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INTRODUZIONE

Alla base del successo di ogni terapia farmacologia vi è il raggiungimento

di concentrazioni efficaci di un determinato principio attivo nel sito di

azione. Ciò tuttavia non è semplice da realizzare a causa di numerosi

fattori, alcuni di tipo fisiologico, altri relativi alle caratteristiche chimico

fisiche del farmaco stesso e alla velocità di disgregazione della forma

farmaceutica che lo veicola.

Tra i primi vi sono la vascolarizzazione e il flusso ematico della zona di

somministrazione, la permeabilità e l’estensione della superficie

assorbente, non ultimo il pH del mezzo. Tra i fattori legati alle proprietà

chimico-fisiche di un principio attivo vi sono la sua solubilità nei fluidi

biologici ed il suo coefficiente di ripartizione olio/acqua, il quale deve

essere tale da consentire sia l’attraversamento delle barriere epiteliali da

parte del farmaco sia la sua diffusione negli spazi inter- e intracellulari.

Se inoltre il principio attivo deve agire a livello di particolari distretti

dell’organismo quali il Sistema Nervoso Centrale (SNC), un ulteriore

ostacolo è rappresentato dalla presenza della Barriera Emato-Encefalica

(BEE), un vero e proprio “filtro biologico” che consente o impedisce alle

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molecole di passare dal sangue al cervello.

1. LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA (BEE)

La BEE regola la concentrazione e la clearance di composti endogeni ed

esogeni nel tessuto nervoso, garantendo l’omeostasi delle cellule cerebrali e

impedendone il contatto non solo con sostanze eventualmente dannose ma

anche con agenti terapeutici [Abbott, 2004]. Infatti più del 98% dei

composti di nuova sintesi, potenzialmente attivi a livello del SNC, non è in

grado di attraversarla [Béduneau et al., 2007].

Nonostante il volume cerebrale occupato dai capillari e dalle cellule

endoteliali sia rispettivamente dell’1% e dello 0.1%, i piccoli vasi cerebrali

si estendono su un’area pari a 20 m2, superficie che, in assenza della BEE,

permetterebbe alle piccole molecole di giungere alle cellule dell’encefalo in

meno di un secondo, poiché esse distano dai capillari in media non più di

20 µm [Pardridge, 2001].

A conferire tuttavia la selettività alla BEE è l’organizzazione anatomica dei

capillari stessi, i quali sono circondati da cellule quali astrociti (responsabili

del supporto strutturale del tessuto nervoso), periciti (cellule contrattili

separate dalla membrana basale mediante una matrice extracellulare di

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collagene) e microglia (macrofagi residenti nel SNC) [Blasi et al., 2007]

(Figura 1). Essi creano attorno ai vasi cerebrali una struttura altamente

organizzata le cui principali caratteristiche sono:

• presenza di tight junctions: conosciute anche come zonula

occludens, garantiscono un’efficace regolazione del transito di

sostanze attraverso la BEE in quanto costituiscono uno strato

continuo tra le cellule endoteliali e la sommità apicale delle

cellule epiteliali; inoltre le differenze riscontrate nella loro

morfologia comportano una diversa permeabilità delle varie aree

dell’encefalo [Lapierre, 2000; Wolburg and Lippoldt, 2002];

• assenza di fenestrature nei capillari della BEE;

• scarso fenomeno di pinocitosi;

• presenza di tre sistemi di trasporto (trasporto carrier-mediato,

trasporto mediato da recettori e trasporto attivo di efflusso);

• presenza di astrociti.

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Figura 1. Sezione di un capillare cerebrale

Il ruolo della BEE è inoltre adiuvato dalla presenza di altre due strutture:

una barriera emato-liquorale, che separa il sangue dal liquor ed è

rappresentata dai plessi corioidei e dalle leptomeningi, ed una barriera

liquor-encefalica, che separa il liquor dal tessuto nervoso vero e proprio.

1.1. Gli astrociti

Tali cellule costituiscono circa il 90% della massa cerebrale, hanno una

tipica forma a stella e presentano numerose estroflessioni, denominate

“end-feet”, che rivestono la membrana basale della BEE. Le loro funzioni

sembrano essere il mantenimento dell’omeostasi del cervello attraverso il

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controllo della concentrazione di ioni potassio, l’inattivazione dei

neurotrasmettitori, la regolazione e la produzione di fattori di crescita e di

citochine, da alcuni dei quali dipende l’espressione dell’apolipoproteina E

(Apo E) [Gee and Keller, 2005].

1.2. Trasporto di molecole attraverso la BEE

Una valida strategia per raggiungere concentrazioni efficaci di farmaci nel

SNC consiste nello sfruttare i diversi meccanismi di trasporto presenti sulla

BEE, come il processo di diffusione facilitata per sostanze endogene quali

glucosio e amminoacidi, oppure il processo di endocitosi mediata da

recettore per molecole quali insulina, transferrina e Apo E [Pardridge,

2001; Pardridge, 2003]. Grazie a queste due modalità di trasporto,

localizzate sul versante luminale della BEE, è possibile favorire il

passaggio all’interno del cervello di principi attivi o di loro adeguati veicoli

in grado di interagire con tali trasportatori o recettori.

Il trasporto mediato da carrier è un meccanismo di trasporto molto

espresso sull’endotelio dei vasi della BEE; esso permette il trasferimento di

molecole dal lume dei capillari cerebrali all’interno del cervello, regolando

il passaggio di composti che sono capaci – in altri distretti dell’organismo –

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di attraversare le membrane biologiche per semplice diffusione grazie alla

loro alta lipofilia, al loro peso molecolare inferiore a 500 Da e alla loro

parziale carica positiva [Pardridge, 2001; Abbott, 2004].

Dal momento che la semplice diffusione attraverso la BEE non è

consentita, i trasportatori hanno come ruolo primario quello di garantire,

nel tessuto nervoso, il sufficiente apporto di glucosio, amminoacidi

essenziali, acidi monocarbossilici e nucleosidi, necessari al funzionamento

e alla sopravvivenza delle cellule cerebrali. Sfruttando tali carriers è perciò

possibile che farmaci e profarmaci in grado di mimare le molecole

endogene e i nutrienti attraversino la BEE [Cornford and Hyman, 1999;

Bonina et al., 2000].

Uno di questi trasportatori localizzati sulla BEE è quello per il glucosio

GLUT1, dal quale dipende il passaggio dal sangue al SNC non soltanto di

D-glucosio ma anche di composti dalla struttura simile come il 2-

deossiglucosio, il galattosio e il mannosio [Pardridge, 1995]. La sua

espressione è diversamente regolata in seguito allo svilupparsi di tumori

nell’encefalo; è stato infatti dimostrato che il GLUT1 viene sovraespresso

in emangioblastomi cerebrali ma sottoespresso in glioblastoma multiforme

[Tsukamoto et al., 1996]. Si verifica invece, in altri tipi di gliomi, che

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l’isoforma predominante del recettore è la GLUT3, la quale è presente

anche nei neuroni del cervello sano [Boado et al., 1994]. Sfruttando proprio

l’elevata affinità per il carrier GLUT1 da parte di liposomi rivestiti con

derivati del mannosio (ad esempio p-aminofenil-α-mannoside), è stato

possibile veicolare con successo farmaci all’interno del SNC di topo

[Umezawa and Eto, 1988].

Un altro trasportatore che è presente sulla BEE e che può perciò essere utile

per introdurre principi attivi all’interno dell’encefalo è quello per la colina.

La colina, oltre ad essere il precursore del neurotrasmettitore acetilcolina, è

anche un componente della membrana fosfolipidica ed è dunque essenziale

per l’organismo umano [Allen and Smith, 2001]. In seguito al rilascio e alla

degradazione dell’acetilcolina, la colina viene captata dalle cellule nervose,

che possono così riutilizzarla, grazie al suo trasportatore espresso sulla

BEE; quest’ultimo presenta un’area carica negativamente che gli permette

di interagire con la colina e con altre sostanze aventi gruppi ammonici

quaternari, quali la carnitina e la tiamina [Lockman and Allen, 2002]. A

causa della maggiore attività delle cellule cancerose rispetto a quelle sane,

in sede di tumori cerebrali è stato riscontrato un incremento del trasporto

attivo della colina [Tedeschi et al., 1997]. In tali circostanze, nanoparticelle

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cariche positivamente preparate a partire da maltodestrine e rivestite con

1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina sono risultate essere in grado

di permeare la BEE [Fenart et al., 1999]: è stato infatti dimostrato in vitro

che il loro passaggio attraverso un monostrato di cellule endoteliali è di 3-4

volte maggiore rispetto a sistemi nanoparticellari non rivestiti e si verifica

senza che venga alterata la permeabilità paracellulare, quindi

principalmente per effetto del trasportatore della colina sulla BEE.

Il trasporto mediato da recettore avviene grazie ad un processo di

endocitosi attraverso cui, in seguito al legame di un ligando col suo

specifico recettore localizzato sul versante luminale della BEE, si produce

una internalizzazione del complesso ligando-recettore dentro vescicole

endocitotiche [Vyas and Sihorkar, 2000].

Studi in vitro e in vivo hanno evidenziato la presenza di un’alta

concentrazione di recettori per l’insulina nei capillari cerebrali del coniglio

[Frank and Pardridge, 1981] e dell’uomo [Pardridge et al., 1985]. Duffy e

Pardridge, ad esempio, hanno dimostrato la transcitosi dell’ormone

attraverso la BEE in seguito ad iniezione nell’arteria carotidea di conigli

[Duffy and Pardridge, 1978].

I recettori per l’insulina sono spesso sovraespressi in numerosi tumori del

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cervello e la loro espressione aumenta in dipendenza dello stadio del

tumore [Elmlinger et al., 2001]. In tali circostanze inoltre è stata osservata

una elevata affinità dell’ormone al suo recettore, rendendo quest’ultimo un

valido candidato come direzionante per la veicolazione di farmaci

chemioterapici al cervello mediante l’uso di nanoparticelle [Glick et al.,

1989].

Tuttavia l’insulina, essendo un ormone peptidico, ha una bassa emivita e

ovviamente provoca ipoglicemia ad alte dosi; tale effetto sistemico

potrebbe essere limitato però dalla sostituzione del polipeptide con il

fattore di crescita insulina-simile (IGF), il quale ha il vantaggio di non

provocare un drastico abbassamento della concentrazione di glucosio nel

sangue, a meno che non venga adoperato in quantità di gran lunga maggiori

di quelle che verrebbero usate in terapia.

Dati sperimentali su cellule endoteliali di cervello isolato hanno dimostrato

che IGF-I e IGF-II subiscono endocitosi [Reinhardt and Bondy, 1994],

sebbene l’elevata interazione dell’IGF con le proteine ematiche influenzi

negativamente le sue potenzialità come direzionante [Ocrant, 1991].

I trasportatori di efflusso sono molto spesso responsabili dell’insuccesso

delle strategie discusse in precedenza poiché limitano l’efficacia

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terapeutica di principi attivi capaci di attraversare virtualmente la BEE.

La glicoproteina P (P-gp) è un trasportatore di efflusso ATP-dipendente ed

è presente nelle membrane apicali di differenti tipi di cellule epiteliali,

incluse quelle che formano la BEE [Schinkel et al., 1999; Stouch and

Gudmundsson, 2002]. Dal momento che l’azione della P-gp è uno dei

principali fattori che impedisce l’accumulo di numerose molecole a livello

del tessuto nervoso, la sua inibizione potrebbe essere una possibile

procedura per promuovere la penetrazione di farmaci nel SNC [Miller and

Kabanov, 1999; Kabanov et al., 2003].

È stato dimostrato che molti tensioattivi normalmente usati nelle

preparazioni farmaceutiche, quali i Poloxameri, assolvono a tale compito

[Kabanov et al., 2003].

2. SISTEMI COLLOIDALI PER LA SOMMINISTRAZIONE DI


PRINCIPI ATTIVI
Alla luce delle difficoltà associate ad una terapia farmacologica per

malattie del SNC, si comprende il motivo per il quale la moderna

tecnologia farmaceutica si è indirizzata alla progettazione ed al

perfezionamento di sistemi quali cellule “ghost”, nanoparticelle,

microcapsule, liposomi e micelle che permettano di superare tali

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inconvenienti [Cohen and Bernstein, 1996].

Un carrier, al fine di esplicare in modo ottimale la sua funzione e

aumentare il numero di interazioni tra il principio attivo che veicola e il suo

sito d’azione dovrebbe:

• degradarsi lentamente;

• essere sensibile a variazioni di pH o di temperatura;

• essere in grado di permanere in circolo abbastanza a lungo da

permettere il mantenimento della concentrazione terapeutica del

farmaco;

• accumularsi nel sito di azione attraverso il direzionamento attivo

ottenuto mediante la coniugazione con ligandi specifici dell’area

interessata [Lasic and Martin, 1995; Torchilin and Trubetskoy,

1995].

2.1. Liposomi

I liposomi sono dei sistemi colloidali largamente studiati e utilizzati per la

veicolazione di principi attivi e sono formati da fosfolipidi anfipatici

organizzati in un doppio strato (Figura 2). Vengono classificati, sulla base

delle loro dimensioni, in multilamellari (100-200 nm), vescicole

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unilamellari piccole (10-50 nm) e vescicole unilamellari grandi (LUV, 50-

1000 nm) [Chrai et al., 2001].

Figura 2. Struttura del doppio strato fosfolipidico dei liposomi

Le molecole inglobate al loro interno possono essere sia idrofile sia

lipofile, poiché esse possono situarsi rispettivamente nella fase interna

acquosa o tra le code idrofobe. Oltre al vantaggio di veicolare farmaci di

diversa natura, l’utilizzo di liposomi permette di incrementare la

permeazione di principi attivi attraverso la BEE, poiché alcuni costituenti

di tali sistemi sembrano inibire la P-gp [Rahman et al., 1992]. È stata

inoltre notata una diminuzione della clearance plasmatica di liposomi

peghilati, cioè sistemi in cui i fosfolipidi erano stati coniugati con PEG,

rispetto ai liposomi non peghilati [Allen, 1994].

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2.2. Nanoparticelle

Le nanoparticelle sono sistemi colloidali con un diametro medio compreso

tra 10 e 1000 nm. In esse il farmaco può essere disciolto, disperso o

racchiuso in una matrice, polimerica o lipidica, che ne modula la velocità e

il profilo di rilascio nell’organismo [Soppimath et al., 2001].

Le nanoparticelle polimeriche possono essere preparate a partire da

polimeri naturali o sintetici sotto forma di nanocapsule o nanosfere: le

nanocapsule sono sistemi vescicolari in cui il principio attivo si trova in

una cavità delimitata da una membrana polimerica; le nanosfere invece

sono dei sistemi matriciali in cui il farmaco è fisicamente e uniformemente

disperso in una matrice polimerica [Langer, 2000]. Grazie alle loro

dimensioni, le nanoparticelle si prestano ad essere somministrate per

qualsiasi via, ad attraversare le membrane biologiche, a proteggere i

principi attivi dall’inattivazione chimica e/o enzimatica, riducendone gli

effetti tossici e collaterali mediante la possibilità di direzionamento a

tessuti specifici, e a rilasciare i farmaci che veicolano direttamente

all’interno delle cellule, dalle quali sono captate mediante endocitosi

[Brigger et al., 2002].

Le nanoparticelle lipidiche solide (SLN) sono costituite da una matrice

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lipidica solida che è stabilizzata da un tensioattivo [Wissing et al., 2004].

Presentano, tra i vantaggi, stabilità di alcuni anni, ridotta tossicità dovuta

all’utilizzo di lipidi biodegradabili e ben tollerati dall’organismo,

dimensioni dell’ordine dei nanometri, tutte caratteristiche che ne

permettono la somministrazione per via parenterale. La capacità di

caricamento del principio attivo, che dipende dalla solubilità di

quest’ultimo nella miscela lipidica fusa, e la sua possibile espulsione in

seguito a transizioni polimorfiche [Freitas and Muller, 1999] rappresentano

degli svantaggi che sono stati superati dai carriers lipidici nanostrutturati

(NLC), costituiti da lipidi strutturalmente diversi tra loro [Heurtault et al.,

2002].

È stato dimostrato che nanoparticelle lipidiche solide peghilate in superficie

sono in grado di sfuggire al processo di opsonizzazione, inibiscono la P-gp

[Buckingham et al., 1995] e, grazie al trasporto passivo attraverso la BEE,

rilasciano i farmaci ai tumori del cervello [Koziara et al., 2004].

2.3. Micelle polimeriche

Le micelle polimeriche sono delle strutture con diametro compreso tra 5 e

100 nm che si ottengono dall’associazione spontanea in soluzione di

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copolimeri anfifilici formati da unità ripetitive idrofobe e idrofile, in

seguito al raggiungimento di una certa concentrazione (detta

concentrazione di aggregazione critica, CAC) e ad una data temperatura

(temperatura critica di micellizzazione, TMT). Al di sotto di questi valori le

macromolecole esistono come unimeri e al di sopra coesistono come

aggregati micellari in equilibrio con le singole unità [Torchilin, 2007].

Un sistema micellare ottimale dovrebbe:

• formarsi spontaneamente e incorporare al suo interno molecole

di principio attivo (quest’ultimo dovrebbe essere rilasciato in

forma libera in seguito al contatto col sito bersaglio);

• avere dimensioni di 10-20 nm affinché possa essere in grado di

giungere ai tessuti in seguito all’attraversamento delle

membrane;

• essere stabile in vivo per un tempo sufficientemente lungo;

• non causare effetti indesiderati;

• essere formato da componenti che possano essere eliminati

dall’organismo con facilità una volta completata la loro funzione

di veicolo [Kabanov et al., 2002].

Le micelle ottenute dall’aggregazione di unimeri anfifilici sono spesso più

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stabili dei sistemi ottenuti dalla micellizzazione di piccole molecole di

tensioattivo (queste ultime, per la loro natura, tendono anch’esse a formare

micelle in soluzione) e posseggono valori di CAC dell’ordine di circa 10-6

M, valore di due ordini di grandezza inferiore a quella di tensioattivi

convenzionali come il Polisorbato 80 [Kabanov et al., 2002].

La formazione delle micelle polimeriche è da attribuire ad un decremento

di energia libera del sistema, dovuto alla sottrazione dei gruppi lipofili

dall’interfaccia con il solvente acquoso, al ripristino dei legami a idrogeno

tra le molecole di acqua e alla formazione di interazioni tra la porzione

idrofila del polimero e il solvente; tale fenomeno è favorito anche

dall’instaurarsi di forze di van der Waals tra i gruppi idrofobi all’interno

del sistema, le quali permettono di ottenere un ulteriore guadagno

energetico [Jones and Leroux, 1999].

In acqua la struttura micellare ottenuta è del tipo core-shell, in cui i

segmenti lipofili si associano all’interno del sistema (core) mentre le

porzioni idrofile formano l’involucro esterno (shell) (Figura 3).

Le porzioni idrofobe e idrofile possono essere organizzate all’interno della

catena polimerica in maniera differente, dando origine a copolimeri

random, a blocchi o ramificati (graft) [Torchilin, 2001].

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Figura 3. Organizzazione strutturale di una micella

2.3.1. Metodi di preparazione delle micelle e incorporazione di farmaci al

loro interno

Le micelle polimeriche possono essere preparate con due diverse

metodologie, cioè per dissoluzione diretta o per dialisi.

Il primo metodo, adottato per copolimeri solubili in acqua, consiste nella

dispersione del copolimero in un mezzo acquoso a temperatura ambiente o

maggiore e ad una concentrazione superiore alla CAC.

I copolimeri con una bassa solubilità in acqua sono invece convertiti in

micelle attraverso il metodo della dialisi, che prevede la dissoluzione del

copolimero in un solvente organico miscibile con acqua, come ad esempio

dimetilsolfossido (DMSO), dimetilformammide (DMF), tetraidrofurano

(THF), e successiva dialisi in acqua.

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L’incorporazione di farmaci apolari all’interno delle micelle è resa

possibile dall’orientamento caratteristico core-shell assunto dai copolimeri

(Figura 4). Il principio attivo infatti, man mano che l’acqua viene spinta

all’esterno del sistema, interagisce sempre di più con il core idrofobico,

processo che avviene spontaneamente perché è energeticamente favorito.

All’aumentare della quota di farmaco che si solubilizza nella porzione

lipofila, cresce la probabilità che si verifichi un aumento del volume delle

micelle a causa dell’accumulo al loro interno del principio attivo.

Figura 4. Struttura core-shell di una micella e disposizione farmaco al suo interno.

L’efficacia dell’incorporazione dipende non solo dalla compatibilità tra

core idrofobo e farmaco incapsulato, ma anche da alcune caratteristiche di

quest’ultimo quali polarità, lipofilia ed eventuale carica; l’esito finale del

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processo dipende inoltre dalle dimensioni delle porzioni idrofile e lipofile

dei copolimeri poiché, se queste ultime sono predominanti rispetto alle

prime, le dimensioni del core micellare aumenteranno e permetteranno di

incorporare maggiori quantità di principio attivo [Allen et al., 1999].

L’incorporazione del farmaco nelle micelle può avvenire tramite

interazione di tipo fisico con le porzioni polimeriche idrofobiche o tramite

legame covalente del principio attivo alla macromolecola.

Se il farmaco è legato covalentemente al core idrofobo, la sua

incorporazione all’interno delle micelle procede simultaneamente con la

formazione del sistema; il rilascio del principio attivo risulterà controllato

dal processo di penetrazione dell’acqua nel core lipofilo, dalla

dissociazione micellare e dalla rottura del legame farmaco-copolimero.

Se l’incorporazione del principio attivo avviene invece attraverso

interazioni fisiche, il suo rilascio dal sistema risulterà dipendente dalla sua

velocità di diffusione nel core micellare e dalla disaggregazione delle

micelle. Per effettuare questo tipo di preparazione esistono due metodi

principali.

La preparazione per dissoluzione diretta di micelle polimeriche contenenti

farmaco prevede che una soluzione di copolimero disciolto in acqua venga

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aggiunta ad una soluzione organica di principio attivo, oppure che un

farmaco solubilizzato in un solvente organico volatile sia addizionato ad

una soluzione acquosa di micelle preformate, facendo evaporare

successivamente la fase organica.

Nel metodo per dialisi invece un principio attivo è disciolto insieme al

copolimero che formerà le micelle in un solvente organico e tale soluzione

è dializzata in acqua in un secondo momento [Harada and Kataoka, 1998;

Kwon et al., 1997 ].

2.3.2 .Caratterizzazione delle micelle polimeriche

Lo studio dimensionale e morfologico delle micelle polimeriche viene di

norma effettuato attraverso misure di light-scattering, tecnica che consente

di determinare dimensioni medie e geometria (es. di tipo sferico,

ellissoidale, vescicolare o tubulare) [Cameron et al., 1999].

La morfologia delle micelle polimeriche viene determinata dalla

conformazione dei copolimeri che le costituiscono, dalla loro

concentrazione e dal tipo di solvente utilizzato per la preparazione dei

sistemi. Strutture non sferiche sono spesso formate da copolimeri a blocchi

asimmetrici in cui la porzione lipofila è più corta di quella idrofila.

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2.3.3. Stabilità delle micelle polimeriche

La stabilità delle micelle polimeriche, così come il rilascio del principio

attivo in esse contenuto, sia in vitro sia in vivo, dipende dal valore della

CAC. L’equilibrio copolimero/micelle e la concentrazione al di sotto della

quale tale equilibrio si sposta verso la formazione dei monomeri sono

direttamente correlati con la stabilità termodinamica; la stabilità cinetica

invece dà informazioni sulla velocità reale di dissociazione delle micelle in

quanto, anche in seguito a diluizione a concentrazioni inferiori alla CAC,

possono ancora esistere micelle preformate per un tempo abbastanza lungo

da svolgere la loro funzione di carriers di farmaci.

In particolare lo stato fisico del core micellare, il contenuto di solvente in

quest’ultimo e il rapporto tra le regioni idrofile e idrofobe del copolimero

sono parametri che influenzano in modo determinante la stabilità cinetica

[Tian et al., 1993].

Il valore della CAC è condizionato dalle porzioni lipofile delle micelle

polimeriche poiché, all’aumentare della lunghezza del blocco idrofobo

rispetto a quella del blocco idrofilo, si ha generalmente una notevole

diminuzione dei valori di CAC, a cui fa seguito un incremento sensibile

della stabilità micellare [Kwon and Kataoka, 1995].

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2.3.4. Composizione delle micelle polimeriche

Numerose tipologie di polimeri sono state utilizzate per la costituzione di

molecole anfifiliche in grado di formare micelle.

Per la porzione idrofila sono frequentemente utilizzati i poli(etilen glicoli)

(PEGs) con un peso molecolare compreso tra 1 e 15 kDa [Kwon, 2003]. Il

largo uso di questo polimero è da ricercarsi nel basso costo, nella limitata

tossicità e nella sua elevata idratazione che stabilizza i sistemi

nanostrutturati in un mezzo acquoso [Calvo et al., 2001; Moghimi, 2002].

Adoperato nelle micelle, il PEG costituisce l’involucro esterno che

interagisce con l’ambiente biologico e conferisce le proprietà

farmacocinetiche al carrier, mentre il core micellare – formato dalle

porzioni idrofobe dei copolimeri – funge da reservoir non acquoso in cui il

principio attivo è disperso e protetto da possibili alterazioni chimiche che

possono verificarsi nell’ambiente biologico [Roberts et al., 2002; Veronese

and Harris, 2002; Torchilin, 2007]. Il PEG è capace di ridurre il

riconoscimento immunitario dei sistemi colloidali di cui fa parte ad opera

dei macrofagi del Sistema Reticolo-Endoteliale (RES) quali cellule di

Kupffer del fegato, macrofagi della milza o del midollo osseo [Couvreur

and Gref, 2006]. È stato inoltre approvato dalla Food and Drugs

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Administration (FDA) per le somministrazioni parenterali [Veronese and

Harris, 2002].

Altre valide alternative ai PEGs sono il poli(N-vinil-2-pirrolidone) (PVP),

dotato di un’alta biocompatibilità [Johnson et al., 1992] ed usato in

formulazioni come liposomi [Torchilin et al., 1994], nanoparticelle

[Sharma et al., 1996], microsfere [Moneghini et al., 2000] e micelle

polimeriche [Benahmed et al., 2001]; il poli(vinil alcol) e il suo copolimero

poli(vinilalcol-co-viniloleato), già usati per preparare micelle che

incrementano la permeazione transcutanea del retinil palmitato [Luppi et

al., 2002].

Le porzioni lipofile delle micelle sono normalmente costituite da composti

ottenuti dalla polimerizzazione di L-lisina [Katayose and Kataoka, 1998],

acido aspartico [Yokoyama et al., 1990; Harada and Kataoka, 1998], acido

D,L-lattico [Ramaswamy et al., 1997] e spermina [Kabanov and Kabanov,

1990].

Alcuni di tali monomeri formano blocchi polimerici idrofobi che

direttamente costituiscono il core lipofilo delle micelle; altri composti

(lisina, spermina) formano catene idrofile polimeriche che prima

complessano elettrostaticamente le molecole idrofobe di farmaco e poi

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formano il core delle micelle.

2.3.5. Proprietà delle micelle polimeriche

I vantaggi che si riscontrano nell’utilizzo delle micelle sono molteplici e

riguardano non solo le metodiche di preparazione, che risultano essere

semplici e riproducibili. Tali sistemi infatti permettono di incorporare nel

core idrofobico principi attivi poco solubili nei fluidi biologici,

veicolandoli e proteggendo molti di essi da alterazioni chimiche e/o

enzimatiche grazie allo shell idrofilo micellare, il quale garantisce anche la

dispersione in acqua delle micelle [Gref et al., 1995; Inoue et al., 1998].

Molecole polari invece, piuttosto che essere incorporate all’interno di tali

sistemi, potrebbero essere adsorbite sulla superficie delle micelle [Attwood

and Florence, 1983].

Queste ultime inoltre, come la maggior parte dei veicoli colloidali, quando

vengono somministrate per via parenterale, sono in grado di aumentare la

biodisponibilità e il tempo di permanenza dei farmaci nella circolazione

sistemica, aumentando la possibilità che i principi attivi si possano

accumulare nel sito bersaglio e contribuendo alla riduzione degli effetti

collaterali tossici [Jones and Leroux, 1999; Torchilin, 2001; Kwon and

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Kataoka, 1995].

I farmaci veicolati da micelle, grazie alle piccole dimensioni di queste

ultime, raggiungono spontaneamente aree in cui, a seguito di tumori o

infarti, si è verificato un aumento della permeabilità dei vasi; è stato infatti

dimostrato che l’incorporazione in micelle di sostanze anticancro come

l’adriamicina permette un maggiore accumulo del principio attivo in sede

tumorale piuttosto che in tessuti normali, minimizzando così gli effetti

indesiderati [Yuan et al., 1995].

Altra caratteristica importante di questi nanovettori è la possibilità di

coniugare sulla loro superficie dei ligandi specifici per alcuni tessuti [Gref

et al., 1995; Inoue et al., 1998]; ciò permette di ottenere un direzionamento

attivo verso una determinata regione dell’organismo e di aumentare

l’efficacia farmacologica di un farmaco incorporato nelle micelle.

2.3.6. Micelle direzionate e stimolo-sensibili

Esistono numerose possibilità per incrementare l’accumulo di sistemi

nanostrutturati in aree patologiche ben definite.

a) Targeting passivo

Numerosi fenomeni patologici, responsabili di provocare nell’organismo

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alterazioni di tipo infettivo, infiammatorio o ischemico, producono nelle

aree colpite anche una aumentata permeabilità dei vasi sanguigni che le

irrorano, facendo sì che si verifichi in tali sedi un accumulo preferenziale di

nanocarriers, comprese le micelle [Palmer et al., 1984; Maeda et al.,

2000]. Nei tumori solidi inoltre, insieme alla maggiore permeabilità dei

vasi, si riscontra uno scarso drenaggio linfatico dagli interstizi cellulari,

fenomeno che provoca un aumento della ritenzione della zona interessata

(effetto EPR) (Figura 5). Affinché si assista però alla diffusione e

all’accumulo di nanocarriers nei tessuti neoplastici, è necessario che le

dimensioni di questi sistemi colloidali siano paragonabili ai diametri delle

fenestrature dei capillari che irrorano le masse tumorali, diametri che

variano in base al tipo stesso di tumore [Yuan et al., 1995; Monsky et al.,

1999].

Le micelle infatti, rispetto ad altri sistemi come i liposomi, espletano bene

la funzione di vettori di principi attivi poiché le loro dimensioni sono

inferiori alle più piccole fenestrature riscontrate in sede tumorale. Risultati

interessanti a questo proposito sono stati ottenuti nel trattamento

dell’adenocarcinoma solido al colon di topo; la somministrazione di

adriamicina incorporata nelle micelle ha evidenziato un’efficacia maggiore

26
rispetto al farmaco libero [Yokoyama et al., 1999].

Cellula Sito normale farmaco Sito


Sitotumorale
tumorale
endoteliale
endoteliale
vascolare
Particelle
contenenti
farmaco
Torrente ematico
Torrente ematico

Figura 5. Effetto EPR

Oltre alle dimensioni, le porzioni che formano lo shell idrofilo possono

contribuire in maniera decisiva alla permanenza delle micelle nella

circolazione sistemica e al loro conseguente accumulo nel sito bersaglio. È

stato osservato infatti che sistemi micellari, come quelli formati da

oligomeri di PEG e fosfatidil etanolammina (PE), subiscono una clearance

minore all’aumentare delle dimensioni della porzione di PEG [Lukyanov et

al., 2002]. Ciò avviene probabilmente perché i residui di PEG creano un

maggiore impedimento sterico sul sistema e una minore interazione di esso

con le opsonine plasmatiche. Il tempo in cui tali micelle restano in circolo è

leggermente inferiore a quello dei liposomi rivestiti con PEG [Klibanov et

al., 1990], fenomeno che potrebbe essere in parte attribuito alle dimensioni

più piccole delle prime rispetto ai secondi e quindi al più rapido

27
attraversamento dei vasi [Weissig et al., 1998].

b) Micelle stimolo-sensibili

In molti dei tessuti interessati da processi patologici si assiste ad un

aumento di 2-5°C della temperatura e/o ad una diminuzione del pH di 1-2

unità rispetto ai valori fisiologici [Helmlinger et al., 1997; Tannock and

Rotin, 1989]. Si è perciò pensato di incrementare l’efficacia delle micelle

come veicoli di principi attivi rendendole capaci di disgregarsi e rilasciare i

farmaci in risposta a variazioni di pH o di temperatura.

Micelle sensibili a variazioni di pH o di temperatura sono ad esempio

quelle costituite da copolimeri della poli(N-isopropilacrilamide) con acido

poli(D,L-lattico), che sono in grado di disgregarsi nel sito bersaglio [Maeda

et al., 2000; Kohori et al., 1998]. Copolimeri a blocchi pH-sensibili sono

inoltre quelli costituiti da PEG e t-butil metacrilato, etil acrilato o n-butil

acrilato, che sono stati usati per preparare micelle contenenti nel core

indometacina e progesterone [Cammas et al., 1997].

È stato anche dimostrato che micelle formate da copolimeri a blocchi di

poli(2-etil-2-ossazolina)-b-poli(L-lattide) e caricate con doxorubicina sono

capaci di rilasciare questo principio attivo all’interno degli endosomi, al cui

28
interno il pH è acido [Jones et al., 2003; Wang et al., 2005].

Sono stati preparati nanocarriers termosensibili a partire da copolimeri a

blocchi di PEG e N-isopropilacrilamide/2-

[mono(mono/di)lattoilossipropilmetacrilamide] [Bae et al., 2005]. Tali

micelle polimeriche, all’aumentare della temperatura, sono in grado di

rilasciare una quantità maggiore di farmaco incorporato [Liu et al., 2005].

c) Targeting attivo mediante coniugazione con agenti direzionanti

La realizzazione di micelle polimeriche può prevedere la coniugazione

sulla loro superficie di molecole direzionanti [Gao et al., 2005]. Tra i

possibili ligandi vanno ricordati anticorpi [Liaw et al., 2001; Torchilin

2004], porzioni zuccherine, transferrina [Torchilin, 2004; Jule et al., 2003;

Ogris et al., 1999] e residui di folato [Dash et al., 2000]. Gli ultimi due

sono attualmente adoperati nel direzionamento di principi attivi a cellule

tumorali, poiché la maggior parte di esse presenta una sovraespressione

sulla loro superficie di recettori specifici per il folato e per la transferrina.

È stato dimostrato che micelle di dimensioni comprese tra 70 e 100 nm,

formate dai copolimeri anfifilici di PEG e polietileneimina, sono capaci di

direzionare attivamente farmaci, se coniugate con transferrina, a tumori che

29
sovraesprimono il suo recettore [Torchilin, 2004]. Analoghi risultati si sono

ottenuti preparando micelle che espongono sulla loro superficie residui di

folato [Park et al., 2005; Leamon and Low, 2001]. È risaputo infatti che i

carcinomi ovarici, nasofaringei, cervicali e del colon esprimono in maniera

non fisiologica alti livelli di recettori per il folato (FR-α) [Wu et al., 1999].

Sebbene FR-α sia espresso anche in tessuti normali come la placenta, i

tubuli prossimali dei reni e i plessi corioidei, in condizioni fisiologiche la

sua espressione è ridotta e limitata al versante apicale delle cellule

epiteliali, risultando non direttamente accessibile dal torrente ematico per

sistemi coniugati con residui di folato [Weitman et al., 1992].

3. DIREZIONAMENTO ATTIVO AL SNC

Nonostante i sistemi micellari possano accumularsi spontaneamente a

livello di un tumore grazie alla elevata e discontinua vascolarizzazione del

tessuto neoplastico, essi possono anche depositarsi in organi del RES quali

il fegato, la milza e i reni [Licciardi et al., 2006a]. Di conseguenza si può

ottenere un’insufficiente concentrazione del sistema terapeutico nel sito

tumorale.

Si è perciò cercato di ottenere un direzionamento attivo ad uno specifico

30
organo o tessuto al fine di diminuire gli effetti collaterali tossici del

principio attivo e potenziarne l’efficacia, riducendo al tempo stesso la quota

di farmaco da somministrare.

Per un possibile direzionamento attivo al SNC si sono avuti esiti molto

interessanti funzionalizzando la superficie dei sistemi colloidali con

tensioattivi idrofili come i Polisorbati 20, 40, 60 e 80, capaci di interagire

con l’endotelio cerebrale [Kreuter et al., 1997].

Una delle interpretazioni di tale interazione ritiene che ciò sia dovuto

all’adsorbimento di proteine plasmatiche come le apolipoproteine (Apo)

sulla superficie di sistemi rivestiti con Polisorbato (PS), quando questi

vengono somministrati per endovena. Luck [Luck, 1997] osservò infatti

l’adsorbimento di Apo E sulla superficie di nanoparticelle rivestite con

Polisorbato 20, 40, 60 e 80 in plasma umano.

Le Apo sono proteine anfipatiche in grado di legare i lipidi e sono

costituenti delle lipoproteine, aggregati molecolari deputati al trasporto di

colesterolo e trigliceridi nel sangue. L’apo E in particolare, interagendo con

un tipo di lipoproteine, le lipoproteine a bassa densità (Low Density

Lipoproteins, LDL), forma un complesso che viene riconosciuto da uno

specifico recettore, il quale è espresso copiosamente sul versante luminale

31
delle cellule endoteliali
endoteliali che formano la BEE. In seguito all’interazione del

recettore e del complesso LDL-Apo


LDL Apo E,
E si assiste ad un processo di

endocitosi che garantisce al SNC il corretto apporto di lipidi (Figura


Figura 6)
6

[Dehouck
Dehouck et al., 1994; Meresse et al., 1989].
1989

Figura 6.
6 Processo di endocitosi
endocitosi in seguito al legame dell’Apo E con le LDL

In uno studio condotto da Kreuter si osservò che nanoparticelle di

polibutilcianoacrilato (PBCA), aventi in superficie il PS80, erano capaci di

attraversare la BEE per interazione di tali sistemi


sistemi con l’Apo E e per

successiva endocitosi mediata dal


dal recettore del complesso così formato

[Kreuter
Kreuter et al., 2002].
2002].

32
Numerosi studi in vivo hanno dimostrato che il PS80 presente sulla

superficie delle nanoparticelle costituisce un sito di legame per le Apo B e

le Apo E. Le nanoparticelle diventano così in grado di interagire con il

recettore per le LDL, prima di essere internalizzate dalle cellule endoteliali

del microcircolo cerebrale attraverso un processo di endocitosi mediata da

recettore [Kreuter et al., 1995; Alyautdin et al., 2001]. Appare evidente

perciò che le nanoparticelle rivestite con PS80 mimano le LDL adsorbite

sull’Apo E, proteina che è molto espressa nei tumori cerebrali [Murakami

et al., 1988].

Molecole attive come la dalargina e la loperamide furono incorporate in

nanoparticelle per essere veicolate al SNC [Schroeder et al., 1998;

Alyautdin et al., 1997]. Dopo somministrazione queste sostanze bioattive

non esibivano però alcuna azione terapeutica, in quanto non diffondevano

attraverso la BEE. Quando invece i due farmaci erano adsorbiti sulla

superficie di nanoparticelle di PBCA rivestite con PS80, si osservava un

pronunciato effetto analgesico 45 minuti dopo la somministrazione. Il

meccanismo alla base del trasferimento di tali nanoparticelle all’interno del

SNC rimane tuttavia non completamente chiarito.

In seguito a studi condotti successivamente, è stato proposto un probabile

33
effetto tossico delle nanoparticelle di PBCA funzionalizzate con PS80 nei

confronti della BEE: venne ipotizzato che questi sistemi aprissero le

giunzioni serrate tra le cellule endoteliali del microcircolo cerebrale, dando

luogo ad una traslocazione paracellulare [Olivier et al., 1999]. Studi in

vitro e in vivo condotti da Kreuter non hanno evidenziato alcuna

distruzione della BEE determinata dalla presenza di nanoparticelle di

PBCA rivestite con PS80, dal momento che la permeabilità di markers

extracellulari, come glucosio e inulina, non veniva modificata dalla

presenza di tali sistemi colloidali [Kreuter et al., 2003]. Ciò indicava

dunque il mantenimento dell’integrità delle vie paracellulari.

Nanoparticelle di PBCA rivestite con PS80 sono state recentemente

proposte come possibili carriers per il rilascio nel SNC del fattore di

crescita neuronale (NGF) [Abdel Wahab et al., 2005]; quest’ultimo è

essenziale per la sopravvivenza delle cellule gangliari periferiche e dei

neuroni colinergici centrali e, nonostante la sua impossibilità

nell’attraversare la BEE, la sua efficacia nel prevenire le patologie

neurodegenerative potrebbero renderlo idoneo al trattamento di malattie

come il morbo di Alzheimer e la malattia di Huntington. E’ stato

dimostrato infatti che la somministrazione sistemica a ratti di nanoparticelle

34
di PBCA, rivestite con PS80 e su cui veniva fatto adsorbire NGF,

annullavano con successo l’amnesia acuta indotta da scopolamina,

favorendo il ritorno della memoria.

Sono stati quindi proposti diversi meccanismi per spiegare il trasporto del

sistema nanoparticella-farmaco attraverso la BEE [ Kreuter 2001; Kreuter,

2004]; tra questi i più probabili risultano essere:

1) la realizzazione di un gradiente di concentrazione, che migliora la

diffusione passiva del principio attivo grazie al legame delle

nanoparticelle con la superficie interna dei capillari del cervello e

permette l’accumulo del farmaco;

2) l’uptake del carrier colloidale da parte delle cellule endoteliali

mediante endocitosi o transcitosi.

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