La nostra storia A cura di Sandra Audino
sandra.audino@asf.toscana.it
Applicazioni terapeutiche di piastrine:
passato, presente e futuro
Tra gli elementi corpuscolati del sangue le piastrine sono state le
ultime ad essere scoperte e, per molto tempo, poco si è compreso
della loro origine e della loro funzione. Attualmente le piastrine
sono oggetto di studi che le proiettano verso nuovi utilizzi come
emocomponenti, che superano l'uso trasfusionale e topico classici,
e che, in un futuro non troppo remoto, avranno ricadute importanti
sia nella terapia trasfusionale che non infusionale e nell'ambito della
terapia cellulare. Data la vastità dell'argomento focalizzeremo la
nostra attenzione sull'uso trasfusionale delle piastrine.
La scoperta
La scoperta delle piastrine
è unanimemente attribuita
a Giulio Bizzozero (1846-
1901) (Figura 1), patologo e
padre dell'istologia italiana,
che tra il 1881 e il 1882
comprese per primo il loro
ruolo centrale nell'emostasi
fisiologica e nella trombosi.
La presenza di questi
corpuscoli nel sangue era
stata, in effetti, individuata
precedentemente da altri
studiosi, ma Bizzozero
ebbe il merito di andare
Figura 1 - Giulio Bizzozero (1846-1901).
per primo oltre la semplice
osservazione e di comprendere il ruolo delle piastrine, in un'epoca
nella quale il complesso fenomeno della coagulazione era conosciuto
Il Servizio Trasfusionale marzo-aprile 2016
solo parzialmente e si attribuivano ai globuli bianchi funzioni che,
in realtà, erano di pertinenza delle piastrine. Erano note, all'epoca,
soltanto la trombina e il fibrinogeno, e si dovrà giungere fino al
1905 per la scoperta del fattore V e la prima descrizione della
cascata coagulativa. Prima di Bizzozero le piastrine erano state
interpretate come leucociti degenerati e frammentati, coaguli di
fibrina, batteri, precursori eritrocitari o eritrociti frammentati derivanti
da un'errata tecnica di venipuntura. Le osservazioni microscopiche
in vivo sui vasi mesenterici arteriosi e venosi degli animali, che
escludevano quindi gli artefatti dovuti all'arresto della circolazione,
permisero a Bizzozero di stabilire che questi corpuscoli che
chiamò, appunto, piastrine erano il terzo elemento corpuscolato
32 del sangue, totalmente indipendente da globuli bianchi ed eritrociti.
Riuscì a fornire la dimensione delle piastrine (2-3 µ) e descrisse
le loro variazioni morfologiche, l'assenza del nucleo e soprattutto
la capacità di aderire ai vasi danneggiati. Le osservazioni in vivo
permisero a Bizzozero di capire cosa accadeva quando un vaso
sanguigno veniva danneggiato. Le descrizioni e le conclusioni di
Bizzozero furono estremamente puntuali e precise. Ecco cosa
scriveva nel 1882: «Esaminando con un obiettivo ad immersione
il contenuto di questi vasi (siano essi vene o capillari) si giunge
a questo sorprendente risultato, che veramente a lato dei globuli
rossi e dei bianchi circola un terzo elemento morfologico. Esso è
rappresentato da piastrine pallidissime, a forma di disco a superficie
parallele o, più di rado, di lente, ovali o rotonde; di diametro uguale
ad un terzo od alla metà di quello dei globuli rossi (...). Queste
piastrine si possono riconoscere anche nel sangue appena estratto,
se però il preparato si fa e si assoggetta rapidamente all'esame (...).
La rapida alterazione delle piastrine può venire ritardata od impedita
mescolando il sangue appena estratto con diversi liquidi. Quello di
cui io mi servo di solito per la dimostrazione delle piastrine è una
soluzione di cloruro sodico 0,75% colorata con violetto di metile».
E ancora: « (...) per l'avvenire, nello studio delle funzioni e delle
alterazioni del sangue si dovrà sempre tener calcolo di questo nuovo
elemento morfologico che vi è costante e copioso. L'importanza
delle piastrine sanguigne mi venne già fin d'ora dimostrata
sia dal loro aumento
in molti stati morbosi
(per es. negli animali
salassati), sia da
quanto osservai nella
produzione dei trombi
e nella coagulazione
del sangue. (…)
Riguardo al trombo, le
piastrine costituiscono
la parte maggior del
trombo bianco dei
mammiferi, esse danno
origine, cioè, a quella
copiosa sostanza
granulare che sta fra
i leucociti e che finora Figura 2 - Un disegno di Bizzozero che
credevasi prodotta descrive gli elementi corpuscolati
dalla disgregazione di del sangue.

questi o dalla precipitazione di fibrina. (…) Mi par dunque che la
conclusione delle mie ricerche non possa essere altro che questa:
che la parte principale nella coagulazione del sangue spetta non
ai globuli bianchi ma alle piastrine». Bizzozero arrivò anche ad
intuire che le piastrine, come gli eritrociti e i globuli bianchi, fossero
prodotte dal midollo osseo ma fu soltanto tra il 1906 e il 1910 che
i megacariociti furono individuati come precursori delle piastrine.
Produzione e conservazione di piastrine
Abbiamo avuto già modo di parlare in questa rubrica dei numerosi
vantaggi che l'introduzione delle sacche di plastica, alla fine degli
anni '50 del secolo scorso, ha apportato nella raccolta del sangue.
La possibilità di frazionare il sangue intero e le caratteristiche del
materiale del contenitore di raccolta, hanno permesso la produzione
anche di questo emocomponente, ma fu soltanto negli anni '70,
dopo che fu dimostrato il mantenimento dell'efficacia delle piastrine
conservate per 96 ore a temperatura ambiente (RT), che la
produzione di piastrine entrò nella routine dei Servizi Trasfusionali.
Nel corso del tempo sono stati messi a punto tre metodi diversi per
raccolta di piastrine: da singolo donatore, utilizzando il plasma ricco
di piastrine (PRP), da buffy coat (BC) e da aferesi.
La produzione di
piastrine da BC è
stata sviluppata in
Europa a partire dalla
metà degli anni '70,
quando, per prevenire
l a fo r m a z i o n e d i
microaggregati
nella conservazione
dei concentrati
eritrocitari (CE),
diventò una pratica
comune rimuovere
il BC prima dello
stoccaggio. Soltanto
però dopo il 1985, con Figura 3 - Preparazione di un pool piastrinico
l'introduzione della da buffy coat.
sacca quadrupla, (Ruby Pietersz et al. - Dutch Red Cross Blood
Bank Amsterdam) il recupero delle piastrine da BC divenne una
pratica comune in Europa, dove ancora oggi resta il metodo
privilegiato, introdotto anche, tra il 2005 e il 2008, in Canada. Negli
USA invece il metodo preferito resta, da circa mezzo secolo, la
produzione di piastrine da PRP. Tutti i metodi presentano vantaggi
e svantaggi e mirano ad ottenere il migliore compromesso tra: il
raggiungimento di una raccolta efficiente per numero di piastrine
e funzionalità, un contenuto residuo di leucociti accettabile, il
rischio di contaminazione di patogeni, il rischio immunologico e
immunomodulatore a cui si espone il paziente sottoposto a terapia
trasfusionale e infine il costo del metodo di raccolta utilizzato. è da
sottolineare che, nonostante le piastrine rappresentino grossomodo
soltanto il 10% dei prodotti labili del sangue, esse sono responsabili,
quando utilizzate come emocomponenti per la terapia di supporto
nelle carenze piastriniche, di circa il 25% degli eventi avversi
registrati dai sistemi di emovigilanza.
La nostra storia
A parte le condizioni cliniche e la patologia di base del paziente,
che spesso costituiscono fattori di rischio predisponenti
all'insorgenza di eventi avversi, i preparati piastrinici sono di per
sé prodotti che, a causa dei metodi di raccolta e conservazione,
possono presentare fattori di rischio intrinseci. Le piastrine sono
infatti stressate e attivate, almeno parzialmente, nel corso della
raccolta e anche la conservazione in agitazione a 22 °C ± 2
è una condizione che favorisce la loro attivazione. Dobbiamo
inoltre considerare che le piastrine sono in grado di liberare
numerosi composti bioattivi che possono avere azione pro-
infiammatoria nel paziente ricevente. è evidente che i rischi sono
più elevati in quei pazienti che vengono sottoposti ripetutamente
a trasfusione di piastrine per piastrinopenie centrali, come i
pazienti oncoematologici. Sugli aspetti immunologici del rischio
correlato alla trasfusione di piastrine, molto brevemente, ci
soffermeremo nel prossimo paragrafo.
Piastrine e immunologia: la nuova frontiera
La maggior parte delle trasfusioni di piastrine viene eseguita
allo scopo di prevenire sanguinamenti per piastrinopenie, più
frequentemente, o per piastrinopatie, quest'ultime spesso dovute
a terapie antiaggreganti non suscettibili di "reverse", nel caso
di necessità di interventi chirurgici non procrastinabili e ad alto
rischio di sanguinamento. Considerando che circa il 75% dei
pazienti sottoposti a trasfusione profilattica va comunque incontro
a fenomeni emorragici, la trasfusione di piastrine, ancorché
largamente usata, è oggetto di discussione in ambito scientifico e
viene attualmente considerata un rimedio "a doppio taglio". Molti
sono ad esempio i dubbi anche sull'efficacia di questo trattamento
terapeutico nei casi di emorragia acuta. Tra gli effetti indesiderati
della trasfusione di piastrine hanno un ruolo emergente l'effetto pro-
infiammatorio e l'effetto pro-trombotico. L'attività pro-infiammatoria
delle piastrine è un'acquisizione piuttosto recente e costituisce un
ambito di studi vastissimo e in continuo sviluppo. Da un punto di
vista evolutivo è probabile che le piastrine derivino da cellule con
spiccate proprietà sia emostatiche che immunologiche, proprietà
che risultano pertanto strettamente interconnesse in questo tipo
cellulare. Le piastrine sono infatti, a pieno titolo, cellule effettrici
infiammatorie e sono implicate in tutto lo spettro degli eventi
della flogosi. Con la loro attività emostatica e pro-infiammatoria
contribuiscono alla riparazione vascolare e tissutale, ricoprendo
un ruolo determinante sia nella riparazione dei tessuti che nella
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difesa dai patogeni.
Tra i molti immunorecettori delle piastrine (Figura 4), citiamo i
recettori per i virus coxsackie, che si attivano in corso di infezione.
Nei modelli sperimentali murini, nei topi infettati, la presenza di
piastrine determina la riduzione della viremia, forme più lievi di
miocardite e un aumento della sopravvivenza. Molti studi hanno
dimostrato negli ultimi anni che, nonostante le piastrine siano prive
di nucleo, possiedono un corredo biochimico di fattori di trascrizione.
Si pensa che questi fattori, che nei megacariociti funzionano come
fattori di trascrizione classici, agiscano nelle piastrine attivate
come modulatori della risposta. Sappiamo anche che le piastrine
attivate interagiscono fortemente con tutte le classi di leucociti e
con l'endotelio. 33
La nostra storia
Figura 4 - Immunorecettori piastrinici. Da: "The inflammatory role of platelets via their TLRs and Siglec receptors" F. Cognasse
et al. Frontiers in Immunology. March 2015: Vol 6; Article 83.
Molto sinteticamente possiamo dire che le principali
attività immunitarie delle piastrine comprendono: rilascio di
chemochine, citochine e altri mediatori e interazioni con cellule
endoteliali, monociti, neutrofili. Relativamente alle interazioni con
l'endotelio, oltre il ruolo fondamentale nell'emostasi primaria,
pare che le piastrine svolgano un ruolo protettivo sulla parete
vascolare nei tumori, prevenendone il sanguinamento, mentre
in caso di infiammazione acuta aumentano la permeabilità
vascolare, grazie al rilascio di fattori come la serotonina. Questi
risultati apparentemente contrastanti, pur ottenuti con modelli
sperimentali diversi, sono dovuti al rilascio di mediatori differenti,
in dipendenza delle diverse condizioni patologiche. Restano però
ancora da chiarire molti meccanismi dell'attività di questi corpuscoli
anucleati tanto versatili. Viene a questo punto spontaneo chiedersi
cosa accada alle piastrine durante la conservazione e quale effetto
possano produrre sul ricevente i mediatori liberati, accumulati
nel sovranatante. Cercheremo di dare qualche risposta a queste
domande nel paragrafo seguente.
Conservazione di piastrine e infiammazione
Abbiamo visto come nel corso della conservazione in agitazione a
RT le piastrine vadano incontro ad attivazione. La degranulazione
dei granuli a determina un progressivo incremento dell'espressione
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membranaria di P-selectina e CD40L (proteine pro-infiammatorie
che interagiscono con i ligandi leucocitari), che si ritrovano
anche in forma solubile nel plasma in cui le piastrine sono
sospese. Il CD 40L, interagendo sia con i neutrofili che con le
cellule endoteliali è probabilmente implicato nell'insorgenza
della TRALI (Transfusion Related Acute Lung Injury), che
rappresenta uno dei rischi associati alla trasfusione di piastrine.
Durante la conservazione si assiste anche ad un incremento
dell'espressione della fosfatidilserina (PS) che viene trasferita
dal versante intracitoplasmatico della membrana piastrinica al
versante extracitoplasmatico, dove promuove la coagulazione
e la trombosi. Altro fenomeno di rilievo è la formazione di
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materiale particolato sotto forma di microparticelle piastriniche
membranose (PMP) che originano dalla membrana piastrinica,
fenomeno che si verifica sia in caso di attivazione che di fenomeni
apoptotici. Questo fenomeno, già noto dalla fine degli anni '60
con il termine di platelet dust (polvere piastrinica), ha assunto
negli studi più recenti un ruolo di particolare rilievo. È da notare
che il fenomeno della formazione delle microparticelle si verifica
però anche in vivo nei soggetti sani ed interessa tutti gli elementi
corpuscolati del sangue. Queste microparticelle (MP) hanno
dimensioni particolarmente ridotte (0,05-1.00 µ di diametro)
e possono abbandonare il torrente circolatorio ed entrare nei
tessuti svolgendo un ruolo di vettori delle informazioni tra cellule
contigue o a distanza. Sono infatti composte da un doppio strato
lipidico (formato prevalentemente da fosfolipidi, colesterolo e
proteine di membrana) e trasportano al loro interno una serie
di molecole implicate nel trasferimento delle informazioni
intercellulari: enzimi, proteine di adesione, proteine associate al
citoscheletro, citochine, chemochine, RNA. Tra le MP circolanti il
70%-90% sono PMP di origine piastrinica e tali particelle sono
considerate marker di attivazione piastrinica Le PMP presentano
un'attività pro-coagulante che è 100 volte superiore a quella
delle piastrine. Alti livelli di PMP sono stati rilevati in alcuni studi
nei pazienti piastrinopenici e leucemici che, a dispetto dei bassi
livelli di piastrine, non andavano incontro a sanguinamento.
Non sono ancora disponibili studi sul ruolo pro-infiammatorio
e pro-trombotico delle PMP trasfuse ma si suppone che un
eccesso di PMP possa avere un effetto dannoso, sia in termini
trombotici e infiammatori, che di funzionalità dei vasi sanguigni.
Gli elementi descritti, che si sommano alle note problematiche
relative al mismatch di gruppo ABO, alla possibile sensibilizzazione
agli antigeni del sistema HLA, responsabili della refrattarietà
piastrinica, e alle reazioni allergiche (Figura 5), hanno determinato
la messa a punto di sistemi operativi volti, da una parte, a ridurre i
prodotti indesiderati nei preparati piastrinici, dall'altra, a proporre
strategie alternative alla trasfusione di piastrine.

Figura 5 - I prodotti indesiderati di un concentrato piastrinico. Da: Platelet transfusion-the
new immunology of an old therapy. M. Stolla et al. Frontiers in Immunology.
February 2015; Vol 6: Article 28.
Trasfusione "sicura" di piastrine e alternative alla
trasfusione
È evidente, da quanto detto nel paragrafo precedente, che non può
esistere una trasfusione sicura di piastrine. Le strategie adottate per
ridurre i rischi di questo tipo di trasfusione sono la leucoriduzione,
il lavaggio, l'attenzione alla compatibilità ABO, la concentrazione
delle piastrine con riduzione massimale del sovranatante. Anche
il tipo di contenitore utilizzato per la conservazione delle piastrine
(sono disponibili attualmente almeno una dozzina di combinazioni
di plastiche e plastificanti diversi) svolge un ruolo fondamentale
nel mantenimento ottimale del pH e del tasso di swirling. Quando
la conservazione di piastrine prevede l'utilizzo di un medium
diverso dal plasma, come accade nei pool ottenuti da BC, si
ha una riduzione dell'incidenza di reazioni allergiche e febbrili.
Particolare attenzione deve essere posta quando il destinatario
della terapia trasfusionale è un paziente affetto da una patologia
tumorale. L'interazione tra tumore e piastrine sembra essere
bidirezionale, in quanto il tumore attiva le piastrine, inducendo la
trombosi, e le piastrine rilasciano nella sede della neoplasia fattori
di crescita (come il fattore di crescita trasformante beta TGFß, il
fattore di crescita derivato dalle piastrine PDGF, il fattore di crescita
dell'endotelio vascolare VEGF), che stimolano la proliferazione del
tumore, andando quindi ad antagonizzare le terapie farmacologiche.
Le piastrine inoltre promuovono l'ingresso delle cellule tumorali nel
torrente circolatorio, favorendo così le ripetizioni metastatiche.
Quali strategie, quindi? A parte le alternative farmacologiche,
come l'acido tranexamico, una strategia per ridurre la trasfusione
di piastrine, nei pazienti che sono anche anemici, è la trasfusione
di CE, allo scopo di portare i livelli di Hb a valori di 9-10 g/dL. Molti
studi in vivo e in vitro evidenziano, infatti, che valori più elevati di
La nostra storia
Ht determinano modifiche emoreologiche che spingono le piastrine
nella porzione più esterna del torrente circolatorio, ottimizzando
così le interazioni tra piastrine ed endotelio. La terapia trasfusionale
con piastrine resta comunque l'unica praticabile in moltissimi casi
e la comunità scientifica sta tentando, da una parte di superare i
limiti imposti alla disponibilità di questo emocomponente dal breve
periodo di conservazione, dall'altra di utilizzare i prodotti scaduti, ma
ancora ricchi di fattori di crescita e citochine, nei variegati scenari
della medicina rigenerativa.
Piastrine "fredde": il Cold Storage Platelets
program
Nessuno di noi penserebbe di conservare le piastrine in
frigorifero a 4 °C. Eppure questo sarà probabilmente il futuro,
almeno in certi contesti. Nel giugno 2015 la FDA (Food and Drug
Administration) ha approvato l'uso di piastrine conservate a
freddo per 3 giorni da utilizzare in caso di resuscitation in pazienti
con gravi traumi e sanguinamenti importanti. La metodica è stata
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messa a punto dal U.S. Army Medical Department (Figura 6).
Ancora una volta le necessità dei campi di battaglia, dove è
relativamente facile trasportare CE e plasma, ma non piastrine,
che richiedono l'agitazione a RT, ha stimolato la ricerca. Il
programma Cold Storage Platelets prevede la donazione di
piastrine in aferesi, conservate poi in soluzione additiva al
65% a 4 °C. I benefici ipotizzati erano una riduzione della
contaminazione batterica e una migliore conservazione della
funzionalità piastrinica. Le prove eseguite hanno dimostrato che
le ipotesi erano corrette. In particolare, per quanto riguarda la
funzionalità, la conservazione a 4 °C riduce drasticamente le
richieste metaboliche delle piastrine.
35
La nostra storia
I saggi su stabilità e
resistenza del coagulo
hanno dimostrato
che le piastrine
conser vate a 4 °C
formano coaguli di
resistenza superiore
a quelli delle piastrine
conser vate a RT e
paragonabile a come le cellule mesenchimali, e può sostituire il siero bovino
quella dei coaguli
ottenuti con piastrine
fresche. Una parziale
attivazione delle
piastrine si verifica
anche a 4 °C, ma
Figura 6 - Bagram Air Field's Craig Joint questo fenomeno si
Theater Hospital,153° Blood tradurrebbe in una
S u p p o r t D e t a c h m e n t . U n più rapida formazione
tecnico di laboratorio allestisce del coagulo, quando
la conta piastrinica nell'ambito le piastrine entrano
del programma "Cold Storage i n c o n t a t t o c o n i
Platelets". tessuti danneggiati.
I ricercatori sperano di riuscire a introdurre l'utilizzo di nuove
soluzioni additive per prolungare il periodo di conservazione da 5
a 14 giorni, cosa che permetterebbe una svolta davvero epocale
nella gestione delle scorte di piastrine.
Piastrine scadute: come utilizzarle
I concentrati piastrinici vengono attualmente conservati per 5 o al
massimo 7 giorni, quando si utilizzano tecnologie che riducono
il rischio di contaminazione batterica. Si tratta comunque di una
durata limitata, nel corso della quale si riduce fortemente il potere
emostatico delle piastrine. Ma anche dopo la loro scadenza i
concentrati piastrinici contengono elevate quantità di citochine e
fattori di crescita, che possono avere importanti applicazioni. Il lisato
piastrinico, ad esempio, ottenuto con ripetuti cicli di congelamento/
scongelamento, filtrato sterilmente, deprivato dei detriti cellulari e
sottoposto a inattivazione virale, è un fluido che contiene i fattori
di crescita necessari all'espansione di colture cellulari ex-vivo,
fetale (FBS). È inoltre ipotizzabile che il lisato piastrinico possa
essere frazionato nei suoi componenti, con un processo di tipo
industriale, per ottenere frazioni particolarmente utili all'espansione
di specifiche linee cellulari. Le piastrine scadute potrebbero
quindi essere non più eliminate alla scadenza, bensì congelate
e cedute dai poli di produzione di emocomponenti all'industria
di frazionamento, analogamente a quanto avviene per il plasma.
Abbiamo già avuto modo di parlare delle microparticelle piastriniche
PMP. A tale riguardo è stato sviluppato un sistema di produzione in
vitro di microparticelle da infusione (Infusible Platelet Membrane,
IPM), attraverso cicli di congelamento/scongelamento, lavaggio,
sonicazione, pastorizzazione e filtrazione. Con questo sistema si
sono ottenute particelle del diametro di circa 0,6 µ, negative per
GP IIb/3a, che sono risultate ben tollerate, ma saranno necessari
ulteriori studi per valutare il loro effetto sul processo coagulativo
e la funzionalità piastrinica. Sono stati, infine, prodotti anche degli
agenti emostatici liofilizzati (trombosomi), GP IIb/3a positivi, che
trovano applicazione nelle emorragie incontrollabili.
Molti sono dunque gli scenari di evoluzione delle applicazioni
terapeutiche di piastrine, un universo affascinante con enormi
potenzialità per la cura di numerose patologie.

NUOVA SEZIONE DEL SITO - "Patrocini"

Si comunica che all'interno del menù EVENTI è ora disponibile la pagina per l'inoltro delle richieste di patrocinio
attraverso un form online.
La procedura consente di inviare direttamente alla Segreteria Nazionale la richiesta, senza ulteriore trasmissione
Il Servizio Trasfusionale marzo-aprile 2016

di e-mail, e di allegare i programmi con tutte le indicazioni e le informazioni necessarie alla valutazione da parte del
Consiglio Direttivo SIMTI.
Si possono trasmettere sia richieste per eventi locali/regionali, che automaticamente perverranno in copia anche al
Delegato Regionale competente, sia richieste per eventi nazionali o interregionali.
Tutti gli eventi patrocinati dalla Società scientifica vengono segnalati nella sezione eventi formativi in calendario con
le informazioni di dettaglio fornite dall'organizzatore al momento della richiesta.
È importante inviare le istanze con un congruo margine di tempo per consentire la valutazione dei programmi da parte
del Direttivo durante le periodiche sedute, e quindi consentirne la successiva pubblicazione.

La Segreteria Nazionale SIMTI

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