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Lezione n.

20 del 23/05/2017
Materia: Immunologia
Appunti di: Valeria Ros
Argomenti: Ripresa e approfondimento di concetti già affrontati durante il corso; macrofagi e loro
polarizzazione, polarizzazione dei linfociti T, Innate Lymphoid Cells, linfociti B regolatori.

Gli appelli previsti per sostenere l’esame sono fissati il 12 e il 26 giugno. Al primo appello risultano iscritte
ad oggi 130 persone, quindi probabilmente l’esame si prolungherà anche al giorno successivo, ma il
professore non è in grado di definire a priori la quantità di studenti interrogati al giorno.
Poiché la somministrazione del test scritto che veniva effettuata anni fa non si è più rivelata efficace come
metodo di selezione per accedere all’orale, da alcuni anni è previsto che l’esame consista unicamente in una
prova orale; la prima domanda è selettiva e solamente una risposta pienamente sufficiente permette di
affrontare le successive domande e proseguire l’esame. La durata dell’esame è di 5 minuti se lo studente è
preparato, può arrivare a 20 minuti se meno preparato.
Il programma coincide con l’indice del libro di testo Immunologia Cellulare e Molecolare di Abul K. Abbas,
Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai.
Non è richiesto lo studio delle appendici I, II e III. Il capitolo 21 tratta le immunodeficienze, di cui non è
necessario conoscere tutti gli aspetti clinici; è invece necessario che lo studente sappia da cosa sono causate
e in cosa consistono. Ad esempio, all’eventuale domanda del professore relativamente a cosa prova che le
β2 integrine sono importanti per la risposta immunitaria, è necessario che vengano nominate le
immunodeficienze LAD1, LAD2 e LAD3.
Il professore specifica che in altri capitoli sono presenti aspetti molto molecolari, come il riarrangiamento
genico del TCR, che lo studente può approfondire per proprio interesse ma la cui conoscenza non è
strettamente richiesta all’esame. Viene infine sottolineata l’importanza, sia nella fase di studio sia al
momento dell’esame, di fare ragionamenti.

IMMUNITÀ INNATA
L’immunità innata è la componente dell’immunità che interviene più precocemente, ma non precede
l’immunità specifica solo da un punto di vista temporale, rappresenta anche il requisito perché l’immunità
specifica si attivi; la presentazione dell’antigene è infatti mediata da cellule dell’immunità innata. Questo
vale anche per i linfociti B, i quali pur non necessitando della presentazione dell’antigene, riescono a
funzionare solamente in alcune situazioni senza l’intervento dei linfociti T helper. In assenza di linfociti T,
anche la risposta B, quindi, è fortemente ridotta e compromessa. A testimoniare questa importante relazione
di dipendenza sono le immunodeficienze: ne è un esempio la X-SCID, immunodeficienza severa, dovuta
nell’uomo principalmente ad un difetto dei linfociti T che si rispecchia a sua volta sui linfociti B
coinvolgendo quindi l’intera immunità adattativa. L’immunità innata è anche coinvolta in processi che non
hanno a che fare con la risposta immunitaria, come il processo di fibrosi (soprattutto per quanto riguarda i
macrofagi). Il ruolo dell’immunità innata dunque non si esaurisce nelle prime fasi dell’immunità.
Tra le cellule che svolgono un importante ruolo vi sono i fagociti, di cui fanno parte i macrofagi.

MACROFAGI
I macrofagi svolgono principalmente le seguenti funzioni:
1. Controllo di patogeni: difesa contro infezioni da microbi, nello specifico ruolo antibatterico,
antiparassitario, antifungino e antivirale;
2. Regolazione immunitaria: presentazione dell’antigene, produzione di citochine e reclutamento di
cellule effettrici;
3. Regolazione omeostasi: rimodellamento dei tessuti.
La funzione di controllo dei patogeni viene svolta nelle fasi precoci della risposta immunitaria, ma il ruolo
dei macrofagi non si limita a questo. I macrofagi possiedono infatti funzioni anche più rilevanti, ed una di
queste è la produzione di una quantità enorme citochine, che in massima parte sono citochine
proinfiammatorie; ad esempio IL-1 è prodotta da cellule mieloidi, tra cui i macrofagi; IL-12 è prodotta dai
macrofagi attivati. Un’altra funzione importante consiste nel reclutamento di cellule, e tale funzione viene
esplicata tramite la produzione da parte dei macrofagi di citochine chemiotattiche, cioè chemochine. Un
blocco dell’arrivo dei macrofagi determina una forte compromissione del reclutamento dei linfociti.
I macrofagi hanno inoltre la funzione di esprimere i PRR, alcuni dei quali attivano la fagocitosi, quindi
hanno una funzione direttamente microbicida, altri invece non attivano direttamente la fagocitosi ma
inducono trascrizione genica, come ad esempio i membri della famiglia dei Toll-like receptors: essi non
attivano la fagocitosi ma inducono la trascrizione di NF-kB, RF5 e RF7, cioè fattori trascrizionali che
stimolano la produzione di citochine infiammatorie o di interferone che determina una risposta antivirale.
I macrofagi sono anche responsabili della produzione del contenuto di granuli necessario per eliminare ciò
che è stato fagocitato.
I macrofagi promuovono infine il rimodellamento tissutale, che non ha un effetto solamente negativo, come
avviene ad esempio nei Tumor-associated Macrophages (TAM) che, producendo una serie di fattori,
promuovono l’invasione e la crescita del tumore, ma anche positivo perché permettono il riparo efficace
delle ferite, riportando il danno verso condizioni omeostatiche. Questo meccanismo avviene tramite la
produzione di citochine, come TGF-β, che stimolano l’angiogenesi e quindi la neovascolarizzazione. Ciò
permette di trasportare nutrienti al tessuto e, sempre tramite TGF-β, di attivare i fibroblasti per lo
svolgeranno del proprio ruolo nella formazione della cicatrice.
I macrofagi sono in grado di svolgere attività così differenti e numerose perché vengono plasmati dal
microambiente: le citochine presenti nel microambiente in cui essi si attivano, determina la loro funzione
principale. Il microambiente influenza quindi la polarizzazione dei macrofagi:
-­‐ Microambiente dominato da presenza di PAMP e citochine infiammatorie quali IL-1, TNF, IFN-γ →
macrofago polarizzato M1, deputato a eliminare microbi.
-­‐ Microambiente dominato da citochine presenti durante le fasi di riparo quali IL-4, IL-13 →
macrofago polarizzato M2, in grado di eliminare microbi ma anche di formare granulomi, che
rappresentano una forma di difesa dell’organismo ma creano danno tissutale. Un esempio è
l’infezione da Mycobacterium tuberculosis, in cui la formazione di granulomi altera la
conformazione del tessuto polmonare, che perde la sua funzione.
Le due fasi non convivono, infatti la polarizzazione M1 è presente spesso nelle prime fasi della risposta
immunitaria, mentre la polarizzazione M2 si trova in fasi di infiammazione cronica, quando cioè la risposta
immunitaria viene protratta nel tempo.
Entrambe le condizioni sono associate a situazioni patologiche. Ci sono condizioni in cui i macrofagi
polarizzati M1 sono responsabili di danno tissutale, dovuto ad esempio al deposito in alcuni distretti di
immuno-complessi, a infiammazione cronica (come l’artrite) o alla formazione della placca aterosclerotica. I
macrofagi polarizzati M2 possono invece causare altri danni, dovuti principalmente al processo di fibrosi,
quindi di rimodellamento tissutale; un esempio è l’asma, causata da un profondo rimodellamento del
parenchima polmonare, dovuto ad una costante attivazione dei macrofagi.
Le citochine possono indurre una polarizzazione M1 o M2 perché legano recettori di membrana diversi,
generando quindi una diversa trasduzione del segnale.
Polarizzazione M1
• Recettori di membrana: IFN-γR, TLR
• Fattori di trascrizione: NF-kB, STAT1, IRF (Interferon Regulatory Factor)
Polarizzazione M2
• Recettori di membrana: recettori per IL-4 e IL-13
• Fattori di trascrizione: STAT3, STAT6
È associata alla polarizzazione M1 o M2 anche la regolazione epigenetica, che coinvolge aspetti quali
acetilazione e metilazione degli istoni e induzione/soppressione di miRNA, cioè RNA non codificanti ma che
regolano altri RNA inducendone la degradazione o bloccandone la traduzione. I miRNA indotti o soppressi
durante la polarizzazione M1 o M2 sono stati di recente mappati. Sta inoltre emergendo negli ultimi anni il
ruolo dei miRNA nel modulare lo stato di attivazione del sistema immunitario e il coinvolgimento di questi
in alcune patologie; ad identificare circa un decennio fa questa funzione sono stati Andrew Fire e Craig
Mello, che hanno ricevuto il premio Nobel per la medicina.

IMMUNITÀ SPECIFICA
L’immunità specifica è detta adattativa perché in grado di adattarsi alle diverse situazioni, ma anche
l’immunità innata è in realtà plastica. Il concetto di adattamento era stato quindi inizialmente ristretto
all’immunità specifica, ma attualmente si è a conoscenza del fatto che questo aspetto caratterizza tutte le
componenti del sistema immunitario.
L’immunità specifica ha inoltre la caratteristica di possedere memoria immunologica, a differenza
dell’immunità innata; in realtà ad oggi è noto che anche l’immunità innata possiede una forma di memoria,
che tuttavia non essendo specializzata, come invece è quella dell’immunità specifica, non viene definita
immunologica. La terminologia che viene utilizzata per definire questo tipo di memoria è “Adaptive innate
immunity” o “Trained immunity”. La principale differenza tra la Trained immunity dell’immunità innata e la
memoria immunologica dell’immunità specifica riguarda la durata:
-­‐ La memoria immunologica dell’immunità specifica può durare tutta la vita, perché rimangono
cellule della memoria che si rinnovano e sono quindi sempre presenti. Può essere ottenuta con la
vaccinazione;
-­‐ La memoria dell’immunità innata dura alcuni mesi, raramente raggiunge un anno e si basa
essenzialmente sulla sopravvivenza di cellule che hanno incontrato un determinato tipo di risposta.
Gli effettori della trained immunity sono principalmente i macrofagi e le cellule NK; i neutrofili, ad
esempio, non sono responsabili di questo tipo di memoria perché hanno una vita di pochi giorni.
I primi studi volti alla dimostrazione dell’esistenza di una forma di memoria anche nell’immunità innata
risalgono alla fine degli anni ‘70, quando diversi ricercatori attraverso lo studio del sistema immunitario
nelle piante e negli organismi non vertebrati, che non possiedono l’immunità specifica, hanno osservato che
diversi rappresentanti di queste famiglie, in caso di reinfezione da parte di batteri o di funghi, mantengono
una aumentata attività immunitaria. Si sono anche studiate spugne e coralli, su cui sono stati effettuati
esperimenti di trapianto, osservando che la porzione trapiantata veniva rigettata generando quindi una
risposta molto simile a quella da memoria immunologica. Il microbiologo italiano Vistoni ha osservato che
nei topi l’infezione da Candida lascia una sorta di memoria verso una seconda infezione in caso di incontro
del medesimo patogeno. Ciò ha permesso, quindi, di ipotizzare che fosse presente anche in questi organismi
una forma di memoria.
Un ricercatore e clinico olandese ha riordinato queste evidenze, arrivando a sostenere che la trained
immunity è:
• indipendente dai linfociti T e B;
• non selettiva;
• associata, tendenzialmente, ad una aumentata espressione e attivazione di PRR.
Questo tipo di memoria quindi è determinata da una sorta di pre-attivazione di queste cellule dopo il primo
incontro, le quali risponderanno molto meglio ad un possibile secondo incontro. Lo stato di attivazione e la
conseguente trained immunity derivante da questo durerà fino alla morte di queste cellule.

POLARIZZAZIONE DEI LINFOCITI T


Un linfocita T naïve, in base al contesto citochimico e al fattore trascrizionale che viene attivato, può
assumere caratteristiche diverse e diventare un linfocita Th1, Th2, Th17 o linfocita T regolatore.
Ogni classe di linfociti T helper è caratterizzata da:
1. Produzione di specifiche citochine, tramite cui può dialogare con un determinato tipo di cellule;
2. Specifico profilo di recettori chemiotattici per chemochine, che rende il reclutamento specifico.
• Th1: CXCR3 e CCR5;
• Th2: CCR4, CCR8 e CCR3;
• Th17: CCR6
Cellule polarizzate in modo diverso, dunque, producono citochine diverse e vengono reclutate in maniera
specifica. Questo tuttavia non è peculiare dei linfociti T, infatti esiste un’altra classe di cellule, recentemente
organizzata, costituita dalle cosiddette Innate Lymphoid Cells (ILC): cellule che derivano dallo stipite
linfocitario ma si distinguono dai linfociti T perché non esprimono il TCR. All’interno di questa famiglia
rientrano le cellule NK. Le ILC sono state suddivise, in base al fattore di trascrizione cruciale per la loro
polarizzazione, in 3 famiglie:
-­‐ ILC-1 → fattore trascrizionale è T-bet. È lo stesso fattore di trascrizione
coinvolto nella polarizzazione dei linfociti Th1. Le ILC di gruppo 1,
similmente ai linfociti Th1, producono IFN-γ;
-­‐ ILC-2 → fattore trascrizionale è GATA-3. È lo stesso fattore di
trascrizione coinvolto nella polarizzazione dei linfociti Th2. Le ILC di
gruppo 2, similmente ai linfociti Th2, producono IL-4, IL-5 e IL-13;
-­‐ ILC-3 → fattore trascrizionale è RORgamma-t. È lo stesso fattore di
trascrizione coinvolto nella polarizzazione dei linfociti Th17. Le ILC di
gruppo 3, similmente ai linfociti Th17, producono IL-17 e IL-22.
Il compartimento di cellule linfoidi innate sono quindi speculari al compartimento dei linfociti T helper.
Esiste esclusivamente una differenza tra i due, che riguarda l’attivazione, infatti i linfociti T helper (Th1, Th2
o Th17) sono attivati dal riconoscimento specifico di un antigene, mediato all’interno degli organi linfoidi
secondari dalle cellule dendritiche, mentre le ILC sono attivate da citochine prodotte nel microambiente
patologico o dal riconoscimento di PAMP, similmente a ciò che avviene nell’immunità innata.
È verosimile che nelle fasi precoci della risposta immunitaria, quando non c’è ancora una polarizzazione
della risposta T, le ILC possano contribuire alla risposta polarizzata dei linfociti T.

Le cellule NK producono grandi quantità di IFN-γ e sono le uniche cellule, facenti parte delle ILC, a
possedere oltre ad una funzione regolatoria, anche una funzione citotossica. Tutte le altre ILC hanno invece
esclusivamente un’azione regolatoria, ovvero, producendo citochine, regolano l’attività di altre cellule.
L’importanza di questa azione regolatoria sta però emergendo notevolmente.
È stato inoltre osservato che le cellule con funzione regolatoria, in situazioni patologiche, si espandono, ad
esempio in soggetti con psoriasi è possibile osservare in circolo e nelle biopsie, quindi nelle placche
psoriatiche, la presenza di un’espansione di cellule che hanno il fenotipo di ILC-3, ovvero il tipo di cellule
che produce Th17. La psoriasi è infatti una patologia sia Th1 che Th17; l’asma e l’allergia, ad esempio, sono
invece patologie Th2.
Esiste un farmaco biologico utilizzato da soggetti con psoriasi, che neutralizzando la catena p40, catena
condivisa tra IL-23 e IL-12, intacca una risposta non solo Th1 e Th17, ma anche le ILC. La conoscenza delle
ILC spiega quindi la diversa risposta ai farmaci biologici da parte di diversi pazienti.

Si sono successivamente scoperte altre cellule caratterizzate da una polarizzazione, quali:


• Cellule NK: la scoperta si deve a Giorgio Trinchieri, il quale circa 20 anni fa ha affermato che anche
le cellule NK possono essere polarizzate, in senso 1 o in senso 2, perché producono citochine
diverse;
• Cellule dendritiche: si è scoperto circa 10 anni fa che le cellule dendritiche possono assumere una
forma di polarizzazione definita classica o una forma di polarizzazione alternativa, di cui ne esistono
due tipi. La differenza tra polarizzazione classica e polarizzazione alternativa riguarda la capacità di
fare angiogenesi e quindi di produrre TGF;
• Neutrofili: possono essere neutrofili N1 o N2. I neutrofili polarizzati in senso N2 corrispondono al
fenotipo Th2 e sono stati rilevati solamente in situazioni tumorali, non in altre patologie; è in
particolare stato messo in evidenza che il microambiente tumorale, producendo soprattutto TGF-β, fa
sì che quando il neutrofilo si attiva, venga condizionato e indotto a diventare un neutrofilo che
favorisce la crescita delle cellule tumorali, al posto di essere un neutrofilo citotossico, in grado
quindi di uccidere i microbi e, tramite il rilascio di elastasi ed altri componenti, le cellule tumorali.
Riassumendo l’immunità innata e l’immunità adattativa sono state descritte in modo semplificativo, come
risposte che intervengono in momenti diversi dal punto di vista temporale (una è più precoce, l’altra più
tardiva) e con caratteristiche diverse (una non ha memoria immunologica, l’altra la possiede), ma in realtà tra
questi due estremi vi sono numerose situazioni intermedie.

ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI B


I linfociti B possono essere attivati dal riconoscimento diretto dell’antigene tramite BCR, dunque non
necessitano di presentazione dell’antigene. Spesso necessitano però di un secondo segnale, rappresentato dal
riconoscimento di PAMP o dall’interazione con i linfociti T. Il secondo segnale varia in base alla natura
dell’antigene, in particolare, in presenza di:
-­‐ un antigene proteico, c’è dialogo con il linfocita T ed il secondo segnale è rappresentato dall’insieme
di segnali che arriva al linfocita B dal linfocita T e che comprende molecole co-stimolatorie, tra cui
CD28, CD40 e CD40 ligando e citochine prodotte dal linfocita T;
-­‐ un antigene non di tipo proteico, il secondo segnale deriva dal riconoscimento di PAMP tramite TLR
espressi dal linfocita B.
Gli antigeni riconosciuti dai linfociti B possono quindi essere divisi in due classi:
• Antigeni timo-dipendenti (TD);
• Antigeni timo-indipendenti (TI), che comprendono due categorie: gli antigeni timo-indipendenti di
tipo 1, detti TI-1 e gli antigeni timo-indipendenti di tipo 2, detti TI-2.
Gli antigeni timo-dipendenti sono proteine e inducono scambio isotipico.
Gli antigeni timo-indipendenti in genere non sono proteine, ma polisaccaridi,
glicolipidi e acidi nucleici. Non inducono scambio isotipico, ma ci sono
eccezioni, ad esempio le IgA, il cui scambio isotipico può essere indotto da
citochine prodotte dalle cellule dendritiche o dai macrofagi, come BAFF e
APRIL, senza quindi che avvenga un dialogo con i linfociti T. In alcuni casi
c’è anche un debole scambio isotipico IgG.
Gli antigeni timo-indipendenti di tipo 1 scatenano una risposta diversa in base
alla loro concentrazione, ed un esempio di questo tipo di antigeni è il
lipopolisaccaride (LPS), una tossina batterica. Il lipopolisaccaride quando è
presente ad alte concentrazioni attiva in modo non specifico i linfociti B; il
lipopolisaccaride viene infatti utilizzato in laboratorio come mitogeno dei
linfociti B, cioè come molecola in grado di stimolare la loro proliferazione
policlonale. Questo avviene indipendentemente dal BCR, e dunque
indipendentemente dal riconoscimento dell’antigene. Alte concentrazioni di
lipopolisaccaride si verificano in condizioni di shock settico, cioè quando
l’infezione è sistemica. Se il lipopolisaccaride è invece presente a
concentrazioni basse, in questo caso esso funziona da secondo segnale
nell’ambito di un’attivazione policlonale, quindi rappresenta un co-stimolo
per i linfociti B.
Per indurre l’attivazione dei linfociti B non è necessario che gli antigeni TI-1 siano costituiti da epitopi
ripetuti, è sufficiente che l’LPS leghi il TLR-4.
Gli antigeni timo-indipendenti di tipo 2 sono invece antigeni con epitopi ripetuti, perché devono indurre un
forte cross-linking dei BCR, cioè l’aggregazione di più recettori per gli antigeni, sulla superficie dei linfociti
B. Un elevato numero di BCR attivati induce l’attivazione dei linfociti B.
Solamente gli antigeni TI-1 possono quindi indurre un’attivazione policlonale dei linfociti B.
Riassumendo, i linfociti B sono attivati da 2 segnali:
1. Primo segnale: BCR
2. Secondo segnale:
- Antigeni timo-dipendenti (TD) → cellule T adiuvanti (T helper);
- Antigeni timo-indipendenti (TI) → recettore del sistema immunitario innato (PRR, come TLR).
La capacità di rispondere a questi antigeni varia nell’individuo e un esempio sono i lattanti, che riescono a
rispondere agli antigeni TD e TI-1 ma non agli antigeni TI-2. Questo ha permesso di supporre che siano
diverse le cellule che rispondono ai diversi antigeni. Un altro esempio sono i soggetti che mancano del timo,
i quali non possono rispondere agli antigeni TD, ma mantengono la risposta agli antigeni TI.
Queste caratteristiche permettono di identificare differenti classi di antigeni e quindi anche di patogeni:
diversi patogeni, infatti, possono attivare diverse risposte, e cioè indirizzare le cellule verso una delle 3
risposte (TD, TI-1 o TI-2).
Inoltre non tutte le cellule rispondono a tutti gli antigeni, infatti attualmente si sa che, ad:
-­‐ Antigeni TD, rispondono essenzialmente i linfociti B follicolari, che sono presenti negli organi
linfoidi secondari e vanno incontro alla reazione del centro germinativo;
-­‐ Antigeni TI, sia di tipo 1 che di tipo 2, rispondono i linfociti B della zona marginale, che si trovano
negli organi linfoidi e i linfociti B1, che non sono presenti negli organi linfoidi bensì si trovano nelle
cavità mucose e nella cavità peritoneale. Queste due popolazioni hanno la caratteristica di andare
incontro ad un rinnovo nel tessuto in cui risiedono, quindi non dipendono dalla produzione di
precursori ematopoietici midollari, come invece i linfociti B follicolari, perché durante la vita fetale i
precursori migrano in questi tessuti e qui si rinnovano autonomamente.

C’è quindi una selettività di risposta, dovuta a famiglie diverse di linfociti B, localizzati in tessuti diversi e
con ontogenesi diversa.

LINFOCITI T REGOLATORI
I linfociti T regolatori possono avere origine timica, nella fase di selezione negativa, o periferica, nei
linfonodi, e rappresentano uno dei principali tipi cellulari coinvolti nei meccanismi di tolleranza periferica.
Ad oggi si conoscono anche linfociti B regolatori. Essi hanno un ruolo importante in quanto da un lato
inibiscono quasi tutti gli effettori delle risposte immunitarie, sia innate che specifiche, tra cui Th1, Th17,
cellule dendritiche, monociti-macrofagi e linfociti effettori T CD8 e dall’altro favoriscono lo sviluppo di
sistemi inibitori, stimolando la:
• produzione di linfociti T regolatori, che producono FoxP3, membro della famiglia di fattori
trascrizionali forkhead;
• produzione di linfociti T regolatori di tipo 1 o TR1, che producono IL-10;
• espansione di cellule NKT.
I linfociti B regolatori possono svolgere queste diverse funzioni perché producono citochine quali IL-10,
TGF-β e IL-35. IL-35 è un’interleuchina che appartiene alla famiglia della IL-12, con cui condivide una
catena, ma al posto di stimolare il sistema immunitario ha un ruolo inibitorio; essa è prodotta anche da altre
cellule come i monociti-macrofagi.
L’origine dei linfociti B regolatori non è conosciuta, tuttavia diversi studi hanno messo in evidenza che
esistono diversi stadi maturativi che possono generare linfociti B regolatori, come ad esempio i linfociti B
immaturi. I linfociti B regolatori possono anche derivare dai linfociti B maturi.
Studi dimostrano inoltre un’associazione, osservata non solo in modelli sperimentali ma anche in pazienti,
tra la presenza più o meno elevata di linfociti B regolatori e patologie autoimmuni.

In conclusione il sistema immunitario è costituito da alcune cellule numericamente predominanti, che per
molto tempo sono state il principale oggetto di studio e di ricerca, ed altre meno numerose, che possono
rappresentare il 5%, ma anche in alcuni casi solo lo 0,1% del sangue periferico. Attualmente si sta scoprendo
come siano proprio queste cellule spesso responsabili della regolazione e dell’andamento di una patologia. È
dunque indispensabile abolire la correlazione tra numerosità delle cellule e loro importanza.