[Lezione 12- 18/04]

Le cellule eccitabili sono cellule che sono in grado di rispondere alle perturbazioni con un’alterazione del
loro potenziale di membrana e quindi con un segnale elettrico. I segnali elettrici che si ritrovano a livello
delle cellule possono essere divisi in due categorie:

 Risposta elettrica passiva o potenziale elettrotonico  è una risposta elettrica che si verifica a livello di
tutte le membrane di tutte le cellule (anche quelle non eccitabili). È una risposta che si osserva tutte le
volte che attraverso la membrana passa una corrente. La risposta consiste in una variazione del
potenziale di membrana che dipende dall’intensità della corrente e che è spiegata dalle proprietà
elettriche passive della membrana stessa (capacità dovuta alla presenza del doppio strato fosfolipidico e
resistenza dovuta alla presenza di canali ionici). La risposta elettrica passiva è tipicamente una risposta
locale, si osserva nel punto in cui si ha passaggio di corrente e si propaga a breve distanza dal punto in
cui la corrente viene iniettata.
 Risposta attiva o potenziale d’azione o spike  è tipica delle cellule eccitabili. Quando si ha passaggio
di corrente attraverso la membrana, la cellula risponde cambiando le proprie caratteristiche con un
segnale, il potenziale d’azione, che è rappresentato da un’inversione del potenziale di membrana. Il
potenziale di membrana passa da un valore negativo, tipico della condizione di riposo (tra -60mV e -90
mV), ad un valore positivo. L’inversione del potenziale è un’inversione transitoria: in una cellula come il
neurone ha durata dell’ordine di qualche millisecondo. L’ampiezza del potenziale d’azione a livello di
una stessa cellula eccitabile è sempre la stessa, indipendentemente dall’intensità della corrente: questo
significa che il potenziale d’azione non è un fenomeno graduale, ma è un fenomeno tutto o nulla. Tutto
o nulla significa che il potenziale d’azione o c’è o non c’è. Per avere un potenziale d’azione la corrente
che attraversa la membrana deve avere una certa intensità, ma se questa intensità viene superata, il
potenziale d’azione ha sempre la stessa ampiezza. Il potenziale d’azione non rimane localizzato nel
punto in cui avviene l’iniezione di corrente, ma si auto propaga per tutta la lunghezza della cellula
nervosa.

Proprietà elettriche passive della membrana

Le risposte passive sono dovute a capacità e resistenza di membrana.

La resistenza dipende dal numero e dal grado di

permeabilità agli ioni dei diversi canali ionici.
La resistenza è un qualcosa che può variare nelle varie
cellule perché dipende sia dal numero dei canali che dalla
loro permeabilità. Se ci sono pochi canali ionici, con bassa
permeabilità si avrà una resistenza elevata e quindi una
scarsa conduttanza; se invece ci sono molti canali ionici
con elevata permeabilità, la resistenza sarà bassa e la
conduttanza elevata.
La capacità dipende dalle proprietà del doppio strato
fosfolipidico, assimilabili a quelle di un condensatore.
La capacità di membrana ha un valore che è costante in
tutte le cellule perché tutte le cellule sono caratterizzate da uno strato fosfolipidico.
Cosa succede nella membrana quando passa una corrente? Nelle figure sono rappresentati due schemi
sperimentali che in pratica sono lo stesso schema che è quello utilizzato per registrare le risposte elettriche
delle cellule in funzione dell’iniezione di corrente nelle cellule stesse.

Si ha una vaschetta con all’interno la cellula. Nella cellula vengono inseriti due microelettrodi: uno viene
utilizzato per iniettare corrente, l’altro serve per registrare le variazioni di potenziale. L’elettrodo che inietta
corrente è collegato ad un generatore di corrente e quello che registra è collegato ad un dispositivo per
registrare. Il flusso di cariche positive derivato dalla corrente può fluire dal citosol verso la micro pipetta o
dalla micro pipetta verso il citosol,
a seconda della polarità della
corrente che viene applicata. Il
circuito si chiude attraverso il
bagno, in particolare attraverso
l’elettrodo inserito nel bagno.
Nelle due condizioni la corrente
attraversa la membrana in due
modi diversi: se si ha la situazione
in cui la corrente entra dal citosol
nel microelettrodo (figura a
sinistra), quando il circuito si
chiude, la corrente attraversa la
membrana dall’esterno verso
l’interno.

Se invece le cariche positive fuoriescono dal

microelettrodo (figura a destra), quando il
circuito si chiude, la corrente attraversa la
membrana dall’interno verso l’esterno.

In pratica quindi lo sperimentatore può generare

una corrente in ingresso o una corrente in uscita
semplicemente cambiando la polarità della punta
del microelettrodo.
Gli impulsi di corrente che si usano per studiare
le caratteristiche della membrana sono onde
quadre di corrente cioè si ha corrente 0 fino ad
un certo momento e poi, quando si chiude il
circuito, la corrente passa istantaneamente ad un
valore predeterminato per un certo periodo di tempo (fase on) e poi si riapre il circuito (fase off) e il valore
della corrente torna a 0. Le onde quadre di corrente possono avere una polarità diversa. Quando si genera
un’onda quadra come quella rossa (A)rappresentata in figura e si registra la risposta, si ottiene un
potenziale come quello in verde (C) in cui si vede che il potenziale passa da un valore di riposo ad un valore
meno negativo. Questo significa che se si fa passare una corrente in uscita attraverso la membrana, questa
cambia il proprio potenziale riducendo la differenze di potenziale interno/esterno: la membrana si
depolarizza. Se invece si fa passare la corrente dall’esterno verso l’interno, si osserva un aumento della
differenza di potenziale e quindi un’iperpolarizzazione della membrana.
Il passaggio dal valore di riposo ad un nuovo valore dovuto al passaggio di corrente non avviene seguendo
la variazione di corrente, ma si registra una variazione esponenziale del potenziale di membrana che
raggiunge il valore finale entro un certo tempo x. Quindi l’onda quadra di corrente determina una risposta
deformata rispetto al segnale inviato.

Questa risposta è dovuta alla presenza di un circuito RC nella membrana (elemento capacitivo in parallelo
con elemento resistivo).
Cosa accade a livello di un circuito RC quando ci si fa passare una corrente? La risposta a questa domanda
riflette esattamente quello che accade a livello della membrana. Nel circuito si considera di partire da una
situazione in cui non esiste alcuna differenza di potenziale ai due capi del circuito e quindi nessun accumulo
di cariche sul condensatore.

Si parte da questa situazione in cui il circuito è aperto, non si ha alcun flusso

di corrente e quindi la differenza di potenziale ai due capi dell’armatura è 0.
Non ci sono cariche accumulate sul condensatore e quindi attraverso la
resistenza non passa nessuna carica.

Si chiude il circuito. Attraverso il generatore di

corrente si genera un onda quadra. It è la corrente
totale generata dal generatore. Questa corrente
circola dal + al – e può seguire due vie, la via del
condensatore e la via della resistenza. La corrente si
distribuisce seguendo la via che oppone meno
resistenza al passaggio delle cariche: la resistenza
ohmica è costante mentre la resistenza del condensatore cambia via via che le cariche si accumulano.
Perciò inizialmente il condensatore non oppone alcuna resistenza al passaggio delle cariche e quindi la
corrente passa tutta per questa via (IC è la corrente che passa attraverso il condensatore), poi via via che le
cariche si accumulano sul condensatore si genera una forza elettromotrice che si oppone al passaggio delle
cariche: la corrente che passa dal condensatore si riduce progressivamente nel tempo e inizia a passare
attraverso la resistenza. IR è la corrente attraverso la resistenza.

Quando il condensatore è completamente

carico tutta la corrente fluisce attraverso la
resistenza.
Questa situazione rimane costante fino a
che il circuito rimane chiuso.

Quando il circuito viene aperto, il

condensatore si scarica sulla resistenza.
Come cambia il potenziale di membrana? Come abbiamo detto la membrana plasmatica può essere
assimilata ad un circuito RC. Si applica una corrente Im che passa attraverso la membrana e che si
distribuisce sul condensatore e sulla resistenza. Inizialmente tutta la corrente passa dal condensatore e poi,
proprio come nel circuito RC, inizia a passare anche nella resistenza. Le correnti che passano attraverso la
resistenza e attraverso il condensatore possono essere espresse, secondo la loro legge fisica, come:

La corrente che attraversa il condensatore dipende dalla differenza di potenziale che esiste sulle due
armature secondo una costante che è la capacità di membrana. La corrente che attraversa il condensatore
è 0 quando la differenza di potenziale rimane costante e in questa condizione tutta la corrente passa
attraverso la resistenza.
La corrente di membrana è una costante in quanto viene stabilita dallo sperimentatore sul generatore.

Questa è un’equazione differenziale la cui soluzione, integrando tra V0 e Vf è

dove ovvero una costante di tempo che esprime il tempo necessario affinché la variazione del
potenziale di membrana, che si ottiene facendo passare la corrente, abbia raggiunto il 63% del suo valore
finale.

Il valore del potenziale di membrana al tempo 0 è:

Il valore del potenziale ad un tempo infinito è:

Il valore del potenziale di membrana ad un tempo :

In sintesi ci dice quanto velocemente cambia il potenziale di

membrana quando si applica una corrente e quindi permette di capire
quanto velocemente la membrana è capace di rispondere a variazioni di
corrente.
La cellula nervosa

Le cellule nervose sono le cellule eccitabili per eccellenza.

I neuroni sono le unità strutturali e funzionali del sistema nervoso e hanno la funzione principale di
permettere il passaggio dell’informazione dal cervello alla periferia e viceversa. In questo modo possono
ricevere informazioni dall’ambiente esterno e formulare risposte per eventuali variazioni dell’ambiente.
L’informazione che i neuroni trasportano viene trasportata sia sottoforma di segnali elettrici passivi, sia
come potenziali d’azione. Questi segnali elettrici si realizzano in porzioni diverse del neurone: esso infatti è
una cellula che presenta un’elevata specializzazione funzionale.
Il neurone in figura ha la forma tipica di un motoneurone, ma può
essere comunque utilizzato per vedere la specializzazione funzionale
delle cellule nervose. Nel neurone si distingue la parte del soma in cui
sono contenuti il nucleo e gli organuli e che ha la funzione di ricevere
gli imput da altre cellule nervose e dagli organi di senso. Il soma
presenta numerose ramificazioni: una molto allungata che è l’assone e
altre con lunghezze minori che sono i dendriti. I dendriti, come il soma,
hanno la funzione di ricevere gli imput da altre cellule nervose per cui,
nell’insieme, le membrane che avvolgono i dendriti e la membrana che
avvolge il soma svolgono una funzione di integrazione delle
informazioni che provengono dalle altre cellule nervose.
L’assone ha la funzione di conduzione dell’impulso cioè di propagare
in maniera estremamente rapida l’informazione dal soma e dai dendriti
verso un’altra cellula nervosa. La propagazione dell’informazione lungo
l’assone avviene attraverso potenziali d’azione che si autopropagano.

Come abbiamo già detto, l’informazione a livello del sistema nervoso

viene trasmessa o come segnali passivi o come potenziali d’azione. A
livello del soma e dei dendriti, i segnali elettrici che giungono dalle
cellule vicine sono segnali elettrici graduali e locali. Questi segnali
possono essere originati da uno stimolo esterno che determina la
generazione dei segnali elettrici a livello dei dendriti e del soma di un
neurone sensoriale. Questi segnali vengono integrati e, se la loro somma
dà un segnale elettrico sufficientemente grande, questo segnale
elettrico è in grado di determinare a livello di una porzione del neurone,
detta segmento iniziale (o monticolo assonico o zona di inizio dello
spike o colletto assonico), una serie di potenziali d’azione che si
possono autopropagare.
Se in seguito all’integrazione il segnale fosse troppo piccolo per dare
origine ad una serie di potenziali d’azione, l’informazione non verrebbe
propagata.
L’assone si sfiocca in numerose terminazioni che a loro volta prendono
contatto con altri neuroni: la trasmissione dell’informazione a livello del
punto di contatto tra l’assone di un neurone e i dendriti e il soma del
neurone successivo avviene, per la maggior parte dei casi, attraverso un
segnale chimico. Le terminazioni assoniche liberano, attraverso il
processo di neurosecrezione, un neurotrasmettitore che è in grado di determinare, a livello dei dendriti e
del soma del neurone successivo, segnali elettrici graduali che si sommano a risposte graduali provenienti
da altri neuroni e possono dare origine ad un’altra serie di potenziali d’azione che si propagano lungo
l’assone. Le zone di contatto tra terminazioni assoniche e membrana dei dendriti e del soma sono le
sinapsi. La membrana del terminale assonico viene detta membrana pre-sinaptica e la membrana dei
dendriti e del soma è detta membrana post-sinaptica.
Quindi la trasmissione delle informazioni nel sistema nervoso avviene tramite l’alternanza di risposte
graduali, potenziali d’azione e segnali chimici.

Stimolazione nervosa

Fino ad ora abbiamo visto la via fisiologica attraverso cui si generano potenziali d’azione, ma per studiarne
le caratteristiche si isola un assone e si osserva cosa accade in esso quando ci si fa passare una corrente.
Sperimentalmente si genera all’interno della cellula un segnale graduale che possa poi determinare
l’insorgenza di un potenziale d’azione. Si parla di stimolazione nervosa proprio perché si agisce su una
cellula eccitabile, stimolandola a dare una risposta attiva.
Il sistema per stimolare una cellula eccitabile è quello visto in precedenza ovvero si fa passare una corrente
attraverso la membrana che crea una perturbazione elettrica, un segnale locale e si registrano le variazioni
del potenziale di membrana. Quando si stimola una cellula, l’elettrodo di stimolazione può essere reso più
o meno positivo rispetto al citosol e quindi si può far passare una corrente iperpolarizzante che determina
un aumento della differenza di potenziale o una corrente depolarizzante che determina una diminuzione
della differenza di potenziale.
Una corrente in ingresso è iperpolarizzante perché vengono aggiunte cariche positive all’esterno della
membrana e quindi si aumenta la separazione di cariche a livello del condensatore. Quando la corrente che
passa attraverso il condensatore diventa 0, la corrente continua a fluire attraverso i canali e mantiene il
potenziale al nuovo valore. Se la corrente fluisse in direzione opposta, cariche positive verrebbero aggiunte
al condensatore dall’interno e la differenza di potenziale diminuirebbe perché la carica del condensatore
diminuirebbe e la corrente fluirebbe attraverso la resistenza e continuerebbe a mantenere la membrana
depolarizzata.
Corrente in ingresso iperpolarizzante
Corrente in uscitadepolarizzante

Cosa accade nella cellula quando si applicano correnti iperpolarizzanti e depolarizzanti?

Attraverso l’elettrodo di stimolazione si
genera un’onda quadra di corrente
iperpolarizzante. All’inizio dell’esperimento
sia l’elettrodo di stimolazione che quello di
registrazione sono fuori dalla cellula perciò il
microelettrodo di registrazione registra una
differenza di potenziale pari a 0. I “baffettini”
che si registrano in corrispondenza dello step
on e dello step off della corrente sono degli artefatti dello stimolo che vengono registrati perché ci sono
delle resistenze parassite.
Poi si fa passare l’elettrodo di registrazione attraverso la membrana: si registra il potenziale di riposo (-90
mV).
A questo punto si fa passare il microelettrodo di stimolazione attraverso la membrana e quindi si fa passare
attraverso la membrana una corrente iperpolarizzante:si osserva una risposta passiva e infatti la membrana
subisce un cambiamento di potenziale che ha un andamento esponenziale fino al raggiungimento del
valore di stato stazionario. Se aumenta l’intensità della corrente, aumenta l’intensità della risposta.

Attraverso l’elettrodo di stimolazione si

genera un’onda quadra depolarizzante. Si
vede che per un’intensità abbastanza piccola
la risposta è speculare all’iperpolarizzazione.
Se si aumenta l’intensità della stimolazione
si osserva una risposta che comincia ad
allontanarsi dalla risposta passiva (ha una
durata più lunga).
Se si aumenta ancora l’intensità, la
differenza dalla risposta passiva si accentua e addirittura la forma della risposta può essere completamente
scollegata dalla forma dell’onda quadra di corrente utilizzata per generare la variazione di potenziale: si è
generato il potenziale d’azione. Il potenziale d’azione è un’inversione transitoria del potenziale di
membrana che raggiunge valori positivi (intorno a +30mV).
Se l’intensità è ancora più grande si osserva un potenziale d’azione che ha esattamente la stessa ampiezza
di quella ottenuta con l’intensità più piccola: la risposta del potenziale d’azione, una volta superato un
valore critico del potenziale di membrana, è completamente indipendente dall’intensità dello stimolo.

Il potenziale di membrana oltre al quale si ha la nascita del potenziale d’azione viene detto potenziale
soglia e la corrente necessaria a raggiungere il potenziale soglia è detta corrente soglia.
Il potenziale d’azione è una risposta tutto o nulla e infatti correnti al di sopra della soglia danno origine a
potenziali d’azione tutti uguali mentre correnti al di sotto della soglia non danno origine a potenziali
d’azione.
Di norma ci vuole una depolarizzazione compresa tra 15mV e 25mV per poter superare la soglia.
Ogni cellula eccitabile ha la sua soglia di potenziale.

[Lezione 13- 19/04]

Nel potenziale d’azione si distinguono:

-una fase di salita, detta anche upstroke, che è estremamente
rapida (poche centinaia di microsecondi).
-il picco del potenziale che è il massimo di potenziale che viene
raggiunto durante la fase transitoria (in figura è intorno ai
+50mV)
- un’eccedenza o overshoot che è la porzione che è al di sopra
dello 0.
-una fase di discesa che è la fase di ripolarizzazione della
membrana durante la quale il valore del potenziale di
membrana torna ad essere quello di riposo. Anche questa fase
è molto rapida.
- una fase di iperpolarizzazione postuma. Di solito il potenziale
di membrana non torna subito ad essere quello di riposo, ma è
preceduto da questa fase durante la quale il potenziale di
membrana è leggermente più negativo del potenziale di riposo.
Come già detto, il potenziale d’azione è
un evento tutto o nulla che è capace di
auto propagarsi (propagarsi lungo
l’assone sempre uguale a se stesso).
Questa caratteristica è mostrata nella
figura accanto in cui è rappresentato un
assone dentro al quale è posto un
elettrodo di stimolazione. L’elettrodo di
riferimento è messo molto lontano
dall’elettrodo di stimolazione. Si osserva
che quando l’elettrodo di registrazione
penetra nella membrana si ha la
registrazione del potenziale di riposo. Se
si danno iperpolarizzazioni della
membrana si vedono soltanto gli artefatti dello stimolo e la risposta passiva. Se invece si depolarizza e si
raggiunge la soglia si osserva un potenziale d’azione sempre della stessa ampiezza. Si vede quindi come il
potenziale d’azione sia capace di propagarsi dal punto in cui si origina, lungo tutto l’assone.

Caratteristiche dell’eccitabilità

1)Relazione intensità-durata.
Mette in relazione l’intensità della corrente soglia con la durata dello stimolo. La corrente soglia cambia a
seconda della seguente relazione iperbolica:

Per avere il potenziale d’azione se la durata dello stimolo è più corta, l’intensità deve essere più grande.
C’è un livello minimo di intensità che si deve necessariamente fornire per superare la soglia e questo valore
è chiamato reobase.
Viene definita cronassia la durata di uno stimolo soglia che abbia intensità pari al doppio della reobase.

La relazione intensità-durata è una conseguenza diretta della presenza di un circuito RC a livello della
membrana.
Le onde quadre di corrente evocano una risposta passiva e in questa risposta si può identificare una
costante di tempo che indica il tempo al quale viene raggiunto il 63% del cambiamento di potenziale. La
costante è una proprietà della membrana perciò se si fornisse uno stimolo di uguale durata ma di
intensità maggiore si avrebbe una depolarizzazione più grande, ma sempre con la stessa costante di tempo.
Se l’intensità è molto alta, si può ridurre la durata dello stimolo perché si raggiunge prima il valore soglia.

Nella figura viene riportata l’intensità come rapporto dell’intensità dello stimolo sulla reobase (intensità 1,2
o 3 volte più grande della reobase) e quindi l’intensità vera e propria è rappresentata dai punti sperimentali
e dalla curva. Sull’asse delle ascisse c’è il tempo che è espresso come multiplo della costante di tempo .
Viene riportato il valore della corrente soglia che è la linea tratteggiata spessa.
Le curve continue rappresentano come varia il potenziale di membrana quando si fanno passare attraverso
la membrana impulsi di corrente che sono rappresentati dalle linee tratteggiate sottili.
Ad esempio se se si ha un’intensità pari a 3 volte l’intensità soglia, lo stimolo che bisogna fornire è pari a
quello del primo rettangolino.
Da questo grafico si vede bene quanto affermato prima ovvero che se l’intensità è molto alta, il valore
soglia viene raggiunto prima e perciò si può ridurre la durata dello stimolo.

2)Accomodazione.
Il valore del potenziale soglia dipende anche dalla storia della membrana precedente al momento in cui
viene dato lo stimolo. Se viene applicato uno stimolo ad un assone che è stato mantenuto quiescente per
un certo periodo di tempo, si troverà sempre lo stesso valore soglia. Se invece la stimolazione che supera la
soglia è preceduta da una fase di depolarizzazione o iperpolarizzazione della membrana, la soglia cambia.
Nella figura la linea tratteggiata rappresenta la soglia per la nascita del
potenziale d’azione e la linea continua rappresenta il valore del potenziale
di membrana.
Nel primo alla membrana è stato applicato uno stimolo depolarizzante
sotto soglia perciò il valore del potenziale è cambiato e con esso il valore
della soglia. L’intensità necessaria per avere la nascita di un potenziale
d’azione aumenta.
Nel secondo caso alla membrana è stato applicato uno stimolo
iperpolarizzante e questo porta ad un abbassamento della soglia.
Nel terzo caso si vede che, se si iperpolarizza molto, la soglia di eccitabilità
si abbassa moltissimo. In questa situazione la traccia che rappresenta la
soglia e la traccia che rappresenta il potenziale si incrociano: se si
mantiene la membrana iperpolarizzata per un tempo lungo, quando si riporta la membrana ad un valore di
riposo, si supera la soglia per la nascita del potenziale d’azione.

Il fenomeno dell’accomodazione è quello per cui, quando si vuole stimolare una cellula eccitabile, si deve
usare un’onda quadra di corrente. Questo perché nell’onda quadra la depolarizzazione avviene in maniera
così rapida che non evoca alcun fenomeno di accomodazione. Se venissero, ad esempio, fornite onde a
dente di sega bisognerebbe stare particolarmente attenti a usare una pendenza sufficientemente rapida.

La linea blu rappresenta come cambia il livello di soglia con depolarizzazioni mantenute nel tempo. Se si fa
una depolarizzazione sufficientemente rapida (come quella in a, b e c) si riesce a raggiungere la soglia.
Ovviamente tra a e b lo stimolo che devo applicare è diverso perché la depolarizzazione in b è stata più
lenta e perciò è necessario applicare uno stimolo più intenso per raggiungere la soglia. Lo stesso vale per c.
Se la depolarizzazione è eccessivamente lenta, come in d, la soglia aumenta più rapidamente di quanto il
potenziale di membrana cresca e perciò la soglia non viene raggiunta.

3)Refrattarietà.
Gli stimoli possono essere dati con una certa frequenza. La frequenza a cui si può dare una stimolazione è
limitata dal periodo refrattario. Se uno stimolo è troppo vicino ad un altro, quindi la frequenza degli stimoli
è maggiore, si vede che ad un certo punto l’ampiezza del potenziale inizia a ridursi fino a scomparire
completamente. Per lo stesso motivo non si può dare uno
stimolo al picco del potenziale d’azione perché non
provocherebbe nessuna variazione in quanto non esiste un
effetto sommatorio degli stimoli.
Se però, nel periodo in cui non si possono evocare stimoli, viene
fornito uno stimolo più grande di quelli precedenti, si può
evocare un potenziale d’azione di ampiezza inferiore al primo
stimolo.

Esiste un periodo di tempo dall’insorgenza del potenziale

d’azione in cui la membrana cellulare è completamente
refrattaria a qualsiasi intensità dello stimolo: questo periodo,
che solitamente è di pochi millisecondi, è detto periodo
refrattario assoluto. Il periodo refrattario assoluto è un periodo di tempo, dopo uno stimolo che ha
evocato il potenziale d’azione, durante il quale qualsiasi intensità non
riesce ad evocare un potenziale d’azione.
Dopo il periodo refrattario assoluto la membrana comincia ad
acquistare le sue caratteristiche di riposo per cui, se viene aumentata
l’intensità dello stimolo si può ottenere un potenziale d’azione.
L’intensità necessaria a superare la soglia è molto alta subito dopo il
periodo refrattario assoluto e poi decresce progressivamente fino a
tornare quella di riposo.
Il periodo durante il quale per avere una risposta attiva bisogna
aumentare l’intensità dello stimolo è detto periodo refrattario
relativo.

L’esistenza del periodo refrattario ci dice che durate il potanziale d’azione si ha un cambiamento delle
proprietà della membrana. Le proprietà della membrana vengono recuperate dopo che il potenziale
d’azione è finito, ma ci vuole del tempo affinché vengano recuperate completamente.

Basi ioniche del potenziale d’azione

La maggior parte degli esperimenti che hanno portato a capire le basi ioniche del potenziale d’azione sono
stati fatti sugli assoni giganti del calamaro.
Inizialmente si pensava che durante il potenziale d’azione ci fosse un aumento generalizzato della
permeabilità della membrana a tutti gli ioni perché si notava che la resistenza della membrana cadeva
moltissimo. Però se ci fosse stato un aumento generalizzato della permeabilità, il potenziale di membrana
avrebbe raggiunto soltanto valori pari a 0 perché non sarebbe esistita più differenza di potenziale. In realtà
durante il potenziale d’azione si registra un potenziale di membrana positivo (+40mV). Perciò si
considerarono tutti gli ioni positivi che potevano attraversare la membrana e i loro relativi potenziali di
equilibrio e si osservò che l’unico ione che poteva essere implicato nella crescita del potenziale d’azione è il
Na. Il Na ha infatti potenziale di equilibrio di +60mV. Perciò si ipotizzò che durante il potenziale d’azione ci
fosse un aumento repentino della condutanza della membrana al Na. Se la conduttanza al Na aumenta il
potenziale di membrana si sposta verso il potenziale di equilibrio del Na secondo la seguente relazione:

Se il potenziale di membrana si sposta verso il potenziale di equilibrio del Na.

Esperimento. Per validare l’ipotesi che fosse proprio il Na il responsabile dell’aumento del potenziale, si
fecero esperimenti in cui si cambiava il potenziale di equilibrio del Na. Se si cambia il potenziale di equilibrio
del Na, ed è vero che durante il potenziale d’azione cambia, allora si vede che il picco del potenziale
d’azione cambia in funzione del nuovo potenziale di equilibrio del Na.

L’ipotesi dell’esperimento è quindi che i +40mV derivino dal fatto che

Per cambiare il potenziale di equilibrio del Na, si cambia la sua concentrazione extracellulare. Infatti il
potenziale di equilibrio del Na è definito dall’equazione di Nernst:
Se il potenziale di equilibrio del Na viene abbassato, ci si aspetta che il +40mV si riduca.
In questi esperimenti, fatti da Hodgkin, veniva registrato il
potenziale d’azione in condizioni di controllo (traccia 1) e poi veniva
registrato il potenziale d’azione dopo che la concentrazione
extracellulare di Na veniva ridotta (traccia 2).

Si osserva che la riduzione della concentrazione extracellulare

riduce l’ampiezza del potenziale d’azione.
Si sostituisce parte del Na con il destrosio perché questo non
permea la membrana e quindi permette di mantenere inalterato il
volume cellulare.
La traccia 3 rappresenta il ritorno nelle condizioni di controllo.

Questo esperimento ha quindi portato alla formulazione della teoria del Na secondo la quale il Na è il
responsabile della fase di salita del potenziale d’azione.
La teoria del Na portò Hodgkin a ipotizzare quello che presumibilmente accade durante il potenziale
d’azione. Questa ipotesi è nota come ciclo di Hodgkin.
Il ciclo di Hodgkin prevede che in seguito alla depolarizzazione si abbia un aumento della conduttanza della
membrana al Na e questo aumento della permeabilità fa sì che si abbia un ingresso di Na nella cellula (si ha
ingresso perché il Na segue il suo gradiente elettrochimico) che promuove un’ulteriore depolarizzazione
della membrana e quindi un ulteriore aumento della conduttanza al Na.

Hodgkin in pratica ipotizzò l’esistenza di un feedback positivo che è in grado di spiegare quello che accade
durante la fase di salita del potenziale d’azione.
Hodgkin ipotizzò che la depolarizzazione della membrana non solo aumenta la conduttanza al Na, ma
aumenta anche la conduttanza al K. Solo che se si ha un aumento della conduttanza al K, questo tende ad
uscire dalla cellula. L’uscita del K determina una ripolarizzazione della membrana. Quindi Hodgkin ipotizzò
anche l’esistenza di un feedback negativo per la conduttanza al K.
L’aumento della conduttanza del K avviene con una cinetica più lenta rispetto all’aumento della
conduttanza al Na.

Questa ipotesi fu convalidata inizialmente da misure dei flussi radioattivi di Na e di K durante il potenziale
d’azione. È stato messo in evidenza che effettivamente durante il potenziale d’azione si ha ingresso di Na e
uscita di K e i due flussi si eguagliano.
La misura dei flussi radioattivi non permette di capire qual è la cinetica con cui questi flussi avvengono
perciò sono stati necessari esperimenti mirati per capire questi fenomeni.
L’ipotesi di Hodgkin implica una modifica del circuito equivalente della membrana perché durante il
potenziale d’azione la conduttanza al K e la conduttanza al Na cambiano perciò gli elementi passivi
responsabili del potenziale di riposo vengono racchiusi tutti dal generatore EL. Questa parte di circuito è
caratterizzata da conduttanze costanti, indipendenti dal voltaggio. Vengono inoltre aggiunti due rami, uno
per la batteria del Na e uno per la batteria del K, che sono connessi con conduttanze variabili in funzione
del potenziale di membrana.

In un circuito di questo tipo si può stabilire qual è la corrente che attraversa la membrana che è una
corrente che è data dalla somma delle correnti che attraversa i due rami con la corrente che attraversa il
condensatore.

La corrente IL dovuta agli elementi passivi viene detta corrente di leakage e dipende esclusivamente dal
valore del potenziale di membrana in quanto ha una conduttanza costante.

Aver considerato la membrana come questo circuito ha permesso di fare degli esperimenti grazie ai quali si
può stabilire come variano le conduttanze della membrana agli ioni K e agli ioni Na a vari potenziali di
membrana e a vari tempi. In questo modo si può risalire a cosa accade durante il potenziale d’azione.
Durante la fase di salita del potenziale d’azione si ha un’inversione del potenziale di membrana e quindi la
conduttanza del Na e la conduttanza del K cambiano. Per capire come cambiano si può sezonare il
fenomeno ed andare a vedere come varia la conduttanza ai due ioni a vari potenziali di membrana. Questo
si può fare solo se si blocca il potenziale di membrana al valore di potenziale che interessa e si va a studiare
soltanto le correnti ioniche, senza avere le influenze dovute alla corrente capacitiva. Se si misura una
corrente ad un determinato valore di potenziale, si può stabilire il valore della conduttanza

Per poter misurare solo le correnti ioniche, bisogna mettersi nelle condizioni di eliminare le componenti
capacitive del circuito e perciò bisogna essere nella condizione in cui

Questo si può fare bloccando il potenziale di membrana ad un determinato valore.

Questa situazione è stata ottenuta da Hodgkin con la tecnica del blocco del voltaggio che consiste nel
mantenere il potenziale di membrana costante ad un valore predefinito scelto dallo sperimentatore. In
pratica diventa possibile depolarizzare la membrana e mantenere la depolarizzazione per un tempo
prestabilito. Quando si depolarizza la membrana si genera una corrente che la attraversa: per mantenere
costante il potenziale di membrana è stato messo a punto un circuito elettronico che fa passare attraverso
la membrana una corrente che è esattamente uguale e opposta a quella che la membrana genererebbe e
che perciò annulla la corrente generata dalla membrana stessa.

In figura è rappresentato lo schema del blocco del voltaggio.

Nell’assone sono inseriti degli elettrodi attraverso i quali viene
fatta passare corrente e degli elettrodi che servono per
registrare il potenziale.
Il sistema è basato su un feedback negativo: esiste un
elettrodo che permette di registrare il potenziale di membrana
per poterlo confrontare con un potenziale di comando
stabilito dallo sperimentatore. Se viene messo un potenziale di
comando diverso dal potenziale di riposo, quando si
confrontano il potenziale di membrana (che è quello di riposo)
con quello di comando, viene registrato un segnale d’errore.
Questa differenza di potenziale viene utilizzata per generare
una corrente che fa sì che il potenziale di membrana sia uguale
al potenziale di comando.
Esempio 1

In figura si ha un assone gigante di calamaro immerso in una soluzione salina. Nell’assone viene inserito un
elettrodo di registrazione, mentre nella soluzione salina è immerso un elettrodo di riferimento: così è
possibile registrare la differenza di potenziale ai due lati della membrana. Il potenziale registrato viene
confrontato con un potenziale di comando prescelto dallo sperimentatore per vedere quant’è la corrente
che attraversa la membrana a quel determinato potenziale. Il segnale viene utilizzato per alimentare un
sistema che permette di iniettare nella cellula una corrente che permette di mantenere il potenziale di
membrana uguale al potenziale di comando. Tutto questo deve essere fatto in maniera estremanente
rapida.

Esempio 2

Quando si mette come potenziale di comando un potenziale maggiore del potenziale di riposo, ma minore
del potenziale soglia. Si ha una depolarizzazione molto piccola che, se non ci fosse il blocco del voltaggio,
porterebbe ad una depolarizzazione sotto soglia della membrana e una corrente inferiore alla corrente
soglia.

Il potenziale di membrana viene portato da -60mV a -50mV e si osserva una corrente capacitiva in uscita
che cambia istantaneamente le cariche sul condensatore. Continua a passare corrente perché per
mantenere la separazione delle cariche ci deve essere una corrente che passa attraverso la resistenza (non
si ha più passaggio di cariche attraverso il condensatore perché una volta arrivati a -50mV non si ha più
differenza di potenziale). Tutte le correnti che si vedono quando non esiste differenza di potenziale sono
correnti ioniche, che attraversano i canali di membrana. Questa è una risposta puramente passiva. La
corrente dovuta ai canali passivi, che quindi attraversa principalmente i canali del K (perché sono i maggior
numero), è detta corrente di fondo o corrente di leakage perché non dipende né dal voltaggio né dal
tempo.
Quando il potenziale di membrana viene riportato al valore di riposo, sul condensatore la carica passa da
-50mV a -60mV e perciò si ha una corrente capacitiva in entrata. A questo punto, essendo ad un potenziale
di riposo, non è più necessaria una corrente per mantenere questo potenziale.

[Lezione 14- 26/04]

Esempio 3

Quando si blocca il potenziale di membrana ad un valore sopra la soglia, ad esempio si fa passare da -65mV
a 0mV, si osserva una risposta completamente diversa da quella che ci si aspetterebbe se la conduttanza
della membrana fosse costante.

In questa risposta si distinguono diverse fasi:

-una prima fase, che è l’unica in comune con quella dell’esempio precedente, in cui si ha la corrente
capacitiva in uscita.
-una seconda fase in cui si ha una corrente ionica in ingresso (picco verso il basso) che aumenta. Aumenta
anche se va verso valori negativi perché comunque passa 0 ad attraversare la membrana.
-una terza fase in cui la corrente ionica, dopo essere diminuita nuovamente, si inverte e diventa una
corrente in uscita per poi raggiungere un valore stazionario.

La corrente iniziale prende il nome di corrente transitoria in ingresso, mentre la corrente finale viene detta
corrente ritardata in uscita.

Si può analizzare a questo punto l’esperimento svolto da Hodgkin e Huxley. Loro applicarono un gradino di
potenziale di 56mV a partire da un potenziale di membrana di -65mV e quindi la membrana veniva portata
a -9mV. Si registrano sempre una corrente capacitiva, una corrente transitoria in ingresso e una corrente
 ritardata in uscita.
La corrente capacitiva ha durata di 20-50µs che è il tempo
necessario per cambiare la distribuzione delle cariche sul
condensatore. Rimane un piccolo dislivello rispetto alla
corrente capacitativa che è la corrente di leakage.
Poi si ha la corrente transitoria in ingresso che è una
corrente trasportata dagli ioni Na. È caratterizzata da una
prima fase in cui aumenta molto rapidamente (il picco viene
raggiunto in circa 50µs) e poi da una fase in cui decade e
torna a 0. Questa corrente torna a 0 anche se la membrana è
ancora depolarizzata a -9mV. Quindi la corrente precoce è
caratterizzata da una fase in cui la corrente si attiva, seguita
da una fase in cui la corrente si inattiva.
Infine si ha una corrente tardiva che durante la
depolarizzazione sale sempre, fino a raggiungere un valore
di plateau. Questa corrente è una corrente in uscita
trasportata dagli ioni K.
L’attivazione della corrente del Na è estremamente più
rapida dell’attivazione della corrente del K.

Identificazione delle correnti iniziale e ritardata

L’aumento della conduttanza della membrana al Na determina nella membrana un aumento della corrente
trasportata dal Na che dipende, secondo la legge di Ohm da

dove Vm è il potenziale a cui la membrana viene bloccata.

La corrente iniziale, che si vede non appena la membrana viene depolarizzata, presumibilmente è una
corrente di Na. Per verificare che questa corrente è trasportata degli ioni Na si pensa al circuito RC a cui è
paragonabile la membrana e si sa che la corrente del Na dipende dalla presenza di una conduttanza al Na
diversa da 0 e dipende da un gradiente elettrochimico che spinge il Na ad entrare. La conduttanza al Na non
può essere variata dallo sperimentatore, ma si può agire sul potenziale Vm: tra i potenziali a cui si blocca la
membrana, si può presumere di trovare un potenziale che è uguale al potenziale di equilibrio del Na.

In queste condizioni non si ha flusso di Na attraverso la membrana.

Bisogna verificare se la corrente è effettivamante la corrente iniziale. Se è vero questa corrente cambia
in base al potenziale e si annulla quando il potenziale di membrana è uguale al potenziale di equilibrio del
Na.
Esperimento. La membrana viene bloccata a valori di potenziale diversi e per ogni potenziale viene
registrata la corrente che si genera. Si osserva che quando il potenziale di membrana viene portato a
+52mV la corrente precoce in ingresso scompare e rimane solo una corrente in uscita. Infatti +52mV è un
valore del tutto compatibile con il potenziale di equilibrio del Na. La corrente in ingresso quindi si annulla al
potenziale di equilibrio del Na e questo conferma che la corrente iniziale è trasportata dagli ioni Na.
Dall’esperimento si vede anche che se si blocca il potenziale di membrana ad un potenziale più positivo del
potenziale di equilibrio del Na, la corrente iniziale è una corrente in uscita: anche questo conferma l’ipotesi
perché il gradiente elettrochimico con ha valore positivo e perciò il Na tende ad
uscire dalla cellula e la corrente precoce è una corrente in uscita.

Il potenziale di equilibrio del Na viene detto anche potenziale di inversione del canale del Na o potenziale
di inversione della conduttanza del Na. Questo perché per valori al di sopra del potenziale di inversione e
per valori subito al di sotto del potenziale di inversione, la corrente passa la membrana con direzione
opposta.
Il potenziale di inversione è quindi quel potenziale in corrispondenza del quale la corrente è 0, ma al di
sopra del quale la corrente è in uscita e al di sotto del quale la corrente è in ingresso.

Esperimento. Se si rimuove il Na dall’ambiente extracellulare deve accadere qualcosa alla corrente. La

corrente diventa una corente in uscita perché il Na all’interno della cellula non può essere rimosso.
In questo esperimento quindi è stata misurata la corrente di membrana e sono stati visti gli effetti che ha la
riduzione della concentrazione extracellulare
di Na sulla suddetta corrente.
Si vede che:
- se la concentrazione extracellulare di Na è
quella fisiologica (460mM) si registra una
corrente in ingresso transitoria seguita da una
corrente in uscita.
- se si rimuove il Na dall’ambiente
extracellulare non si osserva più corrente in
ingresso. Il Na in questo caso genera corrente
in uscita perché passa dall’ambiente
intracellulare dove è più concentrato,
all’ambiente extracellulare dove è inesistente.
- se si riporta il Na ai valori fisiologici si vede
comparire nuovamente la corrente in
ingresso.
Anche per il K è valida la relazione

però in questo caso non si può fare lo stesso esperimento fatto per il Na perché bisogna tener conto del
fatto che il potenziale di equilibrio del K ha un valore più negativo del potenziale di membrana (circa -95
mV). Questo significherebbe che il potenziale di membrana andrebbe bloccato a -95mV, ma la
iperpolarizzazione non attiva i canali voltaggio-dipendenti e perciò si vedrebbe soltanto una risposta
passiva. Per questo motivo non si può applicare la stessa procedura del Na per il K. Quindi per il K si può
solo dire che se la corrente in ingresso è dovuta al Na e durante gli esperimenti però era stato dimostrato
anche un aumento della conduttività al K, allora la corrente tardiva deve essere attribuita al K.

Con questi esperimenti quindi si sono verificati quali sono gli ioni responsabili del trasporto delle correnti
precoce e tardiva e perciò è adesso necessario vedere per ogni potenziale di blocco qual è la corrente del
Na e qual è la corrente del K. Avendo queste informazioni ci si può ricavare come variano a seconda del
potenziale la conduttanza al Na e la conduttanza al K e come variano le conduttanze in funzione del tempo.
Il problema a questo punto era quello di separare le due correnti.

Separazione delle correnti iniziale e ritardata

Hodgkin e Huxley trovarono il modo per separare le due correnti.

Si ha sempre il potenziale di membrana che viene portato da -65mV a -9mV: la risposta che si registra è
quella indicata con la lettera a.
Sempre tenendo conto che , Hodgkin e Huxley fanno in modo che
cambiando la concentrazione extracellulare del Na. Questo perché il potenziale di equilubrio del Na è dato
dall’equazione di Nernst:

Con l’equazione di Nernst ci si può quindi calcolare la quantità di Na extracellulare che serve affinchè
Se la corrente di Na è 0, quello che si registra applicando lo stesso gradino di depolarizzazione è la corrente
del K.
A questo punto si sottrae la traccia b dalla traccia a e quello che si ottiene è la corrente di Na che è
rappresentata dalla traccia c.
Questa procedura può essere ripetuta per qualsiasi potenziale di blocco, cambiando opportunamente il
valore della concentrazione extracellulare di Na.

Successivamente sono stati scoperti dei

farmaci che inibiscono in maniera selettiva
i canali del Na e i canali del K. Per isolare la
corrente del Na e/o la corrente del K è
sufficiente tratatre il preparato con il
farmaco. La tetrodotossina (TXT) inibisce
selettivamente i canali voltaggio-
dipendenti del Na e permette quindi di
individuare la corrente del K. Il
tetraetilammonio (TEA) inibisce i canali
voltaggio-dipendenti del K e quindi
permette di isolare la corrente del Na.

Andamento temporale della corrente del Na e della corrente del K

Nella figura sottostante sono riportate le forze che agiscono sugli ioni Na e K e che determinano il loro
passaggio attraverso la membrana e la direzione con cui gli ioni attraversano la membrana.

La freccia blu rappresenta la forza motrice chimica ed è una costante perché la forza chimica è la differenza
di concentrazione tra i due lati della membrana e questo valore si mantiene costante. È diversa per i due
ioni perché essi sono distribuiti in maniera diversa ai due lati della membrana (K tende ad uscire, Na tende
ad entrare)
La freccia rossa è la forza motrice elettrica che dipende dal valore del potenziale di membrana. È la stessa
per i due ioni perché entrambi sono ioni carichi positivamente e quindi risentono della differenza di
potenziale ai due lati della membrana nello stesso modo.
La freccia viola è la forza motrice netta che determina il passaggio degli ioni attraverso la membrana è la
somma algebrica tra la forza motrice elettrica e la forza motrice chimica. La forza motrice netta per il K, per
i valori di potenziale presi in considerazione, è sempre diretta verso l’esterno e aumenta via via che la
membrana viene depolarizzata. La forza motrice netta per il Na è una forza che tende a spostare lo ione
verso l’interno. È una forza che è maggiore a valori negativi del potenziale e si riduce via via che il
potenziale aumenta e, quando si supera il potenziale di equilibrio del Na, si inverte e lo ione tende ad
uscire. La forza motrice netta è quindi il gradiente elettrochimico.

Queste registrazioni sono utilizzate

per costruire la relazione tra corrente
e potenziale di membrana. La
relazione corrente-potenziale è
quella riportata nel grafico a lato. Nel
caso del K sul grafico è riportato il
valore del plateau per ogni potenziale
di blocco, mentre per il Na vengono
riportati i valori di picco della
corrente raggiunto ad ogni
potenziale. Le due curve sono
diverse, l’unica cosa che hanno in
comune è che nessuna delle due è
lineare. Una relazione corrente-
voltaggio non lineare significa che la
pendenza della relazione, che
sarebbe il rapporto corrente-
voltaggio, cambia ai diversi potenziali.
Si sa che

quindi si può capire che si è di fronte

a canali che sono voltaggio-dipendenti.
Nelle fasi finali la relazione è praticamente lineare e questo significa che si sono aperti tutti i canali a
disposizione e l’unico fattore che determina la corrente è rappresentato dalla forza elettromotrice.

[Lezione 15- 27/04]

Dipendenza delle conduttanze del Na e del K dal tempo e dal potenziale di membrana

Hodgkin e Huxley, sulla base di registrazioni sulla corrente del Na e sulla corrente del K durante i gradini di
potenziale, costruirono le curve che rappresentano la conduttanza del Na e la conduttanza del K in funzione
del potenziale di membrana. Per la legge di Ohm:
Le due curve nella figura a sinistra rappresentano come varia la conduttanza dei due ioni ai vari potenziali di
membrana nel tempo. Per ogni potenziale di membrana si ha un andamento della conduttanza e questo
significa che la conduttanza varia non solo a seconda del potenziale, ma anche nel tempo. Le conduttanze
sono sempre positive.
La conduttanza del Na compare per potenziali di membrana al di sopra di -40mV e aumenta con
l’aumentare della depolarizzazione fino a raggiungere il plateau. Essa ha un andamento particolare perché
aumenta fino ad un valore di picco e poi diminuisce, tornando a 0. Questo significa che c’è un’attivazione
dei canali del Na e poi una loro inattivazione. La cinetica di attivazione/inattivazione è tanto più rapida
tanto più la membrana è depolarizzata.
La conduttanza del K aumenta con l’aumentare della depolarizzazione della membrana, raggiunge un valore
massimo ma, a differenza della conduttanza del Na, ha un andamento monotonico. La conduttanza a
questo ione si attiva con la depolarizzazione e, finchè la membrana è depolarizzata, essa rimane elevata.
Anche per il K la cinetica è tanto più rapida tanto più la membrana è depolarizzata. Questa cinetica è però
più lenta di quella del Na: il tempo necessario per il picco della conduttanza del Na è molto minore del
tempo necessario per raggiungere il valore massimo per la conduttanza del K.

Nel grafico a destra viene riportato il valore di picco della conduttanza al Na e il valore massimo della
conduttanza al K in funzione del potenziale di blocco di membrana. Si vede che i valori massimi delle due
conduttanze hanno la stessa dipendenza dal potenziale di membrana: le due curve sono pressochè
sovrapposte.

Cinetica di inattivazione

L’inattivazione è un processo che avviene al livello dei canali del Na. Non è l’inverso dell’attivazione infatti
attivazione e inattivazione sono due processi diversi che avvengono per modifiche della proteina del canale
del Na. L’inattivazione è la diminuzione della conduttanza fino al valore di riposo durante la
depolarizzazione.
L’inverso dell’attivazione viene detto deattivazione. La deattivazione è il ritorno al valore di riposo della
conduttanza, osservato in risposta alla ripolarizzazione della membrana. Questo processo si vede bene nel
canale del K: esso non presenta il fenomeno di inattivazione però, poiché si attiva, avrà anche un processo
di deattivazione.
Nel grafico sottostante si ha un gradino depolarizzante di 56mV che ha una duratadi circa 10ms. Dal tempo
0 al tempo 10ms quindi la membrana viene mantenuta depolarizzata a -9mV. Nel grafico è riportata la
conduttanza del K che aumenta, raggiunge il valore di plateau e si mantiene elevata per tutta la durata della
 depolarizzazione. Se a 6ms dall’inizio della
depolarizzazione si ripolarizza la membrana si
osserva che la conduttanza del K ritorna a 0: i
canali del K che si erano aperti in seguito alla
depolarizzazione si chiudono quando la
membrana viene ripolarizzata. L’andamento
temporale della caduta della conduttanza è
simile all’andamento temporale della salita e
questo permette di capire che i due processi
sono l’uno l’inverso dell’altro.
Nel caso del Na con la depolarizzazione si
raggiunge un picco di conduttanza in un tempo inferiore ad 1ms, dopodichè la conduttanza diminuisce e
torna a 0. L’andamento della diminuzione della conduttanza è molto più lento dell’andamento
dell’attivazione. Ci deve essere un processo che permette la chiusura dei canali che è diverso da quello che
ne ha causato l’apertura: è il processo di inattivazione.
Anche i canali del Na possono essere deattivati: se si ripolarizza la membrana il canale torna nella
conformazione che ha quando la membrana è al potenziale di riposo. La deattivazione si vede nei canali del
Na se si applica ripolarizzazione in un tempo in cui il processo di inattivazione, che è più lento, ancora non
c’è.

Il fenomeno di inattivazione del Na è stato studiato in dettaglio da esperimenti, fatti da Hodgkin e Huxley,
in cui veniva utilizzata una tecnica che consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore
costante (-16 mV) al quale si sa che la conduttanza del Na è attiva. Questo potenziale di -16mV veniva fatto
precedere da un altro gradino a cui il potenziale veniva mantenuto a valori diversi. Questo perché in tuti gli
esperimenti precedenti non si era mai tenuto conto dell’influenza del potenziale di membrana di partenza.
Gli sperimentatori volevano capire quanto il grado di depolarizzazione della membrana prima di attivare i
canali del Na può influenzare la conduttanza del Na. Poiché il potenziale di blocco è a -16mV, se non ci fosse
alcuna dipendenza dal potenziale precedente, si dovrebbe vedere sempre la stessa conduttanza.
Se da -60mV si passasse direttamente a -16mV, si
registrerebbe il bacchettino verticale. Se invece i -16
mV vengono fatti precedere da potenziali diversi per
un tempo lungo rispetto ai tempi di attivazione e
inattivazione dei canali del Na, si vedono risposte
diverse. Quando la membrana è iperpolarizzata la
corrente iniziale di Na è molto più grande della
corrente che si registrerebbe passando direttamente
da -60mV a -16mV: l’ampiezza della corrente di Na
non dipende solo dai -16mV, ma anche dal
potenziale che precede la depolarizzazione.
Quando la membrana è depolarizzata l’ampiezza
della corrente di Na si riduce e addirittura, quando si
depolarizza a -31mV, la risposta è 0 (non si ha più
corrente di Na).
Iperpolarizzando la membrana si rimuove
un’inattivazione dei canali che comunque è presente
anche al potenziale di riposo: quando da -60mV si passa a -16mV, non vengono aperti tutti i canali del Na
possibili perché una parte non può aprirsi in quanto si trova in uno stato inattivato che non è rimosso dalla
depolarizzazione.

Per avere una migliore interpretazione dei

risultati si riportano su un grafico. Viene quindi
riportata l’ampiezza della corrente in funzione
del potenziale che precede il gradino a -16mV.
Si vede che la corrente diminuisce a partire dal
valore massimo che ha in corrispondenza di
-100mV, valore a cui tutti i canali del Na sono
aperti. Se la membrana viene mantenuta a
potenziali minori di -100mV in modulo (-80mV,
-70mV…), la corrente del Na diminuisce e,
quando si ha un gradino condizionante di
-30mV si osserva la completa inattivazione di
tutti i canali del Na.
Quando si è al valore V0 che sarebbe il valore
del potenziale di riposo,la corrente del Na è
minore di quella massima, quindi si ha già una
parziale inattivazione della corrente. Si può a
questo punto cambiare la scala e fare due nuove scale. Una prima scala in cui si fa il rapporto tra la corrente
registrata ai vari potenziali e la corrente massima

e questo permette di capire la percentuale di canali del Na che sono attivabili.

Una seconda scala che è

e che permette di trovare il grado di inattivazione dei canali.

L’inattivazione dei canali del Na è alla base dei fenomeni di accomodazione e refrattarietà. Nel caso
dell’accomodazione la soglia aumenta perché, mantenendo la membrana depolarizzata, si inattiva una
parte dei canali del Na e quindi, per determinare il superamento della soglia è necessaria una corrente più
grande. La soglia si abbassa con l’iperpolarizzazione perché ci sono più canali del Na attivabili.
Nel caso della refrattarietà si ha che dopo la depolarizzazione i canali del Na sono inattivati e quindi non si
può evocare un secondo potenziale d’azione perché, anche se si avessero i canali deattivati e quindi
l’attivazione potrebbe avvenire, si ha l’inattivazione che chiude il canale. Mantenendo il potenziale di
membrana al potenziale di riposo, il fenomeno dell’inattivazione scompare e si ha il ripristino della normale
soglia.

Hodgkin e Huxley, conoscendo la dipendenza della conduttanza dal tempo e dal potenziale di membrana,
furono in grado di scrivere le seguenti relazioni:
Queste due relazioni sono equazioni empiriche, ricavate direttamente dai dati sperimentali.
GK e GNa rappresentano i valori massimi che la conduttanza del K e del Na possono assumere.
n, m e h sono delle variabili tempo e voltaggio dipendenti e esprimono la probabilità che delle particelle si
trovino all’interno del canale nella posizione opportuna per determinarne l’apertura.
Nel caso del K, n4 significa che 4 particelle, indicate con la lettera n, devono essere contemporaneamente
nella posizione corretta per far aprire il canale.
Nel caso del Na ci so o due tipi di particelle, m e h, perché si ha un processo di attivazione ed un processo di
inattivazione separati. Occorre quindi che 3 particelle m e 1 particella h siano contemporaneamente nella
posizione corretta per determinare l’apertura del canale.
n, m e h rappresentano inoltre la frazione dei canali che si trovano nello stato aperto. Conseguentemente
1-n, 1-m e 1-h rappresentano la frazione dei canali nello stato chiuso. Lo stato chiuso e lo stato aperto sono
in equilibrio e questo equilibrio dipende dal potenziale e dal tempo.

Sia per il K che per il Na si ha una situazione di equilibrio dei canali tra stato aperto e stato chiuso, che
dipende da una transizione governata dalle costanti di velocità α e β. Le costanti di velocità dipendono dal
voltaggio.
αn e αm aumentano il loro valore con l’aumentare della depolarizzazione.
βn e βm diminuiscono il loro valore con l’aumentare della depolarizzazione.
αh diminuisce il proprio valore con l’aumentare della depolarizzazione.
βh aumenta il proprio valore con l’aumentare della depolarizzazione.
Per ogni valore di potenziale si può stabilire il numero dei canali aperti e il numero dei canali chiusi in
condizione di equilibrio(calcolo nella seconda e nella terza riga).
è il valore della velocità con cui i canali si aprono. Il reciproco di r è la costante di tempo . La
misura di questi valori ha messo in evidenza che il processo di attivazione del Na è 10 volte più veloce del
processo di attivazione del K e di quello di inattivazione del Na.

Variazione delle conduttanze durante il potenziale d’azione

Dai dati ottenuti tramite i vari esperimenti di blocco del voltaggio, Huxley è stato in grado di ricorstruire
come variano le conduttanze durante il potenziale d’azione.
Mentre per il Na la curva che si ottiene è molto simile a quella che era stata vista durante gli esperimenti di
blocco del voltaggio, per il K si ottiene una curva totalmente diversa. Questo perché il grafico è frutto della
 cinetica di apertura dei canali e della
dipendenza della conduttanza del canale
dal voltaggio.
Quando si è in corrispondenza del
potenziale di riposo (-60mV) i canali
voltaggio-dipendenti sono chiusi.
Quando la membrana subisce una
depolarizzazione cominciano ad attivarsi i
canali del Na, aumenta la conduttanza del
Na: l’aumento della conduttanza
determina una corrente di Na e la salita
rigenerativa della conduttanza al Na, che molto rapidamente raggiunge il valore di picco. Il valore del
potenziale di membrana si sposta verso il valore del potenziale di equilibrio del Na. Il processo di aumento
della conduttanza del Na è un processo che si arresta perché ai valori positivi del potenziale di membrana si
ha l’inattivazione del Na. Infatti il picco di conduttanza del Na non viene raggiunto in corrispondenza del
picco del potenziale d’azione, ma viene raggiunto prima e si arresta in corrispondenza dei valori positivi.
La conduttanza al K si attiva con la depolarizzazione, ma ha una cinetica più lenta perciò all’inizio la
conduttanza al K rimane indietro rispetto a quella al Na. Col progredire della depolarizzazione anche la
conduttanza al K aumenta e l’aumentare di questa conduttanza, associata con la riduzione della
conduttanza del Na, provoca la ripolarizzazione della membrana.
La conduttanza massima del K è molto minore della conduttanza massima del Na: questo non è in
contraddizione con quello che si è visto durante gli esperimenti di blocco del voltaggio (in cui si diceva che
la conduttanza al Na è uguale a quella al K) perché gli esperimenti di blocco del voltaggio hanno permesso
di capire che la cinetica del K è più lenta di quella del Na e quindi il valore che la conduttanza al K assume in
ogni istante dipende non solo dalla conduttanza del K, ma anche dal tempo in cui il valore di conduttanza è
presente.
Quando la membrana viene ripolarizzata si ha la riduzione del valore masismo di conduttanza e quindi si ha
una caduta della conduttanza. La caduta della conduttanza al K avviene più lentamente della caduta della
conduttanza al Na perché la conduttanza al K si mantiene elevata anche quando il potenziale di membrana
ha raggiunto il potenziale di riposo e questo determina lo spostamento del potenziale di membrana verso il
potenziale di equilibrio del K. Questo perché vale sempre la relazione:

Alla fine del potenziale d’azione si ha un’iperpolarizzazione postuma, in cui il potenziale di membrana è più
negativo del potenziale di riposo, perché la conduttanza del K è superiore a quella di riposo in quanto oltre
ai canali passivi sono presenti i canali voltaggio-dipendenti che si stanno chiudendo.

Se si applicassero alla cellula eccitabile piccola una serie di potenziali ripetuti ad alta frequenza, si potrebbe
avere un cambiamento significativo delle concentrazioni di K e Na intracellulari, ma senza mai raggiungere
un equilibrio con l’esterno.

Tecnica del patch clamp

I canali responsabili del potenziale d’azione sono stati messi in evidenza con la tecnica del patch clamp
che è stata messa a punto negli anni ’70 da Neher e Sakmann. Questa tecnica permette di registrare
l’attività elettrica da uno o pochi canali presenti sulla membrana e perciò ha permesso di verificare l’ipotesi
di Hodgkin e Huxley riguardo all’esistenza di canali voltaggio-dipendenti.
La tecnica consiste nell’applicare il blocco del voltaggio ad una microarea della membrana che contiene un
numero limitato di canali.

La procedura è ben illustrata nella figura sovrastante in cui si vede che in una micropipetta che ha diametro
di 0,5-1µm, viene poggiata sulla superficie della membrana. La micropipetta deve avere i bordi smussati in
modo che quando si poggia sulla membrana non la danneggia. La micropipetta viene sottoposta ad una
suzione dall’interno perché in questo modo si ha la possibilità di formare il Gigaseal ovvero un sigillo che ha
una resistenza dell’ordine dei gigaohm (contro la resistenza dell’ordine dei megaohm che si hanno quando
la micropipetta viene semplicemente appoggiata sulla membrana). Una resistenza così grande fa sì che se
dentro la membrana si ha un cambiamento di corrente, tutta la corrente che passa attraverso la membrana
entra nella micropipetta ma non esce. La situazione appena descritta è nota come configurazione cell-
attached.
Ci sono altre configurazioni che permettono di registrare in altre situazioni:
 Configurazione whole-cell. Viene applicata una suzione molto forte, tale da rompere la membrana
oppure la membrana viene resa permeabile. Questo significa che nella micropipetta ci deve essere una
soluzione che riproduce l’ambiente intracellulare in quanto il citosol è in comunicazione con il liquido
dentro la micropipetta. In questo caso si possono fare esperimenti di patch clamp in cui si cambia la
composizione del liquido dentro la micropipetta, cambiando quindi anche la composizione del citosol.
Questa configurazione permette di registrare l’attività elettrica da tutta la membrana.
 Configurazione outside-out patch. Se la membrana è stata rotta si tira la micropipetta, allontanandola
dalla superficie della membrana: la micropipetta va tirata fino a che la superficie della membrana si
rompe. Se la membrana si rompe succede che i lembi di membrana tendono a risaldarsi e formano un
pezzetto di membrana che chiude la micropipetta. Si osserva che all’interno della micropipetta è rivolto
il lato intracellulare della membrana, mentre all’esterno della pipetta (nel suo bagno di perfusione) c’è la
superficie extracellulare della membrana.
 Configurazione inside-out patch. Si ottiene con la trazione che rompe la membrana. Si espone la
micropipetta all’aria e in questo modo si rompe la porzione della membrana rivolta verso l’esterno. In
questo modo la superficie extracellulare della membrana è rivolta verso l’esterno della micropipetta e la
superficie intracellulare della pipetta è rivolta verso l’esterno. La micropipetta deve quindi essere
immersa in una soluzione che riproduce l’ambiente intracellulare. In questo modo si può vedere cosa
succede se l’ambiente intracellulare cambia.
Questa configurazione può essere ottenuta anche facendo una trazione i un ambiente in cui il contenuto
di calcio è ridotto: in questo caso i due lembi citoplasmatici non si riformano.

In un esperimento di patch clamp si registrano risposte di correnti che sono onde quadre. Quandi il canale
si apre, attraverso esso passa tutta la corrente che può passare a quel determinato potenziale.

dove è la conduttanza di un singolo canale.

Si hanno onde quadre di corrente che hanno sempre la stessa ampiezza, ma durata diversa perché le onde
quadre di corrente sono eventi probabilistici.

Per registrare l’attività solo dei canali del K o solo dei canali
del Na, si mette nella micropipetta un bloccante per il canale
che non si vuole registrare.
Nel caso di correnti che attraversano i canali del Na,viene
applicato un gradino di potenziale che blocca la membrana
ad un determinato valore (-40mV). Si registrano le correnti
che attraversano il patch. Nela figura si vedono 10 tracce di
registrazione in quanto l’esperimento è stato ripetuto più
volte (in figura sono solo 10, ma in realtà viene ripetuto 352
volte). Si verifica la comparsa di correnti che hanno quasi
sempre la stessa ampiezza e durata diversa. Le aperture dei
canali si possono osservare ad un tempo molto prossimo a
quello in cui viene applicata la depolarizzazione. Se si
sommano tutte le 352 ripetizioni dell’esperimento e poi se ne
fa la media, si ottiene una corrente che non ha più la forma
di un onda quadra, ma che ha un andamento che riproduce
quello che si registra in esperimenti di blocco del voltaggio.
Questo perché sommano 352 registrazioni è come se si registrasse l’apertura di 352 canali
contemporaneamente.

Nel caso di correnti che attraversano i canali del K, viene

applicato un gradino di potenziale che blocca la membrana a
+50mV e si vede aperture sempre della stessa ampiezza. Queste
aperture sono distribuite in maniera grossolanamente uniforme
durante tutta la depolarizzazione, ma meno frequenti subito
dopo la depolarizzazione: la cinetica di apertura dei canali del K è
più lenta di quella del Na. Se si sommano le ripetizioni e se ne fa
la media, si ottiene una corrente che ha un andamento che
riproduce quello che si registra in esperimenti di blocco del
voltaggio.

Struttura di un canale voltaggio-dipendente

Le proprietà che deve avere un canale voltaggio-dipendente

sono:

 Alta selettivitàil canale deve possedere un filtro di

selettività.
 Sensibilità al voltaggio di membrana il canale deve avere
un sensore di voltaggio collegato al gate di attivazione.
Se si tratta di un canale del Na, serve anche un gate di
inattivazione. Il fatto che la gate di inattivazione si trovi
nella parte del canale che porta verso il citosol è stato
dimostrato perché enzimi come la pronasi, applicati
all’interno della cellula, rimuovono il processo di
inattivazione.
Si è visto che la gate di inattivazione è rappresentata da un gruppo di amminoacidi, organizzati in una
struttura globulare, connessi da una catena polipeptidica alla superficie interna del canale. Questo
modello è chiamato modello di ball and chain.
 Il modello del ball and chain è stato dimostrato, oltre che con l’utilizzo della pronasi, anche andando
ad agire sulla lunghezza della catena polipeptidica che unisce la ball alla proteina canale: se la catena
polipeptidica viene accorciata, l’inattivazione è più efficace perché in questo modo la ball trova più
facilmente l’accesso al canale; con catene più lunghe il processo è più lento perché il movimento che la
ball fa per trovare la bocca del canale è più ampio.

Nella figura sono rappresentati degli

schemi della struttura di canali
voltaggio-dipendenti diversi.
Sia il canale del Na che il canale del Ca
sono delle molecole proteiche formate
da 4 domini transmembranari, ognuno
dei quali è formato da 6 segmenti
transmembrana. Tra i 6 segmenti
transmembranari, il segmento 4 è il
responsabile della sensibilità del
canale al voltaggio.
Il canale del K è formato da 4 subunità
uguali, ciascuna delle quali ha 6 domini
transmembranari, di cui il segmento 4
è quello responsabile della sensibilità
al voltaggio. Quindi grossolanamente
ha la stessa struttura dei canali del Ca e
del Na, solo che è formato da 4
subunità uguali che nel caso del Na e
del Ca non sono necessariamente
uguali.

Il sensore del voltaggio è il segmento 4 in cui sono presenti degli

amminoacidi carichi positivamente che prendono contatto con gli
amminoacidi carichi negativamente dei segmenti adiacenti. Quando il
potenziale di membrana cambia, il segmento sente la variazione di
potenziale e scorre nella membrana: lo scorrimento determina una
modifica nella struttura del canale. Questo modello è noto con il nome
di modello della sliding helix.
Il movimento del segmento 4 avviene prima che il canale si apra e
determina una variazione di corrente attraverso la membrana. L’ipotesi
che ci siano correnti piccole che precedano il potenziale d’azione era già
implicita nelle considerazioni di Hodgkin e Huxley. La corrente di Na è
quindi preceduta da una corrente che è dovuta al movimento di cariche
all’interno del canale e che trasmette al canale l’informazione che il potenziale di membrana è cambiato.

Le correnti che si registrano prima della nascita del potenziale d’azione, vengano registrate solo quando si
ha depolarizzazione e non quando si ha iperpolarizzazione. Per questo motivo le correnti vengono chiamate
correnti di asimmetria (gating currents).

Nella figura si vede cosa accade ai canali durante il potenziale d’azione.