LA CALIBRAZIONE

RELAZIONI LINEARI FRA DUE VARIABILI

In generale, si afferma che «fra due variabili vi è un legame» quando le variazioni di una causano variazioni
dell’altra; in particolare:

• quando le due variabili possono essere associare da una legge del tipo: y = f(x) per cui si dice che a un valore di
x corrisponde uno e un solo valore di y; oppure

• quando le due variabili possono essere correlate in modo generico, nel senso che non esiste una vera e propria
legge, conosciuta e rigorosa, che le metta direttamente in relazione, ma è possibile tracciare una curva di
regressione che permette di evidenziare un legame più o meno forte fra loro.

Importante è quindi studiare la «qualità» e la «forza» della relazione che lega due variabili. In particolare, l’analisi
della correlazione consente di studiare il grado di associazione fra due variabili, mentre l’analisi della regressione
ci consentirà di stabilire quale relazione esiste fra esse.

Nelle procedura generale di calibrazione vengono fatte due assunzioni:

• gli errori nella procedura sperimentale sono solo delle y, cioè nei valori misurati del segnale analitico
(ordinate); le concentrazioni standard x, preparate dall’analista, sono prive di errore;
• l’entità degli errori sulle y è indipendente dalla concentrazione di analita (omoschedasticità: la varianza delle
risposte misurate è costante in tutto l’intervallo di concentrazione);
• Gli errori sulle y sono indipendenti l’uno dall’altro, cioè l’errore commesso ad un livello di concentrazione non
influenza l’errore ad un livello di concentrazione diverso.
 CORRELAZIONE
Quando due variabili non sono legate fra loro da una legge nota e studiata, ma mostrano, se riportate su un
diagramma cartesiano, un certo grado di associazione lineare o meno, è possibile quantificare l’intensità di tale
legame mediante un parametro elaborato da Pearson, detto coefficiente di correlazione (r) o (R) , che nel caso di
una correlazione lineare è dato da:

(x1,y1), (x2,y2)…. …. (xi,yi) sono i singoli punti

x = media dei valori di x

y = media dei valori di y
La posizione (x ,y ) è detta CENTROIDE
R può assumere valori -1 < R < +1 ; un valore R = -1 indica correlazione negativa perfetta, cioè tutti i punti sperimentali
giacciono su una linea retta di pendenza negativa. Quando R =1 c’è una perfetta correlazione positiva. R = 0 non
significa che x e y non sono correlate ma solo che non sono correlate linearmente. Nella pratica analitica si ha spesso a
che fare con valori di R ˃ 0,99. S utilizza spesso anche R2, coefficiente di correlazione quadratico; vale la relazione R ˃ R2.
L’interpretazione numerica deve comunque essere sempre accompagnata dall’analisi visuale del grafico di calibrazione
stesso perché talvolta un alto valore di R può essere fuorviante e portare ad una cattiva interpretazione.

METODO DEI MINIMI QUADRATI

Assumendo che sia stata verificata una relazione lineare tra il segnale analitico e la concentrazione, occorre trovare la
miglior retta che passa per i punti sperimentali. Dato che si assume che tutti gli errori siano sulle y, viene ricercata la retta
che minimizza le deviazioni o distanza (residui) lungo le y tra i punti sperimentali yi e la retta calcolata (di = yi –yi, dove yi
rappresenta i valori di y che si ottengono sostituendo ogni valore sperimentale (xi) nell’equazione di regressione e yi sono i
corrispondenti valori ottenuti sperimentalmente). Queste deviazioni sono positive e negative per cui si minimizza la
somma dei quadrati dei residui. Questo spiega il termine «metodo dei minimi quadrati» dato alla procedura. La retta viene
calcolata facendola passare attraverso il centroide. Si può dimostrare che per la retta y = bx + a:

Ciò equivale a minimizzare la seguente funzione:  d2i = (yi – yi)2

RETTA DI REGRESSIONE TRACCIATA CON IL METODO DEI MINIMI QUADRATI. LA
RETTA CHE MEGLIO SI ADATTA AI PUNTI SPERIMENTALI E’ QUELLA CHE CONSENETE
DI MINIMIZZARE TUTTE LE DISTANZE (di), OVVERO GLI SCARTI, TRA I PUNTI
SPERIMENTALI E LA RETTA
Ciò equivale a minimizzare la seguente funzione:  d2i = (yi – yi)2
ERRORI NELLA PENDENZA E INTERCETTA
La retta così ottenuta viene in pratica usata per stimare la concentrazione di un campione incognito per
interpolazione. Gli errori casuali nei valori della pendenza e dell’intercetta sono quindi importanti e devono essere
considerati.
La deviazione standard dei residui è data da:

n-2 corrisponde al numero dei gradi di libertà della regressione lineare, dato dal fatto che una sola retta può essere
tracciata tra due punti. Da questo valore si calcola la deviazione standard della pendenza:

E deviazione standard dell’intercetta:

Quando si costruisce una curva di calibrazione non è detto che debba per forza passare dal punto (0,0)
a meno che non l’abbia confermato la misurazione di un bianco.

Il bianco del metodo e’ un campione contenente tutti i componenti eccetto l’analita e viene
sottoposto a tutti gli stadi della procedura analitica.

Il bianco ideale è costituito dalla stessa matrice in cui è contenuto l'analita di interesse.
Un bianco di riferimento dovrebbe riflettere tutte le operazioni a cui e’ soggetto l’analita in un
campione reale.

Grazie al bianco e’ possibile ottenere il segnale relativo alla concentrazione zero di analita.

L’intercetta b e’ quindi il segnale dello strumento per un BIANCO

L’intervallo di linearita’ (range lineare) di un metodo analitico esprime l’intervallo di concentrazione
nel quale il segnale varia linearmente con la concentrazione.
Una buona curva di calibrazione avra’ un ampio intervallo di linearita’
L’intervallo dinamico (range dinamico) di un metodo analitico e’ l’intervallo di concentrazione nel
quale vi e’ una risposta misurabile anche se non lineare.
Il calcolo della concentrazione di un campione utilizzando una curva di calibrazione va solamente
fatto all’interno dell’intervallo di linearita’

Intervallo
dinamico

Intervallo di
linearita’
Risposta

0 C1 C2
Concentrazione
 SENSIBILITA’
La sensibilita’ di un metodo indica quanto esso e’ sensibile ad una piccola variazione di concentrazione di
analita. Puo’ essere vista come la pendenza della curva di calibrazione. Nella figura il metodo che ha una
risposta lineare y = 2.5 x + 0.3 e’ 5 volte piu’ sensibile del metodo che mostra una risposta y = 0.5 x + 0.3.

Sensibilita’ come funzione della pendenza di una curva di risposta

A y = 2.5x + 0.3
risposta
y = 0.5 x + 0.3

C
concentrazione

La pendenza m della curva di calibrazione e’ quindi la SENSIBILITA’

 LIMITE DI RIVELABILITÀ E DI QUANTIFICAZIONE

Il limite di rivelabilità (LDR), o minima quantità rivelabile (in inglese limit of detection o LOD), è la
concentrazione di analita che produce un segnale significativamente diverso da quello del bianco
(soluzione in cui l'analita è virtualmente assente).

LDR è un segnale vicino a quello del bianco ma da esso significativamente differente, e quindi
assegnabile all'analita sulla base di un criterio specifico.
La definizione del LDR dipenderà dal criterio usato per accertarsi che il segnale sia
significativamente diverso da quello del bianco.

Quando un segnale è maggiore del limite di rilevabilità possiamo dire che l’analita è presente nel
campione, ma per stabilire il limite oltre il quale è legittimo eseguire misure quantitative è necessario
definire il limite di quantificazione (LDQ), in inglese limit of quantitation o LOQ.
Il limite di rilavabilità è strettamente correlato al rumore, ovvero alla variabilità della
misura, che può essere di natura sia strumentale (legato alla variabilità del sistema di
lettura del segnale) sia analitica (legata alla possibilità di commettere errori casuali).

Vi sono modi differenti per definire tali limiti.

Una definizione del limite di rivelabilita’ e quantificazione ampiamente utilizzata:

LOD = Segnale del bianco (Sb) + 3sb

LOQ = Segnale del bianco (Sb) + 10s

Dove sb e’ la deviazione standard di una serie di almeno dieci campioni di bianco o di

bianco fortificato con la minima concentrazione accettabile (che produce un segnale
misurabile, ma diverso da zero, determinata in base a prove preliminari).

Comunemente si considera che un campione tra il limite di rivelabilita’ e quello di

quantificazione sia nella regione di rivelabilita’ e quindi non quantificabile.