BIOLOGIA CELLULARE E BIOTECNOLOGIE VEGETALI

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Dello stesso Editore:

ARIENTI Le basi molecolari della nutrizione BARNES/HUGHES Ecologia marina BATCHELET Matematica per biologi BELLI Patologia vegetale BREWER Principi di ecologia BROWN Genetica molecolare BRUNI/NICOLETTI Dizionario di erboristeria e di toterapia CABRAS/MARTELLI Chimica degli alimenti CASTINO/ROLETTO Statistica applicata CHIARELLI Dalla Natura alla Cultura: Principi di antropologia biologica e culturale CHRISPEELS/SADAVA Biologia vegetale applicata CONNER/HARTL Elementi di genetica ecologica COOPER/HAUSMAN La cellula: un approccio molecolare COZZANI/DAINESE Biochimica degli alimenti e della nutrizione CROMER Fisica per medicina, farmacia e scienze biologiche DALESCIO Il laboratorio di chimica organica DE CICCO/BERTOLINI/SALERNO Patologia post-raccolta dei prodotti vegetali DEL GOBBO Immunologia DEWICK Chimica, biosintesi e bioattivit delle sostanze naturali DISCHIA La chimica organica in laboratorio DOLARA Tossicologia generale e ambientale DURANTI/PAGANI Enzimologia EVANGELISTI/RESTANI Prodotti dietetici FANTONI/BOZZARO/DEL SAL/FERRARI/TRIPODI Biologia cellulare e Genetica FESSENDEN/FESSENDEN Chimica organica FINESCHI Catalogo tassonomico delle rose del Roseto botanico Carla Fineschi FOYES Principi di chimica farmaceutica FRANCHINI/CALZOLARI Leducazione alimentare nellet evolutiva FREEMAN Atlante di anatomia degli invertebrati FREIFELDER Biologia molecolare: lessenziale FREUND/WILSON Metodi statistici GALLI/CORSINI/MARINOVICH Tossicologia GALZIGNA Elementi di enzimologia GARRETT/GRISHAM Principi di biochimica GASTALDO Compendio della ora ofcinale italiana GIGLIOTTI/VERGA Biotecnologie alimentari GIUDICE/AUGUSTI-TOCCO/CAMPANELLA Biologia dello sviluppo GIUNCHEDI/CONTI/GALLITELLI/MARTELLI Elementi di virologia vegetale GRASSI/LABRA/SALA Introduzione alla biodiversit del mondo vegetale HARRISON Biologia umana HOGNESS Analisi qualitativa JANEWAY/TRAVERS/WALPORT/SHLOMCHIK Immunobiologia JAWETZ/MELNICK/ADELBERG Microbiologia medica JUDD et al. Botanica sistematica + CD JUNQUEIRA/CARNEIRO Istologia KEISLER Elementi di analisi matematica KOLTHOFF Clinica analitica quantitativa LEPORATTI/FODDAI/TOMASSINI Testo-atlante di anatomia vegetale e delle piante ofcinali MADER Biologia lessenziale MAFFEI Biochimica vegetale MARZONA Chimica delle fermentazioni e microbiologia industriale MASTERTON/HURLEY Chimica: Principi e reazioni MAUGINI/MALECI BINI/MARIOTTI LIPPI Manuale di botanica farmaceutica MCKNIGHT/HESS Geograa sica MCMURRY Chimica organica MCNEILL/ALEXANDER Gli invertebrati MEZZOGIORNO/MEZZOGIORNO Compendio di anatomia umana MICHELIN LAUSAROT/VAGLIO Stechiometria per chimica generale MILLER Ambiente, Risorse, Sostenibilit MINELLI/DEL GRANDE Anatomia comparata dei vertebrati MITA/FEROCI Fisica biomedica MONESI Istologia NIELSEN/FORLANI Gli erbicidi ODUM Fondamenti di ecologia PAGANI/ABBOTTO Chimica eterociclica PASQUA/ABBATE/FORNI Botanica generale e diversit vegetale PETRUCCI/HARWOOD/HERRING Chimica generale PILATO Guida pratica per il riconoscimento dei gruppi animali PIPKIN Geologia ambientale QUADERNI DI BIOCHIMICA QUADERNI DI BIOLOGIA VEGETALE Serie Verde: SALA/CELLA Colture di cellule vegetali LOVISOLO et al. Le infezioni da virus nelle piante BENNICI Lo sviluppo nei vegetali superiori RIGANO Ciclo biologico dellazoto GAVAZZI/SALAMINI Mutagenesi e miglioramento delle piante coltivate BALDACCI La diagnosi delle malattie delle piante ALPI et al. Ormoni delle piante e toregolatori sintetici BONFANTE/GIOVANNETTI Le micorizze VERONA Unit biologiche individuali come biocenosi NUTI La ssazione biologica dellazoto GAVAZZI La genetica dei pigmenti nelle piante PACINI/FRANCHI Il polline: biologia e applicazioni RANALLI Miglioramento della patata NIELSEN/FORLANI Gli erbicidi RAVEN/JOHNSON/MASON/LOSOS/SINGER Biologia RHOADES/PFLANZER Fisiologia generale e umana RIGHETTO Lecosistema urbano RINALLO Botanica delle piante alimentari ROHEN/YOCOCHI/LTJEN-DRECOLL Atlante a colori di anatomia umana descrittiva e topograca RUPPERT/BARNES Zoologia: gli invertebrati SAVELLI/BRUNO Analisi chimico farmaceutica SENATORE Biologia e botanica farmaceutica SICA/ZOLLO Chimica dei composti eterociclici farmacologicamente attivi SILIPRANDI/TETTAMANTI Biochimica medica SLOWINSKI Laboratorio di chimica TAIZ/ZIEGER Fisiologia vegetale WHITTEN/DAVIS/PECK/STANLEY Chimica generale WILSON/BOSSERT Introduzione alla biologia delle popolazioni ZIEGLER Conoscenze attuali in nutrizione

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GABRIELLA PASQUA

BIOLOGIA CELLULARE E BIOTECNOLOGIE VEGETALI

AUTORI S. COZZOLINO, G.P. DI SANSEBASTIANO, C. FORNI, A. GENRE, L. LANFRANCO, A. MICCHELI, G. PASQUA, L. TRAINOTTI, A. VALLETTA

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VIETATA PER LEGGE LA RIPRODUZIONE IN FOTOCOPIA E IN QUALSIASI ALTRA FORMA vietato riprodurre, archiviare in un sistema di riproduzione o trasmettere sotto qualsiasi forma o con qualsiasi mezzo elettronico, meccanico, per fotocopia, registrazione o altro, qualsiasi parte di questa pubblicazione senza autorizzazione scritta dellEditore. Ogni violazione sar perseguita secondo le leggi civili e penali.

ISBN 978-88-299-2124-9

Stampato in Italia 2011, by Piccin Nuova Libraria S.p.A., Padova www.piccin.it

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AUTORI

Prof. Salvatore Cozzolino Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale Complesso Universitario di Monte S. Angelo Universit di Napoli Federico II Dr. Gian Pietro Di Sansebastiano Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali Universit del Salento Prof.ssa Cinzia Forni Dipartimento di Biologia Universit di Roma Tor Vergata Dr. Andrea Genre Dipartimento di Biologia Vegetale Universit di Torino

Prof.ssa Luisa Lanfranco Dipartimento di Biologia Vegetale Universit di Torino Dr. Alfredo Miccheli Dipartimento di Chimica Universit di Roma Sapienza Prof.ssa Gabriella Pasqua Dipartimento di Biologia Ambientale Universit di Roma Sapienza Prof. Livio Trainotti Dipartimento di Biologia Universit di Padova Dr. Alessio Valletta Dipartimento di Biologia Ambientale Universit di Roma Sapienza

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PREFAZIONE

Il testo si propone di approfondire lo studio dellorganizzazione strutturale e funzionale della cellula vegetale, di cui sono state poste le basi nel corso di Botanica Generale e di illustrare le potenzialit biotecnologiche di cellule, tessuti ed organismi vegetali. Il testo stato scritto grazie allesperienza degli autori stessi nei campi della Biologia Cellulare, della Biochimica e delle Biotecnologie Vegetali e sulla base delle pi recenti acquisizioni pubblicate su riviste internazionali e monograe di rilievo. Il testo rivolto principalmente agli studenti dei corsi di laurea in Biologia, Biotecnologie ed Agraria ed i contenuti sono stati pensati per rispondere alle esigenze dei nuovi ordinamenti didattici; non solo per fornire gli strumenti utili a superare gli esami, ma anche per stimolare la curiosit in campi in rapida e costante evoluzione. Alla ne di ogni capitolo sono state indicate alcune letture di approfondimento che si possono trovare facilmente nel web ed ogni docente che adotter questo testo potr stimolare gli studenti a cercare nuovi articoli per restare aggiornati. Il libro diviso in quattro parti: la prima e la seconda trattano della Biologia Cellulare Vegetale che, grazie allapporto di nuove tecnologie ed anche alla luce di tutte le nuove conoscenze derivanti dalle scienze omiche, ha fatto passi da gigante. Questo ha contribuito ad una migliore comprensione dei processi biologici, con una visione integrata dellorganismo, come un sistema complesso, portan-

do alla nascita della Biologia dei Sistemi. Inoltre lo studio delle cellule staminali in campo animale ha fatto emergere grande attenzione e prospettive anche in campo vegetale, precedentemente relegato a pochi specialisti. Nella terza e quarta parte vengono descritti i principali sistemi sperimentali e le tecniche di studio della biologia cellulare, classiche e innovative, con lobiettivo di far comprendere le profonde e molteplici connessioni tra ricerca di base ed applicata. La realizzazione di questo testo si deve ad un gruppo di giovani docenti e ricercatori della Biologia Vegetale italiana, altamente considerati nel mondo scientico internazionale, con i quali ho avuto il piacere di collaborare perch entusiasti del loro lavoro, e che hanno trattato i diversi argomenti, spesso complessi, in modo esauriente ed aggiornato. Il testo corredato di unampia iconograa a colori con immagini e schemi originali che, grazie anche al prezioso aiuto dellillustratore Marco Marzola, possono rendere lo studio pi attraente. Vorrei rivolgere un grazie particolare allEditore Dr. Massimo Piccin che mi ha stimolato a scrivere questo testo, dopo il successo che ha riscosso nei diversi atenei italiani il libro di Botanica Generale e Diversit Vegetale, mettendomi a disposizione il suo prezioso staff che ha collaborato con grande competenza e pazienza. GABRIELLA PASQUA

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INDICE GENERALE

PARTE PRIMA LA CELLULA VEGETALE

1 Lo studio della cellula vegetale . . . . . . . 3
A. Genre, G.P. Di Sansebastiano 1.1 La cellula vegetale come massima espressione della complessit degli eucarioti. . 3 1.1.1 Dinamicit della cellula vegetale . . . . . . . . . 4 1.2 Mitocondri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.3 Microcorpi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.4 La biologia della cellula vegetale come modello per la comprensione della cellula umana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.4.1 Segnali legati alla luce e ciclo circadiano. . . 10 1.4.2 Immunit innata e recettori intracellulari . . 11 1.4.3 Proteine Argonauta e silenziamento genico. . 11 1.4.4 Scoperta di nuovi meccanismi molecolari e nuove potenzialit sperimentali . . . . . . . . . . 11 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3.2 Il DNA mitocondriale: origine ed evoluzione, organizzazione e contenuto . . . . . . . . . . . . . . 30 3.2.1 Ricombinazione ed eteroplasmia . . . . . . . . 33 3.2.2 Sterilit maschile citoplasmatica . . . . . . . . 34 3.3 Il DNA plastidiale: origine ed evoluzione, organizzazione e contenuto . . . . . . . . . . . . . . 35 3.4 Il trasferimento di DNA dagli organelli al nucleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.5 Lespressione genica negli organelli . . . . . . . 40 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4 Il sistema di endomembrane . . . . . . . 43
G.P. Di Sansebastiano 4.1 Il Reticolo Endoplasmico . . . . . . . . . . . . . . . 43 4.1.1 Reticolo Endoplasmico Rugoso . . . . . . . . . 46 4.1.2 Traslocazione e maturazione delle proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.1.3 Reticolo Endoplasmico Liscio. . . . . . . . . . . 47 4.1.4 Altri domini funzionali del reticolo endoplasmico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 4.2 Lapparato di Golgi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 4.2.1 Matrice del Golgi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.2.2 Funzioni dellapparato di Golgi . . . . . . . . . 50 4.3 Il Trans Golgi Network e lendocitosi . . . . . . 51 4.4 Esocitosi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.5 Maturazione delle membrane attraverso variazioni della loro composizione lipidica e proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.6 Trasporto vescicolare . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.7 Determinanti della specicit nel trafco vescicolare: SNARE e Rab. . . . . . . . . . . . . . . 55 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

2 Il nucleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
S. Cozzolino 2.1 Organizzazione generale del nucleo e del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.1.1 Involucro nucleare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.1.2 Scambi nucleo-citoplasma . . . . . . . . . . . . . 14 2.1.3 DNA e cromosomi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.4 Proteine istoniche e non istoniche . . . . . . . 17 2.1.5 Controllo epigenetico della trascrizione: limprinting genomico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.2 Il ciclo cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2.1 Ciclo cellulare mitotico . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2.2 Regolazione del ciclo cellulare . . . . . . . . . . 20 2.2.3 Divisione cellulare: mitosi e meiosi . . . . . . 21 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

5 I vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
G.P. Di Sansebastiano, C. Forni 5.1 Biogenesi dei vacuoli e organizzazione del complesso vacuolare. . . . . . . . . . . . . . . . . 59 5.2 Il succo vacuolare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 5.2.1 Meccanismi di accumulo dei avonoidi nei vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

3 Il genoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
L. Lanfranco 3.1 Il genoma nucleare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.1.1 Progetti genoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

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5.3 Proteine intrinseche del tonoplasto . . . . . . . . 64 5.4 Acidicazione dei compartimenti endomembranosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 5.5 Crescita per distensione, turgore e movimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 5.6 Accumulo e degradazione delle proteine . . . . 66 5.6.1 Trasporto delle proteine solubili verso i vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 5.6.2 VSD sequenza specici e loro recettori . . . . 67 5.6.3 VSD C-terminali e i loro recettori . . . . . . . . 67 5.6.4 VSD inuenzati dalla struttura sica della proteina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 5.6.5 Compartimento pre-vacuolare . . . . . . . . . . 69 5.6.6 Trasporto alternativo al vacuolo . . . . . . . . 69 5.7 Potenziale biotecnologico . . . . . . . . . . . . . . . 69 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . . 70

INDICE GENERALE

7.3.1 Lamella mediana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 7.3.2 Parete primaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 7.3.3 Parete secondaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 7.4 Ruolo della parete nella crescita e nel differenziamento cellulare . . . . . . . . . . 104 7.4.1 Divisione ed espansione cellulare e loro controllo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 7.4.2 Modicazioni della parete nel differenziamento cellulare . . . . . . . . . . . 107 7.4.3 Separazione cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . 109 7.4.4 Plasmodesmi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 7.5 Le funzioni della parete . . . . . . . . . . . . . . . . 111 7.5.1 Trasporto apoplastico e simplastico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 113

6 Il citoscheletro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
A. Genre 6.1 Le componenti del citoscheletro . . . . . . . . . . 71 6.1.1 Microtubuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 6.1.2 Microlamenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 6.1.3 Filamenti intermedi . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 6.1.4 Proteine associate al citoscheletro . . . . . . . 78 6.2 Il citoscheletro nel differenziamento cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 6.2.1 Il citoscheletro durante il ciclo mitotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 6.3 La regolazione del citoscheletro . . . . . . . . . . 85 6.4 Il citoscheletro nelle interazioni tra piante e microrganismi . . . . . . . . . . . . . . . 86 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

8 I plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
G. Pasqua 8.1 Proplastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 8.2 Biogenesi e differenziamento dei plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 8.2.1 Divisione dei plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . 117 8.2.2 Stromuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 8.3 Morfologia, struttura e funzione dei differenti tipi di plastidi . . . . . . . . . . . . . 119 8.3.1 Cloroplasti e pigmenti fotosintetici . . . . . . 119 8.3.2 Interazioni tra DNA nucleare e plastidiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 8.3.3 Cromoplasti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 8.3.4 Ezioplasti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 8.3.5 Leucoplasti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 8.3.6 Gerontoplasti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 8.4 Origine evolutiva dei plastidi . . . . . . . . . . . . 129 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 130

7 La parete cellulare. . . . . . . . . . . . . . . . 89
L. Trainotti 7.1 I polimeri della parete . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 7.1.1 Cellulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 7.1.2 Emicellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 7.1.3 Pectine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 7.1.4 Proteine strutturali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 7.1.5 Lignina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 7.1.6 Acqua e altre molecole . . . . . . . . . . . . . . . . 97 7.2 La biosintesi dei polimeri di parete . . . . . . . . 98 7.2.1 Biosintesi della cellulosa . . . . . . . . . . . . . . 98 7.2.2 Biosintesi dei polimeri di matrice . . . . . . . 100 7.2.3 Biosintesi della lignina e degli altri composti fenolici . . . . . . . . . . . . 102 7.2.4 Assemblaggio dei componenti della parete . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 7.3 La struttura della parete . . . . . . . . . . . . . . . . 103

9 La comunicazione cellulare. . . . . . . . 131

A. Genre, L. Lanfranco 9.1 I recettori di membrana . . . . . . . . . . . . . . . . 131 9.2 La segnalazione mediata da endosomi. . . . . 135 9.2.1 Endocitosi dei recettori di membrana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 9.2.2 Endosomi come piattaforme citoplasmatiche di segnalazione . . . . . . . . . . 136 9.3 Le MAP chinasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 9.4 Il ruolo del calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 9.4.1 Generazione del segnale . . . . . . . . . . . . . . 140 9.4.2 Decodica del segnale . . . . . . . . . . . . . . . 141 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 143

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INDICE GENERALE

XI
12.2.2 Disidratazione, diafanizzazione, inltrazione ed inclusione . . . . . . . . . . . . . . 181 12.2.3 Taglio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 12.2.4 Colorazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 12.3 Microscopio stereoscopico. . . . . . . . . . . . . 184

PARTE SECONDA CRESCITA E DIFFERENZIAMENTO

10 Crescita e dierenziamento cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
G. Pasqua, C. Forni 10.1 Totipotenza delle cellule vegetali. . . . . . . . 147 10.2 Crescita per divisione e per distensione. . . 152 10.3 Cellule meristematiche e cellule adulte . . . 153 10.4 Controllo del destino cellulare . . . . . . . . . . 155 10.4.1 RNA, proteine che si legano al RNA e regolazione dellespressione genica . . . . . 156 10.4.2 Ruolo dei ribosomi nello sviluppo . . . . . 160 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 161

13 Microscopia a uorescenza . . . . . . 187

A. Genre 13.1 La uorescenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 13.2 I uorocromi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 13.2.1 Proteine uorescenti . . . . . . . . . . . . . . . . 189 13.3 Il microscopio ottico a epiuorescenza . . . 192 13.4 Preparazione del campione . . . . . . . . . . . . 195 13.5 Applicazioni in ambito vegetale. . . . . . . . . 196 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 198

11 Morte cellulare programmata e necrosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163

G. Pasqua 11.1 Morte cellulare programmata (apoptosi) e necrosi nei diversi organismi (animali, piante, batteri) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 11.2 Morte cellulare nelle piante: meccanismi di attivazione, geni coinvolti e modelli di studio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 11.3 Morte cellulare programmata nei processi di sviluppo vegetativi e riproduttivi . . . . . . . 167 11.4 Morte cellulare programmata nel differenziamento degli elementi vascolari xilematici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 11.5 Morte cellulare programmata in risposta ai patogeni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 11.6 Senescenza e abscissione . . . . . . . . . . . . . . 170 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 171

14 Microscopia confocale . . . . . . . . . . . . 199

A. Genre 14.1 Il microscopio confocale a scansione laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 14.1.1 Laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 14.1.2 Pinhole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 14.1.3 Fotomoltiplicatori . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 14.1.4 Che cosa signica confocale? . . . . . . . . . 201 14.2 Sezioni ottiche e ricostruzioni 3D . . . . . . . 201 14.3 Applicazioni della microscopia confocale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 14.3.1 FRET e FRAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 14.4 Altri tipi di microscopi confocali . . . . . . . . 207 14.4.1 Microscopio confocale a disco di Nipkow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 14.4.2 Microscopio confocale multifotone . . . . . 208 14.5 La microscopia confocale su campioni vegetali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 210

PARTE TERZA TECNICHE CELLULARI E MOLECOLARI

12 Microscopia ottica. . . . . . . . . . . . . . 175
A. Valletta 12.1 Il microscopio ottico composto . . . . . . . . . 176 12.1.1 Percorso della luce . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 12.1.2 Ingrandimento e potere di risoluzione . . 177 12.1.3 Obiettivi a secco e ad immersione . . . . . 178 12.1.4 Profondit di campo . . . . . . . . . . . . . . . . 179 12.1.5 Contrasto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 12.2 Preparazione del campione per il MO . . . . 180 12.2.1 Prelievo e ssazione . . . . . . . . . . . . . . . . 180

15 Microscopia elettronica . . . . . . . . . . . 211

A. Valletta 15.1 Microscopia elettronica a scansione . . . . . 211 15.1.1 SEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 15.1.2 Interazione tra il fascio elettronico incidente e il campione e generazione dei segnali. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 15.1.3 Preparazione del campione. . . . . . . . . . . 216 15.1.4 ESEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 15.2 Microscopia elettronica a trasmissione . . . 218 15.2.1 TEM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218 15.2.2 Preparazione dei campioni biologici per losservazione al TEM . . . . . . . . . . . . . . 220 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 222

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16 Ibridazione in situ ed immunocitochimica . . . . . . . . . . . . . . 223
A. Valletta, C. Forni 16.1 Tipi di sonda impiegati per lISH e loro sintesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 16.2 Preparazione del campione per lISH . . . . 227 16.3 Reazione di ibridazione e lavaggi . . . . . . . 227 16.4 Rivelazione dei segnali di ibridazione . . . . 228 16.5 Controllo della specicit dellibridazione . 228 16.6 Ibridazione in situ uorescente e genomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229 16.7 Immunocitochimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 16.7.1 Antigeni ed anticorpi. . . . . . . . . . . . . . . . 231 16.8 Immunolocalizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . 232 18.1.1 Marker. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 16.8.2 Preparazione del campione. . . . . . . . . . . 233 16.8.3 Metodi per IEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni . . . . . . . . . . . . . . . 235

INDICE GENERALE

PARTE QUARTA BIOTECNOLOGIE CELLULARI VEGETALI

18 Coltura in vitro di cellule e tessuti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
A. Valletta 18.1 Selezione, sterilizzazione e messa in coltura degli espianti . . . . . . . . . . . . . . . . 269 18.2 Mezzi colturali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 18.3 Lutilizzo di regolatori di crescita nelle colture in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 18.4 Principali tipi di colture in vitro . . . . . . . . . 275 18.4.1 Colture di cellule indifferenziate . . . . . . . 275 18.4.2 Colture di organi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 18.4.3 Saggi di vitalit cellulare . . . . . . . . . . . . 282 18.5 Variabilit somaclonale . . . . . . . . . . . . . . . 284 18.5.1 Origine della variabilit somaclonale . . 284 18.5.2 Selezione di varianti somaclonali . . . . . . 285 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 285

17 Dalla genomica alla metabolomica verso la biologia dei sistemi . . . . . . . . . . 237

S. Cozzolino, C. Forni, L. Lanfranco, A. Miccheli 17.1 Genomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 17.1.1 Metodi classici di sequenziamento del genoma: BAC e WGS . . . . . . . . . . . . . . . 237 17.1.2 Tecnologie di sequenziamento massimo di nuova generazione. . . . . . . . . . . 241 17.2 Trascrittomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244 17.2.1 RT-PCR quantitativa . . . . . . . . . . . . . . . . 244 17.2.2 Array . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244 17.2.3 Sequenziamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 17.3 Proli di espressione genica: dagli organi alle cellule . . . . . . . . . . . . . . . . 249 17.4 Proteomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251 17.4.1 Separazione delle proteine . . . . . . . . . . . 252 17.4.2 Proli proteici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 17.4.3 Spettrometria di massa . . . . . . . . . . . . . . 254 17.4.4 Proteomica quantitativa . . . . . . . . . . . . . 255 17.4.5 Puricazione per afnit di complessi proteici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256 17.5 Metabolomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256 17.5.1 Metodi analitici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 17.5.2 Analisi multivariata dei dati e modelli . . 260 17.5.3 Analisi dei ussi metabolici mediante impiego di substrati marcati con 13C: analisi degli isotopomeri . . . . . . . . . . . . . . . 261 17.5.4 Applicazioni della metabolomica nella biologia vegetale . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 265

19 Propagazione in vitro delle piante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287

G. Pasqua 19.1 Micropropagazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 19.2 Coltura di apici vegetativi per risanamento delle piante da virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 19.3 Organogenesi in vitro (caulogenesi, rizogenesi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 19.4 Embriogenesi somatica . . . . . . . . . . . . . . . 292 19.4.1 Confronto tra embiogenesi zigotica e somatica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 19.4.2 Embriogenesi somatica diretta e indiretta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294 19.4.3 Fattori induttivi e ruolo degli ormoni . . . 294 19.4.4 Analisi molecolare e marcatori dellembriogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 19.4.5 Fecondazione in vitro . . . . . . . . . . . . . . . 297 19.4.6 Semi articiali o sintetici . . . . . . . . . . . . 298 19.5 Embriogenesi da polline, produzione di piante apolidi e diploidi omozigoti . . . . . 299 19.5.1 Manipolazione genetica del polline e produzione di embrioni transgenici . . . . . . 301 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 302

20 Conservazione ex situ del germoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303

C. Forni 20.1 Biodiversit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 20.2 Strategie per la conservazione del germoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303

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23 Dalla scala di laboratorio alla scala industriale: sistemi cellulari . . . . . . . . . . 341
A. Miccheli 23.1 Dalle cellule in sospensione alle cellule immobilizzate. . . . . . . . . . . . . . . 341 23.2 Idrogeli e tecnologie per limmobilizzazione in gel. . . . . . . . . . . . . . . 343 23.2.1 Sodio alginato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344 23.2.2 Preparazione delle sfere di alginato . . . . 345 23.3 Sistemi cellulari immobilizzati: aspetti diffusivi e relativi modelli. . . . . . . . . 346 23.3.1 Diffusione in gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347 23.3.2 Diffusione in gel contenente cellule . . . . 348 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 348

20.3 Metodi di conservazione del germoplasma ex situ . . . . . . . . . . . . . . . . 304 20.3.1 Conservazione negli Orti Botanici . . . . . 304 20.3.2 Banche del seme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 20.3.3 Crioconservazione . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 308

21 Cellule vegetali come biofabbriche di prodotti chimici e farmaceutici . . . . . 311

G. Pasqua con la collaborazione di A.R. Santamaria 21.1 Metaboliti secondari e loro ruolo nelle piante . . . . . . . . . . . . . . . . 311 21.2 Uso dei metaboliti secondari in campo farmaceutico, cosmetico ed agroalimentare. . 315 21.3 Metaboliti secondari da colture di cellule ed organi in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317 21.4 Strategie per incrementare la produzione di metaboliti secondari in sistemi in vitro . . 319 21.4.1 Ottimizzazione delle condizioni colturali per aumentare la resa . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319 21.4.2 Selezione delle linee cellulari, trasformazioni geniche ed ingegneria metabolica per aumentare la produttivit di metaboliti secondari . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 21.4.3 Permeabilizzazione di membrane per il recupero dei metaboliti . . . . . . . . . . . . 321 21.4.4 Immobilizzazione cellulare . . . . . . . . . . . 322 21.4.5 Elicitazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322 21.4.6 Produzione di metaboliti in bioreattore . 323 21.5 Biotrasformazione di substrati per produrre molecole di interesse industriale . . . . . . . . . 324 21.6 Estrazione ed analisi chimica dei metaboliti secondari . . . . . . . . . . . . . . . . 325 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 326

24 Dalla scala di laboratorio alla scala industriale: bioreattori . . . . . . 349

A. Miccheli 24.1 Modelli cinetici di crescita cellulare . . . . . 350 24.2 Trasferimento di massa in bioreattori . . . . 351 24.2.1 Modello di trasferimento dellossigeno . 352 24.2.2 Ossigeno come substrato limitante la crescita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354 24.3 Bioreattori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354 24.3.1 Shake asks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355 24.3.2 Stirred tank reactors . . . . . . . . . . . . . . . . 356 24.3.3 Bioreattori pneumatici o airlift reactors . 356 24.3.4 Bioreattori a letto sso o a letto uidizzato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 358

25 Ingegneria genetica nelle piante . . 359

L. Trainotti, L. Lanfranco, G.P. Di Sansebastiano 25.1 Tecniche di trasformazione genica. . . . . . . 359 25.1.1 Metodi chimico-sici . . . . . . . . . . . . . . . . 361 25.1.2 Metodi biologici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 25.2 Strumenti molecolari dellingegneria genica . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 25.2.1 Vettori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 25.2.2 Sistemi di selezione . . . . . . . . . . . . . . . . . 372 25.2.3 Promotori per le biotecnologie vegetali . 375 25.2.4 Geni reporter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377 25.3 Il silenziamento genico mediato da piccoli RNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378 25.3.1 Basi molecolari dei meccanismi di silenziamento mediato da piccoli RNA. . . 378 25.3.2 Applicazioni del silenziamento genico mediato da piccoli RNA per la manipolazione genetica . . . . . . . . . . . 385 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 388

22 Bioproduzioni e biomasse . . . . . . . 329

C. Forni, G.P. Di Sansebastiano 22.1 Biomassa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329 22.2 Uso energetico delle biomasse . . . . . . . . . 330 22.3 Biocarburanti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331 22.3.1 Produzione di olio vegetale puro e biodiesel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331 22.3.2 Produzione di bioetanolo . . . . . . . . . . . . 332 22.3.3 Produzione di biogas. . . . . . . . . . . . . . . . 334 22.4 Valutazione delle biomasse per la sostituzione dei combustibili fossili e la diminuzione dei cambiamenti climatici . . 334 22.5 Bioproduzione di polimeri . . . . . . . . . . . . . 335 22.5.1 Biotecnologie bianche . . . . . . . . . . . . 335 22.5.2 Biotecnologie rosse. . . . . . . . . . . . . . . 336 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 339

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26 Aspetti applicativi della transgenesi nei sistemi vegetali . . . . . . . . . . . . . . . . . 389
L. Lanfranco, G.P. Di Sansebastiano, L. Trainotti 26.1 I sistemi sperimentali vegetali . . . . . . . . . . 390 26.1.1 Specie modello . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390 26.1.2 Dicotiledoni: Arabidopsis, Solanaceae, Pioppo, Fabaceae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390 26.1.3 Monocotiledoni: riso, mais . . . . . . . . . . . 393 26.1.4 La briota Physcomitrella patens . . . . . . 394 26.2 I caratteri ingegnerizzabili . . . . . . . . . . . . . 395 26.2.1 Piante transgeniche di prima generazione: resistenza agli insetti, agli erbicidi e ai virus . . . . . . . . . . . . . . . . . 395

INDICE GENERALE

26.2.2 Piante transgeniche per il miglioramento degli aspetti nutrizionali . . . 397 26.2.3 Piante transgeniche come bioreattori per la produzione di proteine eterologhe . . . 398 26.2.4 Piante transgeniche per la produzione di biocombustibili . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 26.3 Il dibattito sul rischio biotecnologico . . . . 402 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 404

Indice analitico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405

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