Master Facolt di Medicina e Chirurgia Impiego delle nuove tecnologie nella terapia chirurgica delle cardiopatie

SOSTITUTI VALVOLARI CARDIACI INGEGNERIZZATI: SVILUPPO E VALUTAZIONE FUNZIONALE Materiali e dispositivi per lingegneria tessutale

Argomenti del corso 1 - I materiali utilizzati nellambito dellingegneria tessutale 2 - Il caso delle protesi valvolari cardiache ingegnerizzate

3 - Bioreattori: confronto tra i dispositivi in termini di caratteristiche costruttive e prestazioni

Nel caso delle valvole cardiache ingegnerizzate (tissue engineered heart valves, TEHVs), le strade intraprese sono sostanzialmente due:
ricostruzione di valvole completamente artificiali a partire da biomateriali polimerici di sintesi decellularizzazione di valvole cardiache native da donatori della stessa specie (allotrapianto) o di specie diverse (xenotrapianto)

applicazione chirurgica

crescita nel bioreattore

biopsia

semina su scaffold

cellule autologhe

espansione in vitro

Ma quanto incide la procedura di decellularizzazione sulle complessive prestazioni del costrutto ingegnerizzato?

Ricostruzione di una valvola cardiaca mediante tecniche di ingegneria tessutale Per ricostruire una valvola cardiaca con tecniche di ingegneria tessutale si procede attraverso:

1. costruzione di uno scaffold sintetico o decellularizzazione di una valvola nativa per ottenere uno scaffold biologico 2. preparazione della coltura cellulare da utilizzare per la semina in vitro
3. semina delle cellule accresciute in vitro sullo scaffold ed incubazione mediante lutilizzo di un bioreattore.

Costruzione di uno scaffold o decellularizzazione di una valvola nativa per ottenere uno scaffold biologico? preferibile:

costruire uno scaffold mediante lutilizzo di materiali biodegradabili (tipicamente polimeri quali PGA,PLA, PLLA, PHA, etc.);
o utilizzare uno scaffold decellularizzato proveniente da organismo animale?

Scaffold poroso di valvola cardiaca e stampo in alluminio per la fabbricazione (vista dall'alto)

Valvola porcina decellularizzata Cryolife vista dallalto e di lato

Preparazione per la semina in vitro

Schematicamente si procede attraverso le seguenti fasi:

1. isolamento ed espansione di cellule autologhe utilizzando tecniche di coltura standard 2. semina cellulare su scaffold biodegradabile 3D 3. condizionamento biomimetico in un bioreattore 4. impianto della valvola vivente, formata da tessuto autologo e ricostruita con tecniche di ingegneria tessutale.

Nella maggior parte degli approcci allingegneria tessutale cardiovascolare le cellule sono raccolte da tessuti dei donatori, ad esempio dalle arterie periferiche (arterie mammarie, arterie radiali) o vene (vena safena) Linee cellulari endoteliali e miofibroblasti sono ottenuti da popolazioni cellulari vascolari miste, ad esempio marcando le cellule con marcatori di lipoproteine a bassa densit (LDL) con conseguente scelta cellulare a mezzo fluorescente (FACS) Alternativamente le biopsie sono trattate con collagenasi in maniera da distaccare dalla superficie le cellule endoteliali; il resto del tessuto viene tagliato in piccoli pezzi (1 mm3), attaccato a dischi di coltura e coltivato finch i primi miofibroblasti appaiono

La possibile applicazione futura dei concetti propri dellingegneria tessutale ha suscitato linteresse della comunit scientifica nei confronti delle cellule del midollo osseo (cellule staminali mesenchimali, MSCs) o delle cellule progenitrici del sangue come possibile sorgente cellulare alternativa. Lutilizzo di MSCs offre indiscutibili vantaggi: sono facili da ottenere mostrano una estensiva capacit di proliferazione hanno il potenziale di differenziarsi in diversi tipi di tessuti

Di recente hanno suscitato interesse per possibili applicazioni nellingegneria tessutale le cellule staminali da tessuto adiposo che sarebbero in grado di differenziarsi secondo tipi cellulari di grande utilit

Il concetto di ingegneria tessutale suggerisce che lapplicazione di un microambiente favorevole possa guidare la differenziazione cellulare attraverso fenotipi che possano essere appropriati per la sostituzione autologa di tessuti

Semina delle cellule accresciute in vitro sullo scaffold ed incubazione mediante lutilizzo di un bioreattore Le cellule coltivate in vitro vengono seminate sullo scaffold, quindi il manufatto viene messo in coltura in un bioreattore, che crea le condizioni ideali per la crescita cellulare (temperatura, grado di umidit, etc.) La ricerca partita effettuando le colture in maniera statica per poi passare a bioreattori dinamici i quali, oltre a fornire un ambiente biologico attivo, creano da subito le condizioni di normale utilizzo proprie di una valvola cardiaca, ossia un sistema di pompaggio che mette la valvola nelle condizioni di stress tipiche del flusso sanguigno in pressione

Il caso delle valvole porcine decellularizzate Le strade intraprese dai vari gruppi di ricerca che si occupano di ricostruzione di valvole cardiache mediante tecniche di ingegneria tessutale sono sostanzialmente due: ricostruzione di valvole completamente artificiali a partire da biomateriali polimerici di sintesi, biocompatibili e biodegradabili; decellularizzazione di valvole cardiache native da donatori della stessa specie (allotrapianto) o di specie diverse (xenotrapianto).

I principali svantaggi dell'approccio puramente basato sull'utilizzo di biomateriali di sintesi sono: difficolt nella costruzione di una struttura tridimensionale stabile, resistente alla trazione e allo stesso tempo flessibile e provvista di cuspidi funzionali pronunciata trombogenicit dei polimeri utilizzati per la costruzione degli scaffold scarsa adesione cellulare e conseguente scarsa rigenerazione cellulare

L'utilizzo di scaffold biologici pu essere un'alternativa per il superamento di questi inconvenienti Dal punto di vista morfologico uno scaffold biologico sicuramente la struttura che pi si avvicina a quella reale; per poter essere utilizzato in ambito clinico, lo scaffold deve essere sottoposto ad una particolare procedura di lavaggio detta decellularizzazione

Questo tipo di matrice, diversamente da quella artificiale formata da uno o pi polimeri di sintesi, contiene la struttura ed i componenti ottimali per ospitare le cellule dell'organismo ricevente, fornendo un ambiente ideale per i recettori cellulari di superficie e una riserva per i fattori di crescita che modulano i processi biologici quali: angiogenesi, vasculogenesi, migrazione e proliferazione cellulare

La procedura generale adottata per decellularizzare lo scaffold di una valvola cardiaca consiste nei seguenti passi: disinfezione della valvola prelevata in condizioni sterili mediante lavaggio a temperatura ambiente con soluzione di iodio-povidone e PBS (Phosphate Buffered Saline) sterile trattamento decellularizzante con tripsina/EDTA incubazione a 4C per una notte intera in una soluzione antibiotica ulteriore lavaggio con PBS per altre 24 ore per rimuovere i residui cellulari ancora presenti conservazione in soluzione salina (Hanks' buffered) a 4C in attesa di essere utilizzata per l'impianto o la semina

Il cuore bioartificiale Il termine bioartificiale pu trarre in inganno: lobiettivo dei ricercatori che hanno, per primi, tentato la decellularizzazione ed il successivo ripopolamento di un cuore di cadavere, era proprio quello di produrre un organo in tutto e per tutto simile a quello naturale; per questo motivo, forse pi opportuno parlare di cuore ingegnerizzato, volendo quindi precisare che si tratta di un organo ottenuto applicando le procedure dellingegneria tessutale ad una matrice che costituita, come si diceva, dallorgano di un cadavere deprivato delle cellule del donatore

Lapproccio noto poich viene comunemente impiegato nella produzione di tessuti ingegnerizzati: per la prima volta lo si estende ad un organo intero, la cui complessit morfologica e funzionale di molte volte superiore a quella del semplice tessuto

Per realizzare una efficace decellularizzazione del cuore di ratto, gli autori hanno utilizzato lapparato di Langendorff con alcune modifiche: si tratta, in estrema sintesi, di uno strumento ideato nel 1895 dal tedesco Oscar Langendorff allo scopo di studiare il cuore isolato, mantenendone lattivit contrattile grazie alla continua perfusione di ossigeno e metaboliti attraverso una cannula inserita nellaorta ascendente

Apparato di Langendorff in uso presso i laboratori della Wayne State University School of Medicine: al centro della camera si pu notare il cuore di ratto

Una pompa esterna mantiene il flusso, con regimi di circa 0.5 1.5 L/min La perfusione retrograda dellaorta fa chiudere la valvola aortica e forza il flusso nelle arterie coronarie durante la fase diastolica, come in un normale ciclo cardiaco; il flusso prosegue attraverso il sistema coronarico e alla fine esce dal seno coronarico nellatrio destro In questo modo, la parte sinistra del cuore resta sostanzialmente non bagnata, e i ventricoli si contraggono contro la pressione atmosferica interna alle camere

Dal momento che la forza della contrazione proporzionale alla pressione, per generare una contrazione pi fisiologica si pu pressurizzare il ventricolo sinistro mediante linserimento di un pallone o il riempimento con un fluido Versioni pi evolute dellapparato di Langendorff consentono il riempimento di tutte le camere, lasciando il muscolo cardiaco in condizioni pi vicine a quelle fisiologiche

Ott e collaboratori hanno confrontato diversi metodi di decellularizzazione, ottenuti al variare della composizione del detergente I risultati hanno dimostrato che luso di SDS pi vantaggioso per la rimozione del DNA, delle strutture proteiche intracellulari e di tutte le componenti cellulari, rispetto al PEG, al Triton X100 e ad altri protocolli basati sullimpiego di enzimi

In tutti i casi, dopo la totale rimozione delle componenti cellulari, del cuore originario restano intatte le fibre di collagene I e III (arricchite di laminina e fibronectina) e la matrice extra-cellulare sia come composizione che orientazione

Il mantenimento della composizione e dellorientazione delle fibre della ECM stato osservato anche in riferimento alla parete aortica e alla valvola aortica

In Figura si pu osservare come la colorazione dei tessuti cardiaci vari al progredire del processo di decellularizzazione: il cuore diviene sempre pi traslucido mano a mano che il materiale cellulare viene allontanato dal ventricolo destro, poi dagli atri ed infine dal ventricolo sinistro Nel dettaglio di destra, listologia rileva la totale assenza di elementi cellulari, a dimostrazione dellefficace decellularizzazione ottenuta

I campioni decellularizzati sono stati caratterizzati anche dal punto di vista biomeccanico, per verificare se il trattamento subito ne comprometta o meno la funzionalit Gli autori hanno comparato i tessuti del cuore decellularizzato con quelli del cuore di cadavere ed hanno verificato ad esempio che, rispetto alle curve sforzo-deformazione nei test meccanici equiassiali, sia i campioni prelevati da cadavere che i campioni decellularizzati manifestano un comportamento fortemente anisotropo; in entrambi i casi, la resistenza in direzione circonferenziale maggiore di quella in direzione longitudinale per i ventricoli sinistri

Valutazione biomeccanica delle propriet dei tessuti trattati e non trattati con decellularizzazione; si assunto il gel di fibrina come riferimento comune

Calcolando poi il modulo tangenziale al 40% di deformazione, in entrambe le direzioni, i campioni decellularizzati rivelano un modulo significativamente pi elevato dei campioni da cadavere Appaiono pi simili tra di loro i risultati delle prove condotte per misurare la rigidit della membrana, sia in direzione longitudinale che circonferenziale

A questo punto il cuore decellularizzato viene montato sul bioreattore e ripopolato con cellule cardiache di ratto neonato mediante iniezione; le condizione della coltura sterile vengono quindi regolate per sottoporre il cuore ad un flusso pulsato diastolico e sistolico, consentendo le fasi di apertura e chiusura della valvola aortica; al cuore in coltura viene applicata stimolazione elettrica (1 Hz, 520 V, 2 ms) A partire dallottavo giorno dopo la semina delle cellule, il costrutto cardiaco ottenuto capace di rispondere agli stimoli elettrici con attivit contrattile

Dal punto di vista istologico, gli autori hanno riscontrato una maggiore densit di ripopolamento proprio in corrispondenza dei punti di iniezione delle cellule; si inoltre evidenziata la presenza di actina e miosina sarcomeriche nel ventricolo sinistro, accompagnata dalla presenza di cellule positive al fattore di von Willebrand In seguito sono state introdotte, mediante perfusione, cellule endoteliali che, a partire dal settimo giorno, formano singoli strati nei vasi coronarici pi grandi e pi piccoli

In conclusione, gli autori di conseguito almeno tre risultati cruciali lungo la strada che potr portare alla produzione di un vero e proprio organo bioartificiale (o ingegnerizzato, che dir si voglia): 1. lingegnerizzazione dellimpalcatura che funge da struttura dellorgano 2. il ripopolamento della struttura con la necessaria composizione cellulare 3. la maturazione del costrutto per sviluppare la funzione di pompa

 daltra parte importante ricordare che se la decellularizzazione di singole componenti tessutali rappresenta una procedura sperimentale piuttosto comune, la decellularizzazione di un intero organo viene presentata per la prima volta Sfruttando il principio della perfusione, si infatti ottenuta una matrice cardiaca che conserva la complessit funzionale e morfologica dellorgano nativo, preserva lalbero vascolare, le valvole e la geometria delle quattro camere cardiache, fornendo un supporto biomimetico da ripopolare con le tecniche dellingegneria tessutale

Il ripopolamento stato ottenuto in due fasi: dapprima, mediante iniezione di cellule cardiache di ratto neonato, e poi mediante perfusione di cellule endoteliali
Dopo 8 giorni di coltura, il costrutto ripopolato dimostra di essere capace di contrazione e di rispondere ai farmaci

Si pu quindi ragionevolmente presumere che, a seguito di opportuna maturazione, lorgano ottenuto possa diventare trapiantabile in tutto o almeno in parte

Vale sicuramente la pena ripetere che lapproccio proposto, applicato nel caso in esame al cuore, pu essere esteso a qualunque altro organo: dal polmone al fegato, dal rene al muscolo; sono gi in corso studi che riguardano sia lottimizzazione delle procedure di semina delle cellule per favorirne la dispersione allinterno della matrice dellorgano decellularizzata, sia lidentificazione della migliore fonte cellulare, sia la scelta delle condizioni operative pi adatte alla produzione di un organo autologo o off-the-shelf Evidentemente limpatto di queste ricerche nel settore del trapianto di organi potr portare a risultati sensazionali