultano solitamente positivi per CD2, CD7, CD11b,
CD16, CD38, CD45RA, CD56 e CD57, e negativi per sCD3 (catene delta ed epsilon),
CD4, CD5, CD6 e WT31, nonché per le catene del TCR sia alfa/beta che gamma/delta.
Queste cellule sono state da tempo riconosciute come cellule NK [321], e devono essere
escluse dalla determinazione del rapporto CD4/CD8 [322].
Il secondo sottogruppo, di osservazione più rara, presenta fenotipo CD3+, TCR
alfa/beta- (WT31-), TCR gamma/delta+. Rispetto ai T linfociti con TCR alfa/beta, i T
linfociti con TCR gamma/delta non esprimono l' antigene CD5 o lo esprimono a intensità
ridotta [243] [244], e sono caratterizzati da una più intensa espressione dell'antigene CD3
[135].
Il terzo sottogruppo presenta fenotipo CD3+, TCR alfa/beta+ (WT31+), TCR
gamma/delta-, ed è caratterizzato dalla inattesa coespressione dell’antigene CD4. Isolati
elementi con questo fenotipo sono comunemente riscontrabili nel sangue periferico, ma il
riscontro di popolazioni espanse costituisce un riscontro abbastanza infrequente. Questo
fenotipo è più estesamente trattato nel paragrafo “Il fenotipo CD3+ CD4+ CD8+”
compreso nella sezione “L’immunofenotipo nelle neoplasie delle cellule T mature /
Dimostrazione di fenotipi irregolari”.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T

L’antigene CD8 può essere coespresso con CD4 e CD1 sui blasti di una quota di
casi di neoplasia dei precursori T, con particolare riguardo alle forme derivate dai timociti
comuni [29] [205] [34].

Neoplasie dei precursori B

L’espressione di CD8 è di regola assente nelle leucemie dei precursori B [207].

45
Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD8 può essere sporadicamente espresso in isolati casi di leucemia


acuta mieloide [38].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD8 è stato segnalato in alcuni casi di malattia linfoproliferativa


cronica della serie B, e in particolare:
i) in isolati casi di mieloma multiplo [323].
ii) Sulle cellule di alcuni casi di B-CLL, sia in condizioni basali [324] [325]
[326] [105] [327] [328] [163] [329] [330] [331] [332] [333] [334] [106],
che dopo coltura a lungo termine [335]. Nella B-CLL l’espressione di
CD8 sembra a volte correlare con una buona prognosi [329] [331], ma in
altri casi sembra invece associata a cattiva tolleranza della terapia a base di
cladribina [334], oppure a rapida progressione [326], o a trisomia 12 [333].
Almeno in un caso l’espressione di CD8 su cellule di B-CLL è stata
documentata come dimero alfa/alfa [328]. Nel caso descritto da
Avila-Carino, le cellule della B-CLL coesprimevano anche CD3, ed erano
caratterizzate dalla presenza della traslocazione t(18;22) [163].
iii) In isolati casi di linfoma mantellare, dove pare assumere significato
prognostico negativo [336].
iv) In due casi di linfoma diffuso a grandi cellule B [337] [338].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD8 è espresso in una piccola percentuale minoritaria di casi di


micosi fungoide (MF) o sindrome di Sézary (SS) [339] [340], di leucemia T a prolinfociti
(T-PLL) [341] [342] [343] [344] [345], e di leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto
(ATLL) [285], nonché sulle cellule della maggior parte dei casi di malattia
linfoproliferativa dei linfociti granulati a cellule T (T-LDGL).
Anche nei linfomi T periferici (PTCL) i casi CD8+ costituiscono una minoranza
rispetto ai più frequenti casi positivi per l’antigene CD4 [107] [108] [346] [347] [348]
[349]; nella maggior parte dei casi i PTCL CD8+ sono positivi anche per le molecole
citotossiche, che invece tendono a essere negative nei linfomi T periferici CD4+, ad
eccezione dei linfomi CD4+ “nasal type” positivi per CD56 [350] e di alcuni casi di
linfoma di Lennert CD4+ [351].
E’ interessante osservare che in una consistente percentuale di neoplasie delle
cellule T mature caratterizzate dalla coespressione degli antigeni CD4 e CD8, l’antigene
CD8 è stato documentato come omodimero alfa/alfa [352].

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD8 è debolmente espresso sulle cellule della maggior parte dei casi
di malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati a cellule NK (NK-LDGL) [111] [112],
può essere presente sulle cellule dei linfomi a cellule NK “nasal-type” [353], ma è
generalmente assente sulle cellule delle forme derivate dagli elementi più immaturi, come
il linfoma blastico a cellule NK [354] [229].

46
L’ANTIGENE CD10

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD10 (o CALLA) è una glicoproteina di 100 kD, codificata da un


locus presente sul cromosoma 3 (3q21-q27) [355]. L’antigene CD10 compare durante la
maturazione dei B linfociti a livello di cellula pre-pre-B tardiva, e come tale è usualmente
presente su di un piccolo numero di cellule del midollo osseo normale, che prendono il
nome di ematogoni.
Questi elementi sono caratterizzati da positività per CD19, e da parametri fisici ed
espressione di CD45 ridotti rispetto a quelli dimostrati dai linfociti maturi. Mediante
analisi multiparametrica, la popolazione CD10+ midollare può essere ulteriormente
stratificata in almeno due subset diversi, il primo con fenotipo CD10 bright+, CD20±,
CD34+, CD45±-, ed il secondo con fenotipo CD10+, CD20+, CD34-, CD45± [356]. Il
fatto che la popolazione CD34+ comprenda una più elevata percentuale di elementi TdT
positivi rende verosimile l’ipotesi che i due subset rappresentino due diversi stadi
maturativi, il primo più precoce ed il secondo più tardivo.
Il numero di ematogoni normalmente presenti nel midollo osseo tende a declinare
con l’età. Ancorché i diversi studi presenti in letteratura adottino metodologie diverse e
non sempre confrontabili, si ammette che il loro numero, espresso come percentuale delle
cellule midollari mononucleate separate per gradiente di densità, oscilli da circa un terzo
nei soggetti pediatrici a circa il 5% negli adulti [357] [356] [358] [359].
Un aumento degli ematogoni è stato segnalato nei soggetti affetti da sindrome di
Schwachman-Diamond, nonché in soggetti di varia età affetti da porpora
trombocitopenica sia autoimmune sia successiva ad infezioni virali, da malattie
autoimmuni, da linfomi non-Hodgkin, da malattie virali, e da neoplasie solide [360] [361]
[362] [363] [364] [365]. Un aumento degli ematogoni è costantemente presente nel
midollo osseo iper-rigenerante dopo chemioterapia, il che nel caso della leucemia acuta
dei precursori dei B linfociti pone gravi problemi di diagnosi differenziale con la recidiva.
Il riscontro di isolate cellule CD10+ nel sangue periferico di prematuri, neonati e bambini
fino ai 2-4 anni di età è possibile, e non riveste di per sé particolare significato [366]
[367].
Scomparso al momento dell’uscita dal midollo osseo, l’antigene CD10 viene
riespresso dalle cellule B del centro germinativo [248], dove è dimostrabile anche con
tecniche immunoistochimiche [368] [369]. Definitivamente perso all’uscita dal linfonodo,
l’antigene non viene più riespresso, ed è normalmente assente sui B linfociti circolanti nel
sangue periferico dell’adulto. L’antigene CD10 si può però comportare come un antigene
di attivazione della serie B [370], e viene indotto in vitro sulle cellule B tonsillari da
simultanea co-attivazione con anticorpi anti CD40, anti CD44 e anti IgM [371].
L’espressione dell’antigene CD10 non è ristretta ai B linfociti, ma è stata
documentata anche in una piccolissima popolazione di precursori T midollari (1% circa
di tutte le cellule midollari positive per TdT) [359], nei timociti CD3-, CD3dim+ e
CD4-/CD8- [372], nonché sulle cellule T mature in apoptosi [373].
Infine, l’antigene CD10 è espresso debolmente anche sui granulociti neutrofili
[374] [375], nonché sui megacariociti e sui macrofagi midollari [376]. Analisi
immunochimiche hanno dimostrato una sostanziale identità tra l’antigene CD10 espresso
dai polimorfonucleati e l’antigene CD10 espresso dai blasti leucemici, fatte salve piccole
differenze imputabili a modifiche post-traslazionali [377].

ASPETTI CITOMETRICI

47
La distinzione tra ematogoni e precursori B leucemici costituisce un problema
particolarmente spinoso, che può tuttavia essere risolto mediante un’analisi
multiparametrica e quantitativa, sfruttando il fatto che gli ematogoni presentano un
fenotipo prevedibile e ripetibile, mentre i blasti leucemici esprimono spesso fenotipo
aberranti [378] [379], talora caratterizzati da espressione di CD10 particolarmente intensa
[380]. Un altro difficile problema consiste nella distinzione tra iperplasia follicolare
reattiva (RFH, reactive follicular hyperplasia) e linfoma follicolare (FL) in sospensioni di
cellule provenienti da linfonodo. Anche in questo caso la valutazione quantitativa
dell’espressione di CD10 permette di porre diagnosi differenziale, in quanto
nell’iperplasia follicolare reattiva la popolazione CD10 positiva esprime l’antigene con
un’intensità costantemente e caratteristicamente più bassa di quella riscontrabile negli
elementi del linfoma follicolare [381] [369]. Questa diagnosi differenziale si può peraltro
giovare anche della valutazione contemporanea di CD20 e di bcl-2 intracitoplasmatico
[382], eventualmente associata alla dimostrazione della restrizione per una delle catene
leggere.
La dimostrazione dell’antigene CD10 risente della scelta del MoAb e del
fluorocromo adottati nell’analisi [383]. I monoclonali Nu-N1, Nu-N2, and VIL-A1
sembrerebbero particolarmente specifici per le cellule della Common-ALL, mentre
invece J5 e OKB-CALLA riconoscerebbero agevolmente anche cellule di malattie
linfoproliferative croniche [384]. Secondo altri Autori, l’evidenziazione dell’antigene
CD10 nel linfoma follicolare sembrerebbe condizionata all’impiego del MoAb HI10a
[385]. L’espressione di CD10 riconosciuta da HI10a sembrerebbe selettivamente
associata alla presenza del riarrangiamento bcl-2/JH, tanto da risultare positiva non solo
nei casi di linfoma follicolare, ma anche nei casi di linfoma diffuso a grandi cellule con
traslocazione t(14;18) [385].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T

L’antigene CD10 è espresso sugli elementi di una percentuale di casi di


leucemia/linfoma T linfoblastico variabile a seconda delle casistiche dal 20 al 60% dei
casi [29] [386] [387] [388] [389] [390], con particolare predilezione - secondo alcuni
Autori [391], ma non secondo altri [392] – per le forme più immature. La presenza di
CD10 non sembrerebbe rivestire predittività prognostica [387] [389], ancorché alcuni
Autori la associno a un significato prognostico favorevole sia nel bambino [386] che
nell’adulto [388].

Neoplasie dei precursori B

L’antigene CD10 è presente nell’80% circa delle leucemie dei precursori B [393],
ed è espresso per definizione sugli elementi della leucemia linfoblastica “common”, sui
quali è generalmente presente con un’intensità di espressione più elevata rispetto alle
cellule midollari normali [394]. L’intensità di espressione di CD10 costituisce un
parametro dotato di importanza pratica. Vi è infatti evidenza in letteratura che i diversi
livelli di espressione dell’antigene CD10 siano associati a specifiche alterazioni
cromosomiche; in particolare livelli di CD10 maggiori di 3E4 antigeni per cellula
sarebbero predittivi di corredi iperdiploidi e della traslocazione t(12;21) [380] [395],
livelli bassi (tra 1.8 e 4E3) sarebbero predittivi della traslocazione t(1;19) [380], e livelli
non evidenziabili sarebbero correlati alla forma con traslocazione t(4;11) [380]. La

48
presenza di CD10 sulle neoplasie dei precursori B non sembra comunque rivestire
significato prognostico [389].

Leucemie acute mieloidi.

L’antigene CD10 è stato evidenziato in isolati casi di leucemia mieloide acuta [38]
[396]; secondo altre casistiche l’antigene sarebbe presente dal 3 al 10% dei casi testati [80]
[81] [83] [84].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD10 è presente sulla maggior parte delle cellule di una consistente
percentuale di casi di linfoma follicolare (FL) [393] [28] [397]; i linfomi follicolari di
grado più avanzato e i loro infiltrati interfollicolari tendono a esprimere l’antigene
debolmente o a non esprimerlo affatto [398]. Questo comportamento biologico,
unitamente alle peculiarità dei MoAb anti CD10 citate nei paragrafi precedenti, rende
probabilmente ragione del fatto che una quota consistente delle linfocitosi prodotte dalla
leucemizzazione di un linfoma follicolare risulta negativa per CD10 all’analisi
citometrica.
L’antigene CD10 è presente anche sugli elementi di alcuni linfomi mantellari ad
aspetto blastico (BVMCL) [399] [400], ed è stato segnalato in un isolato caso di leucemia
B prolinfocitica (B-PLL) [401], forse reinterpretabile come linfoma mantellare alla luce
del fatto che alcuni casi di malattia linfoproliferativa a morfologia “prolinfocitica” sono
stati successivamente classificati come varianti prolinfocitoidi di linfoma mantellare
[402].
L’antigene CD10 è spesso segnalato sulle plasmacellule neoplastiche di alcuni
casi di mieloma multiplo (MM) [403] [404], dove secondo alcuni Autori sarebbe
associato a un comportamento clinico particolarmente aggressivo [403]. In una casistica
composta da 26 casi di leucemia plasmacellulare e 664 casi di mieloma multiplo, il 6%
circa dei casi di mieloma multiplo e il 6% circa dei casi di leucemia plasmacellulare
coesprimevano CD10 [405].
L’antigene CD10 è stato segnalato anche sulle cellule della maggior parte dei casi
di linfoma di Burkitt [393] (BL) [406], in una minoranza di casi di leucemia a cellule
capellute (HCL) [270] [202] [407], di HCL variante (HCLv) [408], e di HCL variante
giapponese (HCL-J) [409] [410], nonché in una consistente percentuale di linfomi diffusi
a grandi cellule B (DLBCL) [381], dove sembra associato alla variante morfologica
centroblastica [385] e alla presenza della traslocazione t(14;18) [411]. Secondo alcuni
Autori, l’espressione di CD10 nel DLBCL assume significato prognostico positivo [412],
mentre secondo altri assumerebbe significato opposto [413], soprattutto nei casi
caratterizzati da positività per bcl-2 [414]. Sui linfomi marginali l’espressione di CD10 è
variabile, e spazia da una percentuale dell’1,5% riscontrata in una casistica di 124 linfomi
marginali non MALT (tra cui 59 casi di linfoma splenico) [267], a una percentuale di
circa un terzo, rilevata in una casistica selettivamente composta da 100 linfomi splenici a
linfociti villosi (SLVL) [415].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD10 è stata sporadicamente segnalata in alcuni casi di linfoma


T periferico caratterizzati da pattern di crescita di tipo follicolare [416], ed è stata
dimostrata sulle cellule della maggior parte dei casi di linfoma T angioimmunoblastico

49
(AITL) [417]. Esiste un’isolata segnalazione riguardante l’espressione di CD10 da parte
delle cellule di un linfoma cutaneo (CTCL) “inclassificabile” a cellule CD8+ [418].

Neoplasie delle cellule NK

L’espressione di CD10 è di regola assente nelle neoplasie delle cellule NK [419].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD10 è stato segnalato sulle cellule della crisi blastica della leucemia
mieloide cronica (30-50% dei casi) [393], ed è dimostrabile con metodiche
immunoistochimiche in una quota di tumori mesenchimali [420]. La percentuale di
granulociti midollari positivi per CD10 sembra ridotta nelle sindromi mielodisplastiche
[421].

L’ANTIGENE CD11a

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD11a è una glicoproteina di 180 kD, codificata da un locus presente


sul cromosoma 16 [422], che costituisce la catena alfa dell’eterodimero LFA-1
(CD11a/CD18), espresso su tutti i leucociti maturi [423].
Il dimero CD11a/CD18, noto anche come integrina alfaLbeta2, costituisce il
ligando delle molecole di adesione ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) e ICAM-3
(CD50). L’antigene CD11a è normalmente espresso su BFU, CFU, GM-CFU e M-CFU,
sui precursori della serie mieloide, sui linfociti, sui monociti e sui granulociti periferici,
basofili compresi [423] [424]; la sua intensità di espressione varia a seconda del tipo
cellulare considerato, dello stadio maturativo, e dello stato di competenza immunologica
[423].

ASPETTI CITOMETRICI

Un report apparso in letteratura quantifica la densità di espressione di CD11a sui


diversi tipi cellulari, attribuendo 58±16 E03 siti leganti ai monociti, 24±5 E03 ai
granulociti neutrofili, e 33±13 E03 ai linfociti [67]. Per quanto concerne i linfociti, la
marcatura di T linfociti periferici con un MoAb anti CD11a dà generalmente origine ad
un istogramma bimodale, suggestivo per la presenza di due distinte popolazioni cellulari,
la prima esprimente CD11a a bassa densità e detta CD11a dim+, e la seconda esprimente
CD11a ad alta densità e detta CD11a bright+. L’intensità di espressione di CD11a sembra
correlata al grado di competenza immunologica del linfocita. Questo comportamento è
condiviso anche dalle molecole CD2, CD18, CD29 e CD44 [68], e giustifica sia il fatto
che il numero dei linfociti CD11a bright+ aumenta con l’età, passando dall’assenza
virtuale evidenziabile nel sangue cordonale ai massimi valori presenti nel centenario
[425], sia il fatto che il numero dei linfociti CD11a bright+ aumenta nel corso di sindromi
caratterizzate da costante attivazione linfocitaria, come ad esempio l’infezione da Hiv-1
[426]. Le cellule NK esprimono CD11a con valori paragonabili a quelli della popolazione
bright, mentre i B linfociti lo esprimono con intensità inferiore a quella della popolazione
dim.

50
Non tutti gli anticorpi anti CD11a si comportano in modo equivalente; ad esempio
il MoAb S6F1 riconosce un epitopo presente solo sul dimero CD11a/CD18 espresso sui T
linfociti attivati [427].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T e B

L’antigene CD11a è espresso sui blasti di circa il 60% delle leucemie dei
precursori T e B [429].

Leucemie acute mieloidi.

Una bassa espressione di CD11a è stata segnalata sui blasti di AML in generale
[430] e sui promielociti della AML-M3 in particolare [431], che secondo alcuni Autori
non esprimerebbero addirittura l’antigene [432]. Un’elevata espressione di CD11a
costituirebbe cattivo fattore prognostico [431].

Neoplasie delle cellule B mature

Le cellule della leucemia a cellule capellute (HCL) appaiono generalmente


negative per CD11a [433] [434] [435] [436] [437]. Anche le cellule del linfoma di Burkitt
(BL) sono negative per CD11a [438] [439], ma lo esprimono dopo attivazione con PMA
[438]. Nel caso del linfoma di Burkitt il difetto sembra consistere nell’assenza del
trascritto della subunità beta [438]; dato che la catena beta è necessaria per l’espressione
di tutti i dimeri alfa/beta, è logico che le cellule del linfoma di Burkitt non esprimano
nemmeno CD11b o CD11c [440].
Esiste un report che postula una ridotta espressione di CD11a e CD18 sulle cellule
della B-CLL, ma è basato su studi di tipo immunoistochimico e non citometrico [441]. Vi
è comunque evidenza che l’eterodimero CD11a/CD18, analogamente ad altre molecole
di adesione, sia espresso in modo ridotto sulle cellule della B-CLL caratterizzata da
delezione del braccio lungo del cromosoma 11 [442], mentre sarebbe espresso in modo
aumentato sulle cellule della B-CLL caratterizzata da trisomia 12 [443].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD11a è stato evidenziato con tecniche immunoistochimiche sulla


membrana delle cellule della istiocitosi a cellule di Langerhans (LCH) [48] [49] [118].

51
L’ANTIGENE CD11b

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD11b è una glicoproteina di 170 kD, codificata da un locus presente
sul cromosoma 16 [422], che costituisce la catena alfa dell’eterodimero Mac1
(CD11b/CD18). Il dimero CD11b/CD18, noto anche come integrina alfaMbeta2,
costituisce il ligando di C3bi [444] [445], del fattore X [446] e del fibrinogeno [447], ed è
principalmente espresso sugli elementi della serie mieloide, eosinofili e basofili compresi
[448] [424]. La sua espressione è più ristretta rispetto a quella del dimero CD11a/CD18, è
assente sui precursori mieloidi più immaturi, e durante la maturazione compare prima di
CD16 dopo lo stadio di promielocita [449]. Per quanto concerne invece la linea
monocitica, l’antigene CD11b compare non prima dello stadio di monoblasto [423].
Il dimero CD11b/CD18 è presente anche sull’80% dei linfociti NK [56], [450],
sui B linfociti dopo stimolazione con PWM [283], e su alcuni subset di T linfociti. In
particolare l’antigene è espresso:
i) su di un subset di T linfociti CD8+ [450] contenenti perforina [451], a cui
è stata attribuita attività di tipo soppressorio sulla risposta proliferativa
delle cellule T [452] e sulla differenziazione delle cellule B [453];
ii) su di un subset di T linfociti CD4+ [450] caratterizzati da morfologia
granulare [454], nonché sulle espansioni monoclonali che da essi traggono
origine [455];
iii) sui T linfociti con TCR a catene gamma/delta [450].
L’espressione dell’antigene CD11b sui neutrofili e sui monociti viene up-regolata
dal PMA, ed è considerata un indicatore dello stato di attivazione leucocitaria [456]
[457].

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di linfociti periferici normali con un MoAb anti CD11b produce


istogrammi di positività con canale di picco indicativo della presenza di 12±6 E03 siti
leganti per cellula [67]. L’antigene è espresso più intensamente sui polimorfonucleati e
sui monociti, dove è rispettivamente presente nella misura di 45±20 E03 e 52±18 E03 siti
leganti [67].
La dimostrazione citometrica della presenza di CD11b è alquanto delicata. Nella
sua determinazione vanno tenuti a mente alcuni punti, fra cui:
i) il fatto che una prolungata fissazione in paraformaldeide ne diminuisce
l’espressione [458];
ii) il fatto che gli anticoagulanti che legano i cationi bivalenti sono in grado di
alterare un epitopo conformazionale, e inducono la mancata o la ridotta
rilevazione della molecola da parte dei MoAb specifici per quell’epitopo.
Analogamente a CD13, CD16, e CD32, la valutazione di CD11b sui
polimorfonucleati risente drasticamente delle condizioni pre-analitiche [461], in quanto
CD11b viene prontamente up-regolato dall’attivazione indotta da procedure come la
sedimentazione su gradiente di destrano, o il semplice raffreddamento seguito da
riscaldamento.

52
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T e B.

L’antigene CD11b può essere espresso sui blasti di una considerevole percentuale
di casi di leucemie dei precursori T e B [462], ma la sua espressione non sembra dotata di
significato prognostico [463]. In una casistica costituita da 48 T-ALL l’espressione di
CD11b sarebbe stata dimostrata in circa il 47% dei casi, e correlerebbe con l’assenza di
CD3 [464].
L’espressione di CD11b è stata segnalata, congiuntamente all’espressione di
CD16, in un caso di T-ALL con TCR gamma/delta insorta in un soggetto affetto da
sindrome mielodisplastica [465].

Leucemie acute mieloidi.

Lo studio di CD11b è indicato nella immunofenotipizzazione delle leucemie acute,


dove sostiene il ruolo di marcatore di appartenenza alla serie mieloide. Va ricordato a
questo proposito che l’espressione di CD11b, congiuntamente a quella di CD11c, CD14 e
CD64, è particolarmente frequente ed intensa sulle forme FAB M4 e M5, mentre tende a
essere negativa sulle forme FAB M3 [466], M6 e M7 [467] [468] [469] [470]. La capacità
di discriminare tra forme monocitiche (M4 e M5) e forme non monocitiche (M2) è
comunque maggiore per CD14, con CD11c e CD11b in ordine rispettivamente
decrescente [471]. Secondo alcuni Autori, l’espressione di CD11b sarebbe associata con
una maggiore durata della remissione completa e con una sopravvivenza più lunga [472],
mentre secondo altri costituirebbe invece un fattore prognostico negativo, capace di
identificare un sottogruppo di pazienti caratterizzato da una remissione completa di
durata più breve [473] [474] [475]. Questo significato sfavorevole è presumibilmente
giustificato dalla sua associazione con le forme AML-M4 e AML-M5 dotate di cattiva
prognosi, in quanto il 41 % delle AML CD11b+ è diagnosticabile come AML-M4 o
AML-M5 in base ai criteri FAB [476]. Lo studio di CD11b eseguito congiuntamente a
quello di CD34 o CD117, antigeni normalmente espressi da cellule in stadi più immaturi,
può essere utile nella evidenziazione di asincronismi maturativi, e può avere un ruolo
nella evidenziazione della malattia minima residua [477].

Neoplasie delle cellule B mature

L’espressione di CD11b, come pure di altri marcatori della linea mieloide (CD11c,
CD13, CD14, CD15 e CD33), è stata segnalata nella B-CLL [478] [479] [480], e sembra
associata, come anche quella di CD13 e CD33, ad una prognosi peggiore e ad un pattern
diffuso di infiltrazione midollare [478] [481] [479]. E’ noto un caso di B-NHL positivo
per CD11b, CD14 e CD36 evoluto in leucemia acuta monocitica [482].
L’espressione di CD11b è stata segnalata anche in alcuni casi di B-PLL [483]
[484], nonché sui B linfociti monoclonali presenti nel sangue periferico di soggetti affetti
da mieloma multiplo. In questi ultimi casi l’antigene veniva rilevato mediante il MoAb
7E3, e i B linfociti CD11b+ dimostravano restrizione per una catena leggera e fenotipo
CD19+, CD20+, PCA-1+, CD45R0+ [283].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD11b è spesso espresso dalle cellule della malattia linfoproliferativa


dei linfociti granulati a cellule T (T-LDGL) [34] [485].

53
Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD11b è generalmente espresso dalle cellule della malattia


linfoproliferativa dei linfociti granulati a cellule NK (NK-LDGL) [111] [34] [485].

Altre entità nosografiche

Un altro campo di applicazione dello studio dell’antigene CD11b è costituito dalle


sindromi mielodisplastiche (MDS). Questa patologia richiede un approccio analitico
particolare, in quanto è necessario studiare non solo la quota di blasti eventualmente
presente ma anche il comparto maturante. Un deficit di CD11b sul comparto maturante
midollare di questi soggetti costituirebbe un importante fattore prognostico sfavorevole
[486] [487].
L’antigene CD11b è espresso dalle cellule della crisi blastica della CML [467], ed
è stato evidenziato con tecniche immunoistochimiche anche sulla membrana delle cellule
della istiocitosi a cellule di Langerhans (LCH) [48] [49] [118].

L’ANTIGENE CD11c

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD11c è una glicoproteina di 150 kD, codificata da un locus presente
sul cromosoma 16 [422], che costituisce la catena alfa dell’eterodimero p150,95
(CD11c/CD18) [488]. Il dimero CD11c/CD18, noto anche come integrina alfaXbeta2,
costituisce il ligando del fibrinogeno [489], ed è principalmente espresso sugli elementi
della serie mieloide, basofili compresi [424], e a maggior intensità su quelli della serie
monocitaria. Come nel caso di CD11b/CD18, la sua espressione è più ristretta rispetto a
quella del dimero CD11a/CD18; esso è assente sui precursori più immaturi, e compare
non prima dello stadio di mielocita e di monoblasto [467] [423].
Il dimero CD11c/CD18 è presente anche su una percentuale di linfociti NK
variabile dal 30 al 60% [56], su alcuni subset di T linfociti, su alcuni subset di B linfociti
[423], e sulle cellule dendritiche [183], nonché sugli istiociti dei seni, sulle cellule di
Kupffer, sui macrofagi alveolari [490], e sulle cellule della microglia [491].
Sui T linfociti l’antigene CD11c si comporta come un antigene di attivazione, in
quanto appare sul 60% dei linfociti CD8+ e sul 25% dei linfociti CD4+ dopo stimolazione
con PHA [492]; la sua comparsa inizia 96-120 ore circa dopo la stimolazione [493].

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di un campione di sangue periferico normale con un MoAb anti


CD11c produce istogrammi di positività indicativi della presenza di 21±7 E03 siti leganti
per i monociti, e di 11±6 E03 siti leganti per i polimorfonucleati [67].
La capacità di evidenziare CD11c dipende verosimilmente dal particolare
anticorpo monoclonale usato. In una serie di soggetti affetti da B-CLL, i B linfociti
reagivano con i MoAb LeuM5 e IOM-11c rispettivamente nel 10% e nel 70% dei casi
[494].

54
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

L’espressione dell’antigene CD11c è generalmente assente nelle neoplasie dei


precursori T. E’ stato però recentemente segnalato un caso di T-ALL, caratterizzato da
morfologia “hairy” e accompagnato da gammapatia monoclonale, in cui le cellule
patologiche esprimevano CD11c [495].

Leucemie acute mieloidi.

La presenza dell’antigene CD11c è ampiamente segnalata sui blasti delle


leucemie acute mieloidi. Generalmente assente o debole nella AML-M3 [431],
l’espressione dell’antigene CD11c è preferenzialmente ma non esclusivamente associata
alle forme AML-M4 e AML-M5 congiuntamente all’espressione di CD11b e CD14, e
tende a essere negativa nelle forme FAB AML-M6 e AML-M7 [467] [468] [469] [470].
La capacità di discriminare tra forme monocitiche (M4 e M5) e forme non monocitiche
(M2) è maggiore per CD14, con CD11c e CD11b in ordine rispettivamente decrescente.
Una espressione di CD11c particolarmente intensa sembra correlare fortemente con
l’appartenenza alla linea monocitaria [471]. Lo studio di CD11c eseguito congiuntamente
a quello di CD34 o CD117 può essere utile nella evidenziazione di asincronismi
maturativi.

Neoplasie delle cellule B mature

L’analisi dell’antigene CD11c è molto importante nella diagnostica delle


sindromi linfoproliferative croniche della serie B. L’espressione di CD11c permette di
stratificare la B-CLL in due gruppi, il primo CD11c negativo, ed il secondo CD11c
positivo [496] [478] [497]. Secondo alcuni Autori l’espressione di CD11c nella B-CLL
non rivestirebbe significato prognostico [479] [498], ma secondo altri rivestirebbe invece
significato prognostico negativo [478]. L’espressione di CD11c è tipica della leucemia a
cellule capellute (HCL) [490] [499] e di altre sindromi linfoproliferative croniche ad essa
morfologicamente correlate, come il linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL) [415] e la
leucemia a cellule capellute variante (HCLv) [500]. Anche la leucemia B prolinfocitica
(B-PLL) esprimerebbe sistematicamente l’antigene [497]. L’espressione di CD11c, come
pure quella di altri marcatori della linea mieloide (CD13, CD14 e CD15), è stata segnalata
sulle plasmacellule mielomatose [501].
L’entità di espressione di CD11c è alquanto variabile, ed è particolarmente
brillante sia sui linfociti della leucemia a cellule capellute (HCL) che su quelli della
leucemia a prolinfociti (B-PLL), mentre su quelli della B-CLL CD11c+ e del linfoma
splenico a linfociti villosi (SLVL) sarebbe generalmente meno intensa [497].

55
Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD11c è espresso dalle cellule delle sindromi linfoproliferative


croniche della serie T in circa un quarto dei casi, con particolare preferenza per le forme a
fenotipo CD4- CD8+ [492] [502].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD11c è espresso dalle cellule della crisi blastica della CML [467], ed
è stato evidenziato con tecniche immunoistochimiche anche nella istiocitosi a cellule di
Langerhans (LCH) [48] e nel cosiddetto linfoma istiocitico “vero” (THL) [242].

L’ANTIGENE CD13

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD13 è una glicoproteina di circa 150 kD, codificata da un locus


presente sul cromosoma 15 [503], e dotata di attività aminopeptidasica [504]. Esso è
normalmente espresso sugli elementi maturi e immaturi delle linee monocitica e mieloide
[505], basofili compresi [184] [424], ed è presente anche sulle cellule dendritiche [506] e
sulle cellule staminali emopoietiche CD34+ “committed” in senso mieloide, nonché in
numerosi tessuti non emopoietici [504], come ad esempio le cellule basali
dell’epidermide [507].
L’antigene CD13 compare sui precursori mieloidi CD34+ prima dell’espressione
di CD33, sicché la presenza di una popolazione CD13+ CD33- CD34+ è normalmente
rilevabile nel sangue cordonale e nel sangue midollare. La preferenziale coespressione di
CD90, CD117 e CD133 depone per l’elevata immaturità delle cellule componenti questo
subset di progenitori mieloidi [508].
L’antigene CD13 è stato dimostrato sulla superficie di precursori CD19+ presenti
nel midollo osseo e nel fegato fetali [60] e, talora congiuntamente a CD33, su diverse
linee cellulari ottenute da leucemie acute dei B precursori [509].

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di un campione di sangue periferico normale con un MoAb anti


CD13 produce istogrammi di positività indicativi della presenza di 21±8 E03 siti leganti
per i monociti, e di 17±6 E03 siti leganti per i polimorfonucleati [67].
Nei precursori emopoietici della serie mieloide, l’antigene CD13 appare prima nel
citoplasma, e solo successivamente viene espresso sulla superficie, analogamente a
quanto accade nella serie linfatica per le molecole CD3 e CD22 [510] [511]. Può quindi
essere importante, nei casi dubbi, procedere a una ricerca intracitoplasmatica
dell’antigene mediante permeabilizzazione delle cellule contenute nel campione.
Va anche sottolineato che non tutti gli anticorpi anti CD13 si comportano nello
stesso modo, ma che esiste una notevole disparità nel comportamento dei diversi cloni e
delle diverse coniugazioni con i vari fluorocromi [512].

56
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

L’antigene CD13 è espresso o inducibile sui linfoblasti di una notevole


percentuale di casi di T-ALL [513] [392] [514], con particolare predilezione per i casi con
fenotipo CD7+ CD5- CD2- e CD7+ CD5+ CD2- [515].
In una casistica costituita da 48 T-ALL, l’espressione di CD13 sarebbe stata
dimostrata in circa il 38% dei casi, e correlerebbe con l’assenza di CD3 di superficie
[464].
L’espressione di CD13, come pure quella di altri antigeni mieloidi, non sembra
rivestire particolare significato prognostico, né nelle forme dell’adulto [516], né nelle
forme pediatriche [517 ] [463] [514]; in queste ultime l’espressione di CD13 appare
associata a specifiche anomalie genetiche, come ad esempio il riarrangiamento dei geni
ETV6 o MLL [517].

Leucemie dei precursori B

L’antigene CD13 è stato segnalato in una rilevante percentuale di casi di leucemia


dei precursori B sia nell’adulto [518] [516] [514] che nel bambino [519], dove però non
sembra possedere significato prognostico [516] [519] [517] [463] [514]. Questo assunto
non è universalmente condiviso, in quanto secondo alcuni Autori l’espressione di CD13
sarebbe dotata di significato prognostico negativo sia nell’adulto [520] che nel bambino
[521].
L’espressione di CD13, se associata ad assente o ridotta espressione di CD20,
sembra predittiva per la presenza della traslocazione t(12;21) [522], oppure, se associata a
positività per CD10 e CD34 e bassa espressione di CD38, per la traslocazione t(9;22)
[523]. Secondo altri Autori, l’espressione di CD13 sarebbe presente in circa il 40% dei
casi di B-ALL dell’adulto con fenotipo CD10+ CD20-, ma senza correlazione con la
presenza delle traslocazioni t(4;11) o t(9;22) [464].
Nella leucemia dei precursori delle cellule B del bambino l’espressione di antigeni
mieloidi sembra associata al riarrangiamento dei geni ETV6 o MLL [517], mentre in
quella dell’adulto parrebbe piuttosto associata alla monosomia del cromosoma 7 o alla
traslocazione t(9;22) [480].

Leucemie acute mieloidi

Insieme a CD33, CD65, CD117 e mieloperossidasi, l’antigene CD13 concorre a


costituire una rosa di marcatori il cui studio riveste grandissima importanza nella
diagnostica immunologica delle leucemie acute. Esiste infatti una convenzione formulata
dal Gruppo Europeo per la Caratterizzazione Immunologica delle Leucemie (EGIL),
secondo la quale l’espressione di due di questi marcatori rappresenta requisito sufficiente
per l’attribuzione di una leucemia acuta alla linea mieloide [33] [524] [525].
L’antigene CD13 è espresso nella quasi totalità dei casi di leucemia acuta
mieloide sia dell’adulto che del bambino [510] [526] [80], con frequenze che a seconda
delle casistiche arrivano fino al 95% dei casi considerati [83].
Nei pazienti affetti da AML-M3 e trattati con acido trans-retinoico (ATRA),
l’espressione basale di CD13 sembra correlare sia con il rischio di sviluppare la sindrome
da ATRA che con la comparsa di elevati valori di leucocitosi [527].
La positività per CD13 associata a negatività per CD33 sembrerebbe
particolarmente frequente nelle forme AML-M0 [90].

57
Neoplasie delle cellule B mature

L’espressione di CD13, come quella di altri marcatori della linea mieloide


(CD11b, CD11c, CD14, CD15 e CD33), è stata segnalata nella B-CLL [478] [528] [479]
[480]. In alcune casistiche l’espressione di CD13 sembra associata, come pure
l’espressione di CD33, ad una prognosi peggiore e ad un pattern diffuso di infiltrazione
midollare [478] [481], mentre in altre non è evidente un preciso significato prognostico
[479]. L’antigene CD13 è stato segnalato anche sulle cellule della B-PLL [483] e della
HCL [529].
Anche le plasmacellule mielomatose possono esprimere CD13 [530], assieme ad
altri marcatori tipici della linea mieloide come CD11c, CD14 e CD15 [501]. In una
casistica composta da 26 casi di leucemia plasmacellulare e 664 casi di mieloma multiplo,
il 31% circa dei casi di mieloma multiplo e il 23% circa dei casi di leucemia
plasmacellulare coesprimevano CD13 [405].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD13 è normalmente assente nelle neoplasie delle cellule T mature


[531], ma è stato segnalato sui T linfociti neoplastici dei linfomi cutanei CD4+ (CTCL)
[507], e sulla membrana delle cellule del linfoma anaplastico a grandi cellule CD30+
(ALCL) e della sua variante leucemica a piccole cellule [532] [533] [534]. E’ anche noto
un caso diagnosticato come T-PLL che esprimeva CD13 [535], ma che presentava in
aggiunta una serie di anomalie fenotipiche (cyCD3+, HLA-DR+, CD38+, CD7+, CD56+,
CD33+, CD34+, CD65+, assenza di TCR e di altri antigeni B- e T-associati) che ne
rendevano problematico il reale inquadramento.

Altre entità nosografiche

L’antigene CD13 è dimostrabile con metodiche immunoistochimiche in una quota


di tumori mesenchimali [536].

L’ANTIGENE CD14

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD14 è una glicoproteina di 55 kD codificata da un locus presente sul


cromosoma 5 [537]. L’antigene è legato alla membrana cellulare con un legame del tipo
fosfatidil-inositolo [538], e funge da recettore per il complesso LPS/LBS, costituito dal
lipopolisaccaride batterico (LPS) complessato con la proteina circolante che lo lega in
modo specifico (LBS) [539]. Dato il comportamento eterogeneo degli anticorpi che lo
riconoscono, la sua distribuzione sulle cellule normali varia a seconda del MoAb adottato
per esplorarla [540].
Viene generalmente ammesso che CD14 sia espresso ad elevata intensità sui
monociti. Su queste cellule, che risultano anche vivacemente positive per CD11b e CD33,
l’antigene sarebbe presente nella misura di circa 110.000 molecole per cellula [541],
corrispondenti a 114 E3 siti leganti [67]. E’ stata segnalata nel sangue periferico la
presenza di un subset minoritario di monociti caratterizzati da bassi livelli di CD14,
CD11b e CD33, ed elevati livelli di HLA-DR [542] e di CD45 [543]. Procedure di
back-gating avrebbero dimostrato che le cellule CD14+ CD45++, pur iscrivendosi nel

58
cluster dei monociti, esprimerebbero valori di scatter più ridotti rispetto ai monociti
CD14++ CD45+ [543].
L’antigene CD14 non è comunque ristretto ai monociti, ma è espresso a bassa
densità anche dai granulociti [538], sui quali sarebbe presente nella misura di circa 3000
molecole per cellula [541], livello suscettibile di essere upregolato da TNF, GCSF,
GMCSF e formilpeptide [544]. L’antigene sarebbe presente anche sui basofili [184] [545]
[424] e sulle cellule dell’epitelio mammario [546]. Controversa è la sua espressione sui
linfociti normali circolanti. Segnalazioni riguardanti la presenza di CD14 su B linfociti
periferici [540] [547] sarebbero interpretabili più come effetto dell’adsorbimento passivo
della molecola solubile che come prova di vera sintesi [542]. Il ruolo dell’adsorbimento
passivo di questa molecola è stato recentemente posto in rilievo da esperimenti in cui
linfociti co-coltivati con monociti in presenza di forbolo-miristato (PMA) acquisivano
l’antigene CD14 che veniva dismesso dai monociti [548].
La molecola CD14 è espressa anche sulla superficie di vari membri della famiglia
monocito-macrofagica, tra cui i macrofagi delle sierose, i macrofagi alveolari, i
macrofagi splenici, le cellule di Kupffer, e le cellule epitelioidi dei granulomi [544]. La
presenza di CD14 sulle cellule dendritiche è negata da alcuni autori [255] ma postulata da
altri [549], anche se con intensità molto più bassa di quella espressa dai monociti [506].

ASPETTI CITOMETRICI

Gli anticorpi anti CD14 sono in grado di riconoscere tre o quattro distinti epitopi
presenti sulla molecola CD14, e non si comportano tutti nello stesso modo. Questa
eterogeneità sembra dovuta all’esistenza di diverse isoforme di CD14, la cui
distribuzione può presumibilmente variare con la maturazione o con la modulazione
funzionale della molecola. E’ stato infatti messo in evidenza che la maggior parte delle
molecole di CD14 capaci di legare il MoAb LeuM3 viene dismessa dalla superficie
cellulare dei monociti umani dopo stimolazione con PMA, senza concomitante perdita
della reattività con l’anticorpo MY4 [550]. E’ quindi possibile che esistano due forme di
CD14, una MY4- LeuM3+ che viene dismessa dopo attivazione con PMA, ed una MY4+
LeuM3+, che non viene modulata dall’attivazione. E’ stato anche ipotizzato in alternativa
che la molecola di CD14 possieda due epitopi diversi, il primo riconosciuto dal MoAb
MY4 ed il secondo riconosciuto dal MoAb LeuM3, e che l’attivazione con PMA induca
una proteinasi di membrana in grado di liberare la porzione di molecola contenente
l’epitopo riconosciuto da LeuM3, conservando selettivamente la porzione di molecola
contenente l’epitopo riconosciuto dal MoAb MY4 [550].
Mentre l’anticorpo LeuM3 sembra quello dotato della maggiore specificità,
l’anticorpo MY4 sembra invece dotato della più ampia sensibilità, ed è capace di
riconoscere anche i monociti del maiale e di altri primati diversi dall’uomo [542].

59
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T e B

L’antigene CD14 può essere occasionalmente espresso sui blasti della leucemie
dei precursori T e B [518] [553] [516] [480], ma non sembra dotato di significato
prognostico né nelle forme dell’adulto né nelle forme pediatriche [516] [517] [463]. Nelle
forme pediatriche l’espressione di CD14 appare associata a specifiche anomalie
genetiche, come il riarrangiamento dei geni ETV6 o MLL [517].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD14, esplorato con il MoAb MY4 in una coorte costituita da 191 casi
di AML, è risultato espresso in poco meno del 20% [80]. Nello studio delle leucemie
mieloidi acute, gli anticorpi anti CD14 marcano soprattutto i casi compresi nei tipi
AML-M4 e AML-M5 della classificazione FAB, con una particolare selettività per le
cellule più mature [554], ragion per cui i casi CD14+ sono più numerosi nel sottogruppo
M5b rispetto al sottogruppo M5a [83]. Dato che il MoAb MY4 sembra più sensibile
mentre il MoAb LeuM3 sembra più specifico, i risultati ottenuti nelle varie casistiche
dipendono dal tipo di antisiero adottato [555], e devono essere interpretati con cautela.
Per quanto concerne l’attribuzione di linea, va osservato che, anche se meno specifiche
della positività per CD14, l’espressione di CD87, l’espressione anche intracitoplasmatica
di CD68, un’espressione brillante di CD64 [556] e un’espressione brillante di CD11c
costituiscono tutte indizio presuntivo di appartenenza alla linea monocito-macrofagica.
Sui blasti di AML l’espressione di CD14 è associata con bassi livelli di emoglobina alla
diagnosi [554], e se presente su più del 30% delle cellule leucemiche assume significato
prognostico sfavorevole [557], presumibilmente per l’associazione del marcatore con i
più aggressivi sottotipi FAB M4-M5. L’analisi combinata di CD14 e di CD66 può essere
utile nella evidenziazione della cosiddetta mielopoiesi asincrona [558].

Neoplasie delle cellule B mature

Nello studio delle neoplasie delle cellule B mature, il MoAb MY4 marca
debolmente un’elevata percentuale di casi, e sembra in grado di riconoscere epitopi
selettivamente espressi sulle cellule della B-CLL e di altri B-NHL [547] [559]. La
presenza di questi epitopi non verrebbe riconosciuta da altri MoAb anti CD14 [560] [481]
[479], e sarebbe associata a significato prognostico negativo [561]. E’ noto un caso di
B-NHL positivo per CD11b, CD14 e CD36, successivamente evoluto in leucemia acuta
monocitica [482]. L’analisi dell’antigene CD14 può avere infine un ruolo nella
tipizzazione delle plasmacellule mielomatose, in cui è stata segnalata l’espressione di
CD14, come pure quella di altri marcatori della linea mieloide (CD11c, CD13 e CD15)
[501].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD14 è di regola assente nelle neoplasie delle cellule T mature


[480].

60
Neoplasie delle cellule NK

L’espressione di CD14 è di regola assente nelle neoplasie delle cellule NK mature.


Tuttavia è stato riportato un caso di linfoma blastico a cellule NK le cui cellule reagivano
con il MoAb MY4 ma non con il MoAb LeuM3 [562].

Altre entità nosografiche

Lo studio di CD14 è importante nella leucemia mielomonocitica cronica (CMML)


e nella valutazione dell’emoglobinuria parossistica notturna (PNH), in cui l’espressione
di CD14, come pure quella di tutte le altre molecole legate mediante fosfatidil-inositolo
(CD16, CD24, CD55, CD59 e CD67), è caratteristicamente alterata [563]. L’espressione
dell’antigene CD14 è stata dimostrata con metodiche immunoistochimiche anche nel
cosiddetto linfoma istiocitico “vero” (THL) [242].

L’ANTIGENE CD15

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD15 funge da recettore per le selectine, ed è un pentasaccaride


ramificato [564] presente in molte strutture glicoproteiche e glicolipidiche espresse sulla
superficie dei neutrofili, degli eosinofili, dei monociti [565], nonché – debolmente – dei
basofili [424]. Secondo alcuni Autori, l’antigene CD15 comparirebbe sugli elementi della
serie mieloide subito prima del livello di promielocita e sarebbe assente sui precursori
[566], mentre secondo altri l’antigene sarebbe già evidenziabile a livello delle CFU-GM
[567] [568]. Questa disparità di vedute assume particolare importanza nella prospettiva
della definizione di fenotipo asincrono, ed è probabilmente dovuta al fatto che il
comportamento dei diversi anticorpi anti CD15 può variare in funzione del clone
impiegato nell’analisi [569].
Sui T linfociti normali l’antigene CD15 si comporta come un antigene di
attivazione, in quanto compare sulla membrana 48-72 ore circa dopo stimolazione con
PHA, e dopo 120 ore è presente sul 56% circa degli elementi [493]. In ossequio alla sua
natura polisaccaridica, gli anticorpi che lo riconoscono, e che sono specifici per l’epitopo
3-fucosil-N-acetil-lattosamina, appartengono quasi tutti alla classe IgM. L’antigene
CD15 esiste anche sotto forma di molecola sialilata, che è stata clusterizzata
separatamente come CD15s. Gli anticorpi anti CD15 di isotipo IgM non cross-reagiscono
con CD15s [570].

ASPETTI CITOMETRICI

L’antigene CD15 è espresso con intensità progressivamente decrescente sui


neutrofili, sugli eosinofili, sui monociti, e sui basofili [545]. La sua espressione sui
neutrofili è particolarmente intensa, e in un’analisi multiparametrica la sua dimostrazione
può ostacolare per impedimento sterico la consensuale dimostrazione di altri antigeni
intensamente espressi, come ad esempio CD45.

61
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T e B

L’antigene CD15 è presente sui blasti di una percentuale variabile di casi di ALL
sia T che B [571] [518] [502] [80], dove non sembra però dotato di significato
prognostico [463]. E’ possibile che il pattern di reattività dipenda fortemente dal clone
usato, in quanto in una casistica di soggetti affetti da T-ALL e B-ALL il MoAb Smy15c si
dimostrava capace di colorare una percentuale di casi drasticamente superiore a quella
marcata dai MoAb FMC13 e LeuM1 [572].
Secondo alcuni Autori, l’espressione di CD15 sarebbe predittiva del
riarrangiamento dei geni ETV6 e MLL [517], e nella B-ALL sarebbe spesso associata con
l’espressione di CD65 e con la presenza delle traslocazioni t(11;19) [573] e t(4;11) [574]
[573]; in questi casi l’intensità di espressione dell’antigene appare tipicamente bassa.
Secondo altri Autori, la presenza di CD15 sarebbe presente in circa la metà dei casi di
B-ALL con fenotipo CD10-, CD20-, ma senza correlazione con la presenza della
traslocazione t(4;11) [464]. L’espressione di CD15 sulle neoplasie dei precursori T è stata
segnalata sporadicamente, ma in una casistica costituita da 48 T-ALL l’espressione di
CD15 sarebbe stata dimostrata in circa il 28% dei casi, e correlerebbe con l’assenza di
CD3 [464].

Leucemie acute mieloidi

A seconda delle varie casistiche, l’espressione di CD15 nella AML varierebbe dal
30 [575] al 75% dei casi [554] e oltre [473], ed assumerebbe significato prognostico
favorevole [576] [475]. Secondo alcuni Autori, i promielociti leucemici della AML-M3
non esprimerebbero CD15 [577] [432], mentre secondo altri lo esprimerebbero in quasi la
metà dei casi [80]. Secondo altri Autori ancora, l’antigene CD15 sarebbe presente nella
AML-M3 prevalentemente nella sua forma sialilata, e come tale verrebbe riconosciuto
dal MoAb VEP19 ma non dal MoAb VIM-D5 [578]. Lo studio di CD15, eseguito
congiuntamente a quello di CD34 e CD117, antigeni normalmente espressi da cellule in
stadi di maturazione più arretrata, può essere utile nella evidenziazione di asincronismi
maturativi, e può avere un ruolo nella evidenziazione della malattia minima residua [579]
[477] [580] [84].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD15 è stato dimostrato mediante tecniche immunoistochimiche in


alcuni linfomi a cellule B [581]. In una casistica consistente in 68 casi di leucemia a
cellule capellute (HCL), l’antigene CD15 è stato segnalato su più del 20% degli elementi
nel 18% dei casi [202]. La presenza dell’antigene CD15, come pure quella di altri
marcatori della linea mieloide (CD11b, CD11c, CD13, CD15 e CD33), è stata segnalata
nella B-CLL [478] [479]. In particolare, l’antigene CD15 è stato segnalato sulle cellule
della sindrome di Richter “Reed Sternberg-like” [582] [583] [584].
L’antigene CD15 è stato segnalato sulle plasmacellule mielomatose [501] [585];
in una casistica composta da 26 casi di leucemia plasmacellulare (PCL) e 664 casi di
mieloma multiplo (MM), il 7% circa dei casi di mieloma multiplo e l’8% circa dei casi di
leucemia plasmacellulare coesprimevano CD15 [405].

62
Neoplasie delle cellule T mature

La presenza dell’antigene CD15 è stata segnalata in alcuni casi di linfoma T


periferico [571] [586], con particolare predilezione per le forme a cellule “pleomorfe”
[587] e per i linfomi T periferici a fenotipo CD4- CD8+ [502]. L’antigene CD15 è stato
sporadicamente segnalato con metodiche immunoistochimiche in isolati casi di linfoma
anaplastico a grandi cellule (ALCL) [588]. La forma sialilata dell’antigene CD15 è
coespressa dalle cellule CD4+, CD7- della sindrome di Sézary [220].

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD15 è stato dimostrato in un caso di linfoma blastico a cellule NK


leucemizzato [235].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD15 è classicamente presente nelle cellule di Reed-Sternberg del


linfoma di Hodgkin, dove è dimostrabile con tecniche immunoistochimiche [589] [590].
L’espressione dell’antigene CD15 è stata dimostrata anche nel cosiddetto linfoma
istiocitico “vero” [242].

L’ANTIGENE CD16

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD16 funge da recettore a bassa affinità per il frammento


cristallizzabile delle IgG (Fc gamma III) [591], pesa circa 50-80 kD, ed esiste sotto due
forme diverse, codificate da due diversi geni collocati sul braccio lungo del cromosoma 1
[592].
La prima forma, detta Fc gamma IIIa, è costituita da una proteina transmembrana
dotata di una porzione citoplasmatica [592]. Questa forma è espressa dalle cellule NK
[593], da una minoranza di T linfociti con TCR alfa/beta, e dalla maggioranza dei T
linfociti con TCR gamma/delta [594] [595] [596], dove è associata con legame non
covalente alle catene gamma e zeta del complesso CD3. L’antigene CD16 Fc gamma IIIa
viene anche espresso da una sottopopolazione di monociti [597] e dalle mast-cellule,
dove è associato alla catena beta del recettore ad alta affinità per il frammento
cristallizzabile delle IgE (Fc epsilon RI) [598].
La seconda forma, detta Fc gamma IIIb, è una molecola PI-linked, ed esiste sotto
due varianti alleliche diverse, dette NA-1 e NA-2. [592], rappresentate rispettivamente
nel 37 e nel 63 % della popolazione caucasica [599]. La forma Fc gamma IIIb PI-linked è
presente sui neutrofili [600] [595], sulla cui superficie compare successivamente a
CD11b dopo lo stadio di promielocita [449].
L’antigene non sembra presente sui basofili [184] [424] [601], che di tutti i
recettori per Fc di IgG esprimerebbero esclusivamente CD32 [184] [602]. L’espressione
di CD16 sugli eosinofili è controversa. Mentre infatti alcuni Autori la ammettono [595],
altri la negano, basandosi proprio sui valori di side scatter e sull’assenza di CD16 per
identificare gli eosinofili tra tutti i polimorfonucleati [603].
L’espressione di CD16 viene down-regolata sui neutrofili nel corso dell’apoptosi
[604] e in occasione di patologie infiammatorie [114], mentre verrebbe up-regolata sugli
eosinofili dall’interferone gamma [605].

63
Bassi livelli di CD16 sui neutrofili sono stati segnalati nell’AIDS [606], nella
leucemia mieloide cronica (CML) [607], e nelle sindromi mielodisplastiche [608].

ASPETTI CITOMETRICI

Lo studio dell’antigene CD16 viene praticato principalmente per la


caratterizzazione e la quantizzazione dei linfociti con funzione NK. In tal senso è prassi
comune eseguire un’analisi bivariata per CD3 e CD16, ed assumere putativamente come
elementi NK le cellule con fenotipo CD16+ CD3-. Un altro settore in cui lo studio
dell’antigene CD16 va acquistando progressiva importanza è l’analisi del midollo osseo,
con particolare riguardo alla valutazione e alla monitorizzazione della maturazione
mieloide. L’antigene CD16 viene infatti progressivamente espresso nel corso della
maturazione, sicché in un midollo normale un’analisi bivariata per CD16 e CD45,
condotta selettivamente sugli elementi positivi per CD45 e contraddistinti da elevati
valori di side scatter, è in grado di risolvere il comparto mieloide in almeno cinque
sottopopolazioni diverse, caratterizzate da un progressivo incremento dell’antigene
CD16.
Un’analisi quantitativa eseguita con il MoAb ION attribuisce diverse densità di
espressione ai principali tipi cellulari, e in particolare 12±5 E03 siti leganti ai monociti,
12±7 E03 siti leganti ai granulociti eosinofili, 79±30 E03 siti leganti ai linfociti NK, e ben
408±167 E03 siti leganti ai granulociti neutrofili [67]. Esiste inoltre evidenza in
letteratura che l’intensità di espressione di CD16 sulla membrana delle cellule NK è
significativamente più intensa di quella presentata dalle cellule T [596].
Le valutazioni quantitative e qualitative inerenti l’espressione dell’antigene CD16
devono comunque essere considerate criticamente, e ciò alla luce del fatto che:
i) è stato recentemente messo in evidenza un polimorfismo nella espressione
di Fc gamma IIIa sulle cellule NK, che dividerebbe gli individui in
soggetti a bassa ed elevata espressione dell’antigene (rispettivamente circa
5500 e 14000 recettori per cellula) [609];
ii) valutazioni quantitative della densità antigenica eseguite sugli eosinofili
devono tenere conto dell’elevata autofluorescenza di queste cellule, e
devono essere corroborate da adeguati controlli;
iii) i MoAb rivolti verso CD16 possono avere comportamenti diversi a
seconda dell’epitopo riconosciuto [610].
Per quanto concerne quest’ultimo punto va ricordato che alcuni cloni, come ad
esempio 3G8 e 4F7, riconoscerebbero una piccola percentuale di B linfociti periferici
[611], altri cloni, come GRM1 e CLBGran11, sarebbero selettivi per le alloforme di Fc
gamma IIIb, [599], altri ancora, come 1D3, sarebbero specifici per la molecola Fc gamma
IIIb espressa sui neutrofili [612]. E’ stato inoltre ripetutamente riportato che, almeno
limitatamente all’analisi di cellule provenienti da soggetti affetti da malattia
linfoproliferativa dei linfociti granulati (LDGL), l’esplorazione dell’antigene CD16
effettuata con MoAb diversi è suscettibile di fornire risultati non concordanti, sicché i
vari casi possono essere indifferentemente classificati come positivi o negativi in
funzione del clone adottato nell’analisi [614] [615].
E’ anche noto un deficit immunitario causato da una mutazione puntiforme
responsabile della sostituzione con istidina della leucina 48 presente sul primo domain
extracellulare “Ig like”; questa mutazione modifica l’epitopo riconosciuto dal MoAb
B73.1 e lo rende non più riconoscibile dall’anticorpo [616].
L’esplorazione dell’antigene CD16 in campioni di sangue intero o di sangue
midollare impone di considerare l’elevata espressione dell’antigene sui neutrofili; dovrà
quindi essere prestata la massima cura nell’eseguire le marcature sempre in condizioni di

64
eccesso di anticorpo, per evitare che l’antisiero venga sequestrato dai polimorfonucleati e
non sia disponibile per reagire con altre cellule.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T e B

Sui blasti delle neoplasie dei precursori T e B l’espressione di CD16 è possibile


ma eccezionale [617]. L’espressione di CD16 è stata segnalata, congiuntamente
all’espressione di CD11b, sui blasti di un caso di T-ALL con TCR gamma/delta insorta in
un soggetto affetto da sindrome mielodisplastica [465].
Esistono isolate segnalazioni di sporadici casi di linfoma T linfoblastico positivi
per CD16 e per altri antigeni NK associati [618], [387], [619], [620], [621], [622]; è
possibile che questi casi costituiscano un’entità nosografica diversa dal linfoma T
linfoblastico classico, eventualmente inquadrabile tra le neoplasie dei precursori delle
cellule NK [623].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD16 è espresso sui blasti della leucemia mieloide acuta in poco meno
di un quarto circa dei casi; la sua espressione è associata alle forme monocitiche, ed è
generalmente accompagnata dalla coespressione di CD56 [81]. L’espressione di CD16 è
correlata alla presenza di malattia extramidollare [554].

Neoplasie delle cellule B mature

L’espressione di CD16 è di regola assente nelle neoplasie delle cellule B mature


[207].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD16 è presente in una percentuale variabile di casi di malattia


linfoproliferativa dei linfociti granulati a cellule T (T-LDGL) [624] [625]. L’antigene
CD16 è stato frequentemente segnalato sulle cellule dei linfomi a TCR gamma/delta [626]
come il linfoma epatosplenico (HSTCL) [627] [628] [629] [630], e sulle cellule di alcuni
casi di malattia linfoproliferativa dei T linfociti (T-LDGL) caratterizzata dalla presenza di
proteine intracellulari citotossiche [631]. E’ noto anche un caso di T-PLL contraddistinto
dalla coespressione di CD16 e CD56 [632].

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD16 è frequentemente espresso dalle cellule della malattia


linfoproliferativa dei linfociti granulati a cellule NK (NK-LDGL) [624]; la sua
espressione sembra però prevalentemente assente nelle altre neoplasie delle cellule NK,
sia nei linfomi nasali e “nasal-type” [633] che nelle neoplasie dei precursori. In tal senso
l’antigene non sembra espresso né dalle cellule della cosiddetta “myeloid/natural killer
cell precursor acute leukemia” descritta da Suzuki [634] [635], né da quelle della
cosiddetta "myeloid/NK acute leukemia" descritta da Scott [636]. Per quanto concerne il
cosiddetto “linfoma blastico a cellule NK”, l’espressione di CD16 viene negata da alcuni
Autori [635] [234], ma ammessa da altri [230].

65
Altre entità nosografiche

L’intensità di espressione di CD16 sarebbe selettivamente e significativamente


diminuita sui neutrofili della leucemia mieloide cronica, ma non su quelli della
trombocitemia essenziale o della policitemia vera [637]. Nell’emoglobinuria parossistica
notturna (PNH) l’espressione della forma PI-linked del CD16 è ridotta o assente, come
pure quella di tutte le altre molecole legate mediante legame fosfatidil-inositolo (CD14,
CD24, CD55, CD59, CD67 etc.) [638] [563].

L’ANTIGENE CD19

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD19 è una glicoproteina di 95 kD codificata da un locus presente sul


cromosoma 16 [639]. L’antigene CD19 è strettamente associato ai B linfociti [640] [641],
su cui compare fin dallo stadio di cellula pre-pre-B, ancor prima della comparsa di CD10.
Un’analisi multiparametrica, condotta mediante lo studio degli antigeni CD10, CD20,
CD22 e CD34, permette di evidenziare nel midollo osseo normale la presenza di cinque
differenti subset di cellule CD19+ riferibili a distinti e progressivi stadi maturativi [642],
ovvero:
i) un subset CD19+, CD34+, CD10-, CD20-, CD22dim+ (0.5±0.4% di tutte
le cellule CD19+);
ii) un subset CD19+, CD34-, CD10++, CD20-, CD22dim+ (3.4±2.7%);
iii) un subset CD19+, CD34-, CD10+, CD20-, CD22dim+ (3.5±2.2%);
iv) un subset CD19+, CD34-, CD10+, CD20+, CD22dim+ (21±11%),
v) un subset CD19+, CD34-, CD10-, CD20++, CD22+ (73±19%).
L’antigene CD19 è costantemente espresso sui B linfociti maturi [641], e
permane espresso lungo tutta la corsa maturativa fino allo stadio di plasmacellula. La
presenza di CD19 sulla superficie delle plasmacellule è alquanto controversa; mentre
infatti alcuni Autori la escludono [176] [570], altri la ammettono sulle plasmacellule
normali ma non sulle plasmacellule neoplastiche [643]. L’antigene CD19 è presente
anche sulle cellule dendritiche [641].

ASPETTI CITOMETRICI

L’antigene CD19 è uno degli antigeni più frequentemente studiati, in quanto la


sua specificità per la linea B lo candida al conteggio dei B linfociti in un’ampia serie di
situazioni diverse, e lo rende obbligatoriamente parte dei pannelli anticorpali usati nello
studio delle malattie linfoproliferative acute e croniche. Va inoltre osservato che la sua
frequente espressione sui blasti di alcune leucemie mieloidi lo ha a buon diritto inserito
nei pannelli anticorpali applicati alle malattie mieloproliferative acute.
La marcatura di linfociti periferici normali con un MoAb anti CD19 produce
generalmente istogrammi di positività dall' aspetto monomodale, dotati di basso CV, con
un canale di picco indicativo della presenza di un numero di siti leganti valutabile attorno
ai 27±3 E03 per cellula [67]. L’entità di espressione di CD19 non è comunque costante,
soprattutto nelle malattie linfoproliferative croniche, e la sua valutazione è spesso utile
per distinguere i B linfociti neoplastici dai B linfociti normali residui.

66
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

L’espressione di CD19 è di regola assente nelle leucemie dei precursori T. E’ noto


tuttavia un caso di leucemia acuta T/NK le cui cellule esprimevano fenotipo CD2+,
cyCD3+, CD4+, CD13+, CD33+, CD56+, CD19+ e CD30+ [36].

Leucemie dei precursori B

L’espressione di CD19 è di regola presente nelle leucemie dei precursori B, e può


essere sfruttata, congiuntamente all’espressione di un parametro fisico, per la definizione
di un gate immunologico capace di restringere l’analisi alle sole cellule patologiche [298].
Nello studio delle leucemie dei precursori B, l’evidenziazione della coespressione di
CD19 con altri antigeni infrequentemente espressi dai B precursori normali costituisce un
importante strumento nella ricerca della malattia minima residua. In tal senso è
importante rilevare che, sebbene frequenti nei campioni patologici, i fenotipi
rappresentati dalla coespressione di CD19 e CD117, CD19 e CD13, e CD19 e CD33 non
eccedono nella differenziazione B normale le frequenze di 5 su 10.000 per il primo
fenotipo e di 3 su 1000 per gli ultimi due, rispettivamente riferite a tutte le cellule
midollari [642].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD19 è talora dimostrabile sui blasti della leucemia acuta mieloide
[644] [82], con frequenze che in alcune casistiche ammontano al 9-10% circa dei casi
osservati [38] [81] [84]. Il suo riscontro è verificato con particolare frequenza nella M2
con t(8;21) [85] [645], dove non sembra rivestire significato prognostico [646], ma è
anche segnalato nelle AML-M4 e M5 [647], e nella AML-M2 con traslocazione t(8;19),
una variante della AML-M2 con t(8;21) [648]. E’ interessante osservare come in alcuni
casi l’evidenziazione dell’espressione dell’antigene dipenda strettamente dal MoAb usato.
Mentre infatti l’espressione di CD19 sulle AML-M2 con t(8;21) è verificata a prescindere
dal MoAb adottato nell’analisi, in alcuni casi di AML-M4/M5 l’espressione di CD19 è
evidenziabile con il MoAb B4(lytic) ma non con il MoAb B4 89B, né con il MoAb
SJ25-C1 [649].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD19 è di regola presente sulle cellule delle neoplasie delle cellule B
mature, con l’eccezione del linfoma primitivo delle sierose (PEL) [650], del mieloma
multiplo (MM), e della leucemia plasmacellulare (PCL) [643] [651] [34].
E’ interessante osservare che, rispetto ai B linfociti normali, l’espressione di
CD19 è caratteristicamente elevata nella leucemia a cellule capellute (HCL) [652] [653],
ma sarebbe per contro ridotta sulle cellule del linfoma mantellare (MCL) [652] [258]
[653], del linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL) [652] [258], della leucemia B a
prolinfociti (B-PLL) [652], e della leucemia linfatica cronica (B-CLL) [652] [258].
Nell’ambito della B-CLL, valori particolarmente bassi di CD19 si apprezzerebbero nella
B-CLL atipica [654]. Per quanto concerne il mieloma multiplo, esistono in letteratura
alcuni report che distinguono fra plasmacellule normali e neoplastiche in funzione
dell’espressione di CD19: le plasmacellule normali sarebbero CD19 positive a bassa
densità, mentre le plasmacellule neoplastiche sarebbero definitivamente CD19 negative

67
[643] [655] [656]. E’ possibile tuttavia che questa regola patisca eccezioni, in quanto è
noto almeno un caso di mieloma multiplo costituto da plasmacellule sicuramente CD19+
[657].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD19 è di regola assente nelle neoplasie delle cellule T mature.


Esistono comunque in letteratura almeno tre segnalazioni aneddotiche riguardanti la
presenza di CD19 sulle cellule della T-LDGL, sia in condizioni basali [658] [659] che
dopo attivazione in vitro [660].

Neoplasie delle cellule NK

L’espressione di CD19 è di regola assente nelle neoplasie delle cellule NK, ma è


noto un caso di leucemia acuta T/NK caratterizzata da fenotipo CD2+, cyCD3+, CD4+,
CD13+, CD33+, CD56+, CD19+ e CD30+ [36].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD19 è stato evidenziato con metodiche immunoistochimiche nelle


cellule di un caso di sarcoma a cellule follicolari dendritiche [241].

L’ANTIGENE CD20

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD20 è un polipeptide di 33-37 kD, codificato da un gene presente sul


cromosoma 11 [661]. L’antigene CD20 è espresso sui B linfociti maturi, dove è presente
ad un’intensità maggiore rispetto a CD19. Durante la corsa maturativa del B linfocita,
l’antigene CD20 compare dopo CD19 e CD10. Durante la maturazione in plasmacellula
l’antigene CD20 perdura un poco più a lungo di CD19. In funzione di quanto detto,
un’analisi multiparametrica CD10/CD20/CD45/CD19 si presta benissimo alla
dimostrazione di popolazioni immature di B linfociti e alla diagnostica delle leucemie
linfatiche acute della serie B, mentre un’analisi multiparametrica
CD20/CD38/CD45/CD19 è spesso in grado di evidenziare la presenza di popolazioni B
molto mature con fenotipo CD19± CD20+ CD38+++. E’ interessante osservare che
elementi con questo fenotipo spesso si riscontrano fugacemente nel periferico di soggetti
affetti da morbillo.
Va infine ricordato che l’antigene CD20 è presente a bassa intensità anche sulla
superficie di alcuni subset di T linfociti, sia nel sangue periferico [662] [663] [664] che
nel sangue midollare [665]. In particolare l’espressione di CD20 sulle cellule T sarebbe
ristretta a un subset di linfociti citotossici caratterizzati da fenotipo CD8+, CD28+,
CD45RO+, TCR alfa/beta+, CD38-, HLA-DR- [664].

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di linfociti periferici normali con un MoAb anti CD20 produce


generalmente istogrammi di positività dall' aspetto monomodale, con un canale di picco
indicativo della presenza di un numero di siti leganti valutabile attorno ai 149±10 E03 per
cellula [67]; l’intensità di espressione dell’antigene aumenta sui B linfociti attivati [666].

68
In studi effettuati su sospensioni di linfonodo la marcatura produrrebbe invece
istogrammi bimodali, suggestivi per presenza di due popolazioni di B linfociti CD20+, la
prima meno brillante costituita dalle cellule mantellari, e la seconda più brillante
costituita dalle cellule del centro germinativo [381] [382].

MoAb FMC7

Il MoAb anti FMC7 è specifico per un antigene del peso di circa 105 kD espresso
con intensità variabile sui B linfociti [667] [668].
L’antigene FMC7 è debole o assente sulle cellule del linfoma linfocitico e della
leucemia linfatica cronica classica (B-CLL), mentre è vivacemente rappresentato sulle
cellule della B-CLL con trisomia 12, della leucemia linfatica cronica a B prolinfociti
(B-PLL), della leucemia a cellule capellute (B-HCL), e del linfoma mantellare
leucemizzato (MCL) [669] [670] [269]. Esistono inoltre segnalazioni aneddotiche
riguardanti la presenza di FMC7 sulle cellule della linfocitosi policlonale persistente a B
linfociti (PLBL) [671], sulle cellule del linfoma di Burkitt (BL) [274], sulle plasmacellule
del mieloma multiplo IgM [672], e sulle cellule del linfoma follicolare leucemizzato (FL)
[397].
Il fatto che la distribuzione dell’espressione di FMC7 nelle neoplasie
ematologiche riproduca sostanzialmente quella dell’antigene CD20 [673] ha da tempo
suggerito una stretta relazione tra le due molecole. Uno studio condotto transfettando
cellule K562 con un plasmide contente cDNA codificante per CD20 ha dimostrato che
l’anticorpo anti FMC7 riconosce un epitopo conformazionale di CD20 [674]; la
discrepanza tra il peso molecolare dell’antigene CD20 e il peso molecolare attribuito
all’antigene riconosciuto dall’anticorpo FMC7 è probabilmente spiegabile dal fatto che
l’anticorpo FMC7 riconosce un complesso multimerico dell’antigene CD20 [674].

Altri anticorpi

Alcuni anticorpi anti CD20 dimostrano comportamenti particolari.


Il MoAb H147 si è dimostrato in grado di riconoscere un epitopo espresso sulle
cellule della B-ALL e delle linee cellulari pre-B, ma non è chiaro se questo
comportamento sia dovuto alla particolare specificità del clone, capace di riconoscere un
epitopo selettivamente espresso sui precursori, o non piuttosto alla commistione con un
altro MoAb non identificato dotato di diversa specificità [675].
Il MoAb L26 è in grado di riconoscere un epitopo intracitoplasmatico conservato
nelle sezioni paraffinate [676].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

Ancorché CD20 sia un antigene B-associato, è possibile ritrovarlo espresso a


bassa intensità in rari casi di T-ALL [677]. La coespressione di CD20 e CD79 è stata
segnalata in un caso di linfoma linfoblastico T/NK [678].

69
Leucemie dei precursori B

In una recente casistica, l’antigene CD20 risulta espresso su circa un quarto dei
casi di leucemia dei precursori B CD10+ e su circa un terzo dei casi di leucemia dei
precursori B CD10- [154]. L’assente o ridotta espressione di CD20 nelle leucemie a
precursori B del bambino sembra predittiva, se associata ad espressione di CD13, di
traslocazione t(12;21) [522]. Nelle leucemie dei precursori B l’intensità di espressione di
CD20, analogamente all’intensità di espressione di CD45, riveste significato prognostico;
i pazienti con elevati livelli di espressione di CD20 hanno sopravvivenze “event-free”
peggiori di quelli con bassi livelli di espressione [679].
Nello studio delle leucemie dei precursori B, l’evidenziazione della coespressione
di CD20 con altri antigeni infrequentemente espressi dai B precursori normali costituisce
un importante strumento nella ricerca della malattia minima residua. In tal senso è
importante rilevare che, sebbene frequente nei campioni patologici, il fenotipo
rappresentato dalla coespressione di CD20 e CD34 non eccede nella differenziazione B
normale la frequenza di una cellula su mille riferita a tutte le cellule midollari, mentre la
coespressione di CD20 bright e CD34 appare ancora più rara (5 su 10.000 elementi)
[642].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD20 è segnalato nella leucemia acuta mieloide con una frequenza
che varia da sporadiche segnalazioni a circa il 17% dei casi [38] [82], con una particolare
predilezione per la AML-M5 [83]. La sua espressione è spesso limitata a una
sottopopolazione delle cellule analizzate [38].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD20 è di regola presente sulle cellule delle neoplasie delle cellule B
mature, con l’eccezione del linfoma primitivo delle sierose (PEL) e della maggior parte
dei casi di mieloma multiplo (MM) e di leucemia plasmacellulare [650] [680].
I B linfociti circolanti in corso di leucemia linfatica cronica a cellule B (B-CLL)
presentano generalmente – ma non obbligatoriamente [681] [682] - un numero di siti di
legame per cellula molto più basso di quello dei linfociti B normali [683] [2] [652] [653]
[684], e valutabile attorno ai 15-18.000 siti [685]. Un comportamento opposto si nota
invece nella leucemia a cellule capellute (HCL), nella leucemia a prolinfociti B (B-PLL),
nel linfoma mantellare (MCL), nel linfoma follicolare (FL), e nel linfoma splenico a
linfociti villosi (SLVL), sulle cui cellule l’antigene CD20 sembra essere espresso con
particolare intensità [2] [652] [653] [261] [684]. Elevate intensità di espressione di CD20
si verificano anche nelle cosiddette B-CLL “atipiche” [654], e suggeriscono la presenza
di trisomia 12 [686].
L’espressione di CD20 sulle cellule della B-CLL e di altri B-NHL viene
drasticamente down-modulata in corso di trattamento terapeutico con anticorpi
monoclonali anti CD20 [687]; dopo questo tipo di trattamento sono state segnalate
recidive con cellule negative per CD20 [688] [689].
Le plasmacellule del 10-15% circa dei casi di mieloma multiplo (MM) e di una
ancor maggiore percentuale di casi di leucemia plasmacellulare (PCL) esprimono CD20
[405] [680]; i casi di mieloma multiplo CD20+ sembrano caratterizzati da una
sopravvivenza più ridotta ripetto ai casi CD20- [690].

70
Neoplasie delle cellule T mature

La presenza dell’antigene CD20 espresso a bassa intensità è stata riportata in rari


casi di T linfoma periferico (PTCL), esplorati sia con metodiche citometriche [691] [663]
[692] [693] che con metodiche immunoistochimiche [694] [695] [696] [697]. La
presenza dell’antigene CD20 è stata segnalata anche in un caso di leucemia/linfoma a
cellule T dell’adulto (ATLL) positiva per HTLV-I [698], in un caso di linfoma
angioimmunoblastico (AITL) [693], e in isolati casi di linfoma anaplastico a grandi
cellule (ALCL) [699].
L’espressione di CD20 su cellule di linfoma T periferico è in linea con il fatto che
una bassa espressione di questo antigene è stata segnalata sulla membrana di una
sottopopolazione normale di T linfociti [662]. Nel caso di PTCL segnalato da San Miguel,
oltre a CD20 veniva coespresso in modo aberrante anche l’antigene B-associato
riconosciuto dal MoAb FMC7 [691]; questa coespressione è spiegata dal fatto che
l’anticorpo FMC7 riconosce un epitopo dell’antigene CD20 [674].

L’ANTIGENE CD22

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD22 è un eterodimero del peso di circa 130 kD composto da due


catene molto simili fra di loro, appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline, e
codificate da geni presenti sul cromosoma 19 [700]. L’antigene CD22 è una molecola
specifica per la linea B, ed è presumibilmente coinvolta nell’attivazione del B linfocita, in
quanto la sua espressione tende a diminuire con l’attivazione [701].
L’antigene CD22 è espresso nel citoplasma delle cellule pre-pre-B, delle cellule
pre-B e delle cellule B mature, ma solo in queste ultime sarebbe espresso anche sulla
superficie [702] [703]. In realtà, il concetto della mancata espressione di CD22 sulla
superficie delle cellule B più immature sembra attualmente confutato dalla segnalazione
dell’espressione di CD22 di membrana da parte di B linfociti immaturi negativi per CD10
e CD19 [704].
Nonostante esistano in letteratura pareri contrari [705] [424], vi è convincente
evidenza che i basofili del sangue periferico esprimano debolmente CD22 in assenza di
CD19 [601].

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di linfociti periferici normali con un MoAb anti CD22 produce


generalmente istogrammi di positività dall' aspetto monomodale, dotati di basso CV, con
un canale di picco indicativo della presenza di un numero di siti leganti valutabile attorno
ai 17±2 E03 per cellula [67]. Una comune analisi multiparametrica condotta per CD10,
CD19, CD45 e CD22 su campioni di sangue midollare dimostra che gli ematogoni
esprimono CD22, sebbene a un’intensità ridotta rispetto a quella dei B linfociti maturi.
Nella diagnostica delle leucemie acute dei precursori della serie B è prassi
comune ricercare l’antigene CD22 nel citoplasma, sulla base dell’assunto che l’antigene
non sarebbe espresso sulla membrana delle cellule appartenenti agli stadi più immaturi
[155]; la ricerca intracitoplasmatica di CD22 si avvale vantaggiosamente delle soluzioni
permeabilizzanti disponibili in commercio.
Per quanto concerne l’espressione di CD22 sui basofili, esiste evidenza che non
tutti i MoAb anti CD22 si comportano in modo equivalente, in quanto il riconoscimento

71
dell’antigene su questa popolazione cellulare è risultato documentabile solamente con i
MoAb S-HCL1, RFB4 e MYG13 [706].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

L’espressione di CD22 è di regola assente nelle leucemie dei precursori T [162]


[155].

Leucemie dei precursori B

L’espressione di CD22 è di regola presente nelle leucemie dei precursori B [703]


[155]. In una recente casistica l’antigene CD22 risultava presente in tutti i casi di
leucemia dei precursori B CD10+ e in circa l’80% dei casi di leucemia dei precursori B
CD10- [154]. Nello studio delle leucemie dei precursori B, l’evidenziazione della
coespressione di CD22 con altri antigeni infrequentemente espressi dai B precursori
normali costituisce un importante strumento nella ricerca della malattia minima residua.
In tal senso è importante rilevare che, sebbene sia frequente nei campioni patologici, il
fenotipo rappresentato dalla coespressione di CD22 bright e CD34 non eccede nella
differenziazione B normale la frequenza di 5 x 10(-4), riferita a tutte le cellule midollari
[642].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD22 può essere sporadicamente espresso in isolati casi di leucemia


acuta mieloide [38]. Esiste inoltre in letteratura una segnalazione secondo la quale nel
20% dei casi di AML indagati era possibile evidenziare una positività per la ricerca
intracitoplasmatica di CD22; sulla base di studi immunochimici tale segnale veniva
dichiarato aspecifico, e riferito alla presenza di una proteina intracitoplasmatica
cross-reattiva del peso di circa 300kD [703].

Neoplasie delle cellule B mature

L’espressione di CD22 è di regola – ma non infallibilmente! - presente nelle


neoplasie delle cellule B mature [707]. L’antigene CD22 può infatti non essere espresso
sulle cellule dei linfomi diffusi a grandi cellule B (DLBCL) [707], ed è assente sulle
cellule del linfoma primitivo delle sierose (PEL) [680], del mieloma multiplo (MM), e
della leucemia plasmacellulare (PCL) [707] [708]. In alcune casistiche di leucemia
linfatica cronica (B-CLL), ma non in tutte [653], la sua espressione appare
particolarmente bassa o addirittura assente, ma è più elevata nelle cosiddette B-CLL
atipiche [654]. Rispetto ai B linfociti normali, l’intensità di espressione di CD22 è più alta
sulle cellule della leucemia a cellule capellute (HCL) [653], ed è più bassa sulle cellule
del linfoma mantellare (MCL) [653].

Altre entità nosografiche

L’espressione di CD22 è stata segnalata sugli elementi delle neoplasie delle


mast-cellule [709].

72
L’ANTIGENE CD23

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD23 è una glicoproteina transmembrana del peso di 45 kD,


codificata da un gene situato sul cromosoma 19 [710]. L’antigene CD23 funge da
recettore a bassa affinità per il frammento cristallizzabile delle IgE (Fc epsilon RII), ed
esiste in due forme diverse, dette Fc epsilon RIIa e Fc epsilon RIIb, che si differenziano
per pochi amminoacidi della sequenza intracitoplasmatica [711]. L’antigene CD23 può
esistere anche in forma solubile, ed è probabile che in tale veste eserciti un ruolo
autocrino.
L’antigene CD23 nella forma Fc epsilon RIIa è espresso da un subset di B linfociti
presente nel sangue periferico e nei centri proliferativi del linfonodo [712]. E’ coespresso
(assieme a CD1c, CD5, e CD38) sulla maggior parte dei B linfociti del sangue cordonale,
nonché del sangue periferico di alcuni soggetti, tra cui i neonati, alcuni soggetti in età
infantile affetti da SCID, e i soggetti sottoposti a trapianto di midollo autologo o
allogenico, limitatamente al primo anno post-trapianto [23] [20].
L’antigene CD23 nella forma Fc epsilon RIIb è stato segnalato su monociti, sulle
cellule dendritiche e sugli eosinofili [711]. L’antigene è stato segnalato anche su T
linfociti attivati con PHA o PMA [713] [714] [715], e sarebbe espresso anche sulle cellule
stromali del midollo osseo [716].

ASPETTI CITOMETRICI

Non tutti gli anticorpi anti CD23 si comportano allo stesso modo. In alcune prove
eseguite con tecniche immunoistochimiche su sezioni congelate di tonsilla e linfonodo
normali, gli anticorpi anti CD23 potevano essere raggruppati in tre categorie diverse a
seconda della loro reattività, che nel primo gruppo appariva rivolta verso cellule
endoteliali, cellule della zona mantellare e cellule del centro germinativo (cloni BU-38,
BLAST2 e HD50), nel secondo gruppo verso cellule della zona mantellare e del centro
germinativo (cloni H107 e MHM6), e nel terzo gruppo solamente verso cellule del centro
germinativo (clone Tu1) [717]. Pur non esistendo prove eseguite con sospensioni
cellulari, è verosimile che una certa quale eterogeneità di comportamento si verifichi
anche in citometria a flusso.
Esistono in letteratura segnalazioni che gli anticorpi anti CD23 possono legarsi in
modo non specifico ai monociti [47]. La determinazione di CD23 nella diagnostica delle
neoplasie delle cellule B mature dovrebbe essere sempre eseguita consensualmente a
quella dell’antigene CD19, meglio ancora all’interno di un’analisi multiparametrica che
investighi consensualmente CD5.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori B e T

L’espressione di CD23 non è stata riportata nelle leucemie dei precursori B e T


[32] [34] [718].

73
Leucemie mieloidi acute

In una casistica di AML l’espressione di CD23 è stata dimostrata nel 30% dei casi
circa [718].

Neoplasie delle cellule B mature

Lo studio dell’antigene CD23 è importante nella diagnostica delle sindromi


linfoproliferative croniche della serie B, perché permette di distinguere tra la leucemia
linfatica cronica (B-CLL) e il linfoma mantellare (MCL). Ambedue queste malattie
linfoproliferative coesprimono gli antigeni CD5 e CD19, ma solo la B-CLL è positiva per
CD23 [719] [720]. Va comunque sottolineato il fatto che nel caso del linfoma mantellare
l’antigene CD23 può non essere completamente assente, ed è talora espresso a bassa
intensità [721] [722]. L’intensità di espressione di CD23 sui linfociti della B-CLL è
variabile, ma generalmente più intensa di quella riscontrabile sui B linfociti normali, ed è
particolarmente intensa sulle cellule prolinfocitoidi [723]. L’intensità di espressione di
CD23 sulle cellule della B-CLL secondo alcuni autori sarebbe indicativa di prognosi
favorevole [724], mentre secondo altri correlerebbe invece con la presenza di
ipogammaglobulinemia, con pattern sfavorevoli di infiltrazione del midollo osseo, e con
pregressi trattamenti chemioterapici [725]. La B-CLL atipica sembrerebbe esprimere
CD23 con intensità maggiore di quella riscontrabile nella B-CLL tipica [726]. La
positività per CD23 sembra mantenuta anche nella trasformazione a grandi cellule della
B-CLL, mentre per contro non sarebbe riscontrata sulle cellule della variante blastica del
linfoma mantellare (BVMCL) [727]. La leucemia prolinfocitica a B linfociti (B-PLL)
sembrerebbe negativa per CD23 [261]. Mentre il linfoma della zona marginale (MZL) è
positivo per CD23 solo sporadicamente [267], l’espressione di CD23 è invece frequente
nel linfoma follicolare (FL), ed è stata segnalata in una percentuale fino a un terzo dei casi
osservati [728]. Una linfocitosi caratterizzata da positività per CD23 in assenza di CD5 e
CD11c potrebbe essere considerata compatibile con l’ipotesi di linfoma follicolare
leucemizzato anche in assenza di CD10, antigene considerato caratteristico di questa
entità nosografica, ma in realtà espresso in modo irregolare e incostante. In una casistica
consistente di 68 casi di leucemia a cellule capellute (HCL), l’antigene CD23 è stato
segnalato su più del 20% degli elementi nel 21% dei casi [202].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD23 non è stata riportata nelle neoplasie delle cellule T mature
[32] [34].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD23 è stato evidenziato con metodiche immunoistochimiche nelle


cellule di un caso di sarcoma a cellule follicolari dendritiche [241], e sembra debolmente
espresso sulle cellule di alcuni casi di linfocitosi persistente a B linfociti (PLBL) [288].

74
L’ANTIGENE CD24

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD24 è una sialoglicoproteina “PI-linked” del peso di circa 42 kD


[729] codificata da un gene presente sul cromosoma 6 [730], e funge da ligando per la
Selectina P [731]. L’antigene CD24 è un antigene B-associato, ma è assente sulle cellule
pro-B [732] e sulle plasmacellule [733], anche se sembra che le plasmacellule esprimano
l’epitopo riconosciuto dal MoAb HB8 [732]. L’antigene CD24 è presente sia sulla
membrana che nel citoplasma dei granulociti [734] [732] [735].

ASPETTI CITOMETRICI

La marcatura di linfociti periferici normali con un MoAb anti CD24 produce


generalmente istogrammi di positività dall' aspetto monomodale, con un canale di picco
indicativo della presenza di un numero di siti leganti valutabile attorno ai 39±2 E03 per
cellula [67]; un’analisi multiparametrica di sangue midollare normale condotta per CD19
e CD45 permette di visualizzare la presenza di due cluster positivi per CD24, uno a
elevata espressione dell’antigene (240.000 molecole per cellula) relativo ai precursori dei
B linfociti, e l'
altro a espressione più bassa (40.000 molecole per cellula) corrispondente
alle cellule mature [736]. Nel linfonodo l’antigene CD24 è espresso in modo
particolarmente intenso sulle cellule del mantello e della zona marginale, ma è invece
debole su quelle del centro germinativo [737] [732].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

L’espressione di CD24 è di regola assente nelle leucemie dei precursori T [32]


[34], ma è stato segnalato in un isolato caso di T-ALL [738].

Leucemie dei precursori B

L’espressione di CD24 è generalmente ma non costantemente presente nelle


leucemie dei precursori B [32] [34], dove è espresso a un’intensità tipicamente più
elevata di quella rilevabile sui B linfociti maturi [736]. L’assenza di CD24 su almeno una
quota degli elementi è associata alla presenza della traslocazione t(4;11) [739].

Leucemie acute mieloidi

L’espressione di CD24 è stata segnalata nelle leucemie acute mieloidi, dove


appare inaspettatamente correlata alle forme AML-M4 e AML-M5 con una specificità
pari ma una sensibilità superiore a quella espressa da CD14 [740]. E’ nota l’insorgenza di
una leucemia monoblastica a fenotipo ibrido (CD13+, CD14+, CD15+, CD9+, CD10+,
CD22+, CD24+, CD37+, CD5+ e CD4+) in un soggetto affetto da B-CLL [741].

75
Neoplasie delle cellule B mature

L’espressione di CD24 è di regola presente nelle neoplasie delle cellule B mature,


ma è stata descritta come assente o debole sulle cellule della leucemia a cellule capellute
(HCL) [742] [732], della leucemia a cellule capellute variante giapponese (HCL-J) [743],
del linfoma a cellule monocitoidi (MBCL) [744], e dei linfomi della zona marginale
(MZL) [34]. L’assenza o la bassa espressione di CD24 su neoplasie considerate derivanti
da cellule B attivate concorda con il fatto che l’attivazione in vitro di B linfociti con PMA
o SAC down-regola l’espressione dell’antigene [745].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD24 è di regola assente nelle neoplasie delle cellule T mature,


ma è stata selettivamente segnalata malattia di Sézary (SS) [746].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD24 è stato dimostrato sulla membrana di un subset midollare di


precursori mieloidi in soggetti affetti da CML [747]. L’antigene CD24 è stato dimostrato
congiuntamente a CD19 in un caso di CMML [430]. Analogamente al comportamento
delle altre molecole legate mediante fosfatidil-inositolo (CD14, CD16, CD55 CD59,
CD67, etc.), l’espressione del CD24 sui granulociti (ed in alcuni casi anche sui linfociti)
di alcuni pazienti affetti da emoglobinuria parossistica notturna può essere ridotta [563].
L’antigene CD24 è stato inoltre evidenziato con tecniche immunoistochimiche sulla
membrana delle cellule della istiocitosi a cellule di Langerhans (LCH) [49]. L’antigene
CD24 è espresso anche dalle cellule del neuroblastoma [748].

L’ANTIGENE CD25

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD25 è una glicoproteina di 55 kD, codificata da un locus presente sul
cromosoma 10 [749], e costituisce la catena alfa del recettore per l’interleuchina 2.
L’antigene è presente:
i) sui T linfociti periferici non stimolati, dove è rilevabile su di una
percentuale che può arrivare fino a più di un terzo circa di tutti i T linfociti
[754], con una particolare predilezione per le cellule T CD4+ negative per
CD45RA [755];
ii) sui T linfociti stimolati con mitogeni o con antigeni [750] [751], sulla cui
membrana compare 24 ore circa dopo lo stmolo, ed è enacor arilevabile
dopo 96 ore sul 94% circa degli elementi [493];
iii) sui B linfociti sia non stimolati [752] che stimolati con mitogeni e con
anticorpi anti-immunoglobuline [753];
iv) sui monociti, sui basofili e sugli eosinofili [184] [424].

76
ASPETTI CITOMETRICI

L’evidenziazione citometrica di CD25 è talora difficile. A differenza dei T


linfociti attivati con mitogeni, che esprimono sulla membrana un elevato numero di
recettori, le cellule T CD25+ normalmente presenti nel comparto periferico tendono ad
esprimere l’antigene CD25 debolmente, e spesso è problematico valutare con accuratezza
le percentuali di positività, che dipendono sia dal clone usato che dal fluorocromo
coniugato all’anticorpo.
In casi eccezionali, l’antigene CD25 può non essere espresso in membrana, ma
può essere presente nel citoplasma [756]; in tale evenienza la dimostrazione dell’antigene
può richiedere l’esecuzione preliminare di procedure di permeabilizzazione.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie acute

L’espressione di CD25 sui blasti della leucemia acuta correla con la presenza del
trascritto di fusione bcr/abl [757]. L’antigene CD25 è espresso nel 30% dei casi di AML,
con una particolare predilezione per i sottotipi M4 e M5 [758].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD25 è espresso in circa il 50% delle malattie linfoproliferative


croniche della serie B [759], e sugli elementi della leucemia a cellule capellute (HCL)
[760] [761] [762] [270], ma non su quelli della HCL variante (HCLv) [763] [764] [408].
Sono noti eccezionali casi di HCL in cui l’antigene non era evidenziabile sulla membrana,
ma poteva essere dimostrato nel citoplasma, e compariva in membrana dopo coltura in
vitro in presenza di interferone alfa [756]. E’ interessante osservare che sia la HCL
classica che la HCL variante sono positive per CD122, la catena beta del recettore per IL2
[763] [764].
Secondo alcuni Autori, l’espressione di CD25 sulle cellule della B-CLL riveste
significato prognostico negativo [498]. L’antigene CD25 è anche espresso sugli elementi
del 25% dei casi di linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL) [415], e sugli elementi del
50% dei casi di linfoma mantellare di aspetto blastico (BVMCL) [399].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD25 è di solito costante ed elevata nella leucemia/linfoma a


cellule T dell’adulto (ATLL) [765] [766], ma è generalmente assente nella sindrome di
Sézary (SS), nella malattia linfoproliferativa dei T linfociti granulati (T-LDGL), e nella
leucemia prolinfocitica a cellule T (T-PLL) [767], [344] [32] [286] [768]. Sono
comunque noti rari casi di T-PLL positivi per CD25 [769].
L’antigene CD25 è spesso espresso assieme ad altri antigeni di attivazione sulla
superficie delle cellule dei linfomi T periferici (PTCL), con particolare predilezione per le
forme ad alto grado [107] [108] [770] [771] [349].

Neoplasie delle cellule NK

L’espressione di CD25 è di regola assente nella malattia linfoproliferativa dei


linfociti NK [772].

77
Altre entità nosografiche

L’antigene CD25 è espresso dalle cellule dell’istiocitosi a cellule di Langerhans


(LCH) [773] ma non dalle cellule di Langerhans normali [774]. L’antigene CD25, assente
sulle mast-cellule normali, è espresso assieme a CD2 sulla membrana delle mast-cellule
neoplastiche in corso di mastocitosi sistemica [115]. L’antigene CD25 è intensamente
espresso nella cosiddetta leucemia acuta basofila, un entità nosografica spesso confusa
con la AML-M0, per la quale è stato proposto un inserimento nella classificazione FAB
con la denominazione di AML-M8 [775].

L’ANTIGENE CD27

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD27 è un dimero legato da un ponte disolfuro pesante circa 55 kD


appartenente alla superfamiglia dell’NGF, ed è codificato da un locus presente sul
cromosoma 12 [776]. L' antigene CD27 esercita un’attività co-stimolatrice sui T linfociti,
ed è il ligando della molecola CD70. L’antigene CD27 è presente sulla maggior parte dei
T linfociti periferici e dei timociti midollari, ed è up-regolato dall’attivazione [777], ma si
negativizza dopo attivazione prolungata [778]. L’antigene CD27 è espresso anche dai B
linfociti dei centri germinativi [779] [780] e da un terzo dei B linfociti periferici [781], ma
non sui B linfociti del sangue cordonale [781] o sui B linfociti “naive” [780]. Nei B
linfociti l’espressione dell’antigene CD27 sembra ristretta alle cellule capaci di produrre
immunoglobuline; in particolare i B linfociti sIgD+ CD27+ sono in grado di produrre
IgM, mentre i linfociti sIgD- CD27+ producono IgG [782], e i linfociti tonsillari CD27+
sIgM-/sIgD- producono IgA [781]. I B linfociti positivi per CD27 esprimono elevati
livelli di molecole di adesione come CD11a, CD54 e CD58, ed elevati livelli di CD44
[781].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD27 sembra selettivamente espresso dai B linfociti che sono passati
attraverso il processo di ipermutazione somatica, ovvero a cui è stato presentato
l’antigene a livello degli organi linfatici secondari [783] [784] [785] [786]. L’antigene
CD27 è di solito presente sulle cellule della leucemia linfatica cronica (B-CLL), ed è
espresso a una intensità di circa 98±27 E03 molecole per cellula, un valore analogo a
quello riscontrabile sui linfociti T e B normali [787], L’antigene CD27 sembra espresso
con particolare intensità dagli elementi del linfoma a cellule mantellari (MCL) [788].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD27 è stato segnalato sulle cellule della linfocitosi policlonale a B


linfociti (PPBL) [789].

78
L’ANTIGENE CD30

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD30 è un polipeptide di circa 120 kD, codificato da un gene presente


sul cromosoma 1 [790] [791]. L’antigene CD30 appartiene alla famiglia dei recettori del
TNF, e agisce come ligando per l’antigene CD153, che costituisce un altro membro della
stessa famiglia [792]. L’antigene CD30 si comporta come un antigene di attivazione, e
può comparire dopo stimolazione sia sulla membrana dei linfociti T che sulla membrana
dei linfociti B [793] [794] [791]. In particolare, l’antigene CD30 compare sulla
membrana dei T linfociti 2 ore circa dopo stimolazione con PHA, e dopo 96 ore è
presente sul 30% circa degli elementi, con preferenziale espressione da parte delle cellule
CD4+ [493].
L’antigene CD30 in condizioni normali è assente dalla superficie dei linfociti
presenti nel sangue periferico, ma cellule T CD30+ sono state segnalate nel periferico di
soggetti affetti da dermatite atopica [795] e da infezione primaria da HIV [796], nei
linfonodi di soggetti affetti da sindrome di Omenn [797], e nei linfonodi di un soggetto
affetto da linfoadenopatia da carbamazepina [798]. La sua espressione su cloni di cellule
T CD4+ è stata inizialmente correlata alla capacità di produrre citochine di tipo Th-2
[799], ma secondo studi successivi non sembra in grado di discriminare tra cellule CD4
Th-1 e Th-2 [800].
L’antigene CD30 può comparire anche nei macrofagi [801], e nel corso di
patologie di tipo reattivo è stato documentato con metodiche di tipo immunoistochimico
nelle plasmacellule, negli immunoblasti, nelle cellule interdigitate, nelle cellule del
centro follicolare, e negli istiociti [802]. L’antigene CD30 è espresso sugli elementi di
linee cellulari infettate con EBV [803], e sulle cellule NK coltivate in vitro [804].

ASPETTI CITOMETRICI

Secondo isolate segnalazioni reperibili sul Web e non sottoposte a “peer-review”,


la determinazione citometrica dell’antigene CD30 effettuata su cellule in sospensione
mediante il MoAb Ber-H2 si gioverebbe della preventiva permeabilizzazione del
campione [805] [806], ed è stato anche riportato in letteratura che in una serie di linfomi
CD30+ la ricerca dell’antigene effettuata con metodiche immunoistochimiche risultava
positiva in una percentuale di casi superiore a quella ottenuta con metodiche citometriche
[47]. Queste osservazioni si accordano con il fatto che l’antigene CD30, oltre che
espresso in membrana, è presente anche nel citoplasma a livello dei corpi di Golgi [807].
Va poi anche ricordato che la ricerca dell’antigene CD30 effettuata con il MoAb Ki-1
evidenzia l’esistenza di due forme diverse, la prima del peso di 120 kD (Ki-1/120) legata
alla membrana cellulare, e la seconda del peso di 57 kD (Ki-1/57) limitata al comparto
intracitoplasmatico [808]. Studi successivi hanno però dimostrato che l’antigene Ki-1/57
è codificato da un gene presente sul braccio lungo del cromosoma 9 [809], e pur
cross-reagendo con gli anticorpi specifici per CD30 dovrebbe essere considerato un
antigene completamente diverso.

79
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

L’antigene CD30 non è segnalato nelle leucemie dei precursori T [207]. E’ noto
tuttavia un caso di leucemia acuta T/NK le cui cellule coesprimevano fenotipo CD2+,
cyCD3+, CD4+, CD13+, CD33+, CD56+, CD19+ e CD30+ [36].

Leucemie dei precursori B

L’antigene CD30 non è segnalato nelle leucemie dei precursori B [207].

Leucemie acute mieloidi.

A differenza del suo ligando CD30L, l’antigene CD30 non è segnalato nelle
leucemie acute mieloidi [810]. Esiste comunque in letteratura una segnalazione che
attribuisce l’espressione di CD30 alle leucemie acute mieloidi insorte nel corso di
sindrome mielodisplastica [811], e una segnalazione riguardante un caso di sarcoma
granulocitico, successivamente evoluto in leucemia mieloide acuta, in cui all’analisi
immunoistochimica le cellule neoplastiche risultavano positive per l’antigene CD30
[812].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD30 è stato descritto sulle cellule della HCL variante (HCLv) [788],
sulle cellule della sindrome di Richter “Reed Sternberg-like” [583] [584], e sulle cellule
di alcune varietà di linfoma diffuso a grandi cellule (DLBCL) [813], con particolare
preferenza per le forme positive per EBV [814], per il linfoma anaplastico B, per il
linfoma B mediastinico a grandi cellule [815], e per il linfoma primitivo delle sierose
(PEL) [816]. L’antigene CD30 è stato segnalato anche nelle plasmacellule neoplastiche
in alcuni casi di mieloma multiplo (MM) [817] [802], in un isolato caso di non meglio
precisato B-NHL a piccole cellule [802], e in alcune sottopopolazioni cellulari di casi
altrimenti tipici di linfoma follicolare (FL) [818].

Neoplasie delle cellule T mature

La costante espressione dell’antigene CD30, unitamente alla presenza di


particolari caratteristiche morfologiche e architetturali, ha permesso l’individuazione di
una particolare entità nosografica [803], attualmente sistematizzata dalla classificazione
WHO come “linfoma anaplastico a grandi cellule” (ALCL) [485].
Ancorché l’antigene CD30 ne costituisca il principale marcatore, il linfoma
anaplastico a grandi cellule non è l’unica entità nosografica in grado di esprimerlo.
L’antigene CD30 è stato segnalato nei linfomi non Hodgkin della serie T diversi dal
linfoma anaplastico [819] [820] con particolare preferenza per le forme ad alto grado
[802], e nei linfomi cutanei a cellule T (CTCL) , dove sembrerebbe correlare con la
presenza di proteine citotossiche [821]. L’antigene CD30 è stato dimostrato sui linfociti
della malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati sia a cellule T che a cellule NK (T e
NK-LDGL) [822] e in un caso di leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL) [823].

80
Altre entità nosografiche

L’antigene CD30 è stato segnalato nelle cellule della papulosi linfomatoide [821]
[824], nonché nel linfoma istiocitico vero (THL) nella istiocitosi maligna [801] [802].
L’antigene CD30 è stato anche ripetutamente dimostrato in casi di ALCL che erano da un
lato negativi per l’espressione di antigeni T-associati e per il riarrangiamento dei geni del
TCR, dall’altro positivi per l’espressione di antigeni tipici dell’istiocita-macrofago, quali
l’alfa-1-chimotripsina, l’alfa-1-antitripsina, e l’antigene CD68 [825]. Questi casi
dovrebbero probabilmente essere considerati linfomi istiocitici “veri” (THL).
L’antigene CD30 è espresso sulle cellule del carcinoma embrionale [826], ed è
dimostrabile con metodiche immunoistochimiche in una quota di tumori mesenchimali
[827].

L’ANTIGENE CD33

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD33 è un polipeptide di 67 kD codificato da un gene presente sul


cromosoma 19 [828]. La sua espressione è caratteristica della linea mieloide, ed è
particolarmente vivace sui monociti e sui basofili [184] [545] [424]. L’antigene è
presente anche sui precursori mieloidi, e segnatamente su metamielociti, mielociti,
promielociti, mieloblasti e CFU-GM, ma non sui precursori più immaturi [829] [830].
Sulla linea mieloide la sua intensità di espressione tende a diminuire progressivamente
durante la maturazione, fino a divenire molto debole sui neutrofili.
L’antigene CD33 compare sui precursori mieloidi CD34+ dopo la comparsa di
CD13 [508], sicché la presenza di una popolazione CD13+ CD33- CD34+ è normalmente
rilevabile nel sangue cordonale e nel sangue midollare.
L’antigene CD33 è stato segnalato anche sulle cellule dendritiche [506], sulle
mast-cellule cutanee [831], e sul 18 % dei precursori delle cellule B CD19-, CD79a+,
TdT+ [296], e può essere indotto su cellule T CD3+ provenienti da soggetti normali
[832].

ASPETTI CITOMETRICI

Da un punto di vista citometrico non tutti gli anticorpi anti CD33 si comportano
nello stesso modo. Esiste al contrario una notevole variabilità, legata sia al fatto che cloni
diversi riconoscono presumibilmente epitopi diversi, sia al fatto che il tipo di fluorocromo
adottato nella coniugazione condiziona fortemente la valutazione dell’intensità di
espressione dell’antigene. Questa situazione ostacola la reale valutazione dell’intensità di
espressione del marcatore, e sottolinea l’importanza di procedere a una standardizzazione
delle procedure [512].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

L’antigene CD33 (come peraltro anche CD13) è espresso o inducibile sui


linfoblasti di una piccola percentuale di T-ALL [518] [80] [833], con particolare
predilezione per i casi con fenotipo CD7+, CD5-, CD2-, e con fenotipo CD7+, CD5+,
CD2- [515]. In una casistica costituita da 48 T-ALL l’espressione di CD33 sarebbe stata
dimostrata in circa il 51% dei casi, e correlerebbe con l’assenza di CD3 [464].
81
Nelle T-ALL pediatriche l’espressione di CD33, come pure quella di altri antigeni
mieloidi, non sembra rivestire particolare significato prognostico [517 ][463] [514],
ancorché appaia associata a specifiche anomalie genetiche, come ad esempio il
riarrangiamento dei geni ETV6 o MLL [517]. Anche nei casi dell’adulto l’espressione di
CD33 sembra priva di significato prognostico [833] [516].

Leucemie dei precursori B

L’antigene CD33 è stato segnalato in una consistente percentuale di casi di


leucemia dei precursori B [518] [553] [80] [833], dove però non sembra possedere
significato prognostico, né nei casi dell’età adulta né nei casi pediatrici [833] [516] [519]
[517] [463] [514]. Nelle leucemie dei precursori delle cellule B dell’adulto la presenza di
CD33 e/o di CD13 è associata al fenotipo CD10+ CD20-, all’espressione di CD34 e alla
delezione del cromosoma 7, ma non alla traslocazione t(4;11); controversa è
l’associazione con la traslocazione t(9;22) [480] [464]. Nelle leucemie dei precursori
delle cellule B del bambino l’espressione di antigeni mieloidi sembra invece associata al
riarrangiamento dei geni ETV6 o MLL [517].

Leucemie acute mieloidi

Insieme a CD13, CD65, CD117 e mieloperossidasi, l’antigene CD33 concorre a


costituire una rosa di marcatori il cui studio riveste grandissima importanza nella
diagnostica immunologica delle leucemie acute. Esiste infatti una convenzione formulata
dal Gruppo Europeo per la Caratterizzazione Immunologica delle Leucemie (EGIL),
secondo la quale l’espressione di due di questi marcatori rappresenta requisito sufficiente
per l’attribuzione di una leucemia acuta alla linea mieloide [33] [524] [525].
L’antigene CD33 è espresso nella maggioranza dei casi di leucemia acuta
mieloide sia dell’adulto che del bambino [834] [835] [510] [526] [80], con frequenze che
a seconda delle casistiche arrivano fino al 95% dei casi considerati [83]. Secondo alcuni
Autori l’espressione di CD33 rivestirebbe un importante significato prognostico
favorevole [836]; secondo altri Autori il favorevole andamento clinico dei casi positivi
per CD33 sarebbe ristretto a quei casi che oltre a CD33 esprimerebbero
contemporaneamente anche gli altri antigeni mielodi CD13, CD65, CD117 e MPO
(fenotipo panmieloide) [525]. La negatività per CD33 sembra associata a piastrinopenia
[554]; la negatività per CD33 associata a positività per CD13 sembra particolarmente
frequente nella forma AML-M0 [90].

Neoplasie delle cellule B mature

L’espressione di CD33, come quella di altri marcatori della linea mieloide


(CD11b, CD11c, CD14, CD13 e CD15), è stata segnalata nella leucemia linfatica cronica
(B-CLL) [478] [480] [481]. L’antigene CD33 è stato segnalato anche sulle cellule della
leucemia a cellule apellute (HCL) [529] e di una bassa percentuale di casi di mieloma
multiplo (MM) [680].

82
Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD33 non è generalmente segnalato nelle neoplasie delle cellule T


mature [834]. E’ noto un caso di neoplasia delle cellule T periferiche, diagnosticato come
T-PLL, che esprimeva CD33 [535]. Il caso in oggetto presentava comunque diverse
anomalie fenotipiche (cyCD3+, HLA-DR+, CD38+, CD7+, CD56+, CD13+, CD34+,
CD65+, assenza di TCR, assenza di marcatori T associati e assenza di marcatori B
associati) che ne rendevano problematico il reale inquadramento.

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD33 non è espresso dalle cellule della malattia linfoproliferativa dei
linfociti granulati a cellule NK (NK-LDGL) [624], né da quelle dei linfomi nasali e
“nasal-type” [633], ma la sua presenza è descritta nelle neoplasie dei precursori. In tal
senso l’antigene può essere espresso dalle cellule della cosiddetta “Myeloid/natural killer
cell precursor acute leukemia” segnalata da Suzuki [634], dalle cellule della cosiddetta
"myeloid/NK acute leukemia" segnalata da Scott [636], e dalle cellule del cosiddetto
“linfoma blastico a cellule NK” [228] [837] [234].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD33 è stato segnalato sui blasti della cosiddetta “malattia


mieloproliferativa transitoria” (TMPD), che compare nei neonati con sindrome di Down
[838] [173].

L’ANTIGENE CD34

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD34 è un polipeptide del peso di 105-120 kD codificato da un gene


presente sul braccio lungo del cromosoma 1 [839], ed è espresso sulle cellule endoteliali,
sui precursori emopoietici, e sugli stadi più immaturi delle linee B, T, e mieloide [840]
[841]. In particolare, le cellule CD34 comprendono le CFU-M, le CFU-GM, le CFU-G, le
BFU-E, e le CFU-E, e costituiscono una rilevante percentuale delle cellule ancora più
immature formanti colonie [842] [843]. I precursori dei B linfociti normali con fenotipo
CD10+, CD19+, CD20-, CD45±, sono generalmente positivi per CD34 [844] [845]. In
condizioni normali le cellule CD34 possono essere evidenziate nel sangue cordonale,
nonché nel midollo osseo e nel sangue periferico, dove costituiscono rispettivamente
circa l’1,5% e lo 0,1-0,01% degli elementi [845] [846].
La popolazione midollare CD34+ non costituisce una popolazione omogenea, ma
risulta costituita da diverse sottopopolazioni immature accomunate dall’espressione
dell’antigene. Tutte le cellule midollari positive per TdT sono generalmente comprese
all’interno delle cellule CD34+ [844]. Le cellule CD34 sono generalmente CD45 positive,
ma esprimono questo antigene ad un’intensità minore di quella presente sui linfociti
maturi [847].

83
ASPETTI CITOMETRICI

Sull’antigene CD34 sono presenti almeno 3 diversi epitopi, distinguibili fra di


loro in funzione della sensibilità ad alcuni enzimi. In particolare l'
epitopo I è sensibile alla
neuroaminidasi, alla chimopapaina e alla glicoproteasi della Pasteurella haemolytica,
l'
epitopo II è resistente alla neuroaminidasi, ma sensibile a chimopapaina e glicoproteasi,
e l’epitopo III è resistente a tutti e tre gli enzimi [848].

CLASSIFICAZIONE DI ALCUNI MoAb ANTI CD34


IN FUNZIONE DELL’EPITOPO RICONOSCIUTO
clone classe Clone classe
IMMU-133 I 43A1 II
IMMU-409 I 4A1 II
14G3 I QBEND-10 II
My-10 (HPCA-1) I 12.8 III
BI.3C5 I BIRMA-K3 III
547 I CD34-9F2 III
ICH3 I 8G12 (HPCA-2) III
9C5 II TUK3 III

La maggior parte degli anticorpi anti CD34 può essere distinta in tre classi
differenti in funzione dell’epitopo verso cui viene dimostrata specificità; tale
subclassificazione riveste grande importanza pratica, in quanto anticorpi di classe diversa
possono presentare comportamenti diversi. E’ noto infatti che:
i) sia nel midollo osseo normale che in quello leucemico la percentuale di
cellule CD34+ e l’intensità di espressione dell’antigene riscontrabili
all’analisi citometrica variano in funzione dell’anticorpo usato [849];
ii) alcuni anticorpi dimostrano particolare specificità per l’antigene CD34
espresso dalle cellule normali, altri per quello espresso sui blasti delle
ALL, altri ancora per quello delle AML, e per finire altri ancora per quello
delle CML in crisi blastica [849];
iii) i migliori anticorpi per l’esplorazione dell’antigene CD34 finalizzata alla
monitorizzazione della mobilizzazione dei precursori emopoietici sono gli
anticorpi di classe III coniugati con il fluorocromo ficoeritrina [850];
iv) nell’impossibilità di adottare coniugati con ficoeritrina, il fluorocromo
PE/CY5 costituirebbe una valida alternativa [851]; più critico appare
invece l’uso della coniugazione con FITC, non solo per la sua minore
efficienza quantica, ma soprattutto perché negli anticorpi di classe II la
coniugazione con questa molecola può risultare in un aumento della carica
netta negativa in grado di interferire con la capacità di legame [852] [853].

84
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori B.

L’antigene CD34 è presente su circa il 70% di tutte le leucemie acute dei


precursori della serie B (B-ALL) [835] [854]. La sua intensità di espressione è variabile
da caso a caso, e sembra predittiva per la presenza di particolari anomalie cromosomiche
[846].

Correlazione tra intensità di espressione di CD34 e presenza di determinate


anomalie cromosomiche nelle leucemie dei precursori B.
intensità di CD34 anomalia cromosomica espressione di CD10
espressa in MESF
<700 (negativa) t(1;19) positiva
4800 (nel 50% dei casi) t(4;11) negativa
5100 (espressione t(12;21) positiva
bimodale)
8300 cariotipo iperdiploide positiva
38000 t(9;22) positiva

Leucemie dei precursori T.

L’antigene CD34 è presente sulle cellule di una quota variabile (5-20%) di tutte le
leucemie acute dei precursori della serie T [855] [392], con preferenziale espressione
nelle forme a fenotipo più immaturo [856].

Leucemie acute mieloidi.

L’antigene CD34 è presente su di una percentuale di leucemie acute mieloidi


(AML) variabile dal 25 all’65% circa a seconda delle varie casistiche [835] [80] [846].
Per quanto concerne i rapporti tra espressione di CD34 e sottotipi FAB, l’antigene CD34
comparirebbe nel 90-100% dei casi di AML-M0, nel 70-90% dei casi di AML-M1, nel
20-40% dei casi di AML-M2, nello 0-5% dei casi di AML-M3, nel 20-60% dei casi di
AML-M4, nel 50-80% dei casi di AML-M5a, nel 10-30% dei casi di AML-M5b, nel
20-40% dei casi di AML-M6, nel 40-60% dei casi di AML-M7, e nel 90-100% dei casi di
leucemia bifenotipica [838] [857] [858] [859] [846].
Un’intensa coespressione di CD34 accompagnata da CD19 e CD56 è considerata
caratteristica della AML-M2 con traslocazione t(8;21) [645] [860] [861], mentre la sua
presenza in assenza di CD38 è tipica della AML-M0, e viene considerata prova della
elevata immaturità delle cellule clonogeniche [862].
L’espressione di CD34 è stata associata a un cattivo andamento clinico [863] [554] [864]
[557] [865]; tuttavia secondo studi più recenti la presenza di CD34 non dovrebbe essere
considerata “ipso facto” correlata a cattiva prognosi [866] [836] [867] [868], ma
dovrebbe essere valutata all’interno di definiti sottogruppi di pazienti, come quelli affetti
da AML-M2 con t(8;21), da AML-M3 con t(15;17), o da AML-M0 [869].

85
Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD34 è generalmente assente nelle neoplasie delle cellule B mature


[870].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD34 è generalmente assente nelle neoplasie delle cellule T mature


[870]. E’ comunque noto un caso diagnosticato come T-PLL che esprimeva CD34 [535].
Il caso in oggetto presentava comunque diverse anomalie fenotipiche (cyCD3+,
HLA-DR+, CD38+, CD7+, CD56+, CD13+, CD33+, CD65+, assenza di TCR, assenza di
antigeni T-associati, assenza di antigeni B-associati) che ne rendono problematico il reale
inquadramento nosografico.

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD34 è stato segnalato sulle cellule ad abito blastico di un linfoma a


cellule NK [871].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD34 è segnalato anche sui blasti delle sindromi mielodisplastiche


[872] [873] e della leucemia mieloide cronica in fase blastica [874]. Lo studio di CD34
eseguito congiuntamente a quello di CD11b, CD11c e CD15, antigeni normalmente
espressi da cellule in stadi più avanzati di maturazione, può essere utile nella
evidenziazione di asincronismi maturativi.
L’antigene CD34 è stato segnalato sui blasti della cosiddetta “malattia
mieloproliferativa transitoria” (TMPD), che compare nei neonati con sindrome di Down
[838] [173].
L’antigene CD34 è espresso nelle cellule dei tumori filloidi [875] e nelle cellule
delle neoplasie di origine vascolare [876].

L’ANTIGENE CD38

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD38 è una glicoproteina di 46 kD, codificata da un locus presente sul
cromosoma 4 [570]. L’espressione dell’antigene è quanto mai varia in quanto compare:
i) sui timociti corticali [570];
ii) sui T linfociti maturi stimolati con antigeni e con mitogeni come la PHA,
che ne evoca la comparsa entro 24 ore dalla stimolazione [493];
iii) sui precursori dei B linfociti, sui B linfociti maturi stimolati con mitogeni
e con anticorpi anti-immunoglobuline, sulle cellule del centro germinativo
(ma non sulle cellule del mantello) [877], e sulle plasmacellule [878]
[879];
iv) su di una sottopopolazione di cellule staminali CD34 e sui precursori della
serie mieloide fino allo stadio di mielocita, nonché sui basofili, sugli
eosinofili, e sulla maggior parte dei monociti [184] [545] [880] [424];
v) sulla maggior parte delle cellule NK [56];

86
vi) sulle cellule linfatiche del cordone ombelicale e del sangue periferico fino
ai primi 24-36 mesi di vita in una percentuale variabile dal 50 all’80 %
degli elementi [22];
vii) sulla maggioranza dei B linfociti periferici di soggetti affetti da alcuni tipi
di SCID [23];
viii) sui B linfociti dei soggetti sottoposti a trapianto di midollo autologo o
allogenico limitatamente al primo anno dal trapianto [20].

ASPETTI CITOMETRICI

Nel caso dell’analisi di campioni eterogenei, la vasta diffusione dell’antigene


CD38 ne rende obbligatoria l’esplorazione nel contesto di un’analisi multiparametrica, in
modo da restringere selettivamente la valutazione della sua espressione alla popolazione
cellulare di interesse diagnostico, definita a sua volta sulla base degli altri parametri
esplorati consensualmente. Un altro punto molto importante nella analisi dell’antigene
CD38 è la valutazione della sua intensità di espressione, che di per sé può costituire un
elemento fondamentale nella identificazione di determinate popolazioni cellulari, come
ad esempio quella costituita dalle plasmacellule.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T e B

L’espressione di CD38 è di regola presente nelle leucemie dei precursori T e B,


anche se appare più frequentemente espressa nelle leucemie dei precursori T [502] [881].
Nella leucemia acuta dei precursori B un’espressione di CD38 bassa ed eterogenea,
qualora riscontrata congiuntamente all’omogenea coespressione di CD10, CD13 e CD34,
sembra fortemente predittiva per la traslocazione t(9;22) [523]. Almeno nei casi
pediatrici l’espressione dell’antigene non sembra comunque associata a nessun
particolare comportamento clinico [881].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD38 è di regola presente nelle cellule della maggior parte delle
leucemie acute [882], eccezion fatta per i promielociti leucemici della AML-M3 [883], e
per i blasti CD34+ della AML-M0 su cui spesso non è riscontrato [862]. Nel caso delle
leucemie mieloidi acute diverse da AML-M3, l’assenza di CD38 in presenza di CD34
viene considerata prova della elevata immaturità delle cellule clonogeniche [862]. Nelle
AML l’espressione di CD38 è stata associata a basse conte piastriniche e a elevate conte
di blasti circolanti [472].

Neoplasie delle cellule B mature

Lo studio dell’antigene CD38 assume particolare importanza nella


caratterizzazione della B-CLL, in quanto, sebbene esistano pareri contrari [884] [885]
[886], la sua espressione sembra correlare con l’assenza di mutazioni somatiche a carico
dei geni per le regioni variabili delle immunoglobuline [887] [888], e comunque con una
prognosi peggiore [887] [884] [889] [890] [891] [885] [892] [893] [894] [895]. In
accordo con questi presupposti, la presenza di CD38 sembrerebbe meno rappresentata nei
casi di B-CLL con immunoglobuline di membrana di isotipo IgD+ IgM-, fenotipo
riconducibile a un subset di B linfociti normali caratterizzati dalla presenza di mutazioni

87
somatiche [896]. Altri Autori osservano tuttavia che l’espressione dell’antigene CD38,
oltre che con la progressione della malattia, correla con la massa tumorale, e di
conseguenza almeno nei pazienti agli stadi iniziali non sembra rivestire un significato
prognostico diverso da quello associato ai parametri già conosciuti [897].
L’antigene CD38 è regolarmente espresso dalle cellule della leucemia a
prolinfociti B (B-PLL) [898], del linfoma mantellare (MCL) [899], del mieloma multiplo
(MM) e della leucemia plasmacellulare (PCL) [404] [405], sulle quali è espresso con una
intensità caratteristicamente elevata. Nello studio delle neoplasie plasmacellulari,
l’espressione di CD38 può essere usata come marcatore neoplastico allo scopo di
restringere alle plasmacellule trasformate la determinazione di ulteriori parametri, come
ad esempio il contenuto di DNA, utilizzabile per valutazioni cinetiche o per l’analisi della
ploidia [900].
L’antigene CD38 è presente anche sulle cellule del linfoma follicolare (FL), ed è
più intensamente espresso negli elementi linfonodali che in quelli circolanti nel sangue
periferico [901].
In una casistica consistente in 68 casi di leucemia a cellule capellute (HCL),
l’antigene CD38 è stato segnalato su più del 20% degli elementi nel 44% dei casi [202],
mentre in una casistica di 100 casi di linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL) è stato
dimostrato nel 25% dei casi [415].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD38 è spesso presente nelle neoplasie dei T linfociti maturi


[770] [502].

L’ANTIGENE CD43

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD43, detto anche leukosialina o sialoforina, è una glicoproteina


altamente glicosilata del peso di circa 120 kD codificata da un locus presente sul
cromosoma 16 [902]. La sialoforina è presente virtualmente su tutti i monociti, eosinofili,
neutrofili e basofili circolanti, sulle mast-cellule cutanee [831], su tutti i T linfociti, su una
percentuale di cellule B periferiche variabile dal 5 al 10 % a seconda degli Autori [903]
[904], su circa un quarto dei B linfociti cordonali, su circa il 10-15 % dei B linfociti
tonsillari [905] [903], e sui precursori emopoietici CD34+ [902] [906], nonché sugli
eritroblasti e sui megacariociti [207].

ASPETTI CITOMETRICI

L’antigene CD43 viene espresso con particolare brillantezza sui granulociti e sui
T linfociti (anche fino a 1E5 molecole per cellula [907]), mentre sui B linfociti CD43+
viene espresso con minore intensità [903].

88
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T e B

L’espressione di CD43 è presente nella maggior parte dei casi di leucemia dei
precursori T o B [908] [909].

Leucemie acute mieloidi.

L’espressione di CD43 è presente nella maggior parte dei casi di leucemia acuta
mieloide [910], [909], [911], con l’eccezione della AML-M6, sulle cui cellule non
sembrerebbe espresso [207].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD43 è stato rilevato con metodiche immunoistochimiche su di una


minoranza (4%) delle neoplasie delle cellule B mature globalmente considerate [908].
Ad un’analisi citometrica, l’antigene CD43 appare generalmente covariare con
l’antigene CD5 [912], dato che è classicamente espresso sulla membrana delle cellule
della leucemia linfatica cronica (B-CLL) [912] [913] e del linfoma mantellare (MCL)
[912]. Va tuttavia ricordato che CD43, ancorché considerato generalmente assente nel
linfoma della zona marginale (MZL) [912], secondo alcuni Autori è espresso in assenza
di CD5 sulle cellule di una percentuale di casi variabile dal 10 al 50% a seconda delle
casistiche [914] [267], con una particolare associazione con le forme “non spleniche”
[915]. La presenza di CD43 non accompagnata da CD5 è stata segnalata in alcuni
disordini linfoproliferativi post-trapianto [903].
L’antigene CD43 è generalmente negativo sulle cellule del linfoma del centro
follicolare (FL) [912] e del linfoma linfoplasmacitico (LPL) [916] [917]. L’antigene
CD43 può essere espresso anche sulle cellule della leucemia plasmacellulare (PCL), ed è
stato sporadicamente segnalato sulla membrana di linfomi ad alto grado [912], tra cui due
casi di linfomi diffusi extranodali B a grandi cellule (DLBCL) [918].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD43 è stato rilevato con metodiche immunoistochimiche sulla


grande maggioranza delle neoplasie delle cellule T mature [908]. Gli antisieri anti CD43
sono stati considerati più significativi di UCHL1 nell’identificazione dei linfomi T
periferici, con particolare riguardo alla varietà a grandi cellule [919].

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD43 è stato rilevato sulla membrana delle neoplasie delle cellule NK
mature [920].

89
L’ANTIGENE CD45

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD45, noto anche come LCA o “leukocyte common antigen”, è


costituito da una grossa glicoproteina del peso di 240 kDa codificata da un gene presente
sul braccio lungo del cromosoma 1 [921]. La sua espressione è ristretta alle cellule
ematopoietiche mature e immature, con esclusione delle piastrine, dei megacariociti,
degli elementi appartenenti al comparto eritroide, della maggioranza delle plasmacellule,
e di isolati precursori emopoietici “alti” [922] [923]. Nel ratto, nel maiale, e nell’uomo,
l’antigene CD45 è costituito da diverse alloforme [924]; queste alloforme, che possono
consentire la distinzione sierologica tra molecole di antigene CD45 provenienti da
soggetti diversi appartenenti alla stessa specie, non devono essere confuse con le
isoforme CD45RA, CD45R0 e CD45RB, che verranno discusse successivamente.

ASPETTI CITOMETRICI

L’analisi della espressione di CD45, eseguita sulle cellule del sangue periferico
mediante un MoAb specifico per la sequenza condivisa da tutte le isoforme, permette
immediatamente di stabilire che ciascun citotipo esprime l’antigene con un’intensità
caratteristica. In particolare il calcolo dell’ABC (antibody binding capacity) evidenzia
valori di 36±16 E03 siti leganti sui polimorfonucleati, di 103±44 E03 sui monociti, e di
ben 217±64 E03 sui linfociti [67]. Questi valori rimangono costanti sui linfociti e sui
polimorfonucleati, ma sui monociti sembrano suscettibili di variazioni dipendenti da
particolari situazioni come ad esempio l’intenso allenamento fisico [925].
In funzione di questa caratteristica, è possibile risolvere le principali
sottopopolazioni leucocitarie del sangue periferico mediante l’analisi della sola bivariata
CD45 vs SSC. Estendendo l’analisi multiparametrica agli antigeni associati alla linea
mieloide, è possibile rilevare che il cluster dei polimorfonucleati basofili presenta
parametri fisici tipici dei linfociti, ma espressione di CD45 simile a quella dei
polimorfonucleati neutrofili [926]; tale espressione può essere down-regolata in seguito
ad attivazione indotta da allergeni o da altri mediatori [927].
Un’analisi biparametrica di un campione di sangue periferico eseguita per CD45 e
per SSC permette di individuare il cluster dei linfociti con maggiore accuratezza rispetto
ad un’analisi eseguita sui soli parametri fisici [928]. Esiste evidenza che i laboratori di
citometria che impostano l’analisi immunofenotipica dei linfociti sui soli parametri fisici
forniscono globalmente prestazioni peggiori di quelli che praticano l’analisi consensuale
di CD45 [929]. L’analisi contemporanea di CD45 e di SSC risulta particolarmente utile in
tutte le situazioni in cui la definizione del cluster dei linfociti sia resa difficile dalla
presenza concomitante di emazie non lisate, stromi, piastrine o debris, e nell’analisi di
campioni diversi dal sangue periferico, come sospensioni da linfonodo e da altri organi
solidi, o liquidi cavitari dove sia necessario escludere dall’analisi le cellule mesoteliali
esfoliate [930]. L’analisi consensuale di CD45 diviene praticamente obbligatoria
nell’analisi del sangue midollare, in cui è necessario evidenziare la presenza della
componente eritroide e di piccole popolazioni di cellule immature appartenenti sia alla
linea mieloide che alla linea linfoide [931] [932] [933] [934] [930]. Tutte queste
popolazioni, che sono dotate di parametri fisici compatibili con quelli dei mononucleati
piccoli o medio-piccoli, sono caratterizzate da una peculiare espressione di CD45, che è
assente o quasi assente sugli elementi della serie eritroide, mentre è espresso dalle cellule
immature con una intensità tipicamente ridotta rispetto a quella presentata dai linfociti
maturi [935]. Di conseguenza, un’analisi biparametrica di un campione di sangue

90
midollare eseguita per CD45 e per SSC permette di risolvere il citogramma in una serie di
regioni caratteristiche per determinate popolazioni cellulari. Nel citogramma di una tale
analisi è possibile riconoscere la regione 1, tipica per la componente eritroide, la regione
2, tipica per i precursori linfoidi e mieloidi, la regione 3, tipica per i linfociti maturi, la
regione 4, tipica delle cellule appartenenti alla linea monocitaria, e la regione 5, tipica
della componente mieloide maturante. E’ importante rilevare che la presenza del cluster
dei linfociti, con la sua espressione di CD45 tipicamente elevata e poco dispersa,
costituisce una specie di “standard interno” a cui riferire l’intensità con cui CD45 viene
espresso dalle altre popolazioni. Sebbene alcuni Autori descrivano la possibilità di
riconoscere con questo modello anche i diversi stadi maturativi della componente
granulocitaria [933], nella pratica tale discriminazione risulta difficile. E’ possibile
invece distinguere tra precursori mieloidi e precursori linfoidi, dato che questi ultimi sono
caratterizzati da valori di SSC particolarmente bassi. Va ricordato che l’espressione di
CD45 sulle cellule NK mature è alquanto ridotta rispetto a quella evidenziabile sui
linfociti maturi.
Va infine ricordato che, a prescindere da altri fattori, l’espressione di CD45 può
essere modulata in corso di apoptosi [936].
L’espressione di CD45 può infine essere sottostimata per impedimento sterico
quando venga esplorata consensualmente a quella di altri antigeni intensamente espressi,
come ad esempio CD15.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T.

Nelle leucemie dei precursori T l’espressione di CD45 è più bassa ripetto a quella
dei linfociti maturi, ma sembra comunque più elevata di quella riscontrabile sui blasti
delle leucemie dei precursori delle cellule B [937]; il cluster dei T linfoblasti può a volte
arrivare a sovrapporsi parzialmente a quello dei linfociti normali residui [856].

Leucemie dei precursori B

Nelle leucemie dei precursori B l’espressione di CD45 è generalmente analoga a


quella presentata dai precursori B normali, ovvero più bassa ripetto a quella dei linfociti
maturi [935] [938] [939] [736] [940]. Va comunque tenuto conto che:
i) in alcuni casi associati a traslocazione t(4;11) l’entità di espressione di
CD45 può essere sovrapponibile o molto vicina a quella riscontrabile sui
linfociti maturi [679];
ii) nei casi associati a iperdiploidia l’entità di espressione di CD45 è
generalmente ancora più bassa di quella normalmente attesa sulle forme
con traslocazione t(1;19) e con cariotipo normale [941] [937];
iii) in alcuni casi associati a traslocazione t(12;21) il CD45 può essere assente
o espresso con un’intensità paragonabile a quella presente sugli
eritroblasti [942].
In sintesi si può concludere che nelle leucemie infantili dei precursori B l’intensità
di espressione di CD45, analogamente all’intensità di espressione di CD20, riveste
significato prognostico, in quanto i casi associati a iperdiploidia e a bassa espressione di
CD45 sarebbero associati a prognosi favorevole [943] [941], mentre i pazienti con elevati
livelli di espressione di CD45 presenterebbero sopravvivenze “event-free” peggiori di
quelli con bassi livelli di espressione dell’antigene [679].

91
Vi è poi evidenza in letteratura che lo sfavorevole significato prognostico di
un’elevata espressione di CD45 si manterrebbe anche dopo l’esclusione delle forme con
traslocazione t(4;11), caratterizzate da prognosi particolarmente sfavorevole [679]; per
contro, secondo altri Autori, lo sfavorevole significato prognostico di un’intensa
espressione di CD45 sarebbe ristretto alle forme già di per sé classificabili “ad alto
rischio” [937].
Da un punto di vista pratico, il peculiare comportamento di CD45 sui blasti della
B-ALL fa sì che nello studio di questa patologia il gate immunologico di analisi sia
preferenzialmente da porre sul citogramma leader SSC vs CD19 anziché sul citogramma
SSC vs CD45 [298].

Leucemie acute mieloidi

Nei blasti delle leucemie acute mieloidi l’espressione di CD45 è analoga a quella
presentata dalle cellule immature normali, sicché la sua espressione può essere sfruttata
congiuntamente a quella di un parametro fisico per la definizione di un gate
immunologico capace di restringere l’analisi alle sole cellule patologiche [298].
Va comunque ricordato che nelle cellule delle leucemie appartenenti alla linea
monocitica l’intensità di espressione di CD45 può essere alquanto più elevata, e
riprodurre quella normalmente presente sulla componente monocitaria normale [856].
E’ inoltre possibile che sporadici casi i blasti della leucemia acuta mieloide non
esprimano CD45 [944]. In tali casi il gate immunologico dovrà essere modificato in
funzione delle caratteristiche fenotipiche riscontrate, adottando ad esempio come
citogramma leader il citogramma SSC vs CD13.

Neoplasie delle cellule B mature

Le neoplasie delle cellule B mature esprimono l’antigene CD45 a un’intensità


generalmente confrontabile con quella riscontrabile sui linfociti maturi, anche se esiste
evidenza che, rispetto all’intensità di espressione riscontrabile sui B linfociti normali,
l’espressione di CD45 è lievemente ridotta sulle cellule della leucemia linfatica cronica
(B-CLL) e del linfoma mantellare (MCL), e lievemente aumentata sulle cellule della
leucemia a cellule capellute (HCL) [945].
E’ comunque fondamentale non dimenticare che l’antigene CD45:
i) è tipicamente ipo-espresso sui linfociti della leucemia linfatica cronica
(B-CLL) associata a delezione del braccio lungo del cromosoma 11 [442];
ii) è espresso a bassa intensità sulle plasmacellule normali, e spesso assente
sulle plasmacellule neoplastiche [946];
iii) può essere assente sulle cellule di alcuni casi di linfoma anaplastico
(ALCL) CD30+ [947] [588] e di linfoma B a grandi cellule (DLBCL)
[32].

Neoplasie delle cellule T mature

Le neoplasie delle cellule T mature esprimono l’antigene CD45 a un’intensità


generalmente confrontabile con quella riscontrabile sui linfociti maturi, ma casi isolati
possono esprimerlo ad intensità ridotta o anche aumentata [46] [69].

Neoplasie delle cellule NK

92
Una ridotta espressione di CD45 è stata segnalata sulla superficie delle cellule del
linfoma blastico a cellule NK, considerato una neoplasia dei precursori NK [228].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD45 sembra assente dagli elementi della istiocitosi a cellule di


Langerhans (LCH) [948] [949].

LE ISOFORME DELL’ANTIGENE CD45

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD45 viene codificato da una sequenza genica costituita da trentatrè


diversi esoni [950]. Gli esoni 4, 5 e 6 codificano per tre diversi determinanti detti A, B e C,
e per splicing alterno possono generare cinque diverse isoforme di peso molecolare
variabile da 220 a 180 kD e alternativamente contraddistinte:
i) dalla presenza di tutti e tre i determinanti A, B e C, oppure
ii) dalla presenza dei due determinanti A e B, oppure
iii) dalla presenza dei due determinanti B e C, oppure
iv) dalla presenza del solo determinante B, o infine
v) dall’assenza di tutti e tre i determinanti [951].
E’ stata anche segnalata l’esistenza di una isoforma del peso molecolare di 185 kD,
contraddistinta dalla presenza dei due determinanti A e C e dall’assenza del determinante
B. Questa isoforma, considerata un precursore dell’isoforma di 220 kD, è stata
evidenziata nel citoplasma delle cellule B tonsillari e di alcuni linfomi B, ma non nei T
linfociti normali o neoplastici [952].

Isoforma Determinanti Peso molecolare


A B C
CD45RA, CD45RB, CD45RC + + + 220
CD45RA, CD45RB + + - 205
CD45RB, CD45RC - + + 205
CD45RB - + - 190
CD45R0 - - - 180

I tre determinanti A, B e C vengono riconosciuti dagli anticorpi anti CD45


“ristretti” selettivamente per ciascun determinante, e noti come anti CD45RA, anti
CD45RB e anti CD45RC, mentre l’isoforma contraddistinta dalla assenza dei tre
determinanti viene riconosciuta selettivamente da un MoAb noto come anti CD45R0.
Come desumibile anche dall’osservazione della tabella si nota che:
i) tutte le isoforme tranne CD45R0 sono accomunate dalla presenza del
determinante B; di conseguenza i MoAb anti CD45RB sono in grado di
riconoscere quattro distinte isoforme, il cui peso può essere 220 kD nel
caso coesprimano i determinanti A e C, oppure 205 kD nel caso
coesprimano o il determinante A da solo o il determinante C da solo, o
ancora 190 kD nel caso non esprimano né il determinante A né il
determinante C;
ii) le isoforme riconosciute dai MoAb anti CD45RA sono accomunate dalla
presenza di CD45RB e possono esprimere o non esprimere il determinante

93
CD45RC; di conseguenza i MoAb anti CD45RA riconoscono due distinte
isoforme, che a seconda della presenza o meno di CD45RC dimostrano un
peso molecolare di 220 o 205 kD;
iii) tutte le isoforme riconosciute dai MoAb anti CD45RC sono accomunate
dalla presenza di CD45RB e possono esprimere o non esprimere il
determinante CD45RA; di conseguenza i MoAb anti CD45RC
riconoscono due distinte isoforme, che a seconda della presenza o meno di
CD45RA dimostrano un peso molecolare di 220 o 205 kD;
iv) l’isoforma CD45R0 non coesprime nessuno dei tre determinanti, è
riconosciuta selettivamente da un MoAb rivolto verso un epitopo specifico
per l’isoforma in oggetto, e pesa 180kD;
v) non sono note isoforme caratterizzate dalla presenza del solo determinante
C.
Le isoforme dell’antigene CD45 vengono espresse con modalità differenti a
seconda del tipo cellulare considerato. In particolare:
i) i timociti immaturi negativi per CD3 non esprimono CD45R0, e
coesprimono CD45RA nel 20-30% dei casi. I timociti comuni (o
“corticali”) con fenotipo CD4+, CD8+, e i timociti maturi (o “midollari”)
sia con fenotipo CD4+, CD8- che con fenotipo CD4-, CD8+ tendono
invece a coesprimere CD45R0. I linfociti cordonali, considerati lo stadio
immediatamente successivo ai timociti maturi, esprimono CD45RA sul
90% delle cellule [953]. I timociti maturi e i timociti CD45RA+
coesprimono CD45RC [954]. L’esposizione ad antigeni o a mitogeni
induce i T linfociti maturi a down-modulare CD45RA e a coesprimere
CD45R0 [955] [956]. Nel corso della vita la percentuale di T linfociti
positivi per CD45R0 aumenta progressivamente, e questa conversione
viene considerata effetto della pressione antigenica esercitata
dall’ambiente sull’individuo [957] [958].
ii) I B linfociti esprimono omogeneamente CD45RA [959] [960] e CD45RC
[954], tuttavia sulle cellule B attivate si può assistere a una transizione
dall’isoforma ad alto peso molecolare CD45RA all’isoforma a basso peso
molecolare CD45R0 [961] [960]. Nella maturazione a plasmacellula si
assiste alla progressiva comparsa dell’isoforma CD45R0 e quindi alla sua
sparizione, finché sulla plasma cellula “end-stage” l’espressione di CD45
è perduta. Nei soggetti con mieloma sono rappresentati tutti gli stadi
maturativi dei B linfociti, con le cellule B meno differenziate evidenziabili
nel sangue periferico, le cellule a uno stadio intermedio presenti sia nel
sangue periferico che nel midollo osseo, e le cellule B più differenziate e/o
le plasmacellule solamente nel midollo [962].
iii) I linfociti NK esprimono omogeneamente CD45RA e CD45RC [959]
[954], ma possono esprimere CD45R0 dopo stimolazione in vitro [963].
iv) I granulociti e i monociti tendono a esprimere CD45R0 [964].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Le cellule delle neoplasie ematologiche tendono generalmente ad esprimere


l’isoforma di CD45 normalmente presente sulla controparte non trasformata da cui
traggono origine [965].

Neoplasie dei precursori T

94
Non esiste in letteratura omogeneità di vedute sulla distribuzione delle isoforme
CD45RA e CD45R0 nelle neoplasie dei precursori T. Mentre infatti alcuni Autori hanno
rilevato tutte le combinazioni possibili, senza alcuna correlazione tra un definito pattern e
la presenza di CD4 e/o CD8 [966], altri Autori hanno evidenziato l’espressione
dell’isoforma CD45RA sulle leucemie derivate dai precursori più immaturi (CD7+ CD4-
CD8- CD1-), e quella dell’isoforma CD45R0 sulle leucemie derivate dai precursori più
maturi (CD7+ CD4+ CD8+ CD1+) [965].

Neoplasie dei precursori B

Le neoplasie dei precursori B tendono a esprimere CD45RA in assenza di


CD45R0 [967] [965].

Leucemie acute mieloidi

Le leucemie mieloidi acute tendono ad esprimere CD45RA [965], con


l’eccezione delle forme AML-M0, che possono esprimere CD45R0 [968]. Non esiste in
letteratura omogeneità di vedute sulla distribuzione delle isoforme CD45RA e CD45R0
nelle forme a componente monocitaria. Mentre infatti alcuni Autori hanno documentato
la coespressione di ambedue le isoforme [967] [965], secondo altri Autori nelle leucemie
mieloidi acute con componente monocitica l’espressione delle isoforme CD45RA e
CD45R0 è mutuamente esclusiva, con una selettiva espressione di CD45RA da parte dei
blasti delle forme più immature (AML-M5a) e una selettiva espressione di CD45R0 da
parte delle cellule delle forme più mature (AML-M5b) [968]. E’ interessante osservare
che, a differenza dai promielociti normali che sono CD45R0+, i promielociti neoplastici
della AML-M3 esprimono CD45RA, ma si convertono all’espressione di CD45R0 se
coltivati in presenza di acido trans-retinoico [466] [968].

Neoplasie delle cellule B mature

Nelle neoplasie delle cellule B mature le cellule neoplastiche tendono


generalmente ad esprimere l’isoforma ad alto peso molecolare CD45RA [969], ma nella
B-CLL è frequente la coespressione di CD45RA e CD45R0 [970] [971]. L’intensità di
espressione di CD45RA sulle cellule della B-CLL è più bassa di quella riscontrabile sui B
linfociti normali o sulle cellule degli altri B-NHL CD45RA+ [971]. Nel sangue periferico
di soggetti con mieloma multiplo (MM) o con MGUS possono essere riscontrate
popolazioni di B linfociti che esprimono elevate concentrazioni di CD45R0 e basse
concentrazioni di CD45RA, e ciò appare logico, in quanto le plasmacellule mielomatose,
come pure quelle normali, tendono ad esprimere CD45R0 negli stadi più immaturi, per
poi perderlo negli stadi più avanzati e divenire definitivamente negative per CD45 [972].
Le cellule del linfoma follicolare (FL) dimostrerebbero una spiccata reattività con
l’anticorpo MT2, rivolto verso un determinante CD45 ristretto (CD45R) alle molecole
dal peso di 205 e 190 kD; tale reattività non sarebbe presente sulle cellule del centro
germinativo normale [973] [974] [975]. Le cellule del linfoma primitivo delle sierose
(PEL) non esprimerebbero CD45RA [650]. In una casistica consistente di 68 casi di
leucemia a cellule capellute (HCL), l’antigene CD45R0 è stato segnalato su più del 20%
degli elementi nel 25% dei casi [202].

95
Neoplasie delle cellule T mature

Nelle neoplasie dei T linfociti maturi le cellule neoplastiche tendono ad esprimere


l’isoforma a basso peso molecolare CD45R0 [976] [970]. In accordo con questo assunto,
l’assenza o la bassa espressione di CD45RA da parte di cellule CD4+ in campioni bioptici
viene considerata come altamente predittiva della presenza di T-NHL [977].
Nelle neoplasie dei T linfociti maturi sono comunque possibili diverse
combinazioni tra le varie isoforme. In una casistica composta da 78 casi di T-PLL sono
state segnalate le combinazioni CD45RA+ e CD45R0+, CD45RA- e CD45R0+, e
CD45RA+ con CD45R0-, combinazione quest’ultima dotata di significato prognostico in
quanto associata con un decorso clinico più indolente [978]. Nella leucemia/linfoma a
cellule T dell’adulto (ATLL) le isoforme di CD45 possono comportarsi in modo diverso
anche nel contesto dello stesso paziente. E’ stato infatti segnalato che l’isoforma
CD45RA sembra espressa dalle cellule neoplastiche nel sangue periferico e nei linfonodi,
mentre l’espressione di CD45R0 sembra tipica delle cellule infiltranti le lesioni cutanee
[979]; secondo altri Autori un’espressione di CD45R0 a bassa intensità sembra connotare
le cellule CD4 non infettate dal virus HTLV-I, e può essere considerata un marker di
resistenza dell’ospite all’infezione [980].
Sulla distribuzione delle isoforme di CD45 nella malattia linfoproliferativa dei
linfociti granulati T (T-LDGL) non esiste accordo in letteratura; mentre secondo alcuni
Autori la maggior parte dei casi sembra coesprimere le due isoforme CD45RA e CD45R0,
con possibile espressione isolata di CD45R0 [981], secondo altri il fenotipo CD45RA+
CD45R0- costituirebbe il fenotipo di più frequente riscontro [286].

Neoplasie delle cellule NK

L’espressione di CD45R0 è stata segnalata sulle cellule di alcuni casi di malattia


linfoproliferativa dei linfociti granulati NK (NK-LDGL) [963].

Altre entità nosografiche

A differenza dalle leucemie mieloidi acute che tendono a esprimere l’isoforma ad


alto peso molecolare, le crisi blastiche mieloidi della leucemia mieloide cronica tendono
ad esprimere CD45R0 [965].

L’ANTIGENE CD56

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD56 è una glicoproteina di circa 180 kD, codificata da un locus


presente sul cromosoma 11 [982], e costituisce la molecola di adesione delle cellule
neurali (neural cell adhesion molecule, NCAM) [983]. L’antigene è espresso sulle cellule
NK capaci di citotossicità non MHC-ristretta [56], e per la precisione è presente sia sulle
cellule mature (che presentano fenotipo CD94+ CD161+) che sulle cellule immature (che
presentano fenotipo CD94- CD161+), ma è assente sulle cellule pre-NK, che presentano
fenotipo CD56- CD94- CD161+ [984].
L’antigene CD56 non può essere considerato esclusivo delle cellule NK, in
quanto è espresso anche dalle cellule di un subset di T linfociti CD8+ [593] [985], da
quelle di un subset di T linfociti con TCR a catene gamma/delta [986], nonché da quelle
di un piccolo subset di T linfociti CD4+ [986]. Un subset espanso di cellule CD3+, CD4+,

96
CD56+, CD57+, è tipicamente apprezzabile nel sangue periferico dei soggetti con
malattia di Down [987].
L’espressione di CD56 è stata inoltre segnalata su di una sottopopolazione di
monociti dotati di fenotipo CD14++, CD64+, CD16- [988]. Questa segnalazione riveste
un certo interesse teorico, in quanto nel macaco Rhesus l’antigene CD56 viene
normalmente espresso dai monociti e non dalle cellule NK [989].

ASPETTI CITOMETRICI

La maggior parte dei linfociti non T positivi per CD56 coesprime CD16; tuttavia
ad un’analisi bivariata per CD16 e CD56 è spesso possibile mettere in evidenza una
seconda popolazione CD56+ che esprime l’antigene ad intensità aumentata ed è negativa
per CD16. Questa popolazione è negativa per CD3 e HLA-DR, ma coesprime CD2, CD7,
CD25 e CD122 [990], e in condizioni basali esercita un’attività citotossica su cellule K
562 minore di quella della popolazione CD16+, CD56+ [593]. Tale attività è tuttavia
vivacemente inducibile da IL2 e IFN gamma, e non è chiaro se questo subset rappresenti
uno stadio più immaturo o una popolazione completamente distinta dotata di diverse
attività funzionali [56] [991].
La lisi del campione con soluzioni ipotoniche a base di cloruro di ammonio
sembra capace di interferire con l’espressione dell’antigene CD56 [458]; in tali casi
appare logico procedere alla lisi dei globuli rossi mediante soluzioni lisanti basate su altri
principi.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T e B

L’espressione di CD56 nelle neoplasie dei precursori T e B è rara ma segnalata, ed


è più frequente nelle neoplasie dei precursori T [992] [993].
E’ noto un caso di linfoma T linfoblastico (T-LBL) con coinvolgimento
mediastinico e nasale dotato di fenotipo cyCD3+, CD56+, TdT+ [622], ed esistono
isolate segnalazioni di sporadici casi positivi per altri antigeni NK associati [618] [387],
[619] [620] [621] [622] [994] [678]. È possibile che questi casi CD56+ costituiscano
un’entità nosografica diversa dal linfoma T linfoblastico classico, e siano piuttosto
inquadrabili come neoplasie dei precursori delle cellule NK [229] [623].

Leucemie acute mieloidi

L’antigene CD56 è espresso in una percentuale di AML variabile dal 20 al 40% a


seconda delle casistiche [81] [992] [995], con particolare preferenza per i tipi M2, M3,
M5 [996] [995], e M7 [997].
In particolare, per quanto concerne la AML-M3, l’antigene CD56 può essere
espresso sia dagli elementi di casi con traslocazione variante t(11;17) [998], che dagli
elementi di casi tipici con traslocazione t(15;17), nei quali la presenza di CD56
sembrerebbe correlare con una prognosi significativamente peggiore [999] [1000].
L’espressione di CD56 è generalmente predittiva di determinate anomalie
cromosomiche, come la trisomia 8 e i riarrangiamenti del gene MLL situato in 11q32
[1001] [1002] [995], e appare spesso associata alla coespressione dell’antigene 7.1 e
all’espressione di pgp (proteina della “multidrug resistance”) [996]. Nella AML-M2 la
presenza di CD56 è spesso connessa alla trisomia 4 o alla trisomia 10 [1003], e se

97
associata alla coespressione di CD19 e CD34, è quasi invariabilmente predittiva della
traslocazione t(8;21) [85] [1004].
L’espressione di CD56 è associata a cattiva prognosi nella AML-M2 [1005], nella
AML-M3 [999] [1000] [1006] [1007], e nella AML-M5 [996]. Anche se qualche Autore
non sembra concordare con questa osservazione [992] [634], la presenza di CD56 (come
pure di CD2, CD4 e CD7) sui blasti di leucemia acuta non linfocitica è considerata
comunque associata ad aumentato rischio di malattia extra-midollare (sarcoma
granulocitico e localizzazioni cutanee, gengivali e meningee) [95] [1008].

Neoplasie delle cellule B mature

L’espressione di CD56 è di regola assente sulle cellule delle neoplasie dei linfociti
B maturi, ma è stata segnalata con metodiche immunoistochimiche sulle cellule del
cosiddetto linfoma microvilloso [1009]. L’antigene CD56 è stato segnalato anche in un
isolato caso di linfoma primitivo delle sierose (PEL) [307].
L’espressione di CD56, generalmente assente sulle plasmacellule normali, appare
selettivamente ancorché non costantemente presente sulle plasmacellule neoplastiche del
mieloma multiplo (MM) [1010] [1011], ma sembrerebbe meno rappresentata sulle
plasmacellule della leucemia plasmacellulare (PCL) [1012] e sulle plasmacellule delle
localizzazioni extra-midollari [1013]. In una casistica composta da 26 casi di leucemia
plasmacellulare e 664 casi di mieloma multiplo, il 70% circa dei casi di mieloma multiplo
e il 45% circa dei casi di leucemia plasmacellulare coesprimevano CD56 [405]. Esiste in
letteratura una segnalazione secondo la quale la scomparsa di CD56 dalla superficie di
plasmacellule neoplastiche precedentemente positive può preludere alla leucemizzazione
della malattia mielomatosa [1014].

Neoplasie delle cellule T mature

Da un punto di vista generale l’espressione di CD56 costituisce un carattere


comune delle neoplasie derivanti dai T linfociti maturi accomunati da attività citotossica
e dalla presenza intracellulare di molecole citotossiche [1015] [1016].
In particolare, l’antigene CD56 è regolarmente espresso da una serie di neoplasie
dei T linfociti maturi, tra cui il linfoma T epatosplenico (HSTCL) [1017] e il linfoma T
panniculitico a TCR gamma/delta (SPTCL) [1018].
L’espressione di CD56 sulle cellule della malattia linfoproliferativa dei T linfociti
granulati (T-LDGL) assume cattivo significato prognostico [625], e verosimilmente
contraddistingue un subset di malattie più aggressive interpretabili come neoplasie delle
cellule T NK-like [1019].
Per quanto concerne i cosiddetti linfomi T periferici (PTCL), la valutazione della
reale incidenza dell’antigene CD56 è resa difficile dal fatto che in preparati
immunoistochimici le cellule NK neoplastiche, che sono positive per CD56, reagiscono
con anticorpi anti CD3 epsilon; questa situazione è probabilmente responsabile di un
certo grado di confusione tra linfomi T periferici “veri” e linfomi a cellule NK [172].
Sembra comunque che una quota rilevante di PTCL sia in grado di coesprimere CD56
[1020] [1021], la cui presenza si accompagnerebbe ad un peculiare pattern di infiltrazione
extranodale, con frequente coinvolgimento del sistema nervoso centrale, del muscolo, del
tratto gastro-intestinale, del rinofaringe, e delle ghiandole sia endocrine che esocrine. In
alcune classificazioni questi linfomi vengono descritti assieme ai linfomi NK con il
termine onnicomprensivo di T/NK-NHL; e ciò in funzione del fatto che queste entità
nosografiche, ancorché ontogeneticamente diverse, sono accomunate ai linfomi NK dalla

98
storia naturale, dalla distribuzione geografica, dai rapporti con il virus di Epstein Barr, e
dalla espressione dei recettori delle cellule NK [1022] [633] [1023].
L’espressione di CD56 è stata segnalata anche nella cosiddetta malattia
linfoproliferativa T S-100 positiva [1024], in un caso di linfoma/leucemia a cellule T
dell’adulto (ATLL) [1025], e nel linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) CD30+,
dove costituirebbe un indicatore prognostico sfavorevole [1026].
Sono stati segnalati almeno due casi di leucemia T prolinfocitica (T-PLL) positivi
per CD56, il primo caratterizzato dalla coespressione di CD16 [632], e il secondo,
peraltro di dubbio inquadramento, caratterizzato da coespressione di cyCD3, CD7, CD13,
CD33, CD34, CD38, CD65 e HLA-DR, assenza di TCR e assenza degli antigeni B e
T-associati [535].

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene CD56 appare costantemente presente sugli elementi della ancora mal
definita famiglia delle neoplasie delle cellule NK. In particolare la sua espressione in
assenza di TCR, CD3 di membrana e CD5, è stata considerata parametro utile alla
individuazione di un particolare sottogruppo di linfomi [1021], definiti in passato come
“linfomi T periferici a TCR silente”, e poi come “linfomi a cellule NK” [153], o anche più
semplicemente “linfomi CD56+” [1027]. Questi linfomi presentano alcune peculiarità,
come una notevole aggressività, la capacità di dare localizzazioni extranodali in siti
particolari, il fatto di essere spesso correlati al virus di Epstein-Barr, e la distribuzione
geografica, che interessa prevalentemente il Sud-Est asiatico.
La gamma delle neoplasie delle cellule NK CD56+ spazia dalla malattia
linfoproliferativa dei linfociti granulati a cellule NK ai linfomi extranodali nasali o
“nasal-type” a cellule NK [1028], dei quali la “leucemia aggressiva NK” costituisce
presumibilmente la variante leucemica [1029], ed è presumibile che comprenda anche
entità nosografiche derivate da precursori. A queste putative neoplasie dei precursori NK
vanno presumibilmente riferite diverse entità oggetto di sporadiche segnalazioni, come
ad esempio:
i) i già citati linfomi T linfoblastici CD56+ [618] [387], [619] [620] [621]
[622] [994] [678];
ii) la cosiddetta “acute leukemia of conceivable myeloid/NK cell precursor
phenotype”, con fenotipo CD7+, CD33+, CD34+, CD56+, spesso
HLA-DR+, morfologia di tipo L2, e negatività per perossidasi ed esterasi
[634];
iii) la cosiddetta "myeloid/NK acute leukemia", con fenotipo CD33+, CD56+,
CD11a+, CD13dim+, CD15dim+, CD34+/-, HLA-DR-, CD16-, CD2-,
CD3-, CD8-, e caratterizzata da blasti con nuclei profondamente incisi,
scarso citoplasma con fini granulazioni azurofile, e fine positività
granulare per Sudan Black e per perossidasi [636];
iv) la cosiddetta “NK lymphoma/leukemia”, caratterizzata dalla presenza di
cellule con morfologia blastica e fenotipo CD2+, CD3/Leu4-,
cyCD3epsilon+, CD4-, CD5-, CD7+, CD8-, CD16-, CD38+, CD56+,
CD57-, TdT-, granzyme B-, TIA1+ [1030].
E’ appena il caso di osservare come da un punto di vista morfologico la “acute
leukemia of conceivable myeloid/NK cell precursor phenotype” sia difficilmente
distinguibile dalla AML-M0, e come la "myeloid/NK acute leukemia" possa venire
facilmente confusa con la AML-M3 variante; questa ultima osservazione acquista
consistenza anche alla luce di segnalazioni aneddotiche che associano la forma M3v
CD56+ con la resistenza all’ATRA e con l’assenza del riarrangiamento RAR-alfa [636].

99
Va infine ricordato che la coespressione di CD56 e CD4 in assenza di CD3
individua un particolare linfoma cutaneo suscettibile di leucemizzazione. Questo linfoma,
probabilmente derivato da precursori NK immaturi, è caratterizzato da fenotipo CD2-,
CD3-, CD4+, CD8-, CD43+, TCR-, e da configurazione germ-line dei geni codificanti sia
per il TCR che per le immunoglobuline [231] [1031] [233 [Ahn, 2000 #3022], e
corrisponde probabilmente all’entità nosografica definita “blastic NK-cell lymphoma”
dalla classificazione WHO delle neoplasie ematologiche [485] [229].
Va infine ricordato che la coespressione di CD56 e CD4 in assenza di CD3
individua un particolare sottotipo di linfoma cutaneo suscettibile di leucemizzazione.
Questo linfoma, caratterizzato da fenotipo CD2-, CD3-, CD4+, CD8-, CD43+, TCR-, e
da configurazione germ-line dei geni codificanti sia per il TCR che per le
immunoglobuline [231] [1031] [233], è stato interpretato da alcuni Autori come una
neoplasia dei precursori delle cellule NK, e come tale codificato come “blastic NK-cell
lymphoma” dalla classificazione WHO delle neoplasie ematologiche [1321] [229]. Altri
Autori lo considerano invece derivante dalla trasformazione maligna delle cellule
plasmacitoidi dendritiche [237].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD56 appare spesso coespresso sulle cellule CD34 e su mielociti e


metamielociti di pazienti con leucemia mieloide cronica (CML) [1032]. Nel lavoro in
oggetto l’Autore propone lo studio della coespressione di CD56 sulle cellule mieloidi dei
soggetti con CML sottoposti a trapianto di midollo, in quanto la ricomparsa di CD56
sarebbe associata a recidiva. L’espressione di CD56 è stata segnalata anche in isolati casi
di leucemia mielomonocitica cronica (CMML) [1033] [1034], e in isolati casi di crisi
blastica di CML coinvolgenti la cute [1035].
Va infine che ricordato l’antigene CD56 può essere espresso dai cosiddetti tumori
a piccole cellule rotonde (SRCT, "small round cell tumors”) [1036]; il suo studio,
congiuntamente a quello degli antigeni CD45 e CD81 [1037] oppure degli antigeni CD45
e CD9 [1038], può essere utile nella ricerca di cellule di neuroblastoma in campioni di
sangue periferico o midollare.

L'ANTIGENE CD61

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD61, detto anche gpIIIa, è una glicoproteina del peso di 110 kD
codificata da un locus presente sul braccio lungo del cromosoma 17 [1039] [1040].
L'antigene CD61 funge da catena beta nella costituzione di due diverse integrine, e in
particolare nella costituzione della glicoproteina piastrinica gpIIb/gpIIIa in cui si associa
all’antigene CD41, e nella costituzione del recettore della vitronectina in cui si associa
all’antigene CD51 [1039] [1041].
L’antigene CD61 è comunemente espresso sulle piastrine e sugli elementi
immaturi della linea piastrinica [838], ma anche sui macrofagi [1039] e sulle mast-cellule
cutanee [831]. Per quanto concerne la presenza dell’antigene CD61 sulla membrana dei
monociti non esiste in letteratura omogeneità di vedute, in quanto alcuni Autori la negano
[1042], mentra altri la accreditano a bassa intensità [1043].

ASPETTI CITOMETRICI

100
La specificità della dimostrazione citometrica della presenza dell’antigene CD61
sulla membrana delle cellule contenute in un campione è resa difficile dalla possibilità di
fenomeni di satellitismo piastrinico, in cui piastrine CD61+ o loro frammenti [1044] si
legano alla membrana di cellule CD61-, che vengono di conseguenza erroneamente
considerate positive per l’antigene. Questo fenomeno di regola riguarda i monociti e i
polimorfonucleati di alcuni soggetti [1045] [1046] [1047] [1048], si verifica in campioni
anticoagulati con EDTA, ed è presumibilmente dovuto alla presenza di autoanticorpi
reattivi sia contro il complesso gpIIb/gpIIIa che contro il recettore per Fc di IgG [1049], o
all’interazione tra l’antigene piastrinico CD62 espresso dalle piastrine attivate e
l’antigene CD15 presente sui polimorfonucleati [1050]. Il satellitismo delle piastrine può
tuttavia riguardare anche i blasti leucemici [1051] [1052], e costituisce nella fattispecie
un fenomeno particolarmente indesiderabile, in quanto la dimostrazione della presenza di
antigeni piastrinici può costituire l’unico requisito utile alla diagnosi citometrica di
AML-M7 [1053], né la falsa positività indotta dal satellitismo può citometricamente
essere distinta da quella vera, ancorché – almeno per quanto riguarda l’espressione di
CD41 - un istogramma di positività con coefficiente di variazione elevato deponga per la
presenza dell’artefatto [1052]. Di fronte ad una possibile falsa positività per antigeni
piastrinici, può essere utile procedere alla separazione fisica degli elementi in analisi,
all’allestimento di citocentrifugati, e alla loro analisi con tecniche di microscopia a
fluorescenza [1052].
Nella ricerca dell’antigene CD61 non va inoltre dimenticato che l’espressione
intracitoplasmatica dell’antigene precede l’espressione in membrana [1054], dimodoché
sembra sensato procedere ad una preventiva permeabilizzazione del campione nel caso
della sua ricerca in leucemie acute con morfologia e citochimica non conclusive.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie acute mieloidi

Nelle leucemie mieloidi acute l’antigene CD61 è prevalentemente espresso dai


blasti della AML-M7 insorta “de novo” [1053] [1055] [1056] [1057], ma può anche
essere presente sulle cellule della trasformazione megacarioblastica della trombocitemia
essenziale [1058] e delle leucemie acute insorgenti in pazienti affetti da policitemia vera
[1059].

Altre entità nosografiche.

L’antigene CD61 è espresso dai megacariociti circolanti in molti disordini


mieloproliferativi cronici [1060] [1061] [1062], ed è presente sui blasti di più della metà
dei casi di crisi blastica “mieloide” della leucemia mieloide cronica (CML) [1063] [1064].
L’antigene CD61 è stato segnalato sui blasti della cosiddetta “malattia mieloproliferativa
transitoria” (TMPD), che compare nei neonati con sindrome di Down [838] [173] [1065]
[1066] [1067].

L’ANTIGENE CD62L

ASPETTI GENERALI

L' antigene CD62L, per lungo tempo conosciuto come Leu8 o TQ1, è una
glicoproteina di 140 kD codificata da un locus presente sul cromosoma 1 [1068], ed è una

101
molecola di adesione appartenente alla famiglia delle selectine. E’ espressa sulla maggior
parte dei neutrofili, degli eosinofili, dei monociti e dei loro precursori [1069], nonché sui
megacariociti, sulle piastrine e sulle cellule endoteliali, dove interagendo con l’antigene
CD15 espresso sui neutrofili ne media il processo di rolling preliminare alla diapedesi
[1070]. L’antigene CD62L è presente anche su alcune sottopopolazioni di T linfociti
CD4+ e di B linfociti. In particolare, nel linfonodo l’antigene CD62L è presente sulle
cellule del mantello ma è assente sulle cellule del centro germinativo [1071].

ASPETTI CITOMETRICI

L’antigene CD62L è un antigene molto labile, la cui intensità di espressione tende


a diminuire se il campione viene mantenuto a temperature più basse di 20° C [458], e
deve quindi essere misurato subito. La sua intensità di espressione sui monociti risente
dello stato di attivazione, che a sua volta viene diversamente modulato dalle procedure di
separazione [1072].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T e B

L’antigene CD62L è espresso sui blasti di circa un quarto delle leucemie dei
precursori T e B [429].

Neoplasie delle cellule B mature

Sebbene esistano in letteratura report che accreditano nelle neoplasie delle cellule
B mature una diffusa e debole espressione di CD62L priva di comportamenti peculiari
[436], secondo altri Autori l’espressione di CD62L è spesso presente sulle cellule del
linfoma a cellule mantellari (MCL) [400] e della leucemia linfatica cronica (B-CLL)
[1073] [435], ma assente sulle cellule del linfoma follicolare (FL) [1074]. Nel linfoma
MALT, la perdita dell’espressione di CD62L sarebbe associata con la trasformazione in
forme ad alto grado [1075].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD62L è segnalata sulla membrana delle cellule delle neoplasie


dei linfociti T maturi, dove sembra collegata alla capacità di infiltrare le strutture
linfonodali [1076]. L’associazione tra CD62L e linfotropismo sembra concettualmente
analoga a quella che lega altri due homing receptor, l’antigene linfocitario cutaneo (CLA)
e l’integrina alfa4beta7, alla capacità di infiltrare rispettivamente cute e mucosa
gastrointestinale [1076].
In linea con queste considerazioni, CD62L appare caratteristicamente assente
dalla superficie delle cellule della micosi fungoide (MF) [1077] [309].

Altre entità nosografiche

La linfocitosi che compare nei soggetti affetti da pertosse appare prevalentemente


costituita da T linfociti negativi per CD62L. E’ possibile che la down-modulazione
dell’antigene, probabilmente indotta dalla tossina della pertosse, ostacoli lo homing dei T
linfociti negli organi linfatici periferici, spiegando così l’aumento di linfociti nel
comparto periferico [1078].

102
L’ANTIGENE CD65

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD65 è un dodecasaccaride ceramidico simile all’antigene CD15.


Come l’antigene CD15, l’antigene CD65 è espresso sui neutrofili e sui basofili [184], e su
di una sottopopolazione di monociti [1079]. La sua comparsa lungo la maturazione
mieloide avverrebbe dopo la scomparsa di CD34 [1080] e dopo la comparsa della MPO
[1081], e comunque ad un livello successivo di quello rappresentato dalla CFU-GM, che
è CD65 negativa [1082]. Di conseguenza, non è possibile rilevare in un midollo normale
la presenza di elementi CD65+ che siano negativi per la mieloperossidasi [1081].

ASPETTI CITOMETRICI

Il comportamento dei diversi anticorpi anti CD65 può variare in funzione del
clone impiegato nell’analisi. In particolare, i MoAb VIM-8 e VIM-11 riconoscono un
epitopo presente solamente sui granulociti, metre il MoAb VIM-2 riconosce un epitopo
sialilato presente sia sui monociti che sui granulociti, e recentemente definito CD65s
[1083] [1084].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T e B

L’antigene CD65 può essere occasionalmente espresso sui blasti della leucemie
dei precursori T e B [1085] [1086], ma almeno nelle casistiche pediatriche non sembra
dotato di significato prognostico [517], ancorché appaia associato a specifiche anomalie
genetiche, come ad esempio il riarrangiamento dei geni ETV6 o MLL [517]. Nelle
leucemie dei precursori B l’espressione di CD65 sembrerebbe associata alla traslocazione
t(11;19) [573].

Leucemie acute mieloidi

Insieme a CD13, CD33, CD117 e mieloperossidasi, l’antigene CD65 concorre a


costituire una rosa di marcatori il cui studio riveste grandissima importanza nella
diagnostica immunologica delle leucemie acute. Esiste infatti una convenzione formulata
dal Gruppo Europeo per la Caratterizzazione Immunologica delle Leucemie (EGIL),
secondo la quale l’espressione di due di questi marcatori rappresenta requisito sufficiente
per l’attribuzione di una leucemia acuta alla linea mieloide [33] [524] [525].
L’antigene CD65 è frequentemente espresso nelle leucemie mieloidi acute, dove
concorre a mediare l’infiltrazione extravascolare [1087]. Lo studio di CD65, eseguito
congiuntamente a quello di CD34 e CD117, antigeni normalmente espressi da cellule in
stadi di maturazione più arretrata, può essere utile nella evidenziazione di asincronismi
maturativi, e può avere un ruolo nella evidenziazione della malattia minima residua [84].

103
Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD65 non è riportata nelle neoplasie dei T linfociti maturi. E’


comunque noto un caso diagnosticato come T-PLL che esprimeva CD65 [535]. Il caso in
oggetto presentava comunque diverse anomalie fenotipiche (cyCD3+, HLA-DR+,
CD34+, CD38+, CD7+, CD56+, CD13+, CD33+, assenza di TCR e di marcatori B e
T-associati) che ne rendevano problematico il reale inquadramento nosografico.

L’ANTIGENE CD66c

ASPETTI GENERALI

Gli antigeni CD66 costituiscono la famiglia degli antigeni carcinoembrionari, o


CEA, composta da almeno sette distinte glicoproteine codificate da un gruppo di geni
presenti sul braccio lungo del cromosoma 19 [570]. Di queste glicoproteine, quattro sono
espresse anche sulle cellule emopoietiche; a queste quattro molecole sono stati
rispettivamente conferiti i nomi di antigene CD66a (noto anche come BGP, biliary
glycoprotein), CD66b (noto anche come CGM6, CEA gene family member 6), CD66c
(noto anche come NCA90 o nonspecific cross-reacting antigen 90), e CD66d (noto anche
come CGM1) [1088]. Gli antigeni CD66 presentano pesi molecolari variabili, e
precisamente 160-180 kD per CD66a, 95-100 kD per CD66b, 90-95 kD per CD66c, e
circa 30 kD per CD66d. Dal punto di vista strutturale sono distinguibili in due gruppi
diversi, il primo costituito da CD66a e CD66d e caratterizzato da una struttura
transmembrana, e il secondo costituito da CD66b e CD66c e caratterizzato dalla presenza
di un legame del tipo PI-linked.
Gli antigeni CD66 presenti sulle cellule emopoietiche sono preferenzialmente
espressi dalle cellule mieloidi, dove vengono rapidamente up-regolati dall’attivazione, e
giocano un ruolo nella fagocitosi, nella chemiotassi e nell’adesione [1089],
probabilmente promuovendo l’attivazione delle beta integrine e il loro legame con la
fibronectina [1090].
L’antigene CD66c modula la propria espressione durante la maturazione mieloide,
raggiungendo la massima intensità di espressione allo stadio di promielocita [1091].

ASPETTI CITOMETRICI

L’interpretazione dei dati esistenti in letteratura riguardo la distribuzione


dell’antigene CD66c è resa complessa dal fatto che solamente una minoranza degli
anticorpi in grado di riconoscere CD66c è veramente monospecifica per l’antigene,
mentre la maggior parte riconosce epitopi condivisi da altre glicoproteine della stessa
famiglia [1092]. Grande attenzione deve quindi essere prestata alla reale specificità del
clone adottato nell’analisi.
L’antigene CD66 è stato usato nello studio della mielopoiesi midollare all’interno
di un protocollo multiparametrico esteso agli antigeni CD14 e CD13; questo approccio
analitico permetterebbe di differenziare gli stadi immaturi (CD13+ CD66-) da quelli più
maturi (CD13+ CD66+) escludendo nel contempo la componente monocitaria [1093].

104
MoAb KOR-SA3544

L’anticorpo KOR-SA3544, descritto come specifico per un antigene


selettivamente espresso sulla superficie dei blasti della B-ALL caratterizzata da t(9;22)
[1094], sembra riconoscere in realtà l’antigene CD66c [1095].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori B e T

L’antigene CD66c è assente sui blasti delle leucemie dei precursori T, ma sembra
espresso su quelli del 40% circa di tutte le leucemie dei B precursori [1096]. In particolare
l’antigene CD66c è assente sulle cellule della early-B-ALL CD10- e della B-ALL smIg+,
ma sembra frequentemente espresso sulle cellule della early-B-ALL CD10+. E’
comunque assente sulle normali cellule early-B in rigenerazione, tanto che una analisi
bivariata condotta per CD10 e CD66c può aiutare a distinguere tra la malattia minima
residua CD10+ CD66c+ ed il normale midollo iper-rigenerante CD10+ CD66c- [1091].
In una casistica di ALL, l’antigene riconosciuto dal MoAb KOR-SA3544 è stato
segnalato su tutte le ALL caratterizzate da t(9;22), sul 13% delle forme Common, e su di
un caso caratterizzato da traslocazione 11q23 [1094]. Esiste inoltre evidenza che
l’espressione dell’antigene riconosciuto dal MoAb KOR-SA3544 sia in grado di predire
la presenza della sequenza di fusione TEL/AML1 nell’86% dei pazienti con leucemia
acuta dei B precursori [1097].

Leucemie mieloidi acute

L’antigene CD66c è stato sporadicamente segnalato sui blasti della leucemia


mieloide acuta [1098] [1096] [1099]; in particolare l’antigene sarebbe preferenzialmente
presente nei casi di AML-M4 mentre non sarebbe generalmente espresso dalle cellule
della AML-M3 [1091].
Questi dati appaiono lievemente discordanti con quelli presenti in un report della
letteratura, secondo il quale l’antigene riconosciuto dal MoAb KOR-SA3544 sarebbe
selettivamente positivo nei casi di AML-M2 [1094].

Altre entità nosografiche

L’antigene CD66c è stato sporadicamente segnalato sui blasti della crisi blastica
linfoide della leucemia mieloide cronica (CML) [1099].

105
L’ANTIGENE CD71

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD71 è un omodimero composto da due unità glicoproteiche del peso


di circa 90-95 kD codificate da un gene presente sul cromosoma 3 [1100]. L’antigene
CD71 funge da recettore della transferrina [1101], regolando l’assunzione del ferro, e
come tale è presente sia sulle cellule appartenenti al comparto eritroide, dove il ferro è
fondamentale nella sintesi della emoglobina, sia sulle cellule in divisione, dove il ferro è
essenziale da un punto di vista metabolico. In accordo con queste premesse l’espressione
di CD71 è segnalata su una grande varietà di cellule, che comprende:
i) gli eritroblasti e i loro precursori [1102],
ii) i precursori dei linfociti T e B [27],
iii) i centroblasti e i centrociti [1103], e
iv) i linfociti T attivati [1104], sulla cui membrana compare dopo 24 ore circa
dalla stimolazione con PHA, per essere presente dopo 96 ore sull’88%
circa degli elementi [493].

ASPETTI CITOMETRICI

Nell’analisi del midollo osseo la positività per CD71 assume un’espressione


bimodale; la popolazione a bassa intensità di CD71 comprende principalmente
promielociti e mielociti, mentre quella ad elevata intensità comprende proeritroblasti,
eritroblasti basofili ed eritroblasti policromatofili [1105].
Nella valutazione della componente eritroide del midollo osseo, l’antigene CD71
può essere esplorato all’interno di un’analisi multiparametrica che indaghi
contemporaneamente anche glicoforina, CD45, CD105 e presenza di nucleo valutato
mediante l’uso di un colorante per DNA “permeant”. La disponibilità di una
strumentazione “dual laser” con laser secondario capace di emettere nel rosso permette di
gestire il protocollo

anti CD71 FITC / CD105 / LDS751 / anti CD45 APC

capace di:
i) distinguere gli elementi nucleati dal rumore di fondo costituito dai
frammenti e dagli stromi eritrocitari;
ii) distinguere gli elementi nucleati CD71+ CD45- (elementi eritroidi) dagli
elementi nucleati CD71+ CD45+ (elementi attivati non eritroidi);
iii) distinguere gli elementi nucleati CD71+ (elementi eritroidi) dagli eventi
CD71+ non nucleati (stromi e frammenti eritrocitari);
iv) valutare la maturazione della componente eritroide sulla base
dell’espressione dei parametri fisici e dell’intensità di espressione di
CD105.
Sempre allo scopo di distinguere la componente eritroide da quella non eitroide,
lo studio dell’antigene CD71 può essere associato a quello di CD13 e/o CD66; talora lo
studio di CD71 e dei soli parametri fisici è sufficiente a risolvere le diverse componenti
midollari [1105].

106
ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori B e T

L’espressione di CD71 è molto frequente nelle neoplasie dei precursori T e B,


anche se appare più regolarmente espressa nelle neoplasie dei precursori T [502] [881].
Almeno nei casi pediatrici, la sua presenza non sembra comunque associata a nessun
particolare comportamento clinico [881].

Leucemie acute mieloidi

L’espressione di CD71 sui blasti della leucemia acuta mieloide può essere
considerata una evenienza aspecifica correlata all’attività proliferativa della popolazione
neoplastica. La dimostrazione della presenza di CD71 e la valutazione della sua entità di
espressione assumono tuttavia una particolare valenza quando l’assenza di marcatori
mieloidi e la contemporanea espressione di altri marcatori associati alla filiera eritroide
permettano di ipotizzare l’origine eritroide delle cellule neoplastiche [1106] [1107].
Questa evenienza si verifica in una piccola minoranza dei casi raccolti sotto la
denominazione di AML-M6, e configura l’entità nosografica variamente definita come
“leucemia pura eritroide”, “eritroleucemia a differenziazione minima”, AML-M6
“variante”, o AML-M6b [1108].

Neoplasie dei linfociti B maturi

L’espressione di CD71 è tendenzialmente negativa nella leucemia linfatica


cronica (B-CLL) e nei linfomi B a basso grado [1109], ma tende a positivizzarsi
progressivamente nelle forme a grado intermedio e alto [1110] [28] [1111] [1112], dove
può correlare con l’attività cinetica [1113] e rivestire un significato prognostico [1114].
Debole positività per CD71 è stata segnalata in un caso di leucemia plasmacellulare (PCL)
[1115].

Neoplasie dei linfociti T maturi

L’espressione di CD71 è molto frequente nelle neoplasie dei T linfociti maturi,


con particolare predilezione per i linfomi cutanei (CTCL) e i linfomi T periferici (PTCL)
[1112] [502].

Altre entità nosografiche

L’espressione di CD71 è stata rilevata su percentuali variabili di


polimorfonucleati neutrofili midollari di soggetti affetti da anemia refrattaria con o senza
sideroblasti ad anello [873]. L’espressione di CD71, congiunta a quella di altre molecole
specifiche della linea piastrinica, è stata segnalata sui blasti della cosiddetta “malattia
mieloproliferativa transitoria” (TMPD), descritta nei neonati con sindrome di Down [838]
[173] [1065] [1066] [1067].

107
L’ANTIGENE CD79

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD79 è un dimero legato da un ponte disolfuro, costituito da una


catena alfa (nota anche come Ig/alfa o mb1) del peso di 34 kD sintetizzata da un gene
presente sul cromosoma 19 [1116], e da una catena beta (nota anche come Ig/beta o B29)
del peso di 39 kD sintetizzata da un gene presente sul cromosoma 17 [1117]. L’antigene
CD79 si lega in modo non covalente alle immunoglobuline di membrana per formare il
recettore per l’antigene delle cellule B, o BCR [1118].
L’antigene CD79 è un antigene specifico della linea B linfocitaria. La prima
catena a comparire consiste nella catena alfa, che viene espressa nel citoplasma dei
precursori ancor prima della sintesi delle catene pesanti mu [1119] e secondo alcuni
Autori ancor prima della sintesi di CD19 [296]. La catena beta compare nel citoplasma
del precursore B successivamente, subito dopo la comparsa delle catene mu
intracitoplasmatiche [1120], e viene montata in membrana assieme alla catena alfa
quando vengono espresse le immunoglobuline di superficie.
L’antigene CD79 permane sulla membrana dei B linfociti fino alla maturazione a
plasmacellula, quando viene down-modulato, ma rimane ancora rilevabile nel citoplasma;
non esiste consenso in letteratura riguardo alla catena evidenziabile nelle plasmacellule,
che secondo alcuni Autori consisterebbe nella catena alfa [1119], mentre secondo altri
consisterebbe nella catena beta [1117].

ASPETTI CITOMETRICI

Ancorché un recente report consigli l’adozione di una soluzione permeabilizzante


scelta tra le varie soluzioni del commercio [1121], le procedure di permeabilizzazione
necessarie alla evidenziazione dell’epitopo intracitoplasmatico possono
vantaggiosamente essere ridotte alla semplice preincubazione del campione con una
soluzione lisante del commercio, analogamente a quanto avviene per la dimostrazione
della TdT.

MoAb anti catena alfa

Gli anticorpi rivolti verso la catena alfa dell’antigene CD79 dimostrano


comportamenti diversi a seconda del clone considerato. In particolare, solo il clone ZL7-4
sarebbe in grado di riconoscere un epitopo di superficie [1122], mentre gli altri cloni, fra
cui i cloni HM47 e HM57 [1119], riconoscerebbero un epitopo intracitoplasmatico,
obbligando quindi alla preventiva permeabilizzazione del campione. Grande attenzione
nella revisione della letteratura deve essere posta alla metodologia adottata nell’analisi, in
modo da distinguere se la mancata evidenziazione dell’antigene in membrana sia dovuta
alla sua mancata espressione o all’impiego di un anticorpo selettivamente specifico per il
suo domain intracitoplasmatico.

MoAb anti catena beta

Anche gli anticorpi rivolti verso la catena beta dimostrano comportamenti


eterogenei. In particolare, il clone SN8 sarebbe in grado di riconoscere un epitopo
extracellulare [1123], mentre il clone CB3-1 sarebbe specifico per un epitopo espresso in
membrana [1124].

108
ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori B

L’antigene CD79 è comunemente positivo nella maggior parte delle neoplasie dei
precursori dei B linfociti. In particolare è stato segnalato che:
i) la catene alfa è dimostrabile nel citoplasma del 66% delle forme early B, e
nell’86% delle forme Common e pre-B [1125];
ii) la catena beta è dimostrabile nel citoplasma di una minoranza delle forme
early B e Common, e del 70% delle forme pre-B, ma non sulla superficie
[1125].

Neoplasie dei precursori T

L’antigene CD79 alfa è stato segnalato nel linfoma T linfoblastico in una


percentuale di casi variabile, a seconda delle casistiche, dal 10 al 33% dei casi studiati
[1126] [1127] [1128]. La coespressione di CD79 è stata segnalata anche in un caso di
linfoma linfoblastico T caratterizzato dalla coespressione di antigeni caratteristici delle
cellule NK. Questo caso, presumibilmente inquadrabile come una neoplasia dei
precursori delle cellule NK, coesprimeva anche CD20 [678].
La presenza di CD79 alfa nel linfoma T linfoblastico è stata segnalata anche in
medicina veterinaria, in un caso di linfoma T linfoblastico (T-LBL) del cane [1129].

Leucemie acute mieloidi

L’espressione di CD79 alfa è stata dimostrata con metodiche


immunoistochimiche che usavano il clone HM57 nel 5% delle AML non M3 e nel 90%
delle AML-M3 testate; le AML-M3 costituivano casi tipici con positività per la
traslocazione t(15;17) [1130].
In un’altra casistica, il 6% circa delle AML testate risultava positiva per CD79
alfa; i casi in oggetto venivano interpretati come leucemie bifenotipiche [1131].

Neoplasie dei B linfociti maturi

L’antigene CD79 alfa è generalmente segnalato nelle neoplasie dei B linfociti


maturi, ed è stato documentato anche in entità nosografiche di rara evidenziazione, come
il plasmocitoma primitivo del linfonodo [1132] e il linfoma plasmablastico della cavità
orale [1133]. Eccezioni a questa regola sono costituite dal linfoma primitivo delle sierose,
in cui è stata dimostrata l’assenza di CD79 alfa intracitoplasmatico [650], e dalla B-CLL,
in cui l’espressione di CD79 alfa è caratteristicamente assente [1122]. L’antigene CD79
alfa è stato segnalato anche nel citoplasma delle plasmacellule di un caso di leucemia
plasmacellulare (PCL) [1134].
Anche l’antigene CD79 beta è generalmente segnalato nelle neoplasie dei B
linfociti maturi, ma la sua espressione non è costante; in una casistica costituita da quasi
500 casi di malattie linfoproliferative croniche della serie B, la sua espressione (MoAb
SN8) è stata documentata in meno della metà dei casi di linfoma linfoplasmacitico (LPL),
nell’80% circa dei casi di linfoma follicolare (FL), nel 75% dei casi di linfoma splenico a
linfociti villosi (SLVL), nel 25% dei casi di leucemia a cellule capellute (HCL), e solo nel
5% dei casi di leucemia linfatica cronica (B-CLL) [1135], con una preferenziale
espressione nei casi di stadio clinico più avanzato [1136]. La bassa o assente espressione
di CD79 beta sulle cellule della B-CLL è stata confermata da una serie di segnalazioni

109
[1137] [258] [1136] [1138] [261] [1139], ed è stata imputata alla presenza di un
meccanismo di regolazione post-trascrizionale responsabile della produzione di una
variante di CD79 beta deficitaria dell’esone 3 [1140]. Anche cellule B normali possono
presentare questa variante, che probabilmente è correlata ad uno stato di attivazione
[1140]. In accordo con queste osservazioni, lo studio della catena beta di CD79 assume
una notevole importanza nella diagnosi differenziale tra B-CLL e MCL, e tende a
sostituire CD22 anche nei sistemi a punteggio per la diagnosi delle malattie
linfoproliferative croniche della serie B [1141] [1142].

Neoplasie dei T linfociti maturi

L’espressione di CD79 alfa è stata segnalata in rari casi di linfoma T intestinale


associato a enteropatia [695], in un isolato caso di linfoma T periferico [697] e in un caso
di linfoma nasale a cellule T/NK [695].

Neoplasie delle cellule NK

La coespressione di CD79 è stata segnalata in un caso di linfoma linfoblastico T


caratterizzato dalla coespressione di antigeni caratteristici delle cellule NK. Questa forma,
presumibilmente inquadrabile come una neoplasia dei precursori delle cellule NK,
coesprimeva anche CD20 [678].

Altre entità nosografiche

Sono noti isolati casi di leucemia acuta caratterizzati dalla coespressione di CD7,
CD79 alfa e CD117; questa entità è stata interpretata come un disordine neoplastico della
cellula staminale [1143], e probabilmente coincide almeno parzialmente con la leucemia
acuta positiva per CD13, CD33, CD7 e CD19, precedentemente descritta da Mizutani
[1144].

L’ANTIGENE CD87

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD87 è una proteina GPI-linked del peso di 50-65 kD, codificata da
un gene presente sul cromosoma 19 [1145]. L’antigene CD87 costituisce il recettore per
l’attivatore del plasminogeno “urokinasi-type” (UPA-R), induce la formazione di
plasmina sulla superficie cellulare, e gioca un ruolo fondamentale nella chemiotassi dei
neutrofili [1146]. La molecola è espressa sui monociti e sui loro precursori, sui
granulociti e sui loro precursori (promielociti, mielociti e metamielociti), su di una
sottopopolazione di cellule NK, e su altri tipi cellulari, tra cui l’endotelio e i fibroblasti
[1147] [1148]. I linfociti e le cellule CD34+ non esprimono l’antigene. E’ interessante
notare come una consistente sottopopolazione di neutrofili midollari non coesprima
l’antigene [1149] [1150].

110
ASPETTI CITOMETRICI

I risultati prodotti dalle analisi citometriche cambiano lievemente a seconda del


MoAb adottato nell’indagine; ad esempio i MoAb 3B10 e VIM5 riconoscono differenti
epitopi, e nello studio dell’espressione dell’antigene sui blasti leucemici forniscono valori
più elevati rispetto alle determinazioni compiute con gli altri cloni [1151].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori B

L’espressione di CD87 sarebbe rilevabile in circa il 20% dei casi di leucemia dei
B precursori (B-ALL) [1081].

Leucemie acute mieloidi

L’espressione di CD87 sarebbe segnalata nell’80% circa dei casi di AML [1081],
con presenza pressoché costante presenza nei casi di AML-M3 e AML-M5, elevate
frequenze nei casi di AML-M4, e incidenze molto minori nei casi di AML-M0, AML-M1
e AML-M2 [1081] [1151] [1147] [1150].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD87 è presente anche sulla superficie delle plasmacellule


mielomatose, ed è logico ipotizzarne un ruolo nella digestione proteolitica della matrice
ossea [1152].

L’ANTIGENE CD103

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD103 è una glicoproteina di 144 kD che costituisce la catena alfa


dell’integrina alfaE/beta7, ligando della E-caderina [1153]. L’antigene CD103 è
normalmente espresso su di un particolare subset di T linfociti localizzato nella lamina
propria e nell’epitelio della mucosa intestinale [1154], è stato segnalato sui T linfociti
polmonari attivati [1155], e può essere indotto sui T linfociti periferici CD8+ mediante
stimolazione con PHA [1156]. L’antigene CD103 è normalmente espresso anche su di un
piccolissimo subset di B linfociti presente nel sangue periferico [1157] [904], e può
essere indotto sui B linfociti periferici mediante stimolazione con PMA [1158].

ASPETTI CITOMETRICI

Il cluster CD103 è stato riconosciuto nel 1993 [1159], e raggruppa i MoAb


precedentemente citati come B-ly-7, HML-1, Ber-ACT8 e LF-61 [1160] [1161]. Da un
punto di vista immunoistologico, è possibile che il comportamento degli anticorpi
compresi nel cluster non sia completamente sovrapponibile. Vi è infatti evidenza che, a
differenza di B-ly-7, HML-1 sia in grado di reagire anche con un antigene citoplasmatico
dei macrofagi e delle cellule epiteliali ciliate del nasofaringe; ancora, tutti i T-NHL
positivi per B-ly-7 reagirebbero con HML-1 mentre non avverrebbe il contrario [1162].

111
ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori T

L’espressione di CD103 è segnalata in isolati casi di neoplasia dei precursori T


[1163].

Neoplasie delle cellule B mature

Sebbene esistano casi di leucemia a cellule capellute sicuramente negativi per


CD103 [1164], l’espressione di questo antigene viene considerata come il criterio più
utile per l’identificazione di questa particolare entità nosografica [1165] [1157] [1166]
[407], anche in presenza di un numero di cellule leucemiche particolarmente basso e
valutabile attorno all’uno per cento di tutti gli elementi analizzati [1167]. L’antigene
CD103 può essere espresso in alcuni casi di leucenia a cellule capellute “variante” (HCLv)
e di leucemia a cellule capellute “giapponese” (HCL-J) [407], ma è generalmente assente
sulle cellule del linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL) e delle altre neoplasie delle
cellule B periferiche [1156]. E’ comunque possibile la sporadica segnalazione di isolati
casi di B-NHL positivi per CD103; a questo proposito è utile ricordare che in una
casistica costituita da 100 casi di linfoma splenico a linfociti villosi, le cellule del 15% dei
casi dimostravano reattività con il MoAb B-ly-7 [415].

Neoplasie delle cellule T mature

L’espressione di CD103 costituisce un marcatore utile per l’identificazione del


linfoma T intestinale (EATCL) [1168] [1169] [1170] [1171] [1172] [1173]. Va
comunque tenuto presente che esistono casi di linfoma T intestinale negativi per
l’antigene CD103, e che l’antigene CD103 può essere espresso in linfomi T periferici
(PTCL) diversi dal linfoma intestinale [1174] [1171], nonché in isolati casi di
leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL) [1156], e di linfomi cutanei T (CTCL)
come la micosi fungoide (MF) e la malattia di Sézary (SS) [1175] [1156]. Nei linfomi T
cutanei in generale e nella micosi fungoide in particolare, l’espressione dell’antigene sui
T linfociti neoplastici riguarderebbe soprattutto i T linfociti infiltranti l’epidermide
durante gli stadi precoci della malattia [1176] [1177], e una sua perdita da parte di cellule
precedentemente positive rivestirebbe un significato prognosticamente sfavorevole
[1176].

L’ANTIGENE CD117

ASPETTI GENERALI

L'antigene CD117, detto anche “c-Kit”, è una glicoproteina di 145 kD, codificata
da un gene presente sul cromosoma 4 [1178], e costituisce il recettore per il fattore di
crescita delle cellule staminali, o stem cell factor (SCF), detto anche “steel factor” (SLF)
[1179]. L’antigene CD117 è normalmente presente su di una minoranza di precursori
emopoietici midollari [1180], su di una popolazione di cellule staminali timiche destinate
alla differenziazione linfocitaria [1181], su di una minoranza di timociti “early” [1182],
su di una minoranza di cellule B midollari [1183], e su alcune sottopopolazioni di cellule
NK [1184] [1185]. L’antigene è anche espresso sui mastociti normali e leucemici [114]

112
[831] [1186], e sugli elementi di linee cellulari derivate da tumori di origine
neuroectodermica [1187].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T e B

Nelle leucemie dei precursori T e B l’antigene CD117 sembrerebbe espresso in


una percentuale di casi inferiore al 5%, con una particolare predilezione per le T-ALL
[1188] [1189] [1190] [1191] [1192]. Secondo altri Autori il CD117 comparirebbe nel
10% circa delle ALL pediatriche, senza particolari predilezioni per le forme a precursori
T o B [1193].

Leucemie acute mieloidi

Insieme a CD13, CD33, CD65 e mieloperossidasi, l’antigene CD117 concorre a


costituire una rosa di marcatori il cui studio riveste grandissima importanza nella
diagnostica immunologica delle leucemie acute. Esiste infatti una convenzione formulata
dal Gruppo Europeo per la Caratterizzazione Immunologica delle Leucemie (EGIL),
secondo la quale l’espressione di due di questi marcatori rappresenta requisito sufficiente
per l’attribuzione di una leucemia acuta alla linea mieloide [33] [524] [525].
L’antigene CD117 sembrerebbe espresso nel 60-70% circa dei casi di leucemia
acuta mieloide, con preferenza per i tipi M0, M1 e M2 [1194] [1195] [1189] [477] [1196]
[1197] [90]. Il tipo M3 apparirebbe spesso positivo [1194] [89] [84], mentre le forme
monocitiche acute sarebbero prevalentemente negative [1143], anche se secondo alcuni
autori l’espressione di CD117 sarebbe selettivamente presente nella forma AML-M5a
[83]. Le forme con coinvolgimento della serie piastrinica ed eritroide apparirebbero
invece prevalentemente negative [83] [1143].
La selettività dell’associazione tra antigene CD117 e AML sembra migliorabile
dalla contemporanea esplorazione dell’espressione di CD34; in una recente casistica la
coespressione dei due marcatori da parte dei blasti di ALL era apprezzabile in meno
dell’1% dei casi considerati [1198].
Nel sistema a punteggio per la diagnosi delle leucemie bifenotipiche promosso
dalla EGIL [33], l’espressione di CD117 è stata proposta valere un punto a favore della
linea mieloide [524], ma non sembra rivestire significato prognostico [477]. Lo studio di
CD117 eseguito congiuntamente a quello di CD11b, CD11c, CD15 e CD65, antigeni
normalmente espressi da cellule in stadi più avanzati di maturazione, può essere utile
nella evidenziazione di asincronismi maturativi, e può avere un ruolo nella
evidenziazione della malattia minima residua [477] [580] [84].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD117 non è normalmente espresso dalle cellule delle neoplasie dei
linfociti B maturi, ma è stato segnalato in un caso di linfoma follicolare (FL) con
caratteristica traslocazione t(14;18) [1199]. L’antigene CD117, assente sulle
plasmacellule normali, è stato segnalato sulle plasmacellule di circa un terzo dei casi di
mieloma multiplo [1200] [680], ma non sulle plasmacellule della leucemia
plasmacellulare [405]. Popolazioni di B linfociti CD117+ sono presenti a bassissima
frequenza nel sangue periferico di soggetti affetti da mieloma multiplo, e
presumibilmente appartengono al clone neoplastico [1201].

113
Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD117 è stato segnalato in una piccola serie di casi di linfoma


anaplastico (ALCL) CD30+ [1202].

Altre entità nosografiche

Sono noti isolati casi di leucemia acuta caratterizzati dalla coespressione di CD7,
CD79 alfa e CD117; questa entità è stata interpretata come un disordine neoplastico della
cellula staminale [1143], e probabilmente coincide almeno parzialmente con la leucemia
acuta positiva per CD13, CD33, CD7 e CD19, precedentemente descritta da Mizutani e
coll. [1144]. L’antigene CD117 è stato segnalato nel linfoma di Hodgkin [1202], sulle
cellule della mastocitosi sistemica [114] [116] [1203], e sui blasti delle sindromi
mielodisplastiche [1194] [1186] [873]. Anomalie nell’espressione di CD117 sui
precursori emopoietici sono state evidenziate nella neutropenia congenita di grado
elevato [1204]. L’antigene CD117 è espresso sulle cellule del seminoma [826], dei
tumori filloidi [875], e dei tumori stromali gastrointestinali [1205].

L’ANTIGENE CD138

ASPETTI GENERALI

L’antigene CD138, detto anche sindecano-1, è una glicoproteina ricca di gruppi


eparan-solfato e condroitin-solfato del peso di circa 90 kD, codificata da un gene presente
sul cromosoma 2 [570] e comunemente espressa dalle cellule epiteliali [1206]. Sulle
cellule emopoietiche l’antigene CD138 appare prevalentemente ristretto ai B linfociti
post-germinativi [1207], e come tale è presente nei plasmablasti, nelle plasmacellule, e
nelle cellule delle neoplasie derivate dalle cellule situate in questi stadi maturativi [1208],
nonché nelle cellule di Reed-Sternberg [1209] [1206]. Esistono inoltre isolate
segnalazioni che riguardano l’espressione di CD138 sui precursori dei B linfociti [1210]
[1211] [1206]; nell’esempio riportato è possibile osservare il risultato di un’analisi
multiparametrica in cui un MoAb anti CD138 marca un piccolo cluster di cellule dotate di
parametri fisici e di espressione di CD45 compatibili con quelli dei precursori
emopoietici.

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene CD138 è presente sulle cellule del mieloma multiplo (MM) e della
leucemia plasmacellulare (PCL) [1208] [1212] [1213] [405], nonché sulle cellule di una
nuova entità nosografica di recente definizione, detta linfoma primitivo delle sierose, o
“primary effusion lymphoma” (PEL) [1214] [650] [1215]. Esiste evidenza in letteratura
che non tutte le cellule mielomatose siano in grado di esprimere l’antigene; questo
comportamento può essere spiegato con il fatto che l’antigene viene velocemente
dismesso dalle plasmacellule in apoptosi [1216].
Nell’ambito degli altri linfomi non-Hodgkin la distribuzione dell’antigene CD138
appare alquanto controversa. Mentre secondo alcuni Autori la sua presenza sarebbe
selettivamente ristretta ai plasmocitomi e alle leucemie plasmacellulari [1212] [1217],
secondo altri la sua dimostrazione sarebbe costante nei linfomi con differenziazione

114
linfoplasmacitoide (LPL) e nella leucemia linfatica cronica (B-CLL). In una casistica
costituita da 49 B-NHL, un’analisi effettuata sia con tecniche immunoistochimiche che
con tecniche citometriche mediante il MoAb MCA681 dimostrava la presenza
dell’antigene in tutti i casi di linfoma linfoplasmacitoide (LPL) e di leucemia linfatica
cronica (B-CLL), ma non nei casi di linfoma follicolare (FL), mantellare (MCL) e della
zona marginale (MZL) [1210]. Questo riscontro veniva parzialmente confermato da altri
Autori, secondo i quali l’antigene CD138 veniva costantemente dimostrato nelle cellule
della B-CLL, ma era rilevabile anche in alcuni casi di MCL [1218].
L’antigene CD138 è stato anche segnalato nei linfomi non Hodgkin di soggetti
con infezione da Hiv-1 [1213] [1215], e nella variante plasmablastica del linfoma diffuso
a grandi cellule B (DLBCL) [1219].

Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene CD138 non è espresso dalle cellule delle neoplasie dei linfociti T
maturi [1210].

Altre entità nosografiche

L’espressione di CD138 è segnalata nelle cellule di Hodgkin e di Reed-Sternberg


nella malattia di Hodgkin “classica” [1209] [1206] [1220] [1221] [1206].
L’antigene CD138 è presente anche nelle cellule di tumori diversi da quelli del
sistema emopoietico, come ad esempio i sarcomi epitelioidi [1222] e le neoplasie
epiteliali. L’espressione di CD138 determinata con metodiche immunoistochimiche
rappresenta un fattore prognostico nelle neoplasie del distretto testa-collo [1223] e del
polmone [1224].

L’ANTIGENE HLA DR

ASPETTI GENERALI

L’antigene HLA-DR consiste in un eterodimero costituito da una catena alfa e da


una catena beta, codificate da un gene situato sul braccio corto del cromosoma 6 [176], e
pesanti rispettivamente 36 e 27 kD [1225]. L’antigene HLA-DR è costitutivamente
presente su di una moltitudine di tipi cellulari, tra cui i B linfociti immaturi e maturi (ma
non sulle plasmacellule) [1226], e le cellule presentatrici dell’antigene (APC), come i
monociti, i macrofagi, le cellule dendritiche e le cellule di Langerhans [181] [1227] [1228]
[1229].
L’antigene è costitutivamente espresso sui precursori della serie mieloide ed
eritroide, ma non sulle cellule più mature. In particolare è presente:
1) sulle BFU-E, ma non sulle CFU-E né sugli eritroblasti [1230];
2) sulle CFU-C e sui mieloblasti, ma non su promielociti, mielociti,
metamielociti e granulociti neutrofili [1231];
3) sulle CFU-EO, ma non su metamielociti e granulociti eosinofili [1232];
4) sulle CFU-M e sui megacarioblasti, ma non sulle piastrine [1233].
L’antigene HLA-DR è inoltre inducibile sui T linfociti [1234] [1235], e sui
basofili [184], dove assume il significato di antigene di attivazione. Sui T linfociti
normali l’antigene HLA-DR compare sulla membrana dopo 48-72 ore circa dalla
stimolazione con PHA, e dopo 168 ore è ancora presente sul 30% circa degli elementi
[493].

115
Infine l’antigene è talora espresso sulle cellule epiteliali, dove probabilmente
esercita un ruolo nella etiopatogenesi di alcune patologie autoimmuni [1236] [1237].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori T

L’antigene HLA-DR è generalmente assente sui blasti delle leucemie T


linfoblastiche, ma può essere espresso da parte delle forme più immature [391], in
accordo con il fatto che i protimociti normali esprimono l’antigene [1238].

Neoplasie dei precursori B

L’antigene HLA-DR risulta espresso su circa il 70% dei casi di Common-ALL e


sull’80% dei casi di B-ALL [154]. L’antigene HLA-DR appare intensamente espresso
sulle cellule della ALL con t(12;21) [395]; sulle cellule della ALL positiva per CD10 è
sempre espresso a un’intensità nettamente maggiore di quella riscontrabile sulle cellule
della AML (37.300-46.000 MESF vs 9.400-12.000 MESF) [1239].

Leucemie acute mieloidi.

L’antigene HLA-DR è comunemente espresso sulle cellule delle leucemie


mieloidi, con l’eccezione dei promielociti della AML-M3, in cui è generalmente assente
o espresso in modo molto debole [1240], anche se è stato segnalato in alcuni casi di
AML-M3v [1241]. L’espressione di HLA-DR nelle leucemie acute mieloidi non
costituisce comunque una regola, in quanto l’antigene HLA-DR può essere assente sui
blasti di tutti i sottotipi FAB, con particolare preferenza per l’AML-M2 [1240], e può
essere particolarmente debole sui blasti della AML-M0 [862]. La sua presenza appare
associata con malattia extramidollare [554] e con una remissione completa più breve
[475], mentre la sua assenza (anche escludendo le forme di AML-M3 tradizionalmente
associate a buona prognosi) costituirebbe un fattore prognostico favorevole, e sarebbe
associata a un basso tasso di ricaduta e a una aumentata sopravvivenza ad un anno [473].

Neoplasie delle cellule B mature

L’antigene HLA-DR è generalmente espresso nelle sindromi linfoproliferative


croniche B. Nei linfomi “mixed cell type” la distribuzione della positività per l’antigene
HLA-DR appare spesso bimodale; nei linfomi “mixed cell” di origine follicolare
l’intensità di espressione di HLA-DR sembra covariare con le dimensioni delle cellule
neoplastiche [1242].
In una casistica composta da 26 casi di leucemia plasmacellulare (PCL) e 664 casi
di mieloma multiplo (MM) il 56% circa dei casi di mieloma multiplo e il 21% circa dei
casi di leucemia plasmacellulare coesprimevano HLA-DR [405].

116
Neoplasie delle cellule T mature

L’antigene HLA-DR è presente sulle cellule della maggioranza dei casi di


neoplasia dei T linfociti maturi [107] [770] [502], ed è frequentemente riscontrato sui
linfociti della malattia linfoproliferativa dei T linfociti granulati T-LDGL) [286]. Sulle
cellule della leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL) una sua iper-espressione
appare tipica della forma clinicamente meno aggressiva, detta anche “cronica” [766].

Neoplasie delle cellule NK

L’antigene HLA-DR è generalmente espresso sulle cellule delle neoplasie dei


precursori delle cellule NK [636] [354] [1243], ed è stato frequentemente segnalato su
quelle delle malattie linfoproliferative dei linfociti granulati negative per CD3
(NK-LDGL) [1244] [1245] [1246].

LE IMMUNOGLOBULINE

ASPETTI GENERALI

Le immunoglobuline costituiscono una famiglia di molecole tetrameriche


costituite dall’assemblaggio di due catene leggere pesanti 23 kD, e di due catene pesanti
di peso variabile dai 50 ai 70 kD a seconda dell’isotipo [1247] [1248].
Analogamente a quanto accade per le catene dei TCR, le catene delle
immunoglobuline sono codificate da una serie di sequenze geniche chiamate V (variable),
J (joining), C (constant), e D (diversity). A causa del riarrangiamento genico vengono
prodotte sequenze geniche di tipo V-D-J, che per splicing del RNA vengono legate ad una
regione costante (C) [1249] [1250] [1251]. A seconda delle sequenze geniche montate nel
trascritto, le catene pesanti possono essere distinte in 5 isotipi diversi, detti
rispettivamente mu, delta, gamma, alfa, ed epsilon, mentre le catene leggere vengono
distinte in kappa e lambda. La diversità viene generata sia associando in modo random i
segmenti V, D, J e le catene fra di loro, sia introducendo casualmente variazioni nelle
regioni di giunzione. Le catene pesanti sono codificate da un gene presente sul
cromosoma 14 [1252] [1253], mentre i geni codificanti per le catene leggere kappa e
lambda si trovano rispettivamente sul cromosoma 2 [1254] e sul cromosoma 22 [1255].
Le immunoglobuline sono espresse solamente sui B linfociti, dove compaiono
secondo una sequenza precisamente definita [1256]. La prima molecola evidenziabile
lungo la maturazione B linfocitaria è la catena pesante mu [1257], che appare espressa da
sola nel citoplasma delle cellule pre-B midollari [1258]. Linfociti con questo fenotipo
sono normalmente evidenziabili nel midollo osseo, dove costituiscono fino al 6% delle
cellule linfoidi midollari [1259].
Ad uno stadio immediatamente successivo le catene pesanti mu vengono montate
sulla membrana assieme alle catene leggere; questo fenotipo è peculiare delle cellule B
sIgM+. Gli isotipi delle catene leggere vengono espressi secondo una sequenza
prestabilita, con il riarrangiamento dei geni codificanti per le catene leggere kappa che
precede quello dei geni che codificano per le catene leggere lambda [1260] [1261].
Nel corso della maturazione, le cellule B IgM+ tendono a coesprimere anche IgD.
Da un punto di vista molecolare, questo evento sembra dipendere dal fatto che un
trascritto di RNA messaggero codificante per una determinata sequenza V-D-J viene
alternativamente unito con i trascritti di RNA messaggero codificanti per le regioni
costanti Cmu e Cdelta [1262]. Dopo la maturazione, le cellule pre-B sIgM+ sIgD+

117
abbandonano il midollo per situarsi negli organi linfatici secondari, e cominciano a
coesprimere immunoglobuline di superficie di isotipo gamma o alfa [1263] [1264], che
successivamente, per perdita delle sIgM e sIgD, rimangono le uniche immunoglobuline
espresse in membrana. Maturando ulteriormente a plasmacellula, il B linfocita perde le
immunoglobuline di membrana ed inizia la produzione di immunoglobuline
citoplasmatiche destinate alla secrezione.

ASPETTI CITOMETRICI

La determinazione delle immunoglobuline, sia di superficie che citoplasmatiche,


è stata per lungo tempo l’ultima indicazione al passaggio del campione attraverso
gradiente di densità. In realtà, fatti salvi casi particolarissimi, la determinazione delle
imunoglobuline può essere condotta analogamente a quella delle altre molecole oggetto
di studi immunofenotipici.
La evidenziazione delle immunoglobuline di superficie in citometria a flusso
costituisce un compito non sempre facile. Per comprendere le ragioni di queste difficoltà
bisogna tenere conto che:
i) vi sono spesso situazioni patologiche, come ad esempio la leucemia
linfatica cronica, in cui le immunoglobuline sono espresse ad una densità
così bassa da generare segnali difficilmente differenziabili
dall’autofluorescenza caratteristica degli elementi negativi [1265] [681]
[1266] [1267];
ii) il campione di sangue intero usato per la marcatura contiene grandi
quantità di immunoglobuline solubili, che possono interferire con gli
anticorpi anti-immunoglobuline;
iii) la maggior parte degli anticorpi specifici per le immunoglobuline sono
anticorpi policlonali, che, per quanto ottimizzati per l’uso in citometria a
flusso, possono dare origine a reazioni aspecifiche [1268];
iv) le immunoglobuline sieriche endogene vengono catturate in modo
aspecifico dalle cellule con recettore per Fc di Ig, che si colorano quindi
anch’esse con gli antisieri specifici per le immunoglobuline;
v) nessun singolo anticorpo rivolto verso una catena leggera è in grado di
esaurire il possibile repertorio di epitopi [1269].
Come già accennato, nella maggior parte dei casi questi problemi possono essere
risolti osservando alcune precauzioni principali, ovvero:
i) allestendo controlli negativi con antisieri dello stesso isotipo e
coniugazione di quelli adoperati per marcare il campione;
ii) preincubando il campione di sangue intero con siero di topo per almeno 5
minuti, e lavandolo quindi accuratamente con una soluzione di albumina
bovina al 5 % in fisiologica o PBS;
iii) determinando contemporaneamente anche l’antigene CD19 allo scopo di
restringere l’acquisizione ai soli elementi CD19 positivi, procedura
quest’ultima molto utile soprattutto nell’analisi della distribuzione delle
catene leggere [1270];
iv) adottando ove possibile anticorpi monoclonali dal comportamento noto e
riproducibile;
v) mantenendo un reagentario comprensivo di più cloni specifici per ogni
singola catena leggera [1271].
In casi particolari possono essere prese in considerazione altre modalità operative.
Ad esempio il tentativo di dimostrare la presenza di una restrizione per catene leggere che
non abbia dato alcun frutto con l’analisi delle immunoglobuline di superficie può fornire

118
risultati migliori studiando le immunoglobuline nel citoplasma [1272] [1273] [1274]
[1270]. Ancora, nel caso di analisi compiute su campioni di sangue midollare, può essere
utile affiancare anche la determinazione del CD45, in modo da distinguere i B linfociti
maturi CD19+ CD45+ dai precursori CD19+ CD45dim+. In casi particolari si può tentare
di indurre la resintesi delle immunoglobuline sulle cellule del campione da analizzare,
incubando ad esempio 100 µL di sangue intero in 1 mL di RPMI con FCS al 20 % per
tutta la notte a 37 C° possibilmente in CO2 al 5%. Va infine ricordato che lo studio
citometrico delle immunoglobuline di membrana si può utilmente applicare anche a
cellule diverse dai B linfociti; la ricerca delle IgE di superficie, congiunta all’esplorazione
dei parametri fisici e dell’entità di espressione di CD45, permette di evidenziare
incontrovertibilmente i basofili [1275], che presentano classicamente parametri fisici
compatibili con quelli dei linfociti, espressione di CD45 simile a quella dei
polimorfonucleati neutrofili, e positività per le IgE di superficie, dovuta al legame che i
recettori per Fc di IgE presenti sulla membrana di queste cellule stabiliscono con il
frammento cristallizzabile delle IgE circolanti [926].
L’analisi delle imunoglobuline di superficie può essere rivolta sia alla
esplorazione dell’isotipo delle catene pesanti che allo studio della distribuzione delle
catene leggere. Sebbene ambedue gli approcci rivestano particolare importanza nello
studio delle neoplasie ematologiche, lo studio delle catene leggere è particolarmente
rilevante, in quanto la dimostrazione di una restrizione isotipica è operativamente
interpretabile come evidenza di clonalità [1276] [1277]. L’evidenziazione di popolazioni
B ristrette nel sangue periferico di un soggetto affetto da B-NHL senza leucemizzazione
evidente costituisce riscontro relativamente frequente [1278] ma di significato biologico
e clinico controverso; la presenza di popolazioni monoclonali di B linfociti nel sangue
periferico di soggetti affetti da NHL sembra correlare non tanto con l’invasione midollare,
quanto con lo stadio clinico [1279] [1280]; dato che una massiva infiltrazione midollare
correla con un avanzato stadio clinico, questo dato non contrasta con il riscontro che nel
50% circa dei casi con infiltrazione midollare sono evidenti popolazioni B monoclonali
nel sangue periferico [1281].
Da un punto di vista operativo, viene considerato particolarmente suggestivo per
la presenza di una popolazione clonale B il riscontro di un rapporto kappa/lambda
eccedente un range compreso a seconda dei diversi Autori tra 5,5 e 0,7 [1282], o tra 3,3 e
1,0 [1283], o tra 3,0 e 0,5 [47], oppure in alternativa il superamento di una soglia di
positività percentuale posta rispettivamente a 75% per le cellule positive per catene
leggere kappa e a 65% per le cellule positive per catene leggere lambda [1284]. Un altro
sistema per l’evidenziazione di popolazioni B clonali riposa sul confronto tra la forma
dell’istogramma generato dall’analisi della catena leggera kappa e la forma
dell’istogramma generato dall’analisi della catena leggera lambda [1285]. Tale metodo si
basa sul presupposto che la distribuzione del parametro “catena leggera” sia
sostanzialmente simile nelle due popolazioni normali e antitetiche di B linfociti sIg
kappa+lambda- e sIg kappa-lambda+, per cui la dimostrazione di una differenza
statisticamente significativa tra le due distribuzioni deporrebbe per la presenza di una
popolazione anormalmente omogenea, e quindi suscettibile di essere interpretata come
clonale. Questo metodo, sebbene oggetto di iniziale entusiasmo, non ha goduto in seguito
di grande diffusione. I principali motivi del suo mancato successo sono così riassumibili:
i) difficoltà di individuare antisieri anti catene leggere kappa e lambda di
comportamento sovrapponibile all’analisi citometrica;
ii) difficoltà di stabilire un cut-off nella diversità tra distribuzioni capace di
predire con sufficiente specificità la presenza di una popolazione ristretta
clonalmente;
iii) maggior sensibilità delle tecniche citometriche multiparametriche [1286].

119
E’ verosimile che il compito di dimostrare la presenza di rari cloni B all’interno di
popolazioni B policlonali possa essere affidato con maggiore soddisfazione a tecniche di
biologia molecolare [1287] [1288].
Per quanto concerne le immunoglobuline intracitoplasmatiche, le problematiche
relative alla loro determinazione non si scostano da quelle connesse alla dimostrazione di
altri antigeni intracitoplasmatici, e sono spesso alleviate dal fatto che il numero di
molecole di immunoglobuline contenute nel citoplasma è più elevato di quello montato
sulla membrana [1274] Le procedure standard di permeabilizzazione sono in genere
soddisfacenti, ed i normali kit commerciali risultano adeguati allo scopo. Nello studio
delle neoplasie plasmacellulari, la catena leggera intracitoplasmatica viene spesso usata
come marcatore leader allo scopo di restringere alle plasmacellule trasformate la
determinazione di ulteriori parametri, come la quantità di DNA utilizzabile per
valutazioni cinetiche o nell’analisi della ploidia. Il rapporto tra le catene leggere
intracitoplasmatiche rilevabile nel midollo osseo è stato proposto come parametro utile
nella diagnosi differenziale tra MGUS e mieloma multiplo [1289].

ASPETTI DIAGNOSTICI

Neoplasie dei precursori B

Le neoplasie dei precursori B di regola non esprimono immunoglobuline di


superficie. L’espressione citoplasmatica delle sole catene mu, non accompagnata dalla
presenza di altre catene pesanti o leggere né sulla membrana né nel citoplasma, è
caratteristica delle leucemie derivate dalle cellule pre-B [1258]. E’ nota comunque una
rara forma di leucemia dei precursori B, detta “leucemia acuta transizionale a cellule B”,
caratterizzata dall’espressione in superficie delle sole catene pesanti mu non
accompagnata dall’espressione delle catene leggere [1290] [1291].
Come eccezione a questa regola generale, sono stati riportati in letteratura
sporadici casi di leucemia dei precursori B caratterizzati dalla inaspettata espressione in
superficie di catene leggere [1292] [1293] [1294] o di immunoglobuline complete [1295]
[1296] [1297] [1298]. Questi casi di leucemia dei precursori B positiva per
immunoglobuline di superficie non devono essere confusi con la leucemia acuta B a
cellule mature (ALL-L3 secondo la classificazione FAB), che costituisce una neoplasia
dei linfociti maturi, è associata a specifiche e caratteristiche anomalie cromosomiche, e,
pur classificata in passato tra le leucemie linfatiche acute, non deve essere considerata
una leucemia dei precursori B bensì la presentazione leucemica del linfoma di Burkitt
[1299] [1300].

Neoplasie delle cellule B mature

Il 75% circa delle neoplasie delle cellule B mature esprime immunoglobuline di


membrana, con l’eccezione di alcuni linfomi diffusi a grandi cellule (DLBCL) [1301], e
di sporadici casi di varia classificazione, che non montano immunoglobuline di superficie
per una serie di problemi che spaziano da difetti trascrizionali a difetti di trasduzione alla
membrana di catene regolarmente assemblate [1302] [1303] [1304].

120
COMPORTAMENTO DELLE IMMUNOGLOBULINE
NELLE NEOPLASIE DELLE CELLULE B MATURE
Isotipo di membrana Presenza di Catena leggera
ENTITA’ di più frequente immunoglobuline di più frequente
NOSOGRAFICA riscontro citoplasmatiche riscontro
B-CLL/B-SLL IgM+ D+ / IgM+ D- Possibile /
B-CLL CD8+ / / lambda
LPL IgM+ D- Costante /
MCL IgM+ D+ / lambda
FL IgM+ D- G+ > A+ / kappa
MZL IgM+ D- G+ > A+ Frequente /
HCL IgG3+ / /
HCLv / / lambda
HCL-J IgG+ > A+ / kappa
PEL / / lambda
PCL sIg assenti Costante /
MM IgD+ sIg assenti Costante lambda
BL / / lambda
B-CLL: leucemia linfatica cronica a cellule B; B-SLL: linfoma linfocitico a
piccoli linfociti B; LPL: linfoma linfoplasmacitoide; MCL: linfoma a cellule
mantellari; FL: linfoma del centro follicolare; MZL: linfoma della zona
mantellare; HCL: leucemia a cellule capellute; HCLv: leucemia a cellule
capellute “variante”; HCL-J: leucemia a cellule capellute variante “giapponese”;
PEL: linfoma primitivo dei versamenti; PCL: leucemia plasmacellulare; MM:
mieloma multiplo; BL: linfoma di Burkitt.

121
Catene pesanti

L’espressione preferenziale di determinati isotipi è caratteristica di alcune


malattie linfoproliferative. In particolare:
i) le cellule della leucemia linfatica cronica (B-CLL) esprimono debolmente
immunoglobuline di membrana di isotipo IgM, talora coesprimono IgD
[1305] [1306], ed eccezionalmente coesprimono IgA [1307]; possono
inoltre esprimere immunoglobuline citoplasmatiche [1308] [1309] [1305]
[1306] [1310] [1273] [1274];
ii) le cellule della leucemia B prolinfocitica (B-PLL) esprimono
immunoglobuline di membrana di isotipo IgM e IgD, generalmente con
intensità più elevata di quella riscontrabile nella B-CLL [1311] [269];
iii) le cellule del linfoma linfoplasmacitico (LPL) esprimono
immunoglobuline citoplasmatiche e di membrana con preferenziale
espressione di IgM non accompagnata da IgD, e talora di IgG [1312] [917]
[1313];
iv) tra i linfomi della zona marginale (MZL), la forma nodale esprime
preferenzialmente fenotipo IgM+ IgD- e in casi sporadici anche IgG+ o
IgA+, mentre il linfoma splenico della zona marginale (SMZL e SLVL) e
la forma nodale ad esso correlata tendono a coesprimere IgM e IgD [915];
la presenza di immunoglobuline citoplasmatiche è possibile [1314];
v) gli elementi della leucemia a cellule capellute (HCL) dimostrano
propensione per l’espressione di IgG, con preponderante presenza
dell’isotipo IgG3 [1315] [1316] [433] [1317]; sono noti alcuni casi
caratterizzati dalla presenza di immunoglobuline citoplasmatiche di
isotipo IgM [1315] [1318];
vi) le plasmacellule del mieloma (MM) possono esprimere immunoglobuline
di superficie [1319], e di regola sono intensamente positive per le
immunoglobuline citoplasmatiche [1320] [34] [1321]; gli isotipi
riscontrati secondo ordine di frequenza decrescente sono IgG, IgA, e IgD
[1322]; l’isotipo IgE è di eccezionale riscontro [1323] [1324];
vii) le cellule del linfoma follicolare (FL) esprimono intensamente
immunoglobuline di superficie, con preferenza per l’isotipo IgM e/o IgD;
con frequenze decrescenti sono possibili anche l’espressione di IgG e IgA
[32];
viii) le cellule del linfoma a cellule mantellari (MCL) sono intensamente
positive per le immunoglobuline di superficie, ed esprimono generalmente
IgM, spesso associate a IgD [32] [1325];
ix) le cellule dei linfomi diffusi a grandi cellule B (DLBCL) possono
esprimere immunoglobuline citoplasmatiche, ed esprimono spesso
immunoglobuline di membrana, con preferenziale espressione di IgM, e –
in ordine decrescente – di IgG e di IgA [32] [485];
x) le cellule del linfoma di Burkitt (BL) esprimono immunoglobuline di
membrana con preferenziale espressione di IgM, e – in ordine decrescente
– di IgG [1326].

122
Catene leggere

Alcune entità nosografiche esprimono preferenzialmente una delle due catene


leggere. In particolare:
i) la B-CLL CD8+ esprime preferenzialmente catene leggere lambda [331];
ii) il linfoma mantellare (MCL) esprime preferenzialmente catene leggere
lambda;
iii) il linfoma follicolare (FL) esprime preferenzialmente catene leggere
kappa;
iv) la leucemia a cellule capellute variante (HCLv) esprime preferenzialmente
catene leggere lambda [408];
v) la leucemia a cellule capellute variante giapponese (HCL-J) esprime
preferenzialmente catene leggere kappa [743];
vi) il linfoma primitivo delle sierose (PEL) esprime preferenzialmente catene
lambda [1327];
vii) il mieloma multiplo (MM) IgD esprime preferenzialmente catene lambda
[1328];
viii) il linfoma di Burkitt esprime preferenzialmente catene lambda [1326].
Non sembra che sui linfomi indolenti l’espressione di una determinata catena
leggera rivesta significato prognostico [1329]; vi sono comunque segnalazioni in
letteratura che l’espressione di catene leggere kappa avrebbe un significato prognostico
favorevole nella HCL [1330] e nella B-CLL [1306], mentre l’espressione di catene
leggere lambda avrebbe un significato prognostico favorevole nell’immunocitoma
[1306].
Va poi ricordato che esistono in letteratura isolate segnalazioni di co-espressione
di catene leggere kappa e lambda da parte della stessa cellula B. Tale condizione è stata
riscontrata:
i) in B linfociti periferici normali [1331];
ii) in proliferazioni clonali di B linfociti in corso di malattie linfoproliferative
[1332] [248] [1333];
iii) in linee cellulari ottenute sia da precursori B normali [1334] che da cellule
di leucemie acute linfoblastiche [1335] [1336];
iv) nel midollo osseo e nella milza fetali [1334].
In assenza di studi molecolari non può comunque essere escluso che il
rinvenimento di una doppia positività per le due catene leggere sia da ascrivere alla
presenza di autoanticorpi rivolti verso una struttura presente sulla superficie delle cellule
analizzate [1337] [1338].
Infine, vi sono situazioni particolari in cui la valutazione della distribuzione delle
catene leggere sui B linfociti circolanti è in grado di fornire informazioni clinicamente
utili esulanti dalla dimostrazione di una popolazione clonale. E’ stato infatti segnalato che,
nella fase di plateau del mieloma multiplo, sui linfociti circolanti nel sangue periferico si
verifica la soppressione della catena leggera di isotipo concordante con quello della
paraproteina prodotta dal clone neoplastico [1339] [1340]. La presenza di questa
soppressione rappresenterebbe un fattore prognostico favorevole, mentre la sua perdita
potrebbe assumere il significato di marcatore precoce di progressione [1340]. Va
comunque sottolineato che il fenomeno della soppressione dell’isotipo concordante con
quello della paraproteina non è stato confermata da studi successivi [1341].

123
IL T CELL RECEPTOR

ASPETTI GENERALI

Il recettore per l'


antigene (TCR) è un eterodimero costituito dall’unione di una
catena alfa e di una catena beta, oppure dall’unione di una catena gamma e di una catena
delta. Nonostante queste combinazioni siano di solito mutuamente esclusive, in alcuni
casi di leucemia dei precursori delle cellule T sono stati segnalati anche dimeri composti
da una catena beta e da una catena delta [74].
Il TCR a catene alfa/beta è un eterodimero composto da una catena alfa del peso di
45-60 kD codificata da un gene presente sul cromosoma 14 [1342], e da una catena beta
del peso di 40-50 kD codificata da un gene presente sul cromosoma 7 [1343].
Analogamente a quanto accade per le catene delle immunoglobuline, le catene del TCR
alfa/beta sono codificate da una serie di sequenze geniche chiamate V (variable), J
(joining), C (constant) e, limitatamente alla catena beta, D (diversity). A causa del
riarrangiamento genico vengono prodotte sequenze geniche di tipo V-(D)-J, che per
splicing del RNA vengono legate ad una regione costante (C). La diversità viene generata
sia associando in modo random i segmenti V, D, J e le catene alfa e beta, sia introducendo
casualmente variazioni nelle regioni di giunzione [1344], [124]. Il TCR a catene alfa/beta
è presente sulla maggior parte delle cellule T, dove compare fin dallo stadio di timocita
comune, ed è espresso congiuntamente alle catene dell’antigene CD3 [1345].
Il TCR a catene gamma/delta è un eterodimero composto da una catena delta del
peso di 40-60 kD codificata da un gene presente sul cromosoma 14 all’interno del gene
codificante per TCR alfa [1346] [1347], e da una catena gamma del peso di 45-60 kD
codificata da un gene presente sul cromosoma 7 [1348].

PRINCIPALI CARATTERISTICHE
DELLE DIVERSE FORME DEL TCRgamma/delta
I II III
Frequenza 2/3 dei T 1/3 dei T gamma/delta
gamma/delta
Cgamma1 + - -
Cgamma2 - + +
Reattività con BB3 + - -
Reattività con delta - + +
TCS1
CD8 + + -
Ponti disolfuro + - -
MW della catena gamma 40 kD 55 kD 45 kD
(triplicazione (duplicazione
dell’esone) dell’esone)

Analogamente a quanto accade per le catene del TCR a catene alfa/beta, anche le catene
del TCR a catene gamma/delta sono codificate da una serie di sequenze geniche chiamate
V (variable), J (joining), C (constant), e D (diversity). La particolare posizione del gene
codificante per la catena delta fa sì che il gene Vdelta1 sia trascritto con il segmento del
gene Calfa; è stato infatti segnalato che il MoAb A13, specifico per un epitopo codificato
dal segmento Vdelta1, reagisce con alcune cellule T che esprimono il TCR a catene
alfa/beta [1349]. Il TCR a catene gamma/delta è presente sui T linfociti in due forme
distinte mutuamente esclusive, caratterizzate da lievi diversità strutturali riguardanti la

124
regioni costante della catena gamma [1350] [1351]; la prima forma monta la catena
Cgamma1 contenente un ponte disolfuro, mentre la seconda forma monta la catena
Cgamma2, che non contiene un ponte disolfuro e che può essere ulteriormente distinta in
due sottoforme diverse in funzione del numero di ripetizioni dell’esone. Il TCR a catene
gamma/delta è presente su di una popolazione minoritaria di T linfociti circolanti nel
sangue periferico.
Popolazioni espanse policlonali di T linfociti con TCR gamma/delta sono state
segnalate nel corso di numerose situazioni, tra cui la mononucleosi infettiva da EBV
[1352] [1353], l’infezione da HIV-1 [1354] [1355], i linfomi non-Hodgkin [1356], e il
periodo immediatamente successivo al trapianto di midollo allogenico [1357] [1358].

ASPETTI CITOMETRICI

Anticorpi rivolti verso le regioni costanti

L’evidenziazione della presenza del TCR viene normalmente eseguita con


anticorpi rivolti verso epitopi presenti sulle regioni costanti delle catene.
Per quanto concerne il TCR a catene alfa/beta, un clone frequentemente usato è
costituto dal MoAb BMA-031, che riconosce un epitopo framework e funziona molto
bene su cellule in sospensione [1359]. Un altro MoAb specifico per il TCR a catene
alfa/beta usato frequentemente è il clone betaF1, che riconosce un epitopo di membrana
di difficile accessibilità. Per questo motivo l’anticorpo è efficace su sezioni congelate, ma
il suo impiego su cellule in sospensione richiede un pre-trattamento permeabilizzante,
come ad esempio l’incubazione per 5’ in etanolo al 70% in PBS a -20°C, eventualmente
seguita da fissazione in paraformaldeide all’1% per 15’ a 23°C [1360]. La semplice
enumerazione di T linfociti normali con TCR alfa/beta può essere effettuata anche con
l’uso del MoAb WT31, purché sia tenuto presente che questo MoAb non riconosce il
TCR alfa/beta, ma un epitopo di CD3 epsilon particolarmente accessibile sui linfociti che
montano questo tipo di recettore per l’antigene [141].
Per quanto concerne il TCR a catene gamma/delta, la semplice esplorazione della
consistenza della popolazione di linfociti con questo tipo di recettore è generalmente
effettuata con l’uso di un MoAb rivolto verso un epitopo della regione costante della
catena delta, come ad esempio i MoAb 11F2 e TCRdelta1, ma esistono anche MoAb
rivolti verso epitopi della regione costante della catena gamma, come CgammaM1.

Anticorpi rivolti verso le regioni variabili

Le regioni variabili del TCR alfa/beta, note in passato come regioni Valfa e
regioni Vbeta, sono state rispettivamente ribattezzate TCRAV (T-cell receptor
alpha-chain variable region) e TCRBV (T-cell receptor beta-chain variable region). Le
regioni variabili del TCR alfa/beta sono codificate nell’uomo da una sessantina di distinte
sequenze geniche, i cui trascritti possono essere raggruppati in 24 famiglie diverse in
funzione dell’omologia delle loro sequenze; sono infatti considerate appartenenti alla
stessa famiglia le sequenze che dimostrano un grado di omologia pari o superiore al 75%
[1361]. La nomenclatura delle regioni variabili delle catene del TCR e delle sequenze che
le codificano è complessa e talora contradditoria, ed è sottoposta a revisione continua. E’
attualmente disponibile una serie di antisieri capaci di riconoscere più del 60% delle
famiglie delle regioni variabili beta ed alcune regioni variabili alfa.
Nel sangue periferico di soggetti affetti da neoplasie solide o da alcune neoplasie
delle cellule B mature, come ad esempio la leucenia linfatica cronica (B-CLL) e il
mieloma multiplo (MM), è possibile mettere in evidenza la presenza di popolazioni

125
espanse di T linfociti ristretti per una regione variabile del TCR [1362] [1363] [1364]
[1365] [1366] [1367] [1368]. Queste popolazioni sono considerate il risultato della
persistente stimolazione antigenica esercitata dagli antigeni tumore-associati, combinata
con un ridotto tasso apoptotico [1369].
Rispetto al repertorio delle cellule con TCR alfa/beta, quello delle cellule con
TCR gamma/delta appare consistentemente più ridotto. La maggior parte dei linfociti
cutanei gamma/delta usa le regioni variabili Vgamma2 e Vdelta2 [1370], mentre la
maggior parte dei linfociti intraepiteliali intestinali assembla le regioni Vgamma8 e
Vdelta1 [1371]. Nel sangue periferico dell’adulto, la maggior parte delle cellule con TCR
gamma/delta (dal 50 al 95% di tutte le cellule gamma/delta periferiche) assembla le
regioni variabili Vgamma9 e Vdelta2 con la regione costante Cgamma1 [1351] [1372],
[1373] [1374]. La seconda popolazione più frequentemente rappresentata nel sangue
periferico è costituita da cellule che assemblano la regione Vdelta1 con regioni diverse da
Vgamma9; le cellule esprimenti le rimanenti regioni variabili Vgamma e Vdelta sono
estremamente rare [1351] [1373].
Per motivi sconosciuti, in corso di HCL i linfociti con TCR a catene gamma/delta
presenti nella milza assemblano preferenzialmente la regione variabile Vdelta2 anziché la
regione Vdelta1 normalmente espressa nel comparto splenico [1375]. L’espressione
preferenziale di alcune regioni variabili è comunque verificabile anche in alcune
situazioni patologiche di tipo reattivo: ad esempio nella ehrlichiosi sono riscontrabili nel
comparto periferico popolazioni espanse di T linfociti con TCR a catene gamma/delta di
fenotipo Vgamma9/Vdelta2 [1376].

ASPETTI DIAGNOSTICI

L’espressione del TCR sulla membrana delle cellule T è condizionata dalla


presenza della molecola CD3 [1345]. Ciò fa sì che il TCR non sia reperibile sugli
elementi delle neoplasie dei precursori delle cellule T derivate dalle cellule più immature,
né sulla membrana delle cellule delle neoplasie dei T linfociti maturi in cui l’espressione
di CD3 sia difettosa.

Neoplasie dei T precursori

Sulle neoplasie dei precursori delle cellule T positivi per TCR, il TCR a catene
alfa/beta e il TCR a catene gamma/delta sono espressi più o meno nella stessa
proporzione [74]. L’espressione del TCR a catene gamma/delta sembra correlare con una
migliore sopravvivenza, ma un’analisi multivariata non riesce ad attribuire un significato
prognostico indipendente all’espressione di un particolare tipo di TCR [74].

Neoplasie delle cellule T mature

La maggior parte delle neoplasie delle cellule T mature CD3+ coesprime il TCR a
catene alfa/beta, mentre per contro alcune particolari entità nosografiche, come il linfoma
epatosplenico (HSTCL) e il linfoma panniculitico (SPTCL), tendono a esprimere il TCR
a catene gamma/delta con una frequenza variabile dalla maggioranza alla quasi totalità
dei casi riportati in letteratura [1377] [1378] [1379].
Per quanto concerne il ruolo dello studio delle regioni variabili nella diagnostica
delle neoplasie delle cellule T mature, va detto che il riscontro della restrizione per una
regione variabile costituisce uno strumento diagnostico utilissimo, in quanto permette di
tracciare con sicurezza la presenza di popolazioni trasformate nel campione analizzato,
permettendo di evidenziare cellule neoplastiche nel sangue periferico anche in assenza di

126
leucemizzazione evidente [1380]; e ciò non tanto perché la restrizione per una regione
variabile possa essere direttamente considerata prova di clonalità, quanto perché
popolazioni ristrette clonalmente esprimono la stessa regione variabile [1381] [1382]
[1383] [1384]. In un caso eccezionale, sulle cellule della stessa popolazione di linfociti
neoplastici è stata documentata la contemporanea presenza di due distinte e riarrangiate
catene TCR alfa e di due distinte e riarrangiate catene TCR beta [1385]. Tale evenienza è
presumibilmente dovuta a incompleta esclusione allelica dei geni per il TCR, fenomeno
peraltro già documentato anche nei T linfociti normali soprattutto a carico delle catene
alfa [1386] [1387] [1388] [1389].
Va ricordato infine che in alcune sindromi linfoproliferative alcune regioni
variabili sono espresse in modo preferenziale. Le malattie linfoproliferative dei linfociti
granulati T (T-LDGL) tendono ad esprimere preferenzialmente le regioni variabili
TCRBV 13.1, TCRBV 8, TCRBV 6 e TCRBV 5 [981] [1390], il linfoma epatosplenico
(HSTCL) con TCR gamma/delta sembra montare preferenzialmente la regione variabile
TCRVD 1 [1391], e il linfoma sottocutaneo panniculitico (SPTCL) a cellule gamma/delta
sembra esprimere una predilezione per la regione variabile TCRDV 2 [1392] [1391]. E’
stato anche riportato che le cellule linfonodali delle forme incipienti o franche di ATLL,
ma non quelle della linfoadenite associata a HTLV-I, tendono a esprimere
preferenzialmente TCRAV2 [1393].

LA MIELOPEROSSIDASI

ASPETTI GENERALI

La MPO, o mieloperossidasi, è un enzima lisosomiale codificato da un gene


situato sul braccio lungo del cromosoma 17 [1394], coinvolto nella traslocazione t(15;17)
caratteristica della AML-M3 [1395]. L’enzima è fisiologicamente presente nei granuli
azurofili dei polimorfonucleati neutrofili, dove compare verso lo stadio di promielocita
[1396] [1397], ma è rilevabile con tecniche citometriche o immunocitochimiche già a
livello dei precursori midollari CD34+ [1398] [1399]. Come molti altri enzimi
lisosomiali, la MPO è sintetizzata come precursore di grandi dimensioni, che viene
successivamente processato e trasportato ai lisosomi [1400]. Il prodotto della prima
traslazione è costituito da una proteina di circa 80 kD, che viene successivamente
sottoposta all’azione delle glicosidasi e a maturazione proteolitica fino a dare origine alla
MPO nativa, composta da subunità pesanti rispettivamente 60 e 12 kD [1396].

ASPETTI CITOMETRICI

La mieloperossidasi è un antigene lisosomiale, come la lattoferrina, il lisozima e


CD68, e la sua evidenziazione richiede la permeabilizzazione del campione, che può
essere effettuata in modo soddisfacente con una serie di soluzioni permeabilizzanti del
commercio appositamente sintetizzate [1401] [1121], o anche semplicemente mediante
incubazione con alcune soluzioni commerciali destinate alla lisi dei globuli rossi [1402]
[1403].

127
ASPETTI DIAGNOSTICI

Leucemie dei precursori B

In una casistica composta da 57 casi di B-ALL infantile tutti negativi alla ricerca
citochimica della perossidasi, la maggior parte dei casi risultava positiva per la presenza
di mieloperossidasi “immunoreattiva” e/o per la ricerca del suo RNA messaggero [1404];
questi dati venivano confermati in un’altra casistica costituita da altri 43 casi di B-ALL
infantile, in cui rispettivamente il 56% e il 65% dei casi studiati risultava positivo per la
presenza di trascritti MPO-specifici o per la presenza dell’enzima [1405]. In un’altra
casistica costituita da 82 casi di B-ALL dell’adulto, un antisiero policlonale anti MPO era
in grado di evidenziare la presenza dell’enzima nel 23% dei casi. Nella casistica in
oggetto gli Autori riportavano che, rispetto ai casi MPO negativi, la positività per MPO
era associata a una maggior frequenza di espressione di CD13 e CD15, alla presenza di
traslocazione t(9;22), a una più bassa frequenza di malattia extramidollare, e ad una
migliore sopravvivenza globale. I suddetti Autori non solo non consideravano
l’evidenziazione di MPO nella B-ALL come sostegno alla diagnosi di leucemia
bifenotipica, ma auspicavano una modifica dei sistemi di scoring delle leucemie acute
volto a modificare l’importanza della positività per MPO nell’attribuzione di linea
[1406].

Leucemie acute mieloidi

Insieme a CD13, CD33, CD65 e CD117, la mieloperossidasi concorre a costituire


una rosa di marcatori il cui studio riveste grandissima importanza nella diagnostica
immunologica delle leucemie acute. Esiste infatti una convenzione formulata dal Gruppo
Europeo per la Caratterizzazione Immunologica delle Leucemie (EGIL), secondo la
quale l’espressione di due di questi marcatori rappresenta requisito sufficiente per
l’attribuzione di una leucemia acuta alla linea mieloide [33] [524] [525].
La mieloperossidasi (MPO) ricercata mediante metodiche immunofenotipiche
(mieloperossidasi “immunologica”) è presente in una percentuale di leucemie acute
mieloidi che sfiora il 94% dei casi, percentuale maggiore di quella evidenziabile con le
sole tecniche citochimiche [1407]. Da ciò deriva il fatto che lo studio della
mieloperossidasi è essenziale nella diagnostica delle leucemie mieloidi acute, in quanto
contribuisce ad attribuire alla linea mieloide tutti i casi in cui l’enzima eventualmente
presente non possa essere rilevato con le tradizionali tecniche citochimiche, concorrendo
così alla diagnosi di AML-M0 [1408]. Le tecniche immunofenotipiche sono in grado di
dimostrare elevate espressioni dell’antigene in tutti i casi di AML-M1 e AML-M2. Nelle
forme M3 e M3v l’espressione dell’enzima è particolarmente elevata [1409], mentre può
essere debole in AML-M5 ed assente sia nella AML-M6 e che nella AML-M7.

Neoplasie delle cellule B mature

La mieloperossidasi è di regola assente nelle neoplasie dei linfociti B maturi. E’


tuttavia noto un isolato caso di linfoma B angiotropico (IVLBL) positivo per MPO
[1410].

128
Neoplasie delle cellule NK

La mieloperossidasi è stata sporadicamente documentata nelle cellule di alcuni


casi di leucemia acuta suscettibili di essere riclassificati come casi di neoplasia dei
precursori delle cellule NK. Tra questi casi vanno annoverati:
i) la cosiddetta "myeloid/NK acute leukemia" segnalata da Scott, con
fenotipo CD33+, CD56+, CD11a+, CD13dim+, CD15dim+, CD34+/-,
HLA-DR-, CD16-, CD2-, CD3-, CD8-, e caratterizzata da blasti con
nuclei profondamente incisi, scarso citoplasma con fini granulazioni
azurofile, e fine positività granulare per Sudan Black e per perossidasi
[636];
ii) i 10 casi di AML con fenotipo MPO+, cyCD3+, CD2+, CD7+, descritti da
Cross e provvisoriamente definiti come “AML con caratteristiche T
linfoidi” [79];
iii) i 6 casi con fenotipo CD1-, CD4-, CD8-, CD7+, MPO+, cyCD3+, descritti
da Masuda, e classificati operativamente come leucemia “mixed lineage”
[158].

LA TDT (TRANSFERASI DEOSSI-NUCLEOTIDIL TERMINALE)

ASPETTI GENERALI

La TdT, o transferasi deossi-nucleotidil terminale, è una DNA polimerasi


nucleare (EC 2.7.7.31) codificata da un gene situato sul braccio lungo del cromosoma 10
nella regione q23-q25 [1411]. L’enzima è fisiologicamente presente negli stadi più
immaturi della differenziazione linfoide B e T [1412]. In particolare la TdT è presente nei
protimociti, nei timociti immaturi, e nei timociti comuni [1413] [1412] [1414] [27],
nonché nei progenitori delle cellule B CD79+ CD19-, nelle cellule pre-pre-B e nelle
cellule pre-B [702] [1415] [1416]. La localizzazione dell’enzima nella cellula varia con il
variare del ciclo cellulare. Mentre durante l’interfase l’enzima appare situato nel nucleo,
durante la metafase la sua collocazione è citoplasmatica, per ricompartimentarsi nella
struttura nucleare solo nelle fasi successive al momento della formazione delle cellule
figlie [1417].
In base a quanto esposto, nel timo e nel midollo osseo normali è possibile
individuare infrequenti popolazioni di cellule positive per TdT. La numerosità di questi
elementi nel midollo normale si aggira non oltre al 7% nei bambini e al 2% negli adulti
[1418] [1419]. Con l’eccezione di isolati protimociti, la totalità degli elementi TdT+
presenti nel midollo osseo normale è costituita da precursori B (ematogoni) positivi per
CD79a; questi elementi possono essere sia positivi che negativi per CD19 [296]. L’ampia
sovrapposizione tra precursori B ed elementi TdT+ rende ragione dell’aumento di questi
ultimi nel midollo osseo rigenerante [1419]. Nel sangue periferico non si repertano
normalmente cellule positive per TdT [1413]. Le tonsille contengono cellule TdT+; il
riscontro in questi distretti di cellule positive per l’enzima non dovrebbe essere “ipso
facto” interpretato come segno della presenza di una neoplasia dei precursori T o B
[1420].

129
ASPETTI CITOMETRICI

L’evidenziazione citometrica della TdT prevede la preventiva permeabilizzazione


del campione. Questo effetto è ottenibile con una serie di protocolli diversi, che a seconda
degli Autori si fondano sull’uso della saponina [1421], o di procedure combinate a base di
formaldeide e detergenti non ionici [1422]. Attualmente si è affermata la tendenza a usare
soluzioni permeabilizzanti commerciali, dotate di comportamento standardizzato e
riproducibile. E’ interessante notare che possono essere efficaci come soluzioni
permeabilizzanti per l’evidenziazione della TdT anche alcune soluzioni commerciali
proposte per la lisi dei globuli rossi nei campione di sangue intero [1423] [1424] [1401].
A tale proposito è stato recentemente proposto un metodo di ricerca della TdT consistente
nell’aggiunta del MoAb specifico al tubo del controllo negativo, e nella rianalisi del
campione dopo incubazione e lavaggio [1425].

ASPETTI DIAGNOSTICI

La virtuale assenza di elementi TdT+ nei comparti diversi da timo e midollo osseo
rende la TdT un elemento prezioso per la ricerca della malattia minima residua in
comparti come il sangue periferico, il liquido cefalorachidiano e gli organi linfatici
periferici, con la possibile eccezione delle tonsille [1420]. La significatività della
positività per la TdT viene particolarmente accentuata nei casi in cui le cellule
neoplastiche coesprimano TdT e antigeni mieloidi [1426] [1427].
Dato che la TdT può essere evidenziata anche con metodiche enzimatiche e
immunoistochimiche, e dato che anche le metodiche citometriche dimostrano un elevato
grado di eterogeneità riguardante le procedure di permeabilizzazione, il tipo di anticorpo
adottato e l’impiego di tecniche dirette e indirette, è necessario provvedere alla
valutazione critica dei metodi qualora si proceda alla revisione dei dati riportati in
letteratura.

Neoplasie dei precursori T e B

Una quota variabile dall’80 al 90% di tutte le neoplasie dei precursori B e T risulta
positiva alla ricerca della TdT [1428] [1429] [1430] [205]. E’ possibile che la percentuale
di neoplasie dei precursori negativa per TdT si riduca con il progressivo miglioramento
delle tecniche di evidenziazione; sono comunque documentati in letteratura casi di
neoplasie dei precursori T sicuramente caratterizzati dall’assenza dell’enzima [1431].

Leucemie acute mieloidi

La presenza della TdT è stata riscontrata in una percentuale di leucemie acute


mieloidi variabile dal 5 al 20% [1432] [1433] [1430] [1434] [1435] [81], con una
particolare predilezione per i sottotipi FAB M0 e M1 [1435]. In alcuni casi è stata
postulata un’associazione tra la positività per la TdT e la presenza delle traslocazioni t(6;9)
e t(8;21) [1426] [1435]. La positività per la TdT può riguardare solo una frazione della
popolazione neoplastica; secondo alcuni Autori, in quasi tutti i casi di leucemia acuta
mieloide è possibile dimostrare popolazioni cellulari minoritarie positive per l’enzima
[1436]. In accordo con questo assunto, è stato segnalato che nel 50% dei casi di AML-M2
con t(8;21) è possibile dimostrare TdT in almeno il 5% dei mieloblasti [1437].
La presenza della TdT è stata messa in relazione con il riarrangiamento dei geni
codificanti per il TCR e/o per le immunoglobuline, evenienza che si verifica
frequentemente nelle leucemie acute mieloidi [1438]. L’espressione della TdT,

130
unitamente a quella della pgp (proteina della multidrug resistance)e ad altri riscontri
citogenetici, è stata considerata come un fattore prognostico sfavorevole [1433] e
predittivo di resistenza alla chemioterapia [1439].

Neoplasie delle cellule B mature

Le neoplasie delle cellule B mature non esprimono la TdT [1432] [1418] [1440]
[1430]. I linfomi B diffusi a grandi cellule, il linfoma di Burkitt, la variante blastica del
linfoma mantellare sono omogeneamente negativi per l’enzima, e la TdT costituisce un
prezioso elemento discriminante tra queste forme e le neoplasie dei B precursori. E’
tuttavia noto almeno un caso di B-ALL, caratterizzata da tipica morfologia L3,
espressione delle immunoglobuline di superficie e traslocazione t(8;14), che risultava
positiva alla ricerca della TdT [1441].

Neoplasie delle cellule T mature

Ancorché esistano pareri contrari, [1418] [1440], una piccola percentuale di


neoplasie delle cellule T mature è stata descritta positiva alla ricerca della TdT [1430].

Neoplasie delle cellule NK

La TdT è stata sporadicamente segnalata negli elementi del linfoma blastico a


cellule NK a fenotipo CD3-, CD4+, CD56+ [1442] [354] [837] [234] [1443] [230] [871].

Altre entità nosografiche

Circa il 30-40% dei casi di crisi blastica linfoide di leucemia mieloide cronica
(CML) risulta positivo alla ricerca della TdT [1432] [1430]; la presenza di tale positività
sembra correlare con la capacità di rispondere a una terapia a base di vincristina e
prednisone [1444].

131
132
PARTE SECONDA

LE DIVERSE ENTITÀ
NOSOGRAFICHE

133
134
INTRODUZIONE

La classificazione delle neoplasie ematologiche adottata in questo libro si rifà


liberamente alla classificazione detta “REAL/WHO classification” [1321]. Ove
necessario ai fini di una maggiore chiarezza, sono state arbitrariamente interpolate entità
nosografiche riconosciute come autonome dalla successiva classificazione WHO [485], e
sono state tentate correlazioni con alcune classificazioni precedenti, quali la
classificazione secondo Lukes e Collins [1445], la classificazione aggiornata di Kiel
[1446], e la cosiddetta REAL classification [32]. Tutte queste classificazioni sono state
poi integrate con le classificazioni delle leucemie acute, che a loro volta spaziano dalla
classificazione FAB [1447] alla classificazione WHO [485], passando attraverso i primi
tentativi di classificazione integrata [1448] [1449] e alla classificazione EGIL [33]
formulata su base immunologica [33]. A tutte queste classificazioni, eventualmente
integrate dalla cosiddetta Working Formulation del National Cancer Institute [1450] e
dalla classificazione EORTC dei linfomi cutanei primitivi [1451], si rimanda per ulteriori
approfondimenti.
Nella trattazione degli aspetti fenotipici delle neoplasie ematologiche è stata
attribuita particolare rilevanza alle entità nosografiche capaci di invadere i comparti
periferico e midollare, ed è stato ristretto lo spazio dedicato a quelle forme in cui
l’approccio citometrico non è possibile o non è in grado di fornire informazioni
clinicamente rilevanti. In questo senso poco è stato detto sui linfomi a grandi cellule, e
nulla sulle sindromi mieloproliferative croniche e sulla malattia di Hodgkin. Si è
comunque tentata una trattazione anche delle forme di rara o assente leucemizzazione in
quanto:
1) in molte forme linfomatose la leucemizzazione è sporadicamente possibile, e in
tal caso comporta notevoli problemi di diagnostica differenziale;
2) anche in assenza di leucemizzazione “sensu strictu” è spesso possibile
evidenziare nel periferico la presenza di popolazioni cellulari rappresentative del tumore
originario [1452] [1380];
3) è sempre più frequente l’applicazione dell’analisi citometrica a campioni
diversi dal sangue intero, come campioni di sangue midollare, aspirati da cavità, e biopsie
effettuate con ago sottile.
Infine, si è deciso di non trattare alcuni argomenti in rapida evoluzione al
momento della stesura, come ad esempio le sindromi mielodisplastiche.

135
136
CLASSIFICAZIONE REAL/WHO DELLE NEOPLASIE
LINFATICHE (ESCLUSO IL LINFOMA DI HODGKIN)
NEOPLASIE DELLE CELLULE B NEOPLASIE DELLE CELLULE
T/NK

NEOPLASIE DEI PRECURSORI NEOPLASIE DEI PRECURSORI

Leucemia/linfoma linfoblastico B Leucemia/linfoma linfoblastico T

NEOPLASIE DELLE CELLULE NEOPLASIE DELLE CELLULE


MATURE MATURE

Leucemia linfatica cronica a B linfociti / Leucemia prolinfocitica a T linfociti


linfoma linfocitico (B-CLL/SLL). (T-PLL).
Leucemia prolinfocitica a B linfociti Leucemia dei T linfociti granulati
(B-PLL). (T-LDGL, T-GLL).
Linfoma linfoplasmacitico. Leucemia a cellule NK.
Linfoma della zona marginale splenico con Linfoma/leucemia a cellule T dell’adulto
(SLVL) o senza (SMZL) linfociti villosi. (ATLL).
Leucemia a cellule capellute (HCL). Linfoma extranodale nasale a cellule T/NK
(NTCL, NTL).
Mieloma multiplo (MM) / leucemia Linfoma a cellule T con enteropatia (EATL,
plasmacellulare (PCL). EATCL).
Linfoma della zona marginale extranodale Linfoma epatosplenico a cellule T con TCR
(MALToma). a catene gamma/delta (HSTCL).
Linfoma della zona marginale nodale con Linfoma sottocutaneo panniculitico a
(MBCL) o senza (MZL) cellule B cellule T (SCPTCL).
monocitoidi.
Linfoma follicolare (FCL, FL). Micosi fungoide (MF) / sindrome di Sezary
(SS).
Linfoma mantellare (MCL). Linfoma anaplastico a grandi cellule
(ALCL) T o null, primitivamente cutaneo.
Linfoma diffuso a grandi cellule (DLBCL), Linfoma T periferico (PTCL) non altrimenti
comprensivo delle varianti centroblastica, caratterizzato, comprensivo del linfoma
immunoblastica, anaplastica, epitelioide di Lennert e del linfoma della
plasmablastica, ricca in cellule T o istiociti, zona T.
e linfomatoide granulomatosa, e dei Linfoma T angioimmunoblastico (AILT,
sottotipi mediastinico, intravascolare e AITL)
primitivo dei versamenti (PEL).
Linfoma/leucemia di Burkitt (BL). Linfoma anaplastico a grandi cellule
(ALCL) T o null, primitivamente sistemico.

137
138
NEOPLASIE DEI PRECURSORI B

CONSIDERAZIONI GENERALI

L’immunofenotipizzazione costituisce, assieme alla citogenetica, uno dei due


pilastri su cui si fonda la classificazione delle leucemie acute non mieloidi; questa
classificazione ha ormai soppiantato la prima classificazione morfologica formulata dal
gruppo franco-americano-britannico (classificazione FAB). È appena il caso di ricordare
come non vi sia relazione tra la classificazione FAB e le varie entità nosografiche, con la
sola eccezione della forma L3, che tuttavia non può essere considerata “sensu strictu” una
neoplasia dei precursori B in quanto è costituita da cellule B mature.
La classificazione immunologica delle neoplasie dei precursori B ha subito nel
corso del tempo una serie di rimaneggiamenti, ed è presumibile che venga modificata
ancora in funzione dell’acquisizione di nuove conoscenze. Tuttavia al momento attuale la
classificazione più diffusa è ancora la classificazione EGIL del 1995, che classifica le
leucemie linfoblastiche della serie B in quattro sottogruppi principali [33], ovvero:
i) forme B-I, o “pro-B” (dette anche “early B CD10-”, oppure “pre-pre B”)
con fenotipo B CD19+, CD79alfa+ e/o CD22+, TdT+;
ii) forme B-II, o “common” (dette anche “early B CD10+”) positive per
CD10;
iii) forme B-III, o “pre-B”, con catene pesanti µ intracitoplasmatiche [1258];
iv) forme B-IV, o B mature, positive per catene leggere intracitoplasmatiche o
di superficie.

PRINCIPALI SOTTOTIPI DELLA B-ALL


SOTTOTIPO CD79a CD19 CD10 CD20 TdT cy mu sIg DR
Early B + + - - + - - +
CD10-
Early B + + + ± + - - +
CD10+
Pre B + + + ± + + - +
Transitional + + + ± + + + +
pre B/B (mu)
Mature B + + ± + ± -/+ + +

Va osservato che alcuni autori riconoscono l’esistenza di una forma intermedia


(transitional) tra le forme pre-B e le forme B mature, contraddistinta dalla espressione in
membrana della catena pesante mu non accompagnata da catene leggere [1290] [1291];
sono stati anche segnalati isolati casi di leucemia linfoblastica B caratterizzati dalla sola
espressione monotipica delle catene leggere, con mancata espressione delle catene
pesanti [1293] [1294]. Questi ultimi casi andrebbero probabilmente catalogati tra le
neoplasie dei precursori in quanto positivi per TdT ma negativi per traslocazioni
cromosomiche coinvolgenti c-myc. Per quanto concerne le cosiddette forme a cellule B
mature, vi è ormai generale consenso nel considerarle almeno parzialmente omologhe al
linfoma di Burkitt coinvolgente il midollo osseo [1300], e in questo senso verranno
trattate nel paragrafo dedicato a questa entità nosografica.
Le leucemie linfatiche dei precursori B rappresentano un insieme di sindromi
correlate ma diverse, in alcune delle quali è possibile evidenziare la presenza di una
distinta anomalia cromosomica. Dato che entità nosografiche contraddistinte da
situazioni genetiche peculiari tendono a presentare caratteristiche biologiche specifiche, è

139
possibile almeno tentativamente classificare le neoplasie dei precursori B in funzione del
loro cariotipo e investigarne il comportamento fenotipico, nel tentativo di isolare fenotipi
predittivi di determinate lesioni cromosomiche.

CORRELAZIONI TRA GENOTIPO E FENOTIPO NELLA B-ALL


CD10 CD19 CD20 CD34 CD45*
t(1;19) + + +/- - ±
(1.8-4E3 MESF) (<7E2 MESF)
t(4;11) - + - + nel 50% dei casi ±
(4.8E3 MESF)
t(9;22) + + + nell’80% dei casi ±
(38E3 MESF)
t(12;21) + ++ ± + (bimodale o disperso) ±-
(3E4 MESF)) (5.1E3 MESF)
iper + + + + -
diploidia (>3E4 MESF) (8.3E3 MESF)
*: espressione confrontata con quella presentata dai linfociti maturi; MESF: mean
equivalents of soluble fluorochrome.

In particolare si nota che:


i) le forme con traslocazione t(1;19) identificano un gruppo relativamente
omogeneo di pazienti con ALL di tipo pre-B dotate di un caratteristico
fenotipo CD19+, CD10+ (debolmente espresso), CD22+, CD34-,
CD20+/- [1453] [846];
ii) le forme con traslocazione t(4;11) e t(11;19) sono accomunate dalla
presenza di riarrangiamenti del gene MLL, e sono caratterizzate dalla
frequente espressione di CD15 e di CD65 [1454] [574] [573], dalla
frequente assenza di CD10 [1454] [380], da una debole espressione di
CD34 nel 50% circa dei casi [846], da una espressione di CD45
particolarmente intensa [679], e dalla espressione della molecola NG2,
omologo del proteoglicano condroitinsolfato riconosciuto dal MoAb 7.1
[573] [1455];
iii) le forme con traslocazione t(9;22) sono positive per CD10, esprimono
intensamente CD34 nell’80% dei casi [846], sono spesso positive per
CD13, coesprimono CD38 in modo debole ed eterogeneo [523], e sono
generalmente positive per l’antigene CD66c riconosciuto dal MoAb
KORSA [1094];
iv) le forme con traslocazione t(12;21) esprimono CD10 a intensità media,
esprimono debolmente CD34 spesso con modalità bimodale [846],
esprimono CD45 a intensità ridotta [395] [942], spesso coesprimono
CD13, e in genere presentano assente o ridotta espressione di CD20 [522]
[395];
v) le forme con corredo cromosomico iperdiploide esprimono intensamente
CD10 [395], esprimono debolmente CD34 [846], e presentano intensità di
espressione di CD45 particolarmente bassa [941] [937].

140
RAPPORTI TRA LEUCEMIA LINFOBLASTICA E LINFOMA
LINFOBLASTICO

Sebbene la classificazione REAL/WHO accorpi in un’unica definizione la


leucemia linfoblastica e il linfoma linfoblastico [485], secondo altri Autori queste due
forme, ancorché ampiamente sovrapponentisi, configurerebbero due entità biologiche
diverse e distinguibili in base alle modalità di presentazione e alla storia naturale [1456]
[1457] [1458] [623]. La principale differenza tra leucemia linfoblastica e linfoma
linfoblastico consisterebbe nel quadro clinico di esordio, che nel caso del linfoma B
linfoblastico è caratterizzato da scarso o assente coinvolgimento dei comparti midollare e
periferico, ma da frequente interessamento di siti extranodali [1458] [1459]. Questa
diagnosi differenziale non è sempre possibile, soprattutto di fronte a casi clinici che
insorti come linfoma leucemizzino nel prosieguo della loro evoluzione [1460]. Alcuni
Autori hanno definito convenzionalmente come linfoma linfoblastico l’entità nosografica
che al momento della sua presentazione sia connotata dalla presenza di meno del 25% di
blasti nel midollo osseo [1461] [1462] [485] [1459]. Da un punto di vista
immunofenotipico i marcatori più frequentemente espressi sarebbero la TdT e gli antigeni
CD19, CD79a, CD10, e HLA-DR, mentre CD45 e CD20 sarebbero presenti solamente in
due terzi dei casi [1459].

141
NEOPLASIE DEI PRECURSORI T

CONSIDERAZIONI GENERALI

Secondo la classificazione EGIL, anche le leucemie linfoblastiche della serie T


vengono generalmente distinte in quattro gruppi principali [33], ovvero:
i) forme T-I o pro-T, con fenotipo cyCD3+, CD7+, TdT+, ma negative per
CD2, CD5, e CD8;
ii) forme T-II o pre-T, caratterizzate dalla comparsa di CD2 e/o CD5 o CD8;
iii) forme T-III o delle cellule T corticali, caratterizzate dalla comparsa di
CD3 di membrana e dalla positività per CD1a;
iv) forme T-IV o delle cellule T mature, caratterizzate dalla scomparsa di
CD1a.
La classificazione EGIL può essere modificata fondendo le forme T-II e T-III in
un’unica forma “intermediate”, oppure sostituita da una classificazione semplificata che
divida le leucemie dei precursori T in leucemie delle cellule staminali T (T-Stem Cell
Leukemias, o T-SCL), e LAL-T propriamente dette [1463]. Le T-SCL costituirebbero
un’entità nosografica particolare, contraddistinta da frequente coespressione di HLA-DR,
CD117, CD45RA e antigeni mieloidi [965] [1194], nonché da cattiva prognosi [71]
[1464]. Per quanto concerne le T-ALL, non sembra che il fenotipo rivesta particolari
valenze prognostiche, anche se secondo alcuni Autori la forma “intermediate T” positiva
per CD1 presenta migliore andamento clinico [1465].

PRINCIPALI SOTTOTIPI DELLA T-ALL


cyCD3 sCD3 CD1a CD2 CD5 CD7 CD10 TdT
Early T (pro/pre) + - - ± ± + -/+ +
Intermediate T + -/+ + + + + -/+ +
Mature T + + - + + + - +

Le T-ALL con CD3 di membrana generalmente esprimono anche il TCR, sia a


catene alfa/beta che a catene gamma/delta, con una lieve prevalenza per quest’ultimo; una
minoranza di casi coesprime ambedue le catene beta e delta del TCR [74]. E’ interessante
osservare che, differentemente da quanto avviene nei T linfociti maturi del sangue
periferico, spesso i blasti leucemici positivi per il TCR a catene gamma/delta sono
positivi per CD4. Le T-ALL con TCR gamma/delta non coesprimono CD2 in una
percentuale di casi più elevata di quanto non avvenga per le T-ALL con TCR alfa/beta
[72] [73] [74]. L’antigene HLA-DR di solito non è espresso, ma può essere
sporadicamente presente, con una certa predilezione per le forme più immature, che
tendono a esprimere più frequentemente anche CD10 [391]. La coespressione degli
antigeni CD4 e CD8, tipica delle forme T-III o “intermediate”, si accompagna spesso alla
presenza della traslocazione t(11;14) [1466]. L’antigene CD21 è espresso su di una
percentuale aggirantesi attorno al 40% dei casi [1467].
E’ stato segnalato un caso di T-ALL caratterizzata da morfologia hairy e da
espressione di CD11c [495]. E’ inoltre noto un caso di leucemia/linfoma T linfoblastico
con fenotipo “early T” che risultava positivo per CD103; nel caso in oggetto è stata
formulata l’ipotesi che la trasformazione neoplastica abbia interessato un piccolo subset
di timociti HML-1+ presenti nella corticale del timo umano normale [1163]. Un’altra
caratteristica immunofenotipica delle neoplasie dei precursori dei T linfociti sembra
infine essere l’inappropriata espressione di CD79a, riscontrabile a seconda delle
casistiche dal 10 al 33% dei casi studiati [1126] [1127].

142
RAPPORTI TRA LEUCEMIA LINFOBLASTICA E LINFOMA
LINFOBLASTICO

Sebbene la classificazione REAL/WHO accorpi in un’unica definizione la


leucemia linfoblastica T e il linfoma linfoblastico T [485], secondo altri autori queste due
entità, analogamente alle loro controparti a cellule B, configurerebbero due entità
biologiche diverse e distinguibili in base alle modalità di presentazione e alla storia
naturale [623]. La principale differenza tra leucemia linfoblastica T e linfoma
linfoblastico T consiste nel quadro clinico di esordio, che nel caso del linfoma
linfoblastico T è caratterizzato da scarso o assente coinvolgimento della milza e dei
comparti midollare e periferico [1460]. Dal punto di vista immunofenotipico è
interessante osservare che, mentre la maggior parte delle T-ALL tende a presentare
fenotipi compatibili con elevati gradi di immaturità, nei linfomi T linfoblastici è frequente
il fenotipo correlato con lo stadi più maturi della differenziazione timocitica [205].

143
LEUCEMIE ACUTE MIELOIDI

Le leucemie acute mieloidi costituiscono un gruppo eterogeneo di malattie


caratterizzate dall’espansione di blasti o di cellule trasformate arrestate a vari gradi di
differenziazione delle linee mieloide o monocitaria.
Rispetto alle sindromi linfoproliferative acute e croniche, nelle leucemie acute
mieloidi la fenotipizzazione immunologica riveste una importanza clinica meno
stringente. Ciò è dovuto al fatto che in questi casi la diagnosi riposa tuttora ampiamente
sulla classificazione FAB, che non prevede nella maggior parte dei casi l’uso di test
fenotipici. Di conseguenza, la citometria diviene strettamente necessaria solo nello studio
dei casi non facilmente classificabili mediante la morfologia e la citochimica, ovvero:
i) nella leucemia mieloide acuta con minimi segni di maturazione (M0), in
cui i blasti sono perossidasi negativi e non presentano granulazioni [1468]
[33] [1469];
ii) nella forma variante della leucemia promielocitica (M3v) [1469];
iii) nella leucemia monoblastica (M5a) [1470];
iv) nella leucemia eritroide (M6) [33];
v) nella leucemia megacarioblastica (M7) [1053] [33] [1469].
Va però anche detto che nella diagnostica delle leucemie acute mieloidi la
fenotipizzazione immunologica può essere rivolta verso altre finalità, quali:
i) la ricerca di fenotipi aberranti, utili per la monitorizzazione della malattia
minima residua [1471] [1472] [580] [84];
ii) la dimostrazione dell’eterogeneità della popolazione neoplastica [1473];
iii) il riconoscimento di fenotipi predittivi di particolari pattern citogenetici,
come nel caso della AML-M2 con traslocazione (8;21) [645] [861].
Queste finalità sono divenute così importanti che non vi è ormai alcun razionale
per restringere l’analisi immunofenotipica ai soli casi non classificabili mediante
metodiche tradizionali.
Secondo la classificazione EGIL, una leucemia acuta può essere definita come
leucemia acuta mieloide quando, in assenza di evidenza per una diversa attribuzione, le
sue cellule esprimano due o più dei seguenti antigeni: mieloperossidasi (MPO), CD13,
CD33, CD65, e CD117 [33] [524] [525].
Per quanto concerne invece una classificazione immunologica delle diverse forme
di leucemia acuta mieloide, non è riconosciuta al momento attuale nessuna
sistematizzazione confrontabile con quella delle forme linfatiche. E’ peraltro possibile
tentare una divisione che distingua:
i) forme “comuni”, caratterizzate dalla espressione di antigeni mieloidi e
negative per l’espressione di CD7, CD14 o CD19;
ii) ii) forme CD7+, spesso positive per MDR1, CD117 e altri antigeni
T-associati;
iii) iii) forme CD19+, spesso positive per CD56 e associate alla presenza della
traslocazione t(8;21);
iv) iv) forme CD14+, “committed” in senso monocitario e spesso
coesprimenti le isoforme a basso e alto peso molecolare di CD45;
v) v) forme negative sia per HLA-DR che per CD34, comprendenti
massimamente le forme promielocitiche [1474].
Dal punto di vista della classificazione FAB non esiste una correlazione tra
immunofenotipo e sottotipi, ma si assiste invece a una alquanto aspecifica distribuzione
degli antigeni mieloidi lungo tutto lo spettro della classificazione; si nota comunque,
come peraltro logico, la preferenziale espressione dei marcatori più tardivi da parte delle
forme con maturazione, la preferenziale espressione dei marcatori più precoci da parte

144
delle forme senza maturazione, e la preferenziale espressione di antigeni associati alla
linea monocitaria da parte delle leucemie monocitiche “pure” e della componente
monocitica di M4 [1475] [1476].

DIAGNOSI IMMUNOLOGICA
DELLE LEUCEMIE MIELOIDI ACUTE
M0 M2 M3 M4Eo M5 M5 M7
t(8;21) t(15;17) inv16 11q23
MPO +/- + + + -/+ - -
CD2 - - - + - - -
CD13 +/- + + + + - +/-
CD14 - - +/- +/- +/- - +/-
CD15 - + - +/- - + -
CD19 - + - - - - -
CD33 +/- + + + + + +/-
CD34 +/- + - -/+ - - -
CD56 - + - - - - -
CD61 - - - - - - +
CD64 - - + + + + -
CD65 +/- + -/+ + + + +
CD117 + +/- -/+ + +/- - -
HLA-DR +/- + - + + + +/-
-: antigene non espresso; -/+: antigene espresso in meno della metà dei soggetti; +/-:
antigene espresso nella maggioranza dei soggetti.

Va comunque puntualizzato che questa regola è generale e patisce numerose


eccezioni; è curioso tra le altre cose osservare come in alcune casistiche la percentuale di
casi CD15+ tra le leucemie “senza maturazione” sia perlomeno eguale a quella delle
leucemia “con maturazione” [80].
Parametro di un certo interesse è lo scatter laterale delle cellule leucemiche, i cui
valori tendono ad aumentare parallelamente al grado di maturazione della popolazione
neoplastica [1477] [856].
Oltre ai già citati MPO, CD13, CD33, CD65, e CD117, altri marcatori mieloidi
frequentemente studiati sono gli antigeni CD11b, CD11c, CD14 e CD15, e più
recentemente gli antigeni CD64, CD66, e CD87. Un ruolo crescente è anche sostenuto
dalla evidenziazione intracitoplasmatica degli antigeni lisosomiali, resi investigabili in
FCM dalle tecniche di permeabilizzazione. Questi antigeni, detti "granulocyte associated
lysosomal proteins", sono principalmente costituti dalla mieloperossidasi (MPO),
presente nel 90% circa di tutte le AML [1407], dal lisozima (LZ), presente nelle forme
monocitiche [1478], dalla lattoferrina (LF), e dalla macrosialina, o CD68 [1081].
Durante l’analisi immunofenotipica delle leucemie mieloidi acute possono essere
frequentemente rilevati gli antigeni “linfoidi” CD2, CD4, CD7, CD10, CD19 e CD79, e
anche – sebbene con minor frequenza – CD5 e CD20 [1479] [526] [94] [1480] [38] [1471]
[1481] [1472] [82] [83] [1476]. La dimostrazione della coespressione di questi antigeni
non sostiene necessariamente la diagnosi di leucemia ibrida, in quanto:
i) CD2 è frequentemente e caratteristicamente espresso sulle cellule della
AML-M4eo [92] [90] e della AML-M3v [1482] [90];
ii) CD7 è espresso sul 15% di tutte le leucemie mieloidi acute [38], dove è
predittivo di aumentato rischio di malattia extra-midollare [95], ed è

145
probabilmente interpretabile più come marcatore di immaturità che come
marcatore di appartenenza alla linea linfoide;
iii) CD10 non può essere considerato un marcatore strettamente B specifico,
in quanto viene regolarmente espresso dai polimorfonucleati [374] [375];
iv) l’espressione di CD19 è tipica della AML-M2 con t(8;21) [645], ed è
segnalata in una significativa percentuale di AML non M2 [644] [647]
[649];
v) CD79 alfa è segnalato sporadicamente nelle leucemie mieloidi acute, con
un’elevata percentuale di casi positivi tra le AML-M3 tipiche [1130].
Per quanto concerne l’antigene CD4, va rilevato che la sua espressione sui blasti
di leucemia acuta sarebbe più indicativa di appartenenza alla linea mieloide di quanto non
lo siano l’espressione di CD13 e CD33 considerati singolarmente [209].
Per quanto concerne infine la TdT, generalmente considerata selettivamente
espressa nelle leucemie linfoblastiche, va ricordato che la sua presenza può essere
documentata in una percentuale di AML variabile dal 5 al 20% dei casi a seconda delle
casistiche [1432] [1433] [1430] [1434] [1435] [81]. L’evidenziazione della TdT non
presenterebbe significato prognostico negativo, si associerebbe alle forme FAB
considerate più immature, e sarebbe predittiva della traslocazione t(6;9) [1426] [1435].
È possibile che l’esplorazione di determinate combinazioni antigeniche permetta
l’evidenziazione di particolari entità nosografiche dotate di fenotipo e cariotipo
caratteristico. A questo proposito va ricordato che la classificazione WHO delle neoplasie
ematologiche ha estrapolato dal capitolo generale delle leucemie acute mieloidi la forma
AML-M2 con traslocazione t(8;21), la forma AML-M3 con traslocazione t(15;17), la
forma AML-M4 con inversione pericentrica del cromosoma 16, e la leucemia con
anomalie del braccio lungo del cromosoma 11 (11q23) coinvolgenti il gene MLL [1483].

RAPPORTI TRA IMMUNOFENOTIPO E CLASSIFICAZIONE FAB

AML-M0 - Leucemia acuta con minimi segni di differenziazione mieloide

La leucemia acuta mieloide con minimi segni di differenziazione mieloide, o


AML-M0, è una forma di leucemia mieloide acuta non contemplata dalla originale
classificazione FAB, e proposta come entità nosografica autonoma solo successivamente
[1484]. Secondo la classificazione FAB aggiornata, la diagnosi di AML-M0 deve
rispondere ad una serie di criteri costituiti da:
i) una percentuale di blasti eguale o superiore al 30% delle cellule nucleate
midollari (eguale o superiore al 20% secondo la nuova classificazione
WHO [1485]);
ii) una sostanziale negatività (positività inferiore al 3%) degli elementi
patologici per la reazione per il Sudan Black o per la ricerca citochimica
della perossidasi;
iii) la dimostrazione della mieloperossidasi con metodiche di citochimica
ultrastrutturale e/o con metodiche immunofenotipiche, e/o dimostrazione
immunofenotipica di antigeni mieloidi [1486].
Questi criteri si sono lievemente modificati con il tempo, e ora viene considerata
come leucemia AML-M0 quella leucemia mieloide che rispetti i criteri standard di
leucemia acuta, e che soddisfi i seguenti requisiti [1487]:
i) una sostanziale negatività (positività inferiore al 3%) degli elementi
patologici per la reazione per il Sudan Black o per la ricerca citochimica
della perossidasi;

146
ii) la mancata espressione di cyCD3, cyCD22 e cyCD79;
iii) la positività per qualsiasi antigene mielomonocitico noto per non essere
espresso sui linfociti T e B, e/o positività per la mieloperossidasi
evidenziata con metodiche di citochimica ultrastrutturale, di
immunoistochimica o di citometria a flusso.
La AML-M0 costituisce una forma rara, e rappresenta circa il 5% di tutte le
leucemie acute mieloidi [1485]. Da un punto di vista fenotipico la AML-M0 tende a
esprimere gli antigeni mieloidi associati alle fasi più precoci della maturazione mieloide;
in accordo con questo assunto la positività per CD13 associata a negatività per CD33
sembrerebbe particolarmente frequente in questa forma particolare [90]. Frequentissima è
anche l’espressione di CD34, CD38, CD117 [90], e HLA-DR, che spesso è espresso a
bassa intensità [1240]. L’antigene CD38 può mancare, e la sua assenza viene interpretata
come prova della elevata immaturità delle cellule clonogeniche [862]. Il riscontro della
TdT è relativamente frequente, e spesso è segnalata l’espressione di altri antigeni linfoidi,
come CD2 e CD19, ma soprattutto di CD7, che costituisce un marcatore frequentemente
espresso dalle cellule molto immature. La MPO è spesso evidenziabile con tecniche
immunologiche, ma non con la frequenza con cui è dimostrabile nelle forme AML-M1 e
AML-M2 [90]. In alcune casistiche è stata segnalata l’espressione di CD15 [80].
E’ possibile che alcune entità diagnostiche diverse siano erroneamente
diagnosticate come leucemia acuta AML-M0 sulla base dei riscontri morfologici e
immunofenotipici; questo equivoco ha probabilmente interessato alcuni casi di leucemia
acuta dei precursori mieloidi/NK [161], nonché alcuni casi di leucemia acuta basofila,
entità di cui è stato proposto l’inserimento nella classificazione FAB con la sigla
AML-M8 [775]. Per le sue caratteristiche fenotipiche e morfologiche, la AML-M0 è
teoricamente suscettibile di entrare in diagnosi differenziale con altre leucemie acute
come la AML-M7 e la forma eritroide “pura” della AML-M6.

AML-M1 - Leucemia acuta mieloide senza maturazione

La leucemia acuta mieloide senza maturazione, o AML-M1, è alquanto più


frequente della forma con minimi segni di differenziazione mieloide, e costituisce circa il
10% dei casi di AML [1485].
Secondo la classificazione FAB, la diagnosi di AML-M1 deve rispondere a una
serie di criteri costituiti da:
i) una percentuale di blasti eguale o superiore al 90% delle cellule midollari
non eritroidi;
ii) una positività degli elementi patologici per la reazione per il Sudan Black
o per la ricerca citochimica della perossidasi eguale o superiore al 3%;
iii) una componente monocitaria midollare maturante inferiore o eguale al
10% delle cellule midollari non eritroidi;
iv) una componente granulocitaria midollare maturante inferiore o eguale al
10% delle cellule midollari non eritroidi [1486].
Da un punto di vista immunofenotipico la AML-M1 non presenta rilevanti
differenze con la forma AML-M0, e tende a riprodurne le caratteristiche. E’ interessante
notare che in una casistica di leucemie acute diagnosticate “de novo”, la percentuale di
casi CD15+ riscontrata tra le forme di AML-M1 “senza maturazione” era
sostanzialmente eguale a quella riscontrata tra le forme di AML-M2 “con maturazione”
[80].

147
AML-M2 – Leucemia acuta mieloide con maturazione

Secondo la definizione FAB, la diagnosi di leucemia AML-M2 o leucemia


mieloide con maturazione deve rispondere ad una serie di criteri costituiti da:
i) una percentuale midollare di blasti superiore o eguale al 30 % delle cellule
non eritroidi (superiore o eguale al 20% secondo la nuova classificazione
WHO [1485]);
ii) una componente granulocitaria midollare maturante superiore o eguale al
10% delle cellule midollari non eritroidi;
v) una componente monocitaria midollare maturante inferiore o eguale al
20% delle cellule midollari non eritroidi, con mancato soddisfacimento
dei criteri diagnostici per AML-M4, forma con cui si pone spesso in
diagnosi differenziale [1486].
Da un punto di vista citometrico, le cellule della forma AML-M2 presentano
parametri fisici diversi da quelli delle forme senza maturazione, con valori di side-scatter
più elevati. Questa caratteristica è dovuta non solo alla maggiore maturazione dei blasti,
che a differenza di quelli delle forme precedenti appaiono granulati, ma anche alla
frequente presenza di un comparto maturante residuo. Da un punto di vista più
strettamente fenotipico i blasti della AML-M2 sono TdT negativi, esprimono
generalmente ma non costantemente HLA-DR [1240], e tendono ad esprimere gli
antigeni associati alla serie mieloide CD13, CD15 e CD33, nonché gli antigeni CD34 e
CD117 [1189]. La forma AML-M2 può talora esprimere CD19, ed è noto un caso di
AML-M2 positivo per l’antigene CD19 e negativo per antigeni mieloidi [1488].
La citometria a flusso non è a rigore necessaria per pervenire alla diagnosi, ma
può contribuire alla diagnosi differenziale con AML-M4, forma spesso difficilmente
distinguibile da AML-M2, che può essere sospettata in base alla espressione di CD14,
CD64 e CD87, o all’intensa espressione di CD11b e CD11c. Dove la citometria a flusso
risulta invece utilissima è nel riconoscimento della forma variante caratterizzata dalla
presenza della traslocazione t(8;21), e nella individuazione delle forme atipiche.
La forma variante con traslocazione t(8;21) è stata sistematizzata dalla
classificazione WHO tra le leucemie mieloidi con anomalie genetiche ricorrenti [1483], e
presenta alcune particolari caratteristiche [1489], tra cui una peculiare tingibilità acidofila
del citoplasma dei neutrofili maturi [1490], la presenza di frequenti note di dismielopoiesi,
e l’espressione di un fenotipo particolare, costituito da un’intensa positività per CD34, da
una debole ma frequentissima coespressione di CD19, e da una frequente coespressione
di CD56 [85]. L’antigene CD19 è generalmente presente solo su di una sottopopolazione
di blasti [645], e per quanto concerne la presenza della TdT è possibile dimostrarla in
almeno il 5% dei mieloblasti nel 50% dei casi [1437]. Il riscontro della coespressione di
CD19, CD34 e CD56 in corso di AML-M2 con traslocazione t(8;21) è così caratteristico
da poter essere considerato predittivo dell’anomalia citogenetica [860] [861], e dato che
non è riscontrabile nel midollo osseo normale a frequenze superiori allo 0,01% [1004],
può essere considerato alla stregua di un fenotipo “tumore-specifico” utilissimo per la
dimostrazione della malattia minima residua. Va comunque rilevato per la precisione che
la coespressione di CD19, CD34 e CD56 non è esclusivamente ristretta ai blasti mieloidi
della AML M2 con t(8;21), ma può essere riscontrata anche sui blasti di alcuni casi di
ALL; in tal caso il riscontro non è predittivo per specifiche anomalie cromosomiche, ma
può essere ugualmente sfruttato per la monitorizzazione della malattia minima residua.
Sono noti alcuni casi di AML-M2 con t(8;21) caratterizzati da fenotipo CD13-, CD14-,
CD33-; in una segnalazione veniva descritta anche la presenza di positività per MPO
[1491], mentre in un altro report indipendente veniva documentata negatività per CD11b
e intensa espressione di CD117 [1492].

148
Le forme atipiche sono costituite da casi con morfologia e citochimica simili a
quelle della AML M3 e con fenotipo HLA-DR-, CD13+, CD33+, CD2+, CD9+, ma con
assenza della traslocazione t(15;17) [1493].

AML-M3 – Leucemia acuta promielocitica

La diagnosi di leucemia AML-M3, o promielocitica, si basa sul riscontro dei tipici


promielociti ipergranulati; tale riscontro deve essere confermato dalla dimostrazione
della specifica traslocazione cromosomica t(15;17)(q22;q21) [1494]. Il numero di cellule
leucemiche presenti nel midollo può essere anche molto basso, e già secondo la
classificazione FAB poteva essere posto sotto il cut-off del 30% invocato come requisito
diagnostico per le altre leucemie. [1486]. La leucemia M3 viene considerata come una
proliferazione di cellule bloccate allo stato di promielocita; tuttavia alcuni comportamenti
dimostrati dai promielociti leucemici, come ad esempio la frequente tingibilità con blu di
toluidina, suggeriscono che, almeno in una porzione di casi, le cellule leucemiche siano
commissionate verso un differenziamento di tipo basofilo o mast-cellulare [1495].
Il quadro periferico della leucemia acuta a promielociti è alquanto eterogeneo, ed
è costituito dalla presenza di cellule ipergranulari variamente mescolate ad elementi
contenenti numerosi corpi di Auer [88]. Sono stati descritti un sottotipo ipogranulare
caratterizzato da cellule con nucleo a bisaccia [1496], un sottotipo basofilo [1497], e due
sottotipi aggiuntivi, costituiti il primo da promielociti differenziati frammisti a pochi
blasti (sottotipo “M2-like”), e il secondo da blasti frammisti a rari promielociti (sottotipo
“M1-like”) [88].
Le cellule della leucemia promielocitica sono TdT negative, e tendono ad
esprimere una serie di antigeni associati alla linea mieloide. Alcuni sono espressi con
elevata frequenza (CD13, CD33, CD64), altri sono segnalati in modo più irregolare
(CD11b, CD14, CD117) [1498] [578] [1194] [556].
Riguardo all’espressione di CD15, esistono in letteratura posizioni contrastanti,
secondo cui i promielociti leucemici della AML-M3:
i) non esprimerebbero CD15 [577] [432];
ii) esprimerebbero CD15 in quasi la metà dei casi [80];
iii) esprimerebbero CD15 frequentemente ma a intensità bassa [84];
iv) esprimerebbero CD15 prevalentemente nella forma sialilata, che come
tale verrebbe riconosciuta dal MoAb VEP19 ma non dal MoAb VIM-D5
[578].
L’espressione di CD2 e CD7 è possibile [80]; in particolare quella di CD2 sembra
associata alla forma microgranulare [86] [87] [90] e alla presenza del trascritto di fusione
PML-RARalfa del tipo 5’ [91]. Secondo alcuni Autori gli antigeni CD25 e CD38
sarebbero assenti [883], ma in alcuni casi l’antigene CD38 può essere espresso
vivacemente (osservazione personale). La contemporanea positività per CD9 e CD68 è
stata proposta come tipica della leucemia promielocitica [883], ma disgraziatamente la
costante espressione di CD68 non è stata confermata in casistiche successive,
probabilmente a causa del diverso comportamento dei MoAb usati per tracciare
l’antigene [1499]. Per quanto attiene poi alla positività per CD9, va rilevato che questa è
diffusissima in tutte le forme di leucemia acuta mieloide e non mieloide, e da sola non
costituisce elemento dotato di specificità. Classicamente negativi o poco espressi sono
invece CD11a [432], HLA-DR [1500] [1240] e CD34 [1501]. In alcune casistiche
HLA-DR e CD34 possono essere espressi, ma lo sarebbero preferenzialmente dalla
variante ipogranulare [1502] [1499]. Va comunque detto che nella AML-M3 è spesso
possibile evidenziare la presenza di sottopopolazioni di cellule leucemiche CD34+; la
presenza in questi elementi della classica traslocazione t(15;17) suggerisce che, almeno

149
in alcuni casi, la mutazione leucemogena ha luogo a livello dei progenitori emopoietici
[1503]. L’antigene CD56 può essere espresso, ed è stato segnalato sia sugli elementi di
AML-M3 caratterizzata da traslocazione variante t(11;17) [998], che sugli elementi di
AML-M3 tipica caratterizzata da traslocazione t(15;17), su cui sembrerebbe comportare
una prognosi significativamente peggiore [999] [1000].
L’antigene mieloide CD66c, che raggiunge i più elevati livelli di espressione nei
promielociti normali, appare in genere assente sulle cellule della M3, ma compare dopo
esposizione in vitro all’acido trans-retinoico [1091]. In un’isolata casistica, nel 90% dei
casi di AML studiati con metodiche immunoistochimiche è stato possibile dimostrare la
presenza intracitoplasmatica di CD79 alfa [1130]. L’intensità di espressione
dell’antigene CD45 è generalmente minore di quella riscontrabile sui linfociti, e ricorda
quella espressa dai polimorfonucleati maturi. Come nella maggior parte dei casi di AML,
anche nella AML-M3 l’isoforma generalmente espressa è quella ad alto peso molecolare
(CD45RA), ma anche in questo caso l’esposizione in vitro all’acido transretinoico induce
una modifica, determinando uno switch da CD45RA a CD45R0 [965]. È infine
interessante il riscontro di una correlazione tra l’espressione di CD34 e la presenza di
elevati livelli di pgp (proteina della multidrug resistance) [1504]. Come peraltro atteso, il
side scatter dei blasti della forma classica è costantemente più elevato dei blasti della
forma ipogranulare [1499].
L’analisi fenotipica non è di alcuna utilità nella diagnosi della forma classica, che
si presenta inconfondibile da un punto di vista morfologico, e fornisce un pattern tipico
anche con la maggior parte dei citometri ematologici. Le cose cambiano invece nel caso
della forma ipogranulare [1496], caratterizzata da cellule ipogranulate con nuclei a
bisaccia o fogliacei che possono essere confuse con i blasti della leucemia monoblastica,
in particolare con quelli di AML-M5b. In questo caso i dati immunofenotipici, ed in
particolare il riscontro della negatività per HLA-DR, costituiscono un elemento in grado
di orientare la diagnosi.
Va anche tenuta presente l’esistenza di rari casi di leucemia acuta diversa da
AML-M3, caratterizzati dalla presenza di blasti morfologicamente e fenotipicamente
indistinguibili da quelli della AML-M3v [1505]. Questa entità nosografica, che si
sovrappone almeno parzialmente alla “myeloid/natural killer cell acute leukemia”
segnalata da Scott [636], rende presumibilmente conto di quei casi diagnosticati come
AML-M3v che risultano non responsivi all’acido retinoico.
La AML-M3 con traslocazione t(15;17) è stata sistematizzata dalla classificazione
WHO tra le leucemie mieloidi con anomalie genetiche ricorrenti [1483].

AML-M4 – Leucemia acuta mielomonocitica

Secondo la definizione FAB, la diagnosi di leucemia AML-M4 o leucemia


mielomonocitica deve rispondere ad una serie di criteri costituiti da:
i) una percentuale midollare di blasti superiore o eguale al 30 % delle cellule
non eritroidi (superiore o eguale al 20% secondo la nuova classificazione
WHO [1485]);
ii) una componente granulocitaria midollare maturante superiore o eguale al
20% delle cellule midollari non eritroidi;
iii) una componente monocitaria midollare maturante superiore o eguale al
20% delle cellule midollari non eritroidi, accompagnata da una
componente monocitaria periferica superiore o eguale a 5000 elementi per
mmc [1486].
Le cellule della leucemia acuta M4 sono TdT negative, e tendono ad esprimere
HLA-DR ed una serie di antigeni associati alla linea monocitaria, con particolare

150
preferenza per CD11b, CD11c, CD15, CD33, CD64, CD68 e CD87 [1470]. Sulla
componente monocitica l’antigene CD45 è generalmente espresso con l’intensità
normalmente evidenziabile sui monociti [856]. Frequente è il riscontro di CD14, anche se
la frequenza di questo rilevamento dipende dal MoAb usato, mentre infrequente è
l’espressione di antigeni correlati agli stati maturativi più precoci, come CD34 e CD117.
La positività per CD64 espresso ad elevata intensità sembra tipica di questa forma e della
forma M5 [556].
I blasti della AML-M4 segregano spesso in due o più popolazioni diverse; in
alcune casistiche è stata segnalata la presenza contemporanea di popolazioni negative per
i marker monocitici CD11b e CD14, e di popolazioni positive per uno o ambedue gli
antigeni [649].
Sui blasti di alcuni casi di AML-M4 è stata ripetutamente segnalata l’espressione
di CD19; tuttavia, a differenza di quanto avviene per la M2 t(8;21), l’evidenziazione di
questo antigene sembra ristretta all’uso di particolari MoAb, come ad esempio il MoAb
B4(lytic) [649]. I blasti della AML-M4 possono essere positivi per CD24, antigene la cui
espressione nelle leucemie acute mieloidi appare correlata alle forme di origine
monocitaria con una specificità pari ma una sensibilità superiore a quella espressa da
CD14 [740].
La variante AML-M4Eo, caratterizzata da eosinofilia midollare e dalla presenza
della inversione pericentrica del cromosoma 16, è contraddistinta dalla espressione di
CD2 [92]. Questa variante è stata sistematizzata dalla classificazione WHO tra le
leucemie mieloidi con anomalie genetiche ricorrenti [1483].

AML-M5 – Leucemia acuta monocitica

Secondo la definizione FAB, la diagnosi di leucemia AML-M5 deve rispondere


ad una serie di criteri costituiti da:
i) una percentuale midollare di blasti superiore o eguale al 30 % delle cellule
non eritroidi (superiore o eguale al 20% secondo la nuova classificazione
WHO [1485]);
ii) una componente monocitaria midollare maturante superiore o eguale
all’80% delle cellule midollari non eritroidi, costituita da più dell’80% di
monoblasti nella variante monoblastica M5a, e da meno dell’80% di
monoblasti nella variante M5b [1486].
Le cellule della AML-M5 sono generalmente negative per TdT e CD34 e positive
per HLA-DR, ed esprimono una serie di antigeni mieloidi, con una particolare
predilezione per quelli connessi alla differenziazione monocitaria, come CD11b, CD11c,
CD33, CD64, CD87 e CD116 [1506] [556]. Un fenotipo CD13- CD33+ CD34- viene
considerato fortemente suggestivo per una AML monocitica [1471].
La forma più immatura M5a è negativa per MPO, tende a essere negativa per
CD14, e generalmente esprime l’isoforma CD45RA [968], mentre la forma più matura
M5b può esprimere debolmente MPO in alcuni elementi più differenziati, è spesso
negativa per CD117 [1143], esprime l’isoforma CD45R0 [968], ed è positiva per CD14 in
una percentuale più elevata di casi. Va comunque sottolineato che la percentuale di
positività per l’antigene CD14 varia a seconda del MoAb adottato nell’analisi. L’antigene
CD4 è spesso presente, e in alcuni casi può rappresentare l’unico antigene mieloide
espresso tra quelli indagati [212]. Le cellule della AML-M5 possono esprimere CD19
[647], CD24 [740], e CD56 [995]. La coespressione di CD56 sembra predittiva della
presenza di anomalie del gene MLL situato in 11q23, e si accompagna spesso
all’espressione del proteoglicano condroitinsolfato riconosciuto dal MoAb 7.1 [1507]
[1002].

151
La AML con anormalità di 11q23 è stata sistematizzata dalla classificazione
WHO tra le leucemie mieloidi con anomalie genetiche ricorrenti [1483].

AML-M6 – Leucemia acuta eritroide

La dizione di leucemia acuta eritroide comprende almeno due entità nosografiche


alquanto diverse fra di loro, e in particolare:
i) la leucemia acuta mieloide con differenziazione eritroide, detta anche
AML-M6 o AML-M6a, e
ii) ii) la eritroleucemia “pura”, detta anche AML-M6 “variante” o AML-M6b
[1108].
A queste due entità è spesso accostata una terza forma, detta AML-M6c,
caratterizzata dalla contemporanea presenza di una popolazione di blasti e di una
popolazione di pronormoblasti ciascuna superiore al 30% delle cellule midollari [1508]
[1509].
Secondo la definizione FAB, la diagnosi di leucemia AML-M6a deve rispondere
ad una serie di criteri costituiti da:
i) una percentuale midollare di blasti superiore o eguale al 30% delle cellule
non eritroidi [1486] (superiore o eguale al 20% secondo la nuova
classificazione WHO [1485]);
ii) una componente eritroide superiore o eguale al 50% delle cellule nucleate
midollari [1485].
L’analisi citometrica della AML-M6a è utile in quanto non solo è in grado di
esplorare il fenotipo dei blasti leucemici, ma permette la documentazione dell’anomala
espansione del comparto eritroide, costituito da cellule negative per CD45,
mieloperossidasi e antigeni mieloidi, e vivacemente positive per CD71 e CD105. Per
contro i blasti esprimono un fenotipo generalmente indistinguibile da quello degli altri
sottotipi. Esiste in letteratura una isolata segnalazione secondo cui gli eritroblasti
leucemici, contrariamente agli eritroblasti normali, non esprimerebbero la molecola di
adesione caderina-E [1510].
La forma eritroide “pura”, detta anche AML-M6 “variante” o AML-M6b, è molto
più rara, e consiste essenzialmente nella presenza di una percentuale midollare di blasti
superiore o eguale al 30 % delle cellule non eritroidi (superiore o eguale al 20% secondo
la nuova classificazione WHO [1485]), caratterizzati dalla negatività per HLA-DR,
dall’assenza di antigeni associati alla linea T, alla linea B, e alla differenziazione mieloide
eccezion fatta per CD33, e dalla irregolare positività di antigeni tipici della linea eritroide,
quali ad esempio il recettore per la transferrina, la glicoforina A, la spectrina, l’anidrasi
carbonica, e CD36 [1511] [1512] [1513] [1514] [1515] [1106] [1108]. La coespressione
di antigeni correlati alla linea piastrinica è stata ripetutamente segnalata [1516] [1517]
[1107].

152
AML-M7 – Leucemia acuta megacarioblastica

Secondo la definizione FAB, la diagnosi di leucemia acuta megacarioblastica o


AML-M7 deve rispondere ad una serie di criteri costituiti da [1053]:
i) una percentuale midollare di blasti superiore o eguale al 30% delle cellule
midollari nucleate (superiore o eguale al 20% secondo la nuova
classificazione WHO [1485]);
ii) la dimostrazione della natura megariocitica degli elementi patologici,
effettuata mediante immunofenotipizzazione, morfologia ultrastrutturale o
citochimica ultrastrutturale.
Secondo la classificazione WHO, la leucemia megacarioblastica acuta è
caratterizzata dalla presenza di un numero di blasti appartenenti alla linea
megacariocitaria superiore al 50% degli elementi [1485].
La forma AML-M7 è una forma di rara osservazione, relativamente frequente nei
soggetti affetti da sindrome di Down. I blasti della AML-M7 possono esprimere alcuni
antigeni della linea mieloide come CD13 e CD33, possono esprimere CD2, [1518], CD7
[1054] [1518] e CD56 [997], sono negativi per MPO, e spesso si caratterizzano per
l’assenza di marcatori legati agli stadi più immaturi, come HLA-DR, CD34 e CD38.
Caratteristica fenotipica principale dei blasti della AML-M7 è l’espressione degli
antigeni associati alla linea megacariocitica, come CD41, CD61, CD42a e CD42b [1512]
[1519] [1056] [1520]. E’ comunque importante ricordare che:
i) nella dimostrazione degli antigeni piastrinici grande cura deve essere
tributata nell’escludere le false positività causate dai fenomeni di
satellitismo tra le piastrine normali residue e i blasti in esame [1052];
ii) è possibile che l’antigene CD61 sia presente solamente nel comparto
intracitoplasmatico, e quindi dimostrabile solamente previa
permeabilizzazione del campione [1054];
iii) è stato segnalato che l’espressione degli antigeni piastrinici può essere
limitata a quegli antigeni che compaiono più precocemente nel corso della
differenziazione megacariocitaria, come ad esempio CD41 e CD61,
mentre CD42b tenderebbe ad essere positivo in un numero minore di casi,
ed espresso da un numero minore di blasti [1055] [1519].
Va infine ricordato che i blasti della leucemia AML-M7 possono condividere con
quelli della AML-M6 l’espressione di CD36, nonché di altri marcatori caratteristici della
linea eritroide [1511] [1521]. Questa situazione, che può rendere difficile la diagnosi
differenziale tra le due diverse entità nosografiche, è stata ascritta alla trasformazione di
un precursore “alto” totipotente capace di differenziazione nelle due direzioni [1511].

LEUCEMIE BIFENOTIPICHE E LEUCEMIE IBRIDE

Esiste in letteratura una corposa serie di segnalazioni riguardanti l’esistenza di


casi che secondo i criteri del momento non potevano essere attribuiti con sicurezza a una
linea definita a causa della coespressione di antigeni associati a linee diverse. A seconda
delle caratteristiche della popolazione leucemica, questi casi vengono distinti in leucemie
“ibride”, in cui la popolazione neoplastica è omogeneamente costituita da elementi che
coesprimono antigeni “incompatibili”, e in leucemie “bifenotipiche”, in cui la
popolazione neoplastica segrega in due popolazioni distinte riconducibili a linee diverse
in funzione del loro peculiare fenotipo. Sebbene il numero delle leucemie coesprimenti
antigeni associati a linee diverse sia andato nel tempo aumentando parallelamente
all’espandersi dei pannelli impiegati nelle procedure di immunofenotipizzazione, i casi

153
definibili come “leucemia ibrida vera” si sono per contro ridotti, in base a diverse
osservazioni. Vale la pena infatti ribadire che:
i) alcuni antigeni T-associati non sono rigorosamente T specifici, e la loro
espressione isolata non è sufficiente per un’attribuzione di linea. Ad
esempio CD7 può essere presente sui blasti di leucemie mieloidi, mentre
CD2, che peraltro è tipicamente espresso sulle cellule della AML-M4eo e
della AML-M3v, è stato segnalato in un particolare stadio maturativo dei
precursori delle cellule B, nonché su di una quota di monociti circolanti
[57].
ii) Alcuni antigeni B-associati non sono rigorosamente B specifici, e la loro
espressione isolata non è sufficiente per un’attribuzione di linea. Ad
esempio l’espressione di CD19 è tipica della AML-M2 con t(8;21), ed è
segnalata in una significativa percentuale di AML non M2. Vale la pena
tra l’altro ricordare che CD20 è segnalato su di un subset di cellule T, che
CD22 è normalmente espresso dai basofili, e che CD10 non può essere
considerato un marcatore B specifico, in quanto regolarmente espresso dai
polimorfonucleati e dalle cellule di una consistente percentuale di casi di
T-ALL. Va infine detto ricordato che la catena alfa dell’antigene CD79 è
stata dimostrata in alcuni casi di T-ALL, la cui attribuzione alla linea T è
stata inequivocabilmente dimostrata in base a indagini di biologia
molecolare [1522].
iii) Alcuni antigeni associati alla linea mieloide sono regolarmente segnalati
sui blasti delle leucemie linfatiche acute B e T senza che ciò ne confuti
l’attribuzione alla linea linfoide [856]. In particolare, CD15 viene
preferenzialmente espresso dalle cellule della B-ALL con t(4;11), e in una
casistica comprendente 334 casi di ALL, gli antigeni CD13, CD33 e CD65
venivano coespressi rispettivamente nel 14, 16 e 10% dei casi [517].
Esisto comunque sistemi a punteggio che permettono di attribuire una leucemia
acuta di incerta classificazione all’una o all’altra delle linee, in funzione del
raggiungimento di una soglia minima ottenuta sommando i punti connessi all’espressione
di un determinato antigene [1523].

“PESO” DEI SINGOLI ANTIGENI NELLA


ATTRIBUZIONE DI LINEA DELLE LEUCEMIE ACUTE
PUNTEGGIO B-ALL T-ALL AML
PUNTI 2 CD 79, cyIgM, cyCD3, TCR MPO
cyCD22
PUNTI 1 CD19, CD10 CD2, CD5, CD33, CD13,
CD8, CD10 CD117
PUNTI 0,5 TdT TdT, CD7, CD4 CD11b, CD11c,
CD14, CD15

Le leucemie bifenotipiche presentano un’elevata incidenza di anomalie


cromosomiche con frequente dimostrazione della traslocazione t(9;22) [1524] e di
alterazioni del braccio lungo del cromosoma 11 (11q32) [1525], sono caratterizzate da
una cattiva prognosi, e presumibilmente derivano dalla trasformazione di una cellula
progenitrice multipotente [1526]. Le leucemie bifenotipiche spesso rappresentano un
evento secondario a una mielodisplasia pre-esistente o l’evoluzione blastica di una
leucemia mieloide cronica [1527] [1528].

154
L’IMMUNOFENOTIPO NELLE NEOPLASIE DELLE CELLULE B MATURE

GENERALITÀ

Tranne rare eccezioni, non esiste un reale consenso sui protocolli da impiegare
nell’analisi immunofenotipica delle neoplasie delle cellule B mature; ciò nondimeno
l’esperienza comune permette di delineare alcune configurazioni da adottare in alcune
delle situazioni più frequentemente incontrate nella diagnostica quotidiana. La diffusione
dell’uso di protocolli multicolore è certamente desiderabile per i vantaggi immediati che
offre all’operatore in termini di rapidità ed informatività, ma è soprattutto utile in quanto
permette di tradurre entità nosografiche definite in quadri citometrici tipici. La
standardizzazione delle procedure ed il raggiungimento di un consenso generale sui
protocolli da adottare sono suscettibili di permettere la produzione di citogrammi
caratteristici e la loro associazione con entità nosografiche definite, traghettando così la
diagnostica citometrica delle neoplasie ematologiche verso una dimensione
concettualmente non lontana da quella della diagnostica per immagini. Nonostante i
quadri fenotipici tendano a rimanere costanti, sarà comunque prudente tenere a mente che
non è impossibile incontrare nello stesso paziente variazioni non solo nel corso del tempo
[1529], ma anche fra campionamenti simultanei effettuati in sedi diverse [1530].
Le combinazioni possibili di antigeni da esplorare consensualmente sono
numerosissime, e possono variare in funzione
i) delle caratteristiche tecniche dei citometri adottati nelle analisi;
ii) della disponibilità di antisieri coniugati con gli opportuni fluorocromi;
iii) delle preferenze personali dell’operatore;
iv) del tipo di patologia indagata.

DIMOSTRAZIONE DI POPOLAZIONI CLONALI

Nella diagnostica delle malattie linfoproliferative croniche della serie B, la


dimostrazione della restrizione per una catena leggera delle immunoglobuline viene
operativamente considerata prova di clonalità. Va ricordato che nell’analisi di aspirati o
di campioni da linfonodo, la contemporanea permanenza di B linfociti normali può
mascherare la presenza della popolazione clonalmente ristretta. In tali situazioni viene
considerato suggestivo per la presenza di una popolazione clonale B il riscontro di un
rapporto kappa/lambda eccedente un range compreso a seconda dei diversi Autori tra 5,5
e 0,7 [1282], o tra 3,3 e 1,0 [1283], o tra 3,0 e 0,5 [47], oppure in alternativa il
superamento di una soglia di positività percentuale posta rispettivamente a 75% per le
cellule positive per catene leggere kappa e a 65% per le cellule positive per catene leggere
lambda [1284]. Va comunque ricordato che nella B-CLL, che peraltro rappresenta la
sindrome linfoproliferativa di più frequente riscontro, la dimostrazione delle
immunoglobuline di superficie è resa difficile dalla loro bassa espressione; tale evenienza,
anche se da un lato pregiudica la dimostrazione di clonalità, dall’altro costituisce essa
stessa un riscontro tipico, sicché la dimostrazione di una popolazione B positiva per CD5
e per CD23 su cui non sia possibile dimostrare citometricamente la presenza di
immunoglobuline di superficie configura un fenotipo compatibile con diagnosi di B-CLL
[32], e se non altro sostiene fortemente la necessità di approfondire il processo
diagnostico.
In funzione di queste considerazioni, la prima combinazione suggerita per
l’analisi di popolazioni espanse di B linfociti coniuga l’esplorazione delle catene leggere
con l’analisi di un antigene specifico per la linea B. La scelta dell’antigene più adatto
verte teoricamente fra CD79 alfa, CD22, CD20 e CD19, ma in pratica riguarda solo

155
l’antigene CD19, gli altri antigeni possono essere debolmente espressi o assenti in alcuni
casi di malattia linfoproliferativa cronica della serie B.
Nel caso di analisi di campioni di sangue midollare l’analisi multiparametrica può
vantaggiosamente essere estesa a CD45. La combinazione fenotipica

sIg kappa / sIg lambda / CD45 / CD19

appare particolarmente favorevole, in quanto è in grado di fornire informazioni su una


serie di punti importanti, ovvero:
i) la quota di elementi nucleati non eritroidi presente nel campione;
ii) la quota di linfociti presente nel campione;
iii) la quota di B linfociti presente all’interno dei linfociti totali;
iv) l’eventuale clonalità dei B linfociti, o, in alternativa, l’intensità di
espressione delle catene leggere.
Va anche rilevato che questo protocollo a quattro colori è in grado di distinguere i
B linfociti presumibilmente maturi dai precursori dei B linfociti, in quanto la bivariata
CD19 vs CD45 è in grado di dimostrare con sicurezza che gli elementi CD19+ segregano
in due cluster separati distinguibili sia in funzione dell’espressione di CD45 che dei
parametri fisici. L’estensione dell’analisi multiparametrica alle catene leggere delle
immunoglobuline di superficie permette di rilevare sia l’attesa policlonalità dei B linfociti
CD45+ che l’assenza di immunoglobuline sulla superficie dei B precursori CD45±. E’
anche interessante osservare che in una analisi multiparametrica condotta per CD10,
CD19 e CD45, gli elementi CD19+ CD45± (ma non gli elementi CD19+ CD45+)
esprimono selettivamente CD10.

DIMOSTRAZIONE DI FENOTIPI CARATTERISTICI

Da un punto di vista meramente pratico, l’approccio alla diagnostica citometrica


delle malattie linfoproliferative croniche appare profondamente diverso a seconda della
linea a cui esse appartengono. Nello studio delle neoplasie delle cellule T mature uno
degli scopi dell’analisi è la dimostrazione della presenza di un’anomalia fenotipica [45],
consistente in genere nell’assenza di un antigene atteso, o nella anormale intensità di
espressione di un antigene normalmente presente sulla controparte non trasformata. Nel
caso delle più frequenti malattie linfoproliferative croniche della serie B, lo scopo
dell’analisi è invece la dimostrazione della presenza di un fenotipo caratteristico
direttamente riferibile ad una definita entità nosografica. Sebbene moltissimi antigeni
possano essere esplorati in quest’ottica, le molecole più informative risultano essere CD5,
CD23 e CD10 [32].

FENOTIPI DISTINTIVI TRA B-CLL, MCL, FL e MZL


B-CLL MCL FL MZL
CD5 + + - -
CD23 + - - -
CD10 - - + -
B-CLL: leucemia linfatica cronica B; MCL: linfoma mantellare; FL: linfoma del
centro follicolare; MZL: linfoma della zona marginale.

156
Sebbene meno frequentemente utilizzato, anche lo studio delle molecole di
adesione può fornire utili elementi differenziativi [1531] [437]; esiste tuttavia in
letteratura una notevole confusione, dovuta:
i) alla non confrontabilità dei dati ottenuti dalle diverse tecniche,
citometriche e immunoistochimiche, con cui sono state eseguite le analisi;
ii) alla scarsa omogeneità dei concetti di positività e di intensità di
espressione adottati dai vari Autori.
Gli antigeni dotati di maggior interesse sono CD11a, appartenente alle integrine,
CD54, appartenente alla superfamiglia delle immnoglobuline, e CD62L, appartenente
alle selectine. La distribuzione di queste molecole nelle principali malattie
linfoproliferative croniche è molto schematicamente riportata in tabella.

DISTRIBUZIONE DI ALCUNE MOLECOLE DI ADESIONE NELLE


PRINCIPALI MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE
CRONICHE DELLA SERIE B
CD11a CD54 CD62L
FL linfonodale ++ ++ neg
FL leucemizzato Neg ++ neg
B-CLL Neg neg ++
SLL ++ ++ neg
LPL ++ ++ ++
MCL Neg ++ neg
SLVL ++ ++ neg
HCL Neg ++ neg

I concetti generali esposti finora devono comunque essere temperati dalle


seguenti considerazioni. Va detto infatti che:
i) la distribuzione degli antigeni riportata nelle tabelle costituisce una
super-semplificazione di puro significato didattico, in quanto non sarà
impossibile incontrare una tipica B-CLL negativa per CD5 [1532] [1533],
né la mancata espressione di CD10 escluderà necessariamente una
diagnosi di FL [398];
ii) la diagnosi di una sindrome linfoproliferativa costituisce un processo
complesso ed articolato, a cui le tecniche citometriche concorrono con un
peso sempre crescente, ma che si basa in modo imprescindibile sul
concorso dei risultati prodotti da svariate discipline, quali (in ordine
alfabetico) l’anatomia patologica, la biologia molecolare, la citogenetica,
la clinica, e la morfologia.
Deve poi essere ricordato che spesso nella diagnosi delle malattie
linfoproliferative croniche l’entità di espressione degli antigeni B-associati è in grado di
guidare la diagnosi non meno della dimostrazione della loro presenza/assenza.

157
INTENSITÀ DI ESPRESSIONE DEGLI ANTIGENI B-ASSOCIATI
NELLE SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE B
– CONFRONTO CON I B LINFOCITI NORMALI -
CD11a CD19 CD20 / CD22 CD23 CD45 CD79
FMC7 beta
B-CLL / / ↓ ↓ / / ↓
-/↓
“tipica”
B-CLL
“atipica” / / ↑(*) / ↓(*) / ↑(*)
+12
B-CLL ↓ / / / / ↓ /
del(11q)
HCL / ↑ ↑ ↑ / / /
(*) rispetto alla B-CLL “tipica”.

In conformità ai concetti schematizzati nella tabella, la prima combinazione


multiparametrica a 4 colori suggerita dopo la dimostrazione di un cluster di B linfociti
ristretto per una delle catene leggere, o comunque “sospetto” per la mancata espressione
di queste, potrebbe essere costituita dalla combinazione

CD5 / CD23 / CD19 / CD10.

Tale combinazione può essere proposta come secondo step per la valutazione
delle B linfocitosi, in quanto fornisce elementi utilissimi sulla distribuzione degli antigeni
di maggior significatività nella diagnostica differenziale delle malattie linfoproliferative
della linea B. Risulta evidente che questo protocollo potrebbe essere migliorato dalla
consensuale esplorazione della distribuzione delle catene leggere delle immunoglobuline
di superficie. Da un punto di vista tecnico, l’acquisizione o l’analisi possono essere
utilmente ristrette alla sola popolazione CD19+. In tal caso la bivariata SSC vs CD19
costituirà il citogramma leader sul quale operare le opportune selezioni. La dimostrazione
di un fenotipo CD19+, CD5-, CD10-, CD23- è compatibile con diagnosi di linfoma della
zona marginale (MZL), ed è tipica del linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL), che
peraltro ne rappresenta una varietà. Questo fenotipo è inoltre condiviso dalle cellule della
leucemia a cellule capellute (HCL), che entra in diagnosi differenziale con il linfoma
splenico a linfociti villosi anche per quanto concerne gli aspetti morfologici. In accordo
con queste considerazioni, come terzo step nella diagnostica multiparametrica delle
sindromi linfoproliferative croniche della serie B può essere proposta la combinazione

CD103 / CD25 / CD19 / CD11c.

Si noti infatti come questo protocollo sia in grado di chiarire ulteriormente la


natura dei B linfociti CD5 negativi, che in caso di HCL risultano positivi per CD103,
antigene considerato capace della migliore sensibilità nella diagnostica
immunofenotipica di questa entità nosografica. Va anche rilevato che l’ipotesi
diagnostica di HCL, fortemente sostenuta dalla positività per CD103 (nonché dalle
negatività per CD5, CD10, e CD23 desunte dalla multiparametrica precedente), è
ulteriormente rafforzata da altri indizi rilevabili dalla medesima analisi citometrica,
ovvero:

158
i) il comportamento dei parametri fisici degli elementi CD19+ CD103+, che
appaiono aumentati rispetto a quelli degli altri linfociti;
ii) la coespressione di CD11c e CD25 da parte degli elementi CD19+;
iii) un’espressione di CD19 più intensa di quanto normalmente atteso, ove ciò
sia reso apprezzabile dal confronto con eventuali B linfociti normali
residui;
iv) una particolare intensità nell’espressione di CD11c.
Va comunque ricordato per la precisione che l’espressione di CD103 non è
ristretta agli elementi della leucemia a cellule capellute, ma può essere riscontrata anche
su linfociti T attivati, ed è tipica del linfoma T intestinale associato a sindrome
enteropatica (EATCL) [1162]. Anche la coespressione di CD11c e di CD25 non è ristretta
alla leucemia a cellule capellute, ma può essere riscontrata in altre sindromi
linfoproliferative croniche della serie B, apparentemente senza che ciò si associ a un
particolare significato nosografico o prognostico.
Ancora, va sottolineato che le analisi multiparametriche proposte costituiscono
solo l’ossatura di un processo diagnostico differenziale, che a seconda dei casi può – e
deve - essere vantaggiosamente integrato con l’esplorazione della presenza e
dell’intensità di espressione di altri antigeni. A questo proposito, senza nessuna pretesa di
completezza, non sarà inutile ricordare le molecole FMC7, DBA-44, CD11a, CD20,
CD22, CD38, CD43, CD62L, CD75, le catene alfa e beta di CD79, CD122, CD123,
CD138, nonché le immunoglobuline di superficie esplorate per i loro principali isotipi.
Nella diagnostica delle neoplasie delle cellule B mature ci si può trovare talora
nelle condizioni di dover individuare, enumerare o caratterizzare elementi
plasmacellulari nel sangue periferico, nel sangue midollare o in altri distretti. Le difficoltà
connesse con questo compito sono rappresentate dal fatto che, sebbene alcune
plasmacellule normali possano esprimere debolmente CD19 o la catena alfa di CD79, in
genere questi elementi, specialmente se neoplastici, non coesprimono i normali antigeni
B-associati, e fino a poco tempo fa venivano usualmente identificati in funzione dei loro
parametri fisici, della brillante espressione di CD38, e della mancata o ridotta espressione
di CD45. La recente introduzione di MoAb specifici per CD138, molecola presente sulle
plasmacellule, ha radicalmente modificato la situazione, anche se non va dimenticato che
l’espressione di questo antigene può essere riscontrata anche su altri tipi cellulari. Una
combinazione utile nello studio di questi elementi è costituita dal protocollo

CD138 / CD56 / CD45 / CD19,

capace di permettere la distinzione tra plasmacellule normali di fenotipo CD19+,


CD56-, e plasmacellule patologiche di fenotipo CD19-, CD56+.

CASI PARTICOLARI

L’analisi multiparametrica a quattro colori si presta particolarmente bene a


sostenere decisioni cliniche in casi speciali, tra cui soprattutto la monitorizzazione della
malattia minima residua, situazione in cui alla bassa frequenza della popolazione
diagnosticamente rilevante si affianca la coesistenza di elementi normali che esprimono
antigeni condivisi dalle cellule neoplastiche. La scelta dei protocolli è chiaramente
indotta dal particolare tipo di problema a cui la tecnica citometrica è chiamata a dare
risposta. Un caso particolare è costituito dalla monitorizzazione del trattamento della
leucemia a cellule capellute, situazione in cui la presenza di rari B linfociti clonalmente
ristretti può essere mascherata dalla presenza di B linfociti policlonali normali. In questa
evenienza la combinazione

159
sIg kappa / sIg lambda / CD19 / CD11c

Un altro caso particolare è costituito dalla necessità di monitorare l’evoluzione


post-trapianto di soggetti affetti da malattie linfoproliferative del B linfocita CD5+, come
la leucemia linfatica cronica B ed il linfoma mantellare, nonché in tutti i casi di linfoma
caratterizzati dalla coespressione di CD5. In tale evenienza può essere particolarmente
informativa la combinazione

sIg kappa / sIg lambda / CD19 / CD5.

Va infatti ricordato che nel periferico dei soggetti sottoposti a trapianto di midollo
allogenico o a terapia mieloablativa seguita da reinfusione di cellule staminali autologhe,
i nuovi B linfociti normali coesprimono CD5, e tendono a mantenere questa caratteristica
per un lungo periodo [251] [1534] [20]. Di conseguenza è impossibile usare il fenotipo
CD5+ CD19+ da solo per monitorare eventuali recidive, ed è quindi necessario associarvi
l’esplorazione delle immunoglobuline di superficie nel tentativo di evidenziare
consensualmente la presenza di una restrizione per una delle catene leggere. In base a
considerazioni concettualmente analoghe può infine essere proposto il protocollo

sIg kappa / sIg lambda / CD19 / CD10

adatto allo studio del midollo osseo in soggetti affetti da linfoma follicolare, o da altre
malattie linfoproliferative croniche le cui cellule coesprimano CD10.

LINFOMA SEQUENZIALE E LINFOMA COMPOSITO

Si definisce “linfoma sequenziale” un quadro clinico in cui più di una distinta


malattia linfoproliferativa, ciascuna inquadrabile come entità nosografica separata, si
verifica in stazioni distinte o in tempi distinti nello stesso paziente, mentre si definisce
“linfoma composito” un quadro clinico in cui più di una distinta malattia
linfoproliferativa, ciascuna inquadrabile come entità nosografica separata, è
documentabile nello stesso momento e nella stessa stazione [1535]. In genere i linfomi
compositi consistono nella coesistenza di forme B distinte fra di loro [1536] [1537], ma
sono anche note associazioni tra linfomi T e B [1538] [1539] [1540] [1541] [1542] [1543]
[1544] [1545] [1546] [1547] [1548] [1549], associazioni tra forme B e forme NK [1550],
e associazioni tra malattia di Hodgkin e linfomi non Hodgkin sia T [1551] che B [1552]
[1553].
Sia il linfoma sequenziale che il linfoma composito costituiscono una situazione
tutt’altro che rara da incontrare nella pratica quotidiana; i linfomi compositi spesso
possono comparire assieme nel comparto periferico, costituendo un quadro di difficile
interpretazione che ben si avvantaggia dell’approccio multiparametrico delle metodiche
citometriche, che permette di evidenziare contemporaneamente la presenza di distinte
popolazioni patologiche [1554].

160
LEUCEMIA LINFATICA CRONICA A B LINFOCITI (B-CLL)

GENERALITÀ

Il capitolo della leucemia linfatica cronica a B linfociti riunisce due entità simili
ma tradizionalmente tenute distinte, ovvero la leucemia linfatica cronica a cellule B
(B-CLL) e il linfoma linfocitico a piccoli linfociti (B-SLL), suo equivalente non
leucemico. La classificazione REAL/WHO aggrega a queste due forme una terza entità
nosografica, costituita da quei casi che, pur compatibili con la diagnosi di B-CLL per
morfologia ed immunofenotipo, dimostrino note di differenziazione plasmacitoide, con
presenza di immunoglobuline citoplasmatiche e comparsa di componente sierica
monoclonale. Questa terza entità corrisponde al linfoma noto come "immunocitoma
linfoplasmacitoide" della classificazione di Kiel, e non deve essere confusa con
l’immunocitoma linfoplasmacitico della classificazione di Kiel, ribattezzato linfoma
linfoplasmacitoide nella classificazione REAL, e infine linfoma linfoplasmacitico nella
classificazione REAL/WHO. E’ possibile che la B-CLL con differenziazione
plasmacitoide costituisca il corrispettivo anatomo-clinico di alcuni casi di malattia di
Waldenstrom e di malattia delle catene pesanti mu [1555].
La leucemia linfatica cronica a cellule B (B-CLL) è la leucemia di più frequente
riscontro [1556]. E’ diffusa in tutto il mondo con la sola eccezione del Giappone, dove
per motivi non chiariti rappresenta un’entità nosografica infrequente [1557]. La B-CLL è
una malattia ad andamento clinico generalmente torpido e indolente, ma non mancano
casi dotati di comportamento aggressivo, ed è caratterizzata dalla comparsa di
linfoadenopatie e dalla presenza di linfocitosi periferica superiore a 5000 elementi per
mmc, e di infiltrazione midollare pari o superiore al 30% [1558]. Gli elementi tipici della
B-CLL sono generalmente piccoli linfociti con cromatina addensata e senza nucleolo, e
con scarso citoplasma lievemente basofilo privo di granulazioni azurofile; talora è
possibile evidenziare la presenza di cellule “atipiche”, consistenti in elementi di aspetto
prolinfocitoide, o linfoplasmocitoide, o con nucleo inciso, o eccezionalmente binucleati
[1559]. La B-CLL prende il nome di “B-CLL atipica” quando i prolinfociti sono più del
10 ma meno del 55% delle cellule totali, oppure quando più del 15% delle cellule totali è
costituito da cellule linfoplasmacitoidi o con nucleo inciso, con una quota di prolinfociti
comunque inferiore al 10% [767]. La “B-CLL atipica” viene definita “B-CLL/PL” nel
primo caso e “B-CLLpleo” nel secondo. La definizione “B-CLL mixed cells” compare in
letteratura in modo più confuso, in quanto viene talora associata all’una o all’altra delle
situazioni. La presenza di morfologia atipica è spesso associata alla trisomia 12, e
rappresenta un importante fattore prognostico di significato sfavorevole [1560] [1267]
[1561].
In alcuni casi il numero delle cellule di aspetto prolinfocitoide aumenta
progressivamente nel tempo, e la B-CLL/PL si trasforma in leucemia prolinfocitica.
Questa trasformazione costituisce un fenomeno diverso dalla cosiddetta sindrome di
Richter, situazione in cui la leucemia linfatica cronica si trasforma in un linfoma ad alto
grado di malignità [1562].
Negli ultimi anni si è venuta a raccogliere progressiva evidenza che la B-CLL non
costituisca una singola malattia, ma risulti di almeno due diverse entità nosografiche. La
prima forma deriva da B linfociti immaturi, trasformati a uno stadio precedente l’ingresso
nel centro germinativo e di conseguenza caratterizzati dall’assenza di ipermutazioni
somatiche dei geni codificanti per le regioni variabili delle immunoglobuline, mentre la
seconda deriva da B linfociti maturi che hanno attraversato il centro germinativo e
presentano un alto tasso di ipermutazioni somatiche. La prima forma appare
frequentemente associata alla trisomia del cromosoma 12, alla comparsa di morfologia

161
atipica, a elevata espressione di CD38 e a cattiva prognosi, mentre la seconda forma è
associata a bassa espressione di CD38 e a prognosi migliore [887] [1563] [1564].

IMMUNOFENOTIPO

B-CLL tipica

Il fenotipo atteso nella B-CLL tipica è

CD5+, CD10-, CD19+, CD23+, CD43+, CD103- [32] [34] [485].

L’intensità di espressione dei principali antigeni B-associati dimostra un


comportamento peculiare. L’antigene CD19 può essere espresso con una densità
lievemente inferiore di quella presente sui B linfociti policlonali normali residui [261]
(figura provvisoria #10). L’antigene CD20 è espresso a intensità ridotta rispetto ai B
linfociti normali [683] [685] [681] [261] [653], ma può essere up-regolato
dall’interferone alfa [1565]. E’ interessante osservare che l’espressione di CD20 sulle
cellule presenti nel midollo osseo e nel linfonodo è ancora più bassa di quello
evidenziabile sui linfociti periferici [684]. L’antigene CD22 può essere assente o
espresso in maniera particolarmente debole [261] [1566], e in alcuni casi può essere
rilevabile solamente nel citoplasma [1274]. Gli antigeni CD79 alfa e CD79 beta sono
generalmente assenti o debolmente espressi [1135] [1137] [1122] [258] [1136] [1138]
[261] [1566]. L’assenza di CD79 beta è presumibilmente dovuta ad un meccanismo di
regolazione post-trascrizionale, che produce una variante deficitaria dell’esone 3 che
codifica per il domain extracellulare [1140]. Il particolare comportamento di CD79 beta
nella B-CLL fa sì che il suo studio tenda a sostituire quello di CD22 nei sistemi di
diagnosi differenziale basati sul calcolo di un punteggio (score classification) [1141].
L’antigene HLA-DR è generalmente presente, ma può essere eccezionalmente assente
[1567].
L’espressione di diversi altri antigeni è stata variamente attribuita alle cellule della
B-CLL. Per quanto concerne gli antigeni del complesso CD1, alcuni report attribuiscono
alle cellule della B-CLL fenotipo CD1a+, CD1b-, CD1c+, con l’evidenziazione di CD1a
condizionata all’uso di MoAb diversi da OKT6 e da NA1/34 [43] [1568]. La presenza di
CD1a non sarebbe confermata da altri report, che si limiterebbero a evidenziare
l’espressione di CD1c su circa il 40% delle B-CLL indagate [19]. L’espressione di CD2 è
eccezionale ma possibile, ed è stata segnalata in casi isolati [104] [105] [106]. Le cellule
della B-CLL esprimono di solito CD6 [1569] [913], e possono esprimere
occasionalmente CD8 sia in condizioni basali [324] [325] [326] [105] [327] [328] [163]
[329] [330] [331] [332] [333] [334] [106] che dopo coltura a lungo termine [335].
Almeno in un caso l’espressione di CD8 su cellule di B-CLL è stata documentata come
dimero alfa/alfa [328]. Incerto appare il significato della coespressione di questo antigene,
che almeno in un caso sarebbe correlata con un comportamento non aggressivo [330],
mentre in altri casi sarebbe associata a cattiva tolleranza della terapia a base di cladribina
[334], oppure a rapida progressione [326], o a trisomia 12 [333], alterazione
cromosomica predittiva di cattiva prognosi. In un caso isolato l’espressione di CD8 era
associata con l’espressione di CD3 e con la traslocazione t(18;22) [163]. L’antigene
CD10 è sempre negativo. Per quanto concerne il dimero CD11a/CD18 esiste un report
che ne postula una ridotta espressione sulle cellule della B-CLL, ma è basato su studi di
tipo immunoistochimico e non citometrico [441]. La diminuita espressione di CD11a è
stata recentemente segnalata sulle cellule di una forma di B-CLL caratterizzata da bassa
espressione di CD45, delezione del braccio lungo del cromosoma 11, presenza di

162
linfoadenopatie e comportamento clinico aggressivo [442], mentre una sua aumentata
espressione sarebbe associata alla trisomia 12 [443].
L’antigene CD11b può essere espresso, e la sua presenza è stata associata al
riarrangiamento del gene bcl-1, e considerata un fattore dotato di significato prognostico
sia positivo [1570] che negativo [478]. Anche l’antigene CD11c può essere presente. E’
stato lungamente dibattuto se la B-CLL CD11c+ configuri o meno un’entità nosografica
separata, ma non è stato raggiunto un accordo conclusivo; secondo alcuni Autori
l’espressione di CD11c non sarebbe correlata ad una prognosi definita [498], secondo
altri sarebbe associata a una minore aggressività [1570], e secondo altri ancora
costituirebbe un fattore prognostico negativo [478]. Sebbene sull’argomento non esista
assoluta concordia [1571], sembra che le cellule della B-CLL possano più o meno
occasionalmente esprimere anche una serie di antigeni associati alla linea mieloide, come
CD13, CD14, CD15 e CD33 [496] [481] [547] [528] [559]. La presenza degli antigeni
mieloidi, e soprattutto di CD14, sarebbe associata a una peggiore prognosi e a uno stato
più avanzato della malattia [478] [481] [559]. E’ interessante notare che spesso
l’espressione degli antigeni mieloidi è ristretta ai linfociti presenti nel midollo osseo, ed è
assente sugli elementi circolanti nel sangue periferico [1572]. L’espressione
dell’antigene CD21 è ridotta [1573], mentre l’antigene CD23 è regolarmente espresso a
un’intensità maggiore di quella riscontrabile sui B linfociti normali, e appare
particolarmente brillante soprattutto sugli elementi prolinfocitoidi [723]. Secondo alcuni
Autori la sua intensità di espressione sarebbe direttamente proporzionale alla bontà della
prognosi [1574], ma non mancano a questo proposito voci contrastanti, in quanto in un
report isolato l’intensità della sua espressione è stata invece correlata con una più bassa
età all’esordio, una maggiore linfocitosi, e uno stato di malattia più avanzato [1570]. La
presenza dell’antigene CD25 è irregolare, e sembra associata a un comportamento clinico
più aggressivo e alla trisomia 12 [498]. L’antigene CD27 è di solito presente, ed è
espresso a una intensità di circa 98±27 E03 molecole per cellula, un valore analogo a
quello riscontrabile sui linfociti T e B normali [787]. Sebbene esistano pareri contrari
[884] [885] [886], l’antigene CD38 sembrerebbe prevalentemente espresso sulle cellule
della forma immatura senza ipermutazioni somatiche dei geni V(H), mentre sarebbe
raramente espresso su quelle della forma matura con geni V(H) ipermutati, e sarebbe
comunque suscettibile di assumere significato prognostico negativo [887] [884] [890]
[891] [889] [885] [892] [893] [894] [895]. L’antigene CD43 è regolarmente presente
[913]. Assenza di CD11c ed elevata espressione di CD44 definirebbero una forma di
B-CLL caratterizzata da cattiva prognosi [1575]. L’antigene CD45 è generalmente
presente con la stessa intensità rilevabile sui linfociti normali; la sua diminuita
espressione è stata recentemente segnalata sulle cellule di una forma di B-CLL
caratterizzata da bassa espressione di alcune molecole di adesione, delezione del braccio
lungo del cromosoma 11, presenza di linfoadenopatie e comportamento clinico
aggressivo [442]. Per quanto concerne infine le isoforme di CD45, le cellule
neoplastiche tendono generalmente ad esprimere l’isoforma ad alto peso molecolare
CD45RA, ma in una percentuale considerevole di casi possono coesprimere CD45RA e
CD45R0 [1576] [970] [971]. L’intensità di espressione di CD45RA sulle cellule della
B-CLL è più bassa di quella riscontrabile sui B linfociti normali CD45RA+ o sulle cellule
degli altri B-NHL CD45RA+ [971]. La presenza dell’antigene CD138 è controversa, in
quanto è stata esclusa da alcuni Autori [1212], ma è stata dimostrata da altri sia con
metodiche immunoistochimiche che con metodiche citometriche [1577] [1210] [1211]
[1218]. L’antigene FMC7 è in genere assente o espresso debolmente [669].
Per quanto riguarda le molecole di adesione, va rilevato che la B-CLL spesso non
esprime CD11a, mentre il linfoma linfocitico a piccole cellule B (B-SLL) è quasi sempre

163
CD11a positivo [1531] [435]; opposto appare il comportamento di CD62L, tipicamente
espresso a elevata intensità sulle cellule della B-CLL [435] [1578].
Per quanto riguarda poi le immunoglobuline di superficie, le cellule della
B-CLL esprimono debolmente immunoglobuline di membrana di isotipo IgM, talora
coesprimono IgD [1305] [1306], ed eccezionalmente coesprimono IgA [1307]; possono
inoltre esprimere immunoglobuline citoplasmatiche [1308] [1309] [1305] [1306] [1310]
[1273] [1274]. La debole espressione delle Ig è un tratto tipico della B-CLL [1265] [681]
[1266] [1267], e talora è cosi spiccata da non permetterne l’evidenziazione con le
tecniche citometriche, impedendo così la dimostrazione della restrizione per una delle
catene leggere [1265]. Esiste evidenza che l’intensità di espressione delle
immunoglobuline abbia un significato prognostico; i soggetti in cui le immunoglobuline
di superficie non sono evidenziabili o sono comunque espresse debolmente possono
avere un decorso clinico particolarmente indolente [1579].
Per quanto concerne i rapporti fra prognosi e isotipo, la letteratura riporta una
abbondante serie di dati non sempre concordanti. Sebbene alcuni lavori preliminari
attribuiscano un significato prognostico sfavorevole all’espressione di catene leggere
lambda nelle forme tipiche [1580], non vi è al momento attuale evidenza che la presenza
di una determinata catena leggera sia associata ad un particolare comportamento clinico,
mentre sembra invece che l’intensità di espressione delle IgM correli direttamente con
l’aggressività della malattia [1574]. E’ nota una casistica di B-CLL composta da casi
esprimenti catene pesanti mu e casi esprimenti catene pesanti mu e delta, con i casi IgD
positivi associati a migliore prognosi [1581]. E’ stata anche riportata una casistica
composta da casi esprimenti catene pesanti mu e casi esprimenti catene pesanti gamma,
con i casi IgG positivi caratterizzati anch’essi da decorso clinico significativamente più
favorevole [1582]. E’ infine nota una casistica ripartita in casi esprimenti catene pesanti
mu e delta (fenotipo associato alle cellule B “vergini”), in casi esprimenti solo catene
pesanti delta (fenotipo associato ai B linfociti caratterizzati da mutazioni somatiche dei
geni VH), e in casi esprimenti solo catene pesanti mu (fenotipo associato con le cellule B
memoria); i casi caratterizzati dalla sola espressione di IgD erano associati a una minor
incidenza di fattori prognostici negativi, quali ad esempio l’espressione di CD38 o la
presenza di morfologia “atipica” [896]. E’ importante comunque tenere presente che le
casistiche meno recenti sono suscettibili di raccogliere casi diversi da quelli considerati
modernamente B-CLL “vere”.
Sono noti anche casi di B-CLL, interpretabili come linfomi compositi,
caratterizzati dalla presenza contemporanea di due distinte popolazioni clonali, la prima
ristretta per catene leggere kappa e la seconda ristretta per catene leggere lambda [1583];
questa evenienza deve sempre essere tenuta presente nella diagnosi delle linfocitosi
policlonali persistenti a B linfociti. E’ noto anche un caso di sindrome linfoproliferativa
cronica, classificata come B-CLL atipica, caratterizzata dalla presenza di tre distinte
popolazioni di B linfociti, la prima ristretta per catene leggere kappa, la seconda ristretta
per catene leggere lambda, e la terza coesprimente sia catene leggere kappa che catene
leggere lambda [1333].
La B-CLL tipica non pone di solito problemi di diagnosi differenziale, nemmeno
con il linfoma a cellule mantellari (MCL), il quale è CD5+ ma generalmente esprime
poco o punto CD23. Per quanto concerne poi il riscontro di casi di B-CLL negativi per
CD5, è bene considerare come fino alla fine degli anni ’70 la diagnosi di leucemia
linfatica cronica venisse formulata sul riscontro di un tipico quadro clinico, corroborato
dalla evidenza di una linfocitosi periferica e midollare sostenuta prevalentemente da
piccoli linfociti maturi. Questa approccio diagnostico, eventualmente perfezionato dalla
evidenziazione delle immunoglobuline di superficie e dal riscontro della formazione di
rosette spontanee con emazie di topo, era suscettibile di confondere casi di B-CLL con

164
altre entità nosografiche diverse. In quest’ottica vanno probabilmente considerati i casi
riferiti come B-CLL CD5 negativa [1533]. E’ comunque possibile, anche se eccezionale,
l’osservazione di isolati casi di malattia linfoproliferativa CD5 negativa inquadrabili
come B-CLL sulla base della clinica, del cariotipo, del fenotipo residuo e dei quadri
periferico e midollare [262] [263].

B-CLL “atipica”

Il fenotipo delle B-CLL “atipiche” si differenzia da quello delle B-CLL “tipiche”


più da un punto di vista quantitativo che da un punto di vista qualitativo. In questo senso
le B-CLL atipiche tendono a esprimere CD20 e immunoglobuline di membrana con
maggiore intensità rispetto alle forme tipiche, e parallelamente tendono a ridurre
l’intensità di espressione di CD23 [1584] [1266] [261] [654]. L’antigene FMC7 viene
espresso vivacemente, ed è parimenti aumentata l’intensità di espressione di CD11a,
CD22, e della catena beta di CD79 [443] [1136] [261] [654]. Alcuni di questi riscontri
sono tuttavia controversi; esiste infatti un report secondo cui, tra due gruppi costituiti il
primo da soggetti affetti da B-CLL tipica e il secondo da soggetti affetti da B-CLL atipica,
nessuna differenza poteva essere riscontrata nell’espressione degli antigeni CD5, CD38,
e della catena alfa di CD79, mentre l’antigene CD23 risultava espresso con maggiore
intensità nelle forme atipiche [726].
Le caratteristiche fenotipiche e morfologiche della B-CLL atipica ne rendono
difficile la diagnosi differenziale con il linfoma mantellare. Esiste evidenza in letteratura
che i soli parametri significativamente diversi tra B-CLL atipica e MCL siano il grado di
espressione di CD20 e di CD54, significativamente più elevati in quest’ultimo [1585].

B-CLL con differenziazione plasmacitoide

Il fenotipo della B-CLL con differenziazione plasmacitoide non si allontana da


quello della B-CLL classica, ma se ne distingue per la più frequente ed intensa presenza
di immunoglobuline citoplasmatiche. L’isotipo delle catene pesanti può essere sia IgM
che IgG, e sembra dotato di valore prognostico, in quanto vi sono segnalazioni in
letteratura che le forme che esprimono IgM di membrana si comportano peggio di quelle
che esprimono IgG; peggior prognosi sembra associata anche all’espressione di catene
leggere kappa [1306]. E’ anche possibile rilevare un aumento dei parametri fisici,
correlato alla diversa morfologia degli elementi, e l’espressione di CD138 [1210]. La
positività per CD5 costituirebbe un utile elemento differenziale con il linfoma
linfoplasmacitico vero e proprio [1586].

Sindrome di Richter

La comparsa di un linfoma ad alto grado nel quadro di una B-CLL è definita


sindrome di Richter [1562]. Questa evenienza interviene nel 3% circa dei casi di B-CLL
[1587]. Dal punto di vista morfologico il nuovo linfoma consiste generalmente in un
linfoma monomorfo a grandi cellule, ma è anche possibile il riscontro di una varietà con
morfologia simile alle cellule di Reed-Sternberg, definita appunto “Reed-Sternberg-like”
[583] o “leucemia linfatica cronica con trasformazione in malattia di Hodgkin” [584].
Sebbene sia possibile che tale linfoma costituisca una seconda neoplasia [1588] [1589],
nella maggior parte dei casi gli studi di citogenetica e/o di biologia molecolare sono in
grado di provare che il linfoma ad alto grado rappresenta un’evoluzione clonale della
B-CLL sottostante, in quanto le cellule di ambedue le neoplasie esprimono le stesse
anomalie cromosomiche o lo stesso riarrangiamento del gene codificante per le

165
immunoglobuline [1590]. Nel caso di una documentata evoluzione clonale la restrizione
monotipica è di norma la medesima, ma è anche possibile che le cellule del linfoma ad
alto grado dimostrino una restrizione monotipica diversa da quelle della sottostante
B-CLL pur rappresentandone l’evoluzione clonale [1591].
Dal punto di vista immunofenotipico la sindrome di Richter si può allontanare dal
quadro classico della B-CLL, in quanto le cellule del linfoma ad alto grado possono non
esprimere CD5 [1533] [1592], o esprimere un fenotipo compatibile con un più avanzato
stadio di maturazione [1593], anche se sembra che l’antigene CD23 tenda ad essere
conservato [727] [1592]. Nel quadro della sindrome di Richter “Reed-Sternberg-like”, le
cellule di Richter esprimono generalmente fenotipo CD15+ CD30+ [582] [583] [584].

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA B A PROLINFOCITI (B-PLL)

GENERALITÀ

La leucemia linfatica cronica B a prolinfociti (B-PLL) è una forma di rara


osservazione, caratterizzata generalmente da assenza di linfoadenopatie, splenomegalia,
e spiccata linfocitosi periferica costituita da una quota di prolinfociti superiore al 55% dei
linfociti totali [767]. La morfologia della cellula patologica è tipica, ed è caratterizzata da
taglia medio-grande, nucleo con cromatina condensata e presenza di nucleolo centrale
vescicoloso. La B-PLL può presentarsi come tale all’esordio, o costituire il quadro finale
della trasformazione prolinfocitoide di una B-CLL. Ancorché tradizionalmente
riconosciuta come entità nosografica autonoma, è possibile che sotto la denominazione di
B-PLL vengano raccolte entità nosografiche diverse caratterizzate da una comune
morfologia “prolinfocitoide”, che potrebbe quindi costituire lo stadio terminale di distinte
neoplasie delle cellule B mature [1594]. Questa ipotesi, confortata dal riscontro di alcuni
casi di linfoma mantellare leucemizzato con tipica morfologia prolinfocitoide [1595]
[1594] [1596], renderebbe ragione dell’eterogeneità dei fenotipi attribuiti in letteratura a
questa entità nosografica.

IMMUNOFENOTIPO

Il fenotipo della B-PLL è alquanto variabile, e si discosta da quello della B-CLL


in quanto l’espressione di CD5 e di CD23 è spesso ridotta o assente [898] [1597] [261]. In
particolare l’antigene CD5 verrebbe espresso in una percentuale di casi variabile attorno
al 70% [269]; l’accuratezza di questo dato può essere influenzata dal fatto che molte
casistiche accorpano ai casi di B-PLL insorta de novo anche casi di B-PLL derivati dalla
trasformazioni prolinfocitoide di una B-CLL pre-esistente.
Nella B-PLL l’espressione degli antigeni CD20 e FMC7 è nettamente aumentata
[269], e quella di CD22 può essere ridotta [261]. Le cellule della B-PLL esprimono
vivacemente la catena beta di CD79 [1123]. Le immunoglobuline di membrana sono in
genere di isotipo IgM e IgD come nella B-CLL, e sono generalmente espresse ad intensità
elevata [1311] [269]; nel caso di B-CLL in trasformazione prolinfocitoide le
immunoglobuline di superficie appaiono più intensamente espresse sugli elementi
prolinfocitoidi che sui piccoli linfociti [1598]. E’ possibile evidenziare anche la presenza
di immunoglobuline citoplasmatiche, ma sono stati segnalati casi che non presentavano
immunoglobuline né sulla superficie né nel citoplasma, probabilmente per un
concomitante difetto di tipo trascrizionale o post-trascrizionale [1302]. E’ stata segnalata
l’espressione di CD10 [401], di CD13 [483], e di CD11b [483] [484]. In uno dei casi
descritti l’antigene CD11b era espresso sulle cellule leucemiche midollari e non sulle

166
cellule leucemiche del sangue periferico [484]. Per quanto concerne quest’ultima
osservazione, va rilevato che nel caso in oggetto i campioni di sangue periferico venivano
anticoagulati con EDTA, mentre quelli di sangue midollare venivano anticoagulati con
eparina. Questo diverso trattamento del campione può teoricamente essere all’origine
della discrepanza rilevata, almeno per quanto riguarda l’espressione di CD11b. In alcune
casistiche l’antigene CD11c è omogeneamente espresso a intensità elevata [497].

LINFOMA LINFOPLASMACITICO (LPL)

GENERALITÀ

Il linfoma linfoplasmacitico (LPL) delle classificazioni REAL/WHO e WHO, a


cui questo paragrafo si riferisce, corrisponde all’immunocitoma linfoplasmacitico della
classificazione di Kiel, temporaneamente ribattezzato linfoma linfoplasmacitoide nella
classificazione REAL, e non deve essere confuso con l’immunocitoma
linfoplasmacitoide della classificazione di Kiel, che nelle classificazioni REAL/WHO e
WHO non possiede dignità autonoma, ma viene assimilato alla B-CLL di cui viene
considerato una variante con differenziazione plasmacitoide [1446] [485] [1321].
Il linfoma linfoplasmacitico (LPL) costituisce il corrispettivo anatomo-clinico
della maggior parte dei casi classificati come macroglobulinemia di Waldenstrom,
quadro sindromico che può tuttavia essere sostenuto anche da altre entità nosografiche
[1599], come la già citata B-CLL con differenziazione plasmacitoide secondo la
classificazioni REAL/WHO, il linfoma della zona marginale (MZL) nodale [1314] ed
extranodale [1600] [1601], e il linfoma tipo MALT [1602]. E’ verosimile che alcuni casi
di linfoma linfoplasmacitico si estrinsechino clinicamente come malattia delle catene
pesanti gamma [1555]. Il linfoma linfoplasmacitico consiste di una diffusa proliferazione
di piccoli linfociti, di linfociti linfoplasmacitoidi e di plasmacellule. Questo linfoma
costituisce una forma relativamente rara (1% circa di tutti i B-NHL), ma leucemizza
frequentemente (60% dei casi circa).

IMMUNOFENOTIPO

Le cellule del linfoma linfoplasmacitico sono positive per gli antigeni B-associati
CD19, CD20, CD22 e per la catena alfa di CD79, sono positive per CD38, esprimono le
immunoglobuline citoplasmatiche e di membrana con preferenziale espressione di IgM
non accompagnate da IgD, possono esprimere CD11c e CD25, e sono negative per CD5 e
CD10, [1312] [917] [1313]. Secondo alcuni Autori [415], ma non secondo altri [917], le
cellule neoplastiche del linfoma linfoplasmacitico potrebbero esprimere CD23 in una
percentuale di poco superiore alla metà dei casi; parimenti controversa è la presenza di
CD43, che è negata da alcuni Autori [917] ma ammessa da altri [1313]. E’ anche
possibile rilevare un aumento dei parametri fisici, correlato alla diversa morfologia degli
elementi, e l’espressione di CD138 [1210]. L’assenza di CD5, peraltro non costante
[1603], costituirebbe un utile elemento differenziale con la B-CLL a maturazione
plasmacitoide [1586].

LINFOMI DELLA ZONA MARGINALE (MBCL, MZL, SLVL, SMZL)

GENERALITÀ

167
I linfomi della zona marginale costituiscono un gruppo di malattie di recente
individuazione, a cui è possibile ricondurre alcune entità nosografiche strettamente
correlate fra di loro, ovvero
i) il linfoma extranodale del tessuto linfatico associato alla mucosa (linfoma
MALT, o “MALToma”),
ii) il linfoma nodale della zona marginale con (MBCL) o senza cellule B
monocitoidi (MZL),
iii) il linfoma splenico della zona marginale con (SLVL) o senza (SMZL)
linfociti villosi, e probabilmente
iv) il linfoma nodale della zona marginale di tipo splenico [1604] [267] [915]
[1605].
Il linfoma della zona marginale extranodale riguarda spesso pazienti con
situazioni “antigen-driven”, come alcune patologie autoimmuni (malattie di Sjœgren o di
Hashimoto) [1606] o la gastrite cronica da Elicobacter [1607], e di regola non
leucemizza.
Il linfoma nodale della zona marginale (MZL) e la sua variante con cellule
monocitoidi, detta anche “linfoma monocitoide a cellule B di Sheibani” (MBCL),
leucemizzano molto raramente [1608] [1609] [1610].
Il linfoma splenico della zona marginale (SMZL) presumibilmente corrisponde
all’entità nota come “linfoma splenico a linfociti villosi” (SLVL) [1611]. La
corrispondenza tra le due forme sembra suggerita anche dal comune riscontro di una
tipica anomalia cromosomica costituita dalla trisomia 3 [1612]. Il linfoma splenico della
zona marginale è un linfoma abbastanza raro, che costituisce circa l’1% di tutti i linfomi
non Hodgkin [1613], ma è caratterizzato da una frequente leucemizzazione. È verosimile
che la maggioranza dei casi di “leucemia linfatica cronica splenica pura” o di “leucemia
linfatica alinfadenica” della vecchia letteratura sia costituita da casi di SMZL
leucemizzato [1614] [1615].
Il linfoma nodale della zona marginale di tipo splenico consiste in un linfoma
nodale della zona marginale con caratteristiche morfologiche e fenotipiche simili a quelle
del meglio definito linfoma splenico della zona marginale. Analogamente al linfoma
marginale nodale, anche questa entità nosografica leucemizza eccezionalmente [1604].
Esiste poi una piccola quota di casi, inquadrati genericamente come MZL non
MALT, in cui la presentazione della malattia è solo leucemica, senza evidente
coinvolgimento né splenico né nodale [267].

MORFOLOGIA E IMMUNOFENOTIPO

La morfologia delle cellule neoplastiche è spesso simile a quella della leucemia


linfatica cronica B-CLL. Gli elementi villosi del linfoma splenico della zona marginale
possono ricordare quelli della leucemia a cellule capellute (HCL). Sebbene esista una
notevole variabilità tra caso e caso, le protrusioni della membrana delle cellule villose
sono tuttavia meno fini di quelle della HCL, e sono spesso disposte polarmente sulle
cellule che le dimostrano. Da un punto di vista citometrico, le cellule del linfoma splenico
a linfociti villosi campionate dal sangue periferico dimostrano di solito parametri fisici
più ridotti rispetto a quelli delle cellule della leucemia a cellule capellute, nonostante le
dimensioni e le estroflessioni della membrana siano apparentemente simili. Le cellule del
linfoma splenico a linfociti villosi sono generalmente negative per l’isoenzima IV della
fosfatasi acida, dimostrabile invece nelle cellule della leucemia a cellule capellute [1616].
Il fenotipo atteso nei linfomi della zona marginale è:

CD5-, CD19+, CD10-, CD23-, CD43-, CD103-, CD138- [32] [34] [485].

168
Le cellule neoplastiche esprimono regolarmente gli antigeni B-associati CD20,
CD22 e la catena alfa di CD79, e sono intensamente positive per le immunoglobuline di
superficie, con una particolare propensione per l’espressione delle catene leggere kappa.
Per quanto concerne l’espressione delle catene pesanti, la forma nodale (MZL) esprime
preferenzialmente fenotipo IgM+ IgD- e in casi sporadici anche IgG+ o IgA+, mentre il
linfoma splenico della zona marginale (SMZL e SLVL) e la forma nodale ad esso
correlata tendono a coesprimere IgM e IgD [915]. La presenza di immunoglobuline
citoplasmatiche è possibile [1314], in accordo con il riscontro che i linfomi della zona
marginale possono costituire il corrispettivo anatomo-clinico di alcuni casi di malattia di
Waldenstrom [1314] [1602] [1600].
La fenotipizzazione delle cellule dei linfomi della zona marginale fornisce
generalmente risultati alquanto deludenti, in quanto non esiste una combinazione
fenotipica caratteristica di questa entità nosografica. Di solito questi elementi non
esprimono né CD5, né CD10, né CD23, né CD43 [1617], e la loro fenotipizzazione si
limita a fornire un profilo “in negativo”, che risulta comunque utile per procedere a una
diagnosi differenziale con altre forme dotate di fenotipi più suggestivi. Numerose
eccezioni a questo profilo sono state comunque segnalate in letteratura. Ad esempio, la
sporadica espressione di CD5 è possibile [1616], e in una casistica di 124 soggetti
pubblicata da Berger è stata dimostrata con tecniche sia citometriche che
immunoistochimiche nel 12% dei casi; è interessante osservare che un caso coesprimeva
CD5, CD23 e CD43, mimando così il fenotipo classico della B-CLL [267]. La sporadica
coespressione di CD5 è stata segnalata anche da altri Autori, e sembrerebbe associata alla
tendenza alla trasformazione blastica, alla disseminazione alle sedi extranodali,
all’invasione del midollo osseo, e alla leucemizzazione [266] [265] [268]. L’espressione
di CD10 è variabile, e passa da una percentuale aggirantesi attorno all’1,5% dei casi in
una casistica di 124 linfomi marginali non MALT (tra cui 59 casi di linfoma marginale
splenico) [267], ad una percentuale di circa un terzo dei casi in una casistica
selettivamente composta da 100 linfomi splenici a linfociti villosi [415]. Le cellule del
linfoma della zona marginale esprimono spesso CD11c, con una frequenza che arriva
fino al 50% dei casi nel linfoma splenico a linfociti villosi [415]; sia la frequenza che
l’intensità di espressione dell’antigene sono pù basse di quelle rilevabili sulle cellule della
HCL. Queste caratteristiche, unita all’eventuale presenza di immunoglobuline
citoplasmatiche, risultano utili nella diagnosi differenziale con i linfomi del centro
germinativo, generalmente negativi per CD11c. L’espressione di CD23 è stata riportata
in una quota variabile dal 10 al 31% dei casi [415] [267], l’espressione degli antigeni
CD25 e CD38 è stata segnalata rispettivamente nel 25 e nel 30% dei casi di linfoma
splenico a linfociti villosi (SLVL) [415], mentre l’espressione di CD43 oscilla a seconda
delle casistiche dal 10 al 50% dei casi [914] [267], ed è stata segnalata soprattutto nelle
forme “non spleniche” [915], tra cui alcuni casi pediatrici insorti in soggetti privi di
fattori di rischio [1618]. Va infine ricordato che una piccola percentuale di SLVL può
esprimere CD103 [415].

LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE (HCL)

GENERALITÀ

Tra le malattie linfoproliferative croniche, la leucemia a cellule capellute (HCL)


costituisce un’entità nosografica caratterizzata da una particolare modalità di
presentazione, spesso costituita da un quadro pancitopenico accompagnato da

169
splenomegalia. In questi casi le cellule capellute nel sangue sono molto rare o talora
addirittura assenti, e lo studio del sangue periferico eseguito con metodiche tradizionali
non fornisce informazioni utili alla diagnosi, che spesso riposa sulla biopsia del midollo
osseo. Altre caratteristiche del quadro periferico all’esordio sono costituite da moderata
piastrinopenia e da una spiccata monocitopenia, spesso responsabile di infezioni
opportunistiche che possono costituire l’esordio clinico della malattia.
Della leucemia a cellule capellute esiste anche una forma cosiddetta variante
(HCLv), detta anche impropriamente “prolinfocitica”, caratterizzata da una presentazione
frequentemente leucocitosica e da elementi capelluti dotati di un nucleo vescicoloso,
simile a quello rilevabile negli elementi della leucemia a prolinfociti [1619] [1620] [1621]
[500] [408]. E’ stata anche descritta l’esistenza di una variante “giapponese” (HCL-J)
[409] [1622] [1623] [743] [410].
Le cellule della leucemia a cellule capellute (ma non quelle della sua variante)
sono generalmente positive per l’isoenzima IV della fosfatasi acida, noto anche come
fosfatasi acida tartrato-resistente, o TRAP. Prima della comparsa delle tecniche di
fenotipizzazione la dimostrazione citochimica di questo enzima veniva considerata molto
importante; tuttavia la fosfatasi acida tartrato-resistente non è patognomonica di questa
entità nosografica, ed è stata ripetutamente segnalata in isolati casi di altre sindromi
linfoproliferative [1624]

MORFOLOGIA E IMMUNOFENOTIPO

L’elemento caratteristico della leucemia a cellule capellute è costituito da un


mononucleato di taglia medio-grande dotato delle seguenti caratteristiche morfologiche:
i) elevato rapporto nucleo-citoplasma;
ii) nucleo generalmente non nucleolato con cromatina condensata, talora
bilobato o inciso;
iii) delicate propaggini citoplasmatiche simulanti la presenza di peli o villi.
Le cellule della HCL dimostrano generalmente parametri fisici aumentati rispetto
a quelli dei linfociti normali [1167]. Spesso tale caratteristica è sufficiente a distinguerle
dai linfociti normali residui [1625].
Il fenotipo atteso nella leucemia a cellule capellute è:

CD5-, CD19+, CD10-, CD11c+, CD23-, CD25+, CD43-, CD103+, CD138- [32]
[34] [485].

Le cellule della HCL sono generalmente positive per gli antigeni B-associati
CD19, CD20 e CD22, e li coesprimono con un’intensità tipicamente maggiore di quella
rilevabile sui B linfociti normali [270] [261] [653] [1167] [684]; la catena beta
dell’antigene CD79 sembra invece presente solamente in un quarto dei casi [1135].
Questo comportamento può risultare utile nella distinzione citometrica delle cellule
capellute dai B linfociti normali residui [1167].
Le cellule della HCL sono intensamente positive per le immunoglobuline di
superficie, e dimostrano propensione per l’espressione di IgG [1316] [1315] [433]; sono
noti alcuni casi caratterizzati dalla presenza di immunoglobuline citoplasmatiche di
isotipo IgM [1315] [1318]. Una caratteristica inusuale delle cellule capellute consiste
nella frequente coespressione di catene pesanti appartenenti a diverse classi isotipiche,
con preponderante presenza dell’isotipo IgG3 [1316] [433] [1317]. L’espressione delle
catene leggere kappa sembra associata ad una prognosi più benevola [1330].

170
Le cellule della HCL esprimono CD1a [42] e CD1c [21]; è curioso osservare che
l’Autore che evidenzia l’espressione di CD1c non è in grado di confermare la presenza di
CD1a sulle cellule delle HCL della propria casistica.
Isolati casi di HCL coesprimono CD2, senza che a questo fenotipo si associno
particolari comportamenti clinici [101] [103]. Sono anche noti due casi di B-HCL
altrimenti tipica le cui cellule reagivano con il MoAb anti CD3 UCHT1, ma non con il
MoAb OKT-3 [164]. In una casistica costituita da 68 soggetti con HCL, gli antigeni CD4
e CD5 sono stati evidenziati su più del 20% delle cellule rispettivamente nel 12 e nel 10%
degli individui [202]. La espressione di CD5 è stata segnalata anche da altri autori, ed è
associata ad una cattiva risposta all' interferone [271] ma non alla cladribina
(2'-cloro-desossiadenosina) [272]. E’ interessante osservare che nel caso riferito da Usha
l’espressione di CD5 era ristretta alle cellule capellute presenti nel midollo osseo, ma
assente nelle cellule capellute circolanti nel periferico.
L’antigene CD10 è in genere negativo, ma nella casistica di alcuni Autori è stato
segnalato su di una minoranza di elementi nel 5% dei casi [202]. Le cellule della HCL
non esprimono generalmente CD11a [433] [434] [435] [436] [437], possono essere
positive per CD11b [742], ma esprimono intensamente CD11c [490] [762] [270] [497].
La coespressione di CD13 e di CD15 è stata sporadicamente segnalata [529]
[202]. Vi è evidenza in letteratura che CD21 non venga espresso, [529], mentre CD23 è
stato segnalato su più di un quinto degli elementi in circa un quinto dei casi [202].
L’antigene CD24 è descritto come assente [742] o come presente ma espresso a
un’intensità particolarmente bassa [732]; è possibile che questa apparente discrepanza
dipende dalla sensibilità del sistema impiegato nell’analisi fenotipica. La bassa o assente
espressione di CD24 su neoplasie considerate derivanti da cellule B attivate, come la
leucemia a cellule capellute (HCL) e il linfoma a cellule monocitoidi (MBCL) [744], ben
si accorda comunque con il fatto che l’attivazione in vitro di B linfociti con PMA o SAC
down-regola l’espressione dell’antigene [745].
Una caratteristica tipica ma non esclusiva delle cellule capellute è la
coespressione di CD25, catena alfa del recettore per l’interleuchina 2 [760] [761] [762]
[270]. In alcuni casi è stata sporadicamente segnalata la coespressione di CD33 [529],
mentre la presenza di CD38 viene negata da alcuni Autori [529] e segnalata da altri su di
una minoranza di cellule in poco meno della metà dei casi testati [202]. La molecola di
adesione CD44 è intensamente espressa [1626] [529], l’isoforma CD45R0 è segnalata su
di una minoranza di cellule in poco meno di un quarto dei casi testati [202], CD75 è
presente [529] [410], e CD85 è intensamente espresso [1627]. La coespressione di
CD103, antigene peraltro presente anche sui T linfociti dell’epitelio intestinale e sulle
neoplasie da essi derivate, è al momento attuale considerato il marker più specifico e più
sensibile per la diagnosi di HCL [1165] [1157] [270] [202] [1166] [407]; la positività per
CD103 può non essere estesa a tutte le cellule leucemiche, ed è spesso possibile
dimostrare la presenza di sottopopolazioni negative per questa molecola di adesione
[202]. La catena beta del recettore per l’interleuchina 2 (CD122) e la catena alfa del
recettore per l’interleuchina 3 (CD123) sono di norma presenti [1628] [1629]. Le cellule
della HCL si colorano molto bene anche con l’anticorpo FMC7 [529] [1630] che
riconosce un epitopo di CD20 [674], con l’anticorpo DBA-44 [1630] che riconosce
l’antigene CD72 [1631], e con l’anticorpo PCA-1 [1632] che riconosce un antigene
espresso sulle plasmacellule [1633]. L’anticorpo DBA-44, che funziona su campioni
paraffinati svolgendo un importante ruolo in immunoistochimica, è stato per un certo
periodo considerato altamente specifico per l’HCL, ma con il tempo si è rivelato capace
di reagire anche con i linfociti del mantello, con gli immunoblasti reattivi e con le cellule
B monocitoidi, nonché con le cellule dei linfomi centroblastico, immunoblastico, e a
cellule B monocitoidi [1634] [1630].

171
FORME VARIANTI E FORME MORFOLOGICAMENTE SIMILI

Le cellule della HCL variante (HCLv) non esprimono CD25 [500] [408] nè
DBA44 [1635], ma esprimono CD30 [788] e CD122 [763]. In una casistica di 52 pazienti
affetti da HCLv la positività per CD11c, CD79b e CD103 veniva evidenziata
rispettivamente nell’87, nel 24 e nel 60% dei casi testati [408].
Le cellule della HCL variante “giapponese” (HCL-J) sono caratterizzate dalla
frequente mancata espressione delle catene leggere, oppure, qualora positive, dalla
prevalenza di restrizione per catene kappa [743]. Generalmente le cellule della HCL-J
possono esprimere CD103 in una minoranza di casi e sono negative per gli antigeni CD5,
CD10, CD24 e CD25 [1622] [1623] [743], ma sono noti anche casi positivi per CD5 e
CD10 [409] [410].
L’HCL non è la sola entità nosografica caratterizzata da elementi “hairy”, e di
conseguenza entra in diagnosi differenziale con altre entità nosografiche caratterizzate da
morfologia “capelluta”, come il linfoma splenico a linfociti villosi (SLVL). Per la
diagnosi differenziale tra HCL, SLVL e HCLv è stato escogitato un sistema a punteggio
basato sul fenotipo [1523], che però riveste scarso valore pratico, in quanto comprende
l’impiego del MoAb HC2, non reperibile commercialmente. In linea di massima può
essere utile ricordare che l’entità di espressione di CD11c è particolarmente intensa in
HCL, che SLVL è generalmente negativo per CD103, che le cellule della HCL variante
sono negative per CD25, e che rispetto alle cellule della HCL quelle del linfoma splenico
a linfociti villosi appaiono più intensamente positive per la catena beta di CD79 e meno
intensamente positive per CD19 [261]. Va inoltre ricordato che anche gli elementi della
linfocitosi policlonale persistente a B linfociti (PLBL) possono presentare aspetti “hairy”;
questa morfologia capelluta è particolarmente spiccata nella linfocitosi policlonale
persistente a B linfociti variante “giapponese” (HBLD, o “hairy B-cell
lymphoproliferative disorder”). Queste due forme, peraltro policlonali per definizione,
presentano comunque peculiari quadri sindromici e morfologici che ne permettono la
identificazione.
Va infine ricordato che sono stati descritti cinque casi di HCL caratterizzati da una
morfologia di tipo blastico, che in tre casi compariva all’esordio della malattia [1636] e in
altri due interveniva come trasformazione finale di un decorso altrimenti tipico [1637]
[1638].

172
GAMMOPATIA MONOCLONALE DI SIGNIFICATO INDETERMINATO
(MGUS), MIELOMA MULTIPLO (MM), E LEUCEMIA PLASMACELLULARE
(PCL)

GENERALITÀ

La gammopatia monoclonale di significato indeterminato (MGUS), il mieloma


multiplo (MM) e la leucemia plasmacellulare (PCL) sono entità nosografiche di diverso
significato clinico, accomunate dalla presenza di un clone B maturante fino allo stadio di
plasmacellula produttrice di una componente monoclonale. Tra queste forme esistono
tuttavia profonde differenze riguardanti la biologia, la clinica e la storia naturale. In
ossequio a questa premessa, l’immunofenotipo verrà trattato separatamente per ogni
singola entità nosografica.
La gammopatia monoclonale di significato indeterminato (MGUS) è una
condizione contraddistinta dalla presenza di plasmacellule midollari ristrette clonalmente,
dalla comparsa di una componente sierica monoclonale, e dall’assenza di condizioni
cliniche e laboratoristiche che consentano la diagnosi di mieloma multiplo. La MGUS è
un’entità clinicamente benigna, che solo in una minoranza di casi evolve verso un
mieloma multiplo vero e proprio. Al momento attuale è impossibile prevedere se una
MGUS rimarrà stabile o evolverà verso un mieloma multiplo. La diagnosi differenziale
tra le due condizioni è alquanto sfumata, e si basa sul quadro clinico e su di una serie di
indicatori, tra cui il numero di plasmacellule midollari e il comportamento di parametri
correlabili alla massa del tumore o alla sua attività proliferativa, come ad esempio l’entità
della componente monoclonale, la sua evoluzione nel tempo, il tasso sierico della
beta-2-microglobulina, e l’attività della fosfatasi alcalina ossea [1639] [1640].
Il mieloma multiplo (MM) è una condizione evolutiva contraddistinta dalla
presenza di plasmacellule midollari ristrette clonalmente, dalla presenza di una
componente monoclonale nel sangue periferico, e da un quadro sindromico variabile e
principalmente costituito dalla presenza di lesioni osteolitiche, da insufficienza midollare
e da insufficienza renale [1639] [1641].
La leucemia plasmacellulare (PCL) è una condizione biologicamente analoga al
mieloma multiplo, che si distingue da questo per la presenza di plasmacellule nel
comparto periferico e per un andamento clinico spesso più aggressivo [405]. Per
convenzione, la leucemia plasmacellulare è diagnosticata in base alla presenza di un
numero di plasmacellule maggiore di 2000 elementi per millimetro cubo, accompagnati
da una plasmocitosi midollare superiore al 20% [1642]. La presentazione leucemica può
costituire l’esordio della malattia (PCL primitiva), o presentarsi come evento terminale
(PCL secondaria), nel qual caso dimostra spesso andamento tumultuoso. La leucemia
plasmacellulare è frequentemente associata a isotipi particolari, come IgE [1324] o IgD
lambda, o alla presenza delle sole catene leggere [405].
Nonostante tutte queste situazioni siano accomunate dalla presenza di
plasmacellule clonalmente ristrette, si ammette generalmente che la trasformazione
neoplastica interessi un precursore più immaturo, non ancora inequivocabilmente
definito, la cui progressiva maturazione condurrebbe alla produzione di plasmacellule
che si localizzerebbero per homing nel midollo osseo. Sebbene diversi tipi cellulari siano
stati candidati a questo ruolo, nel mieloma multiplo l’analisi delle mutazioni somatiche
dei geni V(H) sembra indicare come responsabile della trasformazione una cellula B
postfollicolare caratterizzata dalla presenza di mutazioni omogenee deponenti per una
cessata esposizione a meccanismi di ipermutazione somatica [1643] [1328]. Per quanto
concerne invece la gammopatia monoclonale, in una percentuale di casi la presenza di
eterogeneità delle sequenze mutate sembra indicare come responsabile della

173
trasformazione una cellula ancora sotto l’influenza dei mutatori [1643]; è possibile che
queste differenze rivestano importanza clinica, rendendo ragione del differente
comportamento delle diverse entità nosografiche.
Contrariamente a quanto avviene nella leucemia plasmacellulare, nella
gammopatia monoclonale e nel mieloma multiplo le plasmacellule circolano nel sangue
periferico a frequenze così basse da non essere evidenziabili all’analisi morfologica
[1644]. Con metodiche immunologiche è possibile mettere in evidenza nel comparto
periferico la presenza di popolazioni di B linfociti ristretti per la stessa catena leggera
della componente monoclonale [1645] [1646], e presumibilmente dotati di capacità
clonogenica [1647]. Oltre all’evidenziazione di plasmacellule presenti nel midollo osseo
[1648], le applicazioni della citometria a flusso in queste patologie dei B linfociti sono
spesso rivolte a compiti particolari, come l’evidenziazione (nonché enumerazione e
caratterizzazione) di plasmacellule presenti a bassa frequenza nel comparto periferico
[1649] [1650], l’evidenziazione di plasmacellule inquinanti il prodotto di citoaferesi
eseguita in pazienti sottoposti a mobilizzazione di precursori emopoietici CD34+ [1651]
[1652], o la distinzione tra plasmacellule neoplastiche e plasmacellule normali nel
follow-up di soggetti sottoposti a regimi terapeutici diversi [1653]. Le capacità
multiparametriche della metodica rendono la citometria flusso strumento di elezione per
lo studio qualitativo delle plasmacellule neoplastiche, in quanto permettono all’operatore
di distinguerle dalle cellule normali residue, restringendo selettivamente a loro lo studio
della distribuzione di determinati parametri, come ad esempio il contenuto di DNA o la
capacità di incorporare bromodesossiuridina. La citometria a flusso dimostra un
importante limite nella valutazione quantitativa delle plasmacellule midollari. Per motivi
non ancora perfettamente chiariti, spesso esiste una grande discrepanza tra le percentuali
di plasmacellule ottenute con questa metodica e quelle talora molto più elevate prodotte
dalle metodiche tradizionali; questa discrepanza può essere almeno parzialmente
ricondotta ad effetti di diluizione del campione con sangue periferico, o a una particolare
fragilità delle plasmacellule [1271].

PARAMETRI FISICI E FENOTIPO

Plasmacellule normali

La situazione più desiderabile contemplerebbe la possibilità di distinguere in


modo inequivocabile tra plasmacellule normali e plasmacellule patologiche,
discriminando ulteriormente all’interno di queste ultime tra le plasmacellule della MGUS
e quelle delle altre forme. Sebbene tale traguardo non possa ritenersi raggiunto, l’analisi
immunofenotipica è comunque in grado di produrre una serie di importanti informazioni.

RUOLO DELL’ANALISI MULTICOLORE


NELLA CARATTERIZZAZIONE DELLE PLASMACELLULE
PARAMETRI INDAGATI IPOTESI
DIAGNOSTICA
CD19 CD38 CD56 FSC / SSC
debole Brillante assente ↑↑ plasmacellule normali
assente Ridotta presente ↑↑↑ plasmacellule
trasformate

Dal punto di vista dei parametri fisici, le plasmacellule normali dimostrano


generalmente valori aumentati rispetto a quelli dei linfociti, con un particolare
incremento dei valori di FSC.
174
Dal punto di vista fenotipico, le plasmacellule (sia normali che patologiche) sono
rimaste per lungo tempo elusive. Prima della comparsa degli anticorpi monoclonali,
l’unico modo per evidenziarle con certezza è stata la dimostrazione della presenza delle
immunoglobuline citoplasmatiche, generalmente effettuata mediante immunoistochimica
o imunofluorescenza in sezioni di tessuto o su citocentrifugato. La comparsa dei primi
anticorpi monoclonali non migliorava sostanzialmente la situazione, in quanto i cloni
capaci di riconoscere le plasmacellule erano pochi, non specifici e spesso non reperibili
commercialmente, e la dimostrazione delle plasmacellule era affidata a un’analisi
multiparametrica che esplorasse contemporaneamente i parametri fisici e l’antigene
CD38, marcatore presente su molti tipi cellulari ma espresso dalle plasmacellule ad una
intensità particolarmente elevata [1648]. L’accuratezza di questo approccio poteva essere
aumentata estendendo l’analisi a CD45, che essendo espresso poco o nulla dalle
plasmacellule permetteva di distinguerle con maggior sicurezza dai grossi mononucleati
attivati positivi per CD38.
Questa situazione è stata drasticamente modificata con l’introduzione degli
anticorpi monoclonali specifici per l’antigene CD138, espresso con grande specificità da
tutte le plasmacellule, normali o patologiche che siano [1577] [1208] [1217]. Attualmente
l’intensa espressione di CD38 e la positività per CD138 sono considerati i migliori
requisiti in grado di identificare le plasmacellule [656], che peraltro risultano debolmente
positive anche per HLA-DR [1654] e CD19 [643] [656], e possono risultare positive per
altri antigeni B-associati, come CD20 [656] e le immunoglobuline di superficie [1319].
Oltre al detto fenotipo

CD19± CD38++ CD45± CD138+,

le plasmacellule normali possono esprimere anche CD10, CD13 e CD33 [1648]


[1654], antigeni spesso segnalati in letteratura come specifici delle plasmacellule
mielomatose [501].

Gammapatia monoclonale (MGUS)

Le plasmacellule dimostrabili nel midollo osseo di soggetti con gammapatia


monoclonale di significato indeterminato (MGUS) possono venire divise in due grandi
categorie. La prima categoria esprime un fenotipo sovrapponibile a quello già descritto
per le plasmacellule normali, ed è verosimilmente costituita dalle plasmacellule
policlonali residue, in quando non dimostra restrizione per una catena all’analisi delle
immunoglobuline citoplasmatiche e non risulta aneuploide all’analisi del contenuto di
DNA. La seconda popolazione dimostra un aumento dei parametri fisici, un’espressione
di CD38 meno brillante, negatività per CD19 e frequente positività per CD56 [655] [656],
ed è presumibilmente costituita da plasmacellule trasformate, in quanto dimostra
restrizione per una catena leggera all’analisi delle immunoglobuline citoplasmatiche e
risulta aneuploide all’analisi del contenuto di DNA [655] [656]. Il fenotipo di queste
plasmacellule trasformate corrisponde sostanzialmente al fenotipo riscontrabile sulle
plasmacellule del mieloma multiplo.
Un’analisi multivariata di numerosi parametri, tra cui il contenuto di DNA e la
percentuale di cellule in fase S, dimostra che il rapporto tra la popolazione di
plasmacellule CD19+ CD56- e la popolazione di plasmacellule CD19- CD56+ costituisce
il miglior singolo parametro discriminante tra MM e MGUS [655] [1655].

175
Mieloma multiplo (MM)

Le plasmacellule mielomatose tendono ad esprimono parametri fisici aumentati


rispetto a quelli delle plasmacellule normali, generando talora tipici cluster a forma di
cuneo, con la punta inserita tra linfociti e monociti, e la base addossata a fondo scala nel
citogramma FSC vs SSC.
Diversamente da quanto generalmente ritenuto, in una consistente percentuale di
casi le plasmacellule mielomatose esprimono immunoglobuline di superficie [1319], e
di regola sono intensamente positive per le immunoglobuline citoplasmatiche [1320]
[34] [1321]. Gli isotipi riscontrati secondo ordine di frequenza decrescente sono IgG, IgA,
sole catene leggere (mieloma micromolecolare), e IgD [1322]. Il mieloma IgE è
eccezionale [1323] [1324], e il mieloma IgM costituisce un’entità nosografica sottoposta
a discussione [1656]; sono noti mielomi multipli non secernenti [1657] [1658], e sono
eccezionalmente possibili mielomi che producono immunoglobuline strutturalmente
anomale, come nel caso dei mielomi emimolecolari che sintetizzano molecole
eterodimeriche composte dall’unione di una catena leggera con una catena pesante [1659]
[1660].
Le plasmacellule mielomatose sono contraddistinte da alcune caratteristiche che
possono essere utili nella distinzione con le plasmacellule normali; queste caratteristiche
consistono nella negatività per CD19 [643] [655] [656] [1661], in una espressione di
CD38 sempre vivace ma alquanto ridotta, e nella frequente positività per CD56 [1010]
[1011] [643] [655]. Per quanto concerne l’espressione di CD19 e di CD56, è importante
notare che spesso non tutte le plasmacellule mielomatose sono positive per l’antigene, ma
che, tranne isolate eccezioni [657], nessuna plasmacellula mielomatosa sembra
presentare fenotipo CD19+ CD56- ([643] [1661], sicché l’esecuzione di un’analisi
multiparametrica condotta per parametri fisici ed espressione di
CD138/CD56/CD45/CD19 è in grado di fornire informazioni precise sulla natura delle
plasmacellule presenti in un dato comparto, e può essere usata nella monitorizzazione
della MGUS nel comparto midollare. Oltre al detto fenotipo

CD19- CD38+± CD45± CD138+,

le plasmacellule mielomatose possono coesprimere una serie di antigeni come CD14,


CD15, glicoforina-A, CD2, CD4, CD23, CD25, CD28 [1661], CD45R, CD71 [1654],
CD117 [1200] [655]. E’ stata segnalata anche l’espressione di CD30, CD43, CD45RA,
CD45R0, CD61 e CD68, nonché di altri antigeni non emopoietici, come CEA, vimentina,
citokeratina, EMA ed elastasi [817].
Altri marcatori espressi dalle plasmacellule trasformate e non dalle plasmacellule
normali sembrerebbero consistere nella glicoproteina p-170 della multidrug resistance
[1663], e nella catena alfa del recettore per l’interleuchina 6 (CD126) [1664].
Da un punto di vista prognostico, i mielomi multipli le cui plasmacellule
esprimono antigeni mielomonocitici sarebbero dotati di comportamento più aggressivo
[1654], e così pure i mielomi positivi per CD20 [690] [1654] e per CD45R0 [1662]. La
scomparsa di CD56 dalla superficie di cellule mielomatose precedentemente positive
sembra costituire un segnale precoce di tendenza alla leucemizzazione [1014].

176
Leucemia plasmacellulare (PCL)

Il fenotipo delle plasmacellule della leucemia a plasmacellule (PCL) sembra


differire alquanto da quello delle plasmacellule del mieloma multiplo; in particolare le
plasmacellule della leucemia plasmacellulare si differenziano da quelle di quest’ultimo in
funzione di una minor frequenza di casi positivi per CD9, CD20, CD56 e HLA-DR [405],
nonché per la mancata espressione di CD117 [405] e di CD31 [1665].

LINFOMA FOLLICOLARE (FL)

GENERALITÀ

Il linfoma follicolare (FL) consiste di una proliferazione di cellule del centro


follicolare, di solito una mistura di centrociti e di centroblasti, corrispondenti alle
“cleaved follicle center cells” e “non-cleaved follicle center cells” della classificazione di
Lukes e Collins [1445]. Il linfoma ha una struttura di tipo nodulare, di solito con
predominanza di centrociti. La percentuale di centroblasti e le dimensioni dei centrociti
costituiscono un fattore prognostico [32].
Il linfoma follicolare è uno dei linfomi più diffusi in Occidente, ed in alcune
casistiche rappresenta un quinto di tutti i casi di linfoma non Hodgkin [1666].

MORFOLOGIA E IMMUNOFENOTIPO

La leucemizzazione del linfoma follicolare (FL) è frequente, e generalmente


avviene in una percentuale variabile dal 10 [1667] al 33% dei casi [1668], anche se sono
note alcune casistiche giapponesi in cui la leucemizzazione è molto più frequente e
riguarda più della metà dei casi osservati [901]. In un numero ancor più elevato di casi è
possibile ritrovare cellule linfomatose in circolo, in assenza di una leucemizzazione vera
e propria [1669].
La morfologia delle cellule di linfoma follicolare circolanti nel periferico è
generalmente quella di piccoli linfociti caratterizzati da incisure nucleari, ma talora è
possibile evidenziare la coesistenza di elementi di piccole e grandi dimensioni, mentre in
altri casi ancora le cellule circolanti possono presentare una morfologia francamente
blastica [1667] [1670].
Il fenotipo atteso nel linfoma follicolare è:

CD5-, CD19+, CD10+, CD11c-, CD23-, CD43-, CD103-, CD138- [32] [34]
[485].

Le cellule del linfoma follicolare sono positive per gli antigeni B-associati CD19,
CD20 e CD22, per la catena alfa dell’antigene CD79, e ovviamente per l’antigene
FMC7 [397]. L’antigene CD20 è espresso in modo particolarmente brillante, in accordo
con il fatto che, in studi effettuati su sospensioni di linfonodo, le cellule del centro
germinativo esprimono l’antigene con intensità maggiore rispetto alle altre cellule B
linfonodali [381] [382].
Le cellule del linfoma follicolare esprimono intensamente immunoglobuline di
superficie, con preferenza per gli isotipi IgM e/o IgD. Con frequenza decrescente è
possibile anche l’espressione degli isotipi IgG e IgA [32]. Al contrario del linfoma
mantellare (MCL), che esprime preferibilmente catene leggere lambda, il linfoma del
centro follicolare esprime prevalentemente catene leggere kappa [1671] [1301].

177
L’espressione di CD2 è eccezionale ma possibile, ed è stata segnalata in due casi
isolati [106]. Le cellule del linfoma follicolare sono generalmente - ma non
obbligatoriamente! [397] [282] - negative per CD5 e CD43, e sono positive per CD10
[397], in accordo con il fatto che, in studi effettuati su sospensioni di linfonodo, le cellule
del centro germinativo intensamente positive per CD20 coesprimono anche CD10 [381]
[382]. La dimostrazione di CD10 svolge un ruolo molto importante nell’identificare una
linfocitosi periferica come leucemizzazione di linfoma follicolare, ma è spesso difficile
da effettuare. Nonostante alcuni Autori abbiano dimostrato l’espressione di CD10 nella
quasi totalità dei campioni analizzati [1672] [1673], nelle mani di altri la dimostrazione di
questo antigene appare assai meno costante, risultando positiva in una percentuale di casi
variabile da 40 a 80% a seconda delle casistiche [1674] [1675]. Questa discrepanza di
risultati può essere attribuita a una serie di fattori diversi, tra cui:
i) il fatto che l’espressione di CD10 può essere molto debole e difficile da
dimostrarsi [1673];
ii) il fatto che l’espressione di CD10 può non interessare in eguale misura
tutte le cellule neoplastiche, in quanto nelle aree interfollicolari dei
linfonodi affetti sono state documentate popolazioni di B linfociti
appartenenti al clone neoplastico ma distinguibili da questo per la
down-regolazione o assenza delle molecole CD10, CD38, e CD95 [1676];
iii) il fatto che non tutti gli anticorpi anti CD10 sembrano egualmente
efficienti nella dimostrazione dell’antigene sulle cellule del B linfocita
proveniente dal centro germinativo, sia esso normale che trasformato.
Per quanto concerne quest’ultimo punto, va rilevato che secondo alcuni Autori
l’evidenziazione dell’antigene CD10 nel linfoma follicolare sembrerebbe condizionata
all’impiego del MoAb HI10a coniugato con PE/CY5, e risulterebbe impossibile con l’uso
di altri antisieri coniugati con FITC [385]. L’espressione di CD10 riconosciuta da
HI10a-PE/CY5 sembrerebbe selettivamente associata alla presenza del riarrangiamento
bcl-2/JH, tanto da risultare positiva non solo nei casi di linfoma follicolare, ma anche nei
casi di linfoma diffuso a grandi cellule con traslocazione t(14;18) [385].
Nell’eventuale analisi di sospensioni linfonodali è molto importante la
valutazione dell’intensità di espressione. Esiste infatti evidenza in letteratura che la
valutazione di questo parametro permetta la diagnosi differenziale tra linfoma follicolare
e iperplasia follicolare (RFH, reactive follicular hyperplasia); e ciò in accordo al fatto che
nell’iperplasia follicolare la popolazione policlonale CD10 positiva esprimerebbe
l’antigene con una intensità costantemente e caratteristicamente più bassa di quella
evidenziabile sulle cellule linfomatose [381] [382].
Contrariamente alle cellule della leucemia a cellule capellute (HCL), quelle del
linfoma follicolare, sono generalmente positive per CD11a e negative per CD11c. Un
altro antigene generalmente considerato assente è l’antigene CD23, ma non va
dimenticato che in alcune casistiche di linfomi follicolari l’espressione di CD23 è stata
segnalata in una percentuale fino a un terzo dei casi osservati [728], sicché una linfocitosi
caratterizzata da positività per CD23 in assenza di CD5 e CD11c potrebbe essere
considerata compatibile con l’ipotesi di linfoma follicolare leucemizzato anche in
assenza di CD10, antigene considerato caratteristico di questa entità nosografica, ma in
realtà espresso in modo irregolare e incostante.
Alcune sottopopolazioni cellulari di casi altrimenti tipici di linfoma follicolare
sono in grado di esprimere CD30 [818]. L’antigene CD43 è negativo, e viene espresso
debolmente anche CD44, che risulta invece intensamente espresso più o meno
intensamente in tutti gli altri linfomi non-Hodgkin a basso grado [1677].
Le cellule del linfoma follicolare dimostrerebbero una spiccata reattività con
l’anticorpo MT2, rivolto verso un determinante CD45 ristretto (CD45R) alle isoforme

178
dal peso di 205 e 190 kD [974]; tale reattività non sarebbe presente sulle cellule del centro
germinativo normale [975].
Vi è inoltre evidenza in letteratura che gli elementi del linfoma follicolare siano
positivi per CD75 [1678], che per inciso non è generalmente espresso sulle cellule del
linfoma mantellare [974]. Dato tuttavia che tali studi vengono generalmente effettuati con
tecniche immunoistochimiche, è possibile che la diversità riguardi non tanto la presenza
di CD75 quanto il suo grado di espressione. Dato comunque che CD75 sembra
peculiarmente espresso sugli elementi del centro germinativo, il suo studio appare molto
interessante nella caratterizzazione di questo gruppo di linfomi.

OSSERVAZIONI SUL GENOTIPO

La grande maggioranza dei linfomi follicolari è caratterizzata dalla traslocazione


tra il cromosoma 14 e il cromosoma 18 [1679], che porta il gene codificante per bcl-2 in
prossimità di una sequenza “enhancer” del gene codificante per le immunoglobuline
[1680] [1681] [1682]. In conseguenza di ciò, nelle cellule dei linfomi follicolari è
possibile evidenziare anche con metodiche citometriche la presenza di elevati livelli di
bcl-2, una proteina regolatrice dei processi di morte cellulare programmata [1683] [1684].
E’ importante tuttavia osservare che è possibile evidenziare livelli elevati di proteina
bcl-2 anche in assenza della traslocazione t(14;18) [1685] [1686].

LINFOMA A CELLULE MANTELLARI (MCL)

GENERALITÀ

Il linfoma a cellule mantellari (MCL) è una entità nosografica costituita da una


proliferazione diffusa o nodulare di elementi derivati dal mantello del centro follicolare.
A causa della sua origine dal centro germinativo e delle sue caratteristiche maturative e
morfologiche “intermedie”, il linfoma a cellule mantellari è stato definito in passato
anche come linfoma centrocitico, linfoma linfocitico intermedio, e linfoma linfocitico a
differenziazione intermedia [1687] [1688]. Tutte queste definizioni rivestono solo valore
storico, e la denominazione di linfoma a cellule mantellari è ormai solidamente diffusa.
Il linfoma a cellule mantellari costituisce un’entità nosografica dal
comportamento alquanto aggressivo, che a seconda delle casistiche leucemizza in una
percentuale variabile dal 5-10 [400] al 30-40% dei casi [1689], con linfocitosi non molto
spiccate, contenute in genere entro i 20.000 linfociti per microlitro [400], producendo
quadri periferici molto simili a quelli della leucemia linfatica cronica, da cui deve essere
distinto. Per leucemizzazione si intende la comparsa di un conteggio di linfociti superiore
a 4000 elementi per microlitro [1690] [1691], ma anche in assenza di una
leucemizzazione evidente, nell’80% circa dei casi è possibile mettere in evidenza nel
sangue periferico piccole popolazioni di cellule linfomatose [1692].
Il linfoma a cellule mantellari può presentarsi anche come malattia a sede
intestinale, caratterizzata dalla formazione di numerosi polipi sessili nel lume, nel qual
caso prende il nome di poliposi intestinale maligna (MLP) [1693] [1694]; nonostante
l’apparente localizzazione, la malattia mantiene un andamento sistemico e coinvolge i
linfonodi tributari [1695]. E’ nota anche una presentazione primitivamente splenica, che
sembra comportare una migliore prognosi, e che è stata ipotizzata costituire una forma
separata della malattia [1696].
In un terzo dei casi il linfoma evolve verso una trasformazione istologica di tipo
blastoide [1697]; questo fenomeno può estrinsecarsi in una presentazione leucemica “de

179
novo” [1595]. E’ nota anche una variante leucemica a cellule nucleolate, capace di
mimare il quadro morfologico della leucemia prolinfocitica [1595] [1594] [1596].

IMMUNOFENOTIPO

Il fenotipo atteso nel linfoma a cellule mantellari è:

CD5+, CD19+, CD10-, CD11c-, CD23-, CD43+, CD103-, CD138- [32] [34]
[485].

Le cellule del linfoma a cellule mantellari sono generalmente positive per gli
antigeni B-associati CD19, CD20, CD22, e per le catena alfa e beta dell’antigene
CD79 [899] [1698]. Nel linfoma a cellule mantellari l’antigene CD20 è classicamente
espresso ad intensità maggiore di quella rilevabile sulle cellule della leucemia linfatica
cronica (B-CLL) [1699] [684], che costituisce la prima entità nosografica in diagnosi
differenziale. Esistono inoltre isolati report che ascrivono al linfoma mantellare una
ipo-espressione degli antigeni CD19 e CD22 [653].
Le cellule del linfoma a cellule mantellari sono intensamente positive per le
immunoglobuline di superficie, ed esprimono generalmente IgM, spesso associate a
IgD [32] [1325]. A differenza del linfoma del centro follicolare (FL), che esprime
preferenzialmente catene leggere kappa, il linfoma a cellule mantellari esprime
preferenzialmente catene leggere lambda [1671] [1301]. Va infine rilevato che,
analogamente al linfoma diffuso a grandi cellule (DLBCL), il linfoma a cellule mantellari
esprime nel 30% circa dei casi il segmento variabile V4-34 delle catene pesanti,
riconosciuto dal MoAb 9G4. Dato che tale segmento è espresso da non più del 6% dei B
linfociti normali, tale riscontro depone per un ruolo della specificità delle Ig nella
linfomagenesi [1700].
La distinzione tra linfoma a cellule mantellari (MCL) e leucemia linfatica cronica
(B-CLL), ostacolata dalla somiglianza morfologica degli elementi neoplastici, è
ulteriormente complicata dal fatto che ambedue le entità nosografiche condividono
l’espressione di CD5 [1699]. L’espressione di questo antigene è generalmente costante,
ma sono noti anche casi di MCL negativi per CD5 [1701] [263] [264]. L’espressione di
CD7 è eccezionale ma possibile, ed è stata segnalata in un caso isolato [106]; in due altri
casi è stata segnalata la coespressione di CD8, che sembra rivestire significato
prognostico negativo [336]. L’antigene CD10 è generalmente assente, ma può essere
espresso nella più aggressiva variante blastica, assieme agli antigeni CD25 e CD38 [399]
[899]. Le cellule del linfoma a cellule mantellari non esprimono CD11c e sono negative
per CD23. Dato che alla negatività di questo ultimo antigene viene attribuita una grande
importanza nella diagnosi differenziale con la B-CLL [719], è necessario ricordare che
sono stati tuttavia documentati isolati casi di MCL positivo per CD23 [721], e che talora
l’antigene CD23, lungi dall’essere completamente assente, viene debolmente espresso.
Sicché, proprio quando più sarebbe necessario come nel caso della distinzione tra MCL e
B-CLL atipica, la diagnosi differenziale basata sull’intensità di espressione di CD20 e
sulla presenza di CD23 diviene particolarmente difficile.
L’antigene CD27, frequentemente presente sulla superficie delle cellule delle
malattie linfoproliferative croniche della serie B, è espresso con particolare intensità dalle
cellule del linfoma a cellule mantellari [788]. Oltre a CD5, gli elementi del linfoma a
cellule mantellari condividono con quelli della B-CLL l’espressione di CD43 e CD44,
anche se sulle cellule di questo l’antigene CD44 è espresso a intensità maggiore [1701]. Il
linfoma mantellare si caratterizzerebbe infine per una vivace espressione di CD54 e per
l’assenza di CD62L [437], mentre CD75 sarebbe espresso a un’intensità più bassa di

180
quella rilevabile in altri linfomi come il linfoma a cellule monocitoidi (MBCL) e la
leucemia a cellule capellute (HCL) [1630]. La presenza dell’antigene CD138 è
controversa, in quanto è stata esclusa da alcuni Autori [1210], ma sarebbe stata dimostrata
da altri in una percentuale minoritaria di casi [1218].
La presentazione leucemica “de novo” della variante blastica è insolita ma
documentata, e pone importanti problemi di diagnosi differenziale con le leucemie dei
precursori B (B-ALL), con i linfomi a grandi cellule B (DLBCL) CD5+, e anche con la
leucemia a prolinfociti B (B-PLL), di cui può mimare la morfologia in casi eccezionali
[402]. Dalle predette entità il linfoma a cellule mantellari si differenzia per la frequente
iper-espressione della Ciclina D1, per la presenza della tipica traslocazione t(11;14), e per
la presenza di riarrangiamenti a carico del gene BCL-1 [402]; nella diagnosi differenziale
con le leucemie dei precursori B giocano un ruolo importante la costante negatività per
TdT e per CD34 [1702].
Una particolare varietà di linfoma mantellare è costituita dalla poliposi
linfomatosa maligna (MLP), caratterizzata dall’invasione linfomatosa multifocale del
tratto intestinale. È interessante notare che, diversamente dalla forma nodale del linfoma
mantellare, le cellule della poliposi linfomatosa maligna sarebbero positive per
l’integrina alfa4beta7 [1703].

CARATTERISTICHE DISTINTIVE TRA FL E MCL


TIPO MCL FL
Sig IgM, IgD IgM, IgG
catena leggera prevalente Lambda kappa
CD5 + -
CD10 - +/-
CD11a - +
CD23 - +/-
CD43 + -
CD75 - +
Cariotipo t(11;14)(q13;q32) t(14;18)(q32;q21)
Oncogene coinvolto bcl-1 bcl-2

OSSERVAZIONI SUL GENOTIPO

La grande maggioranza dei linfomi mantellari è caratterizzata dalla traslocazione


tra il cromosoma 11 e il cromosoma 14 [1699], che porta il gene bcl-1 in prossimità di una
sequenza “enhancer” del gene codificante per le immunoglobuline, determinando un
incremento della sintesi della ciclina D1, una proteina regolatrice del ciclo cellulare
[1704]. E’ stato osservato che, rispetto ai casi negativi, i casi di MCL positivi per la
ciclina D1 presentano cellule di dimensioni maggiori, un più elevato indice mitotico, una
maggiore frequenza di localizzazioni gastrointestinali, ed una sopravvivenza
significativamente peggiore. Questi dati suggeriscono che i gruppi di linfoma mantellare
rispettivamente positivi e negativi per la ciclina D1 rappresentino in realtà entità diverse,
e che probabilmente solo le forme positive costituiscano il linfoma mantellare vero e
proprio. Alla luce di questi assunti, è stato proposto di considerare la positività per la
ciclina D1 come criterio standard per la diagnosi di MCL [1705]. In tal senso
l’evidenziazione citometrica della ciclina D1 nel citoplasma delle cellule del linfoma
mantellare sarebbe estremamente importante, ma nonostante essa sia possibile [1698], è
resa problematica da una serie di difficoltà pratiche, tra le quali particolarmente

181
importante sembra il basso segnale che rende difficile la discriminazione tra elementi
negativi ed elementi sicuramente positivi.

LINFOMA DIFFUSO A GRANDI CELLULE B (DLBCL)

GENERALITÀ

La definizione “linfoma diffuso a grandi cellule B” (DLBCL) individua un gruppo


di linfomi eterogeneo e suscettibile di futuri rimaneggiamenti. Questa definizione
comprende in pratica tutti i linfomi B a crescita diffusa non altrimenti classificati le cui
cellule condividano peculiari caratteristiche morfologiche, ovvero grande taglia, nuclei
vescicolari con nucleoli prominenti, e citoplasma basofilo [32].
La classificazione WHO accoglie tra i DLBCL le entità nosografiche
precedentemente note come i) linfoma centroblastico, ii) linfoma immunoblastico, iii)
linfoma anaplastico B a grandi cellule, iv) linfoma plasmablastico, e v) linfoma diffuso a
cellule B ricco di cellule T e/o istiociti (TCRBCL), nonché i sottotipi costituiti vi) dal
linfoma diffuso a grandi cellule B primitivo mediastinico, vii) dal linfoma intravascolare
(IVL), e viii) dal linfoma primitivo delle sierose, o “primary effusion lymphoma” (PEL)
[485].
Il linfoma diffuso a grandi cellule B è uno dei linfomi più diffusi in Occidente, ed
in alcune casistiche rappresenta un terzo di tutti i casi di linfoma non Hodgkin [1666].

IMMUNOFENOTIPO

I parametri fisici delle cellule dei linfomi diffusi a grandi cellule B possono essere
molto aumentati [1706]; di tale caratteristica va tenuto conto nell’analisi dei campioni, in
modo da non escludere in partenza dal gate di analisi gli elementi diagnosticamente
rilevanti. Questo assunto appare particolarmente vero nell’analisi citometrica del
cosiddetto linfoma diffuso a cellule B ricco di cellule T (TCRBCL), in cui la componente
B neoplastica con espressione monotipica delle catene leggere è selettivamente ristretta
agli elementi con parametri fisici compatibili con quelli dei mononucleati di grandi
dimensioni [1707].
Le cellule dei linfomi diffusi a grandi cellule B sono generalmente positive per gli
antigeni B-associati CD19, CD20 e CD79a [32] [485], ma esprimerebbero CD22 con
minore frequenza [707]. Le cellule dei linfomi diffusi a grandi cellule B possono essere
negative per CD45, possono esprimere immunoglobuline citoplasmatiche, ed esprimono
spesso immunoglobuline di membrana, con preferenziale espressione di IgM, e – in
ordine decrescente – di IgG e IgA [32] [485].
A questo proposito va rilevato che, analogamente al linfoma mantellare, il
linfoma diffuso a grandi cellule esprime nel 30% circa dei casi il segmento variabile
V4-34 delle catene pesanti, riconosciuto dal MoAb 9G4. Dato che tale segmento è
espresso da non più del 6% dei B linfociti normali, tale riscontro depone per un ruolo
della specificità delle Ig nella linfomagenesi [1700].
Non esistono al momento attuale chiare correlazioni tra particolari fenotipi e
varianti morfologiche o sottotipi, ancorché:
i) CD30 appaia spesso espresso sulle cellule della variante con tipica
morfologia anaplastica e su quelle del sottotipo mediastinico [815],
ii) CD138 sia associato alle variante plasmablastica [1708], e
iii) CD10 sia associata alla variante centroblastica [385] e alla presenza della
traslocazione t(14;18) [411].

182
Alcuni linfomi diffusi a grandi cellule B possono essere CD5+. Questi casi non
devono essere confusi con la variante blastica del linfoma mantellare (BVMCL), ed è
possibile che rappresentino una distinta entità clinico-patologica, non ancora riconosciuta
come autonoma, e caratterizzata da primitiva insorgenza splenica con diffuso
interessamento della polpa rossa [214]. L’antigene CD5 è spesso presente anche sulle
cellule del sottotipo intravascolare (IVL) [275] [276] [277]. Sono anche noti isolati casi di
DLBCL caratterizzati dall’espressione inaspettata dell’antigene CD2 [106], CD4 [214]
[106], CD7 [106], e CD8 [337] [338].
Il linfoma primitivo delle sierose (PEL) si differenzia dagli altri linfomi diffusi a
grandi cellule B sia per la presentazione che per il fenotipo. Sebbene infatti siano noti casi
con fenotipo compatibile con quello delle cellule B mature [1709], la maggior parte dei
casi è caratterizzata dall’assenza delle immunoglobuline di superficie o citoplasmatiche,
dalla negatività per i comuni antigeni B-associati, dalla isolata positività per CD138, e
dall’espressione degli antigeni di attivazione CD30, CD38, CD71 e HLA-DR [816]. E’
stato segnalato un caso caratterizzato dalla coespressione inaspettata di CD3
citoplasmatico [165].
La difficoltà nel distinguere dal punto di vista immunofenotipico le varie entità
che compongono il gruppo dei linfomi B diffusi a grandi cellule non costituisce
comunque un grave problema, dato che almeno per quanto concerne i linfomi
centroblastico ed immunoblastico la distinzione non comporterebbe differenze dal punto
di vista clinico e prognostico [1710].

OSSERVAZIONI SUL GENOTIPO

Rispetto all’immunofenotipo, il genotipo appare più efficiente nel distinguere tra


le differenti varianti di linfoma diffuso a grandi cellule [1711]. In particolare, la
traslocazione t(14;18) è tipica del linfoma centroblastico, mentre le delezioni del braccio
lungo dei cromosomi 8 e 14, unitamente alla perdita del cromosoma 10 e alle alterazioni
del braccio lungo del cromosoma 4, sono riscontrate nel linfoma immunoblastico. E’
interessante notare come la traslocazione t(14;18) si accompagni frequentemente
all’espressione di CD10 [411], il che suggerisce per questo antigene un ruolo come
marcatore di origine follicolare [1712]; la positività per CD10 appare in questi casi
particolarmente frequente quando l’antigene venga ricercato con il MoAb HI10
coniugato con PE-CY5 [385].

LINFOMA DI BURKITT / LEUCEMIA A CELLULE DI BURKITT (BL/B-ALL


L3)

Il linfoma di Burkitt esprime generalmente tutti gli antigeni B-associati, monta di


solito IgM di superficie, tende a montare catene leggere lambda [1326], esprime CD77
con particolare intensità [1713] [1714], risulterebbe costantemente negativo per CD1c
[19], e spesso esprime CD10 [1326] [406] [385]. In omaggio all’elevato stadio
maturativo della controparte non trasformata, la TdT è assente. In una piccola casistica di
soggetti affetti da linfoma leucemizzato è stata segnalata l’espressione di CD5 sulla
superficie degli elementi periferici [274].
Alcune caratteristiche che possono contribuire a differenziare questo linfoma
dagli altri linfomi a grandi cellule consistono:
i) in un più elevato tasso di proliferazione;
ii) in una maggior espressione di CD10;
iii) in una più bassa espressione di bcl-2;

183
iv) nell’assenza o ipo-espressione di una serie di molecole di adesione [440]
[1715] [438] [439].
In particolare le cellule del linfoma di Burkitt sono negative per CD11a [438]
[439], ma lo esprimono dopo attivazione con PMA [438]; il fatto che il difetto consista
nell’assenza del trascritto della subunità beta [438], molecola necessaria all’espressione
di tutti i dimeri alfa/beta [1716] [1717] [1718], è in accordo con il riscontro che le cellule
del linfoma di Burkitt non esprimono nemmeno CD11b o CD11c [440].
Il linfoma di Burkitt può leucemizzare, configurando così la B-ALL L3 della
classificazione FAB [1300]. Gli elementi neoplastici presentano una caratteristica
morfologia consistente in taglia media, nucleo nucleolato a cromatina lassa, e citoplasma
intensamente basofilo provvisto di numerosi vacuoli. In isolati casi il fenotipo delle
cellule della B-ALL L3 può allontanarsi da quello atteso, ed è stata riportata la presenza
di TdT, l’assenza di CD20, la persistenza delle catene mu intracitoplasmatiche, e la
mancata espressione delle catene leggere in membrana [1719], nonché l’assenza di
immunoglobuline, sia di membrana che intracitoplasmatiche [406].

LE LINFOCITOSI B POLICLONALI

LINFOCITOSI POLICLONALE PERSISTENTE A B LINFOCITI (PLBL)

La linfocitosi policlonale persistente a B linfociti (PLBL) è una rara entità


nosografica ad etiologia e patogenesi sconosciute, che interessa di regola giovani soggetti
fumatori di sesso femminile, ed è caratterizzata dalla comparsa di linfocitosi persistente.
La sindrome è caratterizzata da altre peculiarità, come la presenza di
ipergammaglobulinemia policlonale di tipo IgM e l’espressione dell’aplotipo HLA-DR7,
ed è in genere asintomatica e accompagnata da obiettività negativa, anche se sono stati
talora riferiti in letteratura la presenza di lieve splenomegalia, la presenza di lieve
trombocitopenia, e il riscontro di noduli linfoidi alla biopsia ossea [1720] [1721] [1722]
[1723] [1724] [1725] [1726] [1727].
Il quadro morfologico della linfocitosi policlonale persistente a B linfociti è
caratterizzato dalla presenza di una quota variabile di linfociti binucleati [1728]; per il
resto la morfologia dei linfociti è indistinguibile da quella dei linfociti normali, anche se
in alcuni casi può essere messa in evidenza la presenza di elementi “capelluti” [1729].
La linfocitosi policlonale persistente a B linfociti è sostenuta da un’espansione
rigorosamente policlonale di cellule B mature, caratterizzate da fenotipo CD5-, CD10-,
CD22+ (talora riferito come “espresso debolmente” [1723]), CD25-, CD37+, FMC7-
[671], CD27+, IgD+ [789].
Osservazioni personali su cinque casi hanno permesso inoltre di rilevare il
seguente fenotipo: CD11c assente o espresso a bassa intensità su di una minoranza di
elementi, CD20 espresso ad elevata intensità, CD23-, CD43- e CD103-.
Della linfocitosi policlonale persistente a B linfociti è nota anche una variante
giapponese, detta HBLD o “hairy B-cell lymphoproliferative disorder”, caratterizzata da
linfociti atipici dotati di morfologia capelluta molto simile a quella della leucemia a
cellule capellute (HCL), e accompagnata dalla presenza di ipergammaglobulinemia
policlonale di tipo IgG [1730] [1731]. Anche la cosiddetta variante giapponese è
sostenuta da un’espansione rigorosamente policlonale di cellule B mature, ma il fenotipo
è alquanto diverso, ed è caratterizzato dalla presenza di immunoglobuline di superficie di
classe IgG e dalla coespressione di CD11c. Il fenotipo più frequentemente riportato nella
variante giapponese è CD5-, CD11c+, CD22+, CD24-, CD25- [1731]. Questa sindrome è
stata descritta anche in un soggetto non fumatore di sesso maschile [1732].

184
LINFOCITOSI POLICLONALE PERSISTENTE A B LINFOCITI CD5+

Oltre alla linfocitosi policlonale persistente a B linfociti, generalmente negativa


per l’antigene CD5, sono noti anche casi di linfocitosi policlonale persistente
caratterizzata dall’espressione di questo marcatore [1733] [1734]. Grande cura deve
essere posta nel differenziare questa linfocitosi policlonale dalla eccezionale ma
segnalata B-CLL biclonale [1583], in cui l’analisi dei geni codificanti per le
immunoglobuline dimostra che la contemporanea presenza di due popolazioni di B
linfociti positive in modo mutuamente esclusivo per le diverse catene leggere non è prova
di policlonalità, ma è bensì dovuta alla convivenza di due diverse popolazioni di B
linfociti neoplastici, il primo ristretto per catene leggere kappa e il secondo ristretto per
catene leggere lambda.

185
L’IMMUNOFENOTIPO NELLE NEOPLASIE DELLE CELLULE T E NK
MATURE

GENERALITÀ

La diagnosi immunofenotipica delle neoplasie delle cellule T e NK mature è resa


difficile da una serie di fattori tra cui non ultima la relativa rarità di queste forme, che
impedisce la costruzione di casistiche omogenee e spesso obbliga ad una collezione di
casi aneddotici.
Questa situazione già sfavorevole è aggravata dal fatto che in queste entità
nosografiche la dimostrazione citometrica della clonalità è particolarmente difficile e
comunque non conclusiva. Tutte queste condizioni fanno sì che, diversamente dalle
neoplasie delle cellule B mature, l’approccio citometrico sia finalizzato non tanto alla
dimostrazione della clonalità della popolazione in esame, quanto alla evidenziazione di
fenotipi che per la loro “irregolarità” siano compatibili con il sospetto diagnostico.

DIMOSTRAZIONE DI POPOLAZIONI CLONALI

Come anticipato, la dimostrazione citometrica della clonalità di una popolazione


T è difficile e non conclusiva. Tale difficoltà risiede nel fatto che, mentre una popolazione
clonale di B linfociti può essere ristretta o per catene leggere kappa o per catene leggere
lambda, una popolazione clonale di T linfociti è ristretta per una regione variabile scelta
tra diverse decine di regioni possibili, alcune delle quali prive di un anticorpo specifico in
grado di riconoscerle. Va anche ricordato che l’eventuale dimostrazione citometrica della
restrizione per una regione variabile del TCR non prova necessariamente la clonalità
della popolazione ristretta, in quanto per definizione una stimolazione superantigenica è
in grado di arruolare T linfociti diversi accomunati dall’espressione della medesima
regione variabile. Per tutti questi motivi, la diretta dimostrazione di popolazioni clonali
appartenenti alla linea T linfocitaria esula di regola la capacità delle tecniche citometriche,
e può essere vantaggiosamente effettuata con tecniche di biologia molecolare [1735].
Nonostante tutte queste riserve, la dimostrazione citometrica di una popolazione
di T linfociti ristretta per una determinata regione del TCR costituisce una prova
indiziaria di grandissimo valore, soprattutto se riferita specificatamente ad una
sottopopolazione cellulare caratterizzata dall’espressione di un fenotipo “irregolare”
[1364]. Va infine osservato che, nella pratica, l’individuazione di popolazioni T
linfocitarie ristrette per specifiche regioni variabili è resa più frequente di quanto atteso
dal fatto che particolari entità nosografiche esprimono preferenzialmente determinate
regioni variabili [1390].
La difficoltà di dimostrare citometricamente la natura clonale di una popolazione
linfocitaria è ancora maggiore per le cellule NK, che non esprimono il TCR. Un certo
aiuto può comunque essere fornito dallo studio di alcuni antigeni costituenti una nuova
famiglia di molecole recettoriali caratteristiche delle cellule NK, la cui eventuale
omogeneità di espressione sostanzia fortemente il sospetto di clonalità [1736] [1737]
[1738].

186
DIMOSTRAZIONE DI FENOTIPI “IRREGOLARI”

Una possibile caratteristica delle neoplasie dei T linfociti maturi consiste nella
presentazione di un corredo di antigeni T-associati qualitativamente o quantitativamente
diverso da quello normalmente atteso sulle cellule T mature non neoplastiche [107] [44]
[45] [1739] [1740] [46] [47] [69]. Questo fenotipo “irregolare” è molto frequente, e a
seconda della sensibilità delle tecniche citometriche usate per evidenziarlo può arrivare a
interessare fino a più del 90% dei casi indagati [69]. E’ comunque importantissimo
sottolineare il concetto che, in particolari situazioni, è possibile evidenziare popolazioni
espanse di T linfociti dotate di fenotipo “irregolare” non per questo necessariamente
neoplastiche, ma piuttosto interpretabili come popolazioni normali modulate nel corso
della risposta immunitaria [69]. Sarà quindi l’esperienza dell’operatore e la collazione di
tutti gli altri dati clinico-laboratoristici disponibili a permettere la corretta interpretazione
del singolo caso in analisi. Non va poi dimenticato che spesso i parametri fisici delle
cellule neoplastiche sono diversi da quelli dei T linfociti normali residui, e possono
contribuire a tracciare la popolazione patologica [46].
I fenotipi “irregolari” più frequentemente documentabili consistono:
1) nella mancata espressione di uno o più antigeni T-associati normalmente
presenti, o nella coespressione di antigeni T-associati normalmente non
coespressi in quello stadio maturativo (ad esempio coespressione di CD4 e
CD8) [1739] [1740] [47] [69];
2) nell’espressione dell’antigene CD1 [44] [45] [46] [47];
3) in anomalie nella modalità di espressione di uno o più antigeni T-associati
[69]. Tali anomalie possono essere sia di tipo “quantitativo” che di tipo
“qualitativo”. Le anomalie di tipo quantitativo consistono nella presenza
dell’antigene a un’intensità minore o maggiore di quella attesa sulle cellule T
mature normali, mentre le anomalie di tipo qualitativo riguardano la
distribuzione del parametro indagato nella popolazione analizzata. Da un
punto di vista citometrico le anomalie qualitative si possono estrinsecare in
istogrammi dotati di coefficienti di variazione particolarmente ristretti, che
riflettono un’anormale omogeneità tra gli elementi componenti la popolazione
indagata.
Alcuni fenotipi “irregolari” sono riscontrabili con maggiore frequenza, e meritano
una trattazione separata.

Espressione irregolare di CD2

Sebbene sia comunemente ritenuto che tutti i linfociti CD3 coesprimano


invariabilmente CD2, nell’uomo è stata segnalata, a frequenze inferiori all’1% di tutti i
linfociti circolanti, l’esistenza di popolazioni di linfociti CD3+ CD2- caratterizzate sia
dall’espressione di TCR a catene alfa/beta [64] che dall’espressione di TCR a catene
gamma/delta [65].
Per quanto concerne le anomalie di espressione di CD2 nelle neoplasie delle
cellule T mature, va ricordato che una percentuale di linfomi T periferici variabile dal 15
al 28% dei casi dimostra irregolarità nell’espressione di questo antigene [107] [213] [45]
[346] [349] [69].

187
Espressione irregolare di CD5

L’antigene CD5 è espresso sulla quasi totalità dei linfociti CD3+ ma non su tutti,
in quanto non solo i T linfociti con TCR gamma/delta possono non esprimere l’antigene
[243] [244], ma anche il 5% circa dei T linfociti CD3+ con TCR alfa/beta non esprime
CD5 nei soggetti normali [245].
Per quanto concerne le anomalie di espressione di CD5 nelle neoplasie delle
cellule T mature, va ricordato che una percentuale di linfomi T periferici variabile dal 5 al
46% dei casi dimostra irregolarità nell’espressione di questo antigene [107] [1741] [213]
[45] [346] [349] [69].

Espressione irregolare di CD7

L’antigene CD7 è fisiologicamente assente in un’importante sottopopolazione di


T linfociti normali [292]. La mancata espressione di CD7 sembra correlare con
l’attivazione; le cellule CD3+ CD7- aumentano con l’età dell’individuo, esprimono
preferenzialmente fenotipo CD4+, CD45RA-, CD45R0+, e possono essere espanse in
una serie di situazioni contraddistinte da attivazione cronica del sistema immunitario,
come l’artrite reumatoide, il trapianto renale, e l’infezione da HIV [293] [291] [292]. Le
cellule CD3+, CD4+, CD7- presenti nell’infezione da HIV, come pure quelle dei soggetti
normali, sono caratterizzate da un pattern di produzione di citokine del tipo Th0/Th2
[1742].
Per quanto concerne le anomalie di espressione di CD7 nelle neoplasie delle
cellule T mature, va ricordato che una percentuale di linfomi T periferici variabile dal 45
al 64% dei casi dimostra irregolarità nell’espressione di questo antigene [107] [213] [45]
[69]. Grande cautela deve quindi essere applicata nel definire “irregolare” l’espressione
di un antigene fisiologicamente modulato sui T linfociti normali.

Il fenotipo CD3+ CD4+ CD8+

La coespressione di CD4 e CD8 costituisce un evento atteso sui timociti comuni,


ma sui T linfociti periferici normali rappresenta un reperto di riscontro abbastanza
infrequente, nonostante esista evidenza che in particolari situazioni cellule CD4 positive
normali siano in grado di coesprimere CD8. E’ stato infatti segnalato che l’interleukina 4
è in grado di indurre l’espressione di CD8 sulla superficie di cloni T umani CD4+ [1743]
[1744], che l’attivazione con PHA ne induce l’espressione sui T linfociti periferici CD4+
[1745] [190], e che l’attivazione con concanavalina può indurne la comparsa su T
linfociti periferici CD4+ sia nell’uomo [1746] che nel ratto [1747]. Esiste anche evidenza
del fenomeno opposto, ovvero del fatto che in particolari situazioni cellule CD8+ sono in
grado di coesprimere CD4. E’ questo il caso dell’attivazione con PHA [190] e
dell’infezione da HIV; in quest’ultimo caso i linfociti CD8 attivati che esprimono CD4
“de novo” possono divenire suscettibili all’infezione con il virus [189]. I linfociti maturi
periferici con fenotipo CD3+, CD4+, CD8+ montano TCR con catene alfa/beta, ed
esprimono generalmente fenotipo CD1a-, CD2+, CD3+, CD5+, CD6+, CD7-, CD11b-,
CD16-, CD38-, CD56+, CD57+, WT31+. Questi elementi si possono riscontrare in
situazioni caratterizzate da profonde sollecitazioni del sistema immunitario, quali il
rigetto di trapianto renale [1748] [1749], l'
artrite reumatoide giovanile [1750], la lebbra
lepromatosa [1751], la miastenia grave [1752], la sindrome di Behçet [1753], e la malattia
di Kawasaki [1754]. Non è chiaro se alcuni casi di popolazioni espanse di linfociti CD3+,
CD4+, CD8+, segnalate da alcuni autori in assenza di patologie concomitanti o in corso di
neoplasie sia solide che ematologiche [1755] [1756] [1757], debbano essere considerate

188
effetto di modulazione del sistema immunologico, o non piuttosto espansioni clonali dal
comportamento particolarmente indolente, come peraltro l’analisi del riarrangiamento
dei geni codificanti per il TCR indurrebbe a ritenere. Linfociti TCR alfa/beta+ CD4+
CD8alfa/alfa+ sono stati segnalati nella lamina propria dell’intestino tenue [319]. E’
interessante osservare che i linfociti CD3+, CD4+, CD8+ post-timici costituiscono una
importante sottopopolazione linfocitaria regolarmente presente nel sangue periferico del
maiale [1758] [1759], del macaco [1760], e della scimmia cynomolgus [1761].
Per quanto concerne l’evidenziazione del fenotipo CD4+ CD8+ nelle neoplasie
delle cellule T mature, va ricordato che questo fenotipo è stato segnalato nei T linfomi
cutanei (CTCL) [1762] [1739] [1763], nei linfomi T periferici (PTCL) [1764] [1739] [69],
nella leucemia prolinfocitica a cellule T (T-PLL) [1765] [1766] [1767] [344] [771]
nonché nella sua variante a piccole cellule [1768], nella leucemia/linfoma a cellule T
dell’adulto (ATLL) [1769] [218] [169], nel linfoma T primitivo dello stomaco [1770], nel
linfoma T intestinale associato a enteropatia (EATCL) [1771], nel linfoma anaplastico a
grandi cellule (ALCL) [1772], e in particolari casi di malattia linfoproliferativa dei
linfociti granulati (T-LDGL) [1773] [771] [225]. Nei linfomi T periferici (PTCL) la
coespressione di CD4 e CD8 può verificarsi secondo tre diversi pattern citometrici,
ovvero (in ordine decrescente di frequenza):
i) CD4bright+ CD8dim+,
ii) ii) CD4dim+ CD8bright+,
iii) iii) CD4bright+ CD8bright+ [69].
E’ interessante osservare che in una consistente percentuale di neoplasie delle
cellule T mature caratterizzate dalla coespressione degli antigeni CD4 e CD8, l’antigene
CD8 è stato documentato come omodimero alfa/alfa [352]. Non è illogico ritenere che,
almeno in alcuni casi, queste sindromi linfoproliferative traggano origine da linfociti
doppio-positivi confinati in determinati comparti e/o normalmente presenti nel sangue
periferico solo a bassissima frequenza.

Il fenotipo CD3+ CD4- CD8-

La contemporanea assenza di CD4 e di CD8 è una caratteristica attesa nei T


linfociti maturi con TCR a catene gamma/delta, ma può essere riscontrata anche nei T
linfociti maturi con TCR a catene alfa/beta. Questi elementi sono presenti a bassissima
frequenza nel periferico di soggetti normali [1774], costituiscono una consistente
frazione dei T linfociti normalmente residenti nell’epidermide [1775], e sono talora
aumentati in alcuni casi di lupus eritematoso sistemico [1776], di GVHD [1777], di
rigetto di organo [1777], di sindrome di Omenn [1778], di immunodeficienza combinata
[1779], e di sindrome ipereosinofila (HES), dove però sono spesso clonalmente ristretti e
configurano in realtà piccole popolazioni linfomatose capaci di arruolare gli eosinofili
mediante iperincrezione di Il-5 [1780]. La presenza di popolazioni espanse di linfociti
con TCR a catene alfa/beta e con fenotipo CD3+, CD4-, CD8- costituisce inoltre un
sintomo della sindrome linfoproliferativa autoimmune (ALPS) [1781] [1782]. Linfociti
con TCR a catene alfa/beta e con fenotipo CD3+, CD4-, CD8-, CD56+, CD94+, CD161+
sono stati riscontrati nel fegato umano adulto normale [986].
Per quanto concerne l’evidenziazione del fenotipo CD3+, CD4-, CD8- nelle
neoplasie delle cellule T mature, va ricordato che, prescindendo dalle forme con TCR a
catene gamma/delta in cui costituisce un reperto atteso [1783], la contemporanea assenza
degli antigeni CD4 e CD8 è stata segnalata in una percentuale di casi di linfoma cutaneo
(CTCL) [1739], in alcuni casi di linfoma T periferico (PTCL) [1739] [1784] [1763] [69]
[1785], in alcuni casi di leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL) [218] [1786]
[1787] [1788], in isolati casi di leucemia T a prolinfociti (T-PLL) [632], in alcuni casi di

189
linfoma intestinale a cellule T associato a enteropatia (EATCL) [1170] [1789], e in rari
casi di malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati (T-LDGL) [1790] [1791]. Non è
illogico ritenere che, almeno in alcuni casi, queste sindromi linfoproliferative traggano
origine da linfociti doppio-negativi confinati in determinati comparti e/o normalmente
presenti nel sangue periferico solo a bassissima frequenza [1789].

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA A T LINFOCITI (T-CLL)

GENERALITÀ

La leucemia linfatica cronica a cellule T (T-CLL) costituisce un’entità


nosografica elusiva e di difficile inquadramento. Questa sua indeterminatezza dipende sia
dalla rarità della sindrome, sia dal fatto che gran parte dei casi di T-CLL descritti in
passato possono essere sistematizzati separatamente come casi di malattia
linfoproliferativa dei linfociti granulati, mentre un’altra percentuale ancora può essere
reinterpretata come espressione leucemica di linfoma T periferico [1792]. Escludendo
quindi i casi a morfologia granulare, i casi di T-CLL “vera” sono di riscontro molto raro,
e raccolgono verosimilmente entità nosografiche diverse fra di loro anche da un punto di
vista morfologico. Sebbene infatti alcuni casi presentino una morfologia indistinguibile
da quella della B-CLL, con la popolazione diagnosticamente rilevante costituita da
piccoli linfociti con nucleo rotondo a cromatina fusa o addensata e scarso citoplasma
lievemente basofilo senza granuli azurofili, nella maggior parte dei casi la taglia è
generalmente maggiore di quella delle cellule della B-CLL, ed il nucleo è più irregolare e
spesso nucleolato.
Attualmente la T-CLL viene negata da alcuni Autori, e viene invece considerata
come variante a piccole cellule della leucemia T prolinfocitica (T-PLL) [1794]. Questa
classificazione riposa su argomenti di tipo clinico e biologico [1795], dato che sia la
leucemia T-PLL “classica” che la sua variante a piccole cellule, o T-CLL che dir si voglia,
dimostrano una notevole aggressività clinica, esprimono generalmente fenotipo CD3+,
CD4+, CD8-, e presentano spesso le medesime anomalie cromosomiche [1796].
Esistono comunque isolate opinioni discordanti, che postulano l’esistenza di una
T-CLL vera, distinta dalla T-PLL in base a considerazioni di ordine morfologico e clinico
[1797] [1798]. Queste opinioni si fondano su segnalazioni sporadiche di espansioni di
piccoli linfociti maturi non granulati e con nucleo privo di nucleolo, che talora presentano
fenotipo CD3+ CD4-, CD8+, e sono dotate di comportamento clinico indolente. E’ stata
anche postulata l’esistenza di una “T-CLL” CD8+ dotata di comportamento clinico
particolarmente aggressivo [343], in alcuni casi contraddistinta dall’espressione
intracitoplasmatica della proteina S-100 [1799].

190
LEUCEMIA T PROLINFOCITICA (T-PLL)

GENERALITÀ

Come già anticipato nel paragrafo precedente, vi è generale consenso nell’usare la


dizione “leucemia T prolinfocitica” (T-PLL) per comprendere sia la forma “classica” che
la forma a piccole cellule precedentemente sistematizzata separatamente come T-CLL.
Gli elementi della forma classica ricordano molto da vicino quelli della B-PLL, con
dimensioni medio-grandi, scarso citoplasma basofilo e nucleo talora a contorno irregolare,
dotato di grande nucleolo vescicoloso centrale; gli elementi della variante a piccole
cellule sono di taglia più piccola e non presentano nucleolo, o lo presentano
sporadicamente e di piccole dimensioni [1767]. Esiste anche una variante detta “a cellule
di Sezary”, caratterizzata dalla presenza di cellule con nucleo convoluto. Questa variante
viene distinta dalla malattia di Sezary vera e propria per la presenza di alterazioni
cromosomiche caratteristiche della leucemia T prolinfocitica [1800] [1801]. Esiste infine
una isolata segnalazione di un caso di T-PLL con cellule circolanti di morfologia bizzarra,
definita “carrot-like” [1802].
La T-PLL costituisce un’entità nosografica clinicamente aggressiva,
caratterizzata dalla frequente presenza di epato-splenomegalia, linfoadenopatie, lesioni
cutanee ed elevata linfocitosi all’esordio [344] [1803] [310]; sono comunque segnalate
forme a esordio clinico più indolente [978]. La maggiore o minore aggressività non
sembra correlata alla morfologia degli elementi circolanti [345].

IMMUNOFENOTIPO

La T-PLL è negativa per TdT e CD1, è positiva per gli antigeni T-associati CD2,
CD3 e CD5, esprime TCR a catene alfa/beta, ed esprime vivacemente CD7, antigene che
spesso è assente o ipo-espresso sulle cellule di altre malattie linfoproliferative della serie
T, come ad esempio la leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL), o la micosi
fungoide/sindrome di Sézary (MF/SS) [310]. La T-PLL esprime in genere fenotipo CD4+,
ma sono stati riportati casi positivi per CD8 [341] [342] [343] [1767] [345], e anche casi
negativi [632] e positivi [1765] [1768] [1766] [1767] [344] [771] [769] per ambedue gli
antigeni. In una casistica composta da 78 pazienti, i casi CD4+ CD8- costituivano il 65%
del totale, mentre i casi CD4+ CD8+ e CD4- CD8+ costituivano rispettivamente il 21% e
il 13% [344]. In alcuni casi che coesprimevano CD4 e CD8 l’antigene CD8 è stato
identificato come dimero alfa/beta; conseguentemente a questo riscontro alcuni autori
hanno ipotizzato per questa entità nosografica una tarda origine timica [771].
L’espressione del fenotipo CD3+ CD4- CD8+ sembra associato alla presenza di nucleo a
contorni irregolari [1767]. E’ noto un caso altrimenti tipico che presentava fenotipo CD4-
CD8- ed esprimeva TCR a catene gamma/delta [1804].
Diversamente dai casi classici di leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL),
l’antigene CD25 è di regola negativo [767], [344], ma può essere sporadicamente
segnalato [769], e quando è presente correla con anormalità della banda 7q35 [1805]. La
ricerca intracitoplasmatica della proteina citotossica TIA-1 è generalmente negativa
[631].
E’ possibile il riscontro di fenotipi “irregolari”: sono stati segnalati casi di T-PLL
negativi per CD3 [1767] [1806], un caso in cui CD3 e TCR potevano essere messi in
evidenza solamente nel citoplasma [1807], un caso contraddistinto da una ridotta
espressione di CD2 [1808], un caso contraddistinto dall’assenza di CD5 [632], un caso
contraddistinto dalla mancata espressione di CD7 [311], e un caso positivo per CD8
caratterizzato dalla debole coespressione di CD20 [692]. Il fenotipo CD3- CD4+ sembra

191
associato alla variante a piccole cellule [1767]. Il caso con morfologia “carrot-like”
riportato da Chan nel 1988 presentava fenotipo CD2+, CD8+, CD56+, CD57+ [1802].
Per quanto concerne l’espressione delle isoforme di CD45, in genere la T-PLL
esprime l’isoforma a basso peso molecolare CD45R0, ma sono segnalati anche casi
CD45R0- CD45RA+; questo fenotipo sembra frequentemente associato con un
comportamento clinico inizialmente indolente [978].
La T-PLL è negativa per gli antigeni associati all’attività NK; sono noti tuttavia
casi contraddistinti dall'
espressione di CD16 [632], CD56 [632] [1802] e CD57 [1802].

MALATTIA LINFOPROLIFERATIVA DEI LINFOCITI GRANULATI (LDGL)

GENERALITÀ

La morfologia granulare è comune sia ad alcuni subset di T linfociti che ai


linfociti NK CD3- CD16+; di conseguenza la malattia linfoproliferativa dei linfociti
granulari (LDGL, dall’acronimo di “lymphoproliferative disease of granular
lymphocytes”, ma anche LGL, da “leukemia of granular lymphocytes”) può essere
distinta in LDGL a cellule T (T-LDGL) e in LDGL a cellule NK (NK-LDGL). La forma
negativa per CD3 è più rara e si verifica nel 15% dei casi [772].
Viene generalmente definita malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati, o
LDGL, una linfocitosi sostenuta da almeno 2000 linfociti granulati per mmc che persista
da oltre 6 mesi [1809]. Esistono comunque casi in cui questo criterio non è soddisfatto,
ma la diagnosi viene formulata egualmente sulla base dei dati clinici e della
evidenziazione di popolazioni di linfociti granulari ristrette per una regione variabile
della catena beta del TCR o per un recettore delle cellule NK [1737] [1738].
La malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati viene spesso riconosciuta
casualmente nel corso di accertamenti routinari, ed è generalmente caratterizzata da un
comportamento clinico particolarmente indolente e prolungato, arrivando talora a
configurare più una curiosità biologico-clinica che una vera e propria malattia. In alcuni
casi è tuttavia possibile evidenziare la presenza di anemia, neutropenia, trombocitopenia,
infezioni ricorrenti, sintomi sistemici e tendenza all’evolutività [1809] [1810] [772]
[1811]; è nota l’associazione con particolari quadri clinici come l’artrite reumatoide
[1812] [1810] e l’aplasia pura della serie rossa (PRCA) [1813] [1814] [1815]. In isolati
casi la malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati presenta caratteristiche di
notevole aggressività; questi casi riguardano generalmente soggetti asiatici affetti dalla
varietà a cellule NK [624]. In ossequio a queste caratteristiche cliniche è stato anche
proposto di dividere le malattie a linfociti granulari NK in “linfocitosi croniche a cellule
NK” e in più aggressivi “linfomi/leucemie a cellule NK” [768].
E’ verosimile che la malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati comprenda i
casi segnalati nella letteratura meno recente come “linfocitosi a cellule T8 con
neutropenia” o come “linfocitosi T gamma”, nonché la maggior parte se non la quasi
totalità dei casi precedentemente descritti di leucemia linfatica cronica T a cellule CD8.

192
MORFOLOGIA

L’elemento morfologico tipico della malattia linfoproliferativa dei linfociti


granulati è costituito da un mononucleato di taglia media o medio-piccola, con citoplasma
non esageratamente abbondante, e nucleo senza nucleolo con cromatina fusa o a zolle. La
caratteristica principale è la presenza di granuli, detti azurofili non tanto perché si
colorino di azzurro alle comuni colorazioni panottiche (dove assumono in realtà
colorazione rosso-brunastra), quanto perché legano il colorante Azur in modo specifico. I
granuli possono essere fini o grossolani, rari o numerosi. Nonostante l’eterogeneità dei
quadri dimostrabili e la presenza di segnalazioni aneddotiche, non sembra possibile
ricondurre uno specifico quadro morfologico a un determinato fenotipo.

IMMUNOFENOTIPO

T-LDGL

Le cellule granulari CD3+ comprendono sia linfociti con TCR a catene alfa/beta
che linfociti con TCR a catene gamma/delta. A loro volta i linfociti granulari con TCR a
catene alfa/beta possono esprimere sia fenotipo CD4+ CD8- [1816] che fenotipo CD4-
CD8+. Esiste anche normalmente nel comparto periferico una popolazione di linfociti
granulari con TCR a catene alfa/beta che coesprimono CD4 e CD8, e che sono
normalmente presenti a frequenze così basse da non essere evidenziabili. Tutti questi
subset, anche se con frequenza diversa, possono dare origine a popolazioni espanse di
linfociti granulari [455]. Di conseguenza, sono stati descritti tutti i seguenti fenotipi:
i) CD3+, TCR alfa/beta+, CD4-, CD8+ [1817] [625] [1818], che costituisce
il fenotipo più frequente [1819];
ii) CD3+, TCR alfa/beta+, CD4+, CD8- [455] [981] [1820] [224] [837];
iii) CD3+, TCR alfa/beta+, CD4+, CD8+ [981] [1821]. [223] [1818] [1820]
[352] [771] [225];
iv) CD3+, TCR alfa/beta+, CD4-, CD8-. [1790] [1822] [1820];
v) CD3+, TCR gamma/delta+, CD4-, CD8- o CD8dim+ [1823] [1790] [1822]
[1824] [1825].
Sono stati anche descritti due casi di LDGL che non esprimevano CD3, ma
dimostravano nel primo caso riarrangiamento dei geni codificanti per le catene gamma e
beta del [1826], e nel secondo riarrangiamento dei geni codificanti per la catena delta
[1827]. Per questi due casi è stata prospettata una derivazione da un precursore timico
precedente al riarrangiamento del gene codificante per TCR alfa [1826].
Le cellule della T-LDGL coesprimono generalmente CD2 e CD5, che però in casi
isolati possono mancare, o essere espressi a intensità più bassa di quella attesa [624] [286].
E’ interessante osservare che nella maggior parte delle forme CD3+ CD4+ l’antigene
CD7 può essere assente o espresso a intensità ridotta [286], ma dato che la distribuzione
dell’antigene CD7 nelle cellule normali è variabile [291], è possibile che tale fenomeno
sia riconducibile alla sua bassa espressione sulla corrispettiva controparte non
trasformata. L’antigene CD8 risulta generalmente costituito dall’eterodimero alfa/beta
[981], ma nelle forme che coesprimono CD4 è costituito dall’omodimero alfa/alfa [981]
[352] [771]. Sebbene le forme CD4+ CD8dim+ coesprimano frequentemente fenotipo
CD56+ [1821], le cellule della T-LDGL in genere coesprimono CD57 ma non CD56 [768]
[1828]. Ancorché questo assunto non sia verificato da tutte le casistiche, l’espressione
contemporanea di CD3, CD8 e CD56 assumerebbe cattivo significato prognostico [625],
e verosimilmente contribuisce a contraddistinguere all’interno delle T-LDGL un subset
di malattie più aggressive interpretabili come neoplasie delle cellule T “NK-like” [1019].

193
Le cellule della T-LDGL possono esprimere CD16, soprattutto qualora siano
sostenute da espansioni di T linfociti granulari con TCR a catene gamma/delta [1822];
l’espressione di CD16 è tuttavia variabile, e la sua dimostrazione risente presumibilmente
del MoAb adottato per evidenziarla [614] [615].
Le forme CD3+ con TCR a catene alfa/beta tendono ad esprimere
preferenzialmente le regioni variabili TCRBV 13.1, TCRBV 8, TCRBV 6 e TCRBV 5
[981] [1390], ma sono stati documentati con metodiche citometriche anche casi ristretti
per le regioni variabili TCRBV 2, TCRBV 3, TCRBV 4, TCRBV 9, TCRBV 12, TCRBV
16, e TCRBV 20 [1390], nonché un caso ristretto per TCRBV 7.1 [1829], e un altro
ancora costituito da una espansione di linfociti con TCR gamma/delta ristretto per la
regione variabile TCRGV 19 [1823]. In un caso eccezionale, è stata documentata sulle
cellule della stessa popolazione di linfociti neoplastici la contemporanea presenza di due
distinte e riarrangiate catene TCR alfa e di due distinte e riarrangiate catene TCR beta
[1385].
Nei casi in cui la popolazione espansa con fenotipo CD4+ CD8- conviva con una
popolazione minoritaria CD4+ CD8dim+, è talora possibile evidenziare l’espressione
della stessa regione variabile della catena beta del TCR sia sulla popolazione CD3+
CD4+ CD8- che sulla popolazione CD3+ CD4+ CD8dim+. In questi casi l’analisi del
riarrangiamento del gene codificante per la catena beta del TCR depone per l’ipotesi che
ambedue le sottopopolazioni appartengano allo stesso clone. E’ tuttavia eccezionalmente
possibile documentare l’esistenza di disordini dei linfociti granulati sostenuti dalla
presenza di due popolazioni clonali fenotipicamente e genotipicamente diverse [1830];
questa evenienza non è limitata alla malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati, ma è
sporadicamente dimostrabile in diverse sindromi linfoproliferative croniche. E’ stato
anche descritto un caso di T-LDGL contraddistinto da un esordio clinicamente aggressivo
e dalla presenza di una doppia popolazione, la prima circolante nel periferico con
fenotipo CD1a-, CD3-, cyCD3+, CD4-, CD8+, CD10-, CD11c+, CD16+, CD56-, CD57-,
HLA-DR+, e la seconda residente nel linfonodo con fenotipo CD1a+, CD3-, cyCD3+,
CD4+, CD8+, CD10+, CD11c-, CD16-, CD56-, CD57-, HLA-DR-, TdT+ [658]. La
configurazione del riarrangiamento del gene codificante per la catena gamma del TCR
deponeva per l’appartenenza delle due popolazioni al medesimo clone.
Gli elementi della T-LDGL sia a TCR alfa/beta che a TCR gamma/delta sono
generalmente negativi per la catena alfa del recettore per l’interleuchina 2 (CD25) [286],
ma esprimono la catena beta (CD122) almeno su di una minoranza di elementi [1831],
esprimono frequentemente HLA-DR [1832], sono generalmente positivi per la pgp
(proteina della multidrug resistance) [1819], e possono esprimere CD30 [822].
Sulla distribuzione delle isoforme di CD45 nella malattia linfoproliferativa dei
linfociti granulati T non esiste accordo in letteratura; mentre secondo alcuni Autori la
maggior parte dei casi sembra coesprimere le due isoforme CD45RA e CD45R0 con
possibile espressione isolata di CD45R0 [981], secondo altri il fenotipo CD45RA+
CD45R0- costituisce il fenotipo di più frequente riscontro [286].
Le cellule della T-LDGL coesprimono CD11b sulla membrana, e contengono
molecole citotossiche come TIA-1 [1833] [1825] [1834].

194
NK-LDGL

Le linfocitosi a cellule granulate negative per CD3 vengono generalmente


interpretate come espansioni di cellule NK mature, e prendono comunemente il nome di
NK-LDGL.
Le cellule della NK-LDGL coesprimono CD2 e CD7 ma non CD5 [287] [111];
anche l’antigene CD2 può essere assente [981] [112]. L’antigene CD8 può essere
presente, ma è espresso a bassa intensità, e risulta generalmente costituito
dall’omodimero alfa/alfa [981]. L’antigene CD16 è generalmente presente [1835] [984],
ma va sottolineato che il suo riscontro dipende fortemente dal MoAb usato per
evidenziarlo. Esiste infatti un report in letteratura secondo il quale su cinque casi di
LDGL positivi per il MoAb clone AB8.28, solo 3 reagivano con il clone GO22, e solo 2
con il clone B73.1 [614].
Gli antigeni CD56 e CD57 sono generalmente presenti. In alcune casistiche
l’assenza di CD57 viene associata a cattiva prognosi; questa segnalazione è in accordo
con le indicazioni di altre casistiche di Autori giapponesi, secondo le quali l’espressione
di CD56 non accompagnata dall’espressione di CD16 e di CD57 predice un evoluzione
clinica aggressiva [1813].
Gli elementi della NK-LDGL sono generalmente negativi per la catena alfa del
recettore per l’interleuchina 2 (CD25), ma esprimono la catena beta (CD122) almeno su
di una minoranza di elementi [1831] [981], possono esprimere HLA-DR [1836] [1244]
[1245] [1246] e CD30 [822], e sono generalmente positivi per CD94 e CD161 [984].
Per quanto concerne la distribuzione delle isoforme di CD45, in alcuni casi di
malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati NK è stata segnalata l’espressione
dell’isoforma CD45R0 [963].
Va infine ricordato che i linfociti clonali della malattia linfoproliferativa dei
linfociti granulati NK sono contraddistinti da un pattern omogeneo di espressione dei
recettori NK per le molecole HLA di classe I [1736] [1737] [1738].

ANTIGENI O COMBINAZIONI DI ANTIGENI


PIÙ FREQUENTEMENTE RISCONTRATI NELLA LDGL
T-LGL NK-LGL
CD3 100 % 0%
TCR alfa/beta 85-90 % 0%
TCR gamma/delta 10-15 % 0%
+
CD4 CD8 - Raramente 0%
CD4+ CD8+ 10-15 % raramente
CD4- CD8+ 75-85 % 20-30 %
CD4- CD8- Raramente 70-80 %
CD16 10-50 % * 75-85 % *
CD56 15-25 % 80-90 %
CD57 70-85 % 50-60 %
HLA-DR 30-40 % maggioranza
*) a seconda del MoAb usato.

195
LINFOMA/LEUCEMIA A CELLULE T DELL'ADULTO (ATLL)

GENERALITÀ

Il linfoma/leucemia a cellule T dell’adulto (ATLL) è una neoplasia frequente nel


Giappone sud-occidentale, nell’area caraibica, nell’Africa occidentale e nel sud-est degli
Stati Uniti, ma è sporadicamente segnalata anche in altre aree [1837] [1838] [1839]
[1840].
Questa entità nosografica è dotata di peculiari caratteristiche clinico-biologiche.
Clinicamente la malattia può essere “acuta”, cioè leucemica ed aggressiva con lesioni
ossee di tipo litico, elevata leucocitosi, ipercalcemia, e rash cutanei, oppure “cronica”,
cioè prevalentemente linfomatosa senza leucemizzazione, oppure addirittura smoldering
[1841].
I casi giapponesi sono regolarmente associati al retrovirus linfotropo HTLV-1, il
cui genoma è evidenziabile nelle cellule neoplastiche, dove è integrato clonalmente; non
mancano tuttavia eccezionali segnalazioni di casi non correlati al virus [1842]. Nei casi
sporadicamente evidenziabili in Occidente l’associazione con HTLV-I è di solito non
dimostrabile.

MORFOLOGIA E IMMUNOFENOTIPO

La cellula diagnosticamente rilevante presenta una morfologia tipica, con


dimensioni medio-grandi, nucleo di forma irregolare (a fiore, o a trifoglio), e citoplasma
basofilo. Va ricordato a questo riguardo che la morfologia multilobata non è
esclusivamente ristretta alla ATLL, ma può anche sporadicamente essere riscontrata nei
linfomi T periferici [1843] e nelle sindromi linfoproliferative croniche B [1844] [1845], e
che per contro sono stati eccezionalmente segnalati casi di ATLL altrimenti classici
caratterizzati da una morfologia Burkitt-like [1846].
Il fenotipo della forma classica è abbastanza caratteristico ancorché eterogeneo.
Le cellule neoplastiche sono positive per gli antigeni T-associati CD2, CD3, CD4 e CD5,
sono usualmente negative per CD7 e CD8, e sono quasi sempre positive per CD25, CD29,
CD38, e CD122 [1847] [1848] [765] [1849] [1850] [308] [218] [1851] [1840].
L’antigene CD3 è spesso espresso a intensità ridotta rispetto a quella attesa sui T linfociti
normali [1852] [167] [168], probabilmente per azione di fattori solubili non identificati
[1853], ma sono noti anche casi negativi per CD3 [1769] [1786] [771], casi positivi per
CD8 ma negativi per CD4 [218] [285] [1854], casi doppio-positivi per CD4 e CD8 [1769]
[218] [1855] [771], e casi derivati da linfociti CD4- CD8- [218] [285] [1787] [1788], a
volte positivi per la proteina S-100 [1787]. E’ noto un caso che presentava cellule CD3+
CD4+ nel periferico e cellule CD3+ CD8+ nel linfonodo; con il trascorrere del tempo le
cellule del comparto periferico passavano da un fenotipo CD3+, CD4+, CD8- a un
fenotipo CD3+, CD4-, CD8- [1856].
La down-regolazione di CD3 sembra assumere un significato prognostico
negativo [1786]. Nei casi coesprimenti sia CD4 che CD8, l’antigene CD8 è stato
segnalato sia come eterodimero alfa/beta [1855] che come omodimero alfa/alfa [771].
L’omodimero alfa/alfa può essere espresso sia a bassa che ad alta intensità [771], il che da
un punto di vista citometrico costituisce un’interessante caratteristica, in quanto il
fenotipo CD8+ alfa/alfa “bright” non si riscontra mai sui linfociti periferici normali. Un
isolato caso giapponese non correlato a HTLV-I presentava fenotipo CD7+, CD5+,
CD2+, CD3+, WT31-, TCRdelta1-, CD4-, CD8-, CD25-, e cariotipo 5q-, t(12;18) [1842].
Sono stati anche segnalati:

196
i) un caso con fenotipo CD3- CD4- CD8- che mimava il quadro istologico di
un linfoma anaplastico a grandi cellule CD30 positivo [1857], e
ii) ii) un caso “smoldering” che all’esordio manifestava fenotipo CD3+,
CD4+, CD8+, ma che dopo breve tempo si convertiva al fenotipo CD3-,
CD4+, CD8- [169].
Per quanto concerne l’espressione delle regioni variabili del TCR, è stato
riportato che le cellule linfonodali delle forme incipienti o franche di ATLL, ma non
quelle della linfoadenite associata a HTLV-I, tendono a esprimere preferenzialmente
TCRAV2 [1393].
Per quanto concerne gli antigeni di attivazione, le cellule dell’ATLL esprimono
HLA-DR, CD25, CD38, e CD71; è stato riferito che l’espressione di CD38 e CD71 è più
elevata sulle forme aggressive o “acute”, mentre sulle forme più miti o “croniche” è
elevata l’espressione di HLA-DR [766]. Le cellule della ATLL esprimono intensamente
CD95, la cui presenza appare inversamente correlata con quella di CD26 [1858]. E’ noto
almeno un caso di ATLL positiva per CD56 [1025], ed è stato riportato un caso
controverso di T-NHL CD30+ morfologicamente inquadrabile come ALCL ma
interpretato come ATLL a causa dell’integrazione del DNA provirale del virus HTLV-I
[823].
Nella leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto le isoforme di CD45 possono
comportarsi in modo diverso anche nel contesto dello stesso paziente. E’ stato infatti
segnalato che l’isoforma CD45RA sembra espressa dalle cellule neoplastiche nel sangue
periferico e nei linfonodi, mentre l’espressione di CD45R0 sembra tipica delle cellule
infiltranti le lesioni cutanee [979]; secondo altri Autori un’espressione di CD45R0 a
bassa intensità sembra connotare le cellule CD4 non infettate dal virus HTLV-I, e può
essere considerata un marker di resistenza dell’ospite all’infezione [980].

T LINFOMA INTESTINALE (EATCL)

GENERALITÀ

Il linfoma intestinale a cellule T (EATCL, enteropathy associated T cell


lymphoma) è un linfoma extranodale che trae origine dai T linfociti intraepiteliali
intestinali. Questo linfoma è stato denominato per qualche tempo “istiocitosi maligna
dell'
intestino” [1859], e può essere accompagnato da una importante sindrome
enteropatica [1860]. La sua leucemizzazione è eccezionale ma documentata.

MORFOLOGIA E IMMUNOFENOTIPO

Le cellule del T linfoma intestinale consistono in cellule mononucleate di taglia


medio-piccola con nucleo rotondo o lievemente irregolare (ad “arachide”), con cromatina
condensata, non nucleolato, e scarso citoplasma lievemente basofilo.
Il fenotipo è generalmente CD3+, CD4-, CD8- [1789], ma sono possibili anche
casi CD8 + [976], e casi che coesprimono sia CD4 che CD8 [1771]. Una caratteristica
distintiva ancorché non costante del linfoma intestinale è l’espressione di CD103 [1168]
[1169] [1171]; questa caratteristica, condivisa con la leucemia a cellule capellute, ne
facilita grandemente l’individuazione [1163]. L’espressione degli antigeni T-associati è
spesso irregolare. La ricerca delle proteine citotossiche TIA-1 e granzyme è spesso
positiva [1861] [1862], ed è segnalata la positività per CD56 [1862] [1863]. E’
presumibile che almeno in una quota di casi questo linfoma derivi da cellule T
intraepiteliali citotossiche arrestate a diversi gradi di attivazione [1861].

197
T LINFOMA EPATOSPLENICO (HSTCL)

GENERALITÀ

Il linfoma epatosplenico (HSTCL, hepato-splenic T cell lymphoma) è una rara


neoplasia dei linfociti T citotossici caratterizzata clinicamente da comportamento
aggressivo, epato-splenomegalia, assenza o scarsità di linfoadenopatie superficiali, scarsa
infiltrazione midollare, e talora associazione con una sindrome emofagocitica [1864]
[1191] [1865]. Questo linfoma, che sembra prediligere i soggetti immunodepressi ed è
specialmente segnalato nei soggetti sottoposti a trapianto di rene [630] [1866], invade il
midollo osseo in circa due terzi dei casi ma leucemizza raramente [1832]. Nonostante la
sua scarsa propensione alla leucemizzazione, in circa il 25-50% dei casi è tuttavia
possibile evidenziare cellule neoplastiche nel sangue periferico [1832].

MORFOLOGIA E IMMUNOFENOTIPO

Gli elementi del linfoma epatosplenico non presentano caratteri morfologici tipici,
ed appaiono come cellule linfoidi di taglia media con nucleo rotondo o lievemente inciso,
cromatina condensata e un citoplasma delicatamente basofilo; sono state segnalate anche
cellule di taglia maggiore, con nucleo irregolare e nucleolato.
Al momento della sua definizione come entità nosografica separata [32], il
linfoma epatosplenico è stato considerato una neoplasia dei linfociti gamma/delta, ma
l’accumularsi delle segnalazioni ha permesso di evidenziare la presenza di un sottotipo
con TCR a catene alfa/beta [1867] [1868], che si differenzierebbe dal più frequente
sottotipo a catene gamma/delta per una preferenza per il sesso femminile e per le età
estreme [1869].
Il fenotipo più frequentemente riferito appare essere CD2+, CD3+, CD5+, CD7+,
CD56+, CD4-, CD8-, CD16-, CD57-, ma è stata anche segnalata la negatività per CD5
[1864] e la positività per CD8 e CD26 [1870]. Tutti i casi di una casistica costituita da otto
pazienti erano positivi per la ricerca della proteina citotossica TIA-1, ma solo un caso
risultava positivo alla ricerca della perforina [628]. I casi con TCR a catene gamma/delta
sembrano preferenzialmente ristretti per TCRVD 1 [1391], che peraltro costituisce la
regione variabile più frequentemente usata dai T linfociti intraepiteliali con TCR
gamma/delta [1371].

T LINFOMA SOTTOCUTANEO PANNICULITICO (SPTCL)

GENERALITÀ

Il linfoma sottocutaneo panniculitico (SPTCL, subcutaneous panniculitis-like T


cell lymphoma) è un linfoma delle cellule T citotossiche caratterizzato da un
coinvolgimento primitivo del tessuto sottocutaneo, con un quadro mimante una
panniculite [1871] [1872]. Le segnalazioni sono sporadiche, ma è possibile che la
malattia comprenda entità nosografiche diverse, che per quanto accomunate dalla sede di
insorgenza si differenziano per prognosi e fenotipo. Accanto a forme indolenti e
suscettibili di guarigione spontanea sono note forme aggressive a rapida evoluzione,
spesso accompagnate da sindromi emofagocitiche [1873] [1874] [1875] e da
leucemizzazione [1876].

198
IMMUNOFENOTIPO

Il fenotipo più frequentemente riscontrato nel linfoma sottocutaneo panniculitico


a cellule T è CD3+, CD4-, CD8+, TIA-1+, perforina+, TCR alfa/beta+ [1877] [1392], ma
sono noti anche casi CD3+, CD4-, CD8-, esprimenti TCR a catene gamma/delta e CD56
[1872] [1392] [1875], e casi negativi per CD3 di membrana e positivi per CD56,
interpretabili come espansioni di cellule NK [1878] [1876]. Gli elementi di uno dei casi
costituito da cellule NK presentavano immunoreattività con un anticorpo anti CD3
policlonale nella regione perinucleare e fenotipo CD43+, CD45+, CD45R0+, nonché
positività per le molecole citotossiche perforina, granzyme-B, e TIA-1 [1878], mentre
quelli di un altro caso presentavano fenotipo CD2+, CD3-, CD7+, CD8-, CD126+,
CD56+ [1876]. I casi con TCR a catene gamma/delta sembrano preferenzialmente
ristretti per TCRVD2 [1392] [1391], che peraltro costituisce la regione variabile più
frequentemente usata dai T linfociti con TCR gamma/delta presenti nella cute [1370].

MICOSI FUNGOIDE / SINDROME DI SÉZARY (MF/SS)

GENERALITÀ

La micosi fungoide (MF) è un linfoma cutaneo a T linfociti caratterizzato da


spiccato epidermotropismo, dalla presenza negli infiltrati di grandi cellule caratteristiche
a nucleo convoluto, dalla comparsa di tipiche lesioni istologiche note come ascessi di
Pautrier, e da una storia clinica particolarmente lunga e indolente, con un prolungato ed
esclusivo interessamento cutaneo culminante solo in fase terminale nella invasione dei
linfonodi, del midollo osseo e di altre strutture extranodali [1879].
La sindrome di Sézary (SS) è un linfoma cutaneo a T linfociti caratterizzato da
lesioni cutanee simili a quelle della micosi fungoide, nonché da linfoadenopatie, e dalla
comparsa nel sangue periferico di caratteristiche cellule dotate di nucleo cerebriforme
[1879].
In base alle peculiarità citate, la sindrome di Sézary viene comunemente
considerata come la variante leucemica della micosi fungoide. In questo senso micosi
fungoide e sindrome di Sézary costituiscono due entità nosografiche fortemente correlate,
e per alcuni Autori configurano aspetti diversi della stessa malattia, ancorché altri Autori
usino indifferentemente il termine “sindrome di Sézary” come sinonimo di
leucemizzazione di T linfoma cutaneo [1880]. Va comunque tenuto conto che proprio le
forme di sindrome di Sézary più eclatanti dal punto di vista ematologico vengono
considerate da altri Autori ancora non veri casi di sindrome di Sézary, ma piuttosto casi di
una variante di T-PLL detta “Sézary-like”. La T-PLL “Sézary like” si distingue dalla
malattia di Sézary vera e propria per la presenza di alterazioni cromosomiche
caratteristiche della leucemia T prolinfocitica, per il ridotto o assente interessamento
cutaneo all’esordio, per un tropismo cutaneo riguardante principalmente il derma e come
tale diverso dall’epidermotropismo della MF/SS, e per la vivace espressione
dell’antigene CD7 [1800] [1801].
Va comunque ricordato che la morfologia cerebriforme non è esclusivamente
ristretta alla MF/SS o alla T-PLL “Sézary-like”, ma può anche sporadicamente essere
riscontrata nelle sindromi linfoproliferative croniche B [1881] [1882]. A titolo di
curiosità va infine rilevato che nei citometri ematologici Bayer del tipo Advia e del tipo
H1/H2/H3 le cellule convolute danno origine a un tipico cluster nel box dei basofili.
Questo comportamento è dovuto al fatto che questi analizzatori ematologici sfruttano la
resistenza della membrana all’acido ftalico per differenziare i basofili dagli altri leucociti

199
presenti nel campione, e che la membrana delle cellule convolute resiste all’acido ftalico
in modo analogo a quella dei basofili.

IMMUNOFENOTIPO

Le cellule della MF/SS esprimono TCR a catene alfa/beta, sono positive per gli
antigeni T-associati CD2, CD3, CD4 e CD5, non esprimono CD25, esprimono l’isoforma
a basso peso molecolare di CD45 [976], e tendono a non esprimere l’antigene CD7.
Sebbene il fenotipo CD4+ CD7- sia considerato specifico per le cellule della MF/SS, è
bene ricordare che una quota di T linfociti normali presenti nel sangue midollare, nel
sangue periferico, nel linfonodo e nella cute non esprimono CD7 [293] [291] [1742] [292]
[69], e che di conseguenza il significato di popolazioni espanse di linfociti CD4+ CD7-
deve essere interpretato con grandissima cautela. Alla luce di questo assunto, grande
importanza è attribuita alla presenza di ulteriori anomalie di espressione a carico degli
altri antigeni T-associati. Questo concetto, che è valido per tutte le neoplasie delle cellule
T periferiche, assume particolarmente rilevanza nella MF/SS, in cui gli antigeni CD3 e
CD4 sembrano frequentemente espressi con un’intensità diversa da quella normalmente
presentata dai T linfociti periferici [140] [226] [166] [69].
Il fenotipo CD4+, CD7-, ancorché caratteristico, non è costantemente
rappresentato, in quanto in alcune casistiche fino a un terzo dei casi esprime CD7, e sono
stati segnalati isolati casi che esprimevano fenotipo CD4+, CD8+ [1762], e fenotipo
CD8+, CD4- [339] [340]. E’ anche noto un caso caratterizzato dalla coesistenza nel
sangue periferico di una popolazione di linfociti CD4+, CD8- e di una popolazione di
linfociti CD4-, CD8+ [1883]. Tutti questi dati vanno comunque considerati con prudenza,
per la possibilità che nelle vecchie casistiche di sindrome di Sézary siano compresi anche
casi di T-PLL “Sézary-like”, il che ben si accorderebbe con la mantenuta espressione
dell’antigene CD7.
Le cellule CD4+ CD7- esprimono CD15s, ma sono negative per CD26 [1884]
[220] e per CD49d [220].
Alcuni Autori riportano che una metà dei casi di linfoma cutaneo a cellule T
esprime l’antigene linfocitario cutaneo (CLA) riconosciuto dal MoAb HECA-452 [1885].
E’ stato anche segnalato che le cellule di alcuni casi di sindrome di Sézary possono
esprimere a bassa intensità l’antigene B-associato CD20 [140], o l’antigene CD103 [1156]
[1176], o anche l’antigene CD24 [746]; la positività per CD24 sarebbe ristretta ad alcuni
particolari epitopi, in quanto non tutti i MoAb anti-CD24 sarebbero in grado di rivelarla.
Recentemente ha suscitato particolare interesse lo studio dell’espressione dell’antigene
CD26, che sembra selettivamente assente sulle cellule della sindrome di Sézary [1886]
[1887] [1888] [1884]; una segnalazione sull’assenza di CD26 era già comparsa nel 1982,
in un lavoro che usava il MoAb 5/9 [1889]. Alcune indagini effettuate con tecniche
immunoistochimiche hanno evidenziato inoltre la frequente mancata espressione di
CD62L [1077].
Una caratteristica recentemente messa in evidenza consiste nella coespressione
dell’antigene CD40 e del suo ligando, l’antigene CD154. E’ stato ipotizzato che
l’interazione tra le due molecole costituisca un corto-circuito paracrino in grado di
impedire l’apoptosi e di condizionare lo homing cutaneo della popolazione neoplastica
[1890].
E’ infine noto anche un caso di MF con TCR a catene gamma/delta, che all’esame
immunoistochimico presentava fenotipo CD3+, CD25+, CD29+, CD45R0+, CD54+,
CD4-, CD8-, CD5-, CD7-, CD16-, CD30-, e CD57- [1891].

200
LINFOMI T PERIFERICI NON ALTRIMENTI SPECIFICATI (PTCLnos)

GENERALITÀ

La classificazione REAL riconosceva un paragrafo destinato ai “linfomi T


periferici non altrimenti specificati” (PTCLnos, peripheral T cell lymphomas not
otherwise specified), in cui venivano raccolti tutti i T linfomi periferici con caratteristiche
anatomo-cliniche non sufficientemente distinte da permetterne la configurazione come
entità nosografica separata [32].
Questo paragrafo è presente anche nella classificazione WHO, e raccoglie tutte le
neoplasie dei T linfociti maturi che non possono essere classificate come
i) leucemia cronica a linfociti/prolinfociti T (T-PLL),
ii) micosi fungoide o malattia di Sézary (MF/SS),
iii) linfoma a cellule T dell’intestino (EATCL), del fegato (HSTCL), e del
sottocutaneo (SPTCL),
iv) linfoma angioimmunoblastico (AITL),
v) linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL), e
vi) malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati T (T-LDGL) [485].
All’interno del gruppo dei linfomi T periferici sono comunque riconosciute
alcune varianti come i) il linfoma della zona T e ii) il linfoma linfoepitelioide di Lennert,
dotati di alcune peculiari caratteristiche istologiche che ne permettono la distinta
identificazione [1892].

IMMUNOFENOTIPO

La grande maggioranza dei linfomi T periferici esprime un fenotipo irregolare che


non riproduce quello normalmente evidenziabile sui T linfociti maturi [45] [46] [69], e
che può variare nello stesso paziente a seconda delle sedi in cui avviene il
campionamento [1893].
L’irregolarità del fenotipo può consistere:
i) nella completa assenza di un antigene T-associato [44] [45] [1739] [46];
ii) nella alterata entità di espressione di un antigene T-associato [46] [69];
iii) nella espressione di un fenotipo doppio negativo CD4- CD8- [45] [1739]
[349] [46];
iv) nella espressione di un fenotipo doppio positivo CD4+ CD8+ [108] [1764]
[45] [1739] [349] [46];
v) nella espressione di CD1 [44] [45] [46].
L’antigene T-associato più frequentemente assente è CD7, seguito da CD5, CD3 e
CD2 [107] [108] [46]. E’ molto frequente il riscontro di popolazioni CD3- CD4+ [44]
[213] [1894], che a una più approfondita analisi si rivelano cyCD3+, sCD3-, CD4+. A
volte l’antigene T-associato non è completamente assente, ma è espresso a intensità molto
bassa (popolazioni CD3dim+ e CD5dim+), con conseguente comparsa di istogrammi di
forma inaspettata all’analisi citometrica. Questo comportamento è tipico di tutte le
neoplasie delle cellule T mature, e costituisce una evenienza particolarmente utile, perché
permette di distinguere la popolazione patologica dalle cellule normali residue
eventualmente presenti, e consente di monitorarla nel tempo. Secondo alcuni Autori,
l’antigene T più frequentemente espresso in modo abnorme sarebbe l’antigene CD3,
seguito da CD7, CD5, e CD2 [69].
Prescindendo dai fenotipi aberranti, la maggior parte dei linfomi T periferici
esprime l’antigene CD4 [107] [108] [346] [347] [348] [349]; i PTCL CD8+ sono la
minoranza, e nella maggior parte dei casi sono positivi per le molecole citotossiche, che

201
invece tendono a essere negative nei linfomi T periferici CD4+, ad eccezione di alcuni
casi di linfoma di Lennert CD4+ [351]. La maggior parte dei linfomi T periferici monta
TCR a catene alfa/beta [1377] [1895] [1378] [1379].
L' espressione degli antigeni B-associati è negativa, ma è stato segnalato un isolato
caso positivo per la catena alfa di CD79 [697] e rari casi positivi per CD20 [691] [663]
[692] [694] [695] [696] [697] [693], interpretati come la trasformazione di una
controparte normalmente positiva per l' antigene CD20 espresso a bassa intensità [663].
L'espressione di CD45R0 è comune [976], ma sono noti anche casi CD45RA+ [1843].
L’antigene CD11c è espresso in circa un quarto dei casi, con particolare
preferenza per le forme a fenotipo CD4- CD8+ [492] [502].
La maggior parte dei casi esprime gli antigeni di attivazione CD25, CD38, CD71
e HLA-DR, che appaiono preferenzialmente espressi dalle forme ad alto grado [107] [108]
[770] [771] [349]. L’antigene CD30 è presente in circa il 50% dei casi con morfologia a
grandi cellule [1896], ma negli altri tipi è di solito sporadicamente espresso solo su di una
minoranza di elementi in una minoranza di casi [349] [1896].

LINFOMA T ANGIOIMMUNOBLASTICO (AITL)

GENERALITÀ

Il linfoma angioimmunoblastico (angioimmunoblastic T cell lymphoma, o AITL),


negato da alcuni Autori come entità autonoma [1897], è riconosciuto come distinta entità
nosografica sia dalla classificazione REAL [32] che dalla classificazione WHO [485].
Il linfoma angioimmunoblastico è un linfoma aggressivo, caratterizzato da
sintomi sistemici, importante linfoadenopatia, ipergammaglobulinemia policlonale,
possibili lesioni cutanee e costante invasione del midollo osseo [1898] [1899].

IMMUNOFENOTIPO

Il fenotipo più frequentemente segnalato è il fenotipo CD4+ [219] [1900], con


tipica espressione di CD134 [1896]; nel periferico di soggetti affetti da questo linfoma
sono state ripetutamente segnalate popolazioni di linfociti con fenotipo CD3-, cyCD3+,
CD4+ [170]. Vi è evidenza in letteratura che le cellule del linfoma T
angioimmunoblastico, ma non quelle degli altri linfomi T periferici, siano in grado di
esprimere CD10 in più del 90% dei casi, anche nel periodo iniziale della malattia [417].
Se confermata, questa caratteristica ne permetterebbe una diagnosi differenziale accurata
e precoce. E’ stato descritto un caso caratterizzato da leucemizzazione e da espressione di
CD20 [693].

202
LINFOMA ANAPLASTICO (ALCL)

GENERALITÀ

Il linfoma anaplastico a grandi cellule (anaplastic large cell lymphoma, o ALCL) è


un linfoma costituito da elementi di grande taglia e di forma irregolare e spesso bizzarra,
con abbondante citoplasma e nucleo nucleolato.
L’ALCL può esordire come malattia sistemica, o come forma a primitiva
presentazione cutanea. La forma sistemica è un linfoma molto aggressivo, mentre la
forma primitivamente cutanea ha in genere un comportamento più mite, ed è
sistematizzata separatamente dalla classificazione REAL/WHO [1321]. Dell’ALCL
esistono alcune varianti morfologiche, tra cui una variante ricca di istiociti [1901], una
variante cosiddetta “a piccole cellule” [1902] [1903], e una ancor più rara variante a
piccole cellule con aspetti plasmacitoidi [1904]. L’invasione midollare è rara, e
comunque di difficile dimostrazione [1905] [1906], e la leucemizzazione costituisce un
evento eccezionale ma segnalato; quando si verifica è generalmente sostenuta dalla
variante “a piccole cellule” [1907] [1908] [532] [1909] [1910] [1911] [1912].

MORFOLOGIA E IMMUNOFENOTIPO

In caso di leucemizzazione, l’elemento caratteristico è generalmente costituito da


un linfocita di taglia medio-piccola con nucleo irregolare, accompagnato sporadicamente
da elementi più grandi.
La principale caratteristica fenotipica dell’ALCL consiste nell’espressione
dell’antigene CD30, e proprio la costante espressione di questo antigene, unitamente alla
presenza delle sue particolari caratteristiche morfologiche, ha permesso l’individuazione
di questo linfoma come entità nosografica autonoma [803]. Vanno comunque tenuti in
considerazione alcuni punti importanti:
i) l’espressione di CD30 non è ristretta a questo particolare linfoma, in
quanto può essere dimostrata anche sulle cellule della HCL variante [788],
sulle cellule della sindrome di Richter “Reed Sternberg-like” [583] [584],
sulle cellule di alcune varietà di linfoma diffuso a grandi cellule B
(DLBCL) [813] [816] [815] [814], in alcune sottopopolazioni cellulari di
casi altrimenti tipici di linfoma follicolare (FL) [818], nonché nei linfomi
non Hodgkin della serie T diversi dal linfoma anaplastico [802] [820], nei
linfomi cutanei a cellule T (CTCL) [821], sui linfociti della malattia
linfoproliferativa dei linfociti granulati sia a cellule T (T-LDGL) che a
cellule NK (NK-LDGL) [822], e sugli elementi della linfoadenopatia
indotta da carbamazepina [798];
ii) l’evidenziazione dell’espressione di CD30 è influenzata dalle metodiche
impiegate per dimostrarla, e in uno studio condotto su campioni bioptici
linfonodali ed extranodali, solamente il 60% dei linfomi anaplastici
positivi per CD30 all’analisi immunoistochimica risultava positivo anche
all’analisi citometrica [47];
iii) esiste evidenza che, nel corso della presentazione leucemica della variante
a piccole cellule, l’antigene CD30, pur espresso dalle cellule infiltranti il
midollo, sia selettivamente assente sulle cellule presenti nel sangue
periferico [1913].
Il linfoma anaplastico a grandi cellule costituisce un’entità eterogenea, la cui
controparte normale nella maggior parte dei casi consiste in un T linfocita citotossico, che
a seconda dell’evenienza può esprimere un TCR a catene gamma/delta o un TCR a catene

203
alfa/beta. In una minoranza di casi l’attribuzione di lineage è più incerta e gli antigeni
T-associati non sono rilevabili, oppure è evidenziabile un fenotipo equivoco compatibile
con una diagnosi di neoplasia delle cellule NK [1772]. Concordemente a quanto
premesso, nella maggioranza dei casi è possibile evidenziare la presenza di proteine
citotossiche come TIA-1 e perforina [1772], e circa nella metà dei casi la presenza del
TCR, con preferenziale espressione della forma a catene gamma/delta [1914].
L’espressione degli antigeni T-associati è variabile, con frequente assenza dell’antigene
CD5; la maggioranza dei casi esprime CD4, una minoranza esprime CD8, ma sono
possibili anche casi doppio positivi e doppio negativi, questi ultimi più frequenti [1772].
Le cellule dell’ALCL tendono a esprimere CD43 e l’antigene epiteliale delle membrane
(EMA) [1915] [1916], sono di solito - ma non sempre [947] - positive per CD45 e CD25
[1915], nella maggioranza dei casi sono negative per CD15 [1917], CD68, e lisozima [32],
in circa la metà dei casi esprimono i gruppi sanguigni H e Y riconosciuti dall’anticorpo
BNH9 [1918], e in un quinto dei casi coesprimono l’antigene CD56, associato a
significato prognostico negativo [1026]. In isolati casi esplorati con metodiche di tipo
immunoistochimico è stata segnalata la presenza dell’antigene CD20 [699]. La forma a
presentazione cutanea tende a essere negativa per le molecole citotossiche [1772], e tende
a esprimere l’antigene cutaneo linfocitario CLA riconosciuto dal monoclonale
HECA-452 [1919].
Una consistente percentuale di casi di ALCL leucemizzato sembra coesprimere
l’antigene CD13 [532] [533] [534], ed è anche possibile la coespressione di CD33,
almeno in una sottopopolazione delle cellule linfomatose (osservazione personale).

OSSERVAZIONI SUL GENOTIPO

La grande maggioranza dei linfomi anaplastici a grandi cellule è caratterizzata


dalla traslocazione tra il cromosoma 2 e il cromosoma 5 [1920] [1921] [1922], che mette
in relazione il gene per la nucleofosmina (NPM, codificata da una sequenza presente in
5q35) con il gene per una tirosina kinasi (Anaplastic Lymphoma Kinase o ALK,
recentemente clusterizzata come CD246 e codificata da una sequenza presente in 2p23),
producendo così un gene di fusione che codifica per una proteina chimerica di 80kD
(p80NPM/ALK) [1922]. Verso questa proteina esistono in commercio anticorpi che
possono essere impiegati per dimostrarne la presenza con metodiche di tipo
immunoistochimico [1923] [1924].

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE DELLE CELLULE NK

GENERALITÀ

Le malattie linfoproliferative delle cellule NK costituiscono un gruppo


eterogeneo dalla sistematizzazione ancora provvisoria e dalla diagnosi difficile.
Analogamente a quanto avviene per le neoplasie delle cellule T mature, le difficoltà
diagnostiche connesse a queste entità nosografiche sono in parte connesse, almeno nelle
nostre regioni, alla loro rarità. A ciò si devono aggiungere i problemi dovuti
all’incompleta conoscenza degli stadi maturativi della linea cellulare a cui appartengono.
Esiste evidenza che le cellule NK modulino il loro corredo antigenico nel corso
della maturazione. In tal senso le cellule pre-NK esprimerebbero fenotipo CD56- CD94-
CD161+, le cellule NK immature esprimerebbero fenotipo CD56+ CD94- CD161+, e le
cellule NK mature esprimerebbero fenotipo CD56+ CD94+ CD161+ [984]; questo

204
schematismo non sembra riprodotto dalle neoplasie che vengono putativamente
considerate la controparte trasformata dei vari stadi maturativi descritti [1023].
Un’ulteriore causa di difficoltà diagnostica riguardante le malattie
linfoproliferative delle cellule NK consiste nella presenza di numerose analogie
clinico-biologiche tra queste entità nosografiche e altre forme più diffuse e più familiari al
patologo. Le neoplasie dei precursori NK si confondono infatti con le leucemie acute
linfatiche o mieloidi, potendo condividere con le prime l’espressione di CD2, CD7 e
cyCD3, con le seconde l’espressione di CD13, CD33 e MPO, e con ambedue una
morfologia indifferenziata. Le neoplasie delle cellule NK mature possono invece
confondersi con le neoplasie delle cellule T citotossiche, con cui possono avere in
comune la presenza intracitoplasmatica di molecole citotossiche e di catene CD3 epsilon,
l’espressione degli antigeni CD2, CD8 e CD56, e non ultimo alcune peculiarità
anatomo-cliniche, consistenti nella prevalente localizzazione extranodale con
predilezione per determinati distretti, come la cute, la cavità nasale, e il tubo digerente.
Queste analogie hanno fatto in modo che le neoplasie delle cellule NK mature siano
spesso sistematizzate con le neoplasie T ad esse simili, dette appunto con termine
anglosassone neoplasie delle cellule T “NK-like”.

NEOPLASIE DEI PRECURSORI NK

Leucemia acuta dei precursori mieloidi/NK

Le neoplasie dei precursori delle cellule NK sono neoplasie riconosciute da poco e


dalla classificazione ancora non definitiva. A prescindere dai già citati “T linfomi
linfoblastici CD56+” [620] [621] [622], tra queste forme va annoverata in primo luogo la
cosiddetta “leucemia acuta dei precursori mieloidi/NK” segnalata da Inaba [160] [161] e
probabilmente finora confusa con altre forme morfologicamente simili come la AML-M0
o la AML-M3v. La “leucemia acuta dei precursori mielodi/NK” presenta morfologia
indifferenziata e fenotipo CD7+, CD33+ e CD56+, talora con addizionale espressione
degli antigeni CD13, CD34, HLA-DR, CD3 citoplasmatico e MPO. E’ presumibile che
questa entità nosografica si sovrapponga almeno parzialmente con alcune forme
sporadicamente segnalate in passato, tra cui:
i) la cosiddetta “acute leukemia of conceivable myeloid/NK cell precursor
phenotype” segnalata da Suzuki, con fenotipo CD7+, CD33+, CD34+,
CD56+, spesso HLA-DR+, morfologia di tipo L2, e negatività per
perossidasi ed esterasi [634];
ii) la cosiddetta "myeloid/NK acute leukemia" segnalata da Scott, con
fenotipo CD33+, CD56+, CD11a+, CD13dim+, CD15dim+, CD34+/-,
HLA-DR-, CD16-, CD2-, CD3-, CD8-, e caratterizzata da blasti con
nuclei profondamente incisi, scarso citoplasma con fini granulazioni
azurofile, e fine positività granulare per Sudan Black e per perossidasi
[636].
Ad una revisione della letteratura, appaiono poi suscettibili di essere riclassificati
come casi di “leucemia acuta dei precursori mieloidi/NK” i 10 casi di AML con fenotipo
MPO+, cyCD3+, CD2+, CD7+, descritti da Cross e provvisoriamente definiti come
“AML con caratteristiche T linfoidi” [79], e i 6 casi con fenotipo CD1-, CD4-, CD8-,
CD7+, MPO+, cyCD3+, descritti da Masuda, e classificati operativamente come
leucemia “mixed lineage” [158].

205
Linfoma blastico a cellule NK

Un’entità nosografica di incerta classificazione, di cui a tutto il 2002 risultavano


pubblicati non più di una sessantina di casi [234], è costituita da un gruppo di linfomi ad
insorgenza spesso cutanea [231] [1031] [233] [1925], che solo successivamente
colonizzerebbero il midollo osseo [232], andando talora incontro a leucemizzazione [620]
[233] [1926]. Queste forme sono clinicamente aggressive, non sembrano correlate con il
virus EBV [633], e sono contraddistinte da morfologia agranulare e da fenotipo CD3-,
CD4+, CD56+ [231] [1926]. Prescindendo dalla comune espressione di CD4 e CD56, il
fenotipo dei singoli casi riportati in letteratura appare alquanto variabile. In una casistica
costituita da quattro casi, le cellule neoplastiche esprimevano CD45 a intensità ridotta,
presentavano fenotipo CD43+ HLA-DR+, esprimevano CD2 in due casi, CD33 in un
caso, e risultavano negative per CD5 e per CD3 sia di superficie che citoplasmatico [228].
In un’altra casistica composta da sette casi, CD4 era espresso nei cinque casi a
interessamento cutaneo, CD2, TIA-1 e TdT erano espressi in 3 casi, CD5 e CD57 in un
caso, CD8 e CD16 in nessun caso, mentre CD33 risultava positivo in tutti e tre i casi
testati [234]. In alcune casistiche veniva riportata anche l’espressione dell’antigene CD16
[230].
Questa entità nosografica è stata definita da alcuni Autori come “linfoma blastico
a cellule NK” [228], ed è stata posta dalla classificazione WHO tra le neoplasie dei
precursori delle cellule NK [229].
Va tuttavia ricordato che, secondo altri Autori ancora, il “linfoma blastico a
cellule NK” non costituirebbe una neoplasia dei precursori NK, ma piuttosto una
neoplasia delle cellule plasmacitoidi dendritiche o comunque derivante dai monociti
plasmacitoidi [237] [239] [238]. Tale indirizzo sarebbe corroborato dal fatto che le cellule
del “linfoma blastico a cellule NK” non sembrano esprimere gli antigeni NK-associati
CD94 e CD161 [984], mentre invece appaiono vivacemente positive per l’antigene
CD123, anch’esso tipicamente presente sulle cellule dendritiche [1936].
La presentazione cutanea del “linfoma blastico a cellule NK” non deve essere
confusa con la presentazione cutanea del linfoma T/NK “nasal type” CD56+ [354], né
con il linfoma cutaneo CD3+ CD4+ CD56+, che dimostra invece morfologia granulare,
riarrangiamento dei geni codificanti per il TCR, e deriva da un raro subset linfocitario
dimostrabile nel sangue periferico [1928].

NEOPLASIE DELLE CELLULE NK MATURE

Malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati NK

La neoplasia delle cellule NK mature di più frequente riscontro è costituita dalla


malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati a cellule NK (NK-LDGL), che è stata
trattata nel paragrafo delle leucemie dei linfociti granulati, a cui si rimanda.
In alcuni casi isolati, questa leucemia può presentare un comportamento
estremamente tumultuoso, prendendo il nome di “leucemia aggressiva a cellule NK”.
Sebbene si ammetta che la morfologia della “leucemia aggressiva a cellule NK” possa
differire da quella della LDGL-NK per la presenza di casi con cellule senza granuli o dal
nucleo irregolare o nucleolato, non sembra esistano fra le due entità nosografiche
differenza fenotipiche di rilievo [984], né è chiaro se la “leucemia aggressiva a cellule
NK” costituisca una forma a sé stante [1030] o non piuttosto la leucemizzazione di
un’altra entità nosografica nota come “linfoma extranodale nasale (o del tipo nasale) delle
cellule NK (o T “NK-like”)” [1929] [1029].

206
Linfomi extranodali nasali (o del tipo nasale)

I “linfomi extranodali nasali o del tipo nasale” sono stati anche descritti come
“linfomi angiocentrici” per la loro spiccata tendenza all’invasione vascolare, e con questa
denominazione sono stati distinti come distinta entità nosografica dalla classificazione
REAL [32]. Una grande percentuale di essi interessa primariamente il rinofaringe e la
cavità nasale; questi casi corrispondono all’entità nosografica precedentemente definita
come “granuloma della linea mediana” (“lethal midline granuloma”), e prendono
correntemente il nome di “linfomi nasali” (“nasal lymphomas”) [1930]. Nei casi in cui la
sede della localizzazione non interessi le cavità nasali, il linfoma prende la
denominazione di “nasal-type”, definizione che sottolinea l’unitarietà dell’entità
nosografica a prescindere dalla localizzazione anatomica.
I linfomi extranodali nasali o “nasal-type” delle cellule NK generalmente non
leucemizzano, e in una casistica costituita da 34 casi nessuno di essi dimostrava invasione
del periferico all’esordio [633]. E’ tuttavia nota l’esistenza di una forma simile,
caratterizzata da costante leucemizzazione e definita “leucemia aggressiva a cellule NK”;
sebbene tra questa e il linfoma “nasal-type” esistano alcune differenze anatomo-cliniche e
fenotipiche [633] [984], è possibile che almeno alcuni casi di “leucemia aggressiva a
cellule NK” siano in realtà casi di linfoma “nasal-type” leucemizzato [1029].
Il fenotipo atteso nel linfoma extranodale nasale o “nasal-type” a cellule NK è
generalmente CD2+, sCD3-, cyCD3epsilon+, CD4-, CD5-, CD7-, CD8-, CD56+, CD57-
[633] [1931]; l’antigene CD16 non sembra generalmente espresso [633], ma è tuttavia
riportato in alcune casistiche [1932]. La ricerca delle proteina della multidrug-resistance
e delle proteine citotossiche TIA-1 e/o Granzyme B è generalmente positiva [1933]
[1934], e l’antigene CD94 è presente, mentre CD161 è assente [1935] [1023] [984]. Va
osservato che nella maggior parte dei casi citati in letteratura, la dimostrazione delle
catene citoplasmatiche CD3 epsilon è stata effettuata su campioni di tessuto inclusi in
paraffina con anticorpi policlonali, capaci di rilevare la presenza di catene epsilon isolate.
I linfomi extranodali nasali o “nasal type”, ancorché fortemente caratterizzati da
un punto di vista clinico e anatomo-patologico, costituiscono tuttavia un insieme
eterogeneo dal punto di vista ontogenetico, in quanto comprendono non solo veri linfomi
NK, ma anche i linfomi a cellule T “NK-like”, così appunto definiti per la loro particolare
somiglianza con le cellule NK. Questi linfomi fanno parte di un gruppo di T linfomi
funzionalmente definibile come “famiglia dei linfomi extranodali a cellule T di fenotipo
citotossico”, e si possono distinguere dai linfomi NK “sensu strictu” per una più regolare
espressione degli antigeni T-associati, per la frequente espressione di CD8, per la
possibile evidenziazione di sCD3(Leu4) e cyCD3(Leu4), ma soprattutto per la
dimostrazione del riarrangiamento dei geni codificanti per le catene del TCR.

207
208
PARTE TERZA

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