Sei sulla pagina 1di 26

In enzimologia il reagente da trasformare in prodotto viene denominato Substrato S.

Il meccanismo prevede la formazione del complesso Enzima-Substrato [ES],


intermedio rispetto alla liberazione del Prodotto [P ] e al ripristino dell’Enzima (E).

Schema generale di una reazione catalizzata da un enzima: la prima tappa è la più


veloce e quindi la velocità dell’intera reazione catalizzata dipenderà dalla seconda
tappa lenta. Entrambe le tappe sono reversibili.

tappa veloce tappa lenta limitante la velocità di reazione

Gli enzimi sono modulabili nella loro attività catalitica da parte di vari fattori
(temperatura, pH, piccole molecole, ioni, ecc), per consentire l’accelerazione o il
rallentamento delle reazioni che catalizzano.
catalizzano.
Il sito attivo

Il complesso ES si forma in una regione dell’enzima,


denominata sito attivo,
attivo che occupa normalmente non più del
5% dell’area totale della superficie della molecola enzimatica.

I siti attivi,
attivi a forma di nicchie o fenditure, sono spazi tridimensionali situati entro la proteina
globulare e in essi sono presenti:

1) catene laterali di AA idrofobici per la creazione di un ambiente privo di acqua, simile al


vuoto, ambiente ideale per l’accelerazione delle reazioni, rallentate invece dalle molecole di
acqua.
2) catene laterali di AA polari per formare legami deboli (legami H, ionici, di van der Waals)
con i substrati per attuare il loro posizionamento nel sito attivo. Essendo questi legami
deboli, il posizionamento dei substrati è facilmente reversibile;

3) catene laterali di AA polari spesso cariche, di norma in numero non superiore a 5, con
funzione di reattività catalitica, chiamati appunto residui catalitici, attivi nella trasformazione
di S in P.
L’energia di attivazione
Il substrato S per essere
trasformato in P deve passare
stato di transizione attraverso lo stato di transizione
S‡ che è la specie molecolare
più altamente reattiva di S, labile
e instabile, facile da trasformare:
lo stato di transizione S‡ è stato
paragonato ad una biglia sulla
punta di un ago per indicare che
è uno stato critico che potrebbe
trasformarsi in P come pure di
nuovo in S.

L’energia necessaria per portare


le molecole S allo stato S‡
chiamato stato di transizione
transizione, è
definita energia di attivazione
attivazione.

Gli enzimi abbassano l’energia di attivazione e aumentano la velocità delle reazioni


senza modificare la costante di equlibrio (Keq).
Il Substrato è paragonabile a
una barretta metallica che
vogliamo spezzare in 2 parti
(Prodotti
Prodotti):
Lo stato di transizione
- nella reazione non catalizzata
dobbiamo pensare di applicare
una forza (meccanica e/o calore)
così forte da piegare la barretta
stato di transizione S‡) fino a
(stato
spezzarla nei 2 Prodotti
Prodotti;
- nella reazione catalizzata la
barretta metallica viene accolta
nel sito attivo dell’Enzima
Enzima che
sarà indotto a ripiegarsi
(adattamento
adattamento indotto
indotto) insieme
complesso ES‡)
alla barretta (complesso
fino a che si spezzerà,
rilasciando i Prodotti e
l’Enzima
Enzima intatto.
Equazione di Michaelis-Menten (1913)

Vmax ⋅ [ S ]
v0 =
K M + [S ]

Leonor Michaelis & Maud Menten

Leonor Michaelis (Berlin, January 16, 1875 – New York, October 8, 1949).
Maud Leonora Menten (Ontario, March 20, 1879 – July 26, 1960), among the first women in Canada to earn a
medical doctorate. At that time women were not allowed to do research in Canada, therefore she decided to do
research in other countries such as the United States and Germany. Accomplished musician and painter.
Grafico Michaelis
Michaelis--Menten
v° = Vmax [S]
Km + [S]
La velocità di reazione in tutti i processi
enzimatici, mantenendo costanti pH,
temperatura e altre condizioni necessarie al
processo, dipende fondamentalmente da :

[E] concentrazione di enzima


[S] concentrazione di substrato

Si può osservare dal grafico che, mantenendo costante [E]


[E], la velocità di reazione aumenta
all’aumentare di [S] in modo direttamente proporzionale solo per un breve tratto, poi
sempre aumentando fino a un valore massimo, Vmax, oltre il quale si mantiene costante,
tendendo all’infinito. Al valore di Vmax, E è saturato da S.

L’aumento infinito di [S] non può dare luogo ad aumento di velocità di reazione oltre al
Vmax, ottenuto per una certa [E][E]. In condizioni di saturazione Vmax può essere
aumentata solamente da un aumento di [E
[E], in modo direttamente proporzionale.
Nelle reazioni non catalizzate: l’> di [S]
causa l’> direttamente proporzionale della
velocità.
Nelle reazioni catalizzate: l’andamento
bifasico (crescente fino a Vmax, e poi non
più fino all’infinito) della cinetica di
saturazione (aumento di v0 per basse [S],
indipendenza della Vmax per [S] infinite o
saturanti) è rappresentato da un’iperbole
rettangolare e definita curva di saturazione
da substrato.

Km è la [S] che corrisponde alla velocità semi-


semi-massima v0 = ½ Vmax .

Si deduce che Km indica, in modo inversamente proporzionale, l’affinità


affinità di E per S:
maggiore è la [S] che consente di sviluppare la Vmax/2, minore è l’affinità di E per S.
Influenza del pH

La maggior parte degli enzimi esprime


massima attività in un intervallo ristretto di
pH che varia moltissimo da enzima a
enzima (intervallo di pH da 2 a 9). Il valore
esatto di pH in cui l’enzima esprime
massima attività è definito pH optimum
optimum. Il
pH fisiologico è mantenuto attorno alla
neutralità e ciò non coincide con tutti i pH
ottimali dei moltissimi enzimi: mutamenti
di pH sono in grado di modificare l’attività
catalitica.
Influenza della Temperatura
Le basse temperature riducono l’attività catalitica per la
difficoltà delle collisioni fra E e S;

si ha un massimo di attività in un intervallo attorno a


40 °C, vicino alla temperatura corporea;

a temperature superiori si ha denaturazione della


proteina enzimatica.

Ciascun enzima presenta una caratteristica temperatura in cui esprime massima


attività; nel nostro organismo, tuttavia, la temperatura viene mantenuta a 37 °C e
perciò tutti gli enzimi lavorano a questa temperatura anche se non è la loro ottimale.
Cambiamenti di temperatura sono in grado di modulare l’attività degli enzimi: il
rialzo febbrile causa aumento di attività enzimatiche per difesa contro agenti
infettanti e contemporanea accelerazione delle reazioni metaboliche dell’organismo.
Il limite di 40 °C non deve essere superato in caso di rialzo febbrile per il rischio di
denaturazione di proteine con ruoli fondamentali (cervello) e in generale di mancato
coordinamento delle reazioni nei vari organi e tessuti.
pH, temperatura e attività enzimatica

Ogni enzima ha il suo pH ottimale Per ogni enzima, esiste una temperatura ottimale
che può non corrispondere con la temperatura in
cui si trova l’enzima (37°C)

Aumento dovuto alla


temperatura Diminuzione

Velocità
(1.7
(1.7--2.5 ogni 10°
10°C) dovuta alla
denaturazione della
proteina

0 10 20 30 40 50

Temperatura
PARAMETRI
CINETICI

KM e affinità
Significato Km
ESOCHINASI= Km BASSA
GLUCOCHINASI= Km ALTA
I trasportatori hanno le caratteristiche di
enzimi

• I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi


• Legano selettivamente il loro substrato, cioè la
molecola che deve essere trasportata
• Cambiano di conformazione per rilasciare il
substrato dall’altro lato
• Ritornano alla conformazione originale per legare
un’altra molecola di substrato
• Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten
Analisi cinetica del transporto di una
molecola tramite proteina carrier:
saturazione
In base alla Ia legge di Fick il flusso di particelle che diffondono liberamente
aumenta linearmente all’aumentare della concentrazione
Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata se si tratta di un flusso di particelle
attraverso la membrana mediato da carriers

Fma 20
x

F=kd∆C I flussi mediati da carriers -a


300
Flusso netto [moli/(cm ×s]

15
2

200 F max differenza della diffusione libera -


F=
F

10 ka sono saturanti
100 1+
C
5 0
0 10
∆C 20 30

0
0 50 100 150 200 104
∆C (mM)

Ciò accade per due motivi:


1. Sulla membrana è presente un numero finito di carriers;
2. Ciascun carrier opera ad una velocità finita
Rappresentazione del concetto di
saturazione con un esempio
numerico
Per semplicità consideriamo una membrana con un solo carrier

Velocità del carrier: 50 p/s

50
N. partic. Flusso

Flusso (Particelle/Carrier/s)
40
1 1
10 10 30
50 50
20
100 50
10
1000 50
0

0 800 1000
N. particelle
Numero di turn
turn--over o costante
catalitica (kcat)
VM = kcat [E0]
 Massimo numero di molecole di substrato
convertite nella unità di tempo da una
molecola (sito) di enzima
 È correlata alla velocità di decomposizione
del complesso ES
Significato di kcat/Km
(costante di specificità)
 Dà una idea della efficienza relativa con
cui vengono trasformati più substrati
(specificità)
 Dà una idea della efficienza catalitica
dell’enzima
 Kcat riflette la velocità con la quale
l’enzima trasforma il substrato in
prodotto. Km è inversamente correlata
con l’affinità dell’enzima per il
substrato
L’INIBIZIONE ENZIMATICA
L’inibizione dell’attività di un enzima avviene quando molecole chiamate inibitori si legano
variamente all’enzima, impedendone l’attività.

Può essere:

a) competitiva quando l’inibitore, con forma chimica analoga a S, compete con


esso per l’ingresso nel sito attivo;

b) non competitiva,
competitiva, quando l’inibitore non si lega nel sito attivo e si può legare
sia a E libero sia al complesso ES.
ES.
L’ inibizione enzimatica può anche essere
essere::
reversibile
l’inibitore si lega debolmente all’enzima e può essere allontanato,
ripristinando l’attività catalitica.
catalitica.
irreversibile
a) l’inibitore si lega stabilmente nel sito attivo e non può essere
allontanato (inibitori suicidi con importanti applicazioni in
farmacologia);;
farmacologia)
b) si è attuata la modificazione chimica di residui di AA catalitici
presenti nel sito attivo (diisopropilfluorofosfato (DIFP) , gas
nervino, modifica il sito attivo dell’acetil-
dell’acetil-colinesterasi enzima
fondamentale per la funzionalità del sistema nervoso).
nervoso).
INIBIZIONE COMPETITIVA E NON COMPETITIVA

Gli inibitori competitivi:


competitivi:
 presentano struttura chimica analoga a quella del substrato
substrato..
Esempi sono i farmaci quali i sulfamidici (antibatterici) e
il metotressato (antitumorale) che agiscono da antimetaboliti
antimetaboliti;;
 competono con esso per entrare nel sito attivo.
attivo.

Gli inibitori non competitivi:


competitivi:
 non si legano nel sito attivo;
 si possono legare all’enzima libero e/o al complesso ES.
sito
substrato
attivo
chiave

veleno

inibizione non competitiva


inibizione competitiva
Inibizione competitiva