Laboratorio biologia molecolare - diabete e metabolismo

Nellarco degli ultimi anni sono state studiate le cause di molte forme monogeniche di diabete ad esordio
precoce EOD (earlyonset diabetes). In questo quadro clinico possono essere inseri il MODY (Maturity
Onset Diabetes of the Young), il MIDD (Maternally Inherited Diabetes and Deafness) e il diabete neonatale.
Definizione
Il MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) descritto per la prima volta nel 1974-1975 da Tattersall la
pi comune forma di diabete monogenico, clinicamente e geneticamente eterogeneo, con trasmissione
autosomica dominante, penetranza completa ed interessamento di almeno 3 generazioni allinterno dello
stesso nucleo familiare, tipicamente diagnosticato prima dei 25 anni o comunque in et giovanile, non
autoimmune e non insulino-dipendente.
Classificazione e prevalenza
Si stima che il MODY sia responsabile del 2-5% dei casi di diabete (a seconda delle popolazioni) anche se
sovente viene impropriamente classificato come diabete di tipo 1 o di tipo 2. Studi di genetica molecolare
hanno dimostrato che questa condizione non riconducibile ad una singola entit eziologica, bens a una
patologia particolarmente eterogenea dal punto di vista clinico e genetico.
Seguendo le linee di classificazione il MODY viene suddiviso in 6 diversi tipi, che interessano 6 geni differenti,
tutti espressi nelle cellule pancreatiche. Sono state descritte mutazioni nonsense, missense, frameshift e di
sito di splicing, distribuite lungo tutti gli esoni dei geni causa di MODY. I geni responsabili di questa forma di
diabete monogenico codificano:

a) per lenzima glucochinasi (GCK-MODY2)

b) per fattori di trascrizione:

hepatocyte nuclear factor-4 (HNF-4-MODY1)

hepatocyte nuclear factor-1 (HNF-1/TCF1 -MODY3)

insulin promoter factor 1 (IPF1-MODY4)

hepatocyte nuclear factor-1 (HNF-1/TCF2-MODY5)

neurogenic differentiation factor 1 (NeuroD1/2-MODY6)

Non tutte le basi genetiche del diabete MODY sono state individuate: molti sono infatti i casi di famiglie in
cui stato dimostrato che i geni responsabili di malattia si trovano al di fuori dei loci MODY attualmente
conosciuti e identificati
I dati epidemiologici presenti in letteratura mettono in evidenza lestrema variabilit della distribuzione dei
vari sottotipi di MODY, in base a diversi fattori come letnia, la regione geografica, let dei pazienti studiati,
ed il metodo di reclutamento del campione.
Studi di coorte hanno evidenziato una differente prevalenza dei vari sottotipi di MODY in popolazioni
diverse. Il MODY 2 stato riscontrato in percentuali variabili dal 10% al 60% di tutti i casi di MODY con
prevalenza maggiore in famiglie francesi e italiane.
Il MODY 3 presenta una prevalenza variabile dal 20% al 65% dei casi (prevalente nelle famiglie inglesi). La
penetranza del MODY 3 a seconda dellet piuttosto significativa: si attesta al 63% nei soggetti fino a 25
anni; sale al 93,6% nei soggetti da 25 a 50 anni, fino ad arrivare ad un 98,7% nei soggetti da 50 a 75 anni; ci
indica come la disfunzione cellulare si instauri progressivamente in questa forma di diabete monogenico.
Le altre forme di MODY sono pi rare in tutti gli studi di coorte, mentre i sottotipi con loci MODY non ancora
identificati (MODY-X) potrebbero rappresentare dal 20% al 50% dei casi, con maggiore prevalenza nelle
famiglie tedesche e spagnole.
attualmente nel nostro laboratorio vengono analizzati i geni che causano MODY2 e MODY3 (quelli con
maggiore prevalenza)
Caratteristiche fenotipiche
In generale sono consigliati i test genetici necessari per una corretta diagnosi di MODY ogni qual volta sia
presente un simile quadro clinico:

Iperglicemia abitualmente diagnosticata prima dei 30 anni di et in almeno uno, meglio se due,
componenti della stessa famiglia. La progressiva riduzione dellet alla diagnosi nelle casistiche
probabilmente riconducibile ad unaumentata attenzione verso queste forme di diabete e
conseguentemente allanticipazione dei test utili per la diagnosi.

Ereditariet di tipo autosomico dominante a trasmissione verticale, attraverso almeno tre

generazioni.

Indipendenza dalla terapia insulinica per almeno cinque anni dopo la diagnosi o livelli di C-peptide
significativi anche in pazienti in terapia insulinica.

Livelli di insulinemia che rientrano nel range di normalit, bench insufficienti a correggere
liperglicemia presente, in considerazione del primitivo difetto nella funzione - cellulare.

Assenza di sovrappeso o di obesit.

Tabella: Caratteristiche cliniche per la diagnosi differenziale dei diabete tipo 1, tipo 2, MODY

Type1 DM

Type2 DM

Common

Increasing

MODY
2-5%of non insulin

Frequency

dependent Diabetics
Genetics

Polygenic

Polygenic

Autosomal Dominant

Family History

<15%

>50%

100%

Ethnicity

Different races

Asians,Polynesians,
Different races
Indigenous,Australians
Throughout
Age of onset

Post-Puberty

<25 yrs

Childhood
Severity of onset

Acute and severe

Mild

Mild/Asymptomatic

Ketosis / DKA

Common

Uncommon

Rare

Obesity

+/-

>90%

+/-

Acanthosis Nigricans

Absent

Common

Absent

Metabolic Syndrome

Absent

Common

Absent

Auto-immunity

Positive

Negative

Negative

Pathophysiology

Cell destruction

Insulin resistance and

relative insulinopaenia

Cell dysfunction

Difetti nel gene che codifica per lenzima glucochinasi

Il MODY 2 causato da mutazioni del gene GCK localizzato sul cromosoma 7, che codifica per lenzima
glucochinasi, uno dei quattro membri della famiglia delle esochinasi, anche chiamata esochinasi IV o D. La
glucochinasi lenzima chiave per la fosforilazione del glucosio a glucosio-6-fosfato in grado di catalizzare
il trasferimento di fosfato da ATP al glucosio nelle cellule del parenchima epatico e nelle isole pancreatiche
con conseguente variazione della concentrazione di glucosio

Figura 1: Modello di beta cellula pancreatica e proteine implicate nel MODY [Figura tratta da: Nyunt O et
al., Investigating maturity onset diabetes of the young, Clin Biochem Rev, 2009].

Dato il ruolo centrale svolto dallenzima glucochinasi nella regolazione dellinsulina facilmente deducibile
che mutazioni nel gene che codifica per questenzima possano portare alterazioni nel metabolismo glucidico
e quindi causare iper o ipoglicemie. Le mutazioni in eterozigosi inattivanti il gene GCK, presentano una
diminuzione dellattivit enzimatica caratterizzato da una leggera forma di diabete, spesso presente fin dalla
nascita ma riscontrata successivamente. Le mutazioni in omozigosi, che inattivano le funzioni del gene GCK,
provocano un fenotipo pi severo con insorgenza, fin dalla nascita, il PNDM (Permanent Neonatal Diabetes
Mellitus). Oltre le forme appena citate, sono state descritte come causa di ipoglicemia mutazioni in
eterozigosi attivanti il gene GCK.

Da un punto di vista strutturale il gene GCK composto da 12 esoni (circa 45,168 bp) ed espresso nel fegato,
nel pancreas e in alcune cellule del sistema nervoso. La presenza di promotori tessuto specifici permettono
la regolazione e la trascrizione differenziale di trascritti che danno luogo a tre differenti versioni dellesone 1
(a,b,c). Il promoter upstream funzionale principalmente nel pancreas ma anche in alcune popolazioni
cellulari del sistema nervoso, il promoter downstream espresso unicamente nel fegato. Gli esoni 1b e 1c
sono espressi nel fegato mentre lesone 1a espresso nelle cellule pancreatiche
Nel nostro Laboratorio valutiamo gli effetti di mutazioni nel gene GCK causa di MODY 2, analizzando
lisoforma 1a espressa specificatamente nelle cellule pancreatiche responsabili di un impatto maggiore
nellorganismo rispetto a quello delle cellule epatiche nel set point del glucosio.
Studi sulle caratteristiche cinetiche delle varianti mutate di GCK hanno dimostrato che lattivit enzimatica
ridotta con un conseguente rallentamento del ciclo glicolitico allinterno della cellula pancreatica. In
vivo, tale rallentamento si traduce in unalterazione della sensibilit al glucosio, per cui sono necessarie
concentrazioni elevate di glucosio per raggiungere la soglia glicemica adeguata a stimolare la secrezione
insulinica. Ci si traduce in uno spostamento verso destra della curva dose-risposta della secrezione
insulinica indotta dal glucosio. Nel fegato si osserva una riduzione della sintesi e del deposito di glicogeno
con un aumento della gluconeogenesi dopo i pasti. Questa alterazione nel metabolismo epatico del glucosio
responsabile delliperglicemia post-prandiale nei pazienti affetti da MODY 2 Nonostante le importanti
alterazioni del metabolismo del glucosio, liperglicemia associata a mutazioni della GCK generalmente
moderata, usualmente responsiva alla sola dietoterapia; meno del 50% dei pazienti affetti presentano un
franco diabete. Paragonato agli altri sottotipi ed al diabete di tipo 2, il MODY 2 presenta una minor
prevalenza di complicanze microvascolari (retinopatia e proteinuria) come prevedibile dal miglior grado di
compenso glicemico raggiunto.

HNF-1
Le mutazioni che causano MODY 3 interessano il gene TCF1/HNF1 localizzato nel cromosoma 12 che
codifica per il fattore di trascrizione HNF1.
I pazienti con queste mutazioni sviluppano la malattia usualmente dopo la prima decade di vita: linsorgenza

di un diabete franco preceduto da alterazioni della secrezione insulinica glucosio-indotta. La penetranza

di questa forma elevata anche se dipendente dallet: la probabilit che la malattia venga diagnosticata
aumenta infatti in modo rilevante fra i 10 e i 40 anni. Al contrario del MODY 2, caratterizzato da una
iperglicemia moderata, il fenotipo caratteristico dei pazienti affetti da MODY 3 una forma differente e pi
grave di diabete che sovente evolve verso linsulino-dipendenza e tende a sviluppare complicanze
microvascolari, come il diabete a insorgenza pi tardiva. LHNF-1 anche espresso a livello delle cellule
tubulari renali e il MODY 3 associato a una ridotta soglia per la glicosuria; ci riflette unalterata
espressione del trasportatore per il glucosio e una disfunzione a carico della componente tubulare renale.
Caratteristiche cliniche e terapia
MODY 2 e MODY 3 rispettivamente causati da mutazioni nei geni che codificano per GCK e HNF-1 sono i
due sottotipi prevalenti, responsabili di circa i due terzi di tutti i casi MODY. Mutazioni in HNF-4 e
TCF2/HNF-1 sono state identificate in poche famiglie e gli altri difetti che causano mutazioni in IPF1 /PDX1
e NEUROD1 sono patologie ancora pi rare. Le differenti alterazioni a livello molecolare possono spiegare
in parte la sostanziale eterogeneit fenotipica dei vari sottotipi, sottesa alle grandi differenze nel decorso
clinico della malattia. In particolare, leterozigosi per la mutazione della GCK causa in genere iperglicemia a
digiuno, presente gi dalla nascita, responsiva alla sola dieta e con basso rischio di complicanze. Al contrario,
mutazioni del HNF-1 e del HNF-4, responsabili di MODY 3 e MODY 1, sono legate a una pi grave
alterazione dellomeostasi del glucosio che in genere richiede un trattamento con ipoglicemizzanti orali gi
in et non troppo avanzata Studi fisiologici e metabolici hanno evidenziato che la secrezione insulinica
mantenuta a normali livelli di glucosio ma progressivamente diminuisce allinizio dellet adulta e aumenta
solo in caso di incremento della glicemia. Per queste ragioni appare evidente che i pazienti con MODY 1 e
MODY 3 hanno un aumentato rischio di sviluppare complicanze micro e macrovascolari. Da notare che i
pazienti con MODY 3 rispondono meglio alleffetto ipoglicemizzante delle sulfoniluree. Tale effetto
particolarmente evidente in caso di deficit di HNF-1, perch il difetto cellulare precede la cascata di
reazioni che inducono la secrezione insulinica dopo lattivazione del recettore delle sulfoniluree. La
definizione delle basi genetiche che conducono alliperglicemia pu quindi avere forti implicazioni nelle
scelte terapeutiche.

Metodo utilizzati per lo studio genetico

Estrazione del DNA
La provetta da utilizzare per effettuare un test genetico deve contenere un anticoagulante come EDTA
(EtilenDiamina-TetrAcetato); questi prelievi possono essere conservati a 20 C per un breve periodo prima
di effettuare lestrazione dellacido nucleico.
Il DNA per lanalisi genetica viene estratto da sangue intero (leucociti) tramite utilizzo di kit commerciali che
prevedono pochi e semplici passaggi (utilizzo di colonnine di silice) oppure tramite il metodo del Salting-Out.
Questo metodo si basa sul principio della diminuzione della solubilit delle proteine e precipitazione delle
stesse ad alte concentrazioni di sale. Questa tecnica estrattiva prevede lisolamento delle cellule nucleate del
campione dopo aver eliminato per lisi i globuli rossi. I leucociti cos isolati vengono trattati allo scopo di
estrarre gli acidi nucleici e degradare le proteine presenti, che vengono allontanate mediante precipitazioni
con sali.
Dopo lestrazione del DNA, la concentrazione dei campioni viene valutata tramite lutilizzo di uno
spettrofotometro (in alternativa fluorimetro o mediante corsa elettroforetica con un gel di agarosio allo
0,8%)

Disegno dei primers

I primers per le reazioni di amplificazione vengono disegnati de novo a partire dalle sequenze presenti nelle
banche dati per i geni GCK e HNF-1 utilizzando il programma PRIMER 3 (http://www-genome.wi.edu/cgibin/primer/primer3_www.cgi) I primers, rispettano le caratteristiche richieste per una progettazione
ottimale: lunghezza da 16 a 20 bp, temperatura di melting (TM) circa uguale per il primer forward e il primer
reverse valutata secondo la formula:
TM = 4(G+C) + 2(A+T) C
lobiettivo del biologo molecolare in questo caso quello di ricercare qualunque variabile genetica
localizzata allinterno delle porzioni codificanti e nelle regioni di regolazione dei geni studiati. Il metodo della
PCR tradizionale per le regioni di interesse seguito del sequenziamento diretto permettono di ottenere
lesatta sequenza nucleotidica degli esoni che costituiscono la porzione codificante del gene.

Amplificazione tramite Polimerasi Chain Reaction (PCR)

Le reazioni di amplificazione per lo studio dei geni GCK, HNF-1 vengono effettuate in un volume finale di 25
l.
I protocolli per le reazioni di PCR di tutte le coppie di primers specifici sono stati messi a punto in laboratorio
ottimizzando le concentrazione di tutta la gamma dei reagenti che compongono la mix di reazione mediante
prove empiriche. Per ogni reazione tramite PCR stato preparato un controllo negativo (senza il DNA) per
identificare eventuali contaminazioni.
La miscela di reazione messa a punto per i geni studiati cos composta:

40-60 ng di DNA genomico in un volume di 3 l

10 X buffer Amplitaq Gold DNA polimerasi senza MgCl2 (Applied Biosystems) 2,5 l

MgCl2 1,5 - 2,0 l/ 2,5 mM

dNTPs 2 l/ 2,5 mM

Primer Forward 0,75 l /20 M

Primer Reverse 0,75 l /20 M

5 U/l AmpliTaq Gold DNA polimerasi (Applied Biosystems) 0,2 l

H2O a volume

I campioni di DNA vengono amplificati tramite la reazione PCR con lutilizzo di un Termo Cycler. Dopo
uniniziale fase di denaturazione a 95C per 10 minuti, stato applicato un numero di cicli ottimizzato per
ogni gene, con una fase di denaturazione a 95C per 30 secondi, una fase di appaiamento per 30 secondi alla
temperatura ottimale primer-specifica e una fase di estensione a 72C per 30 secondi. Dopo lultimo ciclo,
tutti i prodotti di PCR vengono sottoposti ad una estensione finale di 7 minuti a 72C.

Elettroforesi su gel di agarosio

Dopo la reazione di PCR, 5 ul dei prodotti di amplificazione vengono separati elettroforeticamente su un gel
di agarosio al 2% in TBE 1X con aggiunta di bromuro di etidio e visualizzati mediante transilluminatore a luce
UV.

Purificazione dei prodotti PCR

La purificazione dei prodotti PCR pu essere eseguita per mezzo di un composto enzimatico. Questo reagente
costituito da una esonucleasi e una alcalin-fosfatasi, due enzimi proteolitici che permettono di rimuovere i
dNTPs, i primers, e anche i residui di DNA single stranded dal prodotto PCR. Secondo le istruzioni della casa
produttrice, il reagente aggiunto direttamente al prodotto amplificato. Dopo il veloce passaggio da
effettuare in ghiaccio segue un incubazione di 37 C per 15 e una fase di inattivazione enzimatica a 80 C per
15.
La purificazione pu anche essere effettuata con kit commerciali che prevedono un passaggio in colonnine.
Brevemente: il gel della colonnina viene idratato con un tampone adatto e successivamente le colonnine
vengono poste in una microcentrifuga per rimuovere il liquido interstiziale. Il campione viene quindi messo
nella colonnina filtrante e si effettua un secondo passaggio con la microcentrifuga che permette la
purificazione mediante rimozione di componenti a basso peso molecolare.
Reazione di sequenziamento ed analisi delle sequenze
Per le reazioni di sequenza vengono utilizzati reagenti specifici per il sequenziatore (consigliati dallazienda
che produce lo strumento) ed i primers specifici di ciascun frammento.
Le reazioni sono effettuate in un volume finale di 10 l. La composizione finale di una miscela di reazione la
seguente :

DNA 70 ng per un frammento di media lunghezza circa 400bp (20 ng ogni 100bp)

0.3 l primer 10 M (reverse o forward)

3,2 l di mix di buffer di reazione (200 mM Tris HCl pH 8 / 5 mM MgCl2)

0,8 l di Big Dye Terminator Mix (contenente la DNA polimerasi e i dideossinucleotidi marcati
con quattro differenti fluorocromi)

H 2O a volume

Per la reazione di sequenziamento utilizzato il seguente programma da impostare nel Termo- Cycle:

96C per 10

50C per 5

60C per 4

4C per

Per 30 cicli

Per la lettura e lelaborazione dei cromatogrammi di sequenza e sono utilizzati i programmi BIOEDIT e blast
two sequence (NCBI)

Figura: Esempio di Cromatogramma di sequenza

(mutazione in eterozigosi visualizzata tramite un doppio picco nel cromatogramma di sequenza)