Lezione n° 12 del 23/03/2017

Materia: Fisiologia
Appunti di: Edoardo Perdoncin
Argomenti: Liberazione del neurotrasmettitore, ciclo delle vescicole sinaptiche, inibizione presinaptica e
facilitazione presinaptica

La lezione di oggi è l’ultima sulla trasmissione sinaptica, dalla prossima inizieremo a parlare del muscolo e
della contrazione muscolare.

LIBERAZIONE DEL NEUROTRASMETTITORE

Riprendendo i 5 stadi della trasmissione sinaptica di tipo chimico, abbiamo già trattato 3 stadi nel dettaglio.
In questa lezione descriveremo l’immagazzinamento del neurotrasmettitore nella vescicola sinaptica e i
processi che stanno alla base del rilascio di trasmettitori nello spazio sinaptico. Entrambi sono processi che
avvengono nel neurone presinaptico.
In questa lezione ci concentreremo su 3 aspetti:
1. Il rilascio del neurotrasmettitore avviene attraverso l’esocitosi di vescicole sinaptiche e affinché
questo avvenga è necessario che all’interno del bottone presinaptico aumenti la concentrazione di
calcio. Questo ione entra nel bottone sinaptico attraverso canali voltaggio dipendenti specifici.
L’ingresso del calcio è determinato dall’invasione nel bottone sinaptico del potenziale di azione. La
depolarizzazione di membrana non determina direttamente l’esocitosi delle vescicole, è
indispensabile unicamente per permettere al calcio di entrare. In assenza di calcio la trasmissione
sinaptica viene completamente bloccata in tutti i tipi di sinapsi, sia per il rilascio delle vescicole a
centro chiaro, con i neurotrasmettitori classici, sia per il rilascio di quelle a centro denso, con i
neuropeptidi.
2. A seguito di stimolazione da parte di un potenziale d’azione, la concentrazione complessiva di calcio
nel bottone presinaptico varia dal valore normale di 100 nM a 110 nM e persiste per centinaia di
millisecondi. Questa variazione però non è sufficiente a determinare l’esocitosi delle vescicole, sono
necessarie concentrazioni molto superiori a 1 µM.
3. In un bottone sinaptico sono presenti qualche centinaio di vescicole di scorta (circa 200-300).
Supponendo che un neurone scarichi a 10 Hz, cioè 10 potenziali d’azione al secondo, e rilasci una
sola vescicola per scarica, ci vorranno circa 600 vescicole per un minuto di attività. In un minuto,
quindi, andrebbero rilasciate più del doppio delle vescicole di scorta presenti. Questo significa che
all’interno del bottone presinaptico deve esserci un meccanismo di riciclo (recycling) veloce e molto
efficiente delle vescicole per sostenere l’attività sinaptica di un neurone. In realtà, la frequenza di 10
Hz presa come esempio precedentemente è bassa per molti neuroni.
Inoltre, in questa lezione, capiremo in che modo il rilascio del neurotrasmettitore possa avvenire in
0,2/0,3 ms dopo l’arrivo del potenziale d’azione. Il ritardo sinaptico varia da sinapsi a sinapsi, nel caso
migliore è di 0,5 ms, tipicamente è di 1-2 ms.

LIBERAZIONE QUANTICA DEL NEUROTRASMETTITORE

Un concetto fondamentale per la trasmissione sinaptica chimica è quello della liberazione quantica del
neurotrasmettitore. Questo non viene rilasciato in modo continuo, in quantità variabili a piacere, ma
attraverso quantità unitarie minime definite quanti (il termine è stato preso dalla fisica quantistica, ma non
ha niente a che vedere con quest’ultima). Il neurotrasmettitore viene rilasciato in quantità multiple di questo
quanto che, come vedremo, corrisponde al contenuto di una vescicola.
Le vescicole non vengono esocitate esclusivamente quando arriva un potenziale d’azione, ma vi è un rilascio
spontaneo e continuo di neurotrasmettitore; è stato inizialmente studiato a livello delle placche neuro-
muscolari, ma si è poi visto essere valido per tutte le sinapsi, anche a livello centrale.
Se registriamo il potenziale di membrana vicino alla placca motrice di una fibra muscolare a riposo, cioè senza
stimolazione da parte di un nervo motore, osserviamo dei potenziali di 0,5-1 mV (dipende dove ci
posizioniamo) che avvengono spontaneamente. Questi hanno grossomodo la forma dei potenziali di placca,
ma sono molto più piccoli e si propagano elettrotonicamente. Infatti, se ci spostiamo anche solo di 1 mm
dalla placca, vediamo che il potenziale si attenua fino a scomparire, propagandosi passivamente con
decremento. Per questo motivo sono stati chiamati potenziali di placca in miniatura. Quando invece viene
stimolato dal nervo motore, si ha un potenziale di placca vero e proprio, così ampio da portare sempre il
potenziale di membrana a livello soglia; parte quindi un processo autorigenerativo con il potenziale d’azione
che si propaga lungo la membrana senza decremento. A distanza di 1 mm, il potenziale di placca che si
propaga elettrotonicamente è scomparso, ma rimane il potenziale d’azione che si rigenera e si propaga lungo
la membrana.

I potenziali di placca in miniatura, chiamati anche MEPP (dall’inglese “miniature end plate potential”),
vengono rilasciati con una frequenza di circa uno al secondo.
Si è dimostrato che i MEPP rappresentano il rilascio spontaneo, tramite
esocitosi, di singole vescicole sinaptiche: vengono liberate
indipendentemente, e con bassa probabilità, dall’arrivo del potenziale
d’azione dal nervo motore. Generalmente la depolarizzazione indotta dal
potenziale d’azione e il conseguente aumento del calcio all’interno del
bottone sinaptico aumentano la probabilità di rilascio delle vescicole
sinaptiche.
È stato dimostrato che il potenziale di placca non è altro che la somma di
un numero elevato di quanti unitari di neurotrasmettitore.
Tramite questo esperimento studiamo un potenziale di placca indotto da
un potenziale d’azione, quindi tramite stimolazione del motoneurone.
Guardando il grafico, il piccolo artefatto indica il momento esatto in cui lo
stimolo viene applicato. A sinistra di esso, cioè prima della stimolazione,
vediamo potenziali di placca in miniatura spontanei (indicati con “S”) e non
correlati allo stimolo; infatti, in tutti questi casi a volte ci sono e a volte no
ad intervalli casuali. A destra invece, il picco rappresenta il potenziale di
placca. Quest’ultimo è stato ridotto di ampiezza attraverso una riduzione
della concentrazione di calcio extracellulare: basse concentrazioni di calcio
determinano bassi potenziali di placca. Successivamente, a questo potenziale indotto sperimentalmente
possono seguire ancora altri potenziali di placca in miniatura spontanei.
Misurando l’ampiezza dei potenziali di placca, indotti sempre in condizioni di basse concentrazioni di calcio
extracellulare, si nota che questi rappresentano un multiplo di una unità minima, il cui valore è pari a quello
dei potenziali di placca in miniatura spontanei.
Nell’immagine sottostante, l’istogramma nel riquadro mostra l’ampiezza dei potenziali di placca in miniatura
(intorno a 0,4-0,5 mV).
Se facciamo un altro istogramma con le distribuzioni delle ampiezze dei potenziali indotti (sempre in
condizioni di basse concentrazioni di calcio extracellulare), notiamo che c’è un numero elevato di questi bassi
potenziali che hanno esattamente la stessa ampiezza dei potenziali di placa in miniatura; a volte vengono
rilasciati con ampiezza doppia, cioè 0,8 mV, o tripla (o superiori): questo indica che il potenziale d’azione ha
rilasciato rispettivamente due o tre (o più) vescicole. In alcuni casi l’entrata di calcio non è sufficiente a far
rilasciare nemmeno una vescicola (indicati nel grafico con “Mancata risposta”).

Circa il 90% dell’acetilcolina rilasciata nella giunzione neuromuscolare viene liberata in modo lento e continuo
dalle centinaia di zone attive presenti sulla placca neuromuscolare. Dato che questo rilascio avviene in modo
asincrono, non genera un potenziale d’azione. Invece, quando arriva un potenziale d’azione, il rilascio
sincrono di un grande numero di vescicole determina una depolarizzazione tale da indurre la contrazione del
muscolo.
Da ricordare che la giunzione neuromuscolare rappresenta un’eccezione nella famiglia delle sinapsi chimiche,
in quanto si ha un rapporto 1:1 tra potenziale d’azione nell’elemento presinaptico e nell’elemento post-
sinaptico (fibra muscolare scheletrica); nella maggior parte dei casi non è, invece, così, e si avranno potenziali
post-sinaptici di pochi mV, mentre nel caso della giunzione neuromuscolare si arriva anche a 70 mV.
Considerando che il potenziale di placca in miniatura è di 0,5 mV e la variazione di voltaggio necessaria per
aprire un singolo canale è circa 0,3 µV (il professore dice che tale valore non è da ricordare, ndr), si calcola
che il rilascio di un quanto apre circa 2000 canali; per ogni canale servono due molecole di acetilcolina, che
si legano alle due subunità α; considerando inoltre che una certa quota di acetilcolina diffonde via dallo spazio
sinaptico prima ancora di riuscire ad attivare un canale e un’altra quota viene idrolizzata dalla acetilcolina
esterasi prima che possano legarsi al canale, possiamo dire che un quanto contenuto in una vescicola
corrisponde a circa 5000 molecole di acetilcolina. Il potenziale di placca nella giunzione neuromuscolare
richiede il rilascio di circa 150 quanti che vengono liberati da circa 300 zone attive. Questo ci dice che ogni
volta che arriva un potenziale d’azione sulla placca neuromuscolare, ogni zona attiva rilascia un quanto
(quando va bene), mentre in molti casi infatti non ne libera neanche uno. Nell’esempio precedente la
probabilità di rilascio di una vescicola per ogni zona attiva era del 50% (300/150). A livello muscolare abbiamo
un valore così grande di potenziale d’azione postsinaptico perché viene rilasciato un numero elevato di
vescicole sinaptiche (circa 100-200).
Tutto questo avviene anche nel sistema nervoso centrale. La probabilità di rilascio di un quanto a livello delle
sinapsi centrali varia dal 10% al 90%: 90% indica che quasi sempre viene rilasciata una vescicola, 10% indica
che il bottone sinaptico rilascia una volta su dieci una vescicola sinaptica quando viene invaso da un
potenziale d’azione. Questo permette la plasticità sinaptica, infatti la probabilità di rilascio del
neurotrasmettitore viene modulata in modo plastico e adattativo attraverso i meccanismi che abbiamo in
parte visto nelle lezioni precedenti. Oltre a variare la probabilità di rilascio, questi meccanismi plastici e
adattativi a livello sinaptico determinano il cambiamento anche del numero di bottoni sinaptici e di zone
attive in essi contenuti.
Nelle sinapsi centrali un bottone può presentare da 1 a 4 zone attive e un potenziale d’azione determinare il
rilascio da 0 a 2 vescicole per ogni zona attiva, con il rilascio da 1 a 5 quanti per bottone. I canali attivati a
livello postsinaptico nel sistema nervoso centrale sono in numero minore rispetto a quelli attivati nella
giunzione neuromuscolare perché la loro densità è minore. Per questo motivo l’EPSP, il potenziale
postsinaptico eccitatorio, nel SNC è di circa 1-2 mV o inferiore.
Ci sono anche delle eccezioni, per esempio la sinapsi tra fibra rampicante e cellula di Purkinje nel cervelletto:
in questo caso abbiamo un rapporto 1:1 tra il potenziale d’azione che viaggia nella fibra rampicante e il
potenziale d’azione generato dalla cellula di Purkinje. Questo avviene perché la fibra rampicante, come dice
il nome stesso, si arrampica e si avvinghia intorno alla proiezione dendritica della cellula di Purkinje formando
circa 10000 bottoni sinaptici; viene rilasciato così tanto glutammato da indurre un potenziale postsinaptico
eccitatorio talmente ampio da far scaricare non solo un potenziale in quest’ultima cellula, ma un treno ad
alta frequenza di potenziali. Questa eccezione è determinata quindi dal fatto che l’assone contrae un numero
elevatissimo di bottoni sinaptici con la cellula postsinaptica.
Bisogna sempre ricordare che tutto questo può essere modificato in modo adattativo dal tipo di attività con
la quale questa sinapsi viene attivata.

In questo esperimento (in cui si utilizza il neurone di calamaro

gigante, ma il concetto vale per tutte le sinapsi) la membrana
presinaptica viene depolarizzata a diversi livelli e mantenuta
a tal valore di depolarizzazione per un certo periodo di
tempo. Si nota che la corrente sinaptica determinata dal
calcio nel bottone aumenta in funzione del livello di
depolarizzazione. Inoltre, in funzione delle variazioni di
concentrazione di calcio (determinato dalla variazione della
corrente del bottone presinaptico entrante) si registrano
potenziali postsinaptici di ampiezza maggiore. Questo vuol
dire che la quantità di neurotrasmettitore rilasciato nello
spazio sinaptico aumenta all’aumentare della concentrazione
di calcio all’interno del bottone presinaptico. L’esperimento
è stato condotto utilizzando tetradotossina (TTX) e
tetraetilammonio (TEA) per impedire alla cellula
postsinaptica di generare un potenziale d’azione,
consentendoci di misurare soltanto il potenziale
postsinaptico eccitatorio. Bloccando infatti l’entrata di calcio,
il potenziale d’azione postsinaptico non si verifica e l’ampiezza del potenziale postsinaptico eccitatorio
dipenderà dalla quantità di neurotrasmettitore rilasciato, che è a sua volta funzione della variazione di
concentrazione di calcio a livello del bottone presinaptico.
VARIAZIONI DI CALCIO NEL BOTTONE PRESINAPTICO
La variazione di calcio a livello presinaptico in
seguito a stimolazione di un potenziale d’azione è
solo del 10%, un valore troppo basso per
determinare un aumento fisiologicamente
significativo della probabilità di rilascio di una
vescicola sinaptica. A livello della zona attiva i
canali del calcio sono concentrati dove le vescicole
sinaptiche sono già ancorate alla membrana,
pronte per l’esocitosi. La concentrazione di calcio
intorno ai canali voltaggio dipendenti per questo
ione è di 500 µM subito intorno ad esso e, nel giro di pochi micrometri, di 100 µM: questo è un valore molto
superiore alla concentrazione generale del bottone sinaptico. Ogni vescicola è circondata da numerosi canali
del calcio nel raggio di 50 nm, i quali sono talmente vicini ad esse da indurre localmente (questa area viene
chiamata microzona) un aumento elevatissimo di concentrazione dello ione: aumenta migliaia di volte. La
concentrazione complessiva generale rimane alta per centinaia di millisecondi, ma nelle vicinanze di una
vescicola sinaptica la concentrazione di calcio aumenta rapidamente e dura per un periodo di tempo molto
basso.

In questa immagine sono mostrate le concentrazioni di calcio a livello della terminazione sinaptica di una
giunzione neuromuscolare. Dove la concentrazione è elevata sono presenti canali voltaggio dipendenti.
Andando ad un ingrandimento maggiore è possibile notare che i canali del calcio della membrana
presinaptica sono concentrati all’altezza delle zone in cui sulla membrana postsinaptica sono presenti i
recettori per l’acetilcolina.

Se misuriamo la velocità di liberazione del neurotrasmettitore al picco

in funzione della concentrazione di calcio nel bottone sinaptico
notiamo che il 50% della liberazione lo abbiamo con una
concentrazione di calcio di circa 1 µM. Basta quindi la concentrazione
di 1 µM per determinare una liberazione al 50% della vescicola
sinaptica. In realtà le variazioni di concentrazione raggiunte
localmente in un bottone sinaptico sono di 20-30 µM. Inoltre la forma
di questa curva indica che esiste un legame di tipo cooperativo tra più
molecole di ioni calcio e il meccanismo molecolare che sta alla base
della liberazione della vescicola. Si è visto essere necessari 5 ioni
calcio: se si legano 2-3 ioni la probabilità è molto bassa, se sono 5 la
probabilità aumenta in modo non lineare.
RITARDO SINAPTICO
Il ritardo sinaptico è l’intervallo di tempo tra l’arrivo del
potenziale d’azione nel bottone presinaptico e l’insorgere del
potenziale postsinaptico.
Nel grafico la curva superiore indica il potenziale d’azione
presinaptico e quella inferiore la corrente di calcio
presinaptica, cioè la velocità con la quale lo ione entra nel
bottone sinaptico (e non la concentrazione!). Il picco della
corrente di calcio arriva dopo 600-700 ms dopo l’arrivo del
potenziale d’azione (nella registrazione dice “600-700 ms” ma
sul grafico è indicato 0,6 ms, ndr); Questo appresenta una
componente significativa dell’intero ritardo sinaptico. Una
volta arrivati al picco della corrente del calcio, la liberazione
del neurotrasmettitore avviene pochi millisecondi dopo, cioè
molto rapida.
C’è un meccanismo per cui l’ingresso di calcio nella cellula
promuove il rilascio del neurotrasmettitore attraverso
vescicole con un ritardo bassissimo. Il ritardo tra la liberazione
del neurotrasmettitore e la corrente postsinaptica è
praticamente inesistente perché è determinato dalla
diffusione passiva nello spazio sinaptico: tramite la relazione
di Einstein abbiamo visto che per distanze così brevi è questione di µs.
È evidente che la maggior parte del ritardo sinaptico è determinata dal tempo necessario per aprire i canali
voltaggio dipendenti al calcio, i quali, nonostante siano molto veloci, sono il fattore limitante.
Come vedremo dopo, ci vuole più di uno ione calcio che si lega al sistema di proteine che determina la fusione
della vescicola con la membrana della zona attiva: è necessario che ne concorrano 5 attraverso legami di tipo
cooperativo.

CANALI Ca2+ VOLTAGGIO DIPENDENTI NEI NEURONI

I canali al calcio voltaggio dipendenti che possiamo trovare nei neuroni, alcuni anche nei muscoli, sono 5 e
derivano da geni diversi.
I canali coinvolti nelle sinapsi a livello presinaptico sono i P/Q e, soprattutto, N. Questi hanno un rilascio
rapido del calcio, sono tra i più veloci e ciò nonostante sono il fattore che induce maggiormente il ritardo
sinaptico.
I canali L e T li incontreremo ancora perché sono presenti, oltre che a livello neuronale, anche nei muscoli. I
canali di tipo L sono quelli che prevalentemente determinano la contrazione del muscolo scheletrico e
cardiaco. Sono decisamente molto più lenti rispetto a quelli a livello presinaptico.
I canali di tipo T si trovano nel cuore dove sono importanti per determinare l’azione delle cellule segnapasso
(cellule pacemaker, che hanno un’attività ritmica) e sono fondamentali per aumentare la depolarizzazione
spontanea che avviene in queste cellule. Questo tipo di canale è presente anche a livello del SNC.
Il quinto tipo è rappresentato dal canale R presente nei neuroni.
A livello dei bottoni sinaptici troviamo i P/Q e gli N, ma non gli L e T.
I primi quattro canali (L, P/Q, N, R) hanno bisogno di un voltaggio elevato (40mV) per essere aperti, sono
poco sensibili, occorre infatti che arrivi un potenziale d’azione perché si aprano in modo significativo. I canali
T sono più sensibili perché basta una variazione di voltaggio molto piccola per attivarli.
Nella zona attiva sono ancorate le vescicole sinaptiche. Tutti i puntini allineati visibili nell’immagine (A) sono
proteine di membrana, più precisamente sono i canali per il calcio.
A seguito di stimolazione massiva si notano delle fossette che rappresentano i punti di esocitosi (immagine
(B)). La fusione della membrana vescicolare con quella plasmatica in sezione forma una struttura a omega Ω.

Dopo la stimolazione massiva della zona attiva, sempre in quest’area, si ha la formazione di cavità vellutate:
rappresentano le vescicole coperte da clatrina che vengono recuperate dalla membrana. Questo processo va
avanti per più di un minuto; non è l’unico meccanismo di recupero, ma è il più lento e interviene in seguito
ad attivazione massiva della sinapsi.
Le vescicole già pronte per l’esocitosi sono unite da un “nastro” di proteine che le mantiene in situ. Il tempo
richiesto da una vescicola del pool di riserva per migrare fino alla zona attiva è troppo lungo, per questo si ha
l’esocitosi di quelle già ancorate.
CICLO DELLE VESCICOLE SINAPTICHE
MOBILITAZIONE DELLE VESCICOLE SINAPTICHE
Il calcio è indispensabile per aumentare la probabilità di esocitosi.
Non è indispensabile solo per questo motivo, ma anche per la
mobilitazione delle vescicole sinaptiche. Le vescicole di riserva, circa
200-300, si trovano legate al citoscheletro, principalmente ai
filamenti di actina. La sinapsina (di cui ne esistono più tipi), una
proteina della membrana vescicolare, tiene legate le vescicole al
citoscheletro. Il calcio che entra dai canali voltaggio dipendenti,
soprattutto gli N ma anche P/Q, favorisce l’esocitosi e
contemporaneamente va ad attivare una proteinchinasi calcio-
calmodulina dipendente (4 ioni calcio legano una molecola di
calmodulina). La proteinchinasi, così attivata, va a fosforilare le
sinapsine favorendo il distacco delle vescicole dal citoscheletro.
La sinapsina fosforilata va a legare un’altra vescicola (appena
recuperata tramite riciclaggio vescicolare) e insieme si fisseranno ai
filamenti di actina per ricostituire il pool di riserva.

PRIMING ED ESOCITOSI
Sulla membrana della vescicola sinaptica ci sono numerose proteine, per alcune delle quali non si conoscono
ancora le funzioni.
Sono importanti per legare le vescicole alla zona attiva, per promuovere l’esocitosi e per accumulare il
neurotrasmettitore all’interno della vescicola stessa.
Un ruolo fondamentale è svolto dal complesso SNARE (acronimo, la cui traduzione significa “intrappolare”),
costituito da 3 proteine, il cui meccanismo si mantiene conservato e inalterato per tutta la filogenesi (a partire
dai lieviti, passando per batteri e vegetali, arrivando fino all’uomo), il quale sta alla base della fusione tra
membrane cellulari diverse.
La prima proteina è la sinaptobrevina, una v snare (“v” sta per vescicle, indica che si trova sulla membrana
della vescicola), le altre sono SNAP-25 e Sintaxina, entrambe t snare (“t” sta per target, cioè la membrana
del bottone sinaptico). Queste tre proteine si legano insieme in modo molto forte grazie ad una quarta
proteina, Munc18, che inizialmente è legata alla Sintaxina. Se si idrolizzasse anche solo una di queste,
l’esocitosi delle vescicole non avverrebbe e di conseguenza nemmeno la trasmissione sinaptica.
Il primo passaggio della fusione vescicolare è mettere a contatto le due membrane. Entrambe, però,
contengono sulla loro superficie esterna delle cariche negative con la relativa acqua di idratazione legata alla
testa dei fosfolipidi di membrana. Per poterlo fare occorre un ambente energeticamente favorevole: non è
così semplice avvicinare le due membrane. Inizialmente si pensava che queste tre proteine, unendosi a
formare il complesso SNARE, insieme a Munc18 fossero importanti anche per determinare l’esocitosi. In
seguito si è dimostrato che questa ipotesi era sbagliata.
La loro funzione è quella di permettere il priming, cioè mettono la vescicola in posizione per l’esocitosi. Ci
sono dei meccanismi di altre proteine che, in questo momento, bloccano il rilascio della stessa. Nonostante
ciò, in alcuni casi è possibile notare un iniziale poro di fusione che però non progredisce fino all’esocitosi
completa. Forse questo meccanismo è la causa dei potenziali di placca in miniatura spontanei.
Il legame tra le 3 proteine che formano lo SNARE è così forte che, in seguito ad esocitosi determinata dal
calcio attraverso altre proteine, per staccare e recuperare la vescicola dalla membrana è necessario utilizzare
energia scindendo ATP tramite la proteina NSF (fattore solubile).
Sinaptobrevina, Sintaxina e SNAP-25 sono il bersaglio di azione di molte tossine che provocano paralisi. Per
esempio le tossine del botulino e del tetano. I vari tipi di tossina idrolizzano le tre proteine in punti diversi
bloccando la trasmissione sinaptica. Per quanto riguarda il botulino abbiamo paralisi dei muscoli mentre per
il tetano il meccanismo è più complesso perché viene trasportato a livello centrale dal flusso assonico e qui
blocca la trasmissione degli interneuroni inibitori provocando una contrazione tonica.
Senza il priming, l’esocitosi non può avvenire.
Ci sono altre due proteine: Munc13 (che non ha niente a che fare con Munc18) e RIM. RIM, insieme a
Munc13, sembra essere importante per inibire la fusione delle membrane (e quindi che l’esocitosi avvenga
in modo incontrollato) e per riconoscere e legare Rab3. Le vescicole, una volta liberate dal citoscheletro,
devono essere indirizzate verso la zona attiva. Non è chiaro il meccanismo con cui questo avviene ma è noto
che la proteina Rab3 svolge un ruolo importante in questo processo. Rab3 è una proteina monomerica che
lega GTP, idrolizzandolo, e che si trova legata alla membrana della vescicola.

Per far avvenire l’esocitosi è presente un sensore di calcio, il quale è una proteina della vescicola: la
Sinaptotagmina. Questa presenta due siti di legame extracellulari, C2A e C2B, che legano rispettivamente 3
e 2 ioni calcio. In totale, quindi, sono 5 gli ioni calcio ad essere legati a questa proteina. Questo rispecchia
molto bene il modello visto precedentemente (quando abbiamo parlato della probabilità di rilascio del
neurotrasmettitore in funzione della concentrazione di calcio) che prevendeva il legame cooperativo di 5 ioni
calcio. Quando avviene il legame tra Sinaptogamina e 5 ioni calcio, le due membrane si fondono e si forma
un poro di fusione e avviene l’esocitosi.
Nella maggior parte dei casi la membrana della vescicola non si fonde completamente con quella
presinaptica: si forma un poro attraverso il quale il neurotrasmettitore diffonde rapidamente e si richiude.
Resta aperto per pochissimo tempo, frazioni di millisecondo.
La fusione completa può avvenire solo nei casi di attivazione massiccia della sinapsi, cioè quando la frequenza
di esocitosi è molto elevata. Quindi, in condizioni normali questo non avviene e si viene a creare una fusione
solo parziale, con la formazione di un poro di fusione che poi si chiude.

Considerando il ciclo delle vescicole sinaptiche, abbiamo già trattato la maggior parte dei meccanismi.
Ora prenderemo in esame più dettagliatamente quello di Rab3. Una volta che la vescicola si stacca dal
citoscheletro dal pool di riserva deve essere indirizzata. Rab3, quando lega GTP, entra a far parte della
membrana vescicolare e, con meccanismi non ancora chiarissimi, ne determina l’indirizzamento. Il
riconoscimento di RIM e Munc13 è condizione necessaria per portarla nella zona attiva e formare il
complesso SNARE che determina il priming. Dopo il priming, Rab3 idrolizza il GTP in GDP + P i, processo che
utilizza energia, e torna nel citoplasma per riformare Rab3-GTP che a sua volta compirà nuovamente il ciclo.
Questo meccanismo richiede energia sia per portare la vescicola e farla fondere, sia per sciogliere il
complesso SNARE per recuperare la membrana vescicolare. Infatti NSF, attraverso idrolisi di una molecola di
ATP, permette lo scioglimento del complesso SNARE.
Nell’immagine viene mostrato il recupero tramite clatrina, il quale avviene solo in particolari condizioni.
MECCANISMI DI RECUPERO VESCICOLE SINAPTICHE
I meccanismi di recupero delle vescicole sinaptiche sono 3, di cui uno avviene molto raramente e, molto
probabilmente, non ha valore fisiologico vero (anche se è stato riscontrato in condizioni sperimentali).
1. Poro di fusione reversibile: avviene più frequentemente. Bastano da poche decine a centinaia di
millisecondi per il recupero perché si viene a formare un poro di fusione (attraverso il quale il
neurotrasmettitore esce per diffusione nello spazio sinaptico) e non un incorporamento completo
della membrana vescicolare con quella della zona attiva. La vescicola, dopo essersi richiusa, torna nel
citoplasma (dove ci sono dei meccanismi per concentrare il neurotrasmettitore in essa) e nel pool di
riserva.
2. Riciclaggio mediato da clatrina: avviene in seguito a stimolazione frequente, con elevata frequenza
di scarica. del bottone sinaptico. In questo caso si ha la fusione completa delle due membrane. Il
meccanismo è molto più lento, dura circa un minuto, e richiede la clatrina, proteina intracellulare
che tira verso l’interno la porzione di membrana vescicolare. La vescicola appena formata non può
essere riempita direttamente ma deve entrare prima nel sistema endosomiale per poi essere
ricostituite, richiedendo per questo tempi decisamente più lunghi (qualche minuto).
3. Recupero di massa: avviene quando l’attivazione è molto forte e c’è fusione massiva di numerose
vescicole. Non richiede l’intervento della clatrina. Probabilmente questo meccanismo non accade a
livello fisiologico.
Il primo meccanismo di recupero della vescicola è, quindi, molto rapido ed efficiente, il che è dovuto
principalmente alla mancata fusione completa delle due membrane.

CARICAMENTO DEL NEUROTRASMETTITORE NELLA VESCICOLA

Nella vescicola il neurotrasmettitore è molto più concentrato rispetto all’esterno, motivo per cui è necessario
un meccanismo di trasporto attivo secondario, che opera contro gradiente di concentrazione. Stiamo
parlando di neurotrasmettitori a basso peso molecolare perché i neuropeptidi vengono sintetizzati e caricati
nelle vescicole a livello del soma, vicino al nucleo, poi trasportati al bottone sinaptico tramite flusso assonico.
È un trasporto attivo secondario, e non primario, perché avviene uno scambio con idrogenioni e non un
ingresso diretto. Le molecole di neurotrasmettitore vengono portate dentro sfruttando l’energia potenziale
dovuta alla differenza di concentrazione di idrogenioni tra ambiente interno ed esterno. Questo scambio
implica che l’interno della vescicola deve essere precedentemente acidificato tramite inserimento di H+. Sulla
membrana, infatti, è presente una pompa ATPasica che funge da pompa protonica. Questa, scindendo ATP
in ADP+P, sposta contro gradiente gli idrogenioni dal citoplasma alla vescicola. Il pH raggiunto è circa 5,5
mentre all’esterno rimane 7. Questo discorso è valido per tutti i tipi di neurotrasmettitori.
La struttura degli scambiatori è simile: una singola proteina con 12 domini transmembrana. Ne sono stati
identificati 4. Uno specifico per l’acetilcolina (vAChT, presente soltanto nei neuroni colinergici), uno unico per
tutte le monoamine (vMAT), uno per il glutammato (vGluT) e uno comune per GABA e glicina (vGAT) che
sappiamo essere due neurotrasmettitori tipici delle sinapsi di tipo inibitorio. “v” presente nella sigla sta per
vescicolare, di seguito si trova la sigla della molecola e “T”, cioè trasportatore.
MECCANISMO DI RECUPERO DEI NEUROTRASMETTITORI
Vediamo ora i trasportatori che permettono il recupero dei neurotrasmettitori a livello o della glia o del
bottone sinaptico, a seconda dei tipi di sinapsi. Ci sono 3 classi di trasportatori:
1. Trasportatore del glutammato: codificato da specifici geni. Inizialmente si pensava che questo canale
fosse utilizzato anche da altri amminoacidi eccitatori (EAAT = excitatory amino acid transporter)
come l’aspartato. Forse in qualche cellula questo avviene, ma la maggior parte è solo per il
glutammato. Il trasportatore ha 8 domini transmembrana ed è Na/K dipendente. Il glutammato
infatti entra nella vescicola tramite cotrasporto con il sodio e contemporaneo antiporto con il
potassio.
2. Trasportatori per altri neurotrasmettitori: sono codificati da una famiglia diversa di geni. Sono
formati da 12 domini transmembrana (casualmente sono dello stesso numero di quelli presenti nelle
vescicole, le due proteine non hanno niente a che fare l’una con l’altra). Il cotrasporto del
neurotrasmettitore avviene grazie ad uno ione sodio e uno di cloro (Na/Cl dipendenti). Questa classe
comprende un trasportatore per noradrenalina (NET), uno per dopamina (DAT), uno per serotonina
(SERT), uno per il GABA (GAT; in realtà quattro diversi) e uno (sulla slide c’è scritto “2 tipi”; la riporto
di seguito, ndr) per la glicina (GlyT). Possiamo notare che a livello vescicolare il trasportatore per
GABA e glicina è lo stesso mentre sulla membrana del bottone sinaptico sono due diversi. Lo stesso
discorso vale per le amine: un trasportatore unico contro i tre diversi per noradrenalina, dopamina e
serotonina.
3. Trasportatore della colina: assomiglia alle proteine della famiglia GluT (trasportatore del glucosio)
ed è specifico unicamente per questo neurotrasmettitore. (Ricordiamo inoltre che una parte di colina
può essere recuperata in seguito all’azione dell’enzima acetilcolina esterasi dalle sinapsi
colinergiche).
In questa immagine, in cui sono riassunti anche i concetti detti nelle lezioni precedenti, possiamo visualizzare
i meccanismi di trasporto sia vescicolare sia a livello del bottone sinaptico. La glia svolge ruolo di re-uptake
nel caso del glutammato e del GABA. Per le sinapsi adrenergiche e colinergiche questo riassorbimento
avviene esclusivamente per opera del bottone sinaptico.
INIBIZIONE PRESINAPTICA E FACILITAZIONE PRESINAPTICA
Oltre ad avere sinapsi asso-dendritiche e asso-somatiche, abbiamo anche sinapsi asso-assoniche:
meccanismo attraverso il quale un primo neurone agisce sulla terminazione sinaptica di un secondo neurone
(che a sua volta è presinaptico rispetto ad un terzo). In questo modo l’azione del primo neurone non è quella
di modificare l’eccitabilità complessiva del secondo neurone (postsinaptico), inibendolo oppure facilitandolo,
ma ha la funzione di inibire o facilitare la trasmissione sinaptica di particolari sinapsi di tale neurone, non di
tutte. Quindi agisce soltanto su alcuni input sinaptici lasciando inalterata l’eccitabilità complessiva di un
neurone postsinaptico.
Da un punto di vista storico l’inibizione presinaptica è stata individuata prima nel midollo spinale dei
mammiferi.
Nell’inibizione presinaptica le fibre afferenti primarie, e non solo, a livello del midollo spinale ricevono delle
terminazioni asso-assoniche che possiedono una potente azione inibitoria. L’efficacia dell’azione eccitatoria
viene regolata con un meccanismo presinaptico. È molto potente, può arrivare addirittura a bloccare
completamente l’attività di queste fibre, soprattutto quelle di grosso diametro. Questo meccanismo
presinaptico è attivato sia dalle fibre afferenti stesse che da fibre discendenti dai centri superiori (anche loro
quindi possono modulare questa trasmissione).
Tutto ciò è stato studiato tramite il meccanismo della depolarizzazione delle afferenze primarie (PAD).
Stimolando un fascio di fibre afferenti al midollo spinale nel cordone dorsale, si registra un potenziale
depolarizzante che invade anche in modo anterogrado il fascio stesso. Misurando questa depolarizzazione
sia delle fibre stimolate che di quelle vicine in quel dato metamero del midollo spinale, si vede che la
trasmissione sinaptica di queste fibre afferenti è fortemente ridotta. Questo avviene sia tramite attivazione
delle fibre afferenti stesse sia tramite i centri superiori. Infatti questi ultimi mandano delle terminazioni
presinaptiche che bloccano (o inibiscono fortemente) la trasmissione sinaptica tra afferenze primarie e
neuroni delle corna dorsali del midollo spinale.
Inizialmente si pensava fosse un circuito trisinaptico (immagine (A))
poi si è visto avvenire anche in presenza di due sole sinapsi
(immagine (B)). L’azione finale dipende da una sinapsi gabaergica
asso-assonica che ha un’azione inibitoria sulla trasmissione tra la
fibra afferente e il neurone glutammatergico (in questo caso)
presente nel corno dorsale del midollo spinale.
Questo è il primo tipo di inibizione sinaptica. I recettori sono GABA-
A, cioè ionotropici, perciò non si spiega come mai si ha
depolarizzazione e soprattutto perché se io depolarizzo le
terminazioni afferenti delle fibre 1A e 2 (quindi di grosso diametro),
questo riduce la trasmissione: dovrebbe favorirla. Il GABA può
produrre depolarizzazione perché questa terminazione ha dei
trasportatori per il GABA che fanno sì che lo stesso GABA all’interno
abbia un potenziale di Nernst di equilibrio più positivo rispetto al
potenziale di membrana della terminazione. Quindi, aprendo i canali
per il cloro si determinerà una depolarizzazione della cellula: si
sposta il potenziale di membrana verso il potenziale di equilibrio del
cloro (è una sinapsi gabaergica di tipo A e come tale apre i canali del
cloro).
Questo determina un’inibizione della trasmissione sinaptica perché
il potenziale d’azione deve invadere il bottone sinaptico e la quantità di calcio che entra è proporzionale
depolarizzazione del bottone stesso. Però, se prima di far arrivare il potenziale alla zona attiva apro i canali,
cioè aumento la conduttanza di membrana, diminuisco la resistenza di membrana, le correnti del potenziale
d’azione verranno cortocircuitate prima di raggiungere la zona attiva. Quindi, la quantità di corrente che
raggiunge la zona attiva sarà inferiore. Inoltre, dato che la conduttanza del cloro è aumentata notevolmente,
l’ampiezza del potenziale d’azione verrà ridotta. Alla fine avremo correnti più basse e di minore ampiezza che
raggiungono i canali voltaggio dipendenti al calcio. Va ricordato che questi canali sono poco sensibili,
richiedono una depolarizzazione notevole (40 mV) per aprirsi. Lo shunt delle correnti determina una minore
entrata di calcio.
Al contrario, in alcune sinapsi l’effetto è iperpolarizzante.
Questi sono solo alcuni dei meccanismi presenti nei mammiferi attraverso i quali è possibile avere o una
inibizione o una facilitazione sinaptica. Negli invertebrati e nei molluschi ce ne sono altri ancora.
Una inibizione può essere indotta da apertura dei canali al cloro da recettori GABA-A tramite depolarizzazione
(come abbiamo appena visto) o, in altri casi, tramite iperpolarizzazione. Lo shunt della corrente è
fondamentale per spiegare questi meccanismi inibitori.

Nel secondo tipo di inibizione presinaptica intervengono le subunità β γ della proteina G. Queste subunità,
associate a recettori metabotropici, determinano o la chiusura dei canali al calcio o l’apertura dei canali al
potassio o entrambe. Aprendo i canali al potassio si aumenta lo shunt delle correnti e chiudendo quelli al
calcio si aumenta ulteriormente l’inibizione (impedendo l’esocitosi che ricordiamo essere calcio-dipendente).

Esiste anche un terzo meccanismo, non molto chiaro, nel quale le subunità β γ sono in grado di modificare
l’affinità del calcio con le proteine che determinano l’esocitosi, come la sinaptotagmina, diminuendone la
probabilità di rilascio.

Ci sono casi in cui si ha facilitazione presinaptica: l’azione della cellula C2 (chiamata così nel disegno
sottostante) è quella di favorire la trasmissione sinaptica tra le cellule A e B. Il meccanismo è quello che
abbiamo già trovato a livello dei gangli del SNA, cioè una riduzione della corrente al potassio che prolunga il
potenziale d’azione e quindi aumenta (il professore dice “riduce” ma in seguito ad una domanda di uno
studente si corregge dicendo che la slide proiettata a lezione conteneva questo errore, ndr) anche l’entrata
del calcio. Ci sono infatti dei recettori metabotropici che sono in grado di chiudere una conduttanza. In questo
caso, chiudendo la conduttanza al potassio, si determina una depolarizzazione di piccola ampiezza ma che
dura nel tempo, la quale favorisce l’entrata del calcio e prolunga l’azione del potenziale d’azione.
Concludendo, a livello presinaptico abbiamo entrambe le possibilità: facilitazione e inibizione. Quest’ultima
è più comune nel sistema nervoso.