La Malattia Emolitica

del Feto e del Neonato

Francesca Brugnolo
SOC Immunoematologia, Medicina Trasfusionale e Laboratorio
Azienda Ospedaliero-Universitaria Meyer

TRANSFUSION SCIENCE EDUCATIONAL COURSE

18-19 Rome (Italy)
 Definizione
Eritroblastosi Fetale
Idrope Fetale
Ittero del Neonato

E’ rappresentata da un insieme di manifestazioni cliniche,

più o meno gravi, conseguenti all’emolisi dei globuli rossi
fetali e neonatali ad opera di anticorpi materni di isotipo
IgG, capaci di attraversare la placenta, rivolti verso
alloantigeni eritrocitari del feto.
 Patogenesi

IgG materne rivolte verso eritrociti fetali

(dalla V settimana di gravidanza)
Transcitosi
Struttura del recettore FcRn

Emolisi,
prevalentemente
extravascolare
 Fisiopatologia

Anemia emolitica
Iperplasia della serie eritroide midollare
Reticolocitosi, Eritroblastosi
Eritropoiesi extramidollare compensatoria
Epatosplenomegalia
Ipertensione v.porta e v.ombelicale, edema placentare
Edemi generalizzati, anasarca, Idrope fetale
Morte intrauterina del feto (25°-35° settimana)
 Sintomatologia alla nascita
Anemia emolitica di entità variabile
• Pallore, Tachicardia, Tachipnea
• Reticolocitosi, eritroblastosi (assente da anti-K)
• anemia macrocitica (poichilocitosi da anti-D, sferocitosi da ABO)
• TCD+

Idrope
Epatosplenomegalia
Ittero, fino al Kernicterus
• Assente alla nascita, compare nelle prime 24 ore di vita
• Difficoltà all’alimentazione, letargia, ipotonia
• Irritabilità, stato stuporoso, opistotono, convulsioni, pianto, apnea
• Bassa attività glucoronil-trasferasi
• Immaturità della BEE
 BIND
Bilirubin Induced Neurologic Disfunction

Clinica Punti 1 Punti 2 Punti 3

Stato di Sonnolenza Stato stuporoso,

Letargia, irritabilità
coscienza Suzione scarsa Convulsioni
Marcata ipertonia
Tono Leggermente Iper o ipotonia
o ipotonia,
muscolare diminuito Inarcamento lieve
Opistotono
Solo dopo
Pianto Acuto Incostante
stimolazione

1-3 punti: segni minimi di encefalopatia

4-6 punti: encefalopatia progressiva ma reversibile
7-9 punti: encefalopatia irreversibile

Johnson L., Brown AK, Bhutani VK Pediatrics 1999; 104:746

 Un po’ di storia
Anno Descrizione
1609 Un’ostetrica francese descrive la nascita di due gemelli affetti da idrope il primo,
ittero il secondo
1892 Ballantyne descrive i criteri per la diagnosi (edema, anemia, epatosplenomegalia)
1932 Diamond et al. dimostrano che idrope e kernicterus sono 2 aspetti della stessa
patologia
1939 Levine e Stetson descrivono il caso di una secondipara che partorisce un feto morto
e, trasfusa con il sangue del marito, presenta una grave reazione emolitica
1940 Levine ipotizza l’eziologia immunoematologica della MEN
1946 Utilizzo terapeutico dell’exsanguinotrasfusione
1963 Trasfusione in utero intraperitoneale
1968 Introduzione dell’Immunoprofilassi anti-D nel post-partum
1986 Trasfusione in utero eco-guidata
1994 Valutazione della velocità di flusso dell’arteria cerebrale media
2000- La MEN nell’era della biologia molecolare
 Un po’ di numeri
La MEN è la causa più comune di anemia fetale e neonatale
Anni ‘40-’60: mortalità 2‰ delle nascite globali
 Prevenzione

Primaria Trasfusione delle donne in età fertile con unità

antigen-matched

Secondaria Uso estensivo della immunoprofilassi anti-D

Terziaria Uso di emazie antigen-matched

in caso di trasfusione intra-uterina
MEFN: una patologia ri-emergente?

 Immigrazione da Paesi che non fanno prevenzione

 Donne italiane (25% dei casi):
 trasfusioni
 inefficacia del dosaggio della profilassi anti-D
 mancata profilassi (aborti precoci, manovre
invasive per diagnosi prenatale)
 mancata individuazione D parziale
 Alloimmunizazione non dovute al D per le quali non
esiste profilassi (es. anti-c, anti-Kell)
 Alloimmunizzazioni anti-D per anomalo passaggio di
emazie fetali nel circolo materno (in alcuni Paesi
profilassi a tutte le donne RhD neg alla 28a
settimana)
 Eventi potenzialmente
sensibilizzanti in gravidanza
A partire dalla V settimana di gravidanza

 Amniocentesi, Villocentesi, Funicolocentesi

 Emorragia pre-natale
 Trauma addominale
 Gravidanza extrauterina
 Morte intrauterina
 Interventi terapeutici in utero (Trasfusione, Chirurgia,
Inserimento di shunts, Laser)
 Aborto e minaccia d’aborto
 Manovre ostetriche durante il parto (Versione esterna,
Scollamento manuale della placenta)
 Immunoglobuline Rh:
dose e indicazioni
 Dose piena: 300 g di anti-D
 Sufficiente a neutralizzare 15 ml di emazie fetali RhD+
 Solo in 1-2% delle donne l’ emorragia feto-materna è
superiore a 30 ml
 Subito dopo il parto se feto Rh-D+ o prima del parto in
caso di emorragia anteparto maggiore
 Antenatale in corso di amniocentesi (16-18 settimane)
 Profilassi alla 28a settimana
 Mini dose: 50 g
 Sufficiente a neutralizzare 2.5 ml di sangue RhD+
 Aborto nel primo trimestre
 Dose di Ig anti-D per
ml emazie fetali

Dose di Immunoglobulina anti-D ml emazie fetali

neutralizzate
20 mg 100 U.I. 1 ml
50 mg 250 U.I. 2.5 ml
100 mg 500 U.I. 5 ml
300 mg 1500 U.I. 15 ml
 Per calcolare correttamente l’entità
dell’emorragia feto-materna:
test di Kleihauer Betke (Eluizione Acida)
 Mette in evidenza la presenza di emazie con Emoglobina F nel
circolo materno
 Permette una stima quantitativa e quindi un’eventuale dose di Rh-Ig
 Uno striscio di sangue materno post-partum viene fissato e
trattato con un eluente acido
 La emoglobina delle emazie di adulto (materne) viene eluita mentre
quella F (fetale ) persiste
 Il vetrino viene poi colorato con safranina, le emazie materne
appaiono come “ghosts” quelle fetali si colorano
 Contare le emazie fetali su almeno 2000 emazie materne
 Valutazione dell’emorragia
feto-materna
9 d 30 d 60 d
146.8 ml 40 ml 0.06 ml

Paziente

Donatore
maschio
di controllo

Controllo
positivo

Calcolo dell’emorragia feto-materna: %cellule fetali x 18 x 1.22

British Committe for Standards in Haematology FMH Guidelines 2009
 Gestione
della
gestante
per la
prevenzione
della MEFN
Gruppo di Studio Ematologia Neonatale SIN

ASSISTENZA AL NEONATO CON

ALLOIMMUNIZZAZIONE MATERNO-FETALE:
PERCORSO DIAGNOSTICO, TERAPEUTICO E DI
FOLLOW-UP
 Indagini immunoematologiche

- Gruppo, Rh, Kell e test di Coombs all’inizio della gravidanza

- Eventuale identificazione anticorpale
- Titolo anticorpale
- Monitoraggio del titolo anticorpale
 Il titolo anticorpale predice il
rischio?
 Talvolta no!
Anemia non correla con titolo Anti-K

- Possibilità di studiare sottoclassi IgG

(entità dell’anemia correla positivamente con IgG1, negativamente con IgG3)

- Importanza del pattern di glicosilazione anticorpale

(bassa fucosilazione correlata a anemia più grave)

- Utilizzo test biologici di ADCC in vitro

RhD nell'era molecolare
 Algoritmo della gestione delle gestanti RhD negative
non alloimmunizzate e alloimmunizzate
Da: Fasano

Da: R. Fasano Hemolytic disease of the fetus and newborn in the molecular era
Seminars in Fetal and Neonatal Medicine 2016; 21, 28-34

Algorithm for the clinical management of non-alloimmunized RhD-negative, and alloimmunized RhD and non-RhD pregnancies. ∗Targeted RAADP is a
proposed alternative option to universal RAADP for all RhD-negative pregnant women. †In addition to RBC antibody identification, antibody titers are
determined and repeated every four weeks until 24 weeks of gestation, and every two weeks thereafter when a fetus is determined at risk. ‡Paternal
antigen detection and zygosity testing can be done either serologically or molecularly for most non-D Rh and minor RBC antigens. §Non-invasive fetal
molecular diagnostic approaches are preferred to invasive methods which include: amniocentesis, cordocentesis, or chorionic villus sampling. Cff-DNA,
cell-free fetal DNA; RAADP, routine antenatal anti-D prophylaxis; RBC, red blood cell; HDFN, hemolytic disease of the fetus and newborn; MCA, middle
cerebral artery; MoM, multiples of the median; Ag, antigen; Hct, hematocrit
Identificazione di un feto a rischio di
MEN da Rh

Vantaggi

Monitoraggio frequente della madre RhD- solo in caso di

feto RhD+

Utilizzo di Ig anti-D solo quando realmente necessario

Possibilità di valutare omo o eterozigosi paterna per RhD

Possibilità di determinare gruppo e Rh del feto prelevando cellule

fetali o DNA fetale presente nel sangue materno
 Valutazione D-Zigosity paterna

Genotipo più probabile, in base all’aplotipo D, C, c, E, e

Genotipizzazione tramite PCR

•Richiede la certezza della paternità;
•Permette una valutazione generica del rischio paterno di
dare origine ad una gravidanza D-incompatibile;
•Nel caso di eterozigosi paterna, dà vita ad un risultato
probabilistico.
 Valutazione Gruppo ematico Fetale
FUNICOLOCENTESI
rischio di emorragia transplacentare a seguito della procedura (30%) o di danno
fetale (3%).

VILLI CORIALI
Sufficiente materiale per estrarre DNA;
rischio emorragia feto-materna assente;
rischio alterazione sviluppo degli arti.

LIQUIDO AMNIOTICO
E’ la fonte di materiale genetico più usata per la genetica fetale. Rischio di
aumento del titolo anticorpale materno in donna già immunizzata: circa 3%. Si
opta per un prelievo “precoce” (17°-20° settimana) in caso di rischio moderato-
severo di sviluppare MEN e genotipo paterno eterozigote o ignoto.

MUCO CERVICALE
Procedura minimamente invasiva. Scarsità di materiale genetico e possibile
“contaminazione” di materiale genetico materno.
 Genotipizzazione Materna
DNA fetale libero

Aumenta con l’età gestazionale.

La ricerca di DNA fetale libero è efficace a partire dalla 15°

settimana di gestazione

Importanza del timing prelievo-esecuzione del test, per ridurre il

rischio di risultati falsi negativi

Importanza della ricerca di marcatori paterni per la conferma della

presenza di materiale genetico fetale nel campione analizzato
MARKERS PATERNI
1. SRY nel caso di prodotto del concepimento di sesso maschile,
2. studio di polimorfismi paterni nel caso di feto di sesso feminile,
3. RASSF1A marker:
• ipermetilato quando di origine fetale,
• ipometilato quando di origine materna
 Indagini di monitoraggio fetale
Amniocentesi con monitoraggio della bilirubina nel
liquido amniotico con lettura spettrofotometrica
a 450 nm (OD450)
Valutazione ultrasonografica
dell’idrope fetale
Valutazione della velocità di flusso
dell’Arteria Cerebrale Media
MEN da anticorpi diversi da Rh

2) Moise KJ, Fetal anemia due to non-Rhesus-D

red-cell alloimmunization, Semin Fetal Neonatal
2008;13:207-214
3) de Alarcón P, Werner E, Christensen RD,
Neonatal Hematology: Pathogenesis, Diagnosis,
and Management of
Hematologic Problems, 2nd Edition, Cambridge
University Press, February 2013, modificate
 MEN AB0

 Rappresenta circa il 65% delle MEN

 Statisticamente circa il 20% di tutte le
gravidanze presenta incompatibilità AB0
 Incidenza di eventi emolitici 1:150 nascite
 Un bambino a rischio su 5 presenta ittero
 MEN AB0

 Perchè anti-A e anti-B IgG?

• TLR???

 Perchè tendenzialmente meno grave?

• Antigeni A e B numericamente meno espressi nel neonato
• Epitopi A e B presentano minore maturità della struttura
biochimica
• Nel neonato sono presenti sostanze gruppo-specifiche sia
solubili che localizzate sulla superficie di altri tipi cellulari, che
legano le IgG materne
 MEN a confronto

Da G.Reali: MEN: una malattia scomparsa? La trasfusione del sangue 2001 46 148-157
 DAT: sensibilità del test

Metodica
DAT convenzionale in provetta
DAT Microcolonna
DAT Micropiastra
DAT in Citometria a flusso
Molecole/cellula
Almeno 500 molecole
200-300 molecole
100 molecole
<100 molecole
 Trasfusione intrauterina
Indicazioni
Dalla 20° settimana di EG, in caso di MEFN
ACM-PSV >1.5
Hb fetale <8.0-8.5 g/dl
Obiettivi
• Portare Hct fetale > 40%
• Volume da trasfondere (ml): Vol. fetoplacentare (g) x (Hct post-Hct pre)
Hct GRC donatore

Caratteristiche unità da trasfondere

Emazie 0 negative, o prive dell’antigene responsabile,
fresche (< 5giorni), filtrate, lavate, Hct 75-80%, irradiate,
cross-match compatibile con siero materno
 Terapie per la MEN neonatale

 Fototerapia: per favorire la eliminazione della

bilirubina non coniugata
 IVIG: esatto meccanismo di azione tuttora non
ben chiarito, possibile competizione con il
complesso antigene-anticorpo bloccando il
recettore Fc per le immunoglobuline dei
macrofagi
 Exsanguinotrasfusione: per eliminare le emazie
positive per l’antigene
Fototerapia: quando?
 Fototerapia: come?
 Il suo utilizzo, con dispositivi di ultima generazione, equivale
sempre di più a quello di un farmaco con la possibilità di
stabilirne dosaggio, tempi e modalità di somministrazione.
 L’efficacia della FT dipende da diversi fattori:
• la lunghezza d’onda (in particolare tra 460-490 nm).
• la distanza tra la sorgente luminosa e la cute.
• l’area di cute esposta alla luce.
• la radianza spettrale, suggerita ≥ 30 µW/cm2/nm
 Lampade tradizionali, che impiegano come fonti luminose tubi
fluorescenti o lampade alogene
 Lampade di ultima generazione a LED:
 mancata produzione di calore
 maggiore vita media
 minore consumo di energia
 più specifica lunghezza d’onda.
 IVIG

 Nella MEFN non è indicato l’uso delle IVIG in profilassi

 La somministrazione di IVIG in associazione alla FT intensiva, è
indicata nei casi di media gravità, quando nonostante la FT
intensiva, la bilirubina continua a crescere con un incremento >
0,5 mg/dl/h e si avvicina di 2-3 mg/dl a livelli indicativi per ET
 La dose di IVIG raccomandata è di 0.8-1 g/kg, in almeno 4 ore.
 Un’ulteriore somministrazione può essere effettuata a distanza
di 12 ore
Exsanguinotrasfusione:
quando?
 Exsanguinotrasfusione: come?
Scambiare 80-100 ml/kg x 2= ml totali

CVO

Sacca scarto

2 unità GRC 0 ccdee (prive Ag implicato)

• compatibili con madre e neonato
Unità sangue • fresche (<5 giorni)
intero ricostituito • filtrate
Scambio per ciclo • irradiate
<1500g 5 ml • risospese in unità plasma AB
Tra 1500 e 2000 g 10 ml • HCT 40-60%
Tra 2000 e 3500 g 15 ml
>3500g 20 ml
Possibili nuove strategie terapeutiche
Studi clinici globali di FcRn Targeting
per le malattie autoimmuni
Grazie per l’attenzione