Medicina Di Laboratorio - Qu

MEDICINA
DI LABORATORIO
Proff. Vittorio Sambri, Davide Treré, Luca Morandi; Prof.ssa Monica Cricca
UniBo, A.A. 2021/2022 – CdLM in Medicina e Chirurgia
a cura di
‫ר ו פ א ס ב י ר ל ע ת יד‬
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Medicina di laboratorio
Indice
PREFAZIONE E RINGRAZIAMENTI ........................................................................................................................................... 6
PROGRAMMA D’ESAME.......................................................................................................................................................... 7
M0. INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA CLINICA .......................................................................................................... 11
M1. CONCETTI BASE DELLA MICROBIOLOGIA CLINICA ........................................................................................................ 12
M1.1 MICROBIOTA ............................................................................................................................................................ 12
M1.2 DISBIOSI ................................................................................................................................................................... 14
M1.3 COLONIZZAZIONE .................................................................................................................................................... 14
M1.4 SEPSI ......................................................................................................................................................................... 19
M2. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DELLE ALTE E BASSE VIE AEREE ............................................................................ 20
M2.1 INTRODUZIONE ........................................................................................................................................................ 20
M2.2 INFEZIONI DELLE ALTE VIE RESPIRATORIE ............................................................................................................... 21
M2.3 INFEZIONI DELLE BASSE VIE RESPIRATORIE ............................................................................................................. 24
M2.4 INFEZIONI FUNGINE ................................................................................................................................................. 50
M3. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DEL TRATTO GASTRO-INTESTINALE...................................................................... 61
M3.1 CARATTERISTICHE DELLE INFEZIONI DEL TRATTO GASTRO-INTESTINALE .............................................................. 61
M3.2 HELICOBACTER PYLORI ............................................................................................................................................ 62
M3.3 DIARREA INFETTIVA ................................................................................................................................................. 63
M3.4 INFEZIONI VIRALI...................................................................................................................................................... 73
M3.5 INFEZIONI DA AGENTI EZIOLOGICI PROTOZOARÎ .................................................................................................... 73
M3.6 INFEZIONI ELMINTICHE............................................................................................................................................ 76
M4. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DELL’APPARATO CARDIOVASCOLARE .................................................................. 78
M4.1 INFEZIONI DEL CUORE ............................................................................................................................................. 78
M4.2 INFEZIONI DEL TORRENTE CIRCOLATORIO (BLOODSTREAM INFECTIONS – BSI) .................................................... 82
M5. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DEL SISTEMA NERVOSO ........................................................................................ 93
M5.1 VIE DI INFEZIONE...................................................................................................................................................... 93
M5.2 CLASSIFICAZIONE DELLE MENINGITI ....................................................................................................................... 94
M5.3 SEGNI CLINICI DELLE MENINGITI ............................................................................................................................. 95
M5.4 MENINGITI A LIQUOR TORBIDO ............................................................................................................................... 95
M5.5 MENINGITI A LIQUOR LIMPIDO ............................................................................................................................. 100
M5.6 MENINGO-ENCEFALITI A LIQUOR LIMPIDO ........................................................................................................... 100
M5.7 ASCESSI CEREBRALI ................................................................................................................................................ 109
M5.8 MIELITI INFETTIVE .................................................................................................................................................. 110
M5.9 DIAGNOSI DI LABORATORIO .................................................................................................................................. 110
M6. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DELLE VIE URINARIE............................................................................................ 114
M6.1 CLASSIFICAZIONE DELLE INFEZIONI DELLE VIE URINARIE ...................................................................................... 114
M6.2 MODALITÀ D’INFEZIONE ........................................................................................................................................ 114
M6.3 MICROBIOTA DELLE VIE URINARIE......................................................................................................................... 115
M6.4 MECCANISMI DI DIFESA DELL’OSPITE .................................................................................................................... 115
M6.5 FATTORI DI RISCHIO DELL’OSPITE .......................................................................................................................... 115
M6.6 EZIOLOGIA DELLE UTI ............................................................................................................................................. 116
M6.7 SINTOMI DELLE UTI ................................................................................................................................................ 121
M6.8 DIAGNOSI E URINOCOLTURA ................................................................................................................................. 122
M7. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI PROTESICHE E CUTANEE .................................................................................... 125
M7.1 INTRODUZIONE AL PROBLEMA .............................................................................................................................. 125
M7.2 CLASSIFICAZIONE DELLE INFEZIONI ....................................................................................................................... 126
M7.3 DIAGNOSI DI INFEZIONE PROTESICA RITARDATA .................................................................................................. 127
M7.4 DERMATOFITOSI .................................................................................................................................................... 130
APPENDICE: CASI CLINICI ED ESEMPÎ DI DOMANDE .......................................................................................................... 132
3
P0. INTRODUZIONE ALLA PATOLOGIA CLINICA .................................................................................................................. 137

P0.1 STORIA DELLA PATOLOGIA CLINICA ........................................................................................................................ 137
P0.2 PERCORSO DI FORMAZIONE ................................................................................................................................... 137
P1. LE PROTEINE DEL SANGUE............................................................................................................................................ 138
P1.1 GENERALITÀ SULLE PROTEINE DEL SANGUE ........................................................................................................... 138
P1.2 ELETTROFORESI DELLE PROTEINE SIERICHE ........................................................................................................... 138
P1.3 CONDIZIONI ASSOCIATE AD ALTERAZIONI SPECIFICHE DEL TRACCIATO ELETTROFORETICO DELLE PROTEINE
SIERICHE .......................................................................................................................................................................... 143
P1.4 INDICI DI FLOGOSI ................................................................................................................................................... 146
P2. IL LABORATORIO NELLA VALUTAZIONE DELLA FUNZIONE EMOSTATICA .................................................................... 151
P2.1 IL PROCESSO EMOSTATICO ..................................................................................................................................... 151
P2.2 SISTEMA FIBRINOLITICO – FIBRINOLISI ................................................................................................................... 165
P2.3 INDAGINI DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE DELL’EMOSTASI PRIMARIA ..................................................... 170
P2.4 INDAGINI DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE DELL’EMOSTASI SECONDARIA................................................ 172
P2.5 TROMBOFILIA .......................................................................................................................................................... 178
P2.6 COAGULAZIONE INTRAVASALE DISSEMINATA (CID) ............................................................................................... 181
P2.7 CONCLUSIONI .......................................................................................................................................................... 183
P3. DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE DISLIPOPROTEINEMIE.......................................................................................... 185
P3.1 MACROMOLECOLE BIOLOGICHE ............................................................................................................................ 185
P3.2 LIPOPROTEINE ......................................................................................................................................................... 186
P3.3 METABOLISMO DEI LIPIDI ....................................................................................................................................... 190
P3.4 DISLIPOPROTEINEMIE ............................................................................................................................................. 195
P3.5 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE IPERLIPOPROTEINEMIE................................................................................... 200
P3.6 CLASSIFICAZIONE “DI LABORATORIO” O “FENOTIPICA” DELLE IPERLIPOPROTEINEMIE SECONDO FREDERICKSON
(NON TRATTATA A LEZIONE) ........................................................................................................................................... 204
P4. IL LABORATORIO NELLA VALUTAZIONE DIAGNOSTICA DEL DIABETE .......................................................................... 205
P4.1 CENNI STORICI SUL DIABETE ................................................................................................................................... 205
P4.2 DIABETE ................................................................................................................................................................... 206
P4.3 CLASSIFICAZIONE DEL DIABETE MELLITO................................................................................................................ 211
P4.4 INDAGINI DI LABORATORIO .................................................................................................................................... 216
P5. IL LABORATORIO NELLA VALUTAZIONE DELLE ALTERAZIONI DELL’EQUILIBRIO ACIDO-BASE .................................... 220
P5.1 GLI IONI H+ E IL PH .................................................................................................................................................... 220
P5.2 LA REGOLAZIONE DELL’EQUILIBRO ACIDO-BASE .................................................................................................... 222
P5.3 ACIDOSI E ALCALOSI RESPIRATORIE E METABOLICHE ............................................................................................ 228
P5.4 EMOGASANALISI ..................................................................................................................................................... 231
P5.5 APPLICAZIONI DELLA TEORIA A CASI CLINICI ........................................................................................................... 234
P6. ESAMI DI PRIMO LIVELLO PER LO STUDIO DELLA FUNZIONALITÀ EPATICA ............................................................... 237
P6.1 GENERALITÀ SUL FEGATO ....................................................................................................................................... 237
P6.2 BILIRUBINA .............................................................................................................................................................. 238
P6.3 ENZIMI SIERICI INDICATORI DI DANNO EPATOCELLULARE O COLESTATICO .......................................................... 244
P6.4 PROTEINE SIERICHE ................................................................................................................................................. 245
P6.5 FATTORI DELLA COAGULAZIONE ............................................................................................................................. 246
P6.6 APPLICAZIONI DELLA TEORIA A CASI CLINICI ........................................................................................................... 246
P7. ESAMI DI LABORATORIO PER LO STUDIO DELLA FUNZIONALITÀ RENALE ................................................................... 248
P7.1 STUDIO DELLA FUNZIONALITÀ RENALE .................................................................................................................. 248
P7.2 ESAME DELLE URINE ............................................................................................................................................... 248
P7.3 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE EMATICA DI COMPOSTI AZOTATI NON PROTEICI (AZOTEMIA) ..... 260
P7.4 CLEARANCE RENALI ................................................................................................................................................. 262
P7.5 PROVE FUNZIONALI PER TUBULOPATIE .................................................................................................................. 264
B0. INTRODUZIONE ALLA BIOCHIMICA CLINICA................................................................................................................. 269
4
B1. I TEST DI LABORATORIO ................................................................................................................................................ 271

B1.1 CICLO DI LUNDBERG ................................................................................................................................................ 271
B1.2 VARIABILITÀ E STANDARDIZZAZIONE NEI TEST DI LABORATORIO .......................................................................... 274
B1.3 CARATTERISTICHE DI UN TEST DI LABORATORIO.................................................................................................... 276
B1.4 MATERIALE D’INDAGINE ......................................................................................................................................... 277
B2. MEDICINA PERSONALIZZATA ........................................................................................................................................ 279
B2.1 INTRODUZIONE AL CONCETTO DI MEDICINA PERSONALIZZATA ............................................................................ 279
B2.2 METODI D’INDAGINE .............................................................................................................................................. 282
B3. NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) ...................................................................................................................... 299
B3.1 INTRODUZIONE ....................................................................................................................................................... 299
B3.2 454-NGS – PARALLEL SEQUENCING ........................................................................................................................ 299
B3.3 PIATTAFORMA ILLUMINA ....................................................................................................................................... 301
B3.4 APPLICAZIONI DI NGS .............................................................................................................................................. 307
B3.5 OXFORD NANOPORE ............................................................................................................................................... 311
B4. PRINCIPÎ DI EPIGENETICA ............................................................................................................................................. 312
B4.1 INTRODUZIONE ....................................................................................................................................................... 312
B4.2 DEFINIZIONE DI EPIGENETICA ................................................................................................................................. 312
B4.3 MECCANISMI EPIGENETICI...................................................................................................................................... 313
B4.4 MEMORIA EPIGENETICA ......................................................................................................................................... 316
B4.5 EPIGENETICA NEL CANCRO ..................................................................................................................................... 317
B4.6 APPLICAZIONI CLINICHE DELL’EPIGENETICA........................................................................................................... 318
B4.7 BIOMARKER GENETICI ED EPIGENETICI IN ONCOLOGIA ......................................................................................... 319
B5. DIAGNOSI PRECOCE DEI TUMORI DEL CAVO ORALE ................................................................................................... 326
B5.1 EPIDEMIOLOGIA DEI TUMORI DEL CAVO ORALE .................................................................................................... 326
B5.2 LESIONI ORALI PRENEOPLASTICHE ......................................................................................................................... 326
B5.3 MODIFICAZIONI GENETICHE NEI HNSCC................................................................................................................. 327
B5.4 MODIFICAZIONI EPIGENETICHE NEI HNSCC ........................................................................................................... 327
B6. ETEROGENEITÀ TUMORALE E BIOPSIA LIQUIDA .......................................................................................................... 329
B6. PAN-CANCER ANALYSIS OF WHOLE GENOME .......................................................................................................... 329
B6.2 ETEROGENEITÀ TUMORALE .................................................................................................................................... 329
B6.3 BIOPSIA LIQUIDA ..................................................................................................................................................... 331
APPENDICE: DOMANDE QUIZIZZ ........................................................................................................................................ 335
5
PREFAZIONE E RINGRAZIAMENTI
Questa dispensa di Medicina di laboratorio contiene le sbobine fatte dagli studenti del canale B iscritti al
terzo anno del corso di laurea in Medicina e Chirurgia presso l’Alma Mater Studiorum, durante l’A.A.
2021/2022.
Le lezioni sono state tenute dal prof. Vittorio Sambri per la parte di Microbiologia clinica, dal prof. Davide
Treré per la parte di Patologia clinica e dal prof. Luca Morandi per la parte di Biochimica clinica.
La parte di Microbiologia clinica si basa prevalentemente sulle lezioni della prof.ssa Monica Cricca, ampliate
con argomenti trattati dal prof. Sambri.
Le varie sbobinature sono state rilette e controllate, nonché unificate da me, Q. U.
Desidero, acciò, in questa sede ringraziare sbobinatori e revisori che hanno contribuito colle loro prestazioni
alla realizzazione di questa dispensa.
Possiate perdonarmi per eventuali sviste, errori o refusi.

Con la speranza che possa esservi utile,
Usque ad finem et ultra,
NickMagnus
6
PROGRAMMA D’ESAME
Il corso integrato di Farmacologia comprende tre moduli:
1. Microbiologia clinica (2 CFU) – prof. Vittorio Sambri – prof.ssa Monica Cricca;
2. Patologia clinica (2 CFU) – prof. Davide Treré;
3. Biochimica clinica (1 CFU) – prof. Luca Morandi.
Microbiologia clinica:
• Diagnosi di laboratorio delle patologie infettive: metodi e valore clinico del dato microbiologico.
Microbiologia delle infezioni delle alte e basse vie respiratorie e infezioni nel paziente
immunocompromesso. Microbiologia delle infezioni dell’apparato gastro-enterico ed
intraddominali. Microbiologia delle infezioni delle vie urinarie. Microbiologia delle infezioni di cute,
ossa e articolazioni. Infezioni delle protesi articolari. Microbiologia delle infezioni dell’apparato
cardiocircolatorio e sepsi. Microbiologia delle infezioni del sistema nervoso centrale. Microbiologia
delle zoonosi.
Patologia clinica:
• Le proteine sieriche. [Separazione elettroforetica delle proteine sieriche; profili elettroforetici
associati a patologie specifiche; proteine della fase acuta e velocità di eritrosedimentazione (VES).] Il
laboratorio nella valutazione della funzione emostatica. [Indagini di laboratorio per la valutazione
della funzionalità piastrinica, della fase plasmatica della coagulazione e del sistema fibrinolitico;
indagini di laboratorio per la definizione degli stati di ipercoagulabilità.] Diagnosi di laboratorio della
coagulazione intravasale disseminata (CID). [Fisiopatologia della CID; indici di attivazione del
sistema della coagulazione; indici di attivazione del sistema fibrinolitico; indici di consumo dei fattori
della coagulazione.] Diagnosi di laboratorio delle dislipoproteinemie. [Lipoproteine plasmatiche e
loro metabolismo; lipoproteine ed aterosclerosi; valutazione quantitativa e qualitativa dell'assetto
lipoproteico.] Il laboratorio nella valutazione diagnostica del diabete. [Classificazione del diabete;
alterazioni metaboliche del diabete; esami di laboratorio per la diagnosi del diabete e per il controllo
del paziente diabetico.] Il laboratorio nella valutazione diagnostica dei disturbi dell'equilibrio acido-
base. [Quadri di laboratorio delle acidosi e delle alcalosi respiratorie e metaboliche; l'emogasanalisi
nella definizione diagnostica dei disturbi semplici e complessi dell'equilibrio acido-base.] Esami di
laboratorio di primo livello per lo studio della funzionalità epatica. [Bilirubina e urobilinogeno;
enzimi sierici indicatori di citolisi e di colestasi, rapporto albumina / globuline; fattori della
coagulazione.] Esami di laboratorio per lo studio delle funzionalità renale. [Esame delle urine
(chimico, fisico e del sedimento); determinazione della concentrazione ematica di composti azotati
non proteici (uremia - BUN, creatininemia e uricemia), prove di clearance, prove funzionali di
diluizione e di concentrazione.]
Biochimica clinica:
• Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica: inquadramento nell’ambito della Medicina di
laboratorio, finalità e limiti. Biomarcatori. Fase pre-analitica, analitica, post-analitica e
standardizzazione di un test di laboratorio. Fonti di variabilità biologica. Proprietà diagnostiche dei
test di laboratorio. Prelievo, raccolta e validità dei campioni per la diagnostica di laboratorio.
Sensibilità, specificità, valori predittivi, curve ROC e validazione clinica nei test di laboratorio.
Medicina personalizzata: nuovi approcci diagnostici e bioinformatici nel comprendere le basi
biologiche delle malattie; caratterizzazione del singolo paziente a seconda delle modificazioni
genetiche ed epigenetiche per una opportuna stratificazione e adozione delle terapie più efficaci.
Sviluppo di test diagnostici, prognostici e predittivi attraverso metodi di Next Generation e nanopore
Sequencing. Principi di epigenetica. Utilizzo di biomarcatori genetici ed epigenetici in oncologia e
nelle malattie neurologiche. Eterogeneità tumorale e sequenziamento a singola cellula. Biopsia
liquida: valutazione dell'evoluzione tumorale o della malattia neurodegenerativa attraverso
biomarcatori a DNA/RNA da plasma, CSF, saliva, urine. Utilizzo di tool bioinformatici nell'analisi di
dati ottenuti tramite saggi di Next Generation Sequencing e radiogenomica. La diagnostica di
laboratorio liquorale nelle patologie del SNC.
7
Testi consigliati
• Murray Patrick et al., Microbiologia Medica, EDRA.
• Marcello Ciaccio e Giuseppe Lippi, Biochimica Clinica e Medicina di Laboratorio, EdiSES.
Contatti
• Prof. Vittorio Sambri à vittorio.sambri@unibo.it
• Prof. Davide Treré à davide.trere@unibo.it
• Prof. Luca Morandi à luca.morandi2@unibo.it
Modalità d’esame
A ogni candidato verranno formulate due domande su argomenti di due delle tre discipline selezionate dalla
commissione. Nel caso in cui lo studente ne facesse richiesta, verrà posta una terza domanda inerente la
disciplina non oggetto delle prime due. Il voto finale corrisponderà alla media dei voti ottenuti nelle singole
prove.
8
PARTE I
MICROBIOLOGIA
CLINICA
Microbiologia clinica
10
M0. INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA CLINICA

(prof.ssa Cricca – prof. Sambri)
La microbiologia clinica è importante perché permette di passare dal germe (che è quello che si studia in
microbiologia medica) al paziente.
Si potrebbe fare un paragone tra la concezione del mondo tolemaica e quella copernicana: la microbiologia
medica è come la prima (la Terra – corrispondente al microbo – è al centro dell’universo), mentre la
microbiologia clinica coincide con la seconda (il Sole al centro corrisponde al paziente). Quello che spetta a
noi, ora, è pensare al microrganismo nel quadro clinico di un paziente.
11
M1. CONCETTI BASE DELLA MICROBIOLOGIA CLINICA

M1.1 MICROBIOTA
Il microbiota è l’insieme di microorganismi che colonizzano (vivendo in simbiosi) il corpo umano, i quali
risultano assolutamente necessarî per
esso. Può essere localizzato in diversi
distretti anatomici e ad oggi può essere
considerato un “organo accessorio” con
funzioni omeostatiche e metaboliche.
Perfino zone fino a qualche tempo fa
ritenute sterili, come le basse vie
respiratorie, si è scoperto che ospitano una
particolare tipologia di microbiota, il
microbiota polmonare. Seppur in costante
evoluzione durante la vita di ciascun
individuo, è fondamentale mantenerne
l’equilibrio. Per avere un’idea
dell’importanza che assume nell’organismo si può pensare che il peso totale dei germi che compongono il
microbiota sia superiore ai 2 kg (in un uomo adulto che pesa all’incirca 70 kg) ed equivale a miliardi di
microorganismi. Attualmente si conoscono più di 40.000 specie batteriche e 9,9 milioni di geni che
compongono questo sistema, al momento sono stati individuati geni di specie ancora sconosciute. Si
potrebbe pensare di studiare il microbiota intestinale attraverso la coltura delle feci o con svariati cicli di
PCR; tuttavia, entrambi i metodi risultano fortemente limitativi. Il primo a causa di tutte quelle specie che
faticano a crescere in coltura o che hanno bisogno di specifici terreni per poter crescere. Il secondo perché è
necessario conoscere in precedenza le specie che si vanno a ricercare.
La metodologia che al momento risulta più efficace è invece la metagenomica, una tecnica moderna che
utilizza il gene 16S rRNA, importantissimo in tassonomia perché nei batteri costituisce una sorta di targa
genetica, poiché rappresentato in modo continuativo in una determinata specie. La tassonomia batterica più
comune è proprio quella che si basa sulle caratteristiche del gene 16S rRNA. Durante gli studî, per rendere il
processo più snello, vengono osservate solo alcune delle 9 sequenze variabili (solitamente la 3 e la 4)
all’interno del gene 16S rRNA. Questo perché alcune sequenze presentano una “banca dati” più consistente.
La regione 9, in particolare è considerata la più interessante poiché presenta materiale per differenziare due
microorganismi distinti. Nel complesso la tecnica permette di distinguere due specie diverse e addirittura
due genotipi diversi della stessa specie. Per far ciò si parte dalla PCR, con la quale si ottengono le sequenze
d’interesse, queste sono poi sequenziate attraverso la next generation sequencing (NGS).1 Conoscere la
costituzione del microbiota è importantissimo per poter regolare situazioni a rischio come la disbiosi:
variazione nel rapporto fra le varie specie batteriche.
1
Next generation sequencing (NGS): tecnologia innovativa e altamente versatile che permette il sequenziamento in
parallelo di milioni frammenti di DNA; questo permette di eseguire analisi di molteplici geni contemporaneamente, con
una resa diagnostica superiore al sequenziamento tradizionale, accorciando drasticamente i tempi dell’analisi genetica.
Le migliaia di sequenze analizzate sono messe assieme da un sistema bioinformatico altamente preciso che fornisce la
sequenza più probabile.
Sequenziamento di Sanger (SGS): è il metodo di sequenziamento di prima generazione sviluppato da Fredric Sanger nel
1977. Comprende l'incorporazione selettiva di desossinucleotidi che terminano la catena da parte della DNA polimerasi
durante la replicazione del DNA in vitro. Questa tecnica di sequenziamento permette di ottenere due sole sequenze a
partire da un segmento e per questo un errore su una delle due sequenze ha un peso ingente sullo studio, che
corrisponde al 50%.
12
M1.1.1 Diversità del microbiota
[Dalla dispensa Cricca] In questa immagine vengono mostrate diverse specie batteriche e lieviti che possono
colonizzare diversi tratti dell’organismo.
A livello della cute, ad esempio, risiedono gli Stafilococchi coagulasi negativi che vengono chiamati così per
essere distinti dallo Staphylococcus aureus, l’unico in grado di produrre coagulasi. Tra gli stafilococchi
coagulasi negativi che possono risiedere nella cute ci sono lo Staphylococcus haemolyticus e lo S. epidermidis.
Sempre nella cute possono risiedere dei Corynebacteria, come il C. jeikeium o il C. striatum, che in alcune
situazioni possono mutarsi da batterî residenti a batterî patogeni, soprattutto nei pazienti diabetici. C’è anche
il Pityrosporum ovale o Malassezia furfur, un lievito residente nella cute che si può trasformare anche in
patogeno.
Si possono vedere anche diversi microorganismi presenti nel tratto urogenitale, che sono presenti
soprattutto a livello dell’uretra, tra cui l’Ureaplasma parvum e il Corynebacterium aurimucosum.
A livello dello stomaco e dell’intestino abbiamo Helicobacter pylori e anche dei batterî anaerobi, come il
Bacteroides fragilis o il B. thetaiotaomicron, i quali, nei casi di pazienti che soffrono di mucositi (e che quindi
possono avere soluzioni di continuità della mucosa intestinale), possono passare nel torrente ematico e
causare sepsi. Sempre in questa zona si possono trovare diverse specie di Streptococchi, molti Lactobacilli,
come il L. gasseri, il L. casei e il L. reuteri.
Nella cavità orale, faringe e sistema respiratorio risiedono la Candida albicans, le specie apatogene di
Neisseria, come la N. sicca, e gli Streptococchi viridanti, tra cui lo S. salivarius. Questi ultimi in caso di
operazioni dentistiche possono dare sepsi a intermittenza e, in caso di problemi cardiaci, possono insidiarsi
a livello delle valvole cardiache e dare una patologia, l’endocardite. La Candida albicans invece in soggetti
immunodepressi può dare il mughetto.
13
M1.2 DISBIOSI
La disbiosi porta alla perdita della condizione di equilibrio del microbiota, nota come eubiosi. Per cambiare
lo stato del microbiota da eubiosi a disbiosi bastano 2 sole compresse di antibiotico, a seguito delle quali per
tornare a una condizione normale sono necessarî 6 mesi. L’equilibrio è quindi molto precario.
[Dalla dispensa Cricca] Un disequilibrio del microbiota è spesso associato ad una serie di condizioni che
possono avere esiti negativi nell’ospite. Infatti, nel neonato, dove inizia la colonizzazione da parte del
microbiota, ci sono dei batterî che sono in grado, prima dello svezzamento, di metabolizzare dei prodotti della
dieta che l’ospite non è ancora in grado di metabolizzare autonomamente, contribuendo quindi alla sua
nutrizione. Inoltre, con lo sviluppo del sistema immunitario, il microbiota può interferire con l’attecchimento
di specie patogene e quindi proteggere il soggetto dalle infezioni. Di conseguenza la disbiosi può essere una
concausa di diverse patologie, tra cui l’asma, l’eczema, l’intestino irritabile, il morbo di Alzheimer o
l’osteoporosi. Si parla comunque di una associazione, non di una chiara azione patogenetica nell’assetto di
questa tipologia di patologie.
La condizione di disbiosi intestinale fa sì che:

• prevalgano i patobioti in grado di sviluppare malattie, non solo a livello intestinale, ma anche a
livello sistemico come batteriemie (es. Enterobacteriaceae, come E. coli enterobatterico);
• si abbia perdita di microorganismi commensali (es. diminuzione di L. reuteri associata a variazioni
dello spettro autistico);
• si abbia riduzione della diversità batterica che può essere causata ad esempio da diete noncorrette,
AIDS o diabete.
Bisogna prestare attenzione ad articoli talvolta allarmistici riguardanti la disbiosi e lo sviluppo di autismo o
altre patologie, in quanto basati su studi condotti su modelli animali, perciò privi di validità scientifica per
l’uomo.
M1.3 COLONIZZAZIONE
Per colonizzazione si intende la presenza di un particolare microorganismo in una sede del corpo, nello
specifico si tratterà di batterî patogeni, che migrano principalmente alla rinofaringe, orofaringe e cavità
rettale. La loro presenza è completamente asintomatica, non è associata a una produzione di anticorpi e
quindi non causa una risposta immunitaria da parte dell’organismo ospite.
Vengono detti colonizzatori perché presenti in numero cospicuo, tanto da essere rilevati dagli strumenti di
campionamento: ad esempio, lo Staphylococcus aureus e la sua colonizzazione a livello delle coane nasali
può essere rilevato tramite tampone.
Alcune tipiche colonizzazioni sono quelle da:
• Neisseria meningitidis (nello 0-15% della popolazione fra i 0 e 18 anni di età), batterio in grado di
causare la meningite;
• Staphylococcus aureus sulla cute (35-40%);
• Haemophylus influenzae (5-10%);
• Streptococcus pneumoniae (0-50%).
Il paziente colonizzato (portatore sano) può essere individuato tramite il prelievo con tampone sterile che
viene poi inserito in una provetta detta swab. Da qui viene poi inserito in un agar e messo in coltura.
M1.3.1 Streptococcus pneumoniae

Prendendo in esame il caso specifico dello Streptococcus pneumoniae, un batterio colonizzante le alte vie
respiratorie, esso può divenire la causa dello sviluppo della polmonite di comunità. Un paziente che sviluppa
i sintomi tipici della polmonite si reca in genere in pronto soccorso, dove viene effettuata emocoltura ed
esame dell’escreato da cui risulta la presenza di pneumococco nell’espettorato. La prima cosa che può
saltare in mente è diagnosticare la polmonite da pneumococco e trattare la malattia come tale; tuttavia, per
14
evitare errori, è bene considerare che c’è una percentuale (0-50%) di individui in cui lo pneumococco
colonizza di norma le alte vie aeree e in questo caso si deve assolutamente evitare l’errore ditrattare una
colonizzazione. Per questo motivo è importantissimo quantificare il numero delle colonie presenti sulla
placca di coltura e scegliere di conseguenza la giusta soluzione terapeutica; infatti, è bene tenere a mente
che la semplice colonizzazione da Streptococcus pneumoniae non costituisce un fattore di rischio per lo
sviluppo della polmonite.
M1.3.2 Staphylococcus aureus

Per quanto riguarda lo Staphylococcus aureus, dopo essere stato prelevato tramite tampone superficiale
dalle coane nasali, esso viene coltivato su un agar sale-mannite, terreno con elevata concentrazione di sale
(7,5%) e mannitolo (uno zucchero che viene fatto fermentare specificatamente dallo Staphylococcus aureus)
e con un indicatore di pH, il rosso fenolo; in questo modo, se avviene il viraggio del colore da rosso a giallo
dato dall’abbassamento del pH, significa che lo zucchero è fermentato e che quindi in quel terreno è cresciuto
indubbiamente uno Stafilococco
aureo.
Altre piastre particolari possono
rilevare la presenza di meticillino-
resistenza, ovvero la resistenza
all’oxacillina, un farmaco
impiegato in molte terapie.
L’importanza del monitoraggio
della colonizzazione da
Staphylococcus aureus è legata alla
possibilità di contenere infezioni
correlate all’assistenza. Ad
esempio, in caso di intervento
chirurgico è importante sapere se
un paziente soffre di
colonizzazione da parte di uno
Stafilococco aureo resistente alla meticillina perché
potrebbe infettare le ferite chirurgiche e pertanto
deve essere bonificato.
L’unica causa di faringite batterica nei pazienti è
dovuta allo Streptococcus pyogenes, che viene
individuato attraverso la coltura dei batterî
prelevati grazie a un tampone nasofaringeo.
Dall’analisi del tampone, tuttavia, può risultare
talvolta presente lo Staphylococcus aureus: questo
non va assolutamente riportato e trattato, poiché si
tratta di una specie colonizzante non responsabile
della faringite. Questo batterio spesso proviene
dalla zona orale e intacca il tampone per errore.
M1.3.3 Neisseria meningitidis

Un altro batterio la cui colonizzazione viene particolarmente monitorata è la Neisseria meningitidis. È
ricercata soprattutto quando un paziente viene ricoverato per meningite o meningo-encefalite, ricercando
anche tra le persone con cui ha avuto contatto, identificando anche i portatori sani, in modo tale che non
espandano l’infezione ad altri individui. In questo caso il campionamento avviene a livello della rinofaringe.
Il materiale viene inserito poi su piastre di agar cioccolato (che viene prodotto portando i globuli rossi a una
temperatura in cui rilasciano i loro fattori nutritivi) selettive per la Neisseria meningitidis, dette Thayer-
Martin (tipico terreno per Neisseriae), che contengono degli agenti di selezione, quali la vancomicina, la
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colistina e la nistatina, che inibiscono la crescita di Gram–, Gram+ e miceti. Per la Neisseria meningitidis non
si parla di diffusione ambientale, in quanto batterio molto fragile, per cui la sua trasmissione necessita
contatti molto stretti tra soggetto portatore e soggetto sano e per questo motivo è un agente patogeno che
si va a diffondere soprattutto nei mesi autunnali e invernali, quando si sta maggiormente in ambienti chiusi
e il contatto è più ravvicinato.
Con un tampone naso-faringeo seminato su Thayer-Martin, spesso si può riscontrare la presenza del
patogeno, tuttavia anche in questo caso si tratta di un fenomeno di colonizzazione che non deve
preoccupare. La colonizzazione anche questa volta non costituisce un fattore di rischio per lo sviluppo della
meningite.
M1.3.4 SARS-CoV-2
[Dalla dispensa Cricca] Il campionamento per il Covid-19 viene attualmente eseguito tramite l’utilizzo di
tamponi simili a quelli della Neisseria meningitidis, spinti fino a toccare la rinofaringe e oltre a campionare
quest’ultima, viene campionata anche l’orofaringe. Entrambi i cotton fioc vengono poi inseriti nella provetta
che contiene una soluzione di trasporto, detta medium. Essa è composta da agenti inibenti la crescita di
batterî e miceti e altre sostanze che mantengono il virus per il trasporto. Si stanno studiando dei nuovi metodi
di campionamento, legati ad esempio alla saliva, che potrebbero coadiuvare o sostituire l’analisi di tamponi
rino- e orofaringei.
M1.3.5 Colonizzazione vagino-rettale da Streptococcus agalactiae (GBS)

La colonizzazione vagino-rettale da Streptococcus agalactiae (streptococco di gruppo B, una delle principali
cause di mastite nella donna) è importante da valutare nelle donne gravide attraverso uno screening, nelle
ultime settimane di gestazione, quindi più o meno dalla 37ª settimana (circa il 5-35% delle donne sono
portatrici di GBS a livello vaginale o rettale). Viene effettuata attraverso un tampone (il solito tampone con
tappo rosa) tramite cui si campiona la mucosa del retto e della vagina. Lo Streptococcus agalactiae può essere
trasmesso dalla madre al neonato attraverso il passaggio nel canale del parto e può causare nel neonato
delle patologie invasive molto importanti come polmoniti e meningiti neonatali. Lo Streptococcus agalactiae
è uno dei principali agenti eziologici di meningite neonatale assieme all’Escherichia coli, ma per quest’ultimo
non esiste alcun tipo di sorveglianza perché, facendo parte del microbiota intestinale, attraverso un tampone
della mucosa rettale verrebbe sempre individuato. Dopo il prelievo, per favorire la crescita di Streptococcus
agalactiae, si fa un passaggio in terreno Lim-Broth, ossia un terreno di arricchimento contenente colistina e
acido nalidixico.
A destra si può vedere una tipica piastra che contiene un terreno cromogeno, in grado di colorare le colonie
di Streptococcus agalactiae di color malva. Si riescono facilmente a prelevare queste colonie e poi, attraverso
identificazione con MALDI-TOFF, si procede a verificare che
effettivamente si tratti di uno S. agalactiae.
Nel caso vi sia una positività o una colonizzazione da S. agalactiae, si
procede comunicandolo alla paziente e al ginecologo e si procederà
facendo una bonifica di questo Streptococcus agalactiae attraverso una
terapia antibatterica quando la donna entra in travaglio, generalmente
con 2 g di Amoxicillina, a meno che non ci siano delle reazioni allergiche
a questo farmaco (solitamente si somministra penicillina senza neppure
eseguire l’antibiogramma).
Questo sicuramente riduce drasticamente la possibilità che si verifichi
unasepsi neonatale, tuttavia va considerato che la colonizzazione è un
evento transitorio e che dunque un tampone positivo allo Streptococcus
agalactiae nella trentaseiesima settimana non coincide necessariamente con la presenza dello stesso
durante il parto: si può rischiare di somministrare un antibiotico a una donna che non ne ha bisogno e ciò
sicuramente non giova al neonato, questi microorganismi vanno infatti a intaccare l’equilibrio del microbiota.
Viceversa, un tampone negativo non esclude che nel tempo che intercorre tra la trentaseiesima settimana e
il momento del parto non possa presentarsi una colonizzazione.
Un modo per ovviare a questo problema è quello di svolgere una PCR nel momento in cui la donna entra in
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travaglio per verificare o meno la presenza del germe. Va tenuto in considerazione però che questatecnica
ha i suoi limiti e può risultare ipersensibile.
Paesi diversi presentano procedure diverse per quanto riguarda lo screening dello Streptococcus agalactiae,
ad esempio in Inghilterra non viene eseguito nessun tampone. Questo perché si ritiene che l’incidenza della
sepsi neonatale sia troppo bassa per rendere convenienti i benefici rispetto ai costi.
M1.3.6 Colonizzazione da Candida spp

[Dalla dispensa Cricca] Altra colonizzazione molto importante soprattutto per i pazienti critici e
immunodepressi è la colonizzazione da Candida, che è un lievito. La colonizzazione da Candida viene indagata
perché sapere se c’è una colonizzazione è molto importante nel momento in cui si verifica una sepsi. Le sepsi
da Candida sono davvero temibili perché hanno mortalità elevatissima nell’arco delle 24 h, quindi è
necessario individuarle tempestivamente e poter dare al clinico informazioni, utili ai fini di una terapia di tipo
empirico, relativamente alla colonizzazione dei diversi distretti corporei e anche alla specie di Candida che li
colonizza.
I diversi distretti corporei vengono analizzati attraverso campioni differenti:
• feci per il tratto gastro-enterico;
• urina per il tratto genito-urinario;
• i tamponi della mucosa orale per il tratto gastro-enterico, ecc.
L’assenza di isolati di Candida ha sicuramente un importante valore predittivo negativo per la presenza di
un’infezione invasiva, mentre l’isolamento ha uno scarso valore predittivo positivo.
M1.3.7 Quando la colonizzazione ha bisogno di sorveglianza

Ci sono dei casi in cui la difficoltà di gestire il referto microbiologico per distinguere una colonizzazione da
un’infezione assume particolare importanza.
A tal proposito è bene accennare al concetto di antibiotico resistenza, fenomeno per cui molti batterî
sviluppano caratteristiche che li rendono capaci di resistere a una terapia antibiotica. Nel momento in cui
una nuova molecola capace di contrastare un patogeno viene messa in commercio, intercorre un lasso di
tempo relativamente limitato (fra i 6 mesi e i 3 anni) dopo il quale si rende evidente la capacità di alcuni
batterî di resistergli. In genere dopo tre anni il 70% circa dei batterî rimane sensibile alla molecola, mentre il
30% ha sviluppato resistenza. Un esempio storico riguarda la penicillina: molecola somministrata durante il
secondo conflitto mondiale ai feriti di guerra, i primi batterî resistenti alla penicillina furono individuati già
negli anni ‘40.
Sorveglianza attiva CPE

Un problema particolarmente rilevante legato all’antibiotico resistenza che è diventato preoccupante negli
ultimi tredici anni riguarda Enterobacteriaceae in grado di produrre l’enzima carbapenemasi (CPE). La CPE è
in grado di digerire i carbapenemici, farmaci β-lattamici (grazie alla produzione dell’enzima β-lattamasi) che
sono attualmente l’ultima spiaggia nella terapia antibiotica (soprattutto contro i batterî Gram–). Tali batterî,
individuati per la prima volta tra il 2006 e il 2008, hanno sviluppato resistenza ai farmaci e sono
particolarmente pericolosi. Inoltre, attraverso la diffusione dei loro plasmidi, i geni per questi enzimi sono
altamente difffusibili, anche da un paziente all’altro; proprio per questo motivo sono in grado di generare
infezioni nosocomiali e/o comunitarie di grave entità: vi sono conseguenze legate sia all’elevata mortalità
che all’eccessiva aggressività del batterio.
Le Enterobacteriaceae colonizzano di norma l’intestino, fra questi nei paesi occidentali l’Escherichia coli è il
germe più frequentementepresente nelle emocolture di pazienti sani; nei paesi orientali ritroviamo invece la
Salmonella. Questi batterî divengono estremamente pericolosi fuori dall’intestino, come appunto nel caso di
un paziente con batteriemia. Per evitare che questi batterî colonizzino i pazienti e si propaghino negli
ospedali o nelle RSA con le attività di nursing, è di fondamentale importanza mettere in atto una sorveglianza
attiva. La colonizzazioneda Enterobacteriaceae in questo caso costituisce un fattore di rischio per lo sviluppo
di batteriemia in caso di sepsi, in quanto sono microrganismi in grado di produrre CPE che non rispondono
ad alcun tipo di trattamento e i pazienti risultano quindi non trattabili. Laddove è stata condotta sorveglianza
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attiva è stato dimostrato come la trasmissione del patogeno è estremamente preoccupante in alcuni
ospedali, dove il numero di pazienti contagiati in uscita è di molto superiore a quelli già contagiati in ingresso.
L’obiettivo è proprio quello di ridurre tale trasmissione nell’ambiente ospedaliero, poiché anche con un solo
paziente infettato da CPE sottoponiamo a rischio tutti gli altri che potrebbero essere contagiati tramite
normali attività di nursing. È importante sottolineare che in questo caso un’infezione da CPE rappresenta un
fattore di rischio per lo sviluppo di batteriemia.
La sorveglianza viene condotta verso alcuni
geni e nel caso in cui vengano individuate
infezioni/colonizzazioni da CPE, si mettono
immediatamente in atto strategie di
isolamento del paziente, poiché esso
rappresenta un rischio per tutti gli altri
pazienti ospedalizzati. L’individuazione dei
geni viene fatta tramite tampone rettale e
successiva coltura. Diviene poi necessario
seguire i pazienti individuati con un follow-
up che si protrae nel corso degli anni.
Per lo screening si utilizza la tecnica della semina su terreni cromogenici, cioè in grado di colorare i batterî
che vi crescono in base alle loro caratteristiche metaboliche. In questo modo si è immediatamente in grado
di riconoscere il tipo di batterio presente incoltura in base al colore che vien fuori a seguito delle peculiari
reazioni metaboliche messe in atto dal batterio e dal terreno stesso, permettendo al microbiologo di eseguire
anche centinaia di screening al giorno. Questa tecnica dà indicazione di sospetta positività, che viene spesso
verificata con test di conferma come la spettrometria di massa o il test immunocromatografico.
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Alternativamente possiamo sondare la presenza di CPE con il test molecolare. Questo viene svolto
utilizzando un piccolo dispositivo in grado di rilevare la presenza di cinque geni (KPC, VIM, NDM, IMP, OXA-
48). La tecnica può avere vantaggi e svantaggi rispetto all’utilizzo dei terreni cromogenici:
• il test molecolare è più rapido rispetto alla coltura sul terreno cromogenico (circa 2h, rispetto alle
18-24h impiegatenel secondo caso);
• il test molecolare verifica la presenza di un gene che può non essere strettamente correlato alla
presenza di una specie carbapenemasi-produttrice.
Analizzando il rapporto rischi-benefici risulta comunque vantaggioso sfruttare il test molecolare, infatti nel
caso in cui si trovasse un gene della stessa famiglia di uno dei cinque geni sopracitati che si sospetta possa
essere correlato alla presenza di CPE-produttori (es. gene OXA-23), seppur in genere poco frequente, il rischio
di considerare il paziente colonizzato non arreca danni, ma aumenterebbe unicamente le misure di
precauzione prese nei suoi confronti. Non c’è rischio di over-trattamento in quanto ricordiamo che le
colonizzazioni non vengono mai trattate con gli antibiotici. Al contrario, non mettendo il paziente sospetto
in isolamento si rischierebbe di diffondere la potenziale infezione all’interno delle strutture sanitarie.
M1.4 SEPSI
La sepsi è una distruzione multiorgano molto severa che può condurre il paziente allo shock settico, e un
paziente che sviluppa uno shock settico ha delle serie problematiche di recupero. Quando si presenta un
quadro clinico da shock settico, la diagnosi eziologica non ha troppa importanza, ciò che importante è
rimuovere il paziente dallo shock. Quando si è davanti a un quadro clinico così grave si ha poco tempo per
decidere e bisogna prendere delle decisioni giuste. Se un paziente arriva con un quadro clinico di sepsi in PS,
si avranno a disposizione solamente 12 ore per somministrargli una terapia antibiotica efficace.
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M2. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DELLE ALTE E BASSE VIE AEREE

M2.1 INTRODUZIONE
Le infezioni delle vie respiratorie vengono divise in:
• riguardanti le vie aeree superiori (cavità nasali, mucosa orale, faringe, laringe, trachea, seni
paranasali e orecchio medio);
• riguardanti le vie aeree inferiori (bronchi, bronchioli, polmoni).
M2.1.1 Vie di trasmissione

• Trasmissione per via respiratoria (starnutendo, tossendo);
• infezioni favorite dal clima freddo e dagli ambienti indoor sovraffollati, tipici dei mesi invernali;
• polmoniti da aspirazione in pazienti intubati;
• attraverso le mani.
M2.1.2 Difese delle vie aeree

I meccanismi di difesa naturali delle vie respiratorie partono con le vibrisse nasali, che sono sostanzialmente
le ciglia del naso che trattengono, durante la respirazione, le particelle più grosse, impedendo loro il
raggiungimento delle vie respiratorie più profonde.
Vi è poi la mucosa, che trattiene le cellule batteriche attraverso il muco (contiene IgA che possono
neutralizzare i microorganismi) e quindi può impedire ad alcune cellule batteriche che provengono
dall’esterno di raggiungere le vie respiratorie più profonde.
Vi sono degli enzimi come il lisozima, che agisce a livello del peptidoglicano e quindi lisa la parete cellulare,
e la lattoferrina, presente a livello del sangue, che lega il ferro sottraendolo al metabolismo batterico.
Vi sono ciglia vibratili, circa 200 per cellula, che rivestono le vie respiratorie come i bronchi.
Sicuramente molto importanti sono i macrofagi alveolari, sono responsabili della fagocitosi (ci sono anche
dei batterî che sviluppano dei meccanismi di sopravvivenza all’interno dei macrofagi alveolari e quindi sono
in grado di evitare la fusione del fagosoma col lisosoma, riuscendo a sopravvivere, come ad esempio il
Mycobacterium tuberculosis).
Infine, bisogna citare la popolazione microbica residente che fa da barriera all’attecchimento dei batterî e
dei virus patogeni.
M2.1.3 Popolazione microbica residente

[Da diapositiva]
• Antagonizza attecchimento e moltiplicazione di microrganismi patogeni;
• superficie delle vie respiratorie pari a 75 m2, in diretto contatto con l’esterno;
• popolazione numerosa e variegata nelle prime vie aeree, mentre si riduce al di sotto della laringe;
• fino a pochi anni fa gli alveoli polmonari erano considerati sterili
• esiste un «lung microbiota» che è diverso in soggetti sani e in soggetti con malattie del tratto
respiratorio, quali asma, BPCO, e fibrosi cistica.
M2.1.4 Patogenesi delle infezioni delle vie respiratorie

[Da dispensa Cricca]
I fattori di virulenza con cui i microrganismi sono in grado di bypassare le nostre difese sono:
• capacità di aderire all’epitelio respiratorio (adesine batteriche, pili, emoagglutinina del virus
influenzale);
• produzione di tossine (pneumolisina di S. pneumoniae, danneggia le ciglia);
• produzione di proteasi in grado di scindere le IgA (S. pneumoniae);
• capacità di inibire la fagocitosi da parte di macrofagi alveolari: o capsula antifagocitaria (es.
Streptococcus pneumoniae, i ceppi senza capsula (α emolitici) sono ceppi secchi, quelli con la
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capsula sono ceppi più mucosi e lucidi, o capacità di replicarsi nei macrofagi (es. M. tuberculosis
e L. pneumophila).
I microrganismi che vanno a ledere la mucosa respiratoria causano un danno e impediscono l’azione di difesa
della mucosa stessa, quindi possono penetrare e dare infezione/sovrainfezioni batteriche.
Ci sono tre meccanismi principali responsabili con cui accade ciò:
• effetto citopatico diretto: legame, danneggiamento e distruzione della parete mucosa tipico dei virus
(es. virus dell’influenza) à sovrainfezioni batteriche frequenti (tipiche da post-influenza);
• leucocidina: tipica dello Staphylococcus aureus, distrugge i leucociti;
• immunopatologia virus-mediata: risposte immunitarie montate contro virus danneggiano la mucosa.
M2.2 INFEZIONI DELLE ALTE VIE RESPIRATORIE

[Non trattate dal prof]
Le infezioni del primo tratto delle vie aeree sono principalmente tre:
• faringo-tonsilliti;
• otite media;
• infezioni rino-sinusali.
M2.2.1 Faringo-tonsilliti
Interessano prima di tutto la faringe (sia orofaringe
che rinofaringe), inoltre coinvolgono anche l’anello
linfatico del Waldeyer, ovvero l’insieme degli organi
linfoidi situati nelle cavità orale e faringea: le
tonsille. Si distinguono le tonsille linguali, palatine,
tubali e le adenoidi.
Classificazione clinica delle faringo-tonsilliti

• Forme acute:
o forme eritematose: sono chiamate anche angine rosse per l’aspetto della mucosa tonsillare,
che appare appunto arrossato ed eritematoso. Si verificano soprattutto in presenza di
infezioni virali e, in particolare, nelle malattie esantematiche (rosolia, morbillo, varicella);
o forme purulente: chiamate invece angine bianche per il colore che assumono le tonsille. Si
verificano in presenza di infezioni batteriche;
o forme pseudo-membranose: le più problematiche, insorgono in presenza di infezione da
virus di Epstein-Barr (EBV) e Corynebacterium dyphteriae. Sono caratterizzate dalla
formazione di una pseudomembrana particolarmente aderente alla mucosa tonsillare,
costituita da un essudato fibrinoso bianco-grigiastro. Nel caso del C.d. la sua formazione è
dovuta alla secrezione della tossina difterica che inibisce la sintesi proteica;
o forme ulcerative: chiamate angina di Plaut-Vincent, di tipo fusospirillare, si verificano in
caso di infezione mista, solitamente causate da batterî anaerobî del genere Fusobacterium o
di batterî spirillari come i Treponema. Sono caratterizzate, come suggerisce il nome, da
ulcerazioni nel parenchima tonsillare;
o forme o angine vescicolari: causate da infezioni da Coxsackievirus e, nel caso di
Coxsackievirus di tipo B, associate a manifestazioni cutanee vescicolari a livello di mani e
piedi (forma “mani-bocca-piedi”).
• Forme ricorrenti: hanno andamento intermittente e sono soprattutto dovute a Staphylococcus
aureus. Occorre però distinguere lo S. aureus patogeno da quello colonizzante;
• Forme croniche: sono principalmente dovute a batterî anaerobi, in particolare i generi Bacteroides
(melaninogenicus) e Fusobacterium (nucleatum), entrambi normalmente presenti nel cavo orale
come commensali.
21
In generale oltre il 50% delle faringo-tonsilliti hanno eziologia virale (Adenovirus, Coxsackievirus A,
Enterovirus, EBV, HSV, RSV, virus influenzale e parainfluenzale, CMV). Le restanti hanno eziologia batterica,
in particolare il 30% è dovuto a infezioni da Streptococcus pyogenes, caratterizzate da sequele tardive di tipo
autoimmune, tra le quali la principale è la malattia reumatica. Di minore importanza sono lo Staphylococcus
aureus, l’Haemophilus influenzae e il Bacteroides melaninogenicus (anaerobio commensale del cavo orale).
Per il prelievo per la diagnosi si utilizza il tampone faringeo:
• tampone con tappo rosso: per indagine virale (contiene sostanze che inibiscono la crescita di batterî
e miceti), utilizzato anche per infezioni da SARS-Cov-2;
• tampone con tappo rosa: per ricerca di batterî e miceti, è il medesimo utilizzato per il tampone della
mucosa rettale, delle cavità nasali e, appunto, della faringe.
Nell’immagine è visibile un esempio di angina bianca da Streptococcus pyogenes, nonché una coltura su agar
sangue in cui è ben visibile l’emolisi completa ad opera delle colonie batteriche (S.P. è beta-emolitico)
Esempio di faringo-tonsillite pseudomembranosa da C. diphteriae (bacillo

Gram+) osservato al microscopio. L’infezione da C. d. può diventare
estremamente pericolosa se la tossina difterica raggiunge la circolazione
ematica e causa complicanze a distanza quali miocardite, paralisi e nefrite. Il
batterio è ormai praticamente assente sul territorio italiano in quanto la
vaccinazione antidifterica è obbligatoria.
Esiste anche una forma di difterite di tipo cutaneo (ECDC), le cui manifestazioni
sono ulcere a livello di mucose e cute. È rilevante in tempi recenti in quanto si sono
verificati casi tra i migranti che raggiungono l’Unione Europea attraverso il
Mediterraneo. La diagnosi si effettua mediante un tampone cutaneo e un esame
colturale.
M2.2.2 Otite media

L’otite media è un’infezione dell’orecchio medio. Vi sono tre aspetti di questa componente dell’apparato
uditivo che favoriscono l’infezione ed eventuali complicazioni:
1. comunicazione diretta con la faringe tramite la tromba di Eustachio;
2. rivestimento costituito da mucosa simil-respiratoria e dunque aggredibile dai patogeni delle vie
aeree superiori;
3. struttura ossea circostante costituita da osso micro-areolare (osso temporale); ciò aumenta la
probabilità di raggiungimento da parte di patogeni e di passaggio di questi alle meningi (meningite
per contiguità).
Come per le faringo-tonsilliti, anche le otiti medie possono essere acute (S. pneumoniae e H. influenzae) o
croniche. Un’ulteriore classificazione riguarda il timpano, che può essere chiuso o aperto. In particolare, nella
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forma acuta è presente una prima fase con iperemia del timpano, che può essere seguita da una fase
suppurativa con estroflessione della membrana ed eventuale perforazione.
I principali agenti eziologici dell’otite media sono così distribuiti:
4. Otite media acuta:
• Streptococcus pneumoniae (25-30%);
• Haemophilus influenzae (20-25%);
• Moraxella catarrhalis (3%).
5. Otite media cronica (frequentemente polimicrobica):
• Staphylococcus aureus;
• Gram– (Escherichia coli, Proteus spp, Pseudomonas spp);
• Anaerobî.
Caso clinico
Paziente al pronto soccorso con dolore all’orecchio, febbre e in stato confusionale, si esegue la
rachicentesi con esame cito-chimico e successivamente molecolare. Il primo indica chiaramente
un’infezione di tipo batterico e l’esame molecolare permette di individuare subito S. pneumoniae come
agente eziologico. È un esempio eclatante di otite media seguita da meningite batterica per contiguità.
M2.2.3 Infezioni rino-sinusali o sinusiti

Sono le infezioni delle cavità nasali e dei seni paranasali. Gli agenti eziologici sono i medesimi delle otiti
medie: per le acute S. pneumoniae, H. influenzae e M. catarrhalis; per le croniche i generi anaerobî
Bacteroides e Fusobacterium; sono spesso polimicrobiche. Numerosi fattori predisponenti queste infezioni
sono manovre ospedaliere come il tamponamento nasale e l’utilizzo di sondini naso-gastrici o tubi naso-
tracheali. Per quanto riguarda le sinusiti acute nosocomiali, gli agenti eziologici sono principalmente i batterî
Gram–.
Otiti medie e sinusiti da funghi filamentosi

Otiti medie: il fungo filamentoso più frequentemente isolato nei casi di otite media è Aspergillus niger, che
dà infezioni solitamente con perforazione del timpano. Per la diagnosi si effettuano tampone o drenaggio
auricolare a seconda dei casi.
Sinusiti: colpiscono soprattutto i pazienti immunocompromessi, indipendentemente dalla causa

dell’immunocompromissione (neutropenici e quindi ematologici, pazienti trapiantati, pazienti sottoposti a
terapia steroidea, diabetici). Gli agenti eziologici prevalenti sono i miceti dei generi Mucorales, a crescita
particolarmente rapida, e Aspergillus. Le infezioni causate sono chiamate rispettivamente mucormicosi e
aspergillosi rino-cerebrali. Nei pazienti immunocompromessi, infatti, l’infezione dei seni nasali è spesso
seguita da un’invasione destruente del tessuto osseo e dal raggiungimento del tessuto cerebrale, rendendo
l’infezione letale.
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La diagnosi avviene tramite tampone o drenaggio nasale; in alternativa spesso si effettua una biopsia della
mucosa palatina nei punti in cui questa si mostra necrotica, e successivamente un’indagine microbiologica.
Per quanto riguarda gli Aspergilli, sono sufficienti l’osservazione al microscopio e l’esame colturale; i
Mucorales invece sono più complicati. Non sono infatti dotati di ife settate, ma di ife cenocitiche, ciò li rende
particolarmente fragili e a rischio rottura durante l’allestimento del preparato per il microscopio o della
coltura. Vi è, infatti, un alto numero di falsi negativi, complicato dal fatto che non risultano efficaci nemmeno
i test immunologici (per galatto-mannano). In conclusione, in caso di sospetta infezione da Mucorales, è
preferibile l’utilizzo di test molecolari, che sono però ancora primitivi.
Caso clinico
Paziente con otite media perforata, si eseguono tampone auricolare e drenaggio del liquido. L’esame
colturale e quello microscopico evidenziano la presenza di ife fungine di Aspergillus flavus.
M2.3 INFEZIONI DELLE BASSE VIE RESPIRATORIE

Le medie-basse vie respiratorie partono dalla trachea bassa, arrivano ai bronchi, ai polmoni e agli annessi di
rivestimento (ovvero le pleure). I quadri clinici principali che si identificano nell’ambito delle infezioni delle
basse vie respiratorie sono:
• tracheo-bronchiti, riguardano il primo tratto delle vie respiratorie inferiori;
• bronchioliti, riguardano i piccoli bronchi;
• polmoniti, riguardano i bronchioli terminali e gli alveoli;
• pleurite, infiammazione della pleura;
• empiema, presenza di liquido purulento nella cavità pleurica;
• ascesso polmonare, presenza di cavità di liquido purulento nel parenchima polmonare.
[Saranno trattate solo le prime tre.]
M2.3.1 Tracheo-bronchiti
Tracheiti e bronchiti sono delle infezioni di “confine” in quanto interessano distretti compresi tra le alte e le
basse vie respiratorie. Colpiscono soprattutto bambini con meno di due anni, anziani e soggetti
immunodepressi: nei bambini in età prescolare le infezioni che si organizzano a livello di trachea e bronchi
sono fondamentalmente di origine virale; questo è molto importante per scegliere la terapia, infatti,
somministrare antibiotico a un bambino piccolo con bronchite non è una scelta adeguata, in quanto è
un’infezione prevalentemente di origine virale e non, appunto, batterica. I virus che causano tracheite e
bronchite nei bambini in età prescolare sono:
• Virus influenzali (poco rilevanti) e parainfluenzali;
• RSV (virus respiratorio sinciziale) à è il più rilevante;
• hMPV (Metapneumovirus umano);
• Rhinovirus;
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• Adenovirus;
• Coxsackievirus.
Tutti questi agenti sono responsabili, inoltre, delle cosiddette “flu like illness”: infezioni respiratorie simili
all’influenza, ma che differiscono da questa sia in termini di severità clinica che di importanza epidemiologica
(influenza è molto più grave). Le flu like illness sono forme da raffreddamento che si contraggono a partire
da ottobre fino a primavera, invece, l’influenza si contrae durante lo specifico periodo epidemico.
Invece, considerando i soggetti adulti, soprattutto gli anziani, e i soggetti immunodepressi, gli agenti
responsabili di queste infezioni del tratto respiratorio sono dei batteri con dichiarata capacità patogena:
• Haemophilus influenzae B;
• Streptococcus pneumoniae;
• Moraxella catarrhalis;
• Bordetella pertussis.
Il soggetto immunodepresso
Il soggetto immunodepresso è un soggetto con una parziale competenza del sistema immunitario: le
cellule immunitarie sono numerose, dunque, un soggetto può avere un deficit che interessa solo alcune
branche della risposta immunitarie, oppure può avere un deficit di tipo globale. Il tipico esempio di
paziente immunodepresso è il soggetto che riceve un trapianto di cellule staminali ematopoietiche, il quale
deve andare incontro ad una forte terapia immunosoppressiva per garantire un corretto sviluppo cellulare;
ancora, altri esempi sono rappresentati dal paziente neoplastico e dal paziente in dialisi. Il soggetto
immunodepresso è un soggetto abbastanza difficile da trattare ed è opinione comune che sia IL paziente,
ovvero, il paziente su cui bisogna investire, proprio perché è difficile trattarlo e perché rischia di morire. Il
prof ritiene però che, per quanto i soggetti immunodeficienti siano meritevoli di attenzione e alta
considerazione, essi siano numericamente “poco” rilevanti (meno dell’1% dei pazienti che frequentano un
normale ospedale) e caratterizzati da una “microbiologia collaterale”, ovvero, circoscritta unicamente al
soggetto immunodepresso stesso e non considerabile per la maggioranza.
M2.3.2 Bronchioliti
Oltre a infezioni quali tracheiti e bronchiti, vanno considerate le bronchioliti, ovvero, le infezioni dei
bronchioli. Proprio a causa del continuum anatomico tra le varie strutture, non si avrà mai un paziente con
bronchiolite senza bronchite; pertanto, questa classificazione delle varie infezioni ha uno scopo puramente
didattico.
Gli agenti eziologici virali delle bronchioliti sono:

• RSV (virus respiratorio sinciziale);
• hMPV (Metapneumovirus umano);
• Virus parainfluenzale.
Tra questi il più importante è il virus respiratorio sinciziale, ovvero, un Paramyxovirus a RNA molto rilevante
per due motivi: è responsabile della bronchiolite, soprattutto nei soggetti sotto i 6 anni di età, e ha una
cadenza stagionale molto precisa. La “stagione” dell’RSV va da novembre fino a marzo, quindi trovare un RSV
a luglio in un bambino affetto da bronchiolite è molto improbabile; la circolazione dell’RSV è evidentemente
connessa al fatto di stare al chiuso nelle scuole, a stretto contatto, …
La diagnosi di bronchiolite da RSV è una diagnosi molto importante, infatti, la bronchiolite da RSV è una forma
ragionevolmente severa da portare il bambino verso il pronto soccorso a causa di un’insufficienza
respiratoria. L’infezione da RSV, specie nel bambino, è inoltre molto diffusiva, dunque, è bene isolare i
bambini affetti da bronchiolite insieme ad altri nelle stesse condizioni, proprio per evitare la diffusione della
malattia.
25
Recentemente sul discorso RSV [povera Vittoria Ferragnez] ci si è dovuto ricredere: da quando si hanno a
disposizione dei test multiplex per fare diagnosi di infezione delle medie-basse vie respiratorie si è scoperto
che RSV circola anche tra la popolazione adulta, e tendenzialmente anziana, provocando forme di
bronchiolite che prima erano abbastanza sconosciute, proprio perché nessuno conosceva l’eziologia di
queste forme respiratorie. I test multiplex, basati su PCR, permettono di identificare simultaneamente RSV,
influenza A e B, questo ha portato all’identificazione di RSV inaspettati. Grazie a queste nuove tecniche è
stato possibile comprendere la causa dell’elevato numero di casi di influenza che si verificano annualmente:
gli agenti eziologici non sono solo Influenza A e B ma anche appunto RSV (cosa che prima non era stata
considerata proprio perché i dati epidemiologici dimostravano che RSV causasse infezione solo nei bambini
e non negli adulti).
L’agente batterico responsabile di bronchioliti è Mycoplasma pneumoniae.
Bordetella pertussis
Bordetella è un batterio che attualmente ha una copertura vaccinale molto efficace: nel passato il vaccino
era fatto con cellule di Bordetella denaturate a causa del calore, e questo comportava un elevato numero di
effetti collaterali e una bassa protezione; invece, attualmente il vaccino si basa sulla tossina purificata della
Bordetella, cosa che ha consentito di eliminare gran parte degli effetti collaterali, dati dal batterio Gram–, e
aumentare la protezione verso la parte patogena responsabile della pertosse. La pertosse è una malattia che
negli ultimi anni è fortemente riemersa perché le persone non si vaccinano e questo ha portato, oltre che ad
un aumento dei casi di pertosse nell’adulto (à la pertosse, così come le malattie esantematiche, è una
malattia dell’infanzia e tutte le malattie dell’infanzia, se prese da adulto, hanno una severità clinica molto
maggiore: si pensi a morbillo e varicella), soprattutto ad un aumento dei casi di pertosse nel neonato.
Il vaccino antipertosse è costituito da tre dosi nel primo anno di vita e un richiamo a sei anni; è obbligatorio
per i nati dal 2001.
Considerando la
mappa che riporta i
casi di pertosse in
Europa nel 2018, si
può notare come
essi siano
consistenti.
Apparentemente in
Italia i casi sono
pochi, questo
perché la mappa
riporta unicamente i
casi notificati,
infatti, c’è uno
specifico
regolamento di
igiene che impone
ad ogni medico, che
osservi o sospetti un
caso di malattia
infettiva e diffusiva,
di notificarlo ai
dipartimenti di sanità pubblica, il quale trasmette l’informazione alla regione che, a sua volta, la trasmette al
Ministero. Il ministero verifica i dati e li invia a Stoccolma dove vengono realizzate queste mappe che,
appunto, hanno validità se il sistema di notificazione funziona bene (come accade in Germania).
In Italia c’è un gravissimo problema di sottonotificazione, come dimostra il caso seguente: sul sito web
dell’istituto superiore di sanità vi è una mappa che riporta i casi di meningite batterica divisi per regione, in
particolare, ogni regione ha un colore diverso a seconda del numero di casi di meningite batterica identificati
26
per 100.000 abitanti; alcune regioni, a causa di deficit nel sistema di notificazione, non hanno alcun caso di
meningite batterica, cosa appunto molto improbabile.
L’Emilia-Romagna per far fronte a questo grave problema di sottonotifica ha messo in atto una valida
strategia: sono state incrociate il 30% delle notifiche cliniche (fatte dal medico alla regione) che non avevano
notifiche di laboratorio associate (dunque considerate invalide) con il 30% delle notifiche di laboratorio che
non hanno mai raggiunto effettivamente la regione. Infatti, affinché una notifica clinica sia valida ci deve
essere una notifica di laboratorio che confermi l’effettiva presenza di un certo microorganismo, es: un medico
individua un caso di meningite e notifica il caso alla regione, e allo stesso tempo un laboratorio notifica alla
regione di aver isolato Neisseria meningitidis.
Questo sistema ha permesso di
capire che 1 caso su 3 non veniva
notificato.
La regione Lombardia,
sicuramente una regione di
altissimo livello, non usa un
sistema di notifica come quello
utilizzato dall’Emilia-Romagna:
per esempio, per la gestione delle
resistenze antibatteriche si fa un
giorno al mese di campionamento
per il laboratorio (è solo un giorno
su 30), invece, in Emilia-Romagna
viene trasmesso giornalmente
tutto quello che si fa e si riscontra,
e non solo una volta in un mese.
Il grafico soprastante riporta la distribuzione dei casi europei di pertosse ogni 100.000 abitanti in base all’età
e al genere: i soggetti più colpiti sono i neonati, proprio perché sono quelli che non si sono ancora vaccinati
e che sono quindi più a rischio.
Diagnosi di pertosse
La diagnosi si fa attraverso tre sistemi:
• esame colturale su terreno selettivo;
• ricerca di anticorpi antitossina, perché è la tossina che è responsabile della malattia: è il sistema
diagnostico di riferimento;
• PCR che si può fare su materiale di derivazione delle alte-basse vie per verificare la presenza del
genoma della Bordetella.
La diagnosi di infezione da Bordetella con esame colturale non è molto sensibile perché la diagnosi di
laboratorio deve essere fatta su un campione biologico che sia rappresentativo del processo patologico: ad
esempio, se un bambino si presenta in PS con i classici sintomi della pertosse (bassa saturazione, crisi
respiratoria,…) vuol dire che si è già in fase di pertosse conclamata; la pertosse in fase conclamata è causata
dalla tossina e non dalla Bordetella, quindi, dato che si è in fase conclamata, sarà molto difficile trovare a
livello delle secrezioni delle alte vie Bordetella in quantità coltivabili e, conseguentemente, l’esame colturale
sarà difficilmente positivo.
Utilizzando la PCR, invece, è molto probabile che il risultato sia positivo: questa positività potrebbe, però,
non essere veritiera in quanto la PCR dà positività anche in un soggetto che magari è solo colonizzato. Per
comprendere meglio questo aspetto, si consideri il seguente caso: un soggetto si presenta con un quadro
sintomatologico simile alla pertosse, si decide di fare una PCR e questa risulta positiva. A questo punto
bisogna valutare situazione e contesto: se il soggetto ha una sintomatologia non grave ci si può permettere
di aspettare e fare ulteriori test per accertarsi che non sia un falso positivo se, invece, il soggetto è un
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bambino con una condizione molto severa bisogna agire tempestivamente (somministrando, ad esempio,
antibiotico) e sperare di aver fatto una giusta diagnosi.
In ogni caso la diagnosi è comunque fondamentalmente sierologica.
Pannelli sindromici
I pannelli sindromici molecolari multiplex sono una nuova tecnica di PCR che va a fornire informazioni clinico-
epidemiologiche su patogeni in grado di generare infezioni a livello dello stesso distretto anatomico.
Mediante un solo pannello sindromico è quindi possibile ricercare contemporaneamente una lista di
patogeni tramite PCR, questo viene utilizzato come strumento diagnostico nelle infezioni delle vie aeree, del
tratto gastro-enterico, ecc…
La massima efficacia nell’utilizzo di questa modalità di diagnosi è raggiunta solo tramite una corretta
interazione tra clinico e microbiologo: infatti una semplice lista di tutti i patogeni il cui genoma è stato rilevato
con la PCR, non aiuta il clinico a fare diagnosi, anzi può anche confonderlo.
Si presentano due principali problematiche:
• distinguere le infezioni dalle colonizzazioni;
• capire se la presenza del DNA sia effettivamente indice di presenza del microorganismo.
Chiaramente, se l’esame diagnostico viene svolto prelevando materiale a livello di tessuti “sterili”, dove non
vi è microbiota, ci sono buonissime probabilità che il DNA trovato appartenga al microorganismo causante
l’infezione, ad esempio in caso di polmonite effettuando un lavaggio bronco-alveolare (BAL)2.
A riprova della difficoltà di interpretazione dei pannelli sindromici, è stato svolto uno studio utilizzando lo
stesso pannello sindromico per infezioni gastro-enteriche a livello di tre laboratorî italiani (Novara, Cesena,
Pescara) su persone sane: tutti i risultati delle PCR sono risultati differenti.
Le PCR abbinate a pannelli sindromici diventeranno sempre più disponibili a livello laboratoriale: la grande
domanda di analisi di tamponi per SARS-CoV-2 ha portato molte strutture a investire soldi per potenziare la
propria capacità di svolgere analisi molecolari, i cui costi sono molto scesi rispetto all’era pre-Covid,
diventando addirittura quasi competitivi con le analisi colturali; per tale motivo le modalità di diagnosi in
futuro cambieranno.
Nell’immagine a lato è visibile un

esempio di pannello sindromico
relativo a infezioni delle alte vie
aeree, che unisce la ricerca di
agenti virali (come: Adenovirus,
Coronavirus, virus dell'influenza A
e B e virus parainfluenzali) ad
agenti batterici (come: Bordetella
pertussis, Chlamydia pneumoniae
o Mycoplasma pneumoniae).
2
Il lavaggio bronco-alveolare (BAL) è una pratica molto invasiva, si attua inserendo un broncoscopio fino agli alveoli,
per poi eseguire un lavaggio con 100/50 mL di soluzione fisiologica, successivamente recuperata e inviata al laboratorio
per le varie analisi.
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Sensibilità e specificità
Sensibilità di un esame diagnostico à Si definisce sensibilità di un esame diagnostico la capacità di
identificare correttamente i soggetti ammalati, ovvero affetti dalla malattia o dalla condizione che ci si
propone di individuare. Se un test ha un'ottima sensibilità, allora è basso il rischio di falsi negativi, cioè
di soggetti che pur presentando valori normali sono comunque affetti dalla patologia o dalla condizione
che si sta ricercando.
Alta sensibilità = alta probabilità che un soggetto malato risulti positivo al test e, quindi, bassa probabilità
che un soggetto malato risulti negativo al test
Il difetto di un test sensibile è che può dare dei falsi positivi (“trova troppi positivi”) e quindi si rende
necessario un test di conferma.
Specificità di un esame diagnostico à Si definisce specificità di un esame diagnostico la capacità di

identificare correttamente i soggetti sani, ovvero non affetti dalla malattia o dalla condizione che ci si
propone di individuare. Se un test ha un'ottima specificità, allora è basso il rischio di falsi positivi, cioè
di soggetti che pur presentando valori anomali non sono affetti dalla patologia che si sta ricercando.
Alta specificità = alta probabilità che un soggetto sano risulti negativo al test e, quindi, bassa probabilità
che un soggetto sano risulti positivo al test.
Più è alta la specificità più cala la sensibilità: sono inversamente proporzionali.
M2.3.3 Polmoniti
Le polmoniti sono infiammazioni acute o croniche del parenchima polmonare, generalmente causate da
agenti infettivi (ma non solo). Possono essere classificate su base epidemiologica, eziologica e anatomo-
patologica.
Gli agenti eziologici delle polmoniti interstiziali sono:
o Mycoplasma pneumoniae;
o Chlamydia pneumoniae;
o Legionella pneumophila;
o Virus: RSV, virus influenzali, virus parainfluenzali, Adenovirus, CMV, VZV, SARS-CoV2.
M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila, inoltre, causano una polmonite interstiziale detta atipica,
così chiamata in quanto questi batterî non rispondono ai farmaci β-lattamici (Legionella è un batterio
intracellulare e dunque non raggiungibile dai farmaci, Chlamydia e Mycoplasma sono privi di parete cellulare,
che è il bersaglio dei β-lattamici). L. pneumophila può causare anche polmoniti alveolari.
Classificazione epidemiologica
La classificazione epidemiologica divide le polmoniti in due grandi categorie:
• polmoniti acquisite in comunità (CAP), quindi contratte dal paziente negli ambienti di vita quotidiana;
• polmoniti nosocomiali (HAP), contratte dal paziente in ambiente ospedaliero.
Polmoniti acquisite in comunità (CAP)

Sono causate da patogeni contratti al di fuori dell’ambiente ospedaliero; per questo il criterio fondamentale
per definire una polmonite come CAP è che il paziente non deve essere stato ricoverato nei 15 giorni
precedenti la comparsa dei sintomi di infezioni polmonare.
Le caratteristiche epidemiologiche sono:

o incidenza annuale in Italia: 3 casi ogni 1.000 abitanti;
o i maschi sono più colpiti delle femmine;
o sono colpiti i bambini piccoli e gli anziani;
o si ha un picco tra ottobre e aprile;
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o sono causate da virus, da batterî o da sovra-infezione batterica in presenza di infezione virale, avviene
spesso con i virus dell’influenza con sovra-infezione da pneumococco (giocano un ruolo fondamentale
le vaccinazioni antinfluenzale e anti- pneumococcica, consigliate per l’anziano).
CAP in età neonatale o pediatrica: in età pediatrica le infezioni virali sono predominanti, ci sono però alcuni
batterî isolati in casi di polmoniti neonatali e pediatriche:
o Streptococcus agalactiae, soprattutto nel neonato, nel quale è anche agente infettivo di meningite.
Per questo si effettua uno screening nelle donne attorno alla 37ª settimana di gravidanza con tampone
vagino-rettale per verificare la presenza di S. agalactiae ed eventualmente iniziare terapia antibiotica
per scongiurare la possibile infezione del nascituro al passaggio nel canale del parto;
o Staphylococcus aureus;
o S. pneumoniae;
o Haemophilus influenzae;
o Moraxella catarrhalis.
CAP nell’adulto: nell’adulto, gli agenti eziologici sono:

o S. pneumoniae;
o H. influenzae;
o batterî delle polmoniti atipiche: Legionella pneumophila, M. pneumoniae, C. pneumoniae;
o Virus: virus influenzali A, B e C; hRSV, SARS-CoV2.
CAP nell’anziano: nell’anziano, invece, data la frequente ospedalizzazione e l’elevato numero di farmaci
assunti, le infezioni sono causate da diversi batterî antibiotico-resistenti, anche ad ampio spettro:
o S. pneumoniae penicillino-resistente;
o MRSA (stafilococco aureo meticillino-resistente);
o Enterobatterî ESBL (β-lattamasi ad ampio spettro, bloccano le cefalosporine di III generazione) sono
trattati tramite l’utilizzo di inibitori delle β-lattamasi insieme a β-lattamici (esempio
Piperacillina/Tazobactam); alcuni sono anche produttori di carbapenemasi;
o Pseudomonas aeruginosa: possiedono meccanismi di resistenza basati su scarsa permeabilità di
membrana o aumentata attività della pompa di efflusso;
o CR-Acinetobacter baumanni (resistente ai carbapenemi): acquisiscono resistenza con meccanismi
genetici e spesso possiedono i medesimi geni di resistenza degli enterobatterî (solitamente però non
presentano il gene KPC);
o vi sono poi agenti eziologici virali, come i virus influenzali A e B, RSV e Rhinovirus.
Agenti eziologici di polmonite in soggetti con fibrosi cistica: la fibrosi cistica è una malattia genetica che
causa, tra le altre manifestazioni, la secrezione di un muco particolarmente denso nelle vie respiratorie, a
causa di una minore secrezione di elettroliti e una conseguente minore secrezione di acqua. Questo muco
patologico favorisce la colonizzazione da parte di batterî e predispone a infezioni delle vie respiratorie, anche
da parte di microrganismi non comunemente isolati in casi di polmoniti in soggetti senza fibrosi cistica.
I principali agenti eziologici sono:
o S. aureus e H. influenzae sono i primi colonizzatori in età pediatrica;
o segue in età adolescenziale la colonizzazione da parte di P. aeruginosa (da una colonizzazione
importante tende a formare biofilm)
Altri microrganismi peculiari:
o Burkholderia cepacia (letale nel 20% dei casi);
o Stenotrophomonas maltophilia;
o Achromobacter xylosoxidans;
o miceti filamentosi: Aspergillus spp, Scedosporium apiospermum.
In un soggetto immunodepresso le cause possono essere, oltre a quelle appena citate, anche una serie di
microrganismi differenti:
30
o Aspergilli (funghi filamentosi): una devastazione per i pazienti ematologici e neutropenici; causano
aspergillosi invasive principalmente polmonari, che possono diventare sistemiche, velocissime
nell’accrescimento, di difficile diagnosi e spesso mortali;
o Cryptococcus neoformans: causa di polmonite nei pazienti HIV+;
o Pneumocystis jiroveci: causa di polmonite nei pazienti HIV+ o con alterazione delle cellule T;
o Nocardia: micobatteriosi atipiche;
o Herpesviridae (CMV, HHV-6, HSV1 e 2, VZV): possono causare polmoniti in pazienti trapiantati o con
altre forme di immunodepressione.
Polmonite cronica: tubercolosi. È una forma indolente, inizia lentamente con febbricola, tosse (secca,
produttiva, emottisi), perdita di peso, sudorazione notturna (sintomi aspecifici). Può dare una polmonite,
come nel corso di un’infezione primaria oppure, in una serie di pazienti, se rimane latente, può riattivarsi in
corso di immunodepressione o immunosenescenza (es. anziano). Per cui possiamo avere sia una polmonite
primaria che da riattivazione.
Polmoniti nosocomiali (HAP)

Per definizione le infezioni nosocomiali, nelle quali rientrano polmoniti correlate all’assistenza, insorgono
dopo le prime 48 h dal ricovero (naturalmente questo dato è collegato più a un valore giuridico che clinico).
Generalmente il principale fattore di predisponente è l’intubazione, frequenza fino a quattro volte maggiore
rispetto ai pazienti non intubati, che nonostante sia fondamentale per normalizzare e consentire la
respirazione, soverchia le difese dell'organismo presenti nelle alte vie respiratorie come muco, ciglia, ecc…
Gli agenti eziologici che promuovono le HAP generalmente sono:
• Pseudomonas aeruginosa;
• MRSA;
• Enterobacteriaceae e altri Gram– non fermentanti, quali A. baumanni, Burkholderia cepacia, S.
maltophilia;
• Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemici (CPE);
• Legionella pneumophila (tramite contaminazione di riserve/serbatoi d’acqua come impianti di
condizionamento).
L’interesse per le infezioni nosocomiali sta aumentando negli ultimi anni, sia per i risvolti legali di un’infezione
contratta in ospedale (risarcimenti e denunce), sia per la possibile maggior resistenza del patogeno agli
antibiotici, infatti, il microorganismo è sopravvissuto a un ambiente molto ostile (disinfettanti, antibiotici,
ecc.), e soprattutto perché, nella maggior parte dei casi, le HAP sono la conseguenza di mancanza di zelo e
attenzione da parte del personale sanitario.
Classificazione eziologica
La classificazione eziologica divide invece le polmoniti in tre categorie, sulla base dell’agente patogeno:
• polmoniti batteriche;
• polmoniti virali;
• polmoniti fungine (molto rare);
Classificazione anatomo-patologica
La classificazione anatomo-patologica divide le polmoniti in base alla localizzazione anatomica dell’infezione:
• polmoniti alveolari: localizzate a livello degli alveoli (prevalentemente batteriche): in ambito
radiografico si evidenzia maggiore radiopacità a livello del parenchima polmonare, reso più denso
dall’infezione;
• polmoniti interstiziali: localizzate nei setti inter-alveolari: hanno comunemente eziologia virale, ad
eccezione di quelle causate da patogeni respiratori atipici, ossia batterî resistenti alle penicilline
come Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila.
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Diagnosi di polmoniti
Per quanto concerne la diagnosi, questa può essere svolta attraverso varie tipologie di esami:
• Ricerca di materiale genetico tramite PCR: questa tecnica viene utilizzata partendo da campioni
biologici ottenuti attraverso aspirati bronchiali, bronco lavaggi, campioni bioptici, tampone
nasofaringeo, campioni salivari e campioni fecali. Per lo svolgimento della PCR c’è un codice colore
per indicare l’urgenza del risultato: viola entro 4h, rosso entro 24h e verde entro 48h.
• Ricerca dell’antigene tramite test rapido: viene utilizzato un campione ottenuto con tampone
nasofaringeo. Andando ad analizzare il processo passo-passo si ha che:
o viene svolto un tampone nasofaringeo;
o il materiale viene messo in una provetta nella quale è presente una soluzione lisante che ha
enzimi che degradano e sciolgono la membrana lipidica dei virus in modo da mostrare meglio
gli antigeni;
o si ottiene una soluzione in cui saranno presenti gli antigeni;
o infine, la soluzione ottenuta dalla provetta è posta sul test rapido che in 15-20 min mostrerà
l’esito: barra di controllo e seconda barra allora è positivo, solo barra di controllo il test è
negativo. Il test è invalido se non ho la barra di controllo e va ripetuto.
• Test rapido di ricerca anticorpale: viene fatto con un pungi-dito, il sangue viene posto su una card
che mostrerà una eventuale positività in circa 10 minuti. Si otterrà una barra di controllo, una barra
per l’eventuale presenza di IgM e una per l’eventuale presenza di IgG (possono comparire entrambe
o solo una). Nel caso in cui sia assente la barra di controllo, analogamente a quanto detto prima, il
test è considerato invalido e di conseguenza è necessario ripeterlo.
• Test sierologico: viene svolto attraverso un prelievo di sangue venoso nel quale, il materiale è posto
in una piastra con 96 pozzetti contenenti antigeni specifici, quindi, successivamente, attraverso dei
test immunoenzimatici e di immunofluorescenza, vengono ricercate IgM e IgG.
I test rapidi hanno una grande efficacia per via della loro velocità e in quanto non vanno a gravare sull’attività
dei laboratorî. Tuttavia, questi risultano essere meno affidabili e accurati dei test svolti a livello laboratoristico
e di conseguenza spesso, soprattutto nei casi in cui la sintomatologia risulta essere più grave, il test viene
ripetuto. Comunque, lo svolgimento dei test rapidi funge da filtro che è necessario per non sovraccaricare di
lavoro i laboratorî.
Gli esami sopracitati differiscono per efficacia e invasività, infatti non tutte le condizioni cliniche permettono
di svolgere determinati tipi di prelievo.
Per esempio, il prelievo dell’espettorato prevede la raccolta del materiale dopo un colpo di tosse, ma il
paziente può, erroneamente, riempire il barattolo sterile con saliva, rendendo il materiale non idoneo per
una diagnosi di polmonite; per tale motivo è fondamentale che il laboratorio analizzi il materiale con blu di
metilene al microscopio per distinguere la saliva dall’espettorato.
Inoltre, in caso di espettorato positivo per pneumococco, essendo quest’ultimo un colonizzatore delle alte
vie aeree, risulta complicato capire se sia effettivamente la causa dell’infezione o solo presente nel prelievo
per una contaminazione da colonizzazione. Per distinguere la colonizzazione dall’infezione è necessario che
il laboratorio faccia una conta semiquantitativa della carica batterica.
Tutte queste problematiche si verificano solo se si utilizza come modalità di prelievo l’espettorato o l’aspirato
tracheale/bronchiale: svolgendo un lavaggio bronco-alveolare, che d’altro canto è più invasivo e pericoloso
per alcune categorie di pazienti (es. pazienti ematologici), il materiale in esame ha sicuramente un rischio
minore di contaminazione da colonizzazione.
Con l’esame colturale semiquantitativo è possibile distinguere una colonizzazione da un’infezione,
soprattutto in esami che si basano su prelievi dell’espettorato. Solitamente gli agenti eziologici delle
polmoniti sono presenti in alte concentrazioni all’interno delle secrezioni respiratorie, minimo 105 UFC/mL,
mentre le concentrazioni di microrganismi colonizzanti delle vie aeree non superano 104 UFC/mL.
Se dall’analisi dell’espettorato di un paziente con polmonite risultano presenti 4 microrganismi diversi, di cui
tre concentrati fra 102-103 UFC/mL e uno concentrato 106 UFC/mL, si può dire con certezza che l’ultimo dei
quattro sia l’agente eziologico della polmonite in corso.
32
Naturalmente bisogna porre attenzione a non trattare univocamente dati provenienti da analisi differenti: la
PCR, essendo molto più sensibile, darà valori di concentrazione UFC/mL molto maggiori rispetto al test
colturale, proprio perché è tutto in proporzione al tipo di analisi effettuata (105 UFC/mL in coltura
corrispondono a circa 109 UFC/mL in PCR).
Campioni prelevabili
Questi campioni possono essere utilizzati non solo per fare diagnosi di infezione polmonare batterica, ma
anche fungina e virale:
• Espettorato (anche indotto, tramite utilizzo di aerosol di fisiologica) à si richiedono al pz colpi di
tosse profondi, così da raccogliere materiale delle basse vie respiratorie. Il materiale è buono per
successive indagini microbiologiche, ma richiede una valutazione per verificare che sia idoneo per
coltivare i batteri; questa valutazione viene fatta tramite esame microscopico (vedi dopo).
• Aspirato naso-faringeo à prelievo sempre delle basse vie respiratorie, ma leggermente più alto,
usato generalmente nei bambini, per la ricerca della Bordetella pertussis o infezioni di tipo virale. Si
utilizza un pannello che comprende batterî come le Bordetellae pertussis e parapertussis, Chlamydia
e Mycoplasma pneumoniae; poi ci sono tutti gli agenti virali: i quattro Coronavirus che danno infezioni
più lievi, rispetto al SARS-COV-2, perché si fermano a livello dei bronchi e sono transitorie.
• Aspirato tracheale e bronchiale à utilizzati dei sondini per aspirare il materiale in punti più profondi
rispetto al naso-faringeo (si arriva alla trachea e ai bronchi);
• Lavaggio bronco-alveolare (BAL) à è il prelievo più invasivo ma più efficace per quanto riguarda la
raccolta di materiali delle basse vie respiratorie;
• Spazzolatura endobronchiale à usato un citobrush, che spazzola la mucosa endobronchiale per
isolare batterî che creano un biofilm o quando c’è un muco abbondante come nei pazienti affetti da
fibrosi cistica. È una tecnica scarsamente impiegata, ma che in alcuni casi può essere molto efficace.
Il muco viene poi fluidificato con ditiotreitolo (che fluidifica i polisaccaridi facenti parte del muco e libera i
batterî che qui rimangono imbrigliati), così da aumentare la performance diagnostica.
Per valutare l’idoneità dell’espettorato (ad alto rischio di contaminazione salivare) si fa uno striscio colorato
con blu di metilene e l’espettorato viene considerato idoneo se
ricco di polimorfonucleati (come mostrato nell’immagine a lato).
Se, al contrario, sono presenti molte cellule epiteliali di tipo
squamoso, che rivestono la mucosa orale (rapporto
citoplasma/nucleo alto: citoplasma abbondante e nucleo piccolo
al centro della cellula), allora vuol dire che sono presenti molte
cellule di desquamazione e magari anche pochi
polimorfonucleati, questo vuol dire che il campione non è
idoneo, perché si tratterà per lo più di saliva.
Importante è considerare il rapporto tra globuli bianchi e cellule
epiteliali della mucosa orale:
• se il rapporto è intorno al 3:1, allora l’espettorato è idoneo;
• se è minore o uguale a 2 il campione non è considerato idoneo e si richiede un ulteriore
campionamento.
Questa valutazione è importante per evitare di dare in un referto dei falsi-negativi: negatività non perché
non c’è patologia, ma magari perché il prelievo non è avvenuto nella maniera corretta.
Principali piastre per semina di materiali biologici

• Agar sale-mannite (immagine in alto a sx) à si presenta con colonie batteriche gialle. È, infatti,
selettivo per la crescita di stafilococchi: contiene mannitolo, zucchero fermentato dallo
Staphylococcus aureus. Quando avviene la fermentazione, si ha la produzione di acidi che portano
ad un abbassamento del pH e viraggio del colore da arancione a giallo;
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• Agar herellea (alto a dx) à selettivo per inibire la crescita dei Gram+. È un terreno che in base alla
fermentazione del lattosio fa virare il colore dal violetto al giallo.
o Le Enterobatteriacee (E. coli, Klebsiella pneumoniae), fermentando il lattosio, si presentano
in colonie che virano verso il giallo
o I batteri che non fermentano il lattosio (come Pseudomonas) invece prendono colorazione
bianca o violetta.
Nell’immagine è presente la Klebsiella, che
si distingue per la produzione di una
capsula che dà un aspetto mucoso.
• Agar sangue (basso a dx) à terreno non
selettivo, sul quale crescono tutti i tipi di
batterî, tranne i più selettivi, come
Hemofilus influenzae. Quest’ultimo può
crescere su terreni arricchiti con agar
cioccolato.
• Agar cioccolato (basso a sx) à arricchito
con fattori V e X per la crescita degli
emofili. Contiene anche agenti selettivi per
garantire la crescita degli emofili rispetto
ad altri bacilli Gram–.
Parallelamente a queste piastre selettive e non
selettive, ci sono terreni per la crescita dei lieviti. Questi si vedono anche su agar sangue, ma è più semplice
individuarli se vengono usati terreni di Chrome-candida, cromogeni, con reagenti incorporati che fanno virare
il colore a verde, blu, rosa, bianco. A seconda del colore che assumono danno indicazioni sulla specie presente
nel tratto respiratorio.
• La colorazione verde è tipica della Candida albicans;
• le colonie blu sono tipiche della Candida tropicalis.
Quelle che risultano bianche o violetto-rosa, vengono poi sottoposte a spettrometria di massa Maldi-Toff per
riconoscere la specie esatta. Glabrata, Krusei e Parapsilosis sono le più comuni nelle colonie che risultano
rosa-bianche (all’occhio esperto la lucentezza e le varie tonalità di rosa già permettono di distinguere le varie
specie).
Oltre alle piastre, un’ulteriore semina viene fatta su un terreno che favorisca la crescita dei funghi filamentosi
e dei lieviti. Il terreno è SAB-CAF (Sabouraud-CAF), specifico per inibire la crescita dei batterî e selezionare
quella di lieviti e funghi filamentosi. È un terreno solidificato a becco di clarino per aumentare la superficie
di semina ed è a chiusura stagna, che facilita i tempi prolungati di incubazione perché impedisce la
disidratazione del terreno. Essendo i funghi filamentosi normali contaminanti ambientali ed essendo presenti
nell’ambiente molte spore fungine, è facile contaminare una piastra quando la si apre per l’osservazione: per
questo le provette si aprono solo sotto cappa a flusso laminare, garantendo l’isolamento del fungo
filamentoso e permettendo l’identificazione
dell’agente realmente presente nelle vie aeree.
L’immagine rappresenta una coltura di

Aspergillus niger, che non è il principale fungo
filamentoso del tratto respiratorio (è il
fungatus), ma è il principale agente eziologico
per le otiti medie.
Carica batterica
È importante per valutare il ruolo patogeno di un
microorganismo isolato da materiale patologico.
Nel tratto respiratorio è presente un microbiota alveolare e contaminanti del cavo orale che possono
contaminare il prelievo del tratto respiratorio.
34
• Se la carica batterica è >

105 UFC/mL à questo
valore indica che la
carica è alta e siamo in
presenza di un
patogeno;
• se la carica è < di 104
UCF/mL à la carica è
bassa e quindi il
batterio che si sta
studiando non è in
realtà presente a livello
patologico nelle basse
vie respiratorie,
probabilmente è un
contaminante.
UFC sta per unità formanti
colonie. La carica in una piastra
è importante per valutare il
carico generale.
Per quantificare la crescita, si
fanno delle semine descritte nelle linee guida, deponendo il materiale patologico in punto preciso della
piastra per poi procedere con delle semine a zig- zag (5
linee avanti e 5 indietro) nel I, II e III quadrante, poi
strisciata che arrivi anche al IV. Queste forniscono quindi
una valutazione semi-quantitativa di un aspirato
bronchiale. Si analizzano i quadranti e si determinano le
unità formanti colonie come descritto in tabella. Per
esempio, se nel I quadrante sono osservabili <10 colonie,
allora la carica attribuita sarà di 103 UFC/mL e così via.
Questo è un esempio di semina a dispersione, in quanto la

carica batterica viene dispersa su tre quadranti diversi. Con
la conta di ciascun quadrante otteniamo una carica
batterica approssimativa espressa in UFC/mL.
Antibiogramma
L'antibiogramma è un esame diagnostico in vitro che consente di saggiare la sensibilità di
un microrganismo a uno o più farmaci antimicrobici.
L’interpretazione è analitica, di laboratorio, e rappresenta un buon punto di partenza per scegliere il farmaco
più adatto. A partire dall’antibiogramma è quindi necessario fare una valutazione clinica più complessa e più
ragionata per capire la terapia migliore.
Per quanto riguarda la classificazione S/I/R, S indica che il microrganismo è sensibile a un certo farmaco, R
indica invece che è resistente. La lettera I significa che il batterio non è sensibile al farmaco con dosaggi
normali, ma lo diventa se aumenta la dose o l’esposizione al farmaco stesso; quindi, è necessario un
approccio terapeutico più aggressivo.
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Esempio di antibiogramma:
Enterobacter è resistente ad amoxicillina + acido clavulanico e
sensibile a tutti gli altri farmaci. La classificazione sensibile o
resistente si valuta in base alla MIC: data questa, ci sono i break point
che indicano i valori per cui un ceppo è resistente o sensibile ad un
farmaco. Ad esempio, la Amikacina (prima riga) ha una MIC <=2. Dato
che un ceppo è sensibile se la MIC è <=8, resistente se > 16, in questo
caso il ceppo è sensibile a questo farmaco. C’è un’ulteriore classe
interpretativa, che è quella intermedia: significa né sensibile, né
resistente.
Nel caso di Haemophilus influenzae abbiamo come unica resistenza il
Sulfa/Trimeth. Tutti questi dati vengono da EUCAST, ente europeo
che si occupa della valutazione degli antibiogrammi. Si occupa di
monitorare nel tempo valori di break-point definirli in maniera
univoca e poter fare un’interpretazione il più affidabile possibile.
Test rapidi
Utili per lo screening dei pazienti che arrivano in PS. Sono effettuati su campioni di urina, quindi il prelievo è
semplice. Per quanto riguarda Streptococcus pneumoniae, questo produce antigeni che sono rilasciati nel
torrente circolatorio nel momento in cui infetta le vie respiratorie profonde e possono essere filtrati dal rene,
motivo per cui li troviamo nelle urine. Il test è sempre immunocromatografico, con banda di controllo: se c’è
positività si colorerà anche la seconda banda in prossimità del campione (sample).
Esiste un altro pannello sindromico per i pazienti con polmonite nosocomiale, che prevede più target rispetto
al pannello pediatrico: virus (meno rispetto al pannello precedente, come MERS-Cov, VRS, Adenovirus e
Coronavirus; non è presente SARS-
CoV perché da anni non dà più casi)
e batterî atipici (Mycoplasma,
Chlamydia, Legionella
pneumophila).
Altri batterî sono tutti quelli
presenti nella tabella.
Oltre a questo, sono indicati i geni
della resistenza: il CTX-M, fornisce
la resistenza alle cefalosporine di
terza generazione, quindi ceppi
resistenti alle β-lattamasi ad ampio
spettro. Ci sono poi i 5 geni di
resistenza ai carbapenemi: KPC (più
frequente), NDM, Oxa48-LIKE, VIM,
IMP (inesistente in Europa).
Fornisce quadro di infezione e
meccanismi di resistenza nel giro di
un’ora. L’esame colturale validerà
poi il test molecolare. Il pannello dà
anche la carica, batterica o virale,
solitamente più alta rispetto a quella che poi viene confermata con l’esame colturale (sovrastima di log in
base 10) perché si cerca il genoma e probabilmente è presente anche quello di microorganismi già morti a
causa del processo infiammatorio.
Altri test
Se non si usano i pannelli sindromici, ci sono altri test molecolari, eseguiti sui singoli agenti eziologici: per i
virus influenzali si fanno tamponi di ricerca dell’RNA (con PCR e retro-trascrizione del genoma virale) e ricerca
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degli antigeni virali. I virus per i quali si ricercano sia gli antigeni che il genoma sono: virus influenzali,
parainfluenzali, respiratorio sinciziale, adenovirus e coronavirus.
I test di ricerca del genoma sono anche per i batterî atipici Mycoplasma, Chlamydia e Legionella.
Hanno valore anche i test sierologici per la diagnosi (con scarsi significati per la diagnosi di polmonite
batterica) di batterî atipici (i tre sopra citati) e infezioni virali, tramite ricerca di anticorpi.
La diagnosi sierologica ha senso innanzitutto perché l’espettorato (che sarebbe il prelievo più semplice da
fare) è assente o scarsamente presente. Inoltre, tramite la diagnosi sierologica è possibile ricercare le IgM,
ovvero classe anticorpale che indica un’infezione acuta, e vengono ricercate anche le IgG, fondamentalmente
per fare una diagnosi di esclusione. In un paziente con infezione acuta da M. pneumoniae devono essere
presenti le IgM, perché le sole IgG non caratterizzano la fase acuta.
Le IgM sono poco specifiche in una risposta sierologica, pertanto nel caso in cui non siano presenti altri
metodi diagnostici bisogna aspettare la cosiddetta sieroconversione, ovvero 15 giorni dopo la comparsa del
primo referto diagnostico di IgM positive compaiono anche le IgG.
Quando, per esempio, ritroviamo la presenza di IgM contro il M. pneumoniae, vuol dire che è in corso
un’infezione acuta dovuta a quel batterio. La presenza di IgG, invece, dimostra che precedentemente c’è
stato un contatto col batterio, ma non ci troviamo più in una fase acuta.
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis è un importante agente eziologico di polmonite nei pazienti già immuno-
compromessi. Questo dà infezioni latenti nel tessuto polmonare, formando granulomi caratterizzati da
necrosi caseosa che al loro interno contengono bacilli di Koch, in stato latente e inattivato, ma vitali, con
possibilità di riattivazione e insorgenza della malattia a seguito dell’abbassamento delle difese immunitarie.
Si formano caverne e causa emottisi [n.d.s. quando si tossisce sangue], ma si può avere anche passaggio nel
sistema circolatorio e quindi formazione di granulomi anche nel tessuto osseo, renale e SNC. La riattivazione
porta alla malattia tubercolare (10% dei casi).
L’infezione primaria è caratterizzata da tosse secca, produttiva, emottisi, da febbricola, perdita di peso e
sudorazioni notturne. È una forma di polmonite subdola in quanto non determina nel paziente uno stato di
malessere tale per cui quest’ultimo pensi che sia necessario recarsi in pronto soccorso, egli non ha
un’estrinsecazione clinica preoccupante. Solitamente la febbricola serale di pochi decimi, unita alla perdita
di peso e alla sudorazione notturna sono i segni che preoccupano maggiormente il paziente, ma rimane vero
che solitamente passa del tempo prima che il paziente diventi consapevole di avere un problema.
Ciò deriva dal fatto che ad oggi la malattia tubercolare si sviluppa in modo inapparente e solitamente
l’infezione primaria si acquisisce nell’età giovanile/adulta. La situazione è, quindi, variata rispetto a 50 anni
fa, quando essa era patrimonio degli alunni delle scuole elementari. Ad oggi in generale la tubercolosi è una
malattia meno frequente e fondamentalmente è una malattia legata a situazioni di povertà e a condizioni
non ottimali di sovraffollamento, malnutrizione o ambientali.
Nell’immagine si osservano micobatteri tubercolari nel parenchima dell’organo bersaglio, il quale di fatto è
il polmone, ma parlare solo di polmone è riduttivo.
Il 90/95% dei pazienti che hanno sviluppato l’infezione primaria, passano poi all’infezione tubercolare latente
(LTBI), stadio in cui il soggetto che ha risolto clinicamente il complesso primario tubercolare, si trova con una
presenza di Mycobacteria vitali in zone all’interno del granuloma, ma senza avere alcun sintomo. Non si può
parlare di infezione cronica poiché non è un’infezione progressiva che sta producendo dei sintomi, ma è
latente, la situazione finché risulta possibile rimane “congelata”.
Nel 10% dei casi dalla fase di latenza avviene una riattivazione che porta alla malattia tubercolare vera e
propria. Quest’ultima avrà una situazione di coinvolgimento di più organi bersaglio, di più apparati, più
evolutiva. Le cause di riattivazione sono molteplici. Tra esse sicuramente c’è uno stato di malnutrizione e di
deperimento organico.
Esiste un serbatoio di infezione, costituito dai soggetti con un’infezione latente, che può riesplodere e dare
una forma attiva.
37
Diagnosi
La diagnostica è molto diversa nell’infezione
primaria rispetto all’infezione latente.
Nella forma di tubercolosi attiva, sia primaria sia
non primaria, quindi anche in una riattivazione, il
soggetto è malato, presenta dei sintomi, i quali
portano alla necessità di diagnosticare
rapidamente la presenza di batterî in materiali
patologici. Il materiale patologico tipico su cui
vengono eseguiti gli esami è l’espettorato (raccolto
chiedendo al paziente di emetterlo tramite lo
sputo), ma possono essere usati anche altri
materiali patologici che siano rappresentativi del
processo patologico che si vuole diagnosticare.
Nella forma di tubercolosi latente, invece, ci si
trova di fronte a un sospetto difficile da individuare
dal punto di vista clinico, poiché il soggetto tubercolare latente non presenta sintomi, sta bene. In questo
caso quindi si può procedere con l’identificazione della risposta immunitaria specifica e in questo ambito non
può essere utilizzata la risposta anticorpale, siccome essa è praticamente nulla. È necessario, pertanto,
identificare una risposta di tipo cellulo-mediata tramite test chiamati “test di ipersensibilità ritardata” come
il test della tubercolina o IGRA, i quali sono dei test che vengono eseguiti non sul paziente ma su linfociti
prelevati dal paziente e poi stimolati in vitro per osservare se c’è una risposta da IFN-γ.
Diagnosi di tubercolosi latente
Test IGRA (Interferon Gamma Release Assay)

Sono test che vengono eseguiti in laboratorio il cui concetto alla base, nonostante sia stato originariamente
applicato nell’ambito della tubercolosi, oggi viene utilizzato anche in molte altre infezioni come quelle da
Citomegalovirus o da SARS-CoV-2. È una tecnologia che presenta alcune sfumature diverse in base alla
casistica, ma il cui concetto alla base è uguale e molto semplice. La procedura, infatti, prevede che siano
prelevati linfociti dal paziente in cui vi è il sospetto di una pregressa infezione; questi vengono stimolati in
vitro, in una provetta, con antigeni specifici dell’agente patologico della malattia da identificare. Dopodiché
si osserva se questo stimolo dato in vitro ai linfociti, li induce a rispondere con la produzione di interferone
gamma. Se essi effettivamente rispondono con IFN-γ, significa che in passato essi hanno già “visto” l’antigene
che è stato usato per stimolarli, quindi significa che c’è una memoria immunitaria e quindi che c’è
un’infezione tubercolare latente.
Si capisce, allora, come il risultato di questo test dipenda da quali antigeni vengono usati per stimolare i
linfociti: se vengono utilizzati antigeni molto specifici, si può ottenere una risposta molto specifica; se
vengono utilizzati antigeni meno specifici, si può ottenere una risposta più sensibile, ma meno specifica. È
necessario, pertanto, stabilire quali siano gli antigeni corretti da utilizzare.
Ad oggi, nell’ambito della diagnosi di tubercolosi latente, esistono due tipi di test IGRA:
1) il QuantiFERON-TB Gold;
2) il T-SPOT.TB.
Essi sono equivalenti per quanto riguarda il significato del risultato clinico, ma sono diversi dal punto di vista
dell’esecuzione.
1) Nel test QuantiFERON-TB Gold si stimano i linfociti e successivamente si compie una determinazione
della reazione dell’IFN-γ anche a distanza di mesi dato che viene congelato. Può essere eseguito in
differita.
2) Con il test T-SPOT.TB si possono immediatamente identificare le cellule che stanno rispondendo con
l’IFN-γ. Non può essere eseguito in differita.
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Test della tubercolina/intradermoreazione di Mantoux/PPD (Purified Protein Derivative)

La tubercolina è un antigene purificato che viene estratto da Mycobacterium bovis e iniettato in modo
intradermico nell’avambraccio del soggetto da testare. Nel caso in cui quest’ultimo abbia già contratto il
Mycobacterium, si avrà la recluta della risposta macrofagica locale ed entro 48/72 ore si avrà la formazione
di un arrossamento cutaneo. Misurando il diametro di quest’aerea di arrossamento reattiva si potrà quindi
stabilire se il soggetto ha avuto o non ha avuto un contatto pregresso.
L’utilizzo di questo test (molto ampio fino a 15 anni fa) presenta degli aspetti problematici, dei “punti deboli”:
1) è necessario che chi esegue il test sia in grado di effettuare un’iniezione intradermica e ciò non è
scontato: se l’iniezione viene fatta nel muscolo o nel sottocute il test perde di affidabilità clinica;
2) il paziente deve ritornare a farsi “leggere”, infatti difficilmente il paziente soggetto a infezione
tubercolare latente è già in ospedale ricoverato. Un esempio di soggetti su cui viene eseguito questo
test sono gli operatori sanitarî, e anche in questo caso c’è la possibilità che l’operatore si dimentichi
di ripresentarsi.
I test IGRA, al contrario, sono vantaggiosi da questo punto di vista perché per la loro esecuzione è sufficiente
un prelievo di sangue da mandare in laboratorio. Inoltre, la specificità dei test IGRA ad oggi è molto più alta
rispetto al test della tubercolina.
Diagnosi di malattia tubercolare

La diagnosi di malattia tubercolare viene eseguita tramite l’identificazione dei Mycobacteria nei materiali
patologici. A questo scopo si utilizzano tre metodi: la microscopia, la coltura e i test molecolari. Questi metodi
non sono mutualmente esclusivi, ma devono essere eseguiti tutti e tre per ottenere il massimo di sensibilità
nell’ambito del flusso diagnostico.
Microscopia
L’esame microscopico viene effettuato solitamente tramite
la colorazione di Ziehl-Neelsen, che è la più classica. Essa
mette in evidenza una caratteristica tintoriale dei
Mycobacteria che è l’alcol-acido resistenza (questa
caratteristica è comune a tutti i Mycobacteria, non
identifica solo il Mycobacterium tuberculosis). I micobatterî,
infatti, sono resistenti alla decolorazione con alcol o acidi
(BAAR), quindi, in questa procedura, una volta che è stato
utilizzato il primo colorante, rosso, essi resteranno
effettivamente di colore rosso. Un’altra colorazione
utilizzata è l’acridina.
Nell’immagine si osserva l’esame microscopico con la
colorazione di Ziehl-Neelsen: i bacilli rossi sono i
Mycobacteria.
Coltura
L’esame colturale può essere eseguito sia su terreno solido, Lowenstein-Jensen, sia su terreno liquido. In
questo caso terreni solidi e liquidi sono altrettanto fondamentali. L’importanza del terreno solido, infatti, sta
nella possibilità di osservare lo sviluppo delle colonie e la loro morfologia, quindi permette a un occhio
esperto, con approssimazione, di stabilire se si è davanti a un Mycobacterium tuberculosis o davanti a un
micobatterio non tubercolare. Il terreno liquido è altrettanto fondamentale e assume particolare importanza
a fronte di un difetto del terreno solido, per il quale se la contaminazione da germi non tubercolari è molto
alta, il terreno che era solido tende a liquefarsi proprio per l’attività del germe contaminante.
L’approccio colturale per la diagnosi del Mycobacterium tuberculosis ha come svantaggio la lenta crescita di
quest’ultimo. Prima di dichiarare negativa una coltura per il Mycobacterium tuberculosis, infatti, è necessario
aspettare almeno 6 settimane, 42 giorni. Vale un discorso diverso per i micobatterî non tubercolari, i quali si
dividono in due gruppi: quelli a rapida crescita (48/72 ore) e quelli a lenta crescita (6 settimane, 42 giorni,
come il M. tuberculosis).
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Il problema relativo a queste tempistiche è che in presenza di un paziente sospetto per la malattia
tubercolare, aspettare 42 giorni espone al rischio di diffusione dell’infezione e dal punto di vista
epidemiologico la probabilità che ciò succeda è consistente.
Inoltre, è da considerare che la tubercolosi polmonare può essere suddivisa, dal punto di vista nosografico,
in forme aperte e forme chiuse. Nelle forme chiuse è presente il tubercolo che cresce, ma siccome esso non
si apre su vie aeree, il soggetto tossisce senza diffondere l’infezione. Nelle forme aperte, invece, il tubercolo
aggetta su una via aerea; quindi, con la tosse il soggetto espelle batterî e perciò è altamente infettante. Per
questi motivi aspettare è un rischio. Inoltre, una rapida diagnosi è utile anche per formulare una terapia
specifica.
La coltura è deludente come approccio perché, anche in terreni arricchiti ad esempio con vitamine, si sta
trattando di batterî a lenta crescita. In realtà è da specificare che nelle forme aperte con una carica batterica
molto consistente la positività emerge anche dopo due settimane. Il problema si presenta nel caso di
negatività, in cui per arrivare al definitivo, certo, negativo, è necessario aspettare 6 settimane.
Metodi molecolari
I metodi molecolari sono fondamentali:
1) hanno la capacità di identificare il M. tuberculosis rispetto ad altri micobatterî non tubercolari;
2) ad oggi hanno tutti la capacità di identificare la presenza di situazioni generiche connesse
all’antibiotico-resistenza. La resistenza che ormai da anni viene determinata è quella da rifampicina,
ma oggi ci sono sistemi diagnostici che associano questa, alla resistenza contro la streptomicina e
l’isoniazide. Grazie ai test molecolari, quindi, abbiamo a disposizione una sorta di antibiogramma
molecolare che può essere molto utile nell’immediato per capire se il batterio è resistente.
I metodi molecolari ad oggi sono quelli di riferimento poiché presentano varî vantaggi, come la facilità e la
velocità di esecuzione, entro poco più di un’ora dall’arrivo del campione in laboratorio si hanno già delle
informazioni. La tecnologia chiamata GeneXpert è stata definita dall’Organizzazione Mondiale della Sanità
(OMS) il riferimento per la diagnosi di tubercolosi nei paesi in via di sviluppo. L’azienda americana creatrice
di GeneXpert ha ricevuto il consenso dall’OMS per propagare il proprio sistema nei paesi in via di sviluppo,
soprattutto in Sudafrica, nazione dove la tubercolosi ha un’enorme diffusione, ma che tramite l’impiego
costante di questa metodologia, oggi sta raggiungendo una situazione controllata della diffusione della
malattia. L’impiego di queste metodiche ha il limite di avere alti costi. A questo proposito è stata ridotta
l’incidenza di tubercolosi in modo consistente anche grazie a programmi di supporto.
In generale per quanto riguarda i costi dei varî metodi diagnostici la microscopia non ha un effettivo costo,
necessita semplicemente di un addetto in grado di preparare il vetrino e di leggerlo; la coltura costa poco
(pochi euro); ogni test molecolare costa all’incirca 50 euro, quindi, è evidente come sia problematico adottare
questo metodo, soprattutto in alcuni paesi.
Questi tre metodi diagnostici, dalla microscopia alla PCR, hanno sensibilità diverse. La microscopia è il
metodo che ha sensibilità inferiore. L’esame colturale ha una sensibilità maggiore perché anche in presenza
di pochi batterî, essi comunque possono crescere ed essere osservati. La PCR è il metodo più sensibile in
assoluto, ad oggi questo metodo molecolare è ultrasensibile e in grado di rilevare anche piccole “tracce” di
DNA del batterio.
È sempre importante contestualizzare l’utilizzo di questi test diagnostici nell’ambito della situazione clinica
del paziente. Nel caso di un paziente in cui è la prima ipotesi diagnostica, il primo sospetto di malattia, si
esegue tutto il flusso diagnostico e, se nei test ultrasensibili molecolari si ha un risultato positivo, si può
procedere con la diagnosi perché c’era già un’ipotesi iniziale, il paziente non ha subito un trattamento, ha un
quadro clinico coerente, il rischio epidemiologico è coerente, la coltura ha tempistiche troppo lunghe, perciò,
è possibile basarsi sul test molecolare e iniziare la terapia. Nel caso in cui, invece, il paziente non è una prima
ipotesi diagnostica, ma si tratta di un paziente già in trattamento da 3 o 4 mesi, il cui quadro clinico è di totale
risoluzione della malattia, la microscopia, ad esempio, diventa significativa perché i test molecolari
rimangono positivi anche a guarigione avvenuta e possono far sorgere dubbî nel verificare l’efficacia della
terapia e quindi nel verificare l’effettiva guarigione.
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Bisogna sempre porre l’attenzione su cosa si vuole diagnosticare, su cosa si sta cercando, richiedendo certi
esami, altrimenti nel caso del paziente già in trattamento, con un test molecolare che risulta positivo,
potrebbe sorgere il dubbio che la terapia non stia funzionando anche dopo mesi di trattamento e si
potrebbero commettere errori.
È necessario sottolineare alcuni aspetti per concludere la trattazione della tubercolosi:

1) ad oggi la tubercolosi non è assolutamente scomparsa;
2) la tubercolosi non è una malattia legata alla presenza di immigrati. Sicuramente si tratta di una malattia
che affligge molte persone immigrate in quanto correlata a situazioni di povertà, ma i flussi migratori non
ne hanno aumentato l’incidenza;
3) nell’ambito della tubercolosi esistono problemi di resistenza ai farmaci. I germi tubercolari sono
classificati in:
a) sensibili;
b) MDR, se sono resistenti ad almeno due farmaci;
c) XDR, se sono resistenti a più di tre farmaci;
d) completamente resistenti.
In Italia i casi in cui il germe è completamente resistente sono pochi, iniziano però ad esserci problemi con i
germi MDR e XDR.
Legionella pneumophila
È un batterio Gram– asporigeno, dotato di flagello polare e parassita endocellulare facoltativo. Tutte le specie
di Legionella sono batterî ambientali che ritroviamo negli ambienti naturali e artificiali. Spesso si ritrovano a
livello di reti idriche contaminate e in serbatoi di acqua ad alta temperatura (è un batterio termofilo).
Non è stata dimostrata trasmissione interumana, ma l’infezione avviene esclusivamente tramite via
respiratoria per inalazione di aerosol infetto proveniente da ambienti acquatici contaminati, sia naturali che
artificiali. In questi ambienti si può trovare libero o associato in biofilm, necessita però di infettare altre cellule
per potersi riprodurre e in ambiente acquatico queste sono rappresentate principalmente da diverse specie
di amebe (protozoi); nell’organismo umano invece, una volta infettato si ritrova nei macrofagi alveolari.
Esistono 61 specie di Legionella. Legionella pneumophila è la specie più frequentemente rilevata nell’uomo
ed è costituita da 16 sierogruppi. Il sierogruppo 1 causa il 95% delle infezioni in Europa e l’85% nel mondo.
Anche in Italia l’analisi della distribuzione di specie e sierogruppi ha confermato la prevalenza di Legionella
pneumophila sierogruppo 1.
Dal punto di vista diagnostico, la sensibilità e specificità dei metodi diagnostici per L. pneumophila
sierogruppo 1 sono abbastanza elevate mentre sono inferiori per gli altri sierogruppi di L. pneumophila o per
altre specie di Legionella.
Diagnosi
Dal punto di vista diagnostico la L. pneumophila risulta problematica in quanto non sono presenti i sintomi
della classica polmonite di comunità (tosse produttiva di espettorato, dolore toracico, brividi, febbre e
respiro affannoso), ma semplicemente una leggera febbriciattola e astenia.
La sensibilità e la specificità degli esami diagnostici per L. pneumophila sierogruppo 1 sono abbastanza
elevate, mentre sono inferiori per gli altri sierogruppi o per altre specie di legionella.
I saggi diagnostici correttamente utilizzati sono:
- esame colturale;
- rilevazione di anticorpi (IgG e IgM) su sieri nella fase acuta e convalescente della malattia;
- rilevazione dell’antigene urinario;
- rilevazione del DNA batterico mediante PCR.
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Il terreno selettivo per legionella si chiama

B.C.Y.E. ed è molto selettivo. Quindi è
possibile coltivare la Legionella, ma questa
ricerca dev’essere richiesta esplicitamente
al laboratorio. Infatti, la Legionella non fa
parte del normale processo diagnostico in
caso di polmoniti in quanto la sua incidenza
è circa dello 0.5%.
La coltura dev’essere fatta in ambiente
umido, microaerofilo e a 36°C.
L’antigene urinario è un antigene proteico

e solubile nelle urine (antigenuria), la cui
presenza è rilevabile nella maggior parte
dei pazienti da uno a tre giorni dopo
l’insorgenza dei sintomi, dura dai 10 ai 15
giorni, con un picco a 5-10 giorni; tuttavia,
può persistere per settimane o mesi in
pazienti anziani o immunocompromessi.
In un paziente in fase acuta, la presenza
dell’antigene è un’indicazione diagnostica
abbastanza affidabile. È comunque
importante ricordare che tardivamente
l’antigene può continuare a risultare positivo nonostante il paziente sia guarito completamente dalla
polmonite. L’interpretazione clinica da parte del medico rimane quindi fondamentale.
Il test è di tipo immunocromatografico: è presente una striscia di cellulosa dove sono deposti degli anticorpi
anti-antigene della Legionella. Se nelle urine è presente l’antigene della Legionella, gli anticorpi si legano e si
forma una striscia rossa a livello della scritta “sample” e una a livello della scritta “control”.
Gli ospedali sono la fonte principale di contagio da legionellosi a causa, ad esempio, di impianti di acqua calda
vecchi o di impianti di condizionamento dove la condensa non è drenata bene. Ogni paziente, anche solo
lontanamente sospettabile di legionellosi, viene esaminato subito, perché se il test viene fatto dopo 48h dal
ricovero in ospedale e risulta positivo, allora l’infezione è di tipo nosocomiale e l’ospedale deve assumersene
la responsabilità. Solo in Emilia-Romagna vengono fatti circa 13000 test ogni anno in coniugazione con
l’antigene da pneumococco urinario, nonostante i casi positivi per la legionellosi siano alla fine molto ridotti.
Questo test viene quindi effettuato principalmente con uno scopo medico-legale.
Terapia
• Il farmaco deve penetrare nei macrofagi.
• Non sono efficaci i β-lattamici e gli aminoglicosidi (amikacina e gentamicina, 30S).
• Sono efficaci i macrolidi (eritromicina, 50S), tetraciclina e chinoloni.
Il monitoraggio ambientale è estremamente importante: nei grossi impianti con acqua calda e condense
dev’essere verificata l’assenza di colonizzazione. Nei servizî sanitarî, inoltre, vanno messi filtri 022 che
impediscano il passaggio di batteri proprio per evitare che la Legionella colonizzi.
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SARS-CoV-2
I Coronavirus sono dei virus a RNA (quindi presentano una buona variabilità genetica) dotati di un involucro
pericapsidico e presentanti delle spicole, dette anche spikes o proteine S, che formano una “corona” da cui
deriva il nome del genere.
Per i Coronavirus è fondamentale il concetto dello spillover: con questo termine si intende il passaggio del
virus da una specie animale all’uomo e l’eventuale successiva circolazione interumana dello stesso che si
verifica se presenti i recettori adatti (per il SARS-CoV-2 sono i recettori ACE2). Lo spillover sta alla base della
nascita dell’attuale pandemia ed è favorito dallo stretto contatto tra uomo e animali selvatici.
Ad oggi si conoscono in totale sette diversi Coronavirus:
1. Human Coronavirus 229E;
2. Human Coronavirus OC43;
3. Human Coronavirus NL63;
4. Human Coronavirus HKU1;
5. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV): oggigiorno non si registrano più casi.
Questo fu identificato per la prima volta nel 2003 in Cina, portò alla morte di 650 persone e si pensa
sia stato veicolato da pipistrelli e zibetti;
6. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV2): agente eziologico della pandemia in
corso;
7. Sindrome Respiratoria mediorientale da Coronavirus (MERS-CoV): vi è ancora qualche caso sporadico
che interessa solamente il medio-oriente. Fu identificato per la prima volta nel 2012 in Arabia
Saudita, portò al decesso di 800 persone ed è stato veicolato dai dromedarî.
I primi quattro sono dei Coronavirus che determinano delle infezioni con sintomatologia lieve che interessa
le alte vie respiratorie o al massimo i bronchi, sono di scarso significato patogeno per l’uomo. Gli ultimi tre
Coronavirus invece hanno una importanza patologica molto maggiore in quanto determinano l’insorgenza di
polmoniti interstiziali, in più questi hanno delle caratteristiche in comune in quanto appartengono tutti alla
classe dei β-coronavirus.
Analizziamo più nel dettaglio il SARS-Cov2. Questo virus, come già detto, è l’agente eziologico della pandemia
in corso e fu identificato per la prima volta a Wuhan nel 2019. Il veicolo non è ancora stato identificato anche
se l’infezione partì dal mercato di Wuhan dove erano presenti varî animali e frutti di mare (si pensa siano
interessati i pipistrelli).
Il SARS-CoV-2 analogamente a tutti gli altri Coronavirus è un virus a RNA a singolo filamento con polarità
positiva che tuttavia non presenta una elevata variabilità. Il genoma del virus codifica sia per proteine
strutturali, tra cui le proteine S, che per proteine non strutturali. Il recettore a cui le proteine S si legano è il
recettore ACE2 presente a livello della mucosa respiratoria ma anche a livello intestinale. Il periodo di
incubazione del virus è mediamente di 5-6 giorni, anche se il tempo massimo di incubazione può raggiungere
le 2 settimane.
Il Covid-19 è a tutti gli effetti una polmonite, infatti il primo sintomo, oltre alla generica febbre, è quella che
viene detta desaturazione felice: il paziente sta male ma non se ne rende conto. La desaturazione è
compensata, finché improvvisamente giungono difficoltà respiratorie molto severe.
Essendo una polmonite, il virus va ricercato nel materiale rappresentativo del processo patologico, ossia le
secrezioni delle alte vie respiratorie (è lì che il virus entra e si replica prima di procedere verso le vie inferiori).
I primi casi avuti a febbraio 2020 fecero preoccupare perché, seguendoli giorno per giorno, in giornata molti
apparentemente non avevano più il virus. Il motivo era che erano intubati e desaturati, per questo il virus si
andava a riscontrare giù in fondo alle vie respiratorie.
La diagnostica, quindi, è sempre stata un cardine sulle alte vie respiratorie.
Il virus, il suo materiale genetico e/o i suoi antigeni, può essere trovato a livello di:
• alte vie respiratorie, quindi in tutte le secrezioni respiratorie;
• nelle feci e negli “swabs” (tamponi) rettali in quanto sono presenti recettori ACE2 a livello intestinale
(specialmente se la sintomatologia comprende diarrea). Nel materiale fecale le componenti
43
antigeniche perdurano per tempi maggiori rispetto a quanto queste non lo facciano a livello della
mucosa respiratoria;
• in alcuni soggetti è possibile trovare il materiale genetico virale a livello ematico (questo è associabile
a una infezione particolarmente severa);
• lo si può trovare in alcuni fluidi corporei come i fluidi oculari, anche in assenza di congiuntivite, e nel
fluido cerebrospinale;
• nei campioni respiratorî delle basse vie aeree come il lavaggio bronco-alveolare.
In questa immagine è possibile osservare come in campioni diversi è possibile trovare antigeni per tempi
diversi (“stool PCR”, la curva gialla indica le feci) e anche la comparsa anticorpale. È importante sottolineare
che le componenti virali sono osservabili anche 3-4 giorni prima della manifestazione sintomatica.
A sinistra della linea tratteggiata ci sono le settimane che precedono l’evidenza sintomatologica: il paziente
è infetto ed infettante, ma non è malato. Bisogna sottolineare la differenza tra infezione e malattia: non è
malato perché non ha sintomi. Cercando di capire quando applicare la determinazione molecolare, essa sarà
probabilmente negativa perché la quantità di virus, rappresentata dalla linea rossa, è decisamente bassa
nella prima settimana dall’esposizione, mentre comincia ad aumentare nella seconda.
A tre settimane/20 giorni la PCR è al massimo delle sue possibilità diagnostiche, in quanto il virus compare.
La PCR rimarrà attiva per 3 settimane e dopo questo periodo si potrà determinare la risposta anticorpale
specifica. La PCR su tampone naso faringeo è rappresentata dalla curva azzurra; cala e tende a zero dopo
tre/quattro settimane. Questa indica la possibilità di isolare agevolmente il virus dal tratto respiratorio, in
quanto in esso il virus si replica. Utilizzando il lavaggio bronco alveolare, il soggetto rimane positivo più a
lungo perché il materiale è più ricco di virus nella fase finale.
La curva gialla indica la positività sulle
feci e il fatto che il virus viene
eliminato per molto tempo. Infatti,
andando ad attuare una
determinazione ambientale del virus
nelle acque reflue si può avere un’idea
di quanto virus stia circolando.
Tuttavia, ciò non ha nessuna rilevanza
diagnostica, poiché non si tratta di
un’infezione gastroenterica. Per
quanto riguarda le IgM e le IgG esse
presentano una particolarità: le linee
tratteggiate escono insieme. In una
fase PCR positiva si hanno già gli
anticorpi, questo è molto utile.
44
Diffusione
Il numero dei casi continua a crescere, nonostante sia ragionevolmente calato il tasso di crescita. Il virus è
diffuso in tutto il mondo: America, Europa, Asia pacifica, Africa. Importante è focalizzarsi sul caso dell’Africa
in cui la stima che viene fatta oggi del numero di casi è di circa 100 milioni di casi al giorno.
Il record riportato è basato su ciò che sappiamo: gli altri continenti riportano, mentre l’Africa no. Il problema
è che si sa cosa sta circolando ma non come, quando, dove.
Di conseguenza l’Africa rappresenta un serbatoio di virus molto grande di cui nessuno ufficialmente si cura
e che si dovrebbe mettere in sicurezza. Il problema è che buona parte dell’Africa ha una spesa sanitaria pro
capite per anno che è la metà del costo di una dose di vaccino. In più buona parte dei vaccini che sono in
circolazione utilizzano la catena del freddo: i vaccini non riuscirebbero neanche ad arrivare in una capitale
dell’Africa, naturalmente in base al Paese, in quanto potrebbe esserci mancanza di energia elettrica. Per
esempio, con Pfizer in Africa si farebbe poco, in quanto esso deve essere tenuto a -20°/-80°.
Per questo si dovrebbero trovare altre soluzioni; sarebbe già meglio utilizzare un vecchio vaccino a virus
ucciso liofilizzato, conterebbe poco ma almeno farebbe un minimo, almeno ci potrebbe arrivare.
Trasmissione
Per quanto riguarda la trasmissione è bene ricordare la differenza tra droplets e aerosol.
I droplets sono più grossi, contengono più virus, e proprio perché sono più grossi cascano più rapidamente e
potenzialmente contaminano le superfici.
L’aerosol è più piccolo, permane in sospensione per più tempo e ha una carica virale inferiore.
All’inizio ci sono state paranoie sulla presenza del virus su oggetti, sulle maniglie delle porte. A questo
proposito la sopravvivenza del virus è sicuramente possibile nell’ambiente ma non così a lungo. Anche per
quanto riguarda la trasmissione oro-fecale, essa non avviene.
45
Fondamentale il concetto dell’interazione tra le proteine spike e ACE2.
Sintomi e fattori di rischio
Per il Covid-19 non esiste una categorizzazione del rischio assoluta: è chiaro che se un paziente ha più di 65
anni, presenta una broncopneumopatia cronica ostruttiva, insufficienza renale, è iperteso, avrà una
situazione peggiore dal punto di vista prognostico. Occorre notare che alla fine è la stessa categoria di
pazienti (circa 70mila) che muore di influenza in Europa. Quindi, queste forme respiratorie si aggravano sui
quadri di patologie intercorrenti.
Diagnosi
Per quanto concerne la diagnosi questa può essere svolta attraverso varie tipologie di esami:
• Ricerca di materiale genetico tramite PCR: questa tecnica viene utilizzata partendo da campioni
biologici ottenuti attraverso aspirati bronchiali, bronco lavaggi, campioni bioptici, tampone
nasofaringeo, campioni salivari e campioni fecali. Per lo svolgimento della PCR c’è un codice colore
per indicare l’urgenza del risultato: viola entro 4h, rosso entro 24h e verde entro 48h;
• Ricerca dell’antigene tramite test rapido: viene utilizzato un campione ottenuto con tampone
nasofaringeo. Andando ad analizzare il processo passo-passo si ha che:
o viene svolto un tampone nasofaringeo;
o il materiale viene messo in una provetta nella quale è presente una soluzione lisante che ha
enzimi che degradano e sciolgono la membrana lipidica dei virus in modo da mostrare meglio
gli antigeni;
o si ottiene una soluzione in cui saranno presenti gli antigeni;
46
o infine, la soluzione ottenuta dalla provetta è posta sul test rapido che in 15-20 min mostrerà
l’esito: barra di controllo e seconda barra allora è positivo, solo barra di controllo il test è
negativo. Il test è invalido se non ho la barra di controllo e va ripetuto.
• Test rapido di ricerca anticorpale: viene fatto con un pungi-dito, il sangue viene posto su una card
che mostrerà un’eventuale positività in circa 10 minuti. Si otterrà una barra di controllo, una barra
per l’eventuale presenza di IgM e una per l’eventuale presenza di IgG (possono comparire entrambe
o solo una). Nel caso in cui sia assente la barra di controllo, analogamente a quanto detto prima, il
test è considerato invalido e di conseguenza è necessario ripeterlo;
• Test sierologico: viene svolto attraverso un prelievo di sangue venoso nel quale il materiale è posto
in una piastra con 96 pozzetti contenenti antigeni specifici, quindi, successivamente, attraverso dei
test immunoenzimatici e di immunofluorescenza, vengono ricercate IgM e IgG.
I test rapidi hanno una grande efficacia per via della loro velocità e in quanto non vanno a gravare sull’attività
dei laboratorî. Tuttavia, questi risultano essere meno affidabili e accurati dei test svolti a livello laboratoristico
e di conseguenza spesso, soprattutto nei casi in cui la sintomatologia risulta essere più grave, il test viene
ripetuto. Comunque, lo svolgimento dei test rapidi funge da filtro che è necessario per non sovraccaricare di
lavoro i laboratorî.
Altri dati utili

L’editoriale Nature apre alla speranza che il SARS-CoV-2 diventerà endemico. Il Coronavirus come è arrivato
non andrà via, poiché la specie umana è troppo diffusa: con 7 miliardi di individui è difficile che il virus smetta
di infettare. Non può succedere da un punto di vista filogenetico. Tuttavia, l’impossibilità di eradicare il virus
non significa che il numero di morti e che l’isolamento sociale continueranno.
Bisogna trasformare la pandemia in endemia. Di virus endemici ve ne sono tanti: parainfluenza, adenovirus.
(Quando si dice di aver preso l’influenza in realtà si ha una patologia acuta delle alte vie respiratorie che
prende il nome di flu like illness, molto meno severa dell’influenza in quanto è autolimitante, dura 3-4 giorni
e presenta un lieve raffreddore.)
Lo scopo è quindi di far sì che il
coronavirus possa diventare uno
di questi, come l’OC43.
L’immunità, sia che provenga dal
vaccino sia che sia post infettiva,
dura poco. L’immunità al
Coronavirus nell’animale ha
durata molto scarsa, qualche
mese. Dal momento che
l’immunità tende a scomparire,
bisogna pensare a degli interventi
booster, è necessaria qualcosa che
blocchi e riduca la trasmissione.
Nel Regno Unito al 16 ottobre
sono 44,8 milioni le persone che
hanno completato il ciclo
vaccinale, il 66,7% della popolazione. Si raggiunge invece il 73,5% se si guarda a chi ha ricevuto almeno una
dose del siero. Numeri ben più bassi di quelli dell'Italia dove l’81,23% della popolazione over 12 è totalmente
immunizzato e l'85,58% ha almeno una dose. Tuttavia, la media dei casi giornalieri nel Regno Unito è di
35000. In Italia poco meno di 3000 casi al giorno.
Di conseguenza il raggiungimento della immunità di gregge è qualcosa di improbabile, c’è bisogno di qualcosa
che prevenga: il vaccino.
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Andando ad analizzare questi dati, si può vedere come le famose varianti siano rapide nel fare il loro mestiere.
Le prime varianti inglesi, che ora si chiamano alfa, sono comparse all’inizio di gennaio. Nella settimana del 20
aprile si è raggiunto l’80% di nuove diagnosi da alfa.
Nel secondo grafico viene rappresentato il contrario: quanti sono quelli che non sono alfa tra le nuove
diagnosi. A inizio gennaio erano il 96%, ad aprile il 5.2%. Pertanto, questo virus quando trova la variante
giusta, quindi quella con una maggiore fitness infettiva, agisce in fretta. La variante delta fa ancora prima:
impiega un mese e mezzo contro i quattro mesi dell’alfa.
Ora la delta è presente al 99.9%. Quindi, quando si trova la variante giusta il virus è micidiale, cambia lo
scenario. Per fortuna i vaccini funzionano anche contro queste varianti.
C’è una distinzione dei vaccini per quanto riguarda la loro efficacia. Quando si parla di efficacia del vaccino si
intende la capacità di prevenire la malattia severa e moderata, mentre l’efficacia sulle infezioni risulta essere
minore. Sulle infezioni ponderate questo vaccino funziona generalmente bene, al 95%, anche se qualcuno un
poco meno (es. Sinovac). Sulla malattia severa, quella che porta in ospedale e forse in terapia intensiva,
l’efficacia è ingente. Se si è vaccinati e ci si ammala, si ha meno del 5% di probabilità di avere malattia grave.
Questo funziona su tutte le varianti. Anche il Sinovac su questa arriva quasi al 90%, mentre sulle infezioni
molto meno.
Oggi come oggi il virus
continua a circolare, si
hanno decine di persone
vaccinate che si infettano.
Non si può sapere
esattamente quanti siano i
vaccinati che si infettano,
ma solo quelli che si
ammalano; tuttavia, se si
ammalano lo fanno in
maniera molto moderata.
Si sta raggiungendo la
famosa fase di endemia, la
quale permetterebbe di
venirne fuori in maniera
sensata.
Importante è analizzare la
categoria degli operatori
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sanitarî perché sono tutti vaccinati e perché è abbastanza facile reperirli, non bisogna cercarli. Gli operatori
sanitari che si ammalano non fanno cluster secondari, non ci sono casi secondari. Nella prima ondata gli
operatori sanitari erano tra i peggiori casi che ci fossero, spargevano e infettavano. Adesso la situazione, per
l’appunto, è molto diversa.
Per quanto riguarda l’utilizzo della PCR essa ha un’applicabilità che deve avvenire in tempi ben definiti, se si
applica prima della comparsa dei sintomi è molto probabile avere un falso negativo, mentre all’esordio dei
sintomi si riesce a riscontrare molto bene il virus.
L’Istituto Superiore di Sanità (ISS) chiede da cinque mesi ai laboratori di riferimento del sequenziamento di
fare una volta al mese, in un giorno predefinito, una raccolta e un sequenziamento di campioni positivi,
derivanti dalla pratica di laboratorio, identificati in quel giorno. È stato fatto il 24 agosto, poi il 26 settembre
con lo scopo di vedere che cosa sta circolando.
Questi sono i dati parziali della sola regione Emilia-Romagna, in quanto comunque i tempi per la raccolta
sono prolungati.
Dati di fine agosto, da notare la quantità di B.1.517.2, che rappresenta 98 campioni su 151.
Tutte le sottovarianti presenti al momento derivano dalla delta.
Il sistema di classificazione nota qualcosa di diverso (es. una delezione).
49
A settembre ci sono stati meno campioni sequenziati e si nota la

presenza di una variante più lontana dal delta, variante che si vede
che deriva dalla delta, ma dalla quale si sta allontanando sempre di
più. Prima corrispondeva a 23 casi su 151, ora 30 su 88, il tutto in un
mese.
Un responsabile del laboratorio di sequenziamento inglese
sottolinea come delta + S: Y145H stia aumentando e come questo
stia avvenendo in varie parti.
La conclusione è che non ci si può permettere di smettere di
studiare questo virus, più lo si tiene compresso con i vaccini più è
probabile che riesca a trovare soluzioni di varianti virali che possono
scappare.
Il vantaggio che si ottiene lavorando con i vaccini a mRNA è che si
può modificare la sequenza del mRNA, in accordo con le varianti che
possono eventualmente emergere e scappare.
M2.4 INFEZIONI FUNGINE

I funghi filamentosi responsabili di
polmonite sono funghi filamentosi
acquisiti per via respiratoria;
possono colpire sia pazienti
immunocompromessi (nella
maggior parte dei casi) che pazienti
immunocompetenti.
Tra quelli che colpiscono anche gli
immunocompetenti abbiamo
Histoplasma capsulatum (presente
nell’appennino tosco-emiliano),
Blastomyces dermatitidis,
Coccidioides immitis e
Paracoccidioides brasiliensis (diffusi
soprattutto in Usa o in America
meridionale).
Le infezioni da miceti opportunisti
(che colonizzano pazienti
immunocompromessi), invece,
comprendono diverse specie di Aspergillus e altri funghi come i Mucorales e i Fusarium.
Questi funghi presentano colorazioni caratteristiche che consentono di identificarli:
• il Fusarium produce macro-conidi a forma lievemente ricurva con dei setti trasversali all’esame
microscopico, dall’aspetto lanoso biancastro in coltura e arancione nel retro;
• il Mucorales, il più veloce a crescere (tanto da sollevare i coperchi delle piastre da coltura nel giro di
1/2 giorni), ha un aspetto a sale e pepe per via delle puntinature del micelio aereo. Le ife sono chiare
e le teste scure.
Oltre all’aspetto morfologico, sia microscopico che macroscopico, anche i tempi di coltura sono utili nella
diagnosi perché il Mucorales impiega per crescere in maniera evidente 1/2 giorni, l’Aspergillus 3/4 giorni e il
Fusarium 6/7 giorni.
M2.4.1 Aspergillosi – generalità

I pazienti a rischio di aspergillosi polmonare invasiva sono pazienti immunocompromessi, in particolare i
neutropenici che hanno subito trapianto di midollo osseo o con leucemia mieloide acuta. Anche i pazienti
50
non neutropenici possono però esser colpiti, come pazienti con l’influenza (dove l’aspergillosi può verificarsi
come complicanza), pazienti ricoverati in terapia intensiva (anche nei pazienti Covid-19) o pazienti
ematologici trattati con CAR-T cells (linfociti chimera che combattono le cellule tumorali).
Facendo riferimento a un recente studio: a Victoria, Australia, sono stati analizzati pazienti ospedalizzati
nell’arco temporale di 11 anni (2005-2016) per ricercare l’incidenza dello sviluppo di infezioni invasive. Tra
tutti i pazienti ospedalizzati, ovvero 619.702, circa 32.815 erano pazienti onco-ematologici e 1765 trapiantati.
Dei pazienti onco-ematologici, il 2,04% ha sviluppato un’infezione invasiva nei 12 mesi successivi alla
diagnosi; nei pazienti trapiantati di midollo parliamo invece del 6,29%. Si può notare come la percentuale sia
più alta nei trapiantati piuttosto che nei pazienti con leucemia. Dunque, anche il trapianto è un’importante
fattore di rischio per questi pazienti ematologici.
Il grafico a destra mostra, invece, quali sono le infezioni fungine invasive più comuni, divise per patologia. Si
rileva che le infezioni invasive più comuni sono quindi le aspergillosi invasive e le infezioni da Candida
invasive, mentre le mucormicosi (più rare) sono più comuni nei trapiantati e nei pazienti con leucemia
mieloide e linfoide. In questo
contesto, per candidiasi
invasive si intende la presenza
di Candida a livello ematico,
quindi una sepsi.
Questo grafico sulla sinistra

illustra invece il tempo medio
per lo sviluppo di infezione
fungina invasiva dalla diagnosi
di malattia ematologica. Il
tempo più breve appartiene ai
pazienti con leucemia mieloide
acuta (meno di 5 mesi) e per i
pazienti che hanno subito
trapianti allogenici (5 mesi).
51
La curva a destra mostra invece il

tempo di sopravvivenza dal
momento della diagnosi. Si nota
come le mucormicosi abbiano il
tempo di sopravvivenza più
breve, circa 20 mesi. Le
aspergillosi, invece, consentono
al paziente di sopravvivere anche
fino a 80 mesi. Le mucormicosi,
che tra queste infezioni hanno il
tasso di sopravvivenza più basso,
sono infezioni che attecchiscono
ai seni paranasali e sono molto
aggressive, l’esordio è rapido e
arrivano velocemente al SNC.
M2.4.2 Aspergillosi polmonare invasiva

L’infezione da Aspergillus può essere acquisita a
livello ambientale. Nell’immagine a lato, a sinistra
è rappresentato l’ambiente esterno con un
aspergillo, un fungo filamentoso, con un micelio
vegetativo e le relative ife settate fungine (in
basso) e un micelio aereo (in alto). In quest’ultimo
si formano delle ife che terminano con delle
vescicole alle quali si attaccano delle fialidi:
queste sono delle piccole cellule adese alla
vescicola dalla quale partono poi delle file di
conidi.
I conidi sono dunque delle piccole spore
microscopiche che diffondono nell’ambiente
trasportate dall’aria, e per inalazione
rappresentano gli elementi di trasmissione
utilizzati dall’aspergillo per entrare nelle vie
respiratorie profonde. Dalle spore fungine si ha
successivamente la riformazione
delle ife, che saranno responsabili
dell’invasione del tessuto ospite.
Dunque, più che i conidi, vedremo le
ife che si addentrano nei tessuti.
In queste infezioni le ife possono
addentrarsi anche a livello dei vasi,
sono cioè angio-invasive, ed è
proprio per questo motivo che si
parla di aspergillosi polmonare
invasiva: le ife essendo molto
appiccicose, una volta raggiunto il
circolo, si attaccano all’endotelio per
dare luogo a nuove ife, che
diffonderanno verso gli altri distretti
corporei. Talvolta la crescita è così
invasiva da portare all’occlusione dei vasi e a conseguente necrosi. È importante sottolineare che nonostante
esse siano in grado di aderire ai vasi, sostanzialmente non andranno mai in circolo.
52
M2.4.3 Altre tipologie di aspergillosi

Oltre all’aspergillosi polmonare invasiva sono altrettanto importanti:
• aspergillosi broncopolmonare allergica, dovuta a sensibilizzazione del soggetto agli antigeni di
• aspergillo;
• asma severo, tipico dei bambini e dovuto sempre a sensibilizzazione.
• aspergillosi polmonare cronica, tipica dei soggetti con una pneumopatia cronica ostruttiva o con una
tubercolosi, caso in cui si possono avere dei focolai polmonari di tubercolosi dove secondariamente
si va a innestare una sovra-infezione da aspergillo.
Dalla tabella possiamo

osservare che sono circa
44.000 i pazienti a rischio di
aspergillosi polmonare
invasiva, ossia pz che
presentano malattie
ematologiche di tipo mieloide
o linfoide (7%), pz trapiantati
(3.1%) ma anche pz affetti da
BPCO e pazienti in terapia
intensiva.
M2.4.4 Specie
Le specie di Aspergillus che
danno aspergillosi polmonare
invasiva sono molteplici. Quella predominante è l’Aspergillus fumigatus, con tipica colorazione grigio-
verdastra data dai conidi che presentano questa pigmentazione, mentre le ife sono trasparenti. Il colore delle
ife è visibile voltando la piastra e osservando il retro (anche nella coltivazione dei funghi neri, voltando la
piastra, è osservabile la colorazione nera delle ife poiché producono melanina).
Oltre al fumigatus, vi sono altre specie di aspergillo, tra cui il flavus e il niger. Queste sono le tre specie più
rilevate in pazienti immunodepressi con aspergillosi polmonare invasiva.
M2.4.5 Diagnosi
Per quanto riguarda la diagnosi, è presente un protocollo definito da alcune associazioni europee
(EORTC/MSG) che aiuta i clinici nel poter definire una diagnosi come certa, probabile o possibile. Non basta
individuare il patogeno per fare diagnosi perché le spore fungine, che sono diffuse nell’ambiente ed
estremamente volatili, si possono ritrovare nel materiale patologico a causa di una contaminazione
(avvenuta nel momento del campionamento), o può accadere che un paziente sia colonizzato senza
necessariamente presentare infezione. La diagnosi viene categorizzata, in base al rischio di insorgenza della
malattia, in tre criterî: criterî dell’ospite, criterî clinici e criterî microbiologici.
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Criterî dell’ospite à Sono rappresentati dalle eventuali malattie e terapie in atto. Possono essere ad esempio
il fatto di essere neutropenici, di aver subito un trapianto di midollo allogenico, avere un’immunodeficienza
congenita o assumere corticosteroidi (immunosoppressori): sono tutti fattori di rischio dell’ospite.
Criterî clinici à Sono fattori di tipo radiologico,

rappresentati ad esempio da una TAC polmonare con
presenza di tipiche lesioni da infezioni fungine, come il
nodulo con opacità in periferia o il nodulo con
cavitazioni e air crescent (come se mancasse un pezzo
del margine del nodulo).
Criterî microbiologici à Sono rappresentati da: esame microscopico diretto (osservazione del materiale
patologico al microscopio), esame colturale, esame anatomopatologico in seguito a biopsia, test sierologici
con indicatori quali il galatto-mannano e il β-1,3-D-glucano.
Si può fornire diagnosi di aspergillosi invasiva certa quando si ha una diagnosi istopatologica che deriva
direttamente da una biopsia del materiale prelevato dal paziente, con la presenza di ife fungine. Si dice
diagnosi istopatologica perché qui l’esame microbiologico non vale: infatti, essendo l’albero respiratorio
soggetto a contaminazione esterna, è necessario osservare le ife fungine nel pezzo istologico per dare
diagnosi certa, tramite esame microscopico diretto o anatomopatologico (Alcuni funghi, come il fusarium,
possono essere anche isolati nel sangue; in questo caso l’esame microbiologico può essere effettuato perché
il sangue è materiale sterile).
Per la diagnosi di
aspergillosi invasiva
probabile si dispone di
criterio dell’ospite +
criterio clinico + criterio
microbiologico. Il criterio
microbiologico può essere
un semplice esame
colturale o, nel caso di
esame colturale negativo,
si può avere un test
sierologico positivo, ad
esempio i galatto-
mannani positivi. Quindi,
ad esempio, in caso di
criterî dell’ospite positivi
(es. neutropenico), tac
suggestiva, coltura
negativa ma galatto-
mannani positivi, si può formulare una diagnosi probabile.
Per una diagnosi di aspergillosi invasiva possibile non si dispone né di criterio microbiologico né di quello
istologico, rimangono i criterî dell’ospite e clinici: es. un paziente neutropenico con tac suggestiva, senza la
certezza microbiologica.
M2.4.6 Tecniche di diagnosi microbiologica

• Esame microscopico diretto
Una volta arrivato il BAL in laboratorio, si può andare a ricercare all’interno di
questo materiale la presenza di ife fungine. L’esame viene effettuato sul
sedimento, ottenuto dalla centrifugazione del BAL, dopo che questo viene
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colorato col calcofluor (che si lega alla chitina della parete, dando una colorazione azzurro/verdastra). Nella
foto alla pagina precedente vediamo le ife settate nel sedimento di BAL in un paziente con leucemia mieloide
acuta con febbre, neutropenia e febbre.
• Esame colturale
Oltre all’esame
microscopico diretto, il
materiale patologico può
essere preso e messo in
coltura. La semina viene
fatta in tubi sigillati
ermeticamente (per evitare
una contaminazione
ambientale),
successivamente, dopo circa
5-10 gg, se è avvenuta la
crescita, si effettua una semina su piastre di Sabouraud (terreno tipico per la crescita dei funghi filamentosi),
prelevando con un’ansa il fungo filamentoso dal tubo ed effettuando 3 “pic” nella piastra (per questo in
genere si osservano 3 grandi colonie).
A partire da un esame colturale si possono
osservare sia caratteristiche macroscopiche che
microscopiche. L’esame microscopico effettuato
sulla colonia avrà uno scopo diverso rispetto a
quello effettuato direttamente su materiale
patologico, ossia quello di determinare la specie
fungina tramite l’utilizzo della colorazione
lattofenolo cotton blu.
Si osservano caratteristiche dell’ifa, della vescicola ecc. A sinistra è presente un aspergillo e a destra un
fusarium, da notare le diverse caratteristiche morfologiche: nel primo caso si notano una vescicola con le
fialidi e i conidi, mentre nel secondo caso i macroconidi si aggregano a formare delle strutture senza nessuna
vescicola.
La parete cellulare degli eumiceti, esterna alla membrana plasmatica, presenta una struttura chimica molto
complessa. I componenti principali sono riconducibili a polisaccaridi di quattro tipi: Mannani, Glucani,
Chitosano (negli Zigomiceti) e Chitina. La chitina è un polimero formato da subunità di N-acetilglucosammina
ed è la componente che trattiene il colorante cotton blu, carico negativamente.
• Spettrometria di massa MALDI-TOF

Questo esame è utilizzato sia per diagnosi di infezione batterica, sia per diagnosi di infezione fungina, inclusi
i lieviti. È un test molto rapido: attraverso la lisi di questi microrganismi si ha il rilascio di proteine che vengono
analizzate attraverso il loro passaggio nel cosiddetto tubo di volo. Questo, in base alla massa e alla carica
delle proteine, le fa migrare e consente la costruzione di uno spettro che è tipico per ogni microorganismo.
Matchando poi lo spettro ottenuto con gli spettri di ogni microorganismo contenuti in un database, si riesce
a identificare sia il genere che la specie in questione (es. Aspergillus niger).
• Test sierologici (GM)

Il test sierologico più indicativo per infezioni da aspergillo è la ricerca del galatto-mannano (GM),
componente della parete cellulare della cellula fungina. Questo può essere rilasciato in circolo: possiamo
dunque trovarlo sia a livello di materiale patologico sia nei campioni di sangue. Questo aspetto è importante
perché, mentre non riusciamo a isolare nel sangue l’aspergillo, qui ne possiamo trovare dei componenti. In
questo senso si presta ad essere un test rapido, semplice e veloce, senza necessità di effettuare un BAL, ma
attraverso un semplice prelievo di sangue in provetta. È, inoltre, un marker precoce di aspergillosi polmonare
invasiva perché sembra precedere di almeno una settimana le anormalità radiologiche, lo sviluppo dei segni
clinici e la crescita del micete in coltura.
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Questo test, dunque, da un lato anticipa la diagnosi, dall’altro risulta però essere aspecifico, quindi può dare
falsi positivi, in quanto:
• potrebbe comparire anche con terapia antibatterica con piperacillina-tazobactam o amoxicillina-
clavulanico;
• potrebbe essere rilasciato anche da altri miceti come il Penicillium, un fungo filamentoso non
patogeno normale contaminante quindi non agente eziologico di polmonite invasiva, anche
dall’Alternaria, dall’Histoplasma, dal Cryptococcus.
Quindi è un test di facile esecuzione, molto utile
ma è scarsamente specifico. Per questo è
importante considerare molti parametri per la
diagnosi.
Il test si avvale di micro-piastre a 96 pozzetti, sul
fondo dei quali sono presenti anticorpi
monoclonali che riconoscono antigeni del galatto-
mannano. Sono poi utilizzati anticorpi monoclonali
secondari marcati con un cromogeno che emette
un segnale nel momento in cui riconosce e si lega
all’immunocomplesso.
In genere: se il valore numerico che si ottiene dal test è superiore a 0.5 (alcuni laboratori utilizzano 1 come
valore cut-off), allora si considera il test positivo.
Questo testo può lavorare non solo sul materiale respiratorio, ma anche sul siero o sul plasma: nel caso di
infezione fungina invasiva, infatti, gli antigeni del galatto-mannano possono essere rilasciati nel torrente
circolatorio, non troviamo quindi l’ifa nel torrente circolatorio ma i suoi antigeni.
Un altro test molto utilizzato è quello del βD-glucano: il βD-glucano è un componente della parete del lievito
che viene rilasciata in modo più consistente del galatto-mannano nel siero. Questo antigene viene ricercato
se si sospetta infezione invasiva da lieviti o in particolare da candida. Il test è utile nel monitoraggio in pazienti
a rischio di sviluppare infezioni fungine invasive (pazienti con resezione intestinale), è eseguito sul siero e su
base bisettimanale; finché il test rimane negativo si può escludere con ragionevole certezza l’infezione, per
cui il valore predittivo negativo è estremamente elevato.
• Test molecolari
Altro test che si può utilizzare è il test di PCR, molto dibattuto soprattutto per l’utilizzo con i campioni di
sangue, quindi come un test da affiancare al GM. Il problema è che le ife fungine sono molto dure e resistenti;
pertanto, risulta difficile estrarre gli acidi nucleici, e di DNA di aspergillo in circolo ce n’è, ma è sempre molto
poco. Quindi per anni si è dibattuto sull’utilizzo o meno di questo test in diagnostica microbiologica, e ad oggi
esistono dei test commerciali sviluppati dalle ditte farmaceutiche che danno dei buoni risultati. Questo è un
test che anche su BAL dà una sensibilità molto superiore rispetto all’esame colturale. Si può usare quindi sia
su sangue che su BAL.
M2.4.7 Terapia – farmaci antifungini

I farmaci antifungini che possono essere utilizzati in terapia nelle infezioni invasive sono:
• polieni à l’amfotericina B è uno dei più utilizzati, agisce legandosi all’ergosterolo della membrana
plasmatica e determina la formazione di pori a livello del bilayer lipidico, alterando in particolare la
permeabilità agli ioni. È molto tossico, ma molto efficace;
• azoli à agiscono inibendo un enzima (CYP51a) coinvolto nella sintesi dell’ergosterolo, quindi stesso
bersaglio dei polieni ma, mentre questi agiscono direttamente sulla membrana, gli azoli agiscono
inibendo la sintesi dell’ergosterolo;
• echinocandine à non sono dei veri e propri fungicidi, ma sono dei fungistatici, quindi non uccidono,
ma inibiscono la crescita, inibendo la sintesi del β-1,3 glucano, un componente della parete cellulare
della cellula fungina, un po’ come la penicillina per i batterî. Sono spesso somministrati in
associazione con polieni o azoli. Sono invece molto efficaci contro i lieviti.
56
Meccanismi di resistenza agli azoli

• Possono dipendere da mutazioni a carico del gene CYP51A, codificante per l’enzima utile alla sintesi
dell’ergosterolo, che è bersaglio degli azoli. Queste mutazioni possono ridurre l’affinità degli azoli
per l’enzima.
• Ci può anche essere una over- espressione delle pompe di efflusso che, una volta che l’azolo entra
nella cellula, fanno sì che venga immediatamente espulso (meccanismo simile a quello della
resistenza degli Pseudomonas ai carbapenemici).
• Ci può essere una over-espressione dell’enzima dovuta a delle mutazioni nel promotore del gene
CYP51A.
Per la terapia dell’aspergillosi
polmonare invasiva uno dei
farmaci più utilizzati è il
voriconazolo, e può essere
utilizzato sia per via endovenosa
che orale, per cui la terapia può
essere seguita anche da casa.
Come terapia alternativa si può
utilizzare anche amfotericina B, in
associazione col voriconazolo o
come alternativa, nel caso si sia
57
sviluppata una resistenza agli azoli. Generalmente tende a non essere utilizzata come farmaco di prima linea
in quanto l’amfotericina è un farmaco ad elevata tossicità.
È importante, come sottolineato nella tabella sottostante, conoscere la specie fungina, poiché alcuni funghi
presenteranno una resistenza intrinseca al voriconazolo, come l’A. niger, e altri all’amfotericina B, come l’A.
terreus.
Sensibilità ai farmaci
Per studiare la sensibilità in vitro dei funghi filamentosi si utilizzano, come suggerito da EUCAST, dei valori
soglia chiamati breakpoints che consistono in concentrazioni di farmaco in mg/L.
Questi valori variano da specie a specie. Per l’Aspergillus fumigatus trattato con amfotericina B:
• valori di MIC ≤ 1: il fungo è sensibile al farmaco;
• valori di MIC > 2: il fungo è resistente al farmaco.
Quando c’è IE vuol dire che ancora non è stata determinata.
La tabella sopra è un esempio di antimicogramma.
Epidemiologia e resistenza agli azoli

Ogni anno si verificano nel mondo 300.000 casi di aspergillosi invasiva. Si stima che in alcuni paesi il 12% degli
aspergilli causanti queste infezioni sia resistente agli azoli, soprattutto a causa dell’utilizzo di farmaci in
agricoltura simili agli azoli (questo avviene soprattutto in Olanda, dove nelle coltivazioni di tulipani vengono
utilizzati questi pesticidi che inducono resistenza agli azoli). Quindi a volte il paziente acquisisce dall’ambiente
58
un aspergillo già resistente, e una volta iniziata una terapia con voriconazolo si vede che il paziente non
risponde. Dunque, non è una resistenza dovuta a una terapia con azoli che fa sì che tramite selezione
sopravvivano solo le ife fungine resistenti a questi, ma è dovuta a degli aspergilli già resistenti presenti
nell’ambiente.
M2.4.8 Polmoniti da Candida

Le polmoniti da Candida rappresentano un fenomeno estremamente raro. Generalmente quando la candida
viene isolata dal materiale respiratorio non si tratta di infezione, ma di colonizzazione; in quest’ultimo caso
conoscere il sito di colonizzazione nell’ospite (vie respiratorie superiori e inferiori, regione rettale e genitale)
può essere utile, soprattutto nei pazienti immunocompromessi, per definire un indice di rischio di sviluppo
di un’infezione invasiva da Candida. L’infezione si presenta solo in alcuni casi a livello delle vie respiratorie
profonde, in particolare a livello alveolare, e le polmoniti da candida possono essere:
• primarie, se causate da aspirazione di materiale infetto;
• secondarie a un’infezione invasiva. Nel caso di sepsi da candida, il fungo è presente nel torrente
circolatorio e può causare infezioni secondarie del tratto respiratorio.
CAGTA (IFA): Candida Albicans Germ Tube Antibodies

Nel caso di sintomatologia respiratoria, si esegue un prelievo di sangue su cui si effettua in seguito il test
CAGTA: esso ricerca la presenza a livello plasmatico di anticorpi contro il tubulo germinativo di Candida
albicans e permette di definire lo stato dell’infezione, distinguendo tra colonizzazione e infezione. Infatti, la
presenza del tubulo germinativo è indice di attivazione e moltiplicazione del lievito e, dunque, di infezione.
In realtà, non tutte le infezioni da Candida possono essere diagnosticate mediante il test CAGTA poiché
alcune specie (esempio la Candida glabrata) non sono in grado di formare tubuli germinativi.
M2.4.9 Infezioni da Pneumocystis jirovecii

Si tratta di un’infezione che interessa le vie respiratorie soprattutto in pazienti immunocompromessi e in
particolare affetti da AIDS. Il principale test utilizzato in diagnostica è l’immunofluorescenza (vedi immagine):
marcando con fluoresceina gli anticorpi anti-Pneumocystis jirovecii e sottoponendo il preparato a radiazioni
ultraviolette, l’emissione di una fluorescenza di colore verde permette di evidenziare le cisti generate dal
fungo.
Sebbene le linee guida indichino l’immunofluorescenza
come test di riferimento per la diagnosi di infezione da
Pneumocystis jirovecii, oggi vengono utilizzati anche test
molecolari di PCR in ausilio a ciò: essi sono più sensibili ma,
come tutti i saggi sensibili, necessitano di una soglia clinica
che identifichi il valore del numero di copie indicativo di
una possibile infezione piuttosto che di una colonizzazione
o della semplice presenza di Pneumocystis jirovecii (fungo
molto diffuso). Ancora oggi vi sono molti studi in corso per
la determinazione del valore della soglia critica e di
conseguenza i test di PCR vengono utilizzati nel follow-up
dei pazienti in cui è stata diagnosticata l’infezione
mediante immunofluorescenza, per monitorare
l’andamento della carica e per valutare l’efficacia della
terapia (si avvale soprattutto del Bactrim).
M2.4.10 Polmoniti nel soggetto immunodepresso

Le polmoniti nei pazienti immunodepressi possono essere causate, oltre che da funghi filamentosi e da
Pneumocystis jirovecii, anche da altri microorganismi, quali:
• Cryptococcus neoformans: causa meningiti, ma può essere agente eziologico anche di svariate
infezioni delle vie aeree;
59
• micobatterî atipici (MOTT): micobatterî diversi da Mycobacterium tuberculosis che provocano

micobatteriosi atipiche. La specie di MOTT più diffuse nell’uomo sono rappresentate dai cluster
avium/intracellulare, kansasii, fortuitum, xenopi. In questi casi di infezione si forma un granuloma a
livello dell’albero respiratorio con ritmi di crescita superiori a quelli del Mycobacterium tuberculosis,
variabili tra qualche giorno e un paio di settimane;
• Nocardia spp.: bacillo Gram+, simile al Mycobacterium tuberculosis, che può essere trasmesso per
via respiratoria ed è molto diffuso nell’ambiente. È l’agente eziologico della nocardiosi polmonare,
caratterizzata da lesioni granulomatose nei pazienti immunocompromessi; il bacillo può inoltre
diffondere per via ematica al SNC, dove genera ascessi granulomatosi, e alla cute, con lesioni
granulomatose necrotiche;
• CMV, HHV-6, HSV-1 e 2, VZV: la polmonite da CMV è maggiormente riscontrata ed è sempre
monitorata nei pazienti ematologici.
60
M3. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DEL TRATTO GASTRO-INTESTINALE

M3.1 CARATTERISTICHE DELLE INFEZIONI DEL TRATTO GASTRO-INTESTINALE

Il tratto gastro-enterico è un grosso serbatoio di germi (circa 2 kg). Un po’ perché esiste una grossa comunità
microbica chiamata microbiota intestinale, un po’ perché tutti i giorni vengono ingerite quantità enormi di
microorganismi in quanto nessun cibo è completamente sterile.
Buona parte di ciò che si ha come contenuto microbico gastro-enterico deriva dal microbiota residente e da
quello che si ingerisce con la nutrizione.
È chiaro che tutta la parte
microbica ingerita con gli
alimenti deve sopravvivere
dalla bocca al grande
intestino. C’è un passaggio,
che è quello dello stomaco,
che rappresenta una grossa
barriera per i batterî.
Questo perché nello
stomaco è presente un pH
fortemente acido (pH 1,5-
3,5).
Le difese, però, non sono
solo quelle del pH acido dello
stomaco.
In bocca, ad esempio, le
difese sono rappresentate
dalla saliva, dal lisozima
salivare, dal fatto che ci sia
un flusso continuo di liquidi
(uno dei fattori più
importanti per evitare la colonizzazione dei batterî) e dal microbiota locale, che costituiscono una prima
difesa dell’organismo (funge da barriera microbiologica contro l’attecchimento dei patogeni).
Tantissimi germi entrano nelle nostre vie urogenitali, ciò nonostante, le infezioni sono un fatto abbastanza
limitato perché se c’è un buon flusso urinario difficilmente riescono a svilupparsi. Il flusso di liquidi, quindi, è
sicuramente un fatto importante.
Poi, gioca un ruolo molto importante la parte di competizione microbica con il microbiota. Ciò che arriva
dall’esterno si ritrova, se riesce a passare tutti questi filtri difensivi, in una situazione di fortissima
competizione ecologica in quanto l’intestino è un organo costituito da migliaia di specie batteriche diverse e
chi arriva per ultimo deve trovare una strada per riuscire a vincere la competizione.
È importante sottolineare il fatto che il microbiota intestinale costituisce anche uno stimolo continuo per il
sistema immunitario, perché è vero che accompagna l’uomo dalla nascita fino alla morte con modificazioni
connesse all’ambiente, all’età, all’alimentazione ecc. ma è anche vero che è un organo considerato abnorme
dal sistema immunitario e dunque si crea una fase di compenso, in modo che il sistema immunitario non si
impegni a distruggerlo.
Il microbiota intestinale dà anche un contributo metabolico (sintesi vitamina K e vitamine del complesso B,
ridotto assorbimento del colesterolo.)
M3.1.1 Sintomi e sindromi cliniche delle infezioni del tratto gastro-intestinale

A livello dello stomaco è possibile riscontrare, entrambe associate alle infezioni da Helicobacter pylori:
• gastrite cronica: stato infiammatorio della mucosa gastrica;
• ulcera peptica: lesione macroscopica della mucosa gastrica o duodenale.
A livello intestinale si avrà:
61
• diarrea, indice di un’aumentata eliminazione di fluidi con le feci (con più di 3 scariche diarroiche al
giorno);
• dissenteria, indice di un’aumentata eliminazione di fluidi con le feci, accompagnate da sangue e
muco. Il quadro clinico è accompagnato da uno stato di infiammazione e danno della mucosa
intestinale (febbre, tenesmo e crampi addominali);
• febbre enterica, quadro sistemico causato dalle Salmonella typhi e paratyphi A-C. Queste possono
entrare nella circolazione ematica e interessare molti organi ed apparati. Nelle nostre situazioni
geografiche le febbri enteriche sono forme estremamente poco probabili, ma muovendosi fuori da
queste situazioni geografiche bisogna tenere in considerazione queste possibilità.
È importante ricordare che diarrea e dissenteria non sono sinonimi, ma sono due cose diverse. Hanno
patogenesi differenti e di conseguenza anche espressione clinica diversa.
La diarrea è un’aumentata eliminazione di fluidi dal lume intestinale e quindi un’aumentata fluidità della
massa fecale.
La dissenteria, al contrario, è una situazione che non è causata da un’alterazione del riassorbimento di liquidi
a livello delle mucose intestinali, ma è causata da una vera e propria situazione di danno del tessuto mucosale
per cui nelle feci (che non sono per forza completamente liquide) c’è sempre muco e sangue. Spesso nei casi
di dissenteria, facendo un esame microscopico, si trova un tappeto di neutrofili, indice di flogosi batterica.
Da un punto di vista clinico l’immediata distinzione tra una e l’altra non è così semplice.
M3.2 HELICOBACTER PYLORI

Bacillo Gram–, spiraliforme, mobile per la presenza di 5-6 flagelli polari. È un batterio ossidasi positivo e
microaerofilo, quindi vive bene anche in tensioni ridotte di ossigeno. Ha inoltre un’importante attività ureasica
che gli permette di controllare il pH a livello gastrico e formare delle nicchie che gli consentono di colonizzare la
mucosa gastrica e di poter poi determinare danno a livello di quest’ultima. Gli aspetti patogenetici di questo
batterio comprendono quindi:
• la produzione di ureasi in grado di scindere l’urea in ammonio e bicarbonato;
• la presenza di flagelli e adesine per aderire alla mucosa gastrica.
L’attività ureasica è la caratteristica che consente all’H. pylori la sopravvivenza nelle nicchie della mucosa
gastrica, posto assolutamente nefasto per i batterî, in quanto la mucosa gastrica ha un pH 1.5-3.5.
L’attività ureasica posseduta da Helicobacter pylori fa sì che in caso di infezione nella mucosa gastrica l’H.
pylori stesso provochi un cambiamento del pH del microambiente, spostandolo a pH 6.5-7.
Tra le tossine prodotte da questo batterio vi sono:
• tossina vacuolante di tipo A (VacA) che costituisce delle porine a livello delle cellule della mucosa
gastrica inducendo apoptosi;
• isola di patogenicità cag e tossina CagA (cytotoxin associated gene A): sono importanti per la
liberazione di VacA e la produzione di IL-8 da parte delle cellule della mucosa gastrica, a livello delle
quali si ha quindi lo sviluppo di un processo infiammatorio.
I genotipi VacA+ e CagA+ (tipo I) sono quelli patogeni, mentre i VacA– e CagA– (tipo II) colonizzano la mucosa
e danno infezioni asintomatiche o a evoluzione benigna). La presenza del gene però non indica se quel gene
è effettivamente espresso.
M3.2.1 Diagnosi
La diagnosi dell’infezione da Helicobacter pylori si avvale di diversi strumenti:
• Test diretti, volti a mettere in evidenza la presenza dell’agente patogeno. Si dividono in
o Invasivi: test effettuati su biopsia gastrica. Prevedono l’utilizzo di un sondino che consente
di prelevare un campione di tessuto gastrico che può essere così sottoposto sia ad esame
istologico che ad una analisi della sua attività ureasica o a PCR. Per la valutazione dell’attività
ureasica si pone il campione in un terreno semisolido con un indicatore di pH; se quest’ultimo
indica un cambiamento del pH virando da giallo ad arancione, si ha la presenza di batteri
ancora vitali, in grado di determinare il cambiamento di pH mediante la produzione di ureasi.
62
o Non invasivi: Breath test. Si basa sulla somministrazione di urea marcata con Carbonio- 13
che, una volta ingerita, viene idrolizzata dall’ureasi batterica a livello dello stomaco, portando
alla produzione di ammonio e anidride carbonica marcata che, dopo essere stata liberata
mediante l’espirazione, viene rilevata da appositi strumenti.
• Test indiretti, volti a mettere in evidenza la risposta immunitaria nei confronti dell’Helicobacter
pylori. Si suddividono a loro volta in
o Test indiretti non invasivi: ricerca di antigeni di H. pylori nelle feci, mediante test ELISA o test
immunocromatografici, simili ai test di gravidanza, che prevedono lo striscio su piastre
reattive di materiale fecale. Se l’antigene è presente, si legherà ai rispettivi anticorpi e si avrà
il segnale di positività;
o Test indiretti sierologici: ricerca delle IgG sieriche mediante tecnica ELISA o Western blot.
Il difetto dei test indiretti non invasivi è che l’eliminazione fecale dell’antigene di Helicobacter non è un fatto
costante, ma dipende da quanto tempo prima è avvenuto un forte svuotamento gastrico.
Quando lo stomaco si svuota, emette nell’intestino una discreta quantità di antigeni.
Se questo fatto è già avvenuto e si raccolgono le feci, la quantità di antigene potrebbe essere sotto al limite
di sensibilità del test.
A questo si ovvia in maniera molto semplice, cioè ripetendo il test 3 volte in un intervallo di tempo compreso
tra una settimana e 10 giorni. Tutto questo ha senso farlo solo ed esclusivamente in un paziente con malattia
dispeptica.
Per quanto riguarda i test indiretti sierologici, essi indicano la sieroprevalenza, cioè la quantità di popolazione
che è positiva per gli anticorpi verso un determinato antigene; questa nei confronti dell’H. pylori nella
popolazione dei paesi occidentali è sopra il 60 % e in Africa o India ancora più alta. Non esiste quindi la
possibilità di trovare un nesso causale tra sieropositività e malattia dispeptica. Di conseguenza, la sierologia
ha solamente un carattere epidemiologico. [Studiatelo bene, fate onore a Vaira!]
M3.3 DIARREA INFETTIVA

Gli agenti responsabili di diarrea infettiva sono:
• batterî, fra cui Campylobacter, Shigella, Salmonella (questi tre vengono sempre ricercati nei
campioni fecali come causa di diarrea infettiva), Yersinia, E. coli enteroemorragico, Vibrio cholereae
(ricercato nei soggetti che viaggiano nelle zone in cui è endemico), Clostridium difficile;
• virus, fra cui Norovirus, Rotavirus, Adenovirus;
• protozoi, fra cui Giardia intestinalis, Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica (quest’ultimo
responsabile, oltre che di diarrea infettiva, anche di infezioni invasive sistemiche critiche nei pazienti
immunocompromessi);
• elminti, fra cui Taenia solium e saginata, Echinococcus granulosus (l’uomo non è ospite definitivo,
ma intermedio, per cui è interessato per lo più per la formazione di cisti a livello del fegato), Anesakis
simplex e Difillobotrium latum, questi ultimi dovute all’ingestione di pesci di acqua salata e dolce.
M3.3.1 Classificazione microbiologica

[Dalla dispensa Cricca]
È importante perché, in primo luogo, permette di avere un sospetto diagnostico in base al tipo di sintomi,
inoltre questo sospetto indirizza verso il tipo di diagnosi microbiologica da fare.
Infezioni da batterî. Hanno un periodo di incubazione (dal momento dell’ingestione del cibo contaminato
alla manifestazione dei sintomi) di 3-7 giorni. I sintomi possono essere diarrea acquosa o dissenteria, ma
anche febbre e altri sintomi a seconda del microrganismo responsabile. La durata in genere è di qualche
giorno, massimo 7. Si possono avere delle complicanze tra cui la batteriemia, che può avvenire per Shigella,
Salmonella e Campylobacter; la presenza, soprattutto per infezione da Campylobacter jejuni, di reazioni
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autoimmuni secondarie come artrite reattiva e/o paralisi periferica ascendente legata alla produzione di
auto-anticorpi contro la mielina, questa condizione è denominata sindrome di Guillain-Barré.
Infezioni da virus. Il periodo di incubazione è brevissimo, di solito 1 giorno. I sintomi sono: vomito
prominente, compulsivo ed esplosivo (il Norovirus induce un tipo di vomito il cui aerosol può causare la
trasmissione dell’infezione ad altre persone), diarrea acquosa (non causano dissenteria), febbricola. La
durata è breve, il tutto è molto esplosivo e rapido per cui di solito in 1-2 giorni il paziente sta bene.
Infezioni da protozoi. Il periodo di incubazione è lungo, maggiore di una settimana, di solito 1-4 settimane.
La manifestazione dei sintomi in genere è graduale: ad esempio la Giardia causa una diarrea non esplosiva,
di qualche scarica al giorno, che può essere alternata a stipsi, ma comunque in genere è cronica (di durata
maggiore di 1 settimana), nausea, inappetenza.
M3.3.2 Meccanismi patogenici di enteriti infettive ed eziologia

In base ai meccanismi patogenetici le enteriti vengono divise in:
• non infiammatorie, per esempio quelle dovute a E.
coli enterotossigeno o Giardia lamblia. Provocano
diarree secretorie osmotiche a causa di un
meccanismo che altera il riassorbimento dei liquidi.
L’intestino, specialmente il tenue, è un tratto dove il
riassorbimento dei liquidi è fondamentale per
arrivare alla composizione di una massa fecale
ragionevolmente solida. Sono dovute alla
produzione di tossine che determinano la liberazione
di ioni, a cui segue quella di acqua, dalle cellule
intestinali (ETEC) o per mancato riassorbimento di
liquidi (Giardia: è un protozoo che non produce
tossine, ma ha un’azione di tappezzamento e copre
la mucosa intestinale che smette così di funzionare);
• infiammatorie, come quelle dovute a Shigella, al
Clostridium difficile o a E. coli enteroemorragico.
Viene provocato un danno alle cellule della mucosa
enterica, il richiamo delle cellule infiammatorie e
l’aumento della liberazione di liquidi, nonché di
sangue e muco dovuto al danno della mucosa
intestinale;
• invasive, infezioni sistemiche (dovute al
superamento della barriera mucosale) da Salmonella
typhi e paratyphi, o Entamoeba histolytica nei
pazienti immunocompromessi. Tra gli organi
interessati dall’Entamoeba histolityca vi sono
polmoni, cuore e SNC, mentre quelli maggiormente
colpiti da Salmonella typhi/paratyphi sono fegato,
reni e cistifellea. Quest’ultima è importante per la
persistenza del microrganismo nell’ospite, che risulta
così un portatore sano, asintomatico, in grado di
continuare a liberare le Salmonellae attraverso le feci
e perpetrare così il circuito oro-fecale di questi
batteri ad esclusiva circolazione interumana.
In genere le infezioni gastro-intestinali vengono trasmesse
per via alimentare e oro-fecale. Spesso il serbatoio dell’infezione è rappresentato dagli animali, quindi molte
infezioni si configurano come zoonosi (non tutte le zoonosi sono trasmesse per via alimentare o oro-fecale).
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M3.3.3 Zoonosi
Per zoonosi si intende il passaggio di un microrganismo potenzialmente patogeno per l’uomo da un ospite
animale all’uomo stesso. Il passaggio è spesso mediato dall’alimentazione o da un vettore artropode. Le
zoonosi sono importanti nelle infezioni del tratto gastro-entico perché queste sono spesso causate dal
passaggio di microrganismi dall’animale all’uomo mediante l’alimentazione. Si parla di:
• circuito oro-fecale: introduzione di un organismo che poi viene liberato con le feci e successivamente
reintrodotto nell’ospite umano. Il termine si riferisce prevalentemente a infezioni a circolazione
interumana;
• via alimentare: introduzione mediante l’alimentazione di un patogeno che poi non segue il circuito
oro-fecale.
Vengono quindi trattati i principali agenti eziologici di zoonosi legate all’alimentazione secondo il documento
europeo della One Health del 2018. Dal punto di vista epidemiologico, a livello europeo, i microrganismi
maggiormente sorvegliati sono
• Campylobacter;
• Salmonella;
• Listeria monocytogenes;
• Shiga-toxin-producing E. coli (STEC);
• Brucella;
• Trichinella;
• Echinococcus.
Tra le zoonosi sotto sorveglianza su base
epidemiologica ci sono Yersinia,
Toxoplasma gondi e altre (Rabbia, febbre Q,
WNV, tularemia). Non tutte interessano il
tratto gastro-enterico e non tutte vengono
sorvegliate costantemente in tutte le
nazioni, ma vengono valutate a seconda dei
dati epidemiologici.
Tra le zoonosi più diffuse vi sono le campilobatteriosi con 246.571 casi in Europa, seguite dalle salmonellosi,
dalle infezioni da STEC, dalle yersiniosi e dalle listeriosi.
Campylobacter
Il Campylobacter è importantissimo dal punto di
vista epidemiologico per quanto riguarda le infezioni
del tratto intestinale: nei laboratori di microbiologia
è una delle analisi di feci più richieste insieme alla
Shigella e alla Salmonella. È un batterio ossidasi
positivo, quindi non fa parte delle
Enterobacteriaceae, è microaerofilo (cresce bene a
basse pressioni parziali di ossigeno), la sua
temperatura ottimale di crescita è di 42°C (sono gli
unici batterî le cui piastre per la coltivazione
vengono incubate a questa temperatura). È un
bacillo Gram–, elicoidale, asporigeno e presenta
flagelli polari. In Europa è la malattia gastro-
intestinale più frequente dal 2005 e nel 2018
abbiamo avuto una frequenza di 64 casi per 100.000
abitanti (la tendenza è rimasta stabile dal 2014 al 2018).
Il resevoir del Campylobacter, essendo una zoonosi, è rappresentato dai volatili da allevamento, in particolare
il pollame (pollo e tacchino): gli uomini si infettano per ingestione di carni poco cotte o non trattate
adeguatamente. È possibile l’infezione anche da latte contaminato non pastorizzato, contaminato da
Campylobacter spp (le cui principali specie sono l’E. coli e il jejuni) poiché, essendo un’infezione intestinale,
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può contaminare le acque e poi, di conseguenza, infettare altri animali come i bovini. Questo batterio inoltre
tende a sopravvivere bene nell’ambiente, perché tende ad associarsi alle amebe, che sono protozoi,
analogamente a quanto fanno le Legionellae.
La diagnosi viene fatta utilizzando un Fecal Swab con tappo verde, che contiene una palettina che permette
di raccogliere materiale fecale, eventualmente raccolto prima in un barattolo sterile. Dev’essere trasportato
il prima possibile in laboratorio (entro 1-2 h dal prelievo), eventualmente può essere conservato a 4 gradi per
un massimo di 48 h. Ovviamente, la prima cosa che si osserva in laboratorio è la consistenza del materiale:
se il materiale è solido, il campione non è idoneo all’analisi di questi microrganismi, la cui manifestazione
clinica è la diarrea. In genere quindi il materiale è liquido e ci si aiuta a trasferirlo per mezzo di una palettina
presente all’interno degli swab.
Il Campylobacter cresce su molti terreni, anche agar sangue semplice, ma
il materiale fecale, essendo particolarmente ricco di specie batteriche
contaminanti (del microbiota intestinale), necessita di terreni selettivi per
la ricerca di patogeni intestinali. I terreni per batterî intestinali
contengono in genere agenti selettivi di tipo antibatterico, come
vancomicina, importante perché inibisce la crescita di Gram+,
cefalosporine (cefoperazone), per inibire la crescita di Gram–, e il
cicloeximide, per inibire la crescita fungina. Ci sono poi delle sostanze
come il carbone vegetale (ma anche l’ematina e il sodio piruvato) che,
come matrice del terreno al posto del globulo rosso, facilita l’aero-
tollerabilità, essendo il Campylobacter microaerofilo. Inoltre, pigmenta di
nero il terreno stesso (terreno Karmali).
La crescita avviene a 42 gradi e la piastra viene tenuta in incubazione per 48 ore, formando colonie quasi
dello stesso colore del terreno, un po’ più grigiastre.
Salmonella
La salmonellosi è la seconda causa di infezione gastro-intestinale dopo la campilobatteriosi in Europa: nel
2018 sono stati rilevati più di 90.000 casi, con un’incidenza di 20 casi per 100.000 abitanti. La maggior parte
delle infezioni è data da S. enteritidis: questa è introdotta attraverso l’alimentazione e la sorgente principale
è rappresentata da pollame, ma anche da altre carni e uova. Appartiene alla famiglia delle
Enterobacteriaceae, a cui appartengono anche Shigella e altri batterî già visti, ossidasi negativi, Gram–,
aerobi-anaerobi facoltativi, asporigeni.
Le salmonellosi si dividono in due tipi che danno quadri clinici distinti:
• le salmonellosi minori, che sono delle gastroenteriti (in particolare enteriti), difficilmente diventano
infezioni sistemiche. Gli agenti eziologici delle salmonellosi minori sono dei serovar (sierotipi) di
salmonella che sono ubiquitari, come ad esempio la S. enteritidis, che sono diffusi in animali da
allevamento. In questo caso il serbatoio è l’animale e la trasmissione all’uomo avviene attraverso
ingestione di cibi contaminati;
• le salmonellosi maggiori sono invece infezioni sistemiche, causate da serovar che si sono adattati
all’uomo e che sono quindi ad esclusiva circolazione interumana, come la S. typhi e S. paratyphi A, B
e C. Il circuito è quindi oro-fecale: l’uomo elimina questi microrganismi con le feci, può contaminare
ad esempio le acque e quindi infettare altri uomini, perpetrando il circuito. Questo avviene anche
grazie a serbatoi umani, che in genere albergano queste specie di Salmonella a livello della cistifellea
e continuano a eliminare il microrganismo nell’ambiente e a perpetrare la circolazione interumana
(che non prende in considerazione il serbatoio animale). La Salmonella typhi e paratyphi, a differenza
delle salmonellosi minori, sono infezioni rare in comunità europea: sono perlopiù da importazione,
correlate ai viaggi al di fuori dell’Europa, principalmente in Asia. Nel 2017 si sono verificati 1098 casi
dei quali il 90% era correlato a viaggi.
In basso, una mappa dell’ECDC, che possiede i dati più aggiornati (2017), rappresenta i paesi più colpiti
colorati in rosso, ossia Francia e UK (>0,75 casi per 100.000 abitanti).
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La distribuzione di tifo e paratifo dipende anche dell’età: in neonati e bambini sotto i 4 anni è lievemente
maggiore nei maschi, tra i 15 e i 24 anni è più frequente nelle donne e poi l’incidenza cala negli anziani. La
Salmonella typhi, con 744 casi e il 68% di quelli totali, è sicuramente l’agente eziologico maggiore tra le
salmonellosi maggiori.
La patogenesi è basata su un
serbatoio quindi umano: la
colecistite cronica può essere
assolutamente asintomatica,
ma è associata allo stato di
portatori, infatti permette di
eliminare il batterio con le feci
nell’ambiente. Si ha quindi la
trasmissione oro-fecale,
abbiamo la colonizzazione del
tenue, l’invasione della
sottomucosa e poi,
attraversando i vasi linfatici e i
linfonodi mesenterici, si
riversa nel dotto toracico che
converge nel torrente
circolatorio, causando una
prima batteriemia transitoria.
Abbiamo poi l’infezione di
diversi tessuti, con moltiplicazione nei macrofagi del fegato, milza e midollo osseo e quindi una batteriemia
secondaria persistente. Dal fegato, la bile giunge alla colecisti (stato di portatore cronico) e si ha una
colonizzazione secondaria del tenue, che porta alla fase veramente sintomatica. Non è tanto la
colonizzazione primaria che dà il quadro di infiammazione intestinale, quanto la colonizzazione secondaria,
che prevede infiammazione e ulcerazione delle placche del Peyer. Infine, anche in questo caso, si avrà
l’eliminazione del batterio con le feci nell’ambiente.
Shigella
Le Shigellae sono parassiti esclusivi dell’uomo, perciò anche in questo caso non si parla di zoonosi, ma di
infezione interumana a circuito oro-fecale. Si distinguono quattro sottogruppi (S. dysenteriae, S. flexneri, S.
boydii, S. sonnei); la più importante dal punto di vista patologico è la S. dysenteriae, che produce la tossina
di Shiga (l’Escherichia coli produce la tossina shiga-like), il cui effetto citotossico inizialmente era stato
studiato su cellule “vero”, linee cellulari coltivate in vitro. Essa ha effetto sull’epitelio intestinale, causando
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una colite emorragica, ma soprattutto può entrare in circolo con conseguenze molto gravi, come la sindrome
uremico-emolitica, responsabile dell’elevata mortalità della shigellosi, oppure la compromissione del SNC,
per il suo effetto tossico sugli epiteli vascolari. La patogenesi ha origine con la penetrazione per endocitosi
delle Shigellae nell’epitelio intestinale; esse fuoriescono poi dalle vescicole endocitotiche, sfuggendo alla lisi
che avverrebbe a livello dei lisosomi, e si moltiplicano all’interno delle cellule riuscendo a sopravvivere, non
essendo indirizzate al fagolisosoma. Invadono poi le cellule circostanti con la distruzione delle stesse,
evadendo la risposta immunitaria. Invadono la sottomucosa e la lamina propria (dove si accumulano
metaboliti tossici ed endotossina) e quindi richiamano le cellule dell’infiammazione. Le cellule invase
producono segnali di danno che attirano i macrofagi, i quali sono la causa della uccisione delle cellule e della
distruzione della mucosa intestinale portandola alla necrosi, mentre le Shigellae invadono le cellule adiacenti.
Anche in questo caso l’epidemiologia è ECDC 2017: sono riportati circa 2 casi per 100.000 abitanti. Le persone
più colpite sono i bambini con meno di 5 anni di età e i maschi adulti tra i 25 e i 44 anni, soprattutto
omosessuali.
Si utilizza per la diagnosi un terreno Hecktoen, di colore verde petrolio, selettivo: la selettività è importante
per esaminare un campione di feci, molto contaminato, in cui il microrganismo responsabile del processo
infettivo è mescolato a una popolazione molto vasta e numerosa di specie batteriche e diventa quindi più
difficile da individuare. È quindi necessario utilizzare in primis un terreno selettivo per isolare il batterio
patogeno, ma molto spesso si usano anche terreni di arricchimento che favoriscono, attraverso un terreno
liquido, l’arricchimento delle specie patogene desiderate, in modo da isolare il microrganismo di interesse.
In questo caso gli elementi selettivi sono rappresentati dai sali biliari, che inibiscono la crescita di Gram+, e
poi vengono utilizzati lattosio, saccarosio e salicina, che sono metaboliti che vengono fermentati da molte
Enterobacteriaceae come l’Escherichia coli, ma non da Shigellae e Salmonellae. Questo comporta che in
questo terreno la crescita di Shigella e Salmonella non produca alcun pigmento messo in evidenza
dall’indicatore di pH, mentre per esempio le colonie di E. coli si colorano di arancione o giallo, molto ben
visibili. Le colonie di Shigella, invece, sono di colore verde, come il terreno, mentre quelle di Salmonella
risultano pigmentate di nero perché, essendo presenti citrato di ammonio ferrico e tiosolfato di sodio,
mettono in evidenza il solfuro di idrogeno prodotto dalla Salmonella.
Il terreno Hektoen è quindi un terreno cromogeno, che mette in evidenza colonie verdi, nel caso della
Shigella, e con punta nera, nel caso della Salmonella.
Abbiamo sempre lo stesso dispositivo per la raccolta del materiale: si fa una semina diretta del materiale
patologico sulle piastre, come per il Campylobacter, ma non necessita di ambiente microaerofilo e di una
temperatura di 42 gradi. Il Campylobacter veniva incubato per 48 ore per poi fare la lettura, invece per
Salmonella e Shigella abbiamo una semina diretta del materiale patogeno e viene fatta una lettura dopo 24
ore e una ulteriore lettura dopo 48 ore.
Per la Shigella e la Salmonella la temperatura è di 37 gradi e dopo 24 ore, se si osservano colonie, si può fare
un’identificazione delle specie tramite spettrometria di massa MALDI-TOFF.
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Per le Salmonellae si possono fare ulteriori passaggi su terreni cromogeni (che colorano la Salmonella di un
violetto malva), particolarmente in condizioni meno ottimali, in cui abbiamo 2-3 colonie nere sormontate
magari da colonie di Escherichia coli, di colore giallo, o altre Enterobacteriaceae che possono essere arancioni.
Si fa dunque una sottocoltura di una colonia
specifica, una coltura secondaria. In una
condizione non ottimale, ripassare una colonia
nera che si trova in mezzo alle altre in un terreno
di questo tipo può favorire l’identificazione di
Salmonella, che diventa viola in mezzo a una serie
di altri batterî di colori diversi, e comunque anche
questa colonia dovrà sempre passare per la
spettrometria di massa.
Un’altra strategia per isolare questo tipo di
batterî è utilizzare un brodo di arricchimento, in
questo caso un terreno selenite (brodo di
arricchimento in cui si inserisce il materiale
fecale, viene lasciato in arricchimento a 37° per
una notte; la peculiarità di questo terreno è che inibisce la crescita di ogni batterio eccetto per la Salmonella),
che favorisce la crescita delle Salmonellae e delle Shigellae rispetto a tutti gli altri batterî contenuti nelle feci.
Avremo quindi:
• una semina sulle piastre del materiale fecale con lettura nelle 24 ore;
• parallelamente, si fa una prima semina in brodo di selenite e, dopo 24 ore di arricchimento, si fa una
seconda semina su piastra Hecktoen con lettura dopo 24 ore dall’arrivo del campione al laboratorio.
Qui la semina viene fatta con arricchimento e sarà più probabile poter identificare le colonie di Shigella e
Salmonella: si tenta la prima strada, per tentare di avere una diagnosi più rapida, e comunque si ha una sorta
di backup alle 48 ore, per confermare una eventuale diagnosi fatta alle 24 ore oppure per poter identificare
quei casi che ci si è persi non arricchendo il materiale di partenza, con spettrometria ed eventuali piastre
cromogene (che non sono selettive, colorano quindi i batteri in base al loro metabolismo, nel caso della
Salmonella di violetto).
La reazione di Widal-Wright, invece, è una ricerca sierologica, oggi non più utilizzata, che cerca gli anticorpi
anti-Salmonella typhi, paratyphi e anti-Brucella utilizzando l’agglutinazione: essa sfrutta sospensioni
batteriche dei batterî sopracitati marcate con coloranti e si fanno reagire con il siero del paziente. Se sono
presenti anticorpi si forma una reazione di agglutinazione nel siero del paziente. Questa tecnica veniva
utilizzata quando questi tre batterî erano molto diffusi e davano delle “febbri di origine sconosciuta” (FUO)
e sono quindi stati associati insieme in una sola tecnica diagnostica che oggi non ha più valore clinico, sia per
la bassa prevalenza di queste infezioni che per le migliori tecniche diagnostiche oggi presenti.
Escherichia coli
Normalmente presente nel tratto intestinale di uomo e bovini. Prototipo del batterio Gram–. In alcune
situazioni è adesivo e a parte alcune sottopopolazioni non da patologie intestinali. Gli E. coli sono difficili da
differenziare gli uni dagli altri, essendo simili dal punto di vista sia genetico che antigenico: l’unica cosa che
si può utilizzare come una sorta di classificazione è la loro capacità patogena.
Prenderemo in considerazioni solo le infezioni da Escherichia coli entero-emorragico, che sono quelle che
hanno un valore patogeno più significativo nei confronti dell’uomo. L’esame colturale dell’Escherichia coli,
infatti, non ha grande importanza, è sempre presente in un esame fecale. Bisogna piuttosto mettere in
evidenza un’eventuale produzione della tossina entero-emorragica, che causa infezioni più gravi, necessita
di ospedalizzazione ed è caratterizzata da una mortalità più elevata.
I principali quadri patologici da infezione di E. coli sono:
• infezioni esogene, di origine animale (come le zoonosi da E. Coli entero-emorragico);
• meningite neonatale intra-partum, dovuta al passaggio dei ceppi K di E. coli dal retto al canale del
parto (endogena);
69
• endogene delle vie urinarie, da sierotipi uropatogeni;

• endogene del distretto addominale e di quello respiratorio.
La maggior parte delle infezioni da E. coli sono dunque di origine endogena, ossia da batterî patogeni presenti
nel tratto intestinale che per qualche motivo cominciano a proliferare dando un danno. Importanti del punto
di vista patologico sono le infezioni esogene, in particolare da ceppi entero-emorragici.
Zoonosi da ceppi entero-emorragici (STEC: E. coli produttore di tossina shiga-like): è dovuta a un serbatoio
che è il bovino adulto, in genere asintomatico: le carni sono contaminate (come nelle infezioni da
Campylobacter nel pollame) e inoltre, eliminando il microrganismo nell’ambiente con le feci, può infettare
per esempio le acque che vengono utilizzate per irrigare i campi, contaminando anche ortaggi e vegetali.
Quindi attraverso l’alimentazione l’uomo si può infettare, andando incontro a una dissenteria con un periodo
di incubazione che va da 3 a 8 giorni. Importante è sì la sintomatologia locale, la dissenteria, ma anche le
complicazioni, dovute all’azione sistemica della tossina shiga-like, quindi la sindrome uremico-emolitica e il
possibile danno a livello del sistema nervoso centrale. Il tasso di mortalità è del 3-5 %.
L’epidemiologia del 2018 riporta 8.161 casi di STEC con incidenza di 2.28 casi per 100.000 abitanti, con un
incremento del 39% rispetto al 2017.
Abbiamo diversi sierogruppi di EHEC, sono identificati da O (antigene Outer membrane) seguito da un
numero che si basa sul gruppo progressivo di isolamento. La maggior parte dei casi è dovuto al sierogruppo
O157 che è quello più importante e di cui si è parlato di più.
Famoso è l’outbreak verificatosi in Germania nel 2011 con l’infezione di 3950 persone, 53 delle quali sono
morte (51 erano tedeschi) e 800 persone infettate hanno sofferto della sindrome uremico-emolitica. In
questo caso pare che l’alimento incriminato fossero i germogli di soia, contaminato da STEC (quindi
probabilmente un bovino infetto ha liberato con le feci il batterio che ha contaminato un serbatoio per
l’irrigazione).
Essendo E. coli componente del microbiota intestinale, l’isolamento in coltura non permette di distinguere i
ceppi patogeni. La diagnosi da E. coli EHEC può essere quindi effettuata semplicemente con un test
immunocromatografico, in cui viene messo in evidenza non tanto la presenza del batterio, ma la presenza
della tossina. Si utilizza una card (il principio è sempre lo stesso) per mettere in evidenza le shiga-like toxins.
Yersinia
La Yersinia enterocolitica e la Yersinia pseudotubercolotica sono le specie più importanti dal punto di vista
patogeno per la specie umana, sono responsabili di enteriti. Sono zoonosi e il serbatoio è rappresentato
70
principalmente da suini: la via di contaminazione è quindi assunzione di carne poco cotta o cruda (esiste
anche la Yersinia pestis, agente eziologico della peste, che non c’entra però in questo contesto).
Si ha un danno della mucosa come nelle Shigellae, può
causare diarrea, ma soprattutto dissenteria. La Y.
enterocolitica può portare a adenite mesenterica che può
mimare anche un’appendicite acuta (analogamente, la Y.
pestis attacca i linfonodi, in questo caso non mesenterici) e
può diventare un’infezione sistemica in pazienti
immunocompromessi. Può causare anche poliartrite
reattiva, soprattutto in soggetti HLA B-27 positivi. Per
poliartrite reattiva si intende una artrite post-infettiva, non
legata alla presenza del batterio nel cavo articolare, ma a una
reazione immunomediata, scatenata dall’infezione.
Il terreno di coltura si chiama CIN, la crescita ha la peculiarità
di avvenire a 32 gradi, 10 gradi in meno rispetto al
Campylobacter, per 48 ore. Questo terreno è sia selettivo
che cromogeno, l’indicatore di pH vira tra il giallo e il rosso e la Yersinia cresce con la punta rossa e un alone
chiaro circostante.
Vibrio cholerae
Poco importante nelle nostre zone, sono infezioni da importazione, che si vedono quindi soltanto in pazienti
che si sono recati in zone endemiche per queste infezioni. È un bacillo Gram–, mobile per il flagello polare,
aerobio-anaerobio facoltativo, asporigeno, non capsulato. Può essere trasmesso per via oro-fecale, per
ingestione di acqua o alimenti contaminati da materiale fecale di individui infetti: ha quindi trasmissione
interumana. I cibi critici sono i frutti di mare, soprattutto in paesi in cui non c’è un elevato standard igienico
e una corretta gestione degli impianti fognari e dell’acqua potabile, portando quindi a una contaminazione
dei serbatoi di acqua da parte di queste feci infette da Vibrio cholerae.
È in corso la settima epidemia di Vibrio cholerae, iniziata ne 1961 in Asia meridionale, raggiungendo l’Africa
nel 1971 e l’America nel 1991. I sierogruppi che possono causare epidemia sono 2, il ceppo O1 e il ceppo
O139: il primo è il più importante, il secondo interessa più che altro il sud-est asiatico; altri sierogruppi sono
poco patogeni per l’uomo, possono causare deboli forme di diarrea e non sviluppano vere e proprie
epidemie.
La semina viene fatta dopo arricchimento in acqua peptonata3: si mette il materiale patologico nel solito
fecal swab, con tappo verde, viene fatto arricchimento in acqua peptonata e poi isolamento su terreno
selettivo, dove il Vibrio cholerae appare in colonie rosse con alone trasparente.
Clostridium difficile
Una delle principali emergenze in campo sanitario e microbiologico: il Clostridium difficile è un microrganismo
molto particolare, agente di infezione principalmente in ambito nosocomiale. È l’agente eziologico della
colite pseudomembranosa, che insorge a seguito di una terapia antibiotica per os (via orale): viene infatti
depauperato il microbiota intestinale, favorendo la proliferazione di microrganismi ivi presenti; il Clostridium,
che è in grado di trovarsi anche in forma di spore e resistere agli antibiotici, si guadagna una nicchia ed è
capace di esercitare la sua funzione patogena attraverso tossine citotossiche, determinando una colite di tipo
infiammatorio, con la produzione proprio di pseudomembrane.
È un bacillo Gram+, anaerobio obbligato, dotato di flagelli.
3
Acqua peptonata: acqua ricca di peptoni e agenti selettivi che consentono l’arricchimento del Vibrio cholerae, un po’
come il terreno selenite. Sono terreni selettivi liquidi che favoriscono la crescita di un batterio Gram– rispetto agli altri,
arricchendone la presenza e favorendone l’isolamento (in questo caso gli agenti selettivi favoriscono la crescita proprio
del Vibrio cholerae).
71
Negli USA è la causa di 250k infezioni

all’anno (in Europa è pari al doppio),
14k morti e più di un miliardo di
dollari in eccesso per la spesa
sanitaria statunitense.
È un Gram+ anaerobio obbligato in
grado di produrre due tipi di tossina,
la tossina A e la tossina B, dotato di
flagelli ed è un normale colonizzante
del microbiota intestinale. Il 3% dei
soggetti immunocompetenti è
colonizzato in maniera totalmente
asintomatica. Nei soggetti in ricovero
ospedaliero trattati con antibiotici il
numero di colonizzati raggiunge il 7-
25% con una percentuale di ceppi
produttori della tossina di 2-8%. Il C.
difficile è anche possibile trovarlo
nell’ambiente. Il problema del
Clostridium difficile è di natura
iatrogenica, ovvero dovuto a
intervento medico, nello specifico
all’utilizzo di antibiotici ad ampio
spettro, soprattutto se ripetuto e
prolungato nel tempo. Questo causa
una transizione del microbiota da uno
stato di eubiosi a uno di disbiosi,
consentendo ad alcune specie di
aumentare di numero a causa dell’assenza di competizione per spazio e sostante nutritive, dando quindi
occasione al Clostridium difficile di proliferare.
La popolazione in cui il problema Clostridium difficile ha un senso è quella di pazienti sotto terapia antibiotica
e con diarrea. La principale causa dell’insorgenza della CDAD, la Clostridium difficile associated diarrhea, è
data dall’uso di profilassi prolungate e trattamenti empirici di infezioni con antibiotici. Uno studio dell’Unione
Europea di qualche anno fa ha rilevato che negli ospedali c’è un uso sbagliato ed eccessivo di antibiotici,
prescritti persino a pazienti in psichiatria (senza neanche sospetto di infezione). Questo rovina il microbiota
dei pazienti e favorisce la diffusione del Clostridium.
Solitamente il trattamento per un’infezione da Clostridium difficile consiste nel prescrivere al paziente
antibiotici contro il Clostridium, come il Metronidaziolo. Tuttavia, essendo il problema nato in primo luogo
dall’uso scorretto di antibiotici solitamente questo intervento è temporaneo e non risolutivo e il microbiota
sarebbe in uno stato ancora peggiore. Si possono utilizzare gli anticorpi monoclonali oppure la Vancomicina,
un antibiotico migliore ma più costoso, ma entrambi non sono lontanamente validi e cost-efficient come il
Fecal Microbiota Transplant, solitamente utilizzato in caso di recidive. È una pratica sicura e risolutiva, con
un’efficacia vicina al 98%, rimettendo il microbiota in uno stato di eubiosi. Inoltre, anche le complicanze a
lungo termine sono praticamente ridotte a zero. Bisogna prendere una donazione di feci, preferibilmente da
un superdonor; è un processo relativamente semplice e breve, si lavano le feci e si inserisce la sacca
contenente il microbiota in un endoscopio e la si inserisce a livello colico.
La diagnosi da Clostridium difficile parte dal sospetto diagnostico del paziente con diarrea trattato con
antibiotici. L’esame viene svolto su feci diarroiche, fondamentalmente liquide, si può valutare se il campione
è idoneo basandosi sul Bristol Stool Chart. Preso un campione fecale idoneo, si va a ricercare la presenza
dell’antigene GDH (glutammato deidrogenasi) comune a tutti i sierotipi di Clostridium difficile, che siano
tossinogenici o meno. Dopo aver valutato la presenza del Clostridium difficile con lo screening GDH, si cercano
gli antigeni delle tossine, in caso di positività si è di fronte a una CDAD, in caso di negatività degli antigeni
72
delle tossine, o il Clostridium non è l’agente eziologico della diarrea, ma essa è causata da un altro patogeno,
oppure il test è errato e non è stato in grado di rilevare l’antigene proteico della tossina, cosa molto probabile,
in quanto sono presenti molte proteasi nelle feci. In questo caso bisogna fare un ulteriore step diagnostico,
si svolge una PCR per valutare la presenza del gene della tossina A e B, se questo test è positivo non è
comunque sicuro al 100% che si tratti di CDAD, bisogna valutare se il paziente guarisce con la terapia oppure
continua a presentare diarrea dopo 4/5 giorni.
Questo è da tenere in mente in quanto bisogna essere critici anche nell’analizzare i dati di laboratorio, i quali
devono servire come un altro strumento diagnostico nelle mani del clinico e non devono essere considerati
come oro colato.
M3.4 INFEZIONI VIRALI

[Non trattate a lezione – dalla dispensa Cricca]
Principali agenti eziologici delle infezioni gastrointestinali:
• Norovirus: l’infezione interessa il tratto gastrointestinale e si presenta, oltre che con gastroenteriti,
con un vomito epidemico. È tipico dei mesi invernali e delle comunità chiuse (ospedali, case di riposo,
scuole), che ne facilitano la trasmissione.
• Rotavirus: colpisce soprattutto i bambini, è la prima causa di diarrea infantile, tant’è che nel
calendario vaccinale in vigore dal 2017 il vaccino anti-Rotavirus è fortemente raccomandato.
• Adenovirus: l’abbiamo visto nelle cistiti emorragiche, nelle infezioni respiratorie...
La diagnosi diretta si basa sulla ricerca degli antigeni virali nelle feci, tramite test immuno-cromatografici o
ELISA, ma abbiamo anche la ricerca del genoma nelle feci tramite saggio di PCR.
M3.5 INFEZIONI DA AGENTI EZIOLOGICI PROTOZOARÎ

[Non trattate a lezione – dalla dispensa Cricca]
Le infezioni da protozoo interessano maggiormente il tratto intestinale rispetto a quello gastrico.
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M3.5.1 Giardia intestinalis o Giardia lamblia

Rientra tra gli agenti eziologici protozoari ed è sicuramente la più importante dal punto di vista
epidemiologico.
Giardia intestinalis è un protozoo di circa 20 micron con flagelli e due nuclei; esso possiede inoltre un disco
ventrale che gli permette di aderire alla mucosa intestinale. Presenta una forma cistica con 4 nuclei, che è
presente nell’ambiente: all’interno dell’intestino dalla cisti si liberano 2 trofozoiti con 2 nuclei ciascuno, che
rappresentano la forma vegetativa. La moltiplicazione avviene per scissione binaria.
L’uomo è il principale serbatoio di questa infezione. Questo protozoo non invade la mucosa intestinale, ma
si dispone su di essa determinando un danno dei microvilli e, quando presente in numero molto elevato,
determina malassorbimento, che si presenta clinicamente come diarrea. Nel 2017 si sono registrati 19.437
casi di giardiasi nell’EU con un’incidenza di 5,5/100.000 abitanti, principalmente nella fascia d’età da 0 a 4
anni con una rete di infezione di 17,6 casi per gli individui di sesso maschile e 14,9 per il sesso femminile.
Nella fascia da 0 a 4 anni è possibile riscontrare un’incidenza 3 volte superiore alla media. I paesi più colpiti
sono stati Belgio, Estonia e Svezia. Secondo l’OMS è sufficiente l’ingestione di 10 cisti per dare un’infezione
nel 100% dei casi. Le forme cistiche di Giardia possono sopravvivere anche in acque clorate per 60-90min
quindi, considerando il numero esiguo di cisti necessarie, l’ingestione di acqua di piscine può portare a
infezione (anche il trofozoite può restare vitale in acque clorate quasi per un’ora).
Il ciclo inizia con l’ingestione di alimenti o acque
contaminate da cisti. A livello intestinale avviene la
liberazione dei trofozoiti che proliferano per scissione
binaria. Sempre a livello intestinale avviene il passaggio
dalla forma vegetativa a quella cistica e l’eliminazione
delle cisti con le feci.
Questa è un’immagine istologica di una biopsia
intestinale colorata con ematossilina eosina; è possibile
notare la presenza di un gran numero di forme vegetative
che determinano danno dei villi e malassorbimento.
M3.5.2 Cryptosporidium parvum

Nel 2017 in UE sono stati rilevati 11.449 casi di cryptosporidiosi con 3,2 casi/100.000 ab. I paesi più colpiti
sono stati Germania, Olanda e UK, dove sono avvenute il 71% delle infezioni. Anche in questo caso la fascia
d’età più colpita è 0-4 anni con 12,5 casi /100.000 abitanti, con valori circa quattro volte superiori alla media.
Il Cryptosporidium parvum è la seconda causa più comune di gastroenterite dopo il Rotavirus e interessa
anche soggetti immunocompromessi. Fattori come l’aumento del numero di soggetti immunocompromessi
e i cambiamenti climatici concorrono ad aumentare il numero di casi di questa infezione.
[Dalle slide: Le oocisti di Cryptosporidium sono spesso rilevate nelle acque di superficie e ci si aspetta che con
i cambiamenti climatici, a causa delle condizioni metereologiche estreme, possa esserci un aumento del
numero di casi nel futuro, in particolare un aumento del rischio per i bambini delle aree urbane.]
Il ciclo vitale inizia con l’ingestione di cisti presenti in acque o cibi contaminati da feci (anche le acque da
balneazione possono essere contaminate). Le cisti raggiungono così l’intestino e a questo livello avviene la
maturazione in forme vegetative. Queste invadono gli enterociti, all’interno dei quali si moltiplicano, per
74
questo, dal punto di vista patogenetico, l’infezione è più grave rispetto a un’infezione da Giardia. La presenza
di oocisti nelle feci è fondamentale per la diagnosi di infezione da Cryptosporidium.
Dal punto di vista laboratoristico si può evidenziare la presenza di cisti nelle feci con colorazione di Ziehl-
Neelsen. Attraverso la colorazione con carbolfucsina, il Cryptosporidium parvum si colora di rosso,
successivamente si esegue decolorazione con alcol-acido e si prosegue alla colorazione con blu di metilene.
Le cisti resisteranno alla decolorazione e sarà possibile osservare in un campione di feci a fresco le cisti rosse
in campo blu. Si possono eseguire saggi di immunofluorescenza che permettono di evidenziare la presenza
del patogeno attraverso l’utilizzo di anticorpi anti-Cryptosporidium. Gli anticorpi legati emettono un segnale
fluorescente rilevato tramite l’utilizzo di microscopi a ultravioletti.
[Figura B: Le oocisti di Giardia duodenalis sono più grandi rispetto a quelle di Cryptosporidium e vengono
messe in evidenza con anticorpi anti-Giardia].
L’esame di immunofluorescenza è un
saggio diretto e ha la maggior sensibilità
e specificità, seguito dalle tecniche
immunoenzimatiche. I test molecolari
permettono di identificare
Cryptosporidium a livello di specie:
questo è necessario nella diagnosi
differenziale perché alcune specie
diverse dal C. parvum sono apatogene.
M3.5.3 Entamoeba histolytica

È un protozoo molto patogeno nell’uomo; esso spesso nei pazienti immunocompromessi è associato a
disseminazione sistemica e può dare luogo a infezioni extra-intestinali. Esistono delle specie di Entamoeba,
morfologicamente identiche all’hystolitica, che sono considerate poco patogene o apatogene per l’uomo (es.
Entamoeba dispar, moshkovskii e bangladeshi) e il loro ruolo è ancora oggetto di studî. Risulta fondamentale
distinguere le specie di Entamoeba per comprenderne l’effettiva patogenicità. Una caratteristica importante
per riconoscere E. hystolitica è la sua capacità di inglobare i globuli rossi per un meccanismo di
eritrofagocitosi: risulta quindi frequente la presenza di eritrociti nel corpo di E. hystolitica all’osservazione
microscopica. Occasionalmente anche E. dispar può effettuare eritrofagocitosi, ma questa sua capacità è
molto meno spiccata rispetto a E. hystolitica.
Il ciclo vitale parte sempre dalla forma cistica che viene ingerita. Successivamente, essa matura a trofozoite
nell’intestino; sia le cisti che i trofozoiti possono essere ritrovati nelle feci e la presenza di questi nelle feci
dissenteriche consente di effettuare la diagnosi.
In questa infezione abbiamo tre forme di rapporto fra ospite e parassita:
• infezione asintomatica con colonizzazione non invasiva: presenti soprattutto a livello del colon;
• malattia intestinale di tipo invasivo: interessa gli enterociti e può avere delle manifestazioni cliniche
gravi come dissenteria;
• infezione invasiva che coinvolge diversi organi: principalmente il fegato, i polmoni ma anche il SNC.
Nell’infezione da E. hystolitica il passaggio al SNC avviene successivamente all’ingestione per passaggio
attraverso la mucosa intestinale con successiva disseminazione e infezione extraintestinale. (Un’altra ameba
responsabile di infezione al SNC è Naegleria fowleri, la cui infezione avviene per passaggio del patogeno
attraverso il bulbo olfattivo, per inalazione di acque dolci contaminate).
Oltre a E. hystolitica e le specie morfologicamente simili a questa, come E. dispar, esistono molte altre specie
di Entamoeba che sono in grado di colonizzare il tratto G.I., ma che non sono responsabili di patologia. Sono
però importanti per la diagnosi differenziale con E. hystolitica, per questo è importante riconoscerle tramite
una diagnosi di specie.
Si può effettuare tramite diverse metodiche:
• identificazione microscopica: osservazione di cisti o trofozoiti in campioni di feci concentrati o no.
Risulta difficile fare una diagnosi di specie: l’unica caratteristica identificativa è la presenza di globuli
rossi fagocitati all’interno delle amebe, tipico di E. hystolitica;
75
• ricerca anticorpale: viene eseguita in pazienti con una malattia extraintestinale, negativi alla ricerca
di cisti e trofoziti in un campione fecale con esame microscopico diretto. La ricerca anticorpale è
importante nelle regioni in cui l’infezione da E. hystolitica non è endemica in quanto indice di
un’infezione in corso; nelle regioni in cui è endemica, la ricerca anticorpale non è utile a questo
scopo;
• ricerca antigenica: molto utile dal punto di vista diagnostico in aiuto all’identificazione microscopica
per distinguere le specie patogene da quelle apatogene;
• test molecolari: test di prima scelta per distinguere E. hystolitica da E. dispar.
Ricapitolando: la diagnosi diretta si avvale dell’analisi microscopica diretta delle feci, della ricerca degli
antigeni protozoarî tramite test di immunofluorescenza o immunoenzimatici (esistono test più semplici, i test
immunocromatografici che possono mettere in evidenza gli antigeni di Entamoeba, di Giardia e di
Cryptosporidium) e test molecolari, utili per distinguere E. hystolitica da E. dispar. La diagnosi sierologica con
ricerca di anticorpi anti-E. hystolitica è utile nelle aree in cui l’infezione non è endemica.
M3.6 INFEZIONI ELMINTICHE

Le principali infezioni elmintiche sono quattro, di cui due verranno trattate in questo capitolo.
M3.6.1 Anisakis simplex

È un nematode con sezione trasversale circolare, la cui infezione viene trasmessa tramite l’ingestione di pesce
di acqua salata crudo o poco cotto (sgombro, sardine, tonno).
Il ciclo vitale inizia dalle uova non embrionate che vengono rilasciate dall’ospite definitivo all’interno
dell’acqua. Queste all’interno dell’ambiente
marino diventano uova embrionate e
successivamente si ha la schiusa delle stesse.
Vengono così rilasciate larve nell’ambiente
acquatico che possono essere ingerite da piccoli
crostacei, i quali a loro volta verranno mangiati da
molluschi, cefalopodi o pesci di piccole dimensioni
(a questo livello le larve dell’Anisakis sono già
presenti e infettanti all’interno dei loro tessuti).
Quest’ultimi saranno poi prede di mammiferi
marini che sono gli ospiti definitivi di Anisakis
simplex. Le larve di A. simplex vanno a maturare a
forme adulte a livello della mucosa gastrica dei
mammiferi marini. L’uomo può infettarsi
mangiando pesce di acqua salata infettato dalle
forme larvali, queste andranno poi a maturare a
livello della mucosa gastrica umana.
L’insediamento gastrico di questo elminta di circa 3
cm (che causa vomito e dolore intenso poche ore
dopo il pasto) può essere messo in evidenza da una
gastroscopia: a questo livello si può procedere con
la rimozione dell’elminta tramite l’utilizzo di pinze.
La migrazione di A. simplex a livello intestinale può determinare la formazione di granulomi eosinofili, dopo
due settimane dall’infestazione, che mimano il morbo di Chron. La diagnosi può avvenire anche tramite
esame istologico di prelievi bioptici con rilevazione della presenza dell’elminta.
[Prevenzione: cottura a 60° per almeno 10 minuti o abbattimento a -20° per almeno 24 ore.]
ECHINOCOCCUS GRANULOSUS à Questa infestazione è tipica del SNC; è necessario ricordare però che
questo forma delle cisti di grosse dimensioni fino a 10 cm a livello del fegato.
76
TAENIA SOLIUM E TAENIA SAGINATA à L’uomo è l’ospite definitivo, ossia colui che alberga le forme adulte
di notevoli dimensioni, anche diversi metri. Questa è un’infestazione tipica dell’intestino, ma è possibile
anche a carico del sistema nervoso centrale.
Nel caso della Taenia solium si manifesta una malattia detta cisticercosi in cui l’uomo non si comporta da
ospite definitivo bensì da ospite intermedio. In questa patologia l’uomo si contamina a seguito dell’ingestione
delle uova della Taenia, successivamente si formano delle cisti di dimensioni più piccole rispetto a quelle
dell’Echinococcus. Le cisti si formano a livello della cute, dell’occhio e altri visceri. La Taenia solium è l’unica
a dare la cisticercosi. Questo tipo di tenia non è presente sul territorio italiano, al contrario è presente la
Taenia saginata che determina teniasi intestinale.
M3.6.2 Diphyllobothrium latum

La difillobotriosi è un’altra infestazione elmintica data da DIPHYLLOBOTHRIUM LATUM (cestode), la
principale specie patogena per l’uomo. Questo elminta può assumere in forma adulta una dimensione
cospicua, tra i 3 e i 10 metri; può essere considerato l’analogo della tenia nel pesce di acqua dolce, non di
acqua salata come per l’Anisakis. L’infestazione da Diphyllobothrium avviene per via alimentare. È un elminta
segmentato: il segmento caudale può essere eliminato con le feci, con l’emissione delle uova solitamente
(non di proglottidi).
Il ciclo vitale di questo elminta è molto simile a quello dell’Anisakis: in questa infezione sia l’uomo che alcuni
mammiferi acquatici, uccelli e canidi rappresentano gli ospiti definitivi. Le cisti vengono rilasciate in acqua
dolce sotto forma di uova non embrionate, infatti l’embrione si sviluppa in acqua: da queste si sviluppa la
forma larvare detta coracidia, forma mobile dotata di ciglia, che viene predata dai crostacei. All’interno dei
crostacei si formano le larve procercoidi; pesci di piccole dimensioni si nutrono di questi crostacei e in questi
pesci si sviluppa una forma larvare più evoluta detta plerocercoide. Quest’ultima andrà poi a infettare pesci
di maggiori dimensioni, infestandone i tessuti: le forme larvali presenti nei tessuti sono quelle che vanno a
infestare l’uomo o altri predatori. A livello dell’intestino dell’uomo le forme larvali evolvono in forme adulte
diventando elminta segmentato.
Questo elminta è diffuso in zone con clima temperato: soprattutto in Europa dell’Est e Russia. Si pensa che
l’infestazione nell’uomo da parte di questo elminta sia largamente sottostimata in Italia: studi riportano
infestazione da Diphyllobothrium latum individuata nel pesce persico nei laghi italiani fino a una positività
del 30% nel lago di Como.
La diagnosi viene eseguita esaminando i campioni fecali e ricercando la presenza delle uova. Per la diagnosi
di specie si deve ricorrere a saggi di biologia molecolare che vengono svolti a partire da DNA estratto sia dalle
uova che dalle proglottidi.
77
M4. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DELL’APPARATO

CARDIOVASCOLARE
M4.1 INFEZIONI DEL CUORE

Le infezioni del cuore sono rilevanti dal punto di vista clinico, ma non particolarmente rilevanti dal punto di
vista epidemiologico (eccezion fatta per le endocarditi).
M4.1.1 Endocarditi
Le endocarditi sono infezioni del foglietto interno del cuore che interessano prevalentemente le valvole
cardiache, sane o alterate, e/o altre aree dell’endocardio. Si manifestano in soggetti con: preesistenti lesioni
cardiache (ad es. malattia reumatica), protesi valvolari, difetti congeniti, malattie valvolari degenerative
nell’anziano; tutte queste condizioni rappresentano fattori di rischio per l’insorgenza di un’infezione a livello
valvolare. Si parla principalmente di infezioni batteriche e fanno sempre seguito a una batteriemia almeno
transitoria. I principali agenti eziologici sono:
• Staphylococcus aureus: patogeno professionale che possiede meccanismi patogenetici (adesine) tali
da permettergli di colonizzare anche una valvola sana;
• batterî opportunistici: vanno a infettare delle valvole già soggette ad alterazioni anatomiche o
sostituite con protesi valvolari, che favoriscono la formazione di biofilm. Es. streptococchi viridanti,
facenti parte del microbiota del cavo orale, e batteri Gram- del gruppo HACEK, appartenenti
anch’essi al microbiota del cavo orale: Haemophilus influenzae, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella kingae (batterio
che è anche associato all’artrite infantile). Essi presentano scarsa patogenicità ma alta capacità di
aderire alla fibrina; sono normalmente presenti sulla cute e per questo davano frequentemente,
eccetto l’H. influenzae, endocardite nei soggetti che abusano di droghe per via endovenosa (poiché
chiaramente questa è una pratica non sterile in cui tramite l’iniezione veniva trasportato nel circolo
ematico tutto ciò che si trova sulla superficie cutanea).
Clinica
Spesso è una situazione associata a batteriemia continua e a un quadro di sepsi, quindi febbre, brivido,
cefalea, ipotensione, astenia e malessere. In più abbiamo l’alterazione delle valvole cardiache, con
conseguenti soffî, ed eventuali complicanze, come emboli settici (che partono dalle valvole colpite e causano
infezioni metastatiche) o insufficienza cardiaca. Esistono forme subacute a decorso lento e inizio subdolo
(febbricola, astenia), con in questo caso una batteriemia non continua.
M4.1.2 Miocarditi
Le miocarditi sono infezioni del foglietto medio del cuore, il muscolo cardiaco. Gli agenti eziologici
responsabili sono:
• virus (causa principale): Enterovirus (es. Coxsackievirus), Parvovirus B19, HHV6;
• batterî: Staphyloccous aureus, Corynebacterium diphteriae (in particolare la tossina);
• protozoi: Trypanosoma cruzii responsabile della malattia di Chagas, viene trasmesso attraverso un
artropodo vettore, una cimice ematofaga (bisogna prendere in considerazione anche trasfusioni,
trapianti e via madre-feto);
• elminti: Trichinella spiralis.
Trypanosoma cruzii
Il Trypanosoma cruzii possiede un ciclo vitale particolare: il protozoo dopo aver
infettato la cimice viene trasmesso come tripomastigota durante il pasto ematico del
vettore attraverso gli escrementi; l’entrata può avvenire attraverso le mucose o la
cute. Questa cimice si ciba anche di frutta, per cui una delle cause più frequenti ma
78
anche più difficili da identificare di

Malattia di Chagas è il consumo di
frutta, o peggio, succhi di frutta di
zone tropicali contaminati dal
Trypanosoma. Invece è più facile
identificare la causa se si è stati
punti dalla cimice, poiché appare
un rigonfiamento sulla pelle. A
livello della congiuntiva, una delle
mucose più permissive, si può
avere la comparsa di un edema
che prende il nome di segno di
Romaña, mentre a livello della
cute si possono creare delle lesioni
da grattamento a causa del
prurito, con soluzioni di continuità
che permettono al tripomastigota
di penetrare attraverso la cute e
invadere anche il sottocute. Una volta che si ha
l’entrata del protozoo all’interno dell’organismo,
possono essere infettate le cellule nel sito di
inoculo, anche dei macrofagi inizialmente, e si ha
la trasformazione dei tripomastigoti in
amastigoti, cellule in grado di moltiplicarsi per
scissione binaria, che si ritrasformeranno in
seguito alla fase di replicazione in tripomastigoti, con successiva lisi della cellula ospite e riversamento
all’interno del torrente ematico con diffusione a livello sistemico.
Mediante un esame microscopico si possono individuare nel circolo ematico i tripomastigoti, mentre
mediante un esame istologico si possono trovare le cellule amastigoti all’interno delle cellule miocardiche.
La Malattia di Chagas è una forma molto severa di tripanosomiasi. Il Chagas è molto frequente in Sudamerica,
soprattutto in Brasile e nell’area nord-amazzonica. Questa è una classica patologia di importazione: nelle
nostre aree non è presente la cimice ematofaga (poiché non sopravvive ai nostri climi) quindi non è possibile
la trasmissione autoctona.
La malattia di Chagas prevede due fasi:

Ø una FASE ACUTA, dove osserviamo miocardite nel 100% dei casi; essa è spesso asintomatica, ma è
possibile comunque riscontrare tachicardia e soffi cardiaci all’auscultazione. Può comportare morte
improvvisa proprio per il suo carattere acuto;
Ø una FASE CRONICA, che segue la fase acuta. È molto subdola poiché se la fase acuta è decorsa in
modo asintomatico, il paziente si ritrova con disturbi di conduzione, alterazioni della contrattilità e
cardiomiopatia dilatativa; queste sono tutte condizioni che nell’ambito cardiologico sono attribuibili
a decine di cause diverse e non è facile risalire al Chagas in un’area dove il Chagas solitamente non è
presente.
La fase acuta della malattia di Chagas si presenta nel 100% dei casi con miocardite, spesso asintomatica, ma
anche tachicardia, soffî cardiaci e talvolta morte improvvisa. La fase cronica si manifesta a livello cardiaco
con disturbi della conduzione, cardiomiopatia dilatativa, alterazioni della contrattilità, a livello di altri organi
si può avere megaesofago e megacolon.
Il motivo per cui questa patologia viene trattata è che, mentre la fase acuta dura al massimo qualche
settimana, la fase cronica ha una lunghissima durata, anche di molti anni. Bisogna quindi individuare quella
categoria di soggetti in cui è logico pensare al Chagas come causa di un quadro clinico cardiologico come
quello descritto sopra: tale categoria è quella degli immigrati. In Italia è presente una certa quota di immigrati
79
peruviani e su di loro è stato fatto uno studio epidemiologico di tipo sierologico che ha portato a scoprire che
molti di essi hanno gli anticorpi per il Chagas. In Italia quindi se ci si trova davanti un paziente peruviano con
quei sintomi è facile pensare subito al Chagas e sottoporlo ai necessari test diagnostici. Questo è possibile
perché l’Italia ha un flusso migratorio dal Sudamerica ragionevolmente basso. Ci sono invece paesi europei
come Spagna e Portogallo che hanno un flusso migratorio dal Sudamerica molto più consistente, legato
soprattutto ad una questione di ex-
colonie. È chiaro che in questi paesi
la sorveglianza è molto più
complicata. In Spagna si sono
verificati diversi casi di trapianto di
cuore proveniente da un immigrato
con il Chagas, quindi il ricevente ha
contratto il Chagas.
Questo pone dei problemi nel senso
che è molto importante individuare
i fattori di rischio, in modo da
essere in grado di riconoscere quei
casi in cui è necessario indagare per
una eventuale infezione da
Trypanosoma.
Trichinella spiralis
Le Trichinellae sono degli elminti che hanno dimensioni piuttosto ridotte: la
femmina può raggiungere i 4 mm di lunghezza, mentre il maschio è più piccolo,
lungo intorno a 1-2 mm; lo spessore è di 50 μm circa e la parte caudale contiene
gli organi sessuali. Si conoscono sette specie patogene di Trichinella: la più
importante dal punto di vista patogeno per l’uomo è la Trichinella spiralis, diffusa
in tutto il mondo. La trasmissione avviene mediante l’ingestione di carne cruda
o poco cotta di animali selvatici, che contiene gli embrioni in cisti muscolari di
Trichinella (è una zoonosi con trasmissione per via alimentare).
Le infezioni da Trichinella si possono definire rare anche se probabilmente sottostimate, dal 2011 al 2015 i
casi registrati sono stati:
*Nel 2016 5 nuovi casi; nel 2017 4 nuovi casi.
Nella tabella si fa riferimento nel 2015 all’epidemia di Genova che ha visto coinvolte 52 persone (34 adulti,
18 bambini) a seguito del cenone di Capodanno presso un agriturismo dove hanno consumato carpaccio di
“carne bovina”, probabilmente mista a carne di cinghiale selvatico, responsabile della trasmissione
dell’infezione. Il periodo di incubazione è stato di circa 20 giorni, 36 persone (34 adulti, 2 bambini) sono
risultate sierologicamente positive, di cui 4 ospedalizzate.
A livello mondiale l’incidenza annua è di 10.000 casi, con una mortalità del 2%. Nell’UE prima del 2008 si
avevano circa 800 casi all’anno, nel 2016 si è scesi a 200 casi, attualmente si sta registrando un calo. Nel 2017
ci sono stati 224 casi in 15 diversi stati UE, più del 70% dei casi si sono verificati in Bulgaria, Croazia e Romania.
L’incidenza globale si aggira intorno agli 0,03 casi/100.000 abitanti e la principale sorgente di infezione è il
consumo di carne “undercooked” di maiale di origine non controllata (non da allevamento) e di carne da
caccia, soprattutto cinghiale.
80
Il ciclo vitale della Trichinella è molto

semplice: l’infezione nell’uomo avviene
per via alimentare mediante ingestione
di carne contenti cisti, con all’interno
larve spiraliformi. A livello dello
stomaco, in seguito all’esposizione a
succhi gastrici e pepsina, si ha la
fuoriuscita della Trichinella dalla cisti
con invasione della mucosa intestinale
e sviluppo in forme adulte maschili e
femminili in 2-4 giorni.
Il maschio adulto muore dopo
l’accoppiamento in pochi giorni e viene
espulso con le feci, le forme adulte di
femmina, dopo essersi accoppiate,
sopravvivono per 4-16 settimane e
depositano fino a 1500 embrioni nella
mucosa della parete intestinale, che
sono così in grado di raggiungere il
torrente ematico e andare a costituire
cisti (dopo 6-8 settimane
dall’ingestione) all’interno della muscolatura striata, dove possono poi anche calcificare diventando molto
resistenti (possono persistere per diversi anni), e all’interno del cuore e del sistema nervoso centrale, dove
invece non si incistano e si degradano nel giro di un mese, essendo in questi distretti molto più labili, andando
più facilmente incontro a rottura.
A sinistra femmina adulta all’interno della mucosa

intestinale.
A destra larve spiraliformi che formano le cisti
nella muscolatura striata.
Ratti e roditori sono i primi responsabili del mantenimento dell’endemicità di questa infestazione. Gli animali
carnivori e onnivori, come orsi e cinghiali, si infestano nutrendosi dei roditori.
Le manifestazioni cliniche di trichinellosi possono essere:
• sintomi intestinali: diarrea, dolore addominale soprattutto nella fase che segue l’ingestione;
• segni muscolari di miosite: dolori e spasmi;
• segni cardiaci: tachicardia, alterazione del ritmo che si manifestano entro il primo mese;
81
• segni cerebrali: cefalea, sordità, vertigini entro il primo mese;

• segni sistemici: febbre persistente, eosinofilia tipica delle manifestazioni elmintiche.
M4.1.3 Pericarditi
Le pericarditi sono infezioni del pericardio, la membrana di rivestimento esterna. Le pericarditi spesso sono
dovute a complicazioni di infezioni polmonari che per contiguità diffondono al pericardio. Possono essere:
• pericarditi secche: sono le più frequenti, a eziologia virale e con scarso essudato [il pericardio viene
interessato per via ematica, tipico di Enterovirus con viremia, es. Echovirus e Coxsackievirus B];
• pericarditi essudative o purulente: a eziologia batterica, dovute a batterî che possono causare anche
infezioni delle vie respiratorie profonde: Staphyloccocus aureus, Streptoccocus pyogenes,
Streptococcus pneumoniae, Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae;
• pericarditi croniche: causate dal Mycobacterium tuberculosis quando si ha la riattivazione in un
paziente immunocompromesso (versamento emorragico, pericardite costrittiva);
• pericarditi fungine: da Histoplasma capsulatum, diverse forme di Aspergillus, Blastomyces,
Coccidioides, Candida;
• da parassiti: Echinococcus, amebe, Toxoplasma.
[Clinica: dolore toracico, difficoltà a respirare, tosse secca].
Le cause sono al 95% virali, il che dà una certa tranquillità al medico poiché non esistendo una terapia
specifica per ogni tipo di virus non è necessario individuare lo specifico agente eziologico: nella maggior parte
dei casi la situazione si risolve somministrando cortisone ed eseguendo una pericardiocentesi.
M4.1.4 Diagnosi di laboratorio

Endocarditi: emocoltura, a seconda dell’agente eziologico si possono avere delle sepsi continue o
intermittenti (Streptococchi viridanti, HACEK). Per alcuni patogeni a lenta crescita e poco aggressivi (ad es.
Streptococchi viridanti) è necessario allungare il tempo di emocoltura da 5 a 14 giorni.
Miocarditi (la diagnosi spesso è di tipo clinico) e pericarditi:
• ricerca diretta:
o biopsia miocardica (rara ed invasiva): è necessario valutare molto bene se sia opportuno
eseguirla (va sempre rapportata a quello che è possibile dare al paziente come informazione,
per esempio nel caso delle pericarditi virali è inutile eseguirla per ricercare il virus specifico
che l’ha originata dal momento che, a meno di specifiche esigenze cliniche, la terapia sarà
comunque quella cortisonica);
o liquido pericardico, in presenza di un versamento pericardico, per eseguire una coltura
(batteri, micobatteri, funghi): raramente è efficace perché nella maggior parte dei casi esso
è purulento e la diagnosi su materiale purulento è impossibile.
• ricerche sierologiche:
o IgG e IgM contro gli Enterovirus (Coxsackievirus B, Echovirus);
o anticorpi anti-Trichinella spiralis, anti-Trypanosoma cruzii.
Evoluzione della malattia di Chagas: dopo 1-2 settimane dall’infezione si ha la produzione delle IgM, che
scompaiono intorno all’8-10 settimana, e delle IgG, visibili un po’ più tardivamente, che perdurano per tutta
la vita.
M4.2 INFEZIONI DEL TORRENTE CIRCOLATORIO (BLOODSTREAM INFECTIONS – BSI)

Le infezioni del torrente circolatorio di rilevanza clinica sono causate principalmente da batterî e funghi
(quasi sempre di natura lievitiforme). Si tratta di infezioni che interessano un distretto sterile. Quando in un
distretto sterile è presente un germe, bisogna capire se questo è il responsabile del quadro clinico di cui
soffre il paziente oppure se si tratta di un reperto occasionale. Sono situazioni talvolta abbastanza complicate
dal punto di vista dell’interpretazione clinica del dato.
Le infezioni del circolo sono causa di un quadro clinico estremamente severo dal punto di vista prognostico:
la sepsi.
82
La sepsi non corrisponde alla batteriemia, infatti un paziente con emocoltura positiva non è detto che sviluppi
la sepsi. Si tratta di un quadro clinico di fallimento multiorgano, una cascata che inizia con la riduzione della
funzionalità di uno o più organi e che può evolvere verso lo shock settico.
Se un paziente presenta solamente batteriemia non si può sapere se questa evolverà in uno shock settico,
ciononostante nel caso in cui si presenti un paziente in pronto soccorso con febbre elevata, brivido ed
emocultura positiva, bisogna subito intervenire in maniera utile, poiché ha una fortissima probabilità di
andare verso lo shock.
Questa evoluzione da una sepsi iniziale a shock settico può impiegare meno di 24 h. Per intervenire abbiamo
a disposizione le cosiddette golden hours, 12 h circa da quando il paziente viene identificato come a rischio
di sviluppare sepsi e shock settico, alla effettiva manifestazione dello shock. Quindi in caso di batteriemia, se
interveniamo entro questo intervallo di tempo in maniera efficace con una terapia antibiotica, è molto
probabile che questa non evolva in shock.
In questa situazione è anche possibile tentare una terapia empirica, la quale però deve sempre essere
utilizzata con molta attenzione poiché non è priva di rischi; questi pazienti impiegano poco tempo a
sviluppare insufficienza renale. Se ad esempio viene somministrata una combinazione di 4 farmaci, fra cui la
vancomicina4 si sottopone il rene a un elevato rischio.
L’emocoltura è un esame che consente di individuare i microrganismi responsabili dell’infezione con ottima
affidabilità, in tempi rapidi e su un numero elevato di campioni: rappresenta dunque lo strumento più idoneo
alla gestione delle infezioni del torrente circolatorio. L’emocoltura deve essere eseguita secondo un
protocollo standardizzato che va rispettato per ottenere un risultato ottimale in termini di specificità e
sensibilità.
Le infezioni del torrente circolatorio possono essere classificate su base clinica in:
• batteriemie: se i batterî sono presenti in bassa carica; in genere il SI è in grado di eliminare le cellule
batteriche e le infezioni, spesso asintomatiche, si risolvono spontaneamente;
• setticemie: i batterî e le loro tossine sono presenti nel torrente ematico in quantità più consistenti.
Può essere provocata da diverse condizioni, in primis da focolai infettivi presenti in alcuni distretti
corporei (polmonite, artrite) che possono complicarsi e causare infezione del torrente ematico; altre
possibili cause sono endocardite, cateteri vascolari, manovre dentistiche o strumentali invasive. Una
possibile complicanza della setticemia è rappresentata dall’infezione di organi e tessuti (endocarditi,
artriti etc.), soprattutto in pazienti immunodepressi che rispondono in maniera difettiva alla carica
batterica;
• sepsi (sindrome da risposta infiammatoria sistemica): l’eccessiva presenza di batterî nel torrente
circolatorio genera una massiccia produzione sistemica di citochine infiammatorie e di mediatori
vasoattivi. A lungo andare questa condizione può tradursi in shock settico;
• shock settico: stato terminale della sepsi caratterizzato da disfunzione multiorgano e ipotensione.
Le infezioni del torrente circolatorio possono inoltre essere:

• transitorie: nel caso siano provocate da manovre strumentali invasive. Dipendono dalla popolazione,
dall’età e dallo stato di salute e rappresentano un fenomeno molto più frequente di quanto in realtà
si pensi. Queste infezioni possono essere sintomatiche o asintomatiche e si risolvono
spontaneamente dopo l’eliminazione dei batterî dal torrente circolatorio;
• intermittenti: nel caso di endocardite, che immette in modo intermittente degli emboli settici. Sono
causate dallo stesso microrganismo rilevato in maniera intermittente nel circolo ematico.
Tipicamente associata a infezioni circoscritte (ascessi), infezioni focali (polmonite, osteomielite),
ostruzioni ricorrenti;
• continue: nel caso di focolaio infettivo, sono date da una costante e massiccia presenza di batteri e
tossine nel sangue e sono potenziale causa di sepsi.
4
La vancomicina è impiegata per le infezioni da Gram+, in particolare Stafilococchi meticillino-resistenti. È un farmaco
nefrotossico, deve essere impiegato con cautela nei pazienti con ridotta funzionalità renale.
83
Quando si ha una infezione localizzata che evolve verso una situazione ascessuale, per esempio un ascesso
apicale in un dente, si instaura una risposta flogistica che può non riuscire a controllare la crescita batterica.
I batteri possono entrare in circolo ed essere controllati, ma finché non si risolve il focus infettivo questo
evento può ripresentarsi.
Ad esempio, un diverticolo colico è una possibile sorgente di batteriemia intermittente: quando la crescita
batterica arriva oltre una certa soglia può “scaricare” nel circolo e ciò può ripetersi finché non si interviene
sul diverticolo stesso.
I patogeni possono penetrare nel circolo in varî modi:

• rottura dell’integrità della cute o delle mucose (es. traumi o ustioni, ischemie);
• lesioni iatrogene: dopo manovre invasive (es. estrazione dentale, endoscopia...);
• per propagazione di processi infettivi da altre sedi. (es polmonite batterica da pneumococco, alcuni
casi di infezioni intestinali);
• infezioni proprie dei globuli rossi (classica quella da plasmodio della malaria), infezione delle cellule
ematiche e degli endotelî.
M4.2.1 Batteriemie
La presenza di batterî nel circolo è un fatto assolutamente anomalo, ma molto frequente e può essere
originato da una serie di condizioni patologiche e iatrogene che sono estremamente comuni oggi:
• endocardite batterica è data dalla presenza di una “vegetazione” in cui sono mescolati fibrina e batterî,
che si forma su una valvola cardiaca che ha un flusso non laminare. Se le valvole hanno un difetto di
stenosi o di insufficienza, il flusso tende a essere non laminare (ovviamente dipende da quanto è severo
il difetto valvolare) e di conseguenza aumenta la coagulabilità del sangue: può formarsi un deposito di
fibrina sulla valvola lesionata.
Questa vegetazione che all’inizio è sterile, viene spesso colonizzata dalla presenza di batterî provenienti
dal circolo, poiché risulta un terreno ottimale di attacco e quindi di crescita per i batterî stessi.
I batterî in molti casi hanno la capacità di crescere in biofilm (ad oggi la maggior parte delle infezioni
complicate sono causate da questo tipo di batterî): sono in grado di attaccarsi, specie su superfici
protesiche o anatomicamente danneggiate, e di crescere in una sorta di comunità batterica. Una
comunità batterica in biofilm è una colonia batterica che ha delle caratteristiche completamente
differenti dal batterio singolo isolato. Inoltre, esiste un fenomeno detto quorum sensing, un sistema di
comunicazione fra le cellule batteriche attraverso cui si scambiano informazioni relative all’ambiente e
riescono ad acquisire sistemi di resistenza ai farmaci antibiotici. Questa comunità batterica assomiglia
quasi a un organismo pluricellulare e si tratta quindi di una situazione più complicata da gestire.
• infezioni come polmoniti da pneumococco acquisite in comunità, dove dal 30% al 50% dei casi nelle
fasi iniziali sintomatologiche si verifica una fase batteriemica.
• materiali protesici come cateteri vascolari a permanenza, ad oggi sempre più utilizzati nelle terapie di
sostegno vitale. Questi implantable devices sono sistemi che vengono inseriti nel circolo del paziente
per una terapia cronica oppure per supporto nutrizionale e possono essere inseriti sia a livello periferico
che, più spesso, centrale. Inserire un catetere centrale non è una procedura banale, viene effettuata in
sala operatoria e può essere lasciato in sede a lungo, anche per 6 mesi.
In questa situazione si verificano due condizioni che favoriscono fortemente l’insorgenza di una
batteriemia:
o si verifica una perturbazione del flusso laminare dovuta alla presenza del catetere, per cui si
formano delle deposizioni di fibrina che possono venire colonizzate (vedi endocardite batterica);
o per quanto il catetere sia ben gestito dal punto di vista infermieristico, si tratta comunque di
un’apertura che interrompe l’integrità del sistema vascolare ed attraverso cui i batteri possono
penetrare.
84
• estrazioni dentarie sono manovre teoricamente a rischio, in quanto durante l’intervento di rimozione si
provoca un sanguinamento e le gengive sono tutto fuorché sterili. Infatti, molti pazienti hanno una
situazione gengivale abbastanza compromessa, con una flora batterica anaerobia piuttosto
problematica a livello del solco perigengivale; la paradontite nei casi più gravi può portare fino alla
caduta dei denti. A livello orale non c’è quindi una condizione di sterilità e la quantità di batterî presenti
dipende dal grado di salute e di igiene del paziente; praticando questo genere di manovre si apre questa
cavità fortemente contaminata verso il circolo.
• manovre strumentali invasive: ci sono molte altre manovre mediche che possono agire in modo
iatrogenico (es. endoscopia). Si tratta sempre di situazioni in cui si opera in un distretto ragionevolmente
non sterile, aprendolo sul circolo.
Per esempio, quando un soggetto di sesso maschile inizia a invecchiare, la prostata può dare qualche
problema ingrossandosi; una delle prassi diagnostiche più utilizzate per capire la natura
dell’ingrossamento è la biopsia prostatica transrettale, in cui passando attraverso il retto si raggiunge
la prostata con un ago, per prelevare del tessuto. Passando dal retto c’è un elevato rischio di aprire il
contenuto batterico della mucosa rettale nel circolo prostatico e causare batteriemia. Per questo le linee
guida internazionali indicano una profilassi antibiotica pre-intervento per ridurre questo rischio.
Le batteriemie rappresentano un problema consistente. Per esempio, nel laboratorio microbiologico della
Romagna si riscontrano circa 100 emoculture positive al giorno su un bacino di utenza di circa 1.125.000
abitanti: effettivamente non sono pochi, ma potrebbero essere molti di più, questo perché le batteriemie
solitamente sono un fenomeno transitorio. Per esempio, quando ci si lava i denti, se si spazzola con una certa
veemenza e si ha una gengivite che produce sanguinamento, si apre un distretto con un’elevata carica
microbica sul circolo. Si dovrebbe avere una sepsi tutte le volte che ciò succede, invece questo non accade
poiché la carica batterica infettante gioca un ruolo fondamentale.
La differenza fra una batteriemia a carattere transitorio, dove accidentalmente una quantità limitata di
batterî si ritrova nel sangue e non genera alcun problema, e una batteriemia continua, che può evolvere
potenzialmente verso un quadro di sepsi, dipende fondamentalmente dall’equilibrio fra la carica batterica
(e la “virulenza” dei batteri in circolo) e la capacità del S.I. di rimuoverli in fretta.
Bisogna considerare che in circolo i batterî trovano una condizione ottimale per la loro moltiplicazione, basti
pensare che nelle colture si utilizzano terreni come l’agar sangue.
M4.2.2 Sepsi
La sepsi è una disfunzione multiorgano evolutiva, secondaria a un evento infettivo. Lo stimolo infettivo
genera una risposta flogistica abnorme, che va oltre la necessità di bloccare l’infezione. Le batteriemie sono
sicuramente una fonte di sepsi, ma non sono l’unica: ci sono per esempio sepsi urinarie, sepsi secondarie da
polmonite.
Ogni anno circa 27 milioni di persone nel mondo sviluppano sepsi e, di questi, solo 19 milioni sopravvivono
(30% di mortalità) anche se, alcuni di essi presentano complicanze a lungo termine, come danni neurologici
permanenti a livello del SNC. Gli individui più frequentemente soggetti a rischio di decesso per sepsi sono
neonati, bambini sotto i 5 anni di età e anziani; inoltre, nei Paesi in via di sviluppo le donne gravide che
sviluppano sepsi possono morire durante il parto. In Europa ogni anno si registrano circa 1.200.000 casi di
sepsi e la mortalità è del 13%.
Agenti eziologici
Si tratta degli agenti eziologici che vengono più frequentemente identificati in Italia, poiché l’eziologia della
sepsi è fortemente variabile a seconda della collocazione geografica presa in esame.
Negli ultimi anni si è registrata una diminuzione delle sepsi causate da batteri Gram+, come Enterococcus
faecalis ed Enterococcus faecium, generalmente localizzati nel tratto intestinale o colonizzanti la zona ano-
genitale, e da MRSA (Stafilococchi aurei meticillino-resistenti). Si è invece registrato un aumento delle sepsi
85
da batteri Gram– (Klebsiella, Pseudomonas, E. coli, Acinetobacter), sia fermentanti che non fermentanti, e da
candida (C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei).
I focolai infettivi maggiormente responsabili delle infezioni del torrente ematico sono:
• infezioni del tratto respiratorio (35% dei casi di sepsi);
• infezioni urinarie (25%);
• infezioni gastro-intestinali (11%), ad esempio le infezioni da Salmonella typhi e S. paratyphi;
• infezioni cutanee (11%), ad esempio le infezioni profonde della cute da parte di Streptococcus
pyogenes o Staphylococcus aureus;
• infezioni dei tessuti molli (11%).
Per ridurre la mortalità legata a queste infezioni è fondamentale avviare tempestivamente una terapia, anche
empirica: diversi studi hanno dimostrato che, se l’avvio della terapia avviene entro le 24-48h dall’insorgenza
dell’episodio infettivo, si ha una riduzione della letalità pari al 20-30%.
Le graft infections da Candida sono particolarmente consistenti in due popolazioni:
o immunodepressi, essendo la Candida un normale colonizzante di vari distretti corporei (cavo orale,
mucosa vaginale, mucosa intestinale) in caso di un deficit del S.I. può espandersi;
o pazienti sottoposti a interventi chirurgici addominali fortemente demolitivi: per esempio, in caso di
resezione colica si espone il paziente a un discreto rischio di sviluppare candidemia.
Le infezioni del tratto respiratorio rappresentano la causa più comune di sepsi e a seguire le infezioni di
origine urinaria, gastro-intestinali, cutanee e dei tessuti molli.
L’avvio tempestivo di una terapia antibiotica mirata (entro le golden hours 12-24h) riduce la letalità del 20-
30%, quando la letalità dello shock settico è del 70%, quindi una mortalità piuttosto consistente. Perciò
diventa fondamentale intervenire tempestivamente.
Ricapitolando, il paziente post-chirurgico, immunodepresso, anziano, con comorbidità varie ha una discreta
probabilità di sviluppare una batteriemia e di evolvere verso lo shock.
Principali indicatori di sepsi o batteriemia

I principali indicatori di sepsi sono:
• aumento della temperatura corporea;
• focolai di infezione: polmonite o cistite accompagnata da urosepsi (ad esempio da E. coli) che dalla
vescica può passare al tessuto renale e generare successivamente sepsi a livello del torrente ematico;
• aumento della frequenza cardiaca e della frequenza respiratoria;
• diminuzione della pressione sanguigna;
• brividi;
• alterazione del numero di globuli bianchi;
• stato confusionale, soprattutto quando dalla sepsi si passa allo shock settico;
• markers di flogosi: procalcitonina, PCR e lattati. A seconda della quantità della procalcitonina a livello
ematico sono stati definiti degli intervalli di rischio di sepsi o shock settico:
o rischio lieve se il valore è < 0,5;
o rischio moderato se il valore è compreso tra 0,5 e 2; o Rischio elevato se il valore è compreso
tra 2 e 10;
o probabile sepsi severa se il valore è > 10.
Patogenesi della sepsi

I PAMPs, pattern molecolari associati ai patogeni in maniera aspecifica:
• Gram– dotato di LPS à TLR4;
• Gram+ dotato di peptidoglicano à TLR2;
• funghi dotati di mannani e il plasmodio della malaria interagisce coi TLR2;
• i virus attivano gli stessi recettori TLR2 e 4.
86
L’attivazione dell’immunità innata è quindi correlata alla presenza di un patogeno in generale (aspecifica) e
ciò determina un’eccessiva risposta dell’immunità innata (monociti e neutrofili), con produzione di citochine
pro-infiammatorie e fattori vasoattivi, che attivano l’endotelio e ne aumentano la permeabilità, tra cui TNFα,
IL-1β, IL-8. In questa enorme attivazione immunitaria si attivano anche il sistema del complemento e della
coagulazione. Questa risposta eccessiva dura per un po’ e poi si esaurisce e nelle fasi finali e tardive di sepsi
abbiamo un esaurimento, un crollo della RI dell’ospite. Questo meccanismo è importante che venga bloccato
presto con una diagnosi precoce; se non trattata la sepsi procede:
• produzione di fattori vasoattivi;
• aumentata permeabilità dei vasi sanguigni sistemici, non in modalità localizzata;
• alterata coagulazione, formazione di microtrombi;
• coagulazione intravasale disseminata (CID);
• si ha extravasazione, dai capillari sanguigni, passa meno sangue;
• si può avere ipoperfusione d’organo;
• mancata ossigenazione;
• disfunzione multiorgano, in fase molto tardiva, spesso mortale.
Il passaggio da una fase all’altra è rapido e per ogni ora persa, con un ritardo della terapia antibiotica
appropriata, si ha un aumento di mortalità dell’8%.
La sepsi è un’emergenza microbiologica, uno dei pochi casi in cui il microbiologo deve sbrigarsi in maniera
urgentissima.
Presenta quasi sempre sintomi aspecifici (e per questo è fondamentale la diagnosi tramite emocoltura); solo
in un caso si hanno segni quasi patognomonici: la batteriemia causata da Neisseria meningitidis nella fase
invasiva della sua infezione à causa la presenza di petecchie diffuse nel corpo (purpura fulminans), delle
emorragie cutanee, delle piccole chiazze, macchie puntiformi di colore rosso vivo. Si parla di un segno clinico
molto importante che viene riportato al laboratorio di modo che possa cercare la Neisseria.
Diagnosi
Il gold standard per effettuare la diagnosi di sepsi è l’emocoltura. È un test in cui si impiegano diversi flaconi
che contengono brodo eugonico, cioè un terreno liquido in cui teoricamente qualsiasi germe dovrebbe
riuscire a crescere. Qualunque germe che venga isolato
dal sangue di un paziente che ha febbre con brivido è
potenzialmente il patogeno.
Al fine di ottimizzare la resa in termini di sensibilità del
test, i flaconi sono leggermente diversi. Ci sono flaconi
che sostengono meglio la crescita dei batterî anaerobî
(non significa che non riescano a crescerci gli aerobî,
specie se presenti in elevata carica), altri per batterî
aerobî e alcuni flaconi dedicati alla crescita della Candida,
utili quando si ha un sospetto diagnostico di candidemia.
I principali tipi di flaconi sono:
• flaconi standard (8-10 mL di sangue): sono i flaconi più utilizzati. In particolare, poiché non si conosce
l’agente eziologico dell’infezione, a ogni prelievo il sangue deve essere ripartito equamente in flaconi
standard per batterî aerobi e flaconi standard per batterî anaerobi. L’infezione può essere causata
da batterî aerobi o anaerobi, che crescono selettivamente in uno dei due flaconi, o da batterî aerobi-
anaerobi facoltativi che crescono in entrambi;
• flaconi pediatrici (1-3 mL di sangue): permettono la crescita di tutti i tipi di batteri;
• flacone per i micobatterî;
• flaconi plus: contengono resine per inattivare i farmaci e vengono utilizzati in caso sia già stata
effettuata una terapia empirica.
Le emocolture vanno eseguite il prima possibile e prima della terapia empirica, così da poter raccogliere e
isolare la maggior quantità possibile di microrganismi. La terapia empirica si effettua prima
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dell’identificazione dell’agente eziologico e si basa su dati statistici locali di sorveglianza microbiologica, che
permettono di disporre di una panoramica generale dei principali microorganismi identificati nei materiali
patologici provenienti dai varî reparti ospedalieri. Ad esempio, se l’agente eziologico del 20% delle setticemie
in un reparto di terapia intensiva è Klebsiella pneumoniae, la terapia empirica effettuata è mirata contro tale
batterio: in questo caso vengono somministrati inizialmente carbapenemi e solo successivamente, se ad
esempio l’antibiogramma mette in evidenza la presenza di un ceppo di Klebsiella pneumoniae CPE (dotata di
carbapenemasi e resistente ai carbapenemi), vengono somministrati farmaci più efficaci, di livello superiore
o inferiore a quelli iniziali.
Per aumentare la sensibilità del saggio è preferibile effettuare più prelievi simultaneamente o distanziati di
5-15 minuti l’uno dall’altro: la sensibilità è del 65-80% se si effettua un prelievo, dell’80-88% se si effettuano
due prelievi e raggiunge valori di circa il 96-99% con tre prelievi; dunque, pur essendo sufficienti anche solo
due prelievi, è preferibile effettuarne tre. Inoltre, in presenza di cateteri vascolari è opportuno eseguire un
prelievo da catetere e un prelievo periferico. Poiché la presenza di febbre non è sempre correlata alla
batteriemia, ma tale sintomo spesso compare nella fase di risposta ai microrganismi (dunque quando la carica
batterica è più bassa di quella riscontrabile prima del picco febbrile), è consigliato effettuare il prelievo prima
del picco febbrile e non in concomitanza di questo. Effettuare più prelievi è utile anche per distinguere un
batterio contaminante, come uno stafilococco coagulasi negativo da un batterio patogeno, al fine di
prescrivere la terapia più adeguata. Se in un unico campione di sangue periferico vengono isolati stafilococchi
coagulasi negativi, essendo questi parte del microbiota cutaneo e avendo scarso potere patogeno, la loro
presenza nel campione può essere dovuta a contaminazione e non necessariamente a patologia: lo
stafilococco coagulasi negativo individuato in un solo prelievo da vena periferica viene definito
“contaminante” e non viene effettuato l’antibiogramma. La presenza di questo batterio ha significato
patologico se viene rilevata con più prelievi (tre, di cui uno da catetere) effettuati rispettando le norme
igieniche.
Altri batterî contaminanti cutanei a scarso potere patogeno sono: Bacillus spp., Corynebacterium spp.,
Propionibacterium spp., Aerococcus spp., Micrococcus spp.
In presenza di Stafilococchi coagulasi negativi nel sangue di un solo prelievo, viene refertato che la presenza
di questi è clinicamente rilevante in pazienti portatori di cateteri o altri device. Infatti, il catetere vascolare
rappresenta uno dei principali fattori di rischio per le infezioni del torrente circolatorio, anche nel caso di
microrganismi scarsamente patogeni (come gli Stafilococchi coagulasi negativi): questi batterî generano un
biofilm nei cateteri e sono poi in grado di colonizzare il torrente circolatorio. Se la colonizzazione viene subito
riconosciuta, il catetere viene bonificato o cambiato. I soggetti principalmente a rischio sono pazienti
debilitati, come degenti in terapia intensiva o immunocompromessi.
Nel referto è indicato anche il tempo di positivizzazione: effettuando due prelievi, uno da vena periferica e
uno da catetere, se il tempo di positivizzazione per il campione prelevato da catetere è più breve di circa due
ore è molto probabile che si tratti di setticemia CVC-correlata (correlata a catetere venoso centrale).
Il tempo di positivizzazione del flacone è un indice della carica batterica e del ritmo di moltiplicazione à un
tempo di positivizzazione breve è un indice prognostico negativo.
Fino a qualche anno fa i prelievi venivano effettuati durante il picco febbrile, in quanto questo rappresenta
una reazione immediata alla presenza del microrganismo in circolo. In realtà, la febbre non è correlata in
modo significativo alla presenza di batteriemia.
Il fattore che limita maggiormente la sensibilità dell’emocoltura è il volume di sangue prelevato. Per esempio,
nelle batteriemie da Gram- in genere sono presenti 10 c.f.u/mL di sangue, quindi se si preleva 1 mL si avranno
10 c.f.u, se si prelevano 2 mL 20 batteriî e così via (solitamente un flacone contiene 10-15 mL). Al giorno
d’oggi i sistemi di emocoltura hanno un sensore che misura la quantità di sangue che viene inserita, se questa
è eccessiva o insufficiente viene emesso un rumore. Se la quantità di sangue è troppo poca allora la sensibilità
sarà ridotta.
Un’emocoltura viene considerata positiva se il sistema determina la presenza di anidride carbonica, infatti
sul fondo dei flaconi utilizzati è presente una membrana semipermeabile che rileva la quantità di CO2
prodotta e diventa rossa. Lo spettrofotometro dell’incubatrice percepisce il cambiamento di colore ed
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emette un suono. Se il volume ematico prelevato è eccessivo, oltre a contenere molti batterî sono presenti
anche molti globuli bianchi (è un’infezione, quindi la conta dei globuli bianchi aumenta molto, arrivando
anche a 30 mila per mL) i quali producono CO2, che viene rilevata dall’incubatrice ed erroneamente
interpretata come indice di attività batterica.
Fino a qualche anno fa molti testi dicevano di fare due set di prelievi (quattro flaconi: due aerobi e due
anaerobi) a distanza di 20-30 minuti. In realtà non è mai stato dimostrato che le batteriemie siano
intermittenti. È infatti più opportuno l’approccio single strategy, il quale consiste nell’effettuare due o tre
set di prelievi ravvicinati.
Perché vengono fatti più prelievi?
• Per aumentare la sensibilità: la sensibilità aumenta infatti dal 65-80% con un prelievo all’ 80-88% con
due prelievi e al 96-99% con tre prelievi; se viene rilevato un E. coli in una provetta su sei, è
improbabile che la sua presenza sia dovuta alla scarsa igiene dell’infermiere che ha fatto il prelievo.
In questo caso quindi la presenza di più campioni permette di mettere in evidenza il patogeno anche
se ha una carica molto bassa.
• Per differenziare un contaminante da un reale patogeno: se viene rilevato S. epidermidis (normale
componente del microbiota cutaneo) solo in uno o due flaconi su sei, probabilmente si tratta di un
falso positivo, dovuto a una non corretta disinfezione della cute prima del prelievo. Effettuando un
prelievo da un catetere centrale a permanenza, se sul device è presente una vegetazione batterica
(per esempio una patina di biofilm con stafilococchi) questa viene rilevata nelle analisi, ma non è
responsabile della batteriemia. Bisogna quindi interpretare i risultati dell’emocoltura dal punto di
vista clinico: se il paziente non ha device medici, non è immunodepresso e vengono trovati coagulasi
negativi in circolo, perché possano essere ritenuti responsabili della sepsi almeno il 50% dei flaconi
devono essere positivi (è improbabile che tutti i flaconi siano contaminati). Nel caso di prelievi fatti
a distanza di tempo, è più probabile che siano entrambi contaminati (vengono fatti due “buchi” nel
paziente): con prelievi ravvicinati invece, può essere contaminato dalla cute non disinfettata solo il
primo flacone.
Si stima che la quota “non evitabile” di falsi positivi sia attorno al 2% (prevalentemente costituita da
STAFILOCOCCHI COAGULASI NEGATIVI, BACILLUS spp, CORYNEBACTERIUM spp,
PROPIONIBACTERIUM spp, AEROCOCCUS spp, MICROCOCCUS spp).
Di seguito sono elencate le norme da seguire durante un prelievo per ridurre al minimo la contaminazione
ematica da parte del microbiota cutaneo.
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Per l’emocoltura vengono prelevati, nel caso di un paziente con peso > 36.3 kg, circa 20 mL di sangue per set
(flacone aerobio+anaerobio), mentre per i pazienti pediatrici, a seconda del peso corporeo, vengono
prelevati da 2 a 4 mL di sangue per set, si possono infatti utilizzare i flaconi pediatrici.
La conservazione del flacone è molto importante e questo dovrebbe essere incubato immediatamente per
mantenere costante la temperatura a 37°C. Qualora non fosse possibile incubare immediatamente il flacone,
è importante mantenere i campioni a temperatura ambiente, mai refrigerarli (ciò potrebbe infatti causare la
morte di moltissimi batterî, compromettendo l’analisi del campione, rendendo il tempo di positivizzazione
molto più lungo). I batterî conservati a temperatura ambiente continuano a moltiplicarsi e, per evitare il
rischio di non rilevare la positività nonostante la presenza di batterî, il flacone deve necessariamente essere
posto all’interno dell’incubatore prima della fase di plateau. Sul fondo delle cellette dell’incubatore sono
infatti presenti dei detector in grado di rilevare il segnale fluorescente proveniente dal fondo dei flaconi: il
segnale viene attivato dalla variazione del pH all’interno del flacone, determinata dalla produzione di CO2
dovuta al metabolismo batterico. La registrazione del segnale fluorescente emette un allarme, dopo il quale
il flacone viene rimosso dall’incubatore e sottoposto al percorso diagnostico microbiologico. Il tempo che
intercorre tra l’inserimento del flacone nello strumento e il momento in cui viene emesso il segnale
dall’allarme è definito tempo di positivizzazione, fondamentale per valutare in maniera semi-quantitativa la
carica batterica: maggiore è la carica batterica, più breve è questo tempo. Il ritmo replicativo di un batterio
influisce sul tempo di positivizzazione: vi sono batterî con ritmo replicativo più accelerato di altri e in genere
i batterî Gram– replicano più rapidamente dei batterî Gram+. Il flacone deve rimanere all’interno
dell’incubatore finché non viene registrato il segnale fluorescente e, se tale segnale non dovesse comparire
entro 5 giorni, i campioni verrebbero rimossi. La maggior parte delle emocolture si positivizza infatti in
24/48h, l’unica eccezione è rappresentata nel caso di endocarditi, spesso causate da batterî come
streptococchi viridanti presenti in bassa carica e caratterizzati da una fitness replicativa lenta, in tal caso si
attende fino a circa 10/14 giorni (lo stesso vale nel caso di alcune infezioni del sangue).
Percorso diagnostico
La diagnosi prevede innanzitutto il prelievo di un’aliquota di sangue dal flacone dell’incubatore per effettuare
l’esame microscopico, che fornisce in tempi brevissimi alcune informazioni sul tipo di microrganismo che sta
causando l’infezione. Osservare ad esempio al microscopio se il batterio interessato sia Gram– o Gram+
permette di indirizzare la terapia empirica sull’utilizzo di determinati farmaci piuttosto che altri; inoltre, in
caso di cocchi Gram+ è possibile notare la disposizione a catenelle (streptococchi) o a grappoli (stafilococchi),
oppure rilevare la presenza di infezioni miste (più rare) con bacilli Gram– e cocchi Gram+. L’osservazione al
microscopio ci permette di riconoscere anche la presenza di blastospore di lievito e, in tal caso, indirizzare il
paziente verso una terapia antifungina. Al fine di ottenere queste informazioni è necessario osservare il
campione dopo l’incubazione e non il campione di partenza: infatti, l’incubazione permette di ottenere un
campione con un’alta densità di cellule batteriche osservabili al microscopio.
Parallelamente all’esame microscopico viene eseguito l’esame colturale in cui i campioni vengono posti
principalmente su una piastra di agar sangue ed eventualmente, se fosse stata rilevata la presenza di lieviti,
su terreni specifici per questi ultimi. Questo esame ha lo scopo di distinguere un’infezione mista da
un’infezione singola e di identificare la precisa specie batterica che la causa. Una volta ottenuta la colonia è
possibile analizzarla e procedere con:
• l’identificazione della specie: l’esame più semplice per l’identificazione della specie è la
spettrometria di massa MALDI-TOF. Per questo esame viene preparato un piastrino metallico con
spot prestabiliti in cui vengono poste le cellule batteriche; si aggiunge poi una matrice liquida che
uccide i batterî e consente la ionizzazione della cellula; si inserisce la piastra all’interno di uno
spettrometro di massa che colpisce i batterî, rompendo la membrana e liberando le proteine cariche
positivamente; sottoponendo la piastra a un campo elettrico, le proteine cariche positivamente
migrano verso il polo negativo, con tempi differenti in base alla massa. Si ottiene così uno spettro di
massa caratteristico per ogni specie batterica, che viene confrontato con un database per identificare
la specie. La spettrometria di massa nel caso della Klebsiella pneumoniae è inoltre in grado di rilevare
anche un picco proteico che indica la resistenza ai carbapenemi legata al gene KPC.
90
• l’antibiogramma, utile al fine di scegliere la

terapia maggiormente efficace nei confronti di
quel batterio e sostituire la terapia empirica con
una terapia mirata.
Parallelamente all’esame colturale (che viene sempre
eseguito), per rendere l’iter diagnostico ancora più
rapido, si può bypassare l’identificazione attraverso la
crescita della colonia e identificare la specie a partire dalle
cellule batteriche presenti nel campione di sangue
ottenute per centrifugazione, guadagnando in questo
modo diverse ore. Su questi stessi batterî è possibile
inoltre eseguire l’antibiogramma, molto utile soprattutto
per quanto riguarda i batteri Gram+ che hanno tempi di
replicazione più lunghi e impiegano diverso tempo per
formare una colonia.
L’antibiogramma viene eseguito da strumenti
automatizzati che forniscono, saggiando in vitro, una
concentrazione standard di microrganismi con una serie
di diluizioni scalari di antibiotico, informazioni sul valore
della minima concentrazione in grado di inibire la crescita
del batterio (MIC).
Test molecolari
In presenza di infezioni determinate da microrganismi il cui isolamento o la coltura in vitro con le metodiche
classiche richiedono tempi troppo prolungati (ad esempio infezioni miste) è possibile ricorrere ai saggi
molecolari eseguiti a partire da emocoltura o direttamente dal campione di sangue. A partire da emocoltura
positiva sono disponibili pannelli sindromici, test che permettono la rilevazione di un’ampia gamma di
patogeni contemporaneamente; tale test ha durata di circa 45 minuti e permette di definire sia i ceppi
infettanti che i meccanismi di resistenza. Inoltre, vi è il test FISH che, oltre a identificare la specie, è anche in
grado di definire il valore della MIC. Altri test, eseguiti direttamente a partire dai campioni di sangue,
permettono di anticipare la diagnosi ma sono in grado di determinare esclusivamente la specie infettante
(es. PCR real time in grado di rilevare e identificare più di 40 specie di patogeni batterici e fungini).
Batterî difficili da coltivare

Vi sono batterî che rendono ostico il percorso diagnostico da emocoltura, in tal caso per poterli identificare
è necessario utilizzare test molecolari o colture effettuate su terreni molto ricchi (come agar cioccolato) che
consentano la crescita di batteri esigenti.
I principali batterî difficili da coltivare sono:
• Abiotrophia e Granulicatella (agar cioccolato): varianti nutrizionali degli streptococchi: responsabili
di endocarditi;
• gruppo HACEK, responsabili di endocardite: può essere utile prolungare i tempi di incubazione oltre
i 5 giorni;
• Capnocitophaga canimorsus: il microorganismo cresce in ambiente microaerofilo su agar cioccolato
ed è agente eziologico di una zoonosi che può causare gravi sepsi in pazienti immunocompromessi.
M4.2.3 Candidemia
Le candidemie sono infezioni caratterizzate da mortalità particolarmente elevata (può raggiungere anche il
40%) e i soggetti maggiormente a rischio sono pazienti ricoverati in terapia intensiva, portatori di device
vascolari, pazienti immunodepressi, diabetici, pazienti sottoposti ad emodialisi, neonati pretermine e chi fa
uso di droghe per via endovenosa.
Le principali specie di candida isolate a livello europeo sono la Candida albicans (70% delle infezioni da
Candida), la C. glabrata, la C. tropicalis, la C. parapsilosis e la C. krusei.
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Nell’immagine viene messa in evidenza la crescita di

diverse specie di candida su un terreno cromogeno:
in base al colore che la colonia assume sul terreno è
possibile identificare la specie infettante.
L’identificazione può risultare difficile tra le varie
specie che colorano di rosa il terreno, è dunque
fondamentale eseguire spettrometria di massa
MALDI-TOF.
Un aspetto importante nelle infezioni fungine è la
resistenza ai farmaci, in particolare al fluconazolo
che è il primo farmaco somministrato nella terapia
effettuata in caso di infezione da lieviti. Il tasso di
resistenza è particolarmente elevato per alcune
specie (78% per la krusei, 15% per la glabrata,
quest’ultima molto resistente anche al
voriconazolo), è dunque necessario valutare la resistenza a tale farmaco ed eventualmente procedere con
una terapia alternativa, es. terapia empirica con echinocandine.
La mortalità associata alle candidemie è molto elevata e un dato allarmante è rappresentato dal fatto che il
50% delle infezioni non vengano rilevate dalle emocolture.
Possono quindi essere effettuati dei test alternativi, come la risonanza magnetica miniaturizzata, effettuata
su campione ematico primario e in grado di evidenziare, con una sensibilità del 90%, le principali specie di
candida in un tempo estremamente ridotto (3/5h); questa metodica è però molto costosa e viene utilizzata
soltanto in casi selezionati. Un’alternativa a questo tipo di test è la PCR real-time che permette anche di
valutare la resistenza al fluconazolo.
Candida auris
La Candida auris è una specie emergente di Candida, isolata per la prima volta nel 2009 nell’orecchio di un
paziente in Giappone. Risulta molto importante dal punto di vista clinico per la resistenza della maggior parte
dei suoi ceppi al fluconazolo e per la velocità con cui questi sono in grado di sviluppare resistenza anche alle
echinocandine, a cui sono inizialmente sensibili. Inoltre, tale Candida è particolarmente difficile da
identificare (anche se sia la spettrometria di massa che la PCR sono in grado di rilevarla) e diffonde in maniera
rapidissima negli ambienti ospedalieri, contaminando le mani degli operatori e le superfici, motivo per cui
risulta fondamentale il rispetto delle norme igieniche in ambiente sanitario. I primi casi in Europa sono stati
registrati nel 2013, mentre il primo
caso in Italia è stato registrato nel
2019 a Genova.
Gli isolati di C. auris sono quasi tutti
resistenti al fluconazolo e un terzo
degli isolati sono resistenti ad
amfotericina B. La maggior parte
sono sensibili alle echinocandine,
ma possono sviluppare resistenza al
trattamento.
92
M5. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DEL SISTEMA NERVOSO

Infezioni del SNC: meningiti, encefaliti, meningoencefaliti, ascessi cerebrali, mieliti.

Il SNC è generalmente sterile, ma possono essere presenti virus latenti (Herpesvirus) integrati nelle cellule
dell’ospite anche se non si ha un’infezione in atto. È protetto da:
• scatola cranica e vertebre;
• meningi;
• barriera emato-encefalica (BEE): barriera principale che impedisce l’ingresso di patogeni, tossine e
cellule del sistema immunitario. Le cellule dei capillari di questo distretto hanno tight junctions molto
strette che bloccano il passaggio paracellulare; a questo si aggiungono anche gli astrociti che formano
delle estroflessioni protettive attorno ai vasi sanguigni. Il risultato è quindi una barriera meccanica
che i patogeni devono riuscire a “danneggiare” per poter penetrare e se ciò accade è un grosso
problema, perché il SNC è un sito “immuno-privilegiato”, permettendo ai patogeni di scatenare
infezioni severe.
Le infezioni del sistema nervoso centrale vengono percepite, soprattutto la meningite, come urgenza
microbiologica. Spesso siamo di fronte a un paziente giovane, che si è recato in pronto soccorso con febbre
molto alta, rigidità nucale, fotofobia, poco orientato nel tempo e nello spazio; insomma è un paziente
instabile, quindi a cui dare la precedenza perché può evolvere in maniera rapida e imprevista. Questo tipo di
paziente va prima di tutto stabilizzato, poi si può cominciare con il trattamento specifico.
Di fronte a un paziente così preoccupante, si ha la concezione che la diagnosi di laboratorio sia un’urgenza
assoluta e che da essa dipenda l’azione del clinico. In realtà non è così, perché per la meningite esistono linee
guida ben definite, protocolli specifici da attuare subito, anche senza la diagnosi di laboratorio.
La diagnosi eziologica è comunque necessaria perché:
- le linee guida sono una serie di indicazioni, ma non hanno valore assoluto, non sono valide in tutte le
occasioni: la diagnosi di laboratorio conferma la validità o meno delle linee guida (questa comunque non
è un’urgenza perché si presuppone che nel frattempo si sia comunque già stabilizzato il paziente);
- ha un valore epidemiologico;
- permette di capire se si è di fronte a un’infezione che ha la possibilità di una diffusione secondaria, dal
momento che non tutte le meningiti sono fortemente diffusive; infatti la meningite da pneumococco non
dà casi secondarî (i contatti del soggetto infetto non devono fare una profilassi antibiotica), mentre nel
caso di una meningite da meningococco, che è altamente diffusivo, si è di fronte a un problema di sanità
pubblica (è necessario fare la profilassi antibiotica a tutti coloro che si trovano al pronto soccorso ed è
necessario tracciare tutti i contatti del soggetto infetto nelle ultime 48h) e quindi in questo caso è
giustificata l’urgenza diagnostica, anche perché l’efficacia della profilassi antibiotica è tempo-
dipendente.
M5.1 VIE DI INFEZIONE

Le vie di ingresso dei microrganismi nel SNC sono:
• via ematica: è la più frequente, nel sangue i patogeni circolano:
o liberi [utilizzato da Neisseria meningitidis, pneumococco, Haemophilus influenzae, che
sembra danneggino le tight junctions, e da Trypanosoma brucei, che tramite il flagello
penetra fisicamente nel SNC];
o all’interno di globuli bianchi [meccanismo a cavallo di Troia, utilizzato da HIV, virus del
morbillo, Toxoplasma gondii, Listeria monocytogenes];
93
o all’interno di globuli rossi

(Plasmodium falciparum);
• via intranervosa: percorrendo in via
retrograda gli assoni dei neuroni (ad
es. virus della rabbia, HSV);
• per contiguità (ad es. Streptococcus
pneumoniae nei casi di otite media);
• via traumatica, in cui si entra in
contatto diretto con una superficie
esterna contaminata;
• via olfattiva: viene utilizzata da alcuni
microrganismi, tra cui il virus del
morbillo, Varicella zoster virus,
Streptococcus pneumoniae, Naegleria
fowleri. Questi patogeni passano
attraverso la lamina cribrosa dell’etmoide ed entrano all’interno del bulbo olfattivo, essendo così in
grado di raggiungere il SNC.
M5.2 CLASSIFICAZIONE DELLE MENINGITI

Come tutte le classificazioni, ha un limite, ovvero non è sempre possibile inquadrare tutti i patogeni nella
categoria giusta. Le meningiti possono quindi, in linea generale essere classificate in base:
Ø alla modalità di insorgenza:
1. acute
2. sub-acute
3. croniche
(per essere in grado di distinguere le forme sub-acute da quelle croniche bisogna essere dei
neurologi molto esperti, quindi questa modalità di classificazione non è semplice)
Ø all’eziologia:
1. virali
2. batteriche
3. micotiche
4. protozoarie
5. elmintiche
Ø alle caratteristiche macroscopiche del liquido cerebrospinale:
1. forme a liquor limpido
2. forme a liquor torbido
Viene prelevato il liquor del paziente (sempre al di sotto di L5) e viene messo in una sorta di tubo,
poi viene osservato a occhio nudo: limpido vuol dire completamente trasparente, vuol dire che ci si
può vedere attraverso senza nessun ostacolo; torbido vuol dire che non si vede bene attraverso.
È molto importante sottolineare che sia la limpidezza che la torbidità possono essere accompagnate
da colorazioni, magari dovute a piccole emorragie o a terapie farmacologiche che conferiscono al
liquor xantocromia (colorazione giallastra), ma questo non influisce sulla categorizzazione del liquor
in limpido o torbido.
L’unico fattore influente è la risposta flogistica: un liquor diventa torbido solo se in esso ricadono
polimorfonucleati neutrofili (le cellule coinvolte nella risposta flogistica), altrimenti è limpido.
Le infezioni che innescano una risposta neutrofila e che quindi danno torbidità al liquor sono le
infezioni da batteri piogenici.
94
Le infezioni virali, che invece inducono una risposta di tipo linfocitario-macrofagica, presentano il
liquor limpido, infatti nonostante ci sia cellularità è molto più limitata.
L’unico caso in cui si può parlare di meningite batterica a liquor limpido è quello della meningite
tubercolare, perché il Mycobacterium tuberculosis non è piogenico, ma induce una risposta
prevalentemente macrofagica, quindi il liquor rimane limpido.
Questa classificazione è molto importante in medicina d’urgenza, perché in tempi relativamente
brevi consente di capire se ci troviamo di fronte a una situazione preoccupante in cui studiare
l’eziologia in modo tempestivo è necessario (e questo è il caso delle meningiti a liquor torbido, quelle
batteriche).
M5.3 SEGNI CLINICI DELLE MENINGITI

La maggior parte delle meningiti dà:
• esordio rapido, acuto (indistinguibile clinicamente tra meningite settica e asettica);
• mal di testa molto forte;
• fotofobia e fonofobia;
• nausea e vomito;
• rash cutaneo o petecchie: solo in casi da meningococco;
• triade:
1. febbre;
2. alterazione dello stato di coscienza: il paziente è confuso, sonnolento e può entrare in coma;
3. rigidità nucale: una sorta di riflesso/meccanismo di protezione che irrigidisce i muscoli del
collo per limitarne i movimenti cercando di non aggravare il dolore delle prime vertebre
(dovuto all’infiammazione).
N.B. La triade non è sempre presente. C’è quasi sempre nelle meningiti da pneumococco; in un terzo dei casi
da meningococco.
Le forme virali hanno gli stessi sintomi, sono però solitamente benigne e si risolvono in circa due settimane
(addirittura qualche giorno per il Toscana virus). Le meningiti settiche hanno una progressione rapida verso
le forme molto severe se non trattate subito con antibiotici, con una mortalità fino al 30% nelle forme da
pneumococco ed eventuali sequele neurologiche dovute all’infiammazione.
M5.4 MENINGITI A LIQUOR TORBIDO

Le meningiti a liquor torbido sono un evento morboso mediamente di rilevante gravità. Le caratteristiche
biochimiche del liquor torbido sono:
• la torbidità stessa, data dall’aumento dei leucociti polimorfonucleati neutrofili;
• l’iperproteinorrachia;
• l’ipoglicorrachia.
L’aumento delle proteine è dovuto all’attività dei granulociti polimorfonucleati, che svolgono la loro azione
battericida a cui segue lisi cellulare, che provoca un aumento del contenuto proteico nel liquor. Inoltre,
affinché possa avvenire l’azione di queste cellule esse hanno bisogno di energia e di conseguenza consumano
glucosio, provocando ipoglicorrachia. Dunque, l’analisi di laboratorio basata su questi tre cardini, conferma
la presenza di una meningite batterica e attività neutrofila in corso.
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L’eziologia della meningite ha una notevole variabilità ed è possibile individuare una classificazione dei
patogeni più frequenti sulla base dell’età paziente. La classificazione è stata creata grazie a dati
epidemiologici e non è dunque assoluta, bensì può avere delle eccezioni.
L’eziologia delle meningiti batteriche dipende dall’età e dalla presenza di particolari fattori di rischio.
Se si ha un neonato con in corso una meningite accompagnata da sepsi neonatale, quadro clinico
estremamente preoccupante sia nella fase acuta, sia per gli eventuali reliquati neurologici, gli agenti
eziologici più frequenti sono:
1. Streptococcus agalactiae, costituente del microbiota vaginale, che può essere acquisito per
passaggio tramite canale del parto infetto; esiste uno screening con tampone vagino-rettale
effettuato a 36 settimane di gestazione, al fine prevenire l’infezione del neonato;
2. Escherichia coli, può essere responsabile di meningite neonatale, soprattutto i ceppi K. In questo
caso non c'è una vera e propria procedura, in quanto E. coli è facente parte del microbiota intestinale:
durante la gravidanza si può però effettuare un esame delle urine per evidenziare un'eventuale
cistite, che può rappresentare un rischio di trasmissione al feto;
3. Listeria monocytogenes, che può essere trasmessa per via transplacentare o al momento del parto.
Se la meningite a liquor torbido colpisce un bambino che ha un’età compresa tra 1 e 24 mesi, gli agenti
eziologici possono essere più variabili:
1. Streptococcus agalactiae;
2. Streptococcus pneumoniae;
3. Neisseria meningitidis;
4. Haemophilus influenzae tipo B;
5. Escherichia coli.
Nei giovani adulti, fino a 18-22 anni l’agente più frequente è il meningococco, seguito dallo pneumococco.
Un tempo la meningite che insorgeva in giovani in questa fascia d’età veniva chiamata ‘’meningite delle
caserme’’ poiché il servizio militare obbligatorio era il primo momento in cui i ragazzi entravano a contatto
stretto con molte atre persone, e si aveva quindi la circolazione del meningococco
Nell’età adulta (25-65 anni) invece si inverte la frequenza degli agenti eziologici e quindi si ha più
frequentemente meningite da pneumococco, seguita da quella da meningococco.
Nell’anziano sopra i 65 anni lo pneumococco è il responsabile più probabile e si ha una ricomparsa della
meningite causate da Listeria monocytogenes.
Non compare nell’anziano la Neisseria meningitidis in quanto sono necessarî contatti ravvicinati di
collettività, in ambienti chiusi, per favorire la trasmissione interumana, situazioni che riguardano le persone
di una certa età in maniera minore.
M5.4.1 Terapia empirica per le meningiti

[Dalla dispensa Cricca] In genere si utilizza una terapia farmacologica a base di cefalosporine di terza
generazione, tra cui il Cefotaxime, efficace sia nei confronti di infezione da Streptococcus pneumoniae che da
Neisseria meningitidis, ma non efficace per Listeria monocytogenes, che ne è intrinsecamente resistente. Per
questa ragione ad un bambino, prima del primo mese di età, viene somministrata ampicillina, poiché utile
per i due agenti eziologici tipici di questa fascia di età, ovvero L. monocytogenes (resistente al Cefalotaxime)
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e Streptococcus agalactiae (sensibile ai β-lattamici, tra cui appunto l’ampicilina); alternativamente si possono
usare entrambi.
In caso di S. pneumoniae resistente a Cefotaxime e in caso di L. monocytogenes resistente ad ampicillina si
usa vancomicina.
M5.4.2 Esame microscopico con colorazione Gram

[Dalla dispensa Cricca] Quando si sospetta una meningite di tipo comunitario in laboratorio si effettua un
esame microscopico con colorazione Gram. Quello che si osserva è:
• Streptococcus pneumoniae: cocchi Gram+, allungati, con un’area più chiara che circonda la cellula.
Questo alone rappresenta la capsula, il principale elemento di patogenicità per l’uomo;
• Haemophilus influezae B: si presenta come un bacillo Gram–;
• Neisseria meningitidis: si rilevano cocchi Gram– (unici cocchi Gram– patogeni per l’uomo), in genere
associati a due a due con la parte concava rivolta verso l’altra cellula a formare diplococchi (strutture
simili a chicchi di caffè), presenti anche all’interno dei granulociti neutrofili;
• Listeria monocytogenes: è una Gram+. Questo batterio viene introdotto principalmente con
l’ingestione di formaggi, in particolari quelli freschi e replica anche a temperatura di 4°C (frigorifero).
Questa caratteristica viene utilizzata nella fase di arricchimento del medium (necessario all’esame
colturale), per aumentare la possibilità di isolarla, selezionando negativamente gli altri batteri che a
questa temperatura non sopravvivrebbero.
Streptococcus agalactiae
• Batterio che colonizza il tratto intestinale e genitourinario.
• Il 5-30% delle donne sono portatrici di GBS (Group B Streptococcus) a livello vagino-rettale.
• La trasmissione dell’infezione al neonato avviene durante il passaggio nel canale del parto.
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Immagine del terreno cromogeno: le colonie si presentano

di un colore malva-viola, ma non è facile individuarle poiché
sono spesso poche e negli esami si parte da prelievi di
tessuti con un ricco microbiota che maschera la loro
presenza. L’esame colturale viene perciò preceduto da pre-
incubazione in terreno di arricchimento nelle prime 24 ore,
dopo 24 ore si procede con una semina e al termine delle 48
ore si può verificare la presenza di queste cellule.
L’antibiogramma non viene eseguito in quanto solitamente
è sensibile alle penicilline. Va richiesto solo in caso di
paziente allergico alle β-lattamine.
Listeria monocytogenes
La fonte di infezione sono i formaggi, in particolare quelli freschi.
In un soggetto adulto sano affinché si abbiano sintomi (che sono simil-influenzali) sono necessari 108
UFC/grammo di alimenti, 1000 UFC/g nel caso di liquidi, come il latte.
Tra i soggetti più colpiti da una un’infezione sintomatica, che dia meningiti, ci sono anziani, neonati, donne
in gravidanza (possono trasmetterlo al feto sia durante il passaggio nel canale del parto che durante la
gravidanza, perché la Listeria è in grado di invadere e attraversare la placenta). Il deficit dell’immunità cellulo-
mediata favorisce l’instaurarsi della malattia.
Per la diagnosi è importante sapere che:

• il liquor può apparire anche solo modestamente torbido;
• la glicorrachia può essere normale;
• la pleiocitosi può essere a favore delle cellule mononucleate.
Questo assetto può far confondere con una meningite a eziologia virale: quando l’interpretazione è dubbia,
deve sorgere il sospetto che il paziente possa essere infetto da questo tipo di agente eziologico.
La meningite è spesso accompagnata da sepsi: è quindi giusto analizzare il liquor, ma è anche consigliabile
eseguire un’emocoltura.
Nella madre in gravidanza è consigliabile prelevare un tampone vaginale per cercare la presenza del batterio
(pratica utile ma poco utilizzata). Questo tampone viene posto a seminare in un brodo, in incubazione a 4°C
per 20 giorni per favorire arricchimento, moltiplicazione e isolamento della Listeria, in modo da eseguire in
seguito semine in agar-sangue al giorno 0, 10 ° e 20°. Essendo un esame lento, in casi gravi si ricorre alla PCR,
un esame molecolare.
Neisseria meningitidis
La Neisseria meningitidis può causare:
• meningite;
• meningite e sepsi meningococcica;
• sepsi meningococcica.
Nell’immagine a lato si nota un peculiare esantema petecchiale, causato dalla sepsi che spesso accompagna
la meningite, che non scompare alla digitopressione. È un sintomo patognomonico della meningite
meningococcica.
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La sindrome di Waterhouse-Friderichsen è una possibile conseguenza

dell’infezione da Neisseria meningitidis: è una setticemia fulminante
caratterizzata da insufficienza surrenalica secondaria.
L’OMS registra un tasso più alto di meningite da meningococco in
un’area che comprende i paesi dell’Africa sub sahariana, quella che
viene detta ‘‘cintura della meningite’’ o ‘’meningitidis belt’’. Qui prima
della campagna vaccinale iniziata nel 2010 l’80-85% di tutti i casi era
dovuto al meningococco di gruppo A là dove in USA ed Europa la
maggior parte dei casi sono causati dal gruppo B e C. L’Italia è un paese
a bassa incidenza, con tassi inferiori alla media europea. Anche le
malattie invasive da pneumococco e da emofilo vedono l’Italia in una
posizione favorevole rispetto agli altri paesi europei, con tassi di
incidenza inferiori alla media.
M5.4.3 Vaccini
• Meningococco: dopo l’introduzione del vaccino anti-meningococco di tipo C, che viene effettuato
nel primo anno di età, si è registrata, grazie ad un fenomeno di immunità di gregge (herd immunity),
una riduzione di casi in tutte le fasce di età. Dal 2015 questo vaccino è stato però sostituto con un
vaccino tetravalente (ACW135Y) perché il vaccino per il gruppo C, diminuendo l’incidenza di questo
gruppo, tendeva a favorire per effetto replacement gli altri gruppi (in particolare B e Y). Un’altra sfida
è rappresentata dall’introduzione nel calendario vaccinale regionale, a partire dal 2017, della
vaccinazione contro il meningococco B.
Come si vede nell’immagine il gruppo C diminuisce ma aumentano il B, l’Y e w135, precedentemente

scarsi o assenti.
• Pneumococco: degli oltre 80 sierogruppi di pneumococchi esistenti i vaccini attuali coprono: uno per
13 sierogruppi e uno più ampio per 23. Da queste vaccinazioni non si ottiene quindi effetto gregge,
proprio perché non coprono tutti i ceppi: infatti dopo la loro introduzione si è verificato una
diminuzione del 60% dei casi nella fascia di età 0-4 anni, ma non nelle altre fasce. Inoltre, per effetto
replacement è avvenuto un aumento del 75% della circolazione di ceppi non contenuti nel vaccino.
Dal 2017 viene offerta la vaccinazione contro pneumococco alla coorte dei sessantacinquenni,
insieme al vaccino antinfluenzale.
• Emofilo: grazie alla vaccinazione contro l’emofilo di tipo B si sono ridotte drasticamente negli anni le
infezioni invasive soprattutto in età pediatrica. Si sta assistendo però ad un incremento di forme non
capsulate, in grado di provocare malattia invasiva, che interessano non solo gli anziani e i pazienti
immunocompromessi ma anche i bambini.
99
M5.5 MENINGITI A LIQUOR LIMPIDO

Tra i virus che causano meningiti a liquor limpido troviamo:
• Enterovirus (Coxsackievirus gruppo A e B);
• HHV 1-2;
• EBV;
• CMV;
• HHV-6: circa il 2% della popolazione presenta ciHHV-6 (chromosomally-integrated HHV-6), in ogni
cellula nucleata, ereditato in maniera mendeliana. Quindi trovare alte cariche di HHV6 a livello
ematico può essere indicativo non tanto di una infezione quanto di una integrazione del suo genoma
nelle cellule della parte corpuscolata del sangue. Per risolvere il dubbio si può fare un’analisi di un
bulbo pilifero, non contaminato da sangue, e se si rileva HHV6 significa che siamo in un caso di
integrazione del genoma nella cellula ospite;
• VZV.
In laboratorio arrivano diversi liquor da analizzare, i più urgenti arrivano dal pronto soccorso, gli altri dai
reparti e possono essere liquor di sorveglianza oppure di sospetto di L. monocytogenes, oppure di altra
derivazione. Nei casi urgenti di pazienti che si presentano in pronto soccorso con tutti i sintomi di una
meningite è richiesta una diagnosi rapida, quindi per individuare il possibile agente eziologico si scelgono test
molecolari.
Il FilmArray Meningitis/Encephalitis Panel è un test unico che rileva l’eventuale presenza di uno dei 16
principali agenti eziologici della meningite nel liquor del paziente in una sola ora.
M5.6 MENINGO-ENCEFALITI A LIQUOR LIMPIDO

Le encefaliti pure sono rare, sono dovute a virus e protozoi che riescono a infettare direttamente il tessuto
cerebrale (neuroni e cellule della glia) e creazione un’infezione diffusa. C’è quasi sempre un interessamento
delle meningi (si parlerà sempre di meningo-encefaliti) Solo il virus della rabbia è capace di dare un’infezione
circoscritta ai neuroni e non interessa le meningi. Gli agenti eziologici più comuni sono HSV 1-2, Arbovirus (es
WNV), Enterovirus, amebe a vita libera.
Segni clinici delle encefaliti: visto l’interessamento delle meningi (meningo-encefalite) avremo i tipici sintomi
da meningite già descritti; ci sono però dei segni/sintomi che troviamo solo nelle encefaliti e che ci
permettono di distinguerle. Proprio perché stiamo parlando di un’infezione dei neuroni del SNC possiamo
avere la perdita di alcune funzioni cerebrali in corrispondenza della zona di tessuto colpita: afasia, emiparesi,
cambiamenti nel comportamento o nell’umore, disturbi di personalità. Questi ultimi tre sono sintomi
neurologici che differenziano le meningo-encefaliti, dalle meningiti (dove invece si ha alterazione dello stato
di coscienza inteso come sopore, confusione).
M5.6.1 Meningo-encefaliti batteriche

Il liquor tipico delle meningiti batteriche è torbido, ma alcuni batterî causano meningo-encefaliti con liquor
limpido. Tra queste meningo-encefaliti, tutte principalmente di tipo subacuto o cronico, abbiamo:
1. ME brucellare, (infezione da Brucella spp.);
2. ME luetica (infezione da Treponema pallidum);
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3. ME da Borrelia burgdorferi;
4. ME leptospirosica (infezioni “anitteriche” da Leptospira interrogans, la più patogena per l’uomo);
5. ME tubercolare (infezione da Mycobacterium tuberculosis).
Brucellosi
Le specie più importanti di Brucella spp sono: B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis (nomi che fanno
riferimento alle specie da cui vengono isolati).
Nel 2017 in EU ci sono stati 381 casi confermati con una incidenza di 0.09 casi per 100 000 abitanti. Le
incidenze più alte sono state registrate in Grecia, Italia e Portogallo. I pazienti più interessati sono maschi
compresi nella fascia di età 25-44 anni.
È una zoonosi: deriva dall’ingestione di latte non pastorizzato o carne contaminata. Gli animali sono quindi il
serbatoio di questa infezione. Può essere una malattia professionale dei veterinari, i quali vengono più
facilmente a contatto con animali infetti (il rischio aumenta se assistono al parto dell’animale).
Si manifesta con una infezione sistemica [brividi, sudorazione, perdita di appetito, cefalea e talvolta
linfoadenopatia], che interessa meningi e sistema nervoso centrale, e porta a una febbre ondulante, con
picco serale, calo di notte e ritorno alla temperatura normale la mattina (può durare per mesi e anni).
Si individua o attraverso un esame colturale o con un esame sierologico, detto di Widal-Wright, che rileva gli
anticorpi anti-Brucella attraverso una reazione di agglutinazione tra l’antigene, presente nel reattivo, e gli
anticorpi eventualmente presenti nel siero del paziente (insieme a quelli anti-salmonella, in particolare per
le salmonelle maggiori: S. typhi e S. paratyphi).
Neurosifilide
È la fase terziaria dell’infezione da Treponema pallidum. Gli uomini sono l’unico reservoir (non è una zoonosi)
e la trasmissione è verticale o per contatto diretto con secrezioni o lesioni infette (trasmissione sessuale).
Presenta diverse fasi:

• sifilide primaria: caratterizzata da lesione ulcerativa dolente, nel sito di ingresso; dal fondo
dell’ulcera si preleva materiale per poi verificare la presenza del Treponema;
• sifilide secondaria: si manifesta con lesioni eritematose sia cutanee che mucose, spesso associata a
infezione invasiva quindi meningite;
• sifilide latente: può durare anche decenni e se non trattata 1/3 dei casi può evolvere a sifilide
terziaria. Si formano gomme a livello di diversi organi e tessuti (cute e tessuto osseo), e si possono
verificare danni vascolari (aortiti) e neurologici (neurosifilide).
La diagnosi si avvale di diversi test:
1. test non treponemici (sono sierologici e mettono in evidenza anticorpi non specifici per il
Treponema, ma per la cardiolipina, lipide liberato dalle cellule ospite nel momento in cui vengono
invase dal treponema che rimane adeso sulle cellule treponemiche), una volta molto usati perché
rapidi, ma ora abbandonati perché poco specifici;
2. test di screening automatizzati ELISA (immunoenzimatici) o chemioluminescenti;
3. test treponemici, non automatizzati ma molto precisi tra cui TPHA e FTA- Abs, ELISA, Western blot.
Con essi si ricercano gli anticorpi anti-Treponema pallidum.
101
Nella risposta immunitaria vengono prodotti prima IgM e poi IgG.

Il normale iter diagnostico prevede prima un test automatizzato di screening, seguito, nel caso fosse positivo,
da una conferma tramite test treponemico, in genera il TPHA (emoagglutinazione) perché veloce ed
economico. In caso di discrepanza trai due risultati si usa il saggio di Western blot, che evidenzia anticorpi sia
di classe G che M.
Neuroborreliosi
È una meningite subacuto-cronica dovuta a Borrelia burgdorferi trasmessa all’uomo dalle larve e dalle ninfe
delle zecche Ixodes (è una zoonosi).
È associata alla malattia di Lyme, caratterizzata da febbre, cefalea, astenia e un caratteristico rash cutaneo
denominato eritema migrante (sintomo patognomonico), una manifestazione ad anello che parte nel punto
del morso della zecca e che tende ad espandersi col tempo (anche decine di centimetri).
Se non trattata l’infezione può interessare le articolazioni (artropatia cronica), il sistema nervoso centrale
(paralisi facciale, sordità, meningite) ed il cuore (blocchi atrio-ventricolari e mio-pericarditi).
Meningite leptospirosica
È una zoonosi: il batterio, del genere Leptospira, viene escreto con le urine di animali selvatici infetti e così
contamina le acque. Entra in un ospite che si trova a contatto con l’acqua infetta attraverso soluzioni di
continuità nella pelle. Outbreaks recenti sono stati associati all’attività di “adventure racing”.
Il ceppo più importante nella patologia umana è Leptospira interrogans che presenta 23 sierogruppi.
M5.6.2 Meningo-encefaliti micotiche

La più comune è quella da Cryptococcus neoformans ed è tipica del soggetto affetto da AIDS. Le altre sono
dovute a Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum, funghi filamentosi che danno infezione anche a
pazienti immuno-competenti e possono dare interessamento neurologico in seguito a infezione polmonare.
Meningo-encefalite da ameba
La Naegleria fowleri (definita “ameba mangia cervello”) è un’ameba che si
trova nelle acque dolci e nel suolo. L’infezione, estremamente rara, non
avviene bevendo acqua contaminata, ma quando l’acqua penetra all’interno
del naso; non è in grado di trasmettersi da persona a persona e ha una
mortalità estremamente alta, superiore al 97% (solo 4 persone su 143 che si
sa essersi infettate negli USA dal 1962 al 2016 sono sopravvissute).
Nel 2004 si è verificato in Italia un caso di un bambino di 9 anni che ha acquisito
l’ameba facendo il bagno nelle acque dolci del Po, il bambino è poi deceduto 6
giorni dopo la comparsa dei sintomi: la Naegleria fowleri causò una meningo-
encefalite primaria fatale.
102
Nell’immagine B si osserva la zona di infezione e un test di immunofluorescenza con anticorpi marcati con
fluorocromi che hanno messo in evidenza la Naegleria all’interno del tessuto cerebrale.
La diagnosi può avvenire mediante: una visualizzazione diretta attraverso un esame microscopico, in cui si
può spesso osservare l’ameba muoversi rapidamente in un campione fresco di liquor (esame scarsamente
sensibile), ricerca di antigeni all’interno del liquor o nei tessuti post mortem, oppure mediante test molecolari
PCR (ricerca del genoma).
M5.6.3 Meningo-encefaliti protozoarie

Trypanosoma brucei
Le meningo-encefaliti protozoarie sono infezioni a esordio subacuto o cronico, aventi come agente eziologico
più comune il Trypanosoma brucei (di cui si conoscono due sottospecie con diversa localizzazione, il
gambiense e il rhodosiense). Entrambe le sottospecie provocano la malattia del sonno (l’infezione porta
infatti fino al coma). La malattia è diffusa nell’Africa sub-sahariana. La zoonosi è trasmessa da un artropode
vettore, la mosca tse-tse.
Il T. gambiense causa il 98% delle tripanosomiasi, in particolare forme di tipo cronico, in Africa centrale e
occidentale.
Al T. rhodesiense è invece imputabile il 2% delle tripanosomiasi. È responsabile delle forme acute, è diffuso
in Africa orientale e meridionale e in questo caso la malattia presenta mortalità elevata in un breve arco
temporale. La prognosi è infausta nelle forme da T. brucei rhodesiense.
Il quadro clinico è rappresentato da meningo-encefalite con turbe del sonno che evolvono fino al coma.
Plasmodium falciparum
Il Plasmodium falciparum provoca la malaria quartana maligna. Il coinvolgimento del SNC (emorragie
cerebrali) avviene perché si formano pile di eritrociti alterati, che formano pile nei capillari del SNC. Essi
determinano un blocco della circolazione, una lesione dell’endotelio e una fuoriuscita del sangue.
L’interessamento encefalico si manifesta come una meningo-encefalite maligna ed emorragica, con sintomi
quali il coma, forme emiplegiche, forma delirante, forme di allucinazione e confusione. Anche la meningo-
encefalite da P. falciparum presenta un’elevata mortalità.
Toxoplasma gondii
L’infezione da Toxoplasma gondii è una zoonosi: viene acquisita tramite l’ingestione di cisti, che vengono
eliminate dalle feci di gatto. Le cisti provocano nel SNC delle masse cerebrali piuttosto cospicue, che si
associano a segni neurologici focali.
L’infezione è nella maggior parte dei casi asintomatica. L’infezione diventa sintomatica nei pazienti
immunodepressi e in caso di trasmissione materno-fetale.
M5.6.4 Meningo-encefaliti da elminti

I principali agenti eziologici delle meningo-encefaliti da elminti sono E. granulosus e T. solium.
Echinococcus granulosus
Echinococcus granulosus è un verme piatto costituito da più segmenti: una testa, o scolice, con uncini, un
breve collo, un segmento immaturo, un segmento maturo e l’utero [con 400-800 uova, ciascuno di 30-35 μm,
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200 volte più piccolo della forma adulta]. L’immagine a microscopico elettronico
mostra i rostri della testa, che gli consentono di aderire alla mucosa.
Ciclo vitale. Il ciclo vitale inizia dalla forma adulta, ospitata all’interno dell’intestino
dell’ospite definitivo (i canidi), che rilascia la proglottide gravida all’interno delle feci.
L’ospite definitivo è l’ospite in cui ha luogo la riproduzione sessuata e quindi dove
alberga la forma adulta dell’elminta: i canidi. Dalla disgregazione della proglottide si
liberano le uova nell’ambiente e vengono ingerite da pecore, capre e suini, ospiti
intermedi. Le uova embrionate sono ingerite dagli animali che si cibano di vegetali;
all’interno dell’intestino dell’ospite intermedio si schiudono e con gli uncini aderiscono
alla mucosa intestinale. Le oncosfere, o larve, possono attraversare l’epitelio intestinale e diffondere in alcuni
organi, come fegato, polmone ed
encefalo. La schiusa delle uova provoca
l’invasione dei visceri attraverso il
torrente circolatorio e procurano la
formazione delle cisti idatidee.
All’interno della cisti idatidea, avviene
la maturazione dell’Echinococcus
granulosus, che però è parziale e non
arriva mai alla forma adulta. Quando
un animale carnivoro si ciba
dell’erbivoro, avviene la liberazione
delle forme immature che a livello
dell’intestino maturano a forma adulta.
Anche l’uomo può essere un ospite
intermedio dell’E. granulosus:
attraverso l’alimentazione può fungere
da ospite intermedio e ospitare a livello
intestinale le cisti idatidee. In questo modo, come gli altri ospiti intermedi erbivori, può presentare le cisti
idatidee a livello viscerale.
Cisti idatidea. La cisti idatidea è costituita da:

• strato fibroso esterno: formato da tessuto connettivo di
reazione dell’ospite;
• strato fibroso intermedio: deriva dal parassita, è costituito da
lamelle concentriche di colore biancastro (assomiglia al bianco
d’uovo cotto). Ha una funzione protettiva e filtrante;
• strato germinativo: strato sottile e trasparente, granuloso per la
presenza di capsule. Ha funzione riproduttiva nella fase
asessuata. Dallo strato germinativo germinano piccole cisti che
protrudono nel lume della cisti idatidea e contengono all’interno
le forme immature dell’E. granulosus.
All’interno della cisti sono presenti:

• liquido idatideo: liquido limpido e ricco di NaCl, non coagulabile al calore per l’assenza di proteine;
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• le capsule invece nascono per gemmazione dallo

strato germinativo e contengono 20-30 protoscolici;
• protoscolici: forme immature dell’Echinococcus,
possono essere contenuti nelle capsule ma possono
anche distaccarsene ed essere liberi nel liquido
idatideo;
• all’interno del liquido, è presente la sabbia idatidea
(costituita da elementi di scarto della cisti stessa, come
protoscolici, protoscolici degradatati e capsule che si
sono staccate dallo strato germinativo)
Echinococcosi. L’echinococcosi presenta sintomi che

dipendono dall’azione compressiva esercitata sull’organo e sul
tessuto interessato. Sono cisti di dimensioni importanti:
possono raggiungere i 10 cm di diametro. Avendo queste
dimensioni, i sintomi dipendono dall’azione compressiva esercitata sull’organo (in particolare SNC: essendo
chiuso nella scatola cranica, l’effetto compressivo è particolarmente grave). Le complicazioni per la forma
epatica sono rappresentate dalla rottura della cisti e conseguente shock anafilattico (per rilascio delle
proteine allergizzanti proprie delle forme immature) ed echinococcosi secondaria (per diffusione delle cisti
in altri organi). È comune la sovrainfezione della cisti idatidea di tipo batterico. L’intervento consta di una
terapia antiparassitaria e rimozione chirurgica della massa.
Dati. Nel 2017, sono stati confermati 827 casi di echinococcosi nell’UE. La frequenza di infezione è
0.19/100.000 casi, con un decremento del 13.6 % rispetto al 2016. La maggior parte delle infezioni (71.4%) è
stata provocata da E. multilocularis ed E. granulosus, con rispettivamente 146 casi (26, 3%) e 409 casi (53.3%).
Taenia solium e Taenia saginata

Taenia solium e Taenia saginata hanno dimensioni cospicue. La
trasmissione avviene attraverso ingestione di carne cruda o poco
cotta di maiale (T. solium) e manzo (T. saginata). Maiale e bovini
rappresentano l’ospite intermedio. L’uomo rappresenta l’ospite
definitivo di questa infezione. Infettando l’intestino dell’uomo, la
T. solium o T. saginata libera gli ultimi segmenti corporei, che
vengono rilasciati con le feci o liberamente rilasciati senza defecazione. Il 10% della popolazione nei paesi in
via di sviluppo è parassitata.
Ciclo vitale. Le cisti che si formano nell’ospite intermedio non hanno le stesse dimensioni dell’E. granulosus:
molto spesso sono al di sotto di 1-2 cm di diametro. L’uomo rappresenta l’ospite definitivo: gli adulti si
formano nell’intestino tenue, in un arco temporale di 50-60 giorni, e possono persistere fino a 25 anni.
Normalmente c’è solo un verme infettante: la tenia si àncora alla mucosa intestinale attraverso gli uncini che
sono presenti sulla testa dell’elminta. Gli elminti contengono all’interno l’utero e tutte le cellule uova:
vengono rilasciati i segmenti nell’intestino, che si rompono e rilasciano le cellule uova. La cellula uovo può
essere assunta tramite l’alimentazione da un ospite intermedio, che è rappresentato dal suino o dal bovino.
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La cellula uovo si schiude, si formano

uncini per ancorarsi alla mucosa
intestinale, penetrano la barriera
intestinale, si incistano nella muscolatura
striata dell’ospite intermedio, a formare
strutture dette cisticerchi. L’uomo si
infetta cibandosi della carne cruda o
poco cotta di maiale e di bovino.
Cistocercosi. La cistocercosi è
un’infezione che non riguarda il territorio
italiano ed è data solo dalla Taenia
solium. Nel territorio italiano si è abituati
ad osservare l’infestazione da Taenia
solium in cui l’uomo funge da ospite
definitivo e non quella dove funge da ospite intermedio: la malattia in questo caso è detta cistocercosi.
L’infezione avviene mediante l’ingestione di uova di T. solium: l’uomo si contamina similmente a quanto
accade per l’ospite intermedio e ingerisce le cellule uovo. Analogamente a quanto avviene nel suino, le uova
si schiudono, si ancorano alla mucosa, penetrano l’intestino, vengono trasportate dal torrente circolatorio
virtualmente ad ogni organo con una predilezione per muscolatura, cute, occhi e SNC. La larva matura in
cisticerco e si accresce all’interno di una capsula cistica. Le manifestazioni cliniche dipendono dalla sede in
cui si verifica l’accrescimento della cisti: in genere dà affezioni al SNC (epilessia, cecità e paralisi), ai tessuti
sottocutanei (cisti visibili all’osservazione della cute) e all’occhio. La malattia non è una malattia tipica
dell’Italia e dell’Europa, ma caratteristica dell’Asia e dell’Africa.
M5.6.5 Meningo-encefaliti da artropodi vettori

Questa categoria di meningo-encefaliti includono anche alcune encefaliti che sono già state trattate:
• malattia del sonno, causata da Trypanosoma brucei rhodesiense e gambiense;
• malattia di Lyme, causata da Borrelia burgdorferi, trasmessa tramite le zecche;
• malaria con interessamento del SNC, provocata da Plasmodium falciparum.
Esistono tuttavia altri agenti eziologici che possono determinare una malattia al sistema nervoso centrale,
che si manifesta con meningite o meningo-encefalite.
Tra le infezioni che si localizzano all’interno del sistema nervoso centrale, e non solo, ci sono una serie di
malattie chiamate Arthropode Borne, ossia malattie trasmesse da vettori artropodi ematofagi, che hanno
bisogno di compiere il pasto ematico per completare il loro ciclo vitale. Si tratta prevalentemente di malattie
trasmesse da zanzare, in zone tropicali e negli ultimi anni anche in zone a climi temperati. Tra queste sono di
particolare rilevanza gli agenti eziologici Zika virus, Chikungunya virus, Dengue virus, WNV, Plasmodium.
Oltre alle zanzare ci possono essere altri vettori, come flebotomi (Toscana virus e Leishmania) e le zecche
(Tick borne encephalitis virus, Chrimean Congo hemorragic fever).
Gran parte di queste infezioni hanno spesso un coinvolgimento del SNC e sebbene si tratti di patologie non
particolarmente rilevanti da un punto di vista epidemiologico, esse possono comunque creare degli outbreak
nelle nostre aree geografiche.
Toscana virus
Il virus Toscana è stato isolato per la prima volta 50 anni fa da una ricercatrice italiana dell’Istituto superiore
di sanità, dal pappatacio (Phlebotomus perniciosus), sul monte Argentario, vicino a Grosseto, in Toscana.
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Nel 1983, questo virus è stato riconosciuto come agente eziologico della meningite. Fino al 2010 si riteneva
che esso fosse diffuso solo in Toscana e nel Sud Italia, nelle aree a Sud degli appennini. Tuttavia, studiando
molti soggetti con encefaliti estive si è scoperto che il virus Toscana è il responsabile del 80% delle meningiti
estive asettiche a liquor limpido. Inoltre, si deve considerare che non tutte queste meningiti sono
autolimitanti e in forme lievi, ma una parte dei soggetti colpiti può avere meningo-encefalite, con necessità
di ricovero in terapia intensiva.
Bisogna sottolineare anche che negli ultimi anni a causa dei notevoli cambiamenti climatici si ha una
diffusione sempre maggiore del virus anche in aree geografiche lontane da quella di origine, come ad
esempio nel sud della Germania, pur considerando che questa tipologia di virus è caratterizzato da una
notevole stagionalità dovuta alla diffusione del vettore solo in determinati momenti dell’anno.
West Nile virus (WNV)

Famiglia Flaviviridae, Genoma: ssRNA(+)
Il WNV è un virus trasmesso da zanzare della specie Culex pipiens, che pungono di sera. Si tratta di un virus
con importante stagionalità legata ovviamente all’attività delle zanzare. Il circolo che mantiene viva
l’infezione è un ciclo enzootico tra uccelli infetti e uccelli sani, con la zanzara come vettore. In questo ciclo
biologico l’uomo è un ospite assolutamente
accidentale, che si può infettare a seguito della puntura
da parte di una zanzara infetta.
Il WNV è stato isolato per la prima volta negli anni ‘50
in Uganda, ma successivamente l’area di diffusione del
virus si è molto estesa. In Europa può variare molto di
anno in anno, in quanto è connessa al numero di vettori
e al numero di uccelli migratori che arrivano dall’Africa,
è infatti improbabile che un virus possa rimare nel
nostro continente durante l’inverno, ma molto
probabilmente rientra dall’Africa proprio in base al
movimento degli ospiti naturali e del vettore. Ad
esempio, in Italia ci sono stati anni in cui i casi di WNV
sono stati molto numerosi e altri in cui non si è avuta
traccia del virus.
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La sintomatologia causata da WNV

è molto variabile e può essere
rappresentata a forma di piramide:
circa l’80% dei soggetti infetti sono
completamente asintomatici, il 20%
dei soggetti manifestano la West
Nile fever, una febbre fino a 38-39
°C velocemente autolimitante,
senza ulteriori problemi connessi
che si manifesta d’estate. Circa 1%
dei soggetti sviluppa una forma
grave di meningo-encefalite, con
una mortalità che si aggira intorno
al 10% di questi.
La mortalità è obiettivamente
limitata, ma si deve considerare che
può derivare da una ‘’banale‘’
puntura di zanzara, che quindi nelle aree geografiche europee a clima
temperato, va tenuta in considerazione come una possibile fonte di
malattie, anche a prognosi severa.
Negli anziani, nei bambini e nei soggetti immunodepressi, sono
possibili manifestazioni più gravi, quali meningite, encefalite e paralisi
flaccida (< 1% dei casi).
La mortalità della malattia WN, nelle forme di tipo meningo-
encefalitico, può variare tra il 3% ed il 15%; dopo l’infezione si sviluppa
l’immunità che probabilmente persiste per tutta la vita.
Si è stimato che ogni 150 casi di infezione si avrà un caso di infezione

del SNC.
La diffusione del virus è massima nell’area della valle del Po, che è la
zona in cui si ha la maggiore fermata di uccelli migratori.
La zona orientale del Po è da considerarsi ormai un’area endemica per
l’infezione da WNV (è stato pensato di chiamare la malattia “East Po
River Disease”; è importante inserire l’infezione da West Nile virus nella diagnosi differenziale di tutte le
meningo-encefaliti a liquor limpido e paralisi flaccide, in particolare nel periodo aprile-ottobre.
Tick borne encephalitis virus (TBE)

Il Tick borne encephalitis virus ha un picco dei casi verso luglio e invece di essere trasmesso da zanzare, ha
come vettore una zecca ematofaga (Ixodes ricinus): questa differenza è fondamentale in quanto si riduce
notevolmente la probabilità di contrarre il virus, infatti, mentre d’estate si hanno continui incontri con le
zanzare, il rischio di incontrare una zecca è molto più ridotto, è un evento raro.
È un Flavivirus; il picco dei casi si ha a luglio. La malattia interessa soprattutto il nord Europa: in Italia le
regioni più colpite sono il Trentino-Alto Adige e il Friuli-Venezia Giulia.
L’andamento della malattia è bifasico à picco febbrile (7 gg), intervallo asintomatico (7 gg) seguito da
meningite, meningo-encefalite o encefalomielite.
Rabies virus
La rabbia è una patologia di origine zoonotica, non trasmessa da artropodi, ma dal morso di mammiferi
infetti. In moltissime aree del mondo la rabbia è endemica e quindi il morso di un qualsiasi mammifero (cani,
pipistrelli, mucche, volpi…) può essere causa della patologia. In caso di un morso a rischio è dunque
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fondamentale sottoporsi alla profilassi vaccinale antirabbica in tempi molto rapidi, poiché si tratta di una
patologia progressiva, con una mortalità che, in assenza di trattamento, supera il 70%.
Mappa delle aree geografiche del mondo in cui la rabbia è considerata ad alto rischio. Le aree rosse sono
aree in cui c’è alto rischio di contatto con cani rabidi; le aree arancioni sono ad alto rischio di contatto con
pipistrelli infetti e altra fauna. [Fonte: OMS]
Non c’è un caso umano sul territorio italiano da diversi anni, però è un’infezione ancora diffusa in alcune
regioni del mondo.
I principali vettori di questa malattia sono i cani rabidi nelle zone afroasiatiche e i pipistrelli in Sud America e
Groenlandia. La rabbia viene trasmessa all’uomo attraverso il morso dell’animale rabido. L’animale infetto e
sintomatico rilascia il virus attraverso la saliva (la malattia provoca anche una forte ipersalivazione). Il virus,
non appena è penetrato grazie al morso dell’animale rabido, migra lungo gli assoni dei neuroni sensitivi fino
a raggiungere il SNC. Post-morte, a un esame autoptico, è possibile evidenziare i caratteristici corpi di Negri.
Le manifestazioni cliniche, a livello dell’uomo, avvengono dopo un periodo di incubazione che varia a seconda
dell’entità e della sede del morso. I morsi a livello del volto hanno tempo di incubazione breve, i morsi a
livello degli arti inferiori hanno tempi di incubazione più lunghi. La sintomatologia compare dopo un periodo
di incubazione medio di 5-6 settimane e la malattia, che ha una durata in genere di 2-6 giorni, si manifesta
con modificazioni del carattere, disturbi delle sensibilità nella sede della ferita, scialorrea, cefalea, vomito,
febbre alta con idrofobia, acrofobia (spasmo dei muscoli respiratori ai minimi soffî d’aria), agitazione
psicomotoria, manifestazioni paralitiche, paralisi, accessi convulsivi e morte per paralisi respiratoria.
Nel sospetto di infezione umana si può eseguire un vaccino o una sieroprofilassi, con introduzione di anticorpi
umani antirabici.
La rabbia è malattia diffusa in tutto il mondo; risulta rara nell’uomo, ma frequente negli animali, nei quali si
distingue una rabbia urbana, che colpisce in genere il cane e altri animali domestici, e una rabbia silvestre,
che interessa in genere gli animali carnivori e i pipistrelli. Esiste un monitoraggio degli animali rabici ai margini
delle città: il serbatoio del virus è rappresentato dall’animale rabido selvatico, che trasmette il virus agli
animali domestici, che lo trasmettono all’uomo.
M5.7 ASCESSI CEREBRALI

I microrganismi possono raggiungere il SNC:
• per via ematica (da focolai infettivi lontani, es. ascesso polmonare, endocardite);
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• per penetrazione diretta (in seguito a trauma cranico aperto o per manovre neurochirurgiche);
• per estensione diretta da strutture contigue infette (es. da otite, sinusite, mastoidite).
Agenti eziologici. Gli ascessi del SNC spesso sono ascessi polimicrobici. Se non sono traumatici,
principalmente sono dati da batterî di tipo anaerobio (Bacteroides fragilis, Clostridium, Peptococcus,
Peptostreptococcus), streptococchi viridanti e Staphylococcus aureus, soprattutto come complicanze di
endocarditi. Questi agenti eziologici raggiungono il SNC attraverso la via ematica e sono quelli più frequenti.
Esistono anche ascessi post-trauma e post-neurochirurgia (Staphylococcus aureus, Streptococcus ed
Enterobacteriaceae).
Questi rappresentano gli agenti eziologici del paziente immunocompetente: esistono anche ascessi cerebrali
in pazienti immunodepressi provocati da organismi peculiari, come Nocardia farcinica.
Gli ascessi intracranici sono encefaliti purulente circoscritte, che a seconda del luogo di localizzazione
possono essere classificati in:
• ascessi cerebrali: raccolta di pus nel cervello;
• ascessi subdurali: raccolta di pus tra dura madre e aracnoide;
• ascessi epidurali: raccolta di pus tra dura madre ed endostio del cranio.
È importante la diagnosi precoce di ascesso cerebrale perché può guarire grazie alle moderne terapie e la
mortalità è del 10%, ma se si rompe la mortalità sale fino all’80%. La diagnosi non è microbiologica ma di
imaging, si usano TC e risonanza magnetica.
M5.8 MIELITI INFETTIVE

Infezioni del midollo spinale causate solo da virus: sono tanti i virus a poterle causare, ma lo fanno raramente.
Agente eziologico principale è il virus della poliomielite (grazie al vaccino è quasi scomparso). Anche il WNV
può dare mieliti.
Patogenesi. Tutti i microrganismi capaci di dare mieliti infettive (Enterovirus) si contraggono per via orale,
arrivano nell’intestino, penetrano nel sangue e raggiungono il midollo, penetrano nei neuroni delle corna
anteriori e li distruggono, causando paralisi flaccida asimmetrica (colpiscono solo un lato) e irritazione
meningea.
M5.9 DIAGNOSI DI LABORATORIO

Parlando di tutti i tipi di infezioni che si
localizzano a livello del SNC, i materiali
patologici rappresentativi dell’infezione sono
liquor cefalorachidiano e sangue.
Il liquor è estremamente rappresentativo di
tutte le patologie che si localizzano a livello dello
spazio subaracnoideo, dove il liquor viene
prodotto. Dunque, le meningiti saranno
diagnosticabili in maniera estremamente
efficace tramite questo tipo di analisi, in quanto
sono proprio le meningi lo strato di rivestimento
dello spazio subaracnoideo.
Tuttavia, il liquor non è altrettanto efficace per
la diagnosi di encefalite, poiché si tratta di
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infezioni localizzate nel parenchima encefalico e il responsabile di questo tipo di infezioni non si trova
necessariamente nel liquor. Sarebbe un miglior materiale da analizzare quello derivante da una biopsia del
parenchima encefalico. Questa richiede però un metodo estremamente invasivo e pericoloso, vanno dunque
valutati attentamente i rischi e i benefici della procedura. Si effettua la biopsia del parenchima encefalico
solo per avere certezze in casi particolari come quelli di sospetta encefalite erpetica a liquor negativo.
Si deve sempre tenere in considerazione che molto spesso non si ha discontinuità patologica e anatomica tra
meningiti ed encefaliti, ma si hanno situazioni di meningo-encefaliti, che partono dallo spazio subaracnoideo,
per poi coinvolgere anche il parenchima.
Per il prelievo del liquor cefalorachidiano occorre fare una rachicentesi,
in cui si ottiene un volume solitamente di 10 mL.
Nell’immagine vediamo l’esame macroscopico del liquor
cefalorachidiano. Il prelievo di liquor (9-12 mL) avviene con la rachicentesi
tra la IV e V vertebra lombare, dopo disinfezione con alcool etilico 70% e
colorexidina (dal centro alla periferia). Dev’essere eseguito prima
dell’inizio della terapia antibiotica empirica. La rachicentesi avviene
ponendo il paziente in posizione rannicchiata per aumentare lo spazio tra
le due vertebre.
Il prelievo di liquor permette già di osservare le differenze macroscopiche: il liquor dovrebbe essere limpido
e diventa torbido in caso di meningite batterica purulenta.
Il sangue è un altro materiale che può essere utilizzato per fare diagnosi, anche se non è a diretto contatto
con il SNC ma solo attraverso il circolo. Si tratta di un’analisi non sempre rilevante.
[Il clinico deve dare un’ipotesi diagnostica sul paziente in esame, in base alla quale il microbiologo farà tutti
gli esami necessarî per dare una risposta al quesito diagnostico. Non deve essere il medico clinico a valutare
quali esami devono essere effettuati e quali invece no.]
M5.9.1 Esame microscopico ed esame colturale

In caso di sospetta meningite comunitaria, gli esami più spesso
richiesti sono: esame microscopico, esame colturale per
aerobi/anaerobi e ricerca dell’antigene pneumococcico.
Un’altra procedura che secondo i protocolli deve sempre
essere svolta è l’emocoltura, poiché molto spesso i germi
piogenici arrivano al SNC tramite il circolo.
L’esame microscopico a fresco viene svolto per individuare la
forma e la disposizione delle cellule eventualmente presenti,
ma anche per fare una conta delle cellule bianche e degli
eritrociti presenti nel campione.
Dopodiché si procede con la colorazione di Gram e infine con un esame colturale.
Nelle immagini sono visibili i risultati di indagini a microscopio dopo colorazione di Gram.
Nella prima immagine sono ben visibili i neutrofili polimorfonucleati e si tratta infatti di liquor torbido. Inoltre,
la presenza di diplococchi Gram– con disposizione a chicco di caffè permette di fare una diagnosi immediata
di Neisseria meningitidis.
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Nella seconda immagine sono ben distinguibili diplococchi Gram+ che portano alla diagnosi di Streptococcus
pneumoniae.
Nella terza immagine, colorata con inchiostro di china, si distinguono le blastospore di Criptococcus
neoformans, un micete capsulato, non colorabile per la presenza della capsula che lo rende impermeabile al
colorante. La meningite da Criptococcus era in passato diffusa tra pazienti fortemente immunodepressi come
i soggetti con AIDS, oggigiorno è però molto rara in quanto la maggior parte delle persone HIV positive
vengono trattate con terapia HAART.
L’esame colturale viene svolto su diversi terreni che consentano potenzialmente la crescita di tutti i batterî:
1. agar sangue (tutti i batterî);
2. terreno Tayer-Martin (Neisseria meningitidis);
3. agar cioccolato (Haemofilus);
4. agar Sabourad (funghi);
5. agar sangue in anaerobiosi (anaerobi);
6. terreno BHI (arricchimento).
Molto importante è l’esame d’arricchimento effettuato in un brodo molto ricco (BHI o BSD) che consente di
far crescere anche i batterî che hanno più difficoltà a crescere in vitro; permette infatti di aumentare la carica
batterica e la loro conseguente disseminazione. L’esame viene svolto inserendo qualche goccia di liquor
all’interno del brodo e lasciando poi la provetta all’interno di un termostato per tre giorni. Se dopo tre giorni
il brodo è limpido significa che non è cresciuto nulla, se invece il brodo si è intorbidito si potranno seminare
i batterî presenti all’interno per poter svolgere ulteriori analisi.
M5.9.2 Ricerca dell’antigene pneumococcico

Un’altra tecnica utilizzata è la ricerca dell’antigene di Streptococcus pneumoniae
direttamente nel liquor, facendo un’immunocromatografia.
Il test sfrutta le urine per infezioni polmonari da S. pneumoniae e sfrutta invece il liquor
per le infezioni encefaliche di S. pneumoniae.
M5.9.3 Metodi molecolari diretti

Si possono utilizzare anche metodi molecolari come pannelli di PCR, che comprendono molti batterî, virus e
funghi; ha senso impiegarli quando si hanno campioni di liquor provenienti dal pronto soccorso e che
necessitano di una diagnosi in tempi brevi. La disponibilità di questi test molecolari ha dato un grande
contributo alla diagnosi rapida di eziologie batteriche.
Grazie alla presenza dei pannelli multiplex, inoltre, è aumentata moltissimo la terapia per le meningo-
encefaliti provocate dal virus della varicella, che spesso non venivano diagnosticate. Si tratta di un fatto
rilevante, in quanto la diagnosi di virus della varicella, il quale ha una terapia specifica con antivirali analoghi
dei nucleosidi, come il ganciclovir, ha migliorato notevolmente i risultati del trattamento.
Oltre alla Multiplex PCR, si possono aggiungere anche PCR specifiche per virus meno diffusi (PCR virus
Toscana e PCR virus West Nile):
1. Multiplex PCR per batteri/virus/funghi. Il test è molto rapido (45 min) e individua numerosi agenti
eziologici anche qualora siano morti;
2. PCR virus Toscana e West Nile, il test viene effettuato nella stagione estivo-autunnale;
3. PCR Mycobacterium tuberculosis;
4. PCR Borrelia burgdorferi.
M5.9.4 Indagini sierologiche

L’indagine sierologica può essere rilevante per patologie non acute, ma la meningite e la meningoencefalite
sono acute per definizione (il paziente asintomatico fino a pochi giorni prima, arriva rapidamente in pronto
soccorso con un quadro clinico piuttosto grave). La sierologia non risulta perciò adeguata, tant’è che anche
con un sistema diagnostico molto sensibile la comparsa delle prime IgM richiederebbe minimo sette giorni.
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A volte se si ha il sospetto di una meningo-encefalite di origine virale può avere senso l’analisi sierologica,
purché si aspetti il tempo sufficiente alla comparsa anticorpale. Quindi le ricerche anticorpali nei casi di
encefalite, meningoencefalite a sospetta eziologia virale vanno ben valutate nell’ambito dello sviluppo
dell’infezione. Se i sintomi del paziente sono insorti da troppo poco tempo, avremo un falso negativo, cioè il
test è negativo, ma l’infezione è presente, in quanto c’è l’impossibilità di determinare le IgM non ancora
formatesi.
Fino ad ora si è intesa un’indagine sierologica su un campione di sangue, tuttavia potrebbe essere utile
effettuarla anche sul liquor (sempre contestualmente a quella sul sangue).
In caso di infezione virale, infatti, si ha quasi sempre un danno della barriera ematoencefalica e quindi gli
anticorpi presenti nel siero tenderanno a passare nel liquor.
Verificare la presenza degli stessi anticorpi nei due fluidi corporei e valutare il danno della barriera tramite
parametri biochimici, istituendo un indice di barriera, risulta estremamente utile.
Ad esempio, se la barriera non è danneggiata, ma sono presenti delle IgM nel liquor, significa che si ha una
sintesi intratecale di anticorpi specifici e dunque infezione è confermata. Se invece la barriera è danneggiata
e si hanno IgM e IgG a basso titolo nel liquor, probabilmente derivano da un trasudamento dal circolo che ha
invaso il liquor.
Questo tipo di analisi e di ragionamenti diagnostici di sierologia sul liquor risultano piuttosto complicati e
richiedono una certa esperienza. Attualmente non esiste un metodo diagnostico convalidato, per il quale
sarebbe necessario avere una serie di campioni sicuramente positivi e una serie sicuramente negativi in modo
da poter valutare la sensibilità e la specificità dell’analisi. Ciò è possibile per la sierologia sul sangue, ma non
per le analisi del liquor in quanto sebbene in caso di patologie si possano ottenere campioni positivi, non è
al contrario possibile, per ragioni etiche, sottoporre pazienti sani a un prelievo di liquor al fine di avere a
disposizione campioni che siano certamente negativi.
M5.9.5 Sorveglianza del liquor da derivazione

I pazienti neurochirurgici o ricoverati in neurologia a seguito di trauma presentano cateteri per drenare il
SNC da eventuali accumuli di liquor. Presentano un catetere prossimale, o intracranico, che pesca all’interno
della cavità di un ventricolo cerebrale (solitamente il destro), collegato ad un catetere distale. Il catetere
distale scarica il liquor nel torrente ematico (Derivazione Ventricolo-Atriale, DVA) o in una cavità sierosa come
il peritoneo (Derivazione Ventricolo-Peritoneale, DVP). Tra il catetere prossimale e distale viene posta una
valvola unidirezionale, in modo tale che il liquor passi dal ventricolo al torrente circolatorio/cavità peritoneale
e non faccia il percorso contrario. Solitamente, tra il catetere prossimale e la valvola unidirezionale, è posto
un piccolo serbatoio, il reservoir, utile per prelievi di liquor. Il liquor deve essere analizzato per verificare che
sia sterile: è importante sorvegliare questo liquor per controllare che non vi sia una contaminazione dei
cateteri. Nel caso vi sia effettivamente una contaminazione dei cateteri, gli agenti eziologici sono
rappresentati da Stafilococchi coagulasi negativi (che formano biofilm sui cateteri), Streptococchi viridanti,
E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Pseudomonas. Il liquor può essere inviato in laboratorio, a tempi
prestabiliti, per sorvegliare la stabilità del liquor.
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M6. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DELLE VIE URINARIE

Le infezioni delle vie urinarie (UTI) sono tra le più frequenti cause che portano il paziente dal medico e sono
diffusissime nelle loro forme più leggere. Alcune di esse, però, possono portare anche alla sepsi e dare luogo
a complicazioni molto gravi. La categoria di pazienti più a rischio è sicuramente quella delle donne in
gravidanza ed è per questo motivo che nei protocolli di controllo della gravidanza fisiologica (che decorre
senza complicazioni o problemi) l’urinocoltura è prescritta ogni trimestre, nonostante l’assenza di sintomi.
M6.1 CLASSIFICAZIONE DELLE INFEZIONI DELLE VIE URINARIE

Le infezioni urinarie vengono distinte in infezioni del tratto urinario
alto e infezioni del tratto urinario basso. A rigor di logica, le infezioni
dei tratti più alti sono potenzialmente più gravi (nefriti, pielonefriti,
ascessi renali), mentre quelle dei tratti più bassi sono meno consistenti
(uretriti, cistiti, prostatiti).
In realtà, essendo queste strutture anatomicamente contigue, è raro
che si verifichi un’infezione nei tratti urinarî superiori senza che questa
si propaghi anche alle vie inferiori (es. paziente con pielonefrite molto
difficilmente non presenta una cistite associata).
M6.2 MODALITÀ D’INFEZIONE

In che modo i germi riescono a provocare una UTI?
• Via ascendente: dovuta alla contiguità anatomica molto stretta tra il tratto distale dell’apparato
digerente (retto e perineo) e quello dell’apparato urinario; questa situazione è più frequente nel
sesso femminile per la maggiore vicinanza delle due strutture. Tutti i germi del tratto distale
dell’apparato gastro-enterico hanno la possibilità di spostarsi e raggiungere il tratto urinario.
Affinché ciò si verifichi, i batterî devono avere alcune caratteristiche ben precise, tra cui la capacità
di rimanere adesi alla mucosa delle basse vie urinarie e di risalire fino ad arrivare al rene.
Infatti, bisogna tenere presente che la prima e più rilevante modalità di difesa del tratto urinario
stesso nei confronti delle infezioni consiste nel flusso continuo di urina dalla pelvi fino alla vescica
(dalla vescica in poi il flusso è intermittente).
Esiste, inoltre, la possibilità che batterî presenti a livello renale entrino in circolo portando a urosepsi.
Le cistiti sono, nella maggior parte dei casi, infezioni di tipo endogeno, date perciò da batterî come
Escherichia coli proveniente dalla regione ano-rettale. Sono più frequenti nel soggetto di sesso
femminile soprattutto per ragioni anatomiche (brevità dell’uretra e sua vicinanza alla regione ano-
rettale), che saranno meglio precisate in seguito.
• Via ematica: è possibile, ma meno probabile, che i batterî arrivino al rene attraverso la via ematica.
Tuttavia, la precondizione è che ci si trovi davanti a uno stato di batteriemia almeno transitoria o
intermittente. Se la batteriemia è permanente, la probabilità che i batterî passino dal circolo al rene
aumenta ulteriormente.
In questo modo, alcuni microorganismi possono generare pielonefriti (M. tuberculosis) e ascessi
renali (S. aureus).
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M6.3 MICROBIOTA DELLE VIE URINARIE

Le vie urinarie godono di sterilità nella parte prossimale, mentre sono fortemente colonizzate nella parte
distale, con un gradiente crescente di concentrazione batterica dalla parte prossimale alla distale. La
composizione media del microbiota delle basse vie urinarie è leggermente diversa nei due sessi: quello
femminile è arricchito di Lactobacilli, streptococchi anaerobi, Bacteroides, Veillonella, Candida, che sono
normali componenti del microbiota vaginale. Se questi non ci fossero, si creerebbero situazioni di vaginite e
vaginosi.
La vaginite è un processo flogistico acuto caratterizzato da perdite e dolore.
La vaginosi è, invece, uno stato di disbiosi del microbiota vaginale, che provoca disagi e fastidi a livello
dell’apparato riproduttivo (es. perdite maleodoranti e coito doloroso). La vaginosi è una situazione molto
comune e ha origine quando uno dei componenti del microbiota vaginale non è in condizione eubiotica, cioè
quando prevale sugli altri.
Come si può apprezzare dalla tabella, i primi quattro elementi (Stafilococchi coagulasi negativi,
Corynebacterium, Enterobacteriaceae e M. smegmatis) sono presenti sia nei soggetti di sesso femminile, che
in quelli di sesso maschile. Al contrario, Lactobacilli (che contribuiscono a mantenere il pH vaginale), anaerobi
(Streptococcus, Bacteroides, Veillonella) e Candida sono esclusivi del microbiota vaginale.
M6.4 MECCANISMI DI DIFESA DELL’OSPITE

I meccanismi di difesa dell’ospite sono molteplici:
• flusso urinario: è il principale meccanismo di difesa contro le infezioni batteriche, anche di fronte a un
quadro di cistite si consiglia ai pazienti di bere tanto in modo da aumentare la diuresi;
• peristalsi ureterale;
• valvola vescico-ureterale: se la valvola tiene, è difficile che si verifichi il passaggio di microorganismi;
• sfaldamento cellule epiteliali;
• pH urinario: normalmente compreso tra 4,6 e 6. In caso di assenza di acidità è probabile che ci si trovi
di fronte a infezione batterica. È un parametro fondamentale, che viene misurato nell’esame delle
urine;
• IgA secretorie: esse hanno grande importanza in tutte le infezioni localizzate o che originano dalle
mucose;
• flora batterica residente.
M6.5 FATTORI DI RISCHIO DELL’OSPITE

• Brevità dell’uretra nelle donne: più corto è il tragitto che i microorganismi devono compiere, più
facile è per loro generare l’infezione.
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• Incompleto svuotamento vescicale e potenziale ristagno di urina: il trigono vescicale si abbassa e

una certa quantità di urina resta costantemente in vescica. Questa è una situazione in cui i batterî
possono replicarsi in maniera ottimale, provocando un aumento della carica batterica. Generalmente
si verifica in caso di danni neurologici della vescica e degli sfinteri (spina bifida, sclerosi multipla,
paraplegia) o per via di tumori, stenosi, calcoli, ipertrofia prostatica.
• Cateterizzazione: è il fattore numericamente più importante e più predisponente verso un’UTI. È un
problema sempre più presente a causa dell’aumento dei super-anziani, che spesso necessitano di
cateterizzazione per far fronte a situazioni di incontinenza vescicale o paralisi neurologica della
vescica: sono pazienti che, se non cateterizzati, non riescono a urinare. Tuttavia, il problema del
catetere è che esso rappresenta una porta aperta verso le infezioni e i batterî ne possono colonizzare
la superficie, generando biofilm. Inoltre, la cateterizzazione favorisce la risalita microbica verso il rene
e l’urosepsi.
• Gravidanza: durante la gravidanza l’anatomia della pelvi si modifica, favorendo una risalita batterica
nel tratto urinario. Inoltre, la gravidanza predispone a un aumento della produzione del progesterone
e a un incremento del volume dell’utero. Il progesterone esercita un’azione rilassante sulla
muscolatura della vescica, della pelvi e degli ureteri e crea un ristagno di urina in vescica. Anche il
peso dell’utero può comprimere l’uretra ed essere un ostacolo alla minzione, con conseguente
ristagno di urina in vescica.
• Menopausa: nella menopausa il microbiota vaginale viene riorganizzato, si realizza un equilibrio
completamente nuovo e le mucose vaginali acquisiscono una diversa capacità secretoria. Aumenta
la suscettibilità alle UTI a causa della carenza di estrogeni, che contribuirebbero a ridurre il pH acido
vaginale. Si ha di conseguenza una riduzione di Lactobacilli, determinando un innalzamento del pH e
aumento di enterobatterî in vagina con aumentata adesione batterica all’uroepitelio.
• Iperplasia prostatica: favorisce il ristagno dell’urina in vescica, quindi cistite e UTI alte.
Si può notare che nei soggetti femminili

l’incidenza delle UTI aumenta con l’inizio
dei rapporti sessuali, poi aumenta ancora
di più con fattori di rischio come la
gravidanza, infine con la menopausa la
situazione si assesta rimanendo elevata,
ma non si registra più incremento. Dopo i
50-55 anni, invece, le infezioni urinarie
aumentano nei soggetti maschili e questo
innalzamento è legato proprio
all’ipertrofia prostatica.
Le UTI sono classiche infezioni endogene,
l’infezione esogena è solo nosocomiale ed
è legata a manovre strumentali.
M6.6 EZIOLOGIA DELLE UTI
M6.6.1 Via ascendente
Patogeni convenzionali
I patogeni che sono più comunemente causa di infezione delle vie urinarie per via ascendente sono:
• E. coli: è il responsabile della maggioranza delle infezioni delle vie urinarie di comunità;
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• Staphylococcus saprophyticus: è uno stafilococco coagulasi negativo, patogeno solamente per le vie
urinarie;
• Enterococcus faecalis ed Enterococcus faecium;
• Enterobacteriaceae: Klebsiella spp., Proteus spp., Citrobacter spp., Serratia spp., …
• Pseudomonas aeruginosa: Gram–, non fermentante;
• Staphylococcus aureus.
Patogeni opportunisti
I patogeni opportunisti sono microorganismi che normalmente non portano a malattia, ma che risultano
patogeni in situazioni particolari come l'immunodeficienza. Alcuni di questi sono:
• Candida albicans;
• Streptococcus agalactiae, che si segnala nelle donne giovani in età fertile, per il problema legato
alla trasmissione al feto durante il passaggio nel canale del parto;
• Corynebacterium urealyticum;
• Pseudomonas spp.;
• Stenotrophomonas maltophylia (simile a Pseudomonas).
Contaminanti
I contaminanti sono tutti i batterî normalmente presenti in una determinata area anatomica. Essi si trovano
anche nell’urinocoltura, ma bisogna prestare attenzione a non scambiarli per patogeni (ad esempio di fronte
a una cistite e a positività ai Lactobacilli non si può attribuire a questi l’infezione, poiché essi sono dei normali
commensali).
Alcuni di essi sono:
• Lactobacilli;
• Corynebacteria (tutti ad eccezione del C. urealyticum);
• Streptococchi viridanti;
• Stafilococchi coagulasi negativi (tranne S. saprophyticus).
Non bisogna rischiare di trattare una contaminazione, ma bisogna essere critici, cercando di mantenere un
senso e considerando lo status del paziente e i risultati del laboratorio.
M6.6.2 Via ematogena
Batterî
• Lo Staphylococcus aureus è responsabile della produzione di ascessi renali.
• Un altro batterio a cui bisogna prestare attenzione è il Mycobacterium tuberculosis, poiché la tubercolosi
urinaria è un evento molto raro ma presente. In seguito a una disseminazione biliare il micobatterio
impiega poco tempo a raggiungere il rene.
• La Leptospira interrogans è una spirocheta. Alcuni sierogruppi hanno capacità patogene ed è un batterio
zoonotico. Essa circola in maniera inapparente, senza produrre malattia in molti animali (ad esempio
ratto, vacca e maiale), ma in alcune situazioni si può venire a contatto con un sierotipo patogeno e
acquisirlo.
Leptospira interrogans
La leptospirosi è una malattia abbastanza seria, è invasiva e ha prognosi importante. Purtroppo, essendo la
diagnosi difficoltosa, essa viene formulata tardivamente. Ne consegue che il trattamento viene
somministrato quando la malattia è già in uno stadio avanzato, cosa che ne riduce l’efficacia. Solitamente,
l’infezione è acquisita venendo in contatto con acque contaminate da urine di ratto; la congiuntiva è la porta
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d’ingresso della Leptospira, da cui essa, attraverso il circolo, arriva al rene, dove viene ultrafiltrata, per poi
passare nelle urine.
La Leptospira interrogans dà un’infezione sistemica simil-influenzale, che in genere si risolve in una
settimana. A questa prima fase può però seguire una seconda fase, che interessa il SNC e viene chiamata
malattia di Weil (interessamento anche renale, epatico, polmonare e cardiaco).
Diagnosi: ricerca di anticorpi su campione ematico; ricerca degli antigeni nelle urine; PCR siero, liquor e urine.
Elminti
Schistosoma haematobium
È un elminta che diffonde per via ematogena, ed è l’agente eziologico della schistosomiasi, un’infestazione
presente anche in alcune aree europee come Corsica e Sardegna e che, al momento, conta circa 200 milioni
di persone infettate al mondo.
Essa è solitamente asintomatica, ma, talvolta, nella sua forma uro-genitale genera ematuria, ovvero presenza
di sangue nelle urine.
Un tempo, per definire l’urina ematurica, si usava il
termine “urine a lavatura di carne”, poiché, così come
si osserva una colorazione rossastra, quando si mette
la carne sotto l’acqua, lo stesso avviene anche nel
caso di ematuria macroscopica.
Un’altra complicanza della schistosomiasi è la disuria,
ovvero la difficoltà nell’iniziare la minzione,
nonostante si senta lo stimolo minzionale.
È possibile osservare questo tipo d’infestazione da
elminta soprattutto negli immigrati, che possono poi
introdurla nel mondo occidentale.
Complicanze: carcinoma della vescica, soprattutto
dove l’infezione è diffusa in maniera consistente.
La schistosomiasi ha due localizzazioni: ne esiste una forma intestinale, data da diverse specie, tipica di
America Centrale e Asia, e una forma uro-genitale, data da Schistosoma haematobium, che riguarda quasi
tutta l’Africa, il Medio Oriente, e alcune aree della Corsica e della Sardegna.
Ciclo replicativo. La schistosomiasi ha un ciclo

abbastanza complesso, in cui il punto chiave è
rappresentato da alcuni molluschi acquatici che si
infettano con le uova dell’elminta. Le sporocisti si
sviluppano al loro interno, successivamente le cercarie
vengono rilasciate nell’acqua dal mollusco e possono
infettare un soggetto che fa il bagno in quel luogo. Nella
biopsia vescicale è possibile osservare le uova.
Infine, penetrano nel torrente circolatorio
dell’organismo, migrano all’interno del fegato e
maturano a forma adulta (analizzata precedentemente
al ME), raggiungendo in coppia diversi distretti:
• plesso venoso intestinale, per quanto riguarda
le forme intestinali;
• plesso venoso vescicale, per quanto riguarda le forme ad infestazione urinaria.
In questi distretti, avviene la deposizione delle cellule uovo, successivamente liberate tramite urine o feci.
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Lo schistosoma, come è visibile dall’immagine al ME, presenta una ventosa nella parte
ventrale che consente di attecchire alle mucose. Spesso l’elminta di sesso maschile,
che ha dimensioni minori rispetto a quello di sesso femminile, alloggia in una
insenatura ventrale del corpo della femmina, così da viaggiare protetto in questa
doccia ventrale dell’elminta femminile.
Primi casi autoctoni europei. Il mollusco che ospita lo schistosoma è stato trovato nel
2014 in Corsica ma, viste le somiglianze ambientali, è probabilmente presente anche in Sardegna.
Il numero dei casi nel 2014 è stato pari a 11, mentre nel 2015, quando l’attenzione nei confronti della
schistosomiasi è aumentata, sono stati eseguiti più controlli e sono stati individuati 110 soggetti infestati fra
i residenti in Corsica e 8 fra i turisti italiani.
Diagnosi di laboratorio. La diagnosi di laboratorio si basa sulla ricerca delle uova a livello urinario. Le urine
devono essere raccolte nel primo pomeriggio e dopo aver fatto esercizio fisico, poiché esso fa contrarre la
parete vescicale e le uova sono più concentrate.
L’alternativa è una biopsia vescicale.
La diagnosi sierologica è possibile e ha alta sensibilità, purtroppo, però, non consente di distinguere le
diverse specie. In un soggetto non esposto alla schistosomiasi intestinale negli ultimi anni, che si sia
recentemente recato in aree geografiche come la Corsica, si può anche tentare di fare diagnosi in questo
modo (dal momento che la positività del test è correlata con altissima probabilità a un’infestazione da S.
haematobium), ma se ci si trova davanti a un soggetto immigrato da un paese in cui l’elminta è molto più
diffuso, non si può determinare la specie.
M6.6.3 UTI virali
Hantavirus
Trasmissione. La famiglia degli Hantavirus è molto complessa e comprende virus che trovano serbatoio nei
roditori. L’uomo si infetta tramite aerosolizzazione di secrezioni provenienti da roditori infetti (feci, urine e
altre secrezioni corporee).
Epidemiologia. È un’infezione emergente, che è diventata oggetto di studio negli ultimi 25 anni.
È un’infezione di cui è difficile definire con precisione l’andamento e l’epidemiologia. Dal 2013 in poi si è
registrato un aumento dei casi (2157 casi nel 2013 à 4239 casi nel 2017) ed è difficile capire se questo
aumento sia reale o se sia dovuto al fatto che il virus viene maggiormente ricercato attraverso esami di
laboratorio.
I paesi che sicuramente presentano il maggior numero di casi sono la Finlandia e la Germania (70% dei casi
totali).
Patologia. L’infezione da Hantavirus provoca un quadro di febbre emorragica con sindrome renale o
nefropatia epidemica. La mortalità arriva fino al 5-15%, percentuale abbastanza alta, pertanto, non è un
problema da sottovalutare.
Specie di interesse medico. La famiglia degli Hantavirus comprende diverse specie di interesse medico:
o Hantaan (5-15% di mortalità): presente in Asia e Russia;
o Dobrava (5-15% di mortalità): presente nei Balcani, in paesi come la Slovenia;
o Seoul (1% di mortalità): virus ubiquitario;
o Puumala (1% di mortalità): di origine finlandese, presente in Europa.
In Italia, tutti i casi che si sono verificati sono stati registrati come casi di importazione.
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[Il prof ritiene che il motivo del ridotto numero di casi risieda nel fatto che nel nostro Paese questo tipo di virus
venga ricercato poco a livello di analisi di laboratorio, di conseguenza non vi saranno molti casi. Inoltre, egli
afferma che è alquanto improbabile che l’Hantavirus sia completamente assente nel nostro Paese, dal
momento che esistono specie localizzate in Paesi confinanti con il nostro, come la specie Dobrava in Slovenia].
Diagnosi di laboratorio. La diagnosi di infezione da Hantavirus viene effettuata tramite la ricerca di anticorpi
specifici in un campione ematico.
Ci sono altri virus che entrano in diagnosi differenziale con la schistosomiasi e l’Hantavirus per la
manifestazione di cistite emorragica, presente anche in:
• Poliomavirus umano BK (in pz immunocompromessi);
• alcuni sierotipi di Adenovirus (11, 21), che possono infettare diverse sedi (tratto GI, respiratorio,
urinario).
Poliomavirus
Riguarda il paziente immunocompromesso. I Poliomavirus sono virus a DNA che vengono acquisiti per via
respiratoria e che comprendono diversi virus. Quelli noti da più tempo sono JCV e BKV, i cui nomi derivano
dagli acronimi dei nomi e cognomi dei primi pazienti in cui sono stati isolati questi virus.
Hanno un genoma circolare, analogamente a Papilloma Virus (tant’è che una volta erano considerati facenti
parte della famiglia Papillomaviridae, poi sono stati scorporati e ad oggi costituiscono una famiglia a parte,
detta Poliomaviridae).
L’infezione viene acquisita per via respiratoria, si moltiplica inizialmente nelle alte vie respiratorie, a cui fa
seguito una prima viremia con localizzazione a livello renale. Il virus si moltiplica quindi a questo livello e in
seguito si ha una seconda fase viremica transitoria, che si risolve molto bene nel paziente
immunocompetente.
L’infezione renale latente può dare problemi nel paziente immunocompromesso, dove si può avere una
riattivazione del virus:
o il virus BK si può moltiplicare a livello renale e dare una possibile cistite emorragica nei trapiantati di
midollo; può anche comportare nefropatia e perdita del rene nel caso di trapiantati di rene, che
necessitano di un monitoraggio costante;
o il virus JC è invece soprattutto responsabile di infezioni a livello del SN, come una leucoencefalopatia
multifocale progressiva. Viene richiesta la ricerca di DNA virale soprattutto in seguito a encefalite.
Diagnosi precoce di riattivazione di BK à nefropatia associata a Poliomavirus BK (eventuale rigetto di
trapianto):
• biopsia renale: è un’indagine invasiva, ma gold-standard; è rischiosa in un paziente appena
trapiantato, perciò non viene sempre eseguita);
• indagini non invasive:
1. ricerca delle decoy cells nelle urine;
2. viral-load sierico;
3. viral-load urinario.
Immagine di biopsia renale.

Si notano cellule colorate in bruno, che sono cellule
positive per la presenza di Ag di BKV, messe in evidenza
con anticorpi contro virus SV40 (Simian Virus 40). Anche
quest’ultimo è un Poliomavirus, non molto importante
nella patologia umana, anche se ha avuto un pregresso
storico importante, per cui pare che abbia colpito anche
l’uomo in seguito a vaccinazioni contaminate da questo
virus della scimmia.
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Gli anticorpi contro l’Ag T di SV40 sono in grado di riconoscere anche gli Ag T di JCV e BKV, perciò sono usati
indistintamente per mettere in evidenza le infezioni da questi virus.
Esame citologico eseguito su sedimento urinario in cui sono state messe in evidenza le decoy cells, cellule spia
della presenza dell’infezione da BKV, che si caratterizzano per avere un rapporto nucleo/citoplasma a favore
del nucleo, con inclusioni intranucleari a vetro smerigliato con marginazione della cromatina. Quando viene
visualizzato un reperto anatomo-patologico di questo tipo, si può sospettare una nefropatia da Poliomavirus.
Nell’immagine a destra, è utilizzato inoltre uno staining per il riconoscimento di Ag T per mettere in evidenza
il virus.
Follow up post trapianto. Per scongiurare la riattivazione di infezione da Poliomavirus in un trapiantato si

può fare uno screening delle decoy cells su sedimento urinario. Qualora questo esame risulti positivo, si
procede con test aggiuntivi microbiologici: ricerca di DNA virali in urine (>107 copie/mL) o plasma (>104
copie/mL). (Il plasma è generalmente analizzato solo in seguito al rilevamento di un’alta carica virale a livello
urinario).
Nei casi in cui venga rilevata un’alta carica virale a questi livelli, è necessario modulare la terapia
immunosoppressiva e aggiungere degli antivirali.
M6.7 SINTOMI DELLE UTI
M6.7.1 Via basse

I sintomi classici delle cistiti acute sono:
• disuria, difficoltà nella minzione;
• stranguria, dolore nella minzione;
• urgenza nella minzione;
• pollachiuria, frequenza nella minzione.
Le cistiti possono essere asintomatiche nell’anziano o nei pazienti con catetere permanente. Inoltre,
guardando le urine posso registrare le seguenti condizioni:
• piuria, presenza di pus nelle urine che hanno un aspetto torbido;
• batteriuria, presenza di batteri nelle urine che hanno aspetto torbido;
• ematuria, presenza di sangue nelle urine, che può essere macroscopica o microscopica.
M6.7.2 Vie alte

Le pielonefriti acute presentano generalmente gli stessi sintomi delle infezioni delle vie basse, con aggiunta
in alcuni casi di febbre e dolori lombari (tipici quindi delle UTI delle vie alte). Per questo motivo clinicamente
la distinzione tra infezioni delle vie alte o delle vie basse risulta complicata e l’unico metodo veramente
efficace sarebbe sottoporre a diagnosi diretta l’urina prelevata direttamente dall’uretere attraverso
cateterismo.
Eventuali complicanze delle UTI delle vie alte sono:
121
• ascessi renali;
• batteriemia (urosepsi).
M6.8 DIAGNOSI E URINOCOLTURA

Nell’ambito delle UTI il metodo di riferimento per la diagnosi di laboratorio è l’urinocoltura.
Il materiale patologico di partenza per un’urinocoltura è chiaramente l’urina.
L’urina che si utilizza per questo tipo di esame è un materiale non sterile; infatti, per essere raccolta, essa
passa attraverso le vie urinarie inferiori, che sono uno dei distretti anatomici più contaminati di tutto
l’organismo.
A causa di questa contaminazione, è fondamentale associare all’urinocoltura anche un esame delle urine.
L’urinocoltura fornisce informazioni sulla presenza di germi nelle urine, mentre l’esame delle urine sulla
presenza o meno di infiammazione.
Infatti, se l’urinocoltura segnala la presenza di germi (anche con una carica alta), ma l’esame delle urine indica
che non vi è infiammazione (quindi assenza di cellule dell’infiammazione, assenza di cambiamenti del pH
urinario, assenza di emazie, assenza di cambiamenti di densità delle urine), non si è di fronte a un’infezione,
ma a una semplice colonizzazione.
Perciò, bisogna prestare attenzione: se è presente un’infezione, vi è sicuramente anche una risposta di tipo
flogistico.
M6.8.1 Prelievo
Per ottenere dei risultati chiari, ma soprattutto validi, è importante che durante il prelievo del materiale
patologico (urina) siano rispettate le seguenti condizioni:
- Il prelievo deve essere effettuato prima dell’inizio della terapia antibiotica.
Riguardo a questo punto spesso si riscontrano problemi; infatti, nella maggior parte dei casi il prelievo
viene effettuato dopo che il paziente è già stato sottoposto a terapia antibiotica. Ad esempio, potrebbe
trattarsi sia di pazienti ospedalizzati (che vengono sottoposti a terapia antibiotica per problemi
preesistenti), sia di pazienti che presentano delle recidive (hanno già provato a trattare il problema con
un determinato tipo di antibiotico, il quale, però, si è rivelato inefficace e quindi il problema si è
ripresentato).
- È necessario raccogliere il mitto intermedio (parte centrale della minzione).
Per raccogliere il materiale nel modo corretto, a seguito di un’accurata detersione dei genitali esterni
(che serve a ridurre la carica batterica presente a questo livello), è necessario buttare i primi millilitri di
urina (è proprio in quei millilitri che sono contenuti la maggior parte dei batteri che contaminano le vie
urinarie inferiori) e raccogliere il mitto intermedio (che dà una visione più rappresentativa della carica
virale e del contenuto di batteri presenti in vescica).
M6.8.2 Trasporto
Il trasporto del campione al laboratorio deve avvenire rapidamente (Uriswab entro 24 ore, se conservato a
temperatura ambiente).
Questo punto è molto importante perché la carica batterica si modifica nel tempo: i batterî possono crescere,
moltiplicarsi e, in questo modo, il contenuto e la carica batterica di partenza si modificano.
Spesso i laboratorî di microbiologia non si trovano nei pressi degli ospedali o delle strutture in cui avvengono
i prelievi, ma possono essere lontani anche diversi chilometri. In Italia esiste una legge (legge Balduzzi) che
stabilisce qual è il numero di popolazione che deve afferire a un laboratorio di microbiologia: secondo questa
legge “è sensato, a livello economico” avere un laboratorio di microbiologia ogni 1.500.000 abitanti. I
campioni, quindi, nella maggior parte dei casi, per raggiungere il laboratorio dovranno compiere molta
strada. Esiste quindi un tempo di trasporto, un tempo di arrivo al laboratorio, che è sicuramente superiore al
tempo “consentito”. Oltre ai problemi che riguardano la distanza e il tempo di trasporto, esistono anche
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difficoltà logistiche, bisogna infatti organizzare una rete di trasporti che faccia arrivare i campioni in tempo
utile e che allo stesso tempo sia sostenibile economicamente.
Per evitare che la carica batterica iniziale si modifichi durante il tempo di trasporto al laboratorio, è necessario
utilizzare un sistema che stabilizzi la crescita batterica, cioè un sistema che vada a inibire la crescita dei
batteri. Solitamente esso si basa sull’acido borico.
L’acido borico, a determinate concentrazioni, inibisce la crescita batterica.
La concentrazione di acido borico da utilizzare dipende strettamente dal volume di urina contenuto nella
provetta. Se si utilizzano concentrazioni troppo alte, l’acido borico non ha più azione inibente sulla crescita
batterica, ma va direttamente a uccidere i batterî e, di conseguenza, quella coltura non è valida (essa
risulterebbe negativa, in quanto i batterî sono stati uccisi). L’effetto inibente sulla crescita batterica da parte
dell’acido borico utilizzato in adeguate concentrazioni è valido per circa 24 ore: dopo 24 ore tutto ciò che è
contenuto in provetta muore.
M6.8.3 Diluizione e coltura

Una volta arrivata in laboratorio, la provetta viene diluita e messa in coltura.
Tutto il processo è automatico, cioè è svolto da una macchina. Essa apre la provetta, in seguito il contenuto
viene centrifugato e si effettua la semina (1 μL di urina ad alberello su terreno cromogeno). Infine, la
macchina stessa eseguirà la lettura delle piastre.
Per la coltura vengono utilizzate piastre cromogeniche, in cui si ha la crescita colorata di diverse specie
batteriche.
Ad esempio, nelle piastre in figura (che sono quelle che vengono utilizzate più frequentemente nei laboratorî)
E. coli cresce in rosso, le Enterobacteriaceae in verde e gli Enterococchi in verde smeraldo.
A seconda del risultato si può proseguire o meno con la spettrometria di massa per identificare la specie (nel
caso delle specie Enterobacteriaceae, essa deve essere eseguita perché le specie coinvolte potrebbero essere
diverse, come Klebsiella, Enterobacter, ecc.) e poi si può procedere con l’antibiogramma.
M6.8.4 Carica microbica

L’urinocoltura viene dichiarata:
• negativa, se la carica microbica è inferiore a 104 UFC/mL (circa 10-40 colonie) 5;
• positiva, se la carica microbica è maggiore a 104 UFC/mL (in questo caso è necessario esprimere la
carica microbica precisa, che può andare da 104 UFC/mL fino a superare 105 UFC/mL).
Per la valutazione della carica microbica si conta il numero delle colonie:
• dalle 10 alle 40 colonie: 104 UFC/mL;
• dalle 40 alle 70 colonie: 104 -105 UFC/mL;
• >70 colonie: > 105 UFC/mL.
5
UFC = unità formanti colonie.
123
M6.8.5 Presenza di una popolazione polimicrobica

Spesso la popolazione che si riscontra nelle urinocolture non è composta da una singola specie di batterî (ad
esempio E. coli), ma è polimicrobica, ovvero costituita da tre o più specie batteriche contestualmente
presenti.
Quando ci si trova in questa situazione significa che il prelievo è “sporco”, cioè non è stato effettuato
correttamente, e che l’urina raccolta è contaminata. Infatti, nel caso delle infezioni urinarie è molto
improbabile che l’infezione sia data da più specie batteriche; nella maggior parte dei casi la specie
responsabile dell’infezione è una sola.
Perciò, quando il risultato dell’urinocoltura è una popolazione polimicrobica (costituita per esempio da E.
coli, Staphylococcus saprophyticus e Candida, che sono tutte e tre specie patogene) ci si trova, molto
probabilmente, in presenza di una contaminazione dovuta al fatto che il campione è stato prelevato male.
In queste situazioni il laboratorio di microbiologia può riservarsi il diritto di non dare i risultati della coltura e
di chiedere un nuovo campione (possibilmente prelevato in modo corretto).
Nella piastra riportata vi è la presenza di E. coli (di colore

viola), Enterococchi (verdi, piccoli) ed Enterobatterî (verdi,
grandi).
In questo caso l’urina non è stata raccolta bene: il campione
è stato contaminato e, pertanto, non sarà processato, ma
verrà richiesto un secondo prelievo.
Quindi, se nell’urinocoltura viene rilevata la presenza di
normali batteri contaminanti, cioè di batteri che
appartengono al normale microbiota di quel distretto
anatomico (come lattobacilli e corinebatteri), il laboratorio li
riporterà, ma il medico dovrà prestare attenzione a non
inserirli nella diagnosi, in quanto è normale che essi siano
presenti.
124
M7. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI PROTESICHE E CUTANEE

M7.1 INTRODUZIONE AL PROBLEMA

Il problema delle infezioni da protesi articolari negli ultimi dieci anni sta esplodendo dal punto di vista
epidemiologico e continuerà a crescere. Ciò è imputabile al fatto che il ricorso a sistemi protesici è diventato
ormai di uso comune sia per l’aumento di richiesta dovuto all’invecchiamento della popolazione e
all’aumento aspettativa di vita, sia (probabilmente) per il business legato a questo settore che tende a
sbilanciare il medico nel considerare il bilancio tra rischi e benefici. Come ogni device medico anche le protesi
articolari tendono a sporcarsi, e a peggiorare la situazione è il fatto che non sono vascolarizzate, per cui non
possono essere sede di risposta flogistica risolutiva.
Le protesi infette sul totale dei pazienti operati ogni anno sono:
§ circa il 2% per protesi del ginocchio;
§ 1,5% per protesi d’anca;
§ per dispositivi di osteosintesi come chiodi, placche e fili che gli ortopedici utilizzano nel riparare le
fratture, più la frattura è esposta maggiore è il rischio, in quanto la porta aperta in seguito al trauma
non si riesce mai a pulire completamente; per questo motivo il rischio di infezioni va dall’1-2% per le
fratture chiuse fino a più 30% per le fratture aperte.
Queste percentuali possono sembrare basse, ma ogni anno vengono operati centinaia di pazienti.
Spesso il chirurgo che realizza la protesi non è lo stesso che torna a operare nel caso vi sia infezione; questo
avviene perché per la protesica si ricorre spesso a strutture private che cercano di evitare gli interventi meno
proficui di remissione.
I principali agenti eziologici di infezioni di protesi osteoarticolari sono gli stafilococchi coagulasi negativi. Lo
stafilococco coagulasi negativo è un batterio a scarso potere patogeno che può formare un biofilm sui
cateteri, determinando l’insorgenza di sepsi. Nei mezzi di osteosintesi il principale agente patogeno è lo
Staphyococcus aureus, soprattutto in fratture esposte.
Per questo motivo il risultato del laboratorio necessita sempre di una forte critica clinica, altrimenti si corre
il rischio di trattare una contaminazione invece di un’infezione, e dal momento che il reimpianto protesico
nel caso di infezione richiede una terapia antibiotica con immobilizzazione del paziente per un circa mese e
mezzo, la situazione diagnostica risulta ancor più complicata.
Inoltre, spesso i risultati microbiologici riscontrano infezioni a eziologia polimicrobica, dal momento che la
genesi di queste infezioni è una chirurgia sporca e la localizzazione in cavità articolare non permette il
richiamo della risposta flogistica, per cui si sviluppa sempre un’infezione. Molto spesso succede anche che
protesi clinicamente sporche dove sono manifesti i segni di un’infezione non diano alcun risultato nell’esame
microbiologico, per cui l’eziologia rimane sconosciuta.
125
Dietro a questa problematica ci sono prassi medico-legali molto importanti: impiantare una protesi infetta,
così come reimpiantare in caso di sospetta infezione che invece non sussiste, comporta risarcimenti
importanti al paziente.
M7.1.1 Biofilm
L’elemento fondamentale nella genesi delle infezioni protesiche è la creazione di un biofilm. Il biofilm è una
pellicola di matrice polisaccaridica che viene prodotto dai batterî nel momento in cui aderiscono ai dispositivi
impiantabili; i batterî si trovano all’interno del biofilm, in tal modo sono protetti dalla fagocitosi del sistema
immunitario e dall’azione degli antibiotici. (Oltre ai batterî, possono trovarsi anche altri germi, per esempio i
funghi). I batterî possono generare infezioni di tipo cronico con la possibilità di generare emboli settici che
possono infettare altri distretti anatomici. Nel caso di un’infezione protesica con formazione di biofilm è
necessaria una concentrazione di antibiotico 10 volte superiore al normale per uccidere il batterio protetto
all’interno del biofilm. Per lo studio diagnostico è molto importante isolare il batterio dal biofilm per coltivarlo
in vitro; la separazione avviene tramite dispositivi meccanici come onde d’urto (sonicazione) che rompono il
biofilm liberando i batterî, oppure tramite solventi chimici come il ditiotreitolo, che scioglie i polisaccaridi
liberando i batteri in un mezzo liquido che viene poi utilizzato per le colture in vitro.
M7.2 CLASSIFICAZIONE DELLE INFEZIONI

Le infezioni protesiche sono suddivise in precoci, ritardate e tardive in base al tempo di insorgenza
dell’infezione rispetto al momento dell’impianto.
M7.2.1 Infezioni precoci

L’infezione precoce si sviluppa a meno di 4 settimane dall’impianto.
Questa è solitamente acquisita durante l’intervento, raramente è dovuta a diffusione ematogena da un
focolaio infettivo. I microrganismi responsabili sono dotati di elevata patogenicità (S. aureus, enterobatterî,
bacilli Gram– non fermentanti). È rara la diffusione ematogena
L’approccio terapeutico è di tipo conservativo: la protesi è lasciata in situ e viene svolta terapia antibatterica
long-term.
M7.2.2 Infezioni ritardate

Si manifestano da 1 a 24 mesi dopo l’impianto, sono le più frequenti.
126
Sono solitamente acquisite durante l’intervento, è possibile la diffusione ematogena da focolaio infettivo. È
dovuta a organismi a bassa o media patogenicità (CONS, streptococchi, Corynebacteriaceae,
proprionibatterî) che solitamente contaminano la cute, il cavo orale o le mani. L’approccio terapeutico in
questo caso richiede la rimozione della protesi, al suo posto è posizionato del cemento spaziatore per
mantenere i capi articolari in posizione; viene utilizzata una terapia antibatterica sia in situ per bonificare
l’ambiente di impianto della protesi, sia sulla protesi stessa, a seguito dell’esecuzione degli esami
microbiologici.
M7.2.3 Infezioni tardive

Si manifestano oltre i 24 mesi. Sono acquisite a seguito di diffusione ematogena da focolaio infettivo
(polmonare, urinario ecc.). Sono dovute a microrganismi a crescita molto lenta. L’approccio terapeutico
prevede rimozione della protesi, posizionamento del cemento spaziatore e terapia antibatterica (approccio
non conservativo).
M7.3 DIAGNOSI DI INFEZIONE PROTESICA RITARDATA

Le infezioni ritardate sono le più frequenti e quelle che necessitano maggiore accuratezza nella diagnosi. La
diagnosi di infezione protesica ritardata viene svolta quando si accerta la presenza di un criterio maggiore,
alternativamente due criteri minori, di cui uno sia la positività dell’esame colturale su campione bioptico o
liquido sinoviale, oppure tre criterî minori.
Criterî diagnostici maggiori

• Presenza di una fistula: canale di comunicazione tra l’ambiente articolare e l’esterno;
• esame colturale positivo di almeno due biopsie peri-protesiche: prelevati solitamente durante la
rimozione della protesi infetta; deve essere isolato su entrambi i campioni lo stesso germe.
Criterî diagnostici minori

• Presenza di dolore articolare persistente: per l’articolazione del ginocchio, vale anche una severa
riduzione della capacità di movimento;
• VES e PCR sieriche elevate rispetto ai valori di riferimento (VES >20 mm/h nei maschi e >36 mm/h
nelle femmine, PCR >0,5 mg/dL);
• esame colturale positivo su campione bioptico o su liquido sinoviale;
• alterazioni dell’esame chimico-fisico del liquido sinoviale:
o elevata conta dei globuli bianchi (GB >10.000/μL);
o elevata % di neutrofili (PMN >60%).
M7.3.1 Indagini microbiologiche preoperatorie

Prima dell’intervento di espianto di una protesi contaminata o infetta possono essere svolte due procedure:
• coltura del liquido articolare: il prelievo va effettuato a capsule articolari chiuse, mediante
artrocentesi. Si inserisce un ago all’interno della cavità articolare e si compie prelievo;
• emocolture: vanno eseguite se sono presenti sintomi articolari. Questa ci assicura che l’eventuale
positività dell’emocoltura possa dipendere da un’infezione a livello articolare.
M7.3.2 Indagine microbiologica intraoperatoria

Dal punto di vista clinico e diagnostico, le infezioni protesiche di maggior interesse sono quelle di tipo
ritardato, ovvero che si verificano da 1 a 24 mesi dopo l’impianto protesico. In questo caso, i campioni che
devono essere prelevati nel momento intraoperatorio (la maggior parte delle diagnosi di infezioni protesiche
che giungono alla nostra osservazione in microbiologia) sono tre:
1. prelievo dell’aspirato articolare (ovvero del liquido sinoviale): da raccogliere ovviamente in modo
pulito e inoculare in emocoltura perché sostiene meglio la crescita di eventuali batteri; è necessario
127
anche mantenere un’aliquota per la conta dei granulociti neutrofili, se non riscontrati l’infezione non
sussiste;
2. prelievo di biopsie peri-implantari (attorno all’impianto protesico, almeno 3 pezzi e preferibilmente
5 o 6 campioni di tessuto;
3. coltura degli elementi protesici, raccogliendo la protesi in contenitori sufficientemente grandi che
la mantengano in condizione di sterilità fino al laboratorio; maggiori difficoltà di gestione del
campionamento.
M7.3.3 Modalità di raccolta, trasporto e conservazione

Tutti questi campioni devono essere raccolti osservando le norme di asepsi e devono essere deposti in
contenitori sterili.
In particolare, il prelievo del liquido sinoviale deve essere fatto mediante aspirazione articolare percutanea
(possibilmente eco-guidata) o comunque a capsula articolare chiusa, quindi prima del prelievo delle biopsie
peri-implantari che richiedono invece l’apertura della capsula articolare.
Il liquido sinoviale può essere deposto nei flaconi da emocoltura, dove possono essere messi almeno 0,5 mL
di liquido sinoviale per flacone, sia in quello anaerobio sia in quello aerobio e poi inviati in laboratorio. Si può
fare anche una seconda aliquota di liquido sinoviale con anticoagulante per l’esame microscopico, la conta
dei leucociti totali e l’osservazione dell’eventuale presenza di neutrofili polimorfonucleati.
Per quanto riguarda le biopsie peri-implantari, possono essere eseguite anche al fine di inviarle al laboratorio
di anatomia patologica, perché anche l’esame tissutale istologico può rivelarsi utile per la diagnosi. Ogni
singola biopsia di tessuto peri-implantare deve essere prelevata con strumentazione separata e inserita in
un contenitore dedicato sterile; prelevare almeno 3 biopsie peri-implantari (preferibilmente 5 o 6) per
l’esame colturale. Si consiglia di prelevare biopsie con volume di circa 1 cm3 al fine di agevolare le procedure
analitiche.
Viene raccolta anche la protesi stessa: il reparto deve dotarsi di contenitori sterili, che possono avere
dimensioni anche molto cospicue (alti anche 50 cm) e che devono essere sterilizzati al fine di non inficiare
l’esame microbiologico. I patogeni rilevati sono a scarsa patogenicità (es. stafilococchi coagulasi negativi
fanno parte del microbiota cutaneo), perciò bisogna prestare attenzione a non contaminare questi campioni.
Una volta arrivata in laboratorio, la protesi verrà bagnata da una soluzione contenente ditiotreitolo, agente
che serve per sciogliere il biofilm e liberare i batteri. Questa soluzione verrà agitata, centrifugata e perciò
concentrata, e utilizzata quindi per eseguire le semine sulle piastre più appropriate.
I campioni devono essere consegnati in laboratorio entro due ore dopo il prelievo e, qualora non fosse
possibile, andrebbero conservati a 4 °C per un massimo di 24 ore.
Come avviene per le emocolture, anche il liquido articolare deve essere mantenuto a temperatura ambiente
fino ad un massimo di 24 ore. L’ideale sarebbe poter incubare questi flaconi nel minore tempo possibile, per
evitare alterazioni e falsi negativi.
Ciò che è importante, per quanto riguarda la diagnosi delle infezioni protesiche ritardate, è la tempistica di
refertazione: i tempi di coltura sono molto allungati rispetto a un campione bioptico normale. Operando
infatti un confronto tra biopsia epatica o cutanea e una biopsia protesica, la tempistica di coltivazione è molto
diversa: per i materiali non protesici sono sufficienti 5 giorni di coltura (in brodo liquido, che consente ai
batteri di crescere anche in sospensione); per le protesi, i tempi di refertazione e coltura si aggirano attorno
ai 14/15 giorni (per scongiurare una quota di falsi negativi, soprattutto per microrganismi a lenta crescita,
come Stafilococco coagulasi negativi). Sia i materiali bioptici, sia i materiali protesici, sia il liquido sinoviale
vengono mantenuti in coltura per 14 giorni in un brodo (nel caso del liquido sinoviale bastano i flaconi aerobi
e anaerobi),tioglicolato, che consenta la crescita di batteri aerobi, anaerobi, microaerofili, anche i più esigenti
e anche se in bassa carica. Nel brodo è contenuta anche una bassa percentuale di agar, seppur il terreno sia
liquido, che permette la polarizzazione della crescita batterica: viene utilizzato come supporto per facilitare
l’inizio della proliferazione di batteri soprattutto anaerobî.
128
M7.3.4 Colture falsamente negative

1. Se il paziente è esposto a terapia antibiotica prima del campionamento;
2. in caso di bassa carica microbica;
3. se vengono utilizzati dei protocolli inappropriati: non vengono rispettati i tempi di coltura allungati;
4. in presenza di microrganismi esigenti [es. Abiotrophia defectiva o Granulicatella adiacens], difficili da
evidenziare in coltura, per cui le piastre che vengono utilizzate nel protocollo della protesi non sono
sufficienti per la loro crescita: in questo caso si può ricorrere a indagini di biologia molecolare.
Nel caso di colture negative in pazienti con evidenza clinica di infezione protesica è raccomandabile allestire
colture additive per funghi e micobatteri, indagini in biologia molecolare per un ampio ventaglio di
microrganismi, analisi sierologiche per Brucella e Coxiella e per eventuali altri microrganismi non coltivabili.
M7.3.5 Interpretazione dei risultati

La crescita di un microrganismo molto virulento, anche da un singolo campione, è molto probabilmente
legata a un’infezione protesica (es. Staphylococcus aureus).
Se invece viene isolato un microrganismo potenzialmente contaminante (es. stafilococchi coagulasi negativi,
Propionibacterium acnes) da un unico campione, come liquido sinoviale o soltanto uno dei campioni bioptici,
è difficile valutarne la significatività clinica, perché potrebbe essere potenzialmente contaminante.
Lo stesso vale quando risulta positivo soltanto il brodo: nell’arco di 14 giorni si intorbidisce, viene seminato
sulle piastre e soltanto dal brodo viene isolato un microrganismo a scarsa patogenicità (es. stafilococco
129
coagulasi negativo, Propionibacterium acnes). È difficile, perciò, valutarne la significatività clinica. È

importante eseguire campionamenti multipli per aumentare le chances di isolare da diversi campioni lo
stesso microrganismo. Potrà essere d’aiuto la carica microbica: se ad alta carica, la probabilità si alza (il cut-
off dovrebbe essere di circa 5 cellule batteriche per semina).
Tra gli altri parametri clinici vi sono i fattori predisponenti, bisogna valutare la presenza di una fistola, di
dolore o di ipomobilità articolare. È il clinico che valuta in base ai dati che possiede.
In conclusione
Per quanto riguarda le infezioni protesiche bisogna ricordare:
• principali microrganismi e la peculiarità dei microrganismi a lenta crescita, nell’ambito delle infezioni
protesiche ritardate;
• set base di prelievi che devono essere inviati in laboratorio (liquido sinoviale in flaconi da emocultura;
campioni protesici; campioni bioptici da un minimo di tre a un massimo di 5-6, delle dimensioni di
circa 1 cm3);
• tempi di incubazione lunghi (14 giorni).
M7.4 DERMATOFITOSI
[Non spiegato a lezione (non richiesto all’esame da Sambri) – tratto dalla dispensa Cricca]
Le dermatofitosi (o “tigne”, poiché un tempo si credeva fossero causate da vermi) sono infezioni fungine
della cute provocate da dermatofiti, funghi filamentosi che possono infettare la cute glabra, il cuoio
capelluto, le unghie e i peli. Queste infezioni sono superficiali, interessano lo strato corneo della cute, perciò
non sono microrganismi invasivi. Essi hanno come peculiare capacità enzimatica la produzione di una
cheratinasi, che permette loro di utilizzare la cheratina come fonte di nutrimento.
A sinistra le specie di dermatofita che più spesso

danno infezioni: il più frequente di tutti è il
Trichophyton rubrum.
Il processo patogenetico è unico, perché non viene

invaso nessun tessuto vitale, viene semplicemente
colonizzato lo strato corneo: la manifestazione
clinica è di tipo allergico o di tipo eczematoso,
perché i dermatofiti producono metaboliti che
possono allergizzare o dare eczema locale sulla cute
dell’ospite.
I principali agenti eziologici appartengono ai generi
Epidermophyton, Trichophyton e Microsporum.
Nell’immagine a lato osserviamo l’aspetto

microscopico dei funghi filamentosi: questi sono
chiamati macroconidi, hanno un aspetto molto
peculiare, settato, e sono importanti per
l’identificazione di specie.
130
In base alla localizzazione si parla di:

• Tinea pedis, nel caso l’infezione interessi il
piede: sono presenti lesioni desquamate, le
cui scaglie verranno raccolte in un
contenitore sterilee inviate al laboratorio a
fini diagnostici [si prende facilmente in
piscina o in palestra: le spore resistono a
lungo nel terreno, nei pavimenti, ma anche
nelle moquette e nei tappeti];
• Tinea capitis, se interessa il capo [è
caratteristica dei bambini, si manifesta
con lesioni rotondeggianti con
alopecia e si acquisisce per contatto
diretto];
• Tinea corporis, che riguarda la cute
glabra (busto e arti), è una lesione “a
medaglia”;
• Tinea cruris, nella zona inguinale o perianale.
• Tinea unguium (od onicomicosi) sotto le
unghie: è difficile che si verifichi una tigna del
letto ungueale singola, solitamente riguarda
più di un’unghia. In questo caso le scaglie ungueali da prelevare si trovano nel letto ungueale:
bisognerà scavare con un bisturi sterile sotto l’unghia (anche la terapia andrà eseguita sotto l’unghia).
https://www.youtube.com/watch?v=WyyjhA5gG7M&feature=emb_logo: link per vedere come devono

essere eseguiti i prelievi delle scaglie cutanee e ungueali. Sul sito sono presenti anche quiz.
M7.4.1 Diagnosi di dermatofitosi

In seguito alla raccolta delle scaglie cutanee e sottoungueali, si eseguirà un esame microscopico diretto del
materiale dopo digestione con KOH al 20-40%, al fine di dissolvere il tessuto (le scaglie) e rilasciare le ife
fungine.
Il materiale può essere osservato a fresco o dopo colorazione con Calcofluor white, sostanza fluorescente
che si lega alla cellulosa e alla chitina della parete fungina. Se il preparato viene osservato al microscopio a
UV, permette di evidenziare una fluorescenza delle ife fungine, settate anche in questo caso (come per
l’aspergillo).
Esiste poi l’esame colturale da effettuare sempre sulle scaglie cutanee e ungueali: i dermatofiti devono essere
coltivati a temperatura ambiente (25°C) e avere pazienza, perché, mentre l’Aspergillo impiega circa 1-2
giorni, il Mucorales meno dell’Aspergillo, il dermatofita deve rimanere in osservazione fino a 3 settimane.
Per l’identificazione di genere e di specie è, inoltre, necessaria la produzione dei macroconidi.
M7.4.2 Terapia
Per quanto riguarda le tigne della pelle la terapia fa riferimento a Miconazolo, Terbinafina, Ketoconazolo.
Per le infezioni del cuoio capelluto si possono utilizzare la Griseofulvina, Terbinafina, Itraconazolo,
Fluconazolo.
131
APPENDICE: CASI CLINICI ED ESEMPÎ DI DOMANDE

Domande di ragionamento clinico

1. Per aumentare la sensibilità della diagnosi microbiologica di polmonite di comunità (la polmonite
che si manifesta quando per esempio un paziente si presenta in PS con tosse e febbre, ma è sempre
rimasto a casa; la polmonite di comunità è diversa da quella nosocomiale), cosa si può fare oltre a
un esame colturale sull’escreato?
a. Cercare anticorpi anti-S. pneumoniae (causa più comune di polmonite di comunità).
b. Eseguire una PCR su lavaggio bronco-alveolare.
c. Fare un’emocoltura.
d. PCR sull’escreato.
La risposta giusta è la C. Questo perché si tratta di una polmonite di comunità: il paziente stava
bene, era in casa sua, e dopo (magari) cinque giorni arriva in ospedale faticando a respirare.
L’ipotesi più verosimile è che si tratti di un quadro di polmonite da S. pneumoniae, dato che il 75%
delle polmoniti di comunità, che in gergo medico vengono siglate CAP, sono da pneumococco.
Quindi perché l’emocultura? Perché la polmonite da S. pneumoniae è solitamente preceduta da
una batteriemia dello stesso batterio. Dunque, per aumentare la sensibilità della diagnosi, è bene
compiere una emocultura, ovviamente considerando che il paziente non abbia già iniziato a
prendere degli antibiotici, in questo caso l’emocoltura non avrebbe molto senso.
2. Qual è tra i seguenti parametri il più importante per ridurre il TAT (Turn Around Time), ovvero il
tempo impiegato per la positivizzazione della coltura, in un’emocoltura?
a. Tempo che intercorre tra il prelievo e l’inizio dell’incubazione: ad esempio un infermiere,
dopo aver eseguito i prelievi per fare l’emocoltura, potrebbe non riuscire a mandarli subito
in laboratorio per fare una emocultura e questo può allungare i tempi.
b. Temperatura dell’incubazione: normalmente i batterî si incubano a 36/37 °C, perché è la
temperatura alla quale la maggior parte dei germi cresce.
c. Il fatto che il paziente abbia ricevuto una terapia antibiotica empirica, quindi non mirata sul
patogeno specifico del paziente e senza aver fatto prima l’antibiogramma.
d. Orario di apertura del laboratorio.
La risposta giusta è la D. Teoricamente sono vere tutte, ma è proprio l’orario di apertura del
laboratorio che incide di più: se il paziente è effettivamente batteriemico, la positivizzazione
dell’emocoltura avviene nelle prime 12 ore (nell’80% dei casi). Questo vuol dire che se l’emocoltura
viene viene iniziata alle 9:00 del mattino ed essa si positivizza alle 21:00, il laboratorio potrebbe
essere chiuso equindi ci se ne accorgerà con 8-12 ore di ritardo. Questo può rallentare moltissimo
i tempi di diagnosi.
Inoltre, c’è un’altra problematica che concerne l’ambiente ospedaliero: se l’emocoltura si
positivizza a notte fonda, e il personale di laboratorio telefona in ospedale per comunicare il
risultato, potrebbe accadere che risponda un medico che non segue il paziente, e in questo caso
l’informazione potrebbe essere ignorata totalmente.
È molto importante che a qualsiasi ora, quindi, ci sia qualcuno in gradodi prendere delle decisioni
importanti che concernono la salute del paziente, cosa che anche noi saremo tenuti a fare.
3. La diagnosi microbiologica di infezione urinaria, cioè una infezione che si localizza dal meato
uretrale esterno fino alla pelvi renale, si ottiene principalmente con un’urinocoltura.
L’urinocoltura fatta tramite la minzione però NON è sterile, perché il tratto distale delle vie urinarie
è colonizzato da germi; quindi, per avere un risultato con valore clinico deve essere introdotta la
soglia di significatività clinica della carica batterica. In questi casi, normalmente si considera un
potenziale agente patogeno un microrganismo con una carica batterica maggiore di 1 x 105 CFU/mL
132
(carica batterica molto alta), poiché nel caso in cui sia più bassa, dato che siamo colonizzati da
moltissime specie batteriche diverse, il patogeno non viene considerato.
In quale dei seguenti casi, invece, si considera come potenziale agente infettivo un microrganismo
presente in carica batterica anche minore di 1 x 105 CFU/ml?
a. Paziente immunodepresso.
b. Paziente molto anziano, spesso i pazienti anziani sono cateterizzati per problemi di vario
tipo, soprattutto di tipo neurologico/neuromotorio, con conseguenti difficoltà nella
minzione.
c. Paziente sintomatico con una anamnesi positiva per una pregressa terapia antibiotica (es.
paziente con cistite che tre giorni prima ha preso l’antibiotico).
d. Paziente con catetere vescicale.
La risposta giusta è la C. La risposta A non è corretta, perché non è detto che l’immunodepressione
coinvolga la risposta a livello delle vie urinarie. La B non è vera, anche perché i pazienti molto anziani
sono spesso ipercolonizzati, quindi si considera significatività solo su una carica ancora più alta.
Attenzione: è ben diverso trattare una COLONIZZAZIONE rispetto ad una INFEZIONE.
La D è molto simile alla B: il catetere può “sporcarsi”, ovvero può formarsi un biofilm che attecchisce
su di esso ed è dunque normale che ci sia una carica batterica abbastanza elevata.
Nel caso della C, potremmo immaginare che un paziente si presenti in ambulatorio con febbre e
dolore alle vie urinarie alla minzione, e noi decidessimo di somministrare un antibiotico in maniera
empirica (non in maniera mirata, ma aspecifica). Il paziente potrebbe stare bene alcuni giorni, e poi
i sintomi potrebbero ricomparire in maniera più sfumata. In questo caso, la terapia empirica ha
fatto qualcosa: ha ridotto la capacità infettante del batterio, ma non lo ha eradicato
completamente. Facendo nuovamente l’urinocoltura, quindi, si troverà il germe responsabile
dell’infezione, ma con una carica batterica molto più bassa. Questo fa capire molto bene che il
laboratorio di microbiologia non ha alcun senso se non lavora a stretto contatto col clinico. Al
contrario di quello che può essere un dato di patologia clinica (es. glicemia di 190 mg/dL di plasma,
le cause possono essere diverse), in questo caso il dato permette direttamente di fare una diagnosi.
4. Nel caso di una sospetta epatite virale acuta, in cui il paziente presenta ittero, astenia,
ipertransaminasemia, quale indagine si può fare per capire subito l’agente eziologico?
a. PCR per HBV nel siero del paziente: in questo caso viene rilevato un pezzo di DNA del
genoma di HBV.
b. PCR per HBV su biopsia epatica guidata con l’ecografo.
c. HBe-Ag.
d. HBs-Ag.
e. HBs-Ab.
La risposta giusta è la D. In questo caso, se nel plasma si trova la presenza dell’antigene HBs, allora
possiamo fare una diagnosi certa: sicuramente si tratta di HBV. Attenzione: non bisogna confondersi
con gli anticorpi per HBs, questo perché avremmo segnato come positivi anche tutti i vaccinati. Se
si trovassero gli anticorpi, allora si potrebbe fare una esclusione, cioè si potrebbero
escludere le persone vaccinate contro l’epatite B. Questo non esclude che abbiano l’epatite!
Esempio di caso clinico

Siamo di fronte a un ragazzo di 17 anni che arriva in PS con 39 °C di febbre, mal di testa, vomito, rigidità
nucale e con dolore che nasce dalla schiena e arriva fino alla nuca. Negli ultimi giorni ha la sensazione di
sentirci meno e di non riuscirsi a concentrare bene. La sua anamnesi dice che è un wrestler, che ha sentito
particolarmente freddo dopo gli ultimi incontri di wrestling svoltisi negli ultimi giorni. Non fuma e non beve,
ma è stato a un festino due giorni prima. Non ha perso peso, ma avrebbe dovuto perderne per lo sport che
pratica, infatti, ha cercato di mangiare menoper tornare in forma.
133
All’esame clinico, ci sono diverse aree della cute (dorso, cosce, braccia) in cui compaiono piccole macchie
rossastre.
Qual è la diagnosi più sensata?
a. Meningite da N. gonorrhoeae.
b. Meningite da E. coli.
c. Meningite da N. meningitidis.
d. Meningite da S. pneumoniae.
e. Meningite da virus di La Crosse (LACV).
La risposta più probabile è la C. Questo perché il tempo di incubazione è abbastanza breve (due giorni), e
quindi difficilmente si potrebbe trattare di N. gonorrhoeae. Lo pneumococco, come anche l’E. coli, in un
ragazzo di 17 anni è molto improbabile che causi meningite. Il virus di LaCrosse è praticamente assente nel
territorio europeo, è invece molto più presente in America.
Quali di questi parametri sono considerati critici nella scelta diagnostica (cioè nel capire che si tratta di
quello specifico microrganismo)?
a. Il fatto che abbia mal di testa, vomito, febbre e petecchie.
b. Il party a cui ha partecipato con le ragazze.
c. Il fatto che abbia difficoltà a sentirci.
d. I sintomi da raffreddamento.
La risposta più precisa è la A, per via delle petecchie, un segno classico delle infezioni da Neisseriae. Gli altri
sintomi ci indicano soltanto la presenza di meningite, ma non il microorganismo. La difficoltà uditiva è un
sintomo secondario alla meningite e i sintomi da raffreddamento legati alla stagione invernale.
Cosa potrebbe succedere al paziente se non venisse trattato subito?

a. Il paziente rimarrebbe sintomatico per qualche giorno, e successivamente andrebbe incontro a
guarigione spontanea.
b. Il paziente manifesta via via sintomi più gravi, fino a shock e morte.
c. Il paziente migliorerebbe, però potrebbe avere una perdita permanente dell’udito.
d. Non possiamo dirlo perché non ci sono abbastanza dati.
e. Il paziente guarisce dalla fase acuta ma poi sviluppa un’artrite.
La risposta giusta è la B. La risposta E è fortemente improbabile, è difficile infatti che si sviluppi un’artrite a
seguito di un’infezione da meningococco (potrebbe invece accadere più probabilmente nel caso di una
infezione da gonococco).
Esempî di domande d’esame

• Quali sono nell’adulto le cause più frequenti di meningite?
Sono: S. pneumoniae, N. meningitidis e L. monocytogenes.
• Qual è la terapia empirica appropriata per un paziente di 65 anni con meningite batterica acuta e
Gram-stain del liquor non diagnostico (ovvero non si osserva nulla nel vetrino, situazione comune
poiché non è facile trovare cellule batteriche nel materiale patologico)?
La terapia empirica appropriata è: cefotaxime (S. pneumoniae, H. influenzae e N. meningitidis) e
ampicillina (S. agalactiae e L. monocytogenes), nel caso di resistenza vancomicina.
• Qual è la terapia per uno studente di 19 anni che frequenta il college con meningite acuta e
diplococchi Gram– all’esame microscopico del liquor?
La terapia è con cefotaxime.
• Qual è la terapia appropriata per un bambino di 2 mesi con meningite acuta da S. agalactiae?
La terapia appropriata è l’ampicillina.
134
PARTE II
PATOLOGIA
CLINICA
Patologia clinica
136
Patologia clinica
P0. INTRODUZIONE ALLA PATOLOGIA CLINICA

(prof. Treré)
La patologia clinica, altrimenti chiamata medicina di laboratorio o analisi clinica o biologia clinico-medica è
la branca della patologia generale che si occupa di analizzare i campioni biologici di tessuto, sangue o altri
liquidi e secrezioni con lo scopo di valutare i parametri fisiopatologici ed effettuare una diagnosi.
P0.1 STORIA DELLA PATOLOGIA CLINICA

Il termine “patologia clinica” è molto vasto e racchiude diverse aree di competenza. Deriva dall'anglosassone
“clinical pathology”, che era la definizione ufficiale dei servizî di anatomia patologica con sezioni di
diagnostica di laboratorio negli ospedali americani. Nei centri maggiori nacquero servizî e laboratorî
indipendenti che vennero riuniti all’interno di dipartimenti di patologia clinica. In Italia i servizî di anatomia
patologica furono i primi servizî diagnostici a possedere un proprio organico autonomo. Ben presto le attività
di analisi chimiche e di microbiologia, grazie al rapido sviluppo scientifico, vennero rese autonome nei servizî
di patologia clinica, altresì chiamati servizî di laboratorio di analisi chimico-cliniche e microbiologia, con un
proprio staff indipendente di medici, biologi, chimici, farmacisti e tecnici. Attualmente il termine è indicato
in modo equivalente anche con il nome di medicina di laboratorio, e indica l’insieme dei servizi diagnostici
attuati su materiali biologici prelevati a pazienti. A tal proposito, la disciplina si avvale di diverse metodologie
diagnostiche:
• valutazione macroscopica: l’ispezione visiva del fluido prelevato è il primo parametro di valutazione
attuato dal medico;
• valutazione microscopica: l’analisi morfologica microscopica del campione si effettua mediante
apposite tecniche e permette di esaminare la morfologia cellulare, evidenziare la presenza di cellule
batteriche o altri agenti patogeni e individuare marker infiammatori e tumorali. Le metodiche
utilizzate comprendono le colorazioni, l’immunofluorescenza, l’immunoistochimica, FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization) e così via;
• analizzatori: sono macchinarî deputati all’analisi computerizzata di campioni biologici, utilizzando i
principi della robotica e della spettrofotometria. Sono di particolare utilità nelle indagini biochimiche
ed ematologiche;
• colture cellulari: ricoprono un ruolo fondamentale in campo diagnostico, in particolare nell’ambito
della microbiologia medica. Infatti, i campioni corporei possono essere posti su un terreno di crescita
opportuno per evidenziare la crescita di agenti batterici o altri agenti infettivi responsabili di una
patologia o un disturbo.
P0.2 PERCORSO DI FORMAZIONE

Il patologo clinico è uno specialista di laboratorio che lavora su campioni biologici effettuando indagini di
morfologia macro e microscopica, analisi chimiche, immunologiche, microbiologiche e molecolari. Esistono
due indirizzi professionali della scuola di Specializzazione in Patologia Clinica, uno medico e uno tecnico,
accessibile ai laureati dell'area sanitaria (biologi, farmacisti, biotecnologi). Il medico specialista in patologia
clinica, o patologo clinico, possiede competenze e conoscenze nella diagnostica di laboratorio e nella
prevenzione delle malattie dell'uomo. Lo specialista in patologia clinica a indirizzo tecnico possiede
competenze e conoscenze nella diagnostica di laboratorio, nell'organizzazione di laboratori e nel controllo di
qualità.
In Italia nel 1947 nacque la AIPaC, Associazione Italiana Patologia Clinica, che ha recentemente preso il nome
di AIPaCMeM Associazione Italiana di Patologia clinica e Medicina Molecolare.
137
Patologia clinica
P1. LE PROTEINE DEL SANGUE

(prof. Treré)
P1.1 GENERALITÀ SULLE PROTEINE DEL SANGUE

Le proteine del sangue vengono studiate poiché hanno un significato diagnostico molto importante. Nel
nostro organismo il numero di proteine presenti, in generale, è molto elevato e un centinaio di queste circola
nel sangue periferico. Queste ultime sono quindi facilmente accessibili, poiché basta un prelievo di sangue
per dosarle. Nonostante il numero di proteine nel sangue periferico sia molto inferiore rispetto a quelle totali
nel nostro organismo, queste sono estremamente utili nell’inquadrare la presenza o meno di patologie
importanti. L’utilità dell’esame di laboratorio sta nel fatto di poter valutare eventuali variazioni qualitative e
quantitative delle proteine nel sangue che hanno un significato diagnostico e quindi ci possono aiutare
appunto a valutare la presenza della patologia.
La maggior parte di queste proteine sono sintetizzate prevalentemente dal fegato, mentre sono anche
presenti:
• un 20%, quindi una quota minore, che viene sintetizzata dalle plasmacellule e consistono nelle
immunoglobuline (o anticorpi);
• elementi del complemento e quindi sintetizzate dal sistema monocito-macrofagico;
• apolipoproteine prodotte dalla parete intestinale;
• ormoni proteici circolanti prodotti da specifiche cellule a funzione endocrina.
Nel loro insieme le proteine formano una soluzione relativamente stabile e si suddividono in base alla
solubilità in albumine (solubili in acqua) e globuline (solubili in soluzioni saline diluite).
Quando possibile in laboratorio si preferisce lavorare sul siero. Il plasma è la componente liquida del sangue,
dopo che questo è stato privato della componente corpuscolata. Il siero è il plasma senza i fattori della
coagulazione. In laboratorio si preferisce utilizzare il siero perché, pur avendo un campione di sangue con
anticoagulanti, i fattori della coagulazione possono determinare interruzioni dei circuiti automatici di analisi.
Buona parte dell’attività diagnostica di laboratorio viene effettuata tramite strumenti automatizzati, poiché
a parte la diagnosi molecolare, nessuna diagnosi viene più fatta a mano, per cui i campioni biologici seguono
dei percorsi in queste macchine dove vengono processati. Il materiale che arriva in laboratorio è trattato con
sostanze anticoagulanti: tuttavia, quando il plasma viene processato, si possono formare al suo interno dei
piccoli coaguli che interferiscono con il processo di analisi. È preferibile perciò, quando possibile, utilizzare il
siero, da cui il nome di “proteine sieriche” per le proteine che vengono analizzate. In condizioni normali, la
concentrazione delle proteine sieriche varia tra 6-8 g/dL.
P1.2 ELETTROFORESI DELLE PROTEINE SIERICHE

In laboratorio si utilizza la tecnica elettroforetica per l’analisi
delle proteine sieriche: questa tecnica prevede la separazione
dell’insieme eterogeneo delle proteine nelle diverse componenti,
utilizzando un campo elettrico. Sono, infatti, presenti un anodo o
polo positivo, da cui le proteine partono, e un catodo o polo
positivo, verso cui le proteine, che sono cariche negativamente
(essendo sostanze anfoteriche in un ambiente basico), si
muovono. Il movimento dipende sia dalla quantità di carica
negativa che dalla massa proteica. Le proteine più piccole e
cariche migreranno quindi più velocemente, mentre quelle più
grandi e meno cariche rimarranno praticamente nel punto di
semina. La migrazione avviene quindi con una velocità
direttamente proporzionale alla loro carica elettrica e
138
Patologia clinica
inversamente proporzionale al loro peso molecolare, dividendosi in frazioni distinte chiamate “bande” o
“zone” di migrazione.
Originariamente questa tecnica consentiva di separare quattro tipi di proteine in quattro bande: il primo
consistente nel gruppo di proteine più veloci, che in realtà ne contiene soltanto una, l’albumina, e poi altri
tre gruppi denominati con le lettere greche α, β e γ. Oggi le tecniche più moderne dividono il gruppo α in α1
e α2. Normalmente, dunque, dalla separazione elettroforetica delle proteine sieriche si individuano i seguenti
gruppi o bande:
• albumina (3,2 - 5,6 g/dL; 52 – 68%);
• α1 globuline (0,1 - 0,4 g/dL; 2,4 – 5,3%);
• α2 globuline (0,4 - 1,2 g/dL; 6,6 – 13,5%);
• β globuline (0,6 - 1,3 g/dL; 8,5 – 14,5%);
• γ globuline (0,5 - 1,6 g/dL; 10,7 – 21%);
Il rapporto albumina/globuline varia da 1,2 a 1,7.
Dalla scansione tramite densitometro, dopo aver separato le

proteine e averle colorate, si ottiene un tracciato (quadro siero
proteico o protidogramma) che presenta dei picchi in
corrispondenza di ciascuna banda. Il picco ha un’altezza
proporzionale all’intensità di colorazione della banda e una base
proporzionale alla larghezza della banda, per cui l’area sottesa al
picco è proporzionale alla concentrazione di proteine contenute
nella banda. Pertanto, misurando l’area dei diversi picchi,
riusciamo a ottenere un’espressione percentuale delle cinque
bande i cui valori sono quelli riportati nell’elenco in alto (non sono
da memorizzare, ma è importante osservare che l’albumina da sola corrisponde ad almeno il 60-61% della
quantità delle proteine sieriche e ricordare indicativamente i valori degli altri gruppi, anche gli uni rispetto
agli altri).
Le alterazioni di questi picchi o bande ci possono essere utili nella diagnosi di patologie specifiche. È quindi
necessario innanzitutto conoscere la composizione di queste cinque bande.
P1.2.1 Albumina
È la proteina ematica più abbondante e infatti è la principale responsabile della pressione oncotica nel
plasma. Ha un’emivita di circa 2-3 settimane (da ricordare). La sua funzione oltre a determinare e regolare la
pressione oncotica del sangue, è quella di trasferire e veicolare:
• sostanze insolubili nel sangue periferico (bilirubina, acidi grassi non esterificati);
• ormoni (tiroxina, triiodiotironina, cortisolo, aldosterone);
• farmaci (salicilati, warfarina, clofibrato, fenilbutazone);
• ioni (il 40% del calcio sierico).
[Da slide] La sua concentrazione plasmatica viene utilizzata principalmente come indice di funzionalità
epatica e dello stato nutrizionale: l’albuminemia diminuisce inoltre nelle nefropatie con proteinuria, nelle
ustioni, e nelle enteropatie protido-disperdenti. La riduzione dei suoi livelli plasmatici costituisce un elemento
caratterizzante la “risposta della fase acuta” (è una proteina della fase acuta).
Prealbumina o transtiretina
[non trattata a lezione]
• Denominata “prealbumina” in quanto migra davanti alla albumina, o “trans-ti-retina” in quanto
veicola la tiroxina e la RBP (retinol binding protein).
• È sintetizzata dal fegato ed è presente nel siero e nel liquor, dove costituisce una delle componenti
proteiche maggiori.
• Svolge principalmente una funzione di trasporto per aminoacidi, enzimi, farmaci, ormoni e vitamine.
139
Patologia clinica
• Ha un’emivita di due giorni e, per questo motivo, rappresenta un indice di funzionalità epatica e/o
dello stato nutrizionale più precoce rispetto all’albumina.
• Come l’albumina, i suoi livelli plasmatici si riducono durante la “risposta della fase acuta”.
P1.2.2 Banda α1
Anche questa è costituita per la maggior parte (90%) da un’unica proteina, l’α1-antitripsina (AAT).
α1-antitripsina
Il prefisso “α1” fa riferimento alla famiglia di proteine di appartenenza,
mentre il nome “antitripsina” è correlato alla funzione anti-proteasica di
questo enzima. Questa proteina è un inibitore della tripsina, ma l’attività
inibitoria si estende in realtà a più enzimi, svolgendo un’ampia attività anti-
proteasica. Si lega a elastasi, collagenasi, chimotripsina, plasmina e
trombina. Questi sono enzimi che vengono liberati dai polimorfonucleati
neutrofili durante un processo infiammatorio, poiché hanno attività
antibatterica.
Le proteine come l’α1-antitripsina sono necessarie a tamponare l’azione
isto-lesiva che potrebbero avere questi enzimi nei confronti delle cellule
dell’organismo. Essi, infatti, hanno la proprietà di distruggere i batterî, ma
potrebbero anche danneggiare le cellule proprie.
Il deficit di α1-antitripsina può causare enfisema polmonare ed epatopatia:
• la patologia polmonare si manifesta con broncopneumopatia cronica ostruttiva ed enfisema, tra la
terza e la quarta decade di vita. La malattia colpisce il polmone perché, soprattutto nei soggetti
fumatori o in quelli che vivono in ambienti con un alto tasso di inquinamento, vi è uno stimolo
irritativo cronico e basale a livello polmonare, che determina quindi una risposta flogistica continua.
Se manca l’α1-antitripsina, vi è una mancata inibizione soprattutto dell’elastasi, rilasciata dai leucociti
in risposta alla presenza di agenti irritanti nelle vie respiratorie, che distrugge le fibre elastiche del
parenchima polmonare, determinando l’enfisema;
• la malattia epatica è una vera e propria epatite dovuta a una patologia di accumulo. L’enzima nella
sua forma mutata non può essere infatti trasferito dal reticolo endoplasmatico degli epatociti
all’apparato di Golgi, accumulandosi nel primo. La malattia può essere piuttosto pericolosa, si
manifesta in età pediatrica e può evolvere in cirrosi e in epatocarcinoma.
La patologia da deficit di α1-antitripsina si trasmette come carattere autosomico recessivo con un’incidenza
di 1/2000-4000 nati vivi: è quindi, pur rimanendo relativamente rara, una tra le più comuni malattie
genetiche gravi. Si conoscono ad oggi più di 75 varianti del gene (SERPINA1, da SERine Protease INhibitor A1,
si trova sul cromosoma 14) e vengono classificate con le lettere dell’alfabeto. Una ventina di queste varianti
possono determinare una modificazione nell’attività dell’enzima, con conseguente manifestazione
patologica:
• la variante M è quella che si potrebbe definire “normale”, non è un termine corretto, ma sta a
indicare il fatto che è la più diffusa, poiché è presente in omozigosi in più del 90% della popolazione
europea ed è associata a normali valori dell’enzima;
• la variante Z:
o in omozigosi è pericolosa, poiché determina in questo caso una riduzione dei livelli di enzima
circolante dell’85-90%: questi pazienti hanno un elevato rischio di sviluppare la patologia
polmonare e nel 20% dei casi sviluppano una epatopatia;
o in eterozigosi (con variante M) la riduzione dell’attività dell’enzima è solo del 50% e mancano
quindi le manifestazioni cliniche;
• la variante S:
o in omozigosi causa riduzione del 40% dell’enzima rimanendo però asintomatica;
o in eterozigosi con la variante Z è pericolosa, causando soprattutto manifestazioni cliniche in
soggetti fumatori o in soggetti che abitano in aree urbane ad elevato tasso di inquinamento;
140
Patologia clinica
• la variante Null, molto rara, è però quella più pericolosa tra quelle conosciute, in omozigosi è
associata alla totale assenza dell’enzima e ad un elevatissimo rischio di sviluppare la patologia
polmonare ed epatopatia.
Curiosità: la patologia da deficit descritta finora, per quanto rara e pericolosa, potrebbe essere più
usuale di quanto si pensa: molto probabilmente due famosi musicisti, Chopin e Michael Jackson, soffrivano di
tale malattia.
Altre α1-globuline
Fra le altre alfa1-globuline si hanno:
• α1-glicoproteina acida (od orosomucoide): la sua funzione non è ancora perfettamente compresa,
ma le omologie nella sequenza amminoacidica con le immunoglobuline suggeriscono un suo ruolo
ancestrale nel sistema immunitario. È una proteina della fase acuta (che aumenta in particolare in
corso di malattie autoimmuni, quale il lupus eritematoso sistemico e l’artrite reumatoide) e un
inibitore del progesterone;
• α1-fetoproteina: è una albumina fetale sintetizzata nel sacco vitellino e, a partire dal 4° mese di
gravidanza, dal fegato fetale; dall’8° mese la sua concentrazione sierica decresce rapidamente,
consensualmente a un’aumentata produzione di albumina. Durante la gravidanza un suo aumento
indica difetti del tubo neurale, spina bifida o gravidanza gemellare, mentre una sua riduzione è
associata alla sindrome di Down. In età adulta il suo aumento è associato alla presenza di
epatocarcinoma;
• α-lipoproteine (HDL): le lipoproteine hanno una componente lipidica e una proteica. Le lipoproteine
possono essere classificate in base alla loro densità (HDL, LDL, VLDL) o sfruttando la tecnica
elettroforetica. In base a dove esse si fermano sul gel si possono individuare le α-lipoproteine, che
corrispondono alle HDL.
P1.2.3 Banda α2
Il picco α2 è costituito da due proteine fondamentali: la α2-macroglobulina e la aptoglobina.
α2-macroglobulina
L’α2-macroglobulina è molto grande, ha un peso molecolare di 800 kDa ed è
quindi seconda in dimensioni solo alle IgM, le immunoglobuline pentameriche.
Ha una funzione simile a quella dell’α1-antitripsina: un’anti-proteasi aspecifica,
che interviene anche nella regolazione dei processi emocoagulativi (insieme alla
α2-antiplasmina, inibisce l’azione fibrinolitica della plasmina sulla fibrina,
legandosi a essa), nella risposta immunitaria e nel trasporto di ormoni
(somatotropo e insulina). Non essendo state ancora riconosciute malattie da
deficit congeniti, si può dedurre che le malattie da deficit siano incompatibili con
la vita. Data la sua dimensione, nelle sindromi nefrosiche, come nelle
glomerulopatie importanti in cui il danno glomerulare è molto rilevante e si
altera il filtro glomerulare, determinando il passaggio delle proteine
plasmatiche, la macroglobulina non passa, rimane nel siero. Quindi non viene
dispersa nelle urine, anche in caso di glomerulopatie. Non è una proteina della
fase acuta.
Aptoglobina
L’aptoglobina ha la funzione di intercettare l’emoglobina che si libera dai globuli rossi. Vi sono infatti delle
tipologie di anemie, ossia le anemie emolitiche, che sono rare, ma possono provocare la liberazione di grandi
quantità di emoglobina. Questa quando arriva al glomerulo viene filtrata ed eliminata tramite le urine. In
questo modo si perde l’emoglobina, ma soprattutto il ferro contenuto in essa. L’aptoglobina, quindi,
intercetta l’emoglobina liberata in seguito a emolisi intravascolare, la capta e fa in modo che quindi il ferro
non venga eliminato tramite l’urina: il complesso aptoglobina-emoglobina viene rimosso dal plasma ad
141
Patologia clinica
opera del sistema reticolo-endoteliale e metabolizzato in AA e ferro. Nelle emolisi intravascolari i livelli
ematici di aptoglobina risultano ridotti, mentre aumentano in corso di neoplasie, traumi e processi
infiammatorî. Solo quando le anemie sono di grande entità l’azione dell’aptoglobina non riesce a rimediare
all’eliminazione dell’emoglobina.
L’emoglobinuria, il riscontro di emoglobina nelle urine, è l’espressione di una crisi emolitica che ha superato
le capacità di recupero dell’aptoglobina.
Nelle emolisi intravascolari i livelli ematici di aptoglobina risultano ridotti; l’aptoglobina aumenta, invece, in
corso di neoplasie, traumi e processi infiammatori.
Altre α2-globuline
Sono presenti anche altre proteine del picco α2, che però sono meno rilevanti:
• ceruloplasmina: deputata al trasporto del rame (proteina della fase acuta);
• α2-antiplasmina: inibisce l’azione fibrinolitica della plasmina (proteina della fase acuta);
• proteina trasportatrice della vitamina D (vitamin D binding protein, DBP);
• pre-β-lipoproteine (VLDL).
P1.2.4 Banda β
Sono distinguibili due tipi: β1 e β2, osservabili solo nei tracciati più raffinati,
non in quelli della routine diagnostica.
Nel picco β vengono espresse principalmente la transferrina (β1), proteina
deputata al trasporto di ferro nel plasma, e il fattore C3 del complemento
(β2), proteina della fase acuta.
Nelle anemie sideropeniche i livelli plasmatici di transferrina aumentano
come meccanismo di compenso per la conservazione del ferro, dando
origine ad un modesto picco nella regione β; aumentati livelli di transferrina
si riscontrano anche nella gravidanza e in corso di terapie estro-
progestiniche.
Transferrina
La transferrina (β1) (nei tracciati elettroforetici meglio condotti è possibile
distinguere un picco β1 e β2) è la proteina deputata al trasporto del ferro nel plasma.
Quando manca il ferro, e siamo in condizione quindi di sideropenia, i livelli plasmatici di transferrina
aumentano come meccanismo di compenso per la conservazione del ferro, dando origine a un meccanismo
inutile, poiché anche se si aumenta il trasportatore, la sostanza trasportata, ossia il ferro, non aumenta.
Tuttavia, il picco β1 può andare incontro a un modesto aumento. Aumentati livelli di transferrina si
riscontrano anche nella gravidanza e in corso di terapie estro-progestiniche. È una proteina negativa della
fase acuta.
Altre proteine della banda β

Tra le altre proteine della banda β abbiamo:
• frazione C3 del complemento (β2) (proteina della fase acuta);
• antitrombina III: inibitore della cascata coagulativa, specialmente agendo sul fattore II (trombina), e
sui fattori IX, X, XI e XII (proteina della fase acuta);
• β2-microglobulina: catena leggera degli antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità di
classe I (MHC I);
• β2-lipoproteine (LDL).
P1.2.5 Banda γ
Tra le proteine della banda γ ritroviamo:
142
Patologia clinica
• Immunoglobuline (γ-globuline): si tratta degli anticorpi. Sono divise in cinque

classi: IgG, IgA, IgM, e, meno rappresentate in condizioni normali, IgD e IgE. Le
IgA sono un po’ più veloci nella migrazione, le IgM intermedie, le IgG più
numerose e un po’ più lente.
• Proteina C reattiva, importante indice di flogosi, che è presente in quantità

minime, tanto che non modifica la forma del tracciato. Il suo nome deriva dalla
capacità di legare il polisaccaride C dello Streptococcus pneumoniae. In realtà
è anche in grado di legarsi a molti altri polisaccaridi presenti su specie
batteriche, protozoi e parassiti. (L’acronimo di questa è PCR, da non
confondere con la reazione a catena della polimerasi).
La funzione di questa proteina è:
1. legare questi target su specie soprattutto batteriche, in modo da attivare la via classica del
complemento (attraverso il fattore C1q) e quindi contribuire alla regolazione della risposta
infiammatoria;
2. è anche un’opsonina, poiché legandosi a queste sostanze estranee presenti ad esempio sui
batterî, permette il loro riconoscimento da parte dei leucociti e la successiva fagocitosi.
Dal punto di vista laboratoristico ha un ruolo fondamentale nel monitoraggio delle malattie
infiammatorie.
Non si conoscono neanche in questo caso delle malattie da deficit di questa proteina, che risulta
quindi fondamentale per la vita.
Se si facesse un’elettroforesi del sangue intero, si avrebbe anche un contributo del fibrinogeno, che è il
fattore di coagulazione che ha la maggiore concentrazione a livello plasmatico, tanto da poter essere rilevato
appunto nel tracciato elettroforetico.
Il fibrinogeno è classificato da alcuni
tra le β-globuline: tra i fattori della
coagulazione è quello a più elevata
concentrazione plasmatica (200-400
mg/dL).
Considerando l’immagine di fianco si
può vedere che a sinistra vi è un
grafico relativo all’analisi del siero,
mentre a destra vi è quello relativo al
sangue intero, in cui possiamo
osservare tra il picco β e il γ quello del fibrinogeno.
P1.3 CONDIZIONI ASSOCIATE AD ALTERAZIONI SPECIFICHE DEL TRACCIATO

ELETTROFORETICO DELLE PROTEINE SIERICHE
Le proteine sieriche sono importanti perché le loro alterazioni qualitative e quantitative possono essere utili
nella diagnosi di patologie. Esse rappresentano uno strumento diagnostico importante, a basso costo e di
facile interpretazione.
P1.3.1 Infiammazione acuta o lesioni distruttive

È un quadro che si determina generalmente a seguito di lesioni distruttive: neoplasie, necrosi, ustioni, traumi,
danni cellulari che determinano una risposta di tipo infiammatorio. Il tracciato elettroforetico delle proteine
sieriche a seguito di un evento di questo tipo subisce delle modifiche. In particolar modo si osserva:
• un aumento marcato delle α2-globuline da attribuire in particolare a un aumento dell’aptoglobina;
• un aumento meno marcato delle α1-globuline (in particolare di α1-antitripsina);
• aumenta anche la PCR, ma non determina variazioni evidenti nel profilo elettroforetico.
143
Patologia clinica
P1.3.2 Infiammazione cronica

Il grafico in questo caso mostra:
• un aumento di α2-globuline (da imputare sempre all’aptoglobina);
• un aumento più evidente delle γ-globuline (immunoglobuline). L’aumento di questo picco in questo
caso viene definito a “base larga”.
L’aumento delle γ-globuline sarà questa volta più rilevante dell’aumento delle α2-globuline.
P1.3.3 Epatopatia cronica

Qualsiasi danno cronico al fegato compromette la sua capacità di produrre proteine, anche quelle
plasmatiche. Si avranno pertanto:
• una diminuzione delle α1-, α2- e β-globuline;
• un aumento delle γ-globuline.
L’aumento immunoglobulinico è sia relativo, in quanto la produzione delle altre globuline cala, sia assoluto,
nel caso ci sia ad esempio un’epatite cronica, che porta a iperproduzione di γ-globuline.
Il fegato, tra le tante, ha anche la funzione di smaltire le immunoglobuline provenienti dal circolo ematico,
contribuendo di fatto alla loro clearance. Un’insufficienza epatica, quindi un deficit funzionale epatico, può
determinare una riduzione di questa clearance.
Un indice importante per misurare l’entità di questo processo è il rapporto albumina/globuline. Questo
rapporto fisiologicamente è sempre sopra l’unità (tra 1,2 e 1,7), tuttavia quando diventa sub-unitario allora
si può sospettare una condizione di questo tipo, in cui la clearance immunoglobulinica sia compromessa.
144
Patologia clinica
P1.3.4 Sindrome nefrosica

È una grave glomerulopatia associata a proteinuria elevata, ipoalbuminemia, edemi generalizzati,
iperlipidemia, ipercolesterolemia.
A livello glomerulare, fisiologicamente, le proteine più piccole dell’albumina vengono filtrate e
successivamente riassorbite a livello tubulare, non vengono eliminate con le urine. L’albumina e le grandi
proteine non vengono filtrate.
Quando c’è un danno al glomerulo, viene persa la capacità di filtrazione selettiva e passano anche le proteine
più grandi (come l’albumina), di conseguenza si ha proteinuria, diminuisce la pressione oncotica e si
riscontra edema.
La maggior parte delle grandi proteine (principalmente albumina) viene dispersa, anche le immunoglobuline,
ad eccezione della α-macroglobulina, che avrà un aumento relativo e così farà aumentare anche il picco
delle α2-globuline.
In questa situazione si può cogliere anche l’aumento delle β-globuline, dovuto all’azione compensatoria del
fegato, che cerca di rimediare alla diminuzione della pressione oncotica con un aumento della produzione di
lipoproteine (tra cui β-lipoproteine e pre-β-lipoproteine). Si hanno quindi iperlipidemia e ipercolesterolemia.
In alcuni casi si può riscontrare anche un aumento del picco delle γ-globuline segnatamente a un aumento
delle IgM, di maggiori dimensioni.
P1.3.5 Gammopatia monoclonale

Si può evidenziare un aumento a “base stretta” del picco delle γ-globuline, caratteristico di malattie
linfoproliferative quali il mieloma multiplo, la macroglobulinemia di Waldenström e alcuni casi di linfoma.
In queste patologie si ha un’aumentata produzione di immunoglobuline monoclonali.
Ad esempio, nel mieloma multiplo le plasmacellule cominciano a proliferare in maniera incontrollata e
producono solo un clone di immunoglobuline. Il mieloma multiplo, infatti, è la classica neoplasia di origine
monoclonale.
Nel caso in esame, la frazione di γ-globuline supera anche quella dell’albumina.
P1.3.6 Agammaglobulinemia
È un’immunodeficienza congenita a carico dei linfociti B: condizione rara, ma molto pericolosa, che non
consente al soggetto di produrre anticorpi. A questa può essere associato anche un deficit di linfociti T.
145
Patologia clinica
Nel profilo si osserva l’assenza del picco γ.
P1.3.7 Altre condizioni

Altre condizioni associate ad alterazioni del profilo elettroforetico:
• anemia sideropenica: modesto aumento delle β-globuline (β1) per aumento della transferrina;
• deficit di α1-antitripsina: riduzione/scomparsa del picco delle α1-globuline.
P1.4 INDICI DI FLOGOSI

Gli indici di flogosi sono di importanza fondamentale nella routine diagnostica poiché permettono di
diagnosticare e monitorare il processo flogistico in atto.
In riferimento agli indici di flogosi è necessario considerare:
• le proteine della fase acuta;
• la VES (velocità di eritrosedimentazione).
P1.4.1 Proteine della fase acuta

Il processo di flogosi è caratterizzato da una serie di reazioni locali ma anche sistemiche. Esistono infatti dei
mediatori chimici che vengono prodotti nel sito di infiammazione e che hanno come target delle molecole
presenti in sedi anche molto lontane. L’insieme di sintomi sistemici prende il nome di fase acuta. Con “fase
acuta” si fa riferimento all’insieme di eventi sistemici che accompagnano l’infiammazione acuta. La fase acuta
è sostenuta e regolata da mediatori chimici liberati dal sito o dai siti dell’infiammazione che hanno come
bersaglio specifici recettori posti su cellule distanti dal luogo della loro secrezione. L’evento sistemico più
importante che accompagna la fase acuta è la febbre, ma ve ne sono altri, quali anoressia, sonnolenza,
leucocitosi, aumentata sintesi di alcuni ormoni (ACTH, cortisolo, adrenalina). È di grande rilevanza
l’aumentata produzione da parte del fegato di una serie di proteine, indicate come proteine della fase
acuta.
La riposta della fase acuta è:
• veloce;
• efficace (vi sono ovviamente dei limiti) à è un indicatore sensibile di flogosi;
• standardizzata à rappresenta un grande limite diagnostico, in quanto la manifestazione clinica è
sempre la stessa, indipendentemente dallo stimolo che l’ha prodotta;
• aspecifica à è sempre uguale indipendentemente dalla causa che l’ha prodotta. Questo rappresenta
un limite dal punto di vista diagnostico perché si ha un quadro clinico che può essere dovuto a cause
estremamente diverse tra di loro (fra le più importanti si ricordano infezioni, reazioni immuno-
allergiche, ipossia, infarti, traumi, ustioni, interventi chirurgici e neoplasie maligne).
Si definiscono proteine della fase acuta tutte le proteine la cui concentrazione plasmatica aumenta almeno
del 25% durante un processo infiammatorio. Sono circa trenta.
146
Patologia clinica
Il mediatore che comunica al fegato che deve produrre queste proteine è l’IL-6, liberata a livello del sito di
infiammazione sia da cellule del SI, ma anche da fibroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali. La produzione
di IL-6 è a sua volta stimolata da IL-1 e TNF-α, prodotti dai macrofagi.
Le proteine della fase acuta vengono prodotte in quanto giocano un ruolo importante nella regolazione del
processo infiammatorio. Tra queste proteine infatti vi sono:
• proteine pro-infiammatorie: opsonina, fattori chemiotattici, ecc., che favoriscono la flogosi;
• proteine antinfiammatorie: sono in realtà la maggior parte e arginano il processo infiammatorio. Il
fegato produce queste proteine per limitare tutti quegli eventi isto-lesivi di cui il tessuto normale
risentirebbe inevitabilmente nel momento in cui si cercasse di debellare l’infezione provocata da un
microrganismo. Ci sono casi in cui i danni prodotti dalla risposta infiammatoria sono maggiori di quelli
prodotti dal microrganismo (come accade ad esempio in caso di Covid-19), pertanto il ruolo di queste
proteine antinfiammatorie della fase acuta è fondamentale.
Le proteine della fase acuta fanno parte di tutte le

bande viste precedentemente: α1-, α2-, β-, γ- principali proteine della fase acuta
globuline. Fra le proteine della fase acuta si • a1 an%tripsina
riconosce anche la proteina sierica dell’amiloide • a1 glicoproteina acida
(SAA). Questa lega le HDL, lipoproteine che
• a1 an%chimotripsina
prendono il colesterolo dai tessuti e lo portano al
• proteina sierica dell’amiloide A (SAA) (a1)(*)
fegato, dunque se SAA viene prodotta
eccessivamente lega le HDL e comporta una • aptoglobina ( 2)
a
riduzione della loro funzionalità; in condizioni di • ceruloplasmina (a2)
cronicità tutto ciò può favorire l’amiloidosi • an%trombina III (b)
secondaria. • FC3 del complemento (b2)
La SAA si lega all’isoforma 3 delle HDL spiazzando la • plasminogeno (b2)
Apo-A1, che regola il trasporto inverso (dalla • fibrinogeno (b/g)
periferia al fegato) del colesterolo: le HDL ricche di • proteina C reaBva ( b/g)
SAA presentano un’affinità ridotta per gli epatociti
( )
e
* famiglia di apolipoproteine che si legano alle HDL, coinvolte nei processi di rimozione del
incrementata per i macrofagi.
colesterolo dai tessu: danneggia: dall’infiammazione. Una volta sinte:zzata e secreta dal
fegato la SAA si lega all’isoforma 3 delle HDL spiazzando la Apo-A1, che regola il trasporto
Le proteine della fase acuta hanno funzioni diverse:
inverso (dalla periferia al fegato) del colesterolo: le HDL ricche di SAA presentano un’affinità
• alcune (fattori del complemento, PCR) ridoIa sono
per gli epatoci:
opsonine e incrementata
e fattori per i macrofagi. La persistente
chemiotattici produzione
per neutrofili e di SAA
nell'infiammazione cronica può portare allo sviluppo di amiloidosi secondaria
macrofagi;
• altre (a1-antitripsina, a1-antichimotripsina) sono antiproteasi che neutralizzano le proteasi liberate
da neutrofili e macrofagi;
• i fattori della coagulazione come il fibrinogeno bloccano le emorragie, contribuiscono a
intrappolare i microrganismi nel focolaio infiammatorio e promuovono la guarigione delle ferite;
• aptoglobina, emopessina e ceruloplasmina sono degli “spazzini” (scavengers) dei residui dei
processi distruttivi, in quanto hanno azione antiossidante e riducono i livelli dei radicali liberi
dell’ossigeno che si liberano dalla reazione infiammatoria. È fondamentale che il tessuto venga
“pulito”, in quanto i detriti residuati sono flogogeni e fanno persistere l’infiammazione;
• altre (proteina C reattiva) si legano a particelle estranee o a detriti cellulari e ne promuovono la
clearance, contribuendo a eliminare materiale che potrebbe fare persistere l’infiammazione e
produrre reazioni autoimmunitarie contro antigeni nucleari;
• emopessina e ceruloplasmina sono proteine leganti metalli che prevengono perdite di ferro,
trasportandolo alle cellule del sistema reticolo endoteliale e sottraendolo così ai batterî.
Le proteine della fase acuta svolgono un ruolo importante e da un punto di vista laboratoristico possono
essere utilizzate come indice di flogosi per diagnosticare e monitorare l’andamento del processo di
infiammazione. Teoricamente vi sono circa 30 proteine della fase acuta, ma non avrebbe senso monitorarle
147
Patologia clinica
tutte; bisogna ricercare quelle dal monitoraggio più efficace. La proteina che meglio si adatta a una
valutazione diretta e quantitativa della risposta della fase acuta è la proteina C reattiva.
Proteina C reattiva (PCR)

La proteina C reattiva ha una emivita breve (<24 ore) e una velocità di eliminazione dal sangue costante,
pertanto la sua concentrazione plasmatica dipende esclusivamente dalla entità della sintesi epatica. In
assenza di infiammazione, poi, la sua concentrazione ematica è bassa (circa 1 mg/L) e non dipende né dall’età,
né da fattori individuali; inoltre sono pochi i processi patologici che non determinano un incremento (elevato
o modico) dei livelli plasmatici di questa proteina.
Il grafico illustra il monitoraggio delle varie proteine della fase acuta prodotte a seguito di un danno tissutale
rilevante in un animale da laboratorio.
È evidente che la PCR (linea rossa) aumenta immediatamente e in maniera molto evidente a seguito dello
stimolo infiammatorio. L’aumento della PCR si inizia a osservare 6-8 ore dopo il danno tissutale e procede in
maniera esponenziale, raggiungendo il picco massimo dopo 48 ore, quando ha valori anche centinaia di volte
superiori a quelli di riferimento.
La proteina C reattiva è quindi l’indicatore più affidabile per diagnosticare e monitorare i processi
infiammatori.
Anche la SAA (linea blu) è interessata da un

aumento abbastanza consistente e repentino della
sua produzione. Al terminare dello stimolo
infiammatoria però la PCR è più celere nel ritornare
al valore di riferimento rispetto alla SAA. Proprio
per questa caratteristica la PCR è utilizzata come
indice di flogosi.
Le altre proteine come l’aptoglobina (linea gialla),

il fibrinogeno (azzurro), i fattori del complemento
(viola) sono caratterizzati da una produzione con
picchi più bassi molto più tardivi rispetto allo
stimolo infiammatorio (11-15 gg), dunque è chiaro
come siano meno efficaci per un monitoraggio
accurato.
Altre proteine sieriche vanno incontro a una riduzione della propria concentrazione ematica durante un
processo infiammatorio (es. albumina, che diminuisce in caso di sindrome nefrosica, transtiretina, α1-
fetoproteina, retinol binding protein, transferrina, fattore XII). La diminuzione di concentrazione ematica è
però troppo lieve e dunque non è un indice di flogosi efficace. Queste vengono chiamate “proteine negative
della fase acuta”, ma non hanno possibilità di competere con la PCR in ambito laboratoriale. Il significato
della riduzione di queste proteine durante la fase acuta e i meccanismi che ne regolano le variazioni
plasmatiche non sono stati ancora perfettamente chiariti.
P1.4.2 Velocità di eritrosedimentazione (VES)

Il secondo indice di flogosi è la VES, acronimo di velocità di eritrosedimentazione.
È stato osservato in passato che effettivamente prendendo provette di sangue

(a cui viene aggiunto anticoagulante) di diversi pazienti, vi sia una differenza tra
i livelli dei globuli rossi nel corso del tempo. I globuli rossi sono infatti spinti
verso il basso dalla forza di gravità, avendo densità maggiore al plasma, ma la
velocità con cui questi cadono è variabile. Con riferimento alla figura, si osserva
una notevole differenza nell’estensione dell’“anello giallo” nei diversi campioni.
148
Patologia clinica
La velocità di caduta varia da paziente a paziente, a seconda delle loro condizioni: il primo ad accorgersi di
ciò fu un ginecologo, il quale notò che le donne in gravidanza avevano delle velocità di sedimentazione più
elevate rispetto alla norma.
Il procedimento per ottenere la VES è semplice: si misura di quanti millimetri è sceso il livello dei globuli rossi
in un ora all’interno di una provetta millimetrata posta verticalmente. Ovviamente quest’operazione non
viene più fatta manualmente, ma tramite delle macchine automatizzate. La VES si misura in mm/h.
Nei soggetti con età inferiore a 50 anni i valori di riferimento della VES sono fino a 15 mm/h per il sesso
maschile e fino a 20 mm/h per il sesso femminile (con un incremento durante il periodo mestruale); dopo i
50 anni i valori salgono fino a 20 mm/h per il sesso maschile e fino a 30 mm/h per il sesso femminile.
La VES si può calcolare applicando la legge di Stokes:
Questa legge si applica a particelle ideali sferiche, i globuli rossi in realtà sono biconcavi, ma si può
approssimarne la morfologia. Per la legge di Stokes la velocità di sedimentazione di una particella in un liquido
dipende dal doppio del quadrato del raggio della particella (quindi dalle sue dimensioni), moltiplicato per la
differenza tra le densità delle due sospensioni (nel nostro caso è una costante), moltiplicato per la costante
di gravità (quindi un’altra costante); e il tutto fratto nove volte la viscosità del liquido.
Quindi, semplificando, l’equazione ci dice che la VES dipende dalle dimensioni dei globuli rossi e dalla
viscosità del sangue, la quale è strettamente correlata al numero dei globuli rossi. Definiamo la VES allora
come direttamente proporzionale alla massa degli eritrociti e inversamente proporzionale al numero degli
eritrociti.
La VES è indice di flogosi perché

normalmente i globuli rossi proteine della fase acuta ed
tendono a respingersi tra loro: le aggregazione eritrocitaria
forze di elettro-repulsione
prevalgono, quindi i globuli
circolanti hanno una scarsa
normalità flogosi VES - valori di riferimento:
predisposizione all’aggregazione. + +
età
2
Durante la fase acuta alcune
+ + +
proteine di questa fase, come il + + età + 10
fibrinogeno e le proteine + + 2
+ + + +
asimmetriche come le
+ + +
immunoglobuline, tendono a + legenda:
ridurre le forze elettro-repulsive globulo rosso
che fanno respingere tra loro i
acido sialico
globuli rossi. I globuli rossi allora
cominciano ad aggregarsi tra loro fibrinogeno ed
+ altre proteine della
(rouleaux) portando a un aumento fase acuta
del numeratore della legge di
Stokes, per cui aumenta la VES. Questo indice di flogosi è quindi un indicatore indiretto, in quanto dipende a
sua volta dalla produzione delle proteine della fase acuta. Si tratta, inoltre, di un parametro che dipende
anche da altri fattori, che possono essere disturbanti per la rilevazione o il monitoraggio del processo
flogistico. La VES varia, infatti, con l’età e il sesso, si modifica con una latenza maggiore rispetto alla PCR (in
quanto il fibrinogeno aumenta più tardivamente), e, infine, la VES varia anche a seconda delle patologie che
riguardano il numero o le dimensioni dei globuli rossi.
149
Patologia clinica
• Una policitemia da alta quota provoca un aumento del numero di globuli rossi e la VES risulta
diminuita à controbilancia l’innalzamento indotto da un eventuale infiammazione che non
risulterebbe diagnosticabile (falso negativo).
• Nel caso invece di una anemia, la VES sarebbe più elevata per il calo di numero di globuli rossi, ma
ciò non sarebbe indice di flogosi (falso positivo).
Per diagnosticare un processo infiammatorio è tuttavia più opportuno utilizzare la proteina C reattiva, in
quanto indice diretto (la VES è invece un indice indiretto, essendo dipendente dalle proteine della fase
acuta). Inoltre, la proteina che influenza maggiormente la VES è il fibrinogeno, ma questo aumenta dopo 21
giorni dall’inizio del processo infiammatorio e si riduce un mese e mezzo dopo. La VES, infine, dipende dalle
dimensioni del globulo rosso: le macrocitosi aumentano la VES, le microcitosi e la policitemia la riducono. Vi
sono quindi molti fattori confondenti. Per esempio, un paziente con anemia ha una VES aumentata, ma non
perché abbia un’infezione.
La VES è un indice indiretto e tardivo, ha molteplici limiti, sarebbe quindi meglio utilizzare la proteina C
reattiva. Il valore clinico della VES risiede comunque nel fatto che essa costituisce un metodo semplice e a
buon mercato per la valutazione dei processi infiammatori e di altri processi patologici.
[Si sconsiglia di farle entrambe in contemporanea. Si potrebbe fare prima la VES e, se il risultato non fosse
soddisfacente, fare in seguito anche la PCR, ma mai entrambe contemporaneamente per ragioni economiche
e logiche: non ha senso fare un doppio test quando già uno solo di questi, la PCR, è sufficiente e altamente
affidabile, e non ha senso fare la PCR prima e la VES dopo, perché la VES sarà sempre meno affidabile.]
P1.4.3 Applicazioni degl’indici di flogosi

La flogosi, in realtà, non si diagnostica in laboratorio: la diagnosi di infiammazione è clinica. Gli indici di flogosi
servono piuttosto a monitorare l’infiammazione.
Per concludere, gli indici di flogosi sono dei parametri estremamente sensibili (soprattutto se ci si riferisce
alla PCR) e sono utili per indicare la presenza, l’intensità e la durata di un processo infiammatorio, tuttavia
sono anche degli indici aspecifici: informano del fatto che nel paziente è in atto un processo infiammatorio,
ma non dicono nulla sulla causa del processo stesso. La valutazione di questi indici sarà, dunque, solo l’inizio
dell’indagine diagnostica che dovrà in seguito essere volta a trovare le cause effettive della flogosi.
Le finalità degli indici di flogosi sono:
• rilevare il processo infiammatorio: il processo infiammatorio ha già un’evidenza visibile, dunque
questa è la finalità di minor rilevanza;
• controllare il decorso delle malattie infiammatorie croniche: alcune di queste patologie sono
caratterizzate da un andamento altalenante; hanno dei momenti di accensione e dei momenti di
spegnimento. Nei momenti in cui la risposta infiammatoria si riaccende, si deve intervenire con
farmaci antinfiammatori, che hanno però degli effetti collaterali anche cronici. È importante per
questo monitorare gli indici di flogosi per evitare di somministrare questi farmaci durante le fasi di
spegnimento e prescriverli invece soltanto nelle fasi di effettiva infiammazione;
• check up di un paziente sano: talvolta c’è la possibilità che delle modificazioni di questi indici
precedano i sintomi della patologia, come ad esempio può accadere per una formazione neoplastica.
Gli indici di flogosi possono quindi aiutare a individuare condizioni patologiche di diversa natura che
non hanno un’esplicita manifestazione clinica.
È estremamente improbabile che un’alterazione degli indici di flogosi possa associarsi a uno stato di buona
salute, quindi bisognerà sempre indagare su quale disagio ci possa essere (nel caso di un danno tissutale non
immediatamente manifesto) o su quali siano le sue cause. La causa dell’alterazione potrebbe anche non
essere particolarmente rilevante, ma va comunque sempre rilevata per escludere la presenza, in certi casi,
di processi patologici.
Bisogna inoltre ricordare che la loro negatività non consente di escludere la presenza di un processo
patologico.
150
Patologia clinica
P2. IL LABORATORIO NELLA VALUTAZIONE DELLA FUNZIONE EMOSTATICA

(prof. Treré)
Il termine emostasi (dal greco di αἷμα «sangue» e στάσις «immobilità, interruzione») comprende tutti i
meccanismi fisiologici che l'organismo mette in atto per evitare perdite di sangue. Nell’uomo non è presente
una riserva di sangue, ma ciò che è in circolo è sempre utile e necessario, quindi bisogna evitarne la
dispersione. La milza può essere intesa anche come una riserva di sangue, perché ne contiene tanto; quindi,
in condizioni emergenziali può in qualche modo compensare, ma in realtà l’uomo non ha sangue di deposito.
Dunque, è fondamentale che una alterazione del sistema cardiovascolare venga compensata
tempestivamente.
In realtà il sistema emostatico è un sistema molto complesso perché allo stesso tempo riesce a garantire sia
l’interruzione di un’emorragia che il mantenimento della fluidità del sangue. Perciò grazie alla funzione
emostatica l'organismo può far cessare il sanguinamento di una ferita, pur mantenendo nello stesso tempo
la necessaria fluidità del sangue nel compartimento intravascolare.
Un’alterazione del processo emostatico si traduce clinicamente con due manifestazioni estreme:
• l’incapacità di mantenere il sangue fluido porta alla trombosi;
• l’incapacità di interrompere un sanguinamento porta all’emorragia.
Trombosi ed emorragie sono espressioni patologiche definite estreme dei disturbi dell’emostasi e sono
entrambe ugualmente importanti.
Precisazione: si tratterà più di emorragie, perché rappresentano il contesto in cui il laboratorio è

maggiormente informativo. In laboratorio, si è più completi nella caratterizzazione di quelle condizioni che
determinano l’emorragia, ma purtroppo non sempre ugualmente informativi in quelle condizioni che
determinano trombosi. Tuttavia, ciò non significa che l’emorragia abbia una prevalenza clinica rispetto alla
trombosi: clinicamente sono entrambe rilevanti.
Un’altra considerazione da fare è il fatto che è un argomento complesso e, come tutti gli argomenti complessi,
è necessario semplificarlo. È da tenere conto, però, che una semplificazione provoca approssimazione. Nella
pratica le cose sono sempre più intersecate tra loro rispetto a come vengono semplificate.
P2.1 IL PROCESSO EMOSTATICO

Il processo emostatico è innescato dal contatto del sangue con sostanze diverse da quelle presenti sulla
superficie endoteliale delle pareti dei vasi ed è costituito da una fase primaria e da una fase secondaria.
Si parlerà di emostasi primaria ed emostasi secondaria come se fossero due manifestazioni diverse, ma, in
realtà, l’emostasi è unica: viene scomposta solo per semplicità didattica. Bisogna imparare a considerare
queste semplificazioni su un test, nella pratica clinica sono processi integrati.
L’emostasi primaria consiste nella rapida formazione (pochi secondi) di un agglomerato di piastrine,
chiamato tappo emostatico primario (platelet plug), nella zona della lesione, che consente l’interruzione del
sanguinamento dai vasi capillari e dalle venule. Contemporaneamente alla formazione del tappo, si attiva il
processo di vasocostrizione che riduce la potenziale perdita di sangue diminuendo l’afflusso di sangue nel
distretto danneggiato. La vasocostrizione inoltre favorisce i processi di riparazione poiché consente loro di
lavorare in una condizione di pressione ridotta. È bene precisare però che la vasocostrizione non può essere
protratta all’infinito perché causerebbe l’ischemia dei tessuti a valle: è importante quindi che al ripristino del
flusso ematico corrisponda la solidità e resistenza del tappo emostatico e ciò si verifica grazie all’emostasi
secondaria. La formazione del tappo emostatico avviene in pochi secondi ed è fondamentale per arrestare
la fuoriuscita di sangue dai vasi capillari e dalle venule: è quello che succede quando ci si fa un taglio in cucina
o radendosi la barba, l’emorragia si arresta quasi subito. Tuttavia, il tappo emostatico primario è friabile: non
resiste a un flusso ematico ripristinato.
151
Patologia clinica
L’emostasi secondaria porta, per attivazione del sistema della coagulazione, alla formazione della fibrina, i
cui filamenti rafforzano il tappo emostatico primario, dando origine al tappo emostatico secondario: infatti,
le piastrine adese le une alle altre rappresentano una struttura friabile che deve essere cementata per
resistere al ritorno della pressione ematica; l’emostasi secondaria richiede alcuni minuti ed è importante
soprattutto per bloccare la fuoriuscita del sangue dai vasi di calibro maggiore.
A questo punto si può ripristinare il flusso ematico perché il tappo emostatico è molto più resistente.
In generale quindi le piastrine sono gli elementi fondamentali dell’emostasi primaria e i fattori di
coagulazione lo sono per l’emostasi secondaria.
P2.1.1 Piastrine
Nell’immagine a lato è presente uno striscio di sangue
periferico in cui si identificano: in basso al centro un
polimorfonucleato (a sx) e un linfocita (a dx), mentre sono
evidenziate dalle teste di freccia alcune piastrine al cui interno
sono visibili i granuli (visualizzabili anche con la colorazione di
May-Grunwald e Giemsa).
Le piastrine sono dei frammenti citoplasmatici che derivano dal megacariocita che a sua volta deriva dal
precursore midollare che si chiama megacarioblasto; si aggirano tra le 150’000 e 400'000 per mm3 e sono
per 2/3 circolanti e 1/3 sequestrato in un pool splenico. La vita media delle piastrine è intorno ai 10-12 giorni,
dopodiché vengono rimosse dai fagociti mononucleati del sistema reticolo-endoteliale. Le piastrine non
attivate hanno un diametro tra 1 e 4 μm e uno spessore di 1 μm, pari a 1/7-1/8 di un globulo rosso.
Tra le componenti delle piastrine, le più importanti sono:
• il sistema canalicolare aperto che è costituito dalla membrana plasmatica trilaminare la quale,
invaginandosi profondamente all’interno della cellula, aumenta notevolmente la superficie di
contatto con l’ambiente esterno e favorisce la già elevata reattività delle piastrine; inoltre, il sistema
è avvolto da un glicocalice contenente specifiche glicoproteine recettoriali (Gp);
• il sistema tubulare denso che è il REL, derivato da quello del megacariocita di origine. È in stretto
contatto con il sistema canalicolare aperto, permettendo alle piastrine di produrre e rilasciare in
circolo molto velocemente diverse sostanze;
• un complesso sistema citoscheletrico che permette alle
piastrine di modificare rapidamente (in pochi secondi) la loro
forma. Le piastrine circolanti hanno una “forma discoidale”,
mentre le piastrine attivate assumono una morfologia sferica
con emissione di pseudopodi contenenti recettori specifici
(“forma stellata”).
All’interno delle piastrine sono presenti dei granuli contenenti una
molteplicità di sostanze preformate e quindi immediatamente disponibili al rilascio, per cui le piastrine
possono sintetizzare sostanze, ma per lo più contengono già sostanze dentro i granuli pronte per essere
liberate in circolo. In particolare:
• i granuli α, poco opachi e molto numerosi, contengono:
o proteine adesive: vWF, fibronectina, trombospondina;
o fattori della coagulazione: fibrinogeno, vWF, fattore V, HMWK;
o inibitori della fibrinolisi: PAI-1, α 1-antiplasmina;
o sostanze ad azione anti-eparinica: β-tromboglobulina, fattore piastrinico 4 o modulatori di
crescita (PDGF, TGF- β).
• i corpi densi (granuli δ) contengono calcio, fosforo, ATP/ADP, istamina e serotonina.
P2.1.2 Emostasi primaria

L’emostasi primaria si attiva tutte le volte in cui il sangue viene in contatto con una superficie diversa
dall’endotelio. Un danno endoteliale produce ovviamente una perdita di queste cellule e sotto di esse è
152
Patologia clinica
presente un connettivo estremamente reattivo per le piastrine: quindi, quando le piastrine incontrano il
connettivo sottoendoteliale esposto (collagene, proteoglicani, fibronectina), si attivano attraverso degli
specifici recettori e la reazione piastrinica può essere schematizzata in tre fasi principali:
1. adesione delle piastrine al connettivo sottoendoteliale esposto e passaggio da una forma discoidale
a una forma sferica con protrusione di pseudopodi (forma stellata);
2. attivazione delle piastrine con liberazione in circolo del contenuto dei granuli piastrinici a diversa
attività biologica;
3. aggregazione di altre piastrine con formazione di un tappo emostatico primario.
1) Adesione piastrinica
Si tratta di un’adesione mediata da specifici recettori.
Sulla membrana delle piastrine ci sono dei recettori nominati GP (glicoproteina) seguiti da un numero. In
particolare, GP1A e GP1B sono i recettori che garantiscono alla piastrina di aderire al connettivo
sottoendoteliale (costituito da collagene, proteoglicani e fibronectina) che si espone in seguito a un danno.
Le cellule endoteliali sono poco resistenti, quindi
un danno anche lieve è in grado di alterarle.
Quando le cellule endoteliali vengono distrutte,
scoprono il connettivo sottoendoteliale.
Le piastrine riconoscono il connettivo e vi
aderiscono grazie a questi due recettori, in due
modi:
• direttamente, alle fibre collagene
attraverso il recettore GP1A;
• indirettamente, alle fibre collagene per
l’interposizione del fattore di von
Willebrand (vWF).
Il fattore di von Willebrand è un multimero, una grossa glicoproteina plasmatica, che forma multimeri
eterogenei, mediamente intorno alle 100 unità.
Il vWF viene sintetizzato dalle cellule endoteliali e dai megacariociti: nelle cellule endoteliali è contenuto in
vescicole di deposito, i corpi di Weibel-Palade, mentre nelle piastrine si trova all’interno dei granuli α.
Il vWF ha due funzioni:
• da un lato, media il legame tra piastrine e connettivo sottoendoteliale dei vasi sanguigni che hanno
subìto lesioni, quindi è coinvolto nell’emostasi primaria;
• dall’altro, solubilizza, veicola e stabilisce la funzione del
fattore VIII della coagulazione (proteggendolo dalla
degradazione), dunque, è coinvolto anche nell’emostasi
secondaria.
Ecco, all’incirca, cosa succede: le piastrine vengono calamitate dal

sito danneggiato.
I colori virtuali identificano le cellule endoteliali in rosa e il tessuto
sottoendoteliale in giallo.
Shape change
Un’altra caratteristica delle piastrine è che, quando queste attivano i recettori, cambiano morfologia:
normalmente hanno una forma a disco biconcavo (assomigliano alle orecchiette baresi), poi, quando si
attivano, assumono una forma sferoidale con degli pseudopodi. Gli pseudopodi sono braccini che hanno
recettori che si “aggrappano” al connettivo sottoendoteliale esposto.
153
Patologia clinica
Questo meccanismo si chiama “shape change” e

rappresenta un’alterazione morfologica immediata,
che si verifica in seguito all’attivazione della piastrina.
Le immagini sono in microscopia elettronica, pertanto i
colori sono virtuali (aggiunti successivamente).
In questa immagine al centro vi è una piastrina con morfologia standard,

ovvero piatta (a disco biconcavo). Sopra, invece, le altre si stanno
modificando.
Nell’ingrandimento a lato, invece, sono apprezzabili esclusivamente

piastrine modificate.
Quest’ultima immagine rappresenta il senso e la misura del processo in

atto.
Nella parte bassa al centro vi è una parte di una cellula endoteliale, mentre
in alto a destra un’altra porzione di cellula endoteliale, di cui si vede mezzo
nucleo e degli organuli.
In mezzo vi è una minima area di connettivo esposto, si tratta di una piccola
frazione di micron. Le piastrine immediatamente la riconoscono e,
cambiando morfologia e attivando i recettori Gp, aderiscono a questo
connettivo.
Malattia di von Willebrand

Il deficit ereditario di fattore di von Willebrand (malattia di von Willebrand) è considerata oggi la patologia
coagulativa ereditaria più frequente al mondo. Spesso si ritiene che l’emofilia detenga questo titolo, ma in
realtà da un punto di vista epidemiologico la malattia di von Willebrand è estremamente più frequente, con
una prevalenza di circa 1 paziente ogni 1000 abitanti, mentre l’emofilia di tipo A, ad esempio, ha una
prevalenza di 1/10.000 maschi.
È provocata dal deficit quantitativo (tipi 1 e 3) o qualitativo (tipo 2) del fattore di von Willebrand conseguente
a mutazioni del gene codificante, localizzato sul cromosoma 12. Si trasmette secondo una modalità
autosomica dominante a penetranza incompleta (solo in rari casi è recessiva).
Questa coagulopatia è però meno riconoscibile dell’emofilia, perché fortunatamente, in molti casi, la
mutazione del gene che codifica per il vWF produce un deficit limitato dell’efficienza di questo fattore e
quindi molti pazienti sono asintomatici o hanno manifestazioni cliniche trascurabili che possono essere
154
Patologia clinica
valutate solo in laboratorio. I casi gravi sono effettivamente molto ridotti, circa 1,5 soggetti/milione di
abitanti, mentre l’emofilia tende a essere sempre grave.
Nei pazienti sintomatici, le manifestazioni cliniche più caratteristiche sono costituite da ecchimosi ed
ematomi non proporzionali all'intensità del trauma, epistassi, gengivorragie e mestruazioni abbondanti:
inoltre, a seguito di situazioni chirurgiche o odontoiatriche anche non particolarmente impegnative
(tonsillectomia, appendicectomia, estrazioni dentali), i pazienti manifestano sanguinamenti eccessivi e
prolungati.
Il vWF e la rispettiva malattia prendono il nome dall’ematologo finlandese Erik Adolf von Willebrand (1870-
1949), medico finlandese che intorno agli anni ‘20 visitò una ragazzina di nome Hjördis Sundblom che aveva
manifestazioni emorragiche ricorrenti anche
importanti. Inoltre, i genitori di Hjördis durante
l’anamnesi familiare riferirono che in realtà 7
degli 11 figli avevano manifestazioni simili e
addirittura 3 bambine erano già decedute. Von
Willebrand ricostruì l’albero genealogico in modo
che il quadrato rappresentasse il maschio, il
cerchio la femmina, lo scuro fortemente
sintomatico (Hjördis è il terzultimo pallino nero in
basso a destra) e il tratteggiato con sintomi lievi.
Grazie a questo lavoro, l’ematologo scoprì non
solo che le femmine presentavano con una certa
frequenza sindromi emorragiche, ma anche che
dei 58 soggetti studiati, 23 avevano avuto episodi di emorragia.
Una volta identificata la modalità di trasmissione, chiamò questa patologia “pseudo-emofilia” a seguito delle
differenze tra le due manifestazioni per quanto riguarda:
• la diffusione: l’emofilia colpisce prevalentemente i maschi, mentre in quest’altra patologia la
popolazione era costituita sia da maschi che da femmine. Inoltre, nel caso della famiglia Sundblom
c’era una certa prevalenza per le femmine;
• la diagnosi: i pazienti erano caratterizzati da un allungamento del tempo di sanguinamento.
Per queste due caratteristiche non poteva essere emofilia e venne chiamata col termine di pseudo-emofilia.
Successivamente si capì l’importanza del vWF battezzando la patologia col nome dell’ematologo.
Hjördis Sundblom morì per menorragia in occasione del suo quarto ciclo mestruale e questo fu uno stimolo
ulteriore per l’ematologo per approfondire le cause e la modalità di trasmissione della patologia. La malattia
di von Willebrand in base alle tipologie può essere trasmessa tramite una via autosomica dominante oppure
recessiva. In generale la possibilità di trasmettere la mutazione alla progenie resta elevata.
La diagnosi si basa sul riscontro dell’allungamento del tempo di sanguinamento e dell’aPTT (con PT normale),
oltre che sul dosaggio del fattore di von Willebrand. Il test di aggregazione piastrinica con ristocetina risulta
alterato, mentre il test di aggregazione con ADP è normale.
Sindrome di Bernard-Soulier
È una patologia estremamente più rara (colpisce un individuo su un milione), provocata non dalla mancanza
di vWF, ma dal deficit quantitativo o qualitativo del recettore GPIb (o, più precisamente, GPIb-V-IX).
L’alterazione si verifica conseguentemente a mutazioni dei geni che codificano per le quattro subunità del
complesso recettoriale, GPIbα, GPIbβ, GPV e GPIX, localizzati, rispettivamente, sui cromosomi 17p12,
22q11.2, 3q29 e 3q21.
Si trasmette secondo una modalità autosomica recessiva, manifestandosi clinicamente in omozigosi, spesso
i figli di genitori consanguinei. È anche nota una forma di malattia trasmessa per via autosomica dominante.
È caratterizzata clinicamente da una triade diagnostica specifica:
155
Patologia clinica
• sindrome emorragica, che si presenta nell’infanzia/adolescenza con le stesse manifestazioni descritte

nella sindrome di von Willebrand (principalmente epistassi, gengivorragie, menorragie, ed emorragie
post-traumatiche o chirurgiche);
• piastrinopenia;
• presenza di piastrine giganti a livello del sangue periferico.
Nell’immagine è possibile apprezzare questo

cambiamento: a sinistra vi sono le piastrine normali
(piccole), mentre a destra, invece, le piastrine hanno
dimensioni maggiori, tanto che è quasi difficile
riconoscerle come tali. (In realtà si possono
identificare a partire dal fatto che manca il nucleo,
quindi non possono essere leucociti)
La diagnosi si basa sul riscontro dell’allungamento del tempo di sanguinamento e sulla determinazione
dell’espressione del complesso recettoriale GPIb-V-IX. Come nella sindrome di von Willebrand, il test di
aggregazione con ristocetina è alterato, mentre il test di aggregazione con ADP risulta normale.
Riassumendo: le alterazioni dell’emostasi primaria sono caratterizzate prevalentemente dalla

sindrome di von Willebrand (quando manca il vWF) e molto più raramente dalla sindrome di Bernard-Soulier
(quando manca o non è funzionale il recettore GpIb che lega le piastrine con il connettivo sottoendoteliale).
2) Attivazione piastrinica
Subito dopo, ma in realtà contemporaneamente all’adesione piastrinica, si ha la liberazione di mediatori
chimici preformati a livello delle piastrine contenuti nei granuli. Oltre a questa liberazione, nello stesso
momento avviene anche la tempestiva neosintesi di alcune sostanze necessarie per le fasi successive.
Questi mediatori, fondamentali nella ricerca, ma perfino dal punto di vista terapeutico, sono molteplici,
tuttavia, verranno trattati quelli più funzionali dal punto di vista laboratoristico.
Tali sostanze comprendono:
• molecole ad attività vasocostrittrice e/o pro-aggregante (serotonina, TXA2, ADP, Ca2+): la
vasocostrizione è un riflesso nervoso che può essere protratto da sostanze liberate dalle piastrine;
per quanto riguarda l’azione pro-aggregante, essa favorisce la fase successiva dell’attivazione
piastrinica;
• fattori della coagulazione (fibrinogeno, fattore V): prodotti dal fegato, alcuni di questi hanno una
componente aggiuntiva contenuta nei granuli piastrinici;
• inibitori della fibrinolisi (PAI-1, α2-antiplasmina).
In questa fase si ha anche l’espressione in superficie del fattore piastrinico 3 (FP3) che è un complesso
fosfolipidico capace di fornire il sito di nucleazione critico per il legame del calcio e dei fattori della
coagulazione. FP3 è quindi necessario alla funzione della cascata coagulativa, mostrando ancora una volta
l’intersezione tra l’emostasi primaria e secondaria.
3) Aggregazione piastrinica
L’aggregazione piastrinica è mediata principalmente dall’ADP, liberato dai corpi densi. Un altro fattore che
media l’aggregazione piastrinica è il trombossano.
L’ADP attiva un altro complesso recettoriale presente sulla membrana della piastrina, modificandone la
conformazione: il complesso recettoriale glicoproteina (Gp) IIb/IIIa, rendendolo in grado di reagire con il
fibrinogeno.
156
Patologia clinica
Nell’immagine è possibile apprezzare in alto le

piastrine, che presentano la morfologia alterata,
strettamente unite tra di loro.
Il fibrinogeno è un cofattore importante di questa fase

in quanto si interpone a ponte tra i complessi
GpIIb/IIIa consentendo la formazione di grandi
aggregati piastrinici; il legame tra fibrinogeno e
complessi recettoriali GpIIb/IIIa viene poi stabilizzato
dal cross-linking della trombospondina, liberata dai
granuli α delle piastrine.
Tromboastenia di Glanzmann
Il deficit quantitativo o qualitativo del complesso recettoriale GpIIb/IIIa (solitamente congenito) causa una
grave sindrome emorragica nota come tromboastenia di Glanzmann. Si trasmette secondo una modalità
autosomica recessiva e si tratta di una patologia rarissima: fino a pochi anni fa erano conosciuti pochi migliaia
di casi al mondo.
Le manifestazioni cliniche sono le stesse che si osservano nelle altre condizioni in cui è presente un deficit
della funzione piastrinica, anche se in questo caso il problema è di aggregazione e non di adesione:
sanguinamenti cutanei o mucosi in seguito a traumi minimi che si presentano nella infanzia/adolescenza,
epistassi, gengivorragie, menorragie ed emorragie post-traumatiche o chirurgiche.
La diagnosi si basa sul riscontro di un tempo di sanguinamento prolungato con tempi di coagulazione (aPTT
e PT) normali e normale conta e morfologia delle piastrine. Contrariamente alle sindromi di von Willebrand e
di Bernard-Soulier, nella tromboastenia di Glanzmann il test di aggregazione con ADP è alterato, mentre
risulta normale il test con la ristocetina. La diagnosi viene completata dalla misurazione dei livelli di GPIIb/IIIa,
di GPIIb e IIIa separatamente, e dal legame con il fibrinogeno utilizzando anticorpi monoclonali specifici.
L’ADP, oltre ad attivare il complesso recettoriale GpIIb/IIIa, assieme a trombina e collageno, attiva le
fosfolipasi A2 e C che liberano acido arachidonico dai fosfolipidi della membrana piastrinica (fosfatidilcolina
e fosfatidilinositolo).
L’acido arachidonico può avere due
diversi destini metabolici:
• la via lipossigenasica che
produce leucotrieni;
• la via ciclossigenasica che
produce prostaglandine.
Tra le diverse classi di prostaglandine
il trombossano A2 (TXA2) è
estremamente importante e
rappresenta il più importante agente
aggregante prodotto dal nostro
organismo. Il trombossano non solo
favorisce l’aggregazione delle
piastrine, ma consente anche il
mantenimento della vasocostrizione
necessaria a ridurre il flusso ematico
nel distretto colpito dall’emorragia.
L’aspirina è il più importante farmaco antiaggregante che viene utilizzato per prevenire episodi di trombosi
in pazienti a rischio, tuttavia, non nasce come farmaco antiaggregante, ma antinfiammatorio. Pertanto, se
157
Patologia clinica
viene assunto come farmaco antiinfiammatorio, la sua azione antiaggregante6 diventa il più importante
effetto collaterale che si può avere, ovvero l’emorragia.
Se un paziente in terapia con aspirina si deve sottoporre a un intervento chirurgico, è importante che
sospenda la terapia almeno dieci giorni prima della data programmata per l’intervento.
L’aspirina (acido acetilsalicilico), oltre a essere un farmaco antiinfiammatorio, ha anche una funzione
antiaggregante perché inibisce irreversibilmente la ciclossigenasi.
Quindi, quest’azione nella pratica medica può essere:
• negativa per coloro che hanno necessità di terapie antinfiammatorie prolungate. In questi casi
l’effetto finisce per essere la complicanza più importante nei pazienti che devono prendere
cronicamente questi farmaci (ovvero i FANS) aumentando il rischio di emorragia;
• positiva per coloro che hanno un elevato rischio di trombosi. L’aspirina se usata come farmaco
antiaggregante ha quindi un’azione preventiva nei pazienti che rischiano una trombosi arterovenosa
o hanno avuto patologie che possono facilitare tale alterazione emostatica.
Per la scoperta dell’azione inibitoria dell’aspirina sulla

ciclossigenasi, il ricercatore inglese John R. Vane vinse il
premio Nobel per la medicina nel 1982 (egli non è lo
scopritore dell’aspirina). In questo schema si vede come
l’aspirina blocca mediante acetilazione la ciclossigenasi- 1,
le piastrine non producono più trombossano e si
depotenzia molto la capacità pro-aggregante.
Di seguito sono presentate una serie di indicazioni alla

terapia antiaggregante con acido acetilsalicilico. È un
campionario molto ricco di condizioni patologiche che
prevedono appunto il trattamento giornaliero con aspirina
proprio con la finalità di ridurre il rischio di trombosi, quindi
ridurre la capacità di aggregazione delle piastrine in
pazienti che hanno particolari caratteristiche:
6
Non bisogna fare confusione tra farmaci antiaggreganti e anticoagulanti. Infatti, i farmaci antiaggreganti inibiscono
l’aggregazione piastrinica, mentre gli anticoagulanti inibiscono l’attivazione della cascata coagulativa. Non solo questi
hanno diverse indicazioni, ma hanno anche un diverso meccanismo d’azione.
158
Patologia clinica
• dopo un infarto del miocardio, per prevenirne un secondo;

• dopo un intervento di angioplastica (con o senza stent);
• per prevenire l’infarto in pazienti con angina stabile o instabile;
• dopo un intervento di by-pass;
• dopo un TIA (Attacco Ischemico Transitorio) cerebrale;
• dopo in ictus cerebrale ischemico;
• nella cura e nella prevenzione delle arteriopatie cerebrali periferiche;
• dopo un intervento di disostruzione delle carotidi;
• in presenza di fibrillazione atriali in pazienti giovani o che non possono assumere anticoagulanti per
diversi motivi;
• in pazienti anziani con rischio aterotrombotico (fumo, sedentarietà, diabete, ipertensione);
• in pazienti con alto rischio di malattie da trombosi arteriosa (diabetici).
Nell’immagine è sintetizzata l’emostasi primaria: le piastrine

sono sfigurate nella loro morfologia e dietro ci sono le cellule
endoteliali. Evidentemente sotto il tappo emostatico
primario non c’erano più cellule endoteliali.
Le piastrine hanno aderito coi propri recettori al connettivo
sottoendoteliale e si sono aggregate per costituire il tappo
emostatico primario interrompendo l’emorragia. Questo
processo nella pratica si verifica ogni volta che ci si taglia
mentre si fa la barba o lavorando in cucina. Una volta
lesionata la cute è necessario aspettare qualche minuto
prima che si interrompa l’emorragia grazie al tappo
emostatico primario.
P2.1.3 Emostasi secondaria

Se a questo punto si ripristinasse la normale pressione vascolare, il tappo emostatico primario verrebbe
spazzato via perché friabile e non resistente. L’emostasi secondaria ha quindi lo scopo di consolidarlo così da
permettere il ripristino della pressione e l’adeguata irrorazione dei tessuti.
L’emostasi secondaria è quella fase della coagulazione, che in realtà avviene contemporaneamente
all’emostasi primaria, che garantisce la produzione del collante.
Per fare ciò, a seguito del danno vascolare, le cellule endoteliali sintetizzano fattori che, in sinergia con fattori
prodotti dalle piastrine, attivano la cascata coagulativa. Tale cascata coinvolge i fattori della coagulazione;
questi sono proenzimi inattivi, prodotti dal fegato e circolanti nel sangue periferico, che vengono convertiti
in enzimi attivi.
La cascata presenta il seguente schema: un enzima (fattore attivato) agisce su un substrato (il fattore
successivo nella forma non attiva) in presenza di un cofattore che accelera la reazione. Queste tre componenti
fondamentali sono assemblate sul complesso fosfolipidico (FP3) espresso sulla superficie delle piastrine e
tenute assieme dagli ioni calcio.
La cascata coagulativa culmina con la formazione della trombina che riconosce selettivamente come
substrato il fibrinogeno (proteina plasmatica solubile) trasformandolo in polimero insolubile: la fibrina.
Trombina e fibrina consolidano il tappo emostatico piastrinico (tappo emostatico secondario o definitivo),
conferendogli stabilità e resistenza alle sollecitazioni pressorie.
Questo meccanismo a cascata ha due vie di innesco, molto utili dal punto di vista teorico in laboratorio,
mentre nella pratica clinica le cose sono sempre più complicate.
Data la centralità di questo meccanismo, è necessario conoscerne e comprenderne tutti i passaggi.
Tradizionalmente e per semplicità didattica è suddivisa in due vie, una intrinseca e una estrinseca, anche se
oggi questi schemi sono un po’ superati.
159
Patologia clinica
Via intrinseca
La via di attivazione intrinseca prevede l’attivazione del fattore XII, che si attiva tutte le volte che il sangue
viene a contatto con una superficie diversa dalle cellule endoteliali, come anche con una provetta di
laboratorio. Il fattore XII attivato attiva a sua volta il fattore XI, che a sua volta attiva il fattore IX. Questo
attiva il fattore X, in presenza del fattore VIII, che viene solubilizzato dal vWF, e del fattore piastrinico terzo
(FP3), che viene espresso dalla piastrina quando questa viene attivata, e del calcio. Il fattore X attivato, grazie
alla presenza del cofattore V, del FP3 e del calcio, converte il fattore II, altrimenti chiamato protrombina nella
forma inattiva, in trombina, che rappresenta la forma attivata. La trombina a sua volta attiva il fattore I, o
fibrinogeno, in fibrina solubile, che poi viene resa fibrina insolubile grazie al fattore XIII e al calcio.
È bene ricordare che tutti i fattori della coagulazione possono essere indicati con un nome o un numero, ma
i nomi necessariamente da ricordare sono quelli di:
• protrombina (fattore II) che nella forma attiva si chiama trombina;
• fibrinogeno (fattore I) che nella forma attiva si chiama fibrina. Il fibrinogeno, inoltre, è la molecola
che si interpone fra i due recettori attivati di una piastrina in fase di aggregazione a riprova
dell’intersezione tra emostasi primaria e secondaria.
Via estrinseca
È la via che si attiva tutte le volte che c’è un danno tissutale. È la via più importante in vivo e comincia con
l’attivazione del fattore VII da parte del fattore tissutale (FT, precedentemente chiamato tromboplastina).
Questo è contenuto in tutte le cellule (soprattutto le endoteliali) e si libera quando vengono danneggiate. Il
FT attiva il fattore VII che attiva il fattore X, seguendo poi le stesse tappe finali della via intrinseca.
Dal fattore X le due vie convergono descrivendo quindi la via comune della cascata coagulativa.
• Fattori in comune alle due vie à X, V, II, I.
• Attivazione estrinseca à fattore tissutale, VII.
160
Patologia clinica
• Attivazione intrinseca à fattore XII, XI, IX, VIII.

Se manca un fattore della coagulazione, la cascata si interrompe.
Fattori della coagulazione
Il seguente schema sintetizza tutte le caratteristiche dei fattori di coagulazione (compreso il nome), ma è
necessario focalizzarsi sui tre box rossi:
• il fattore XII, come altri fattori di contatto, non è necessario alla cascata coagulativa in vivo, mentre
è molto importante in quella in vitro: infatti, nei pazienti in cui manca il fattore XII non si hanno
fenomeni emorragici. Il fattore XII è chiamato anche fattore di Hageman dal nome del primo paziente
che fu identificato con questo tipo di alterazione. Hageman era un ferroviere inglese che morì per
embolia polmonare, ovvero una trombosi, situazione opposta all’emorragia.
• il fibrinogeno è il fattore della coagulazione più rappresentato nel sangue periferico, tant’è che se si
fa la separazione elettroforetica delle proteine del plasma, si ha un picco in più che corrisponde a
questa molecola.
• i diversi fattori di coagulazione hanno diversa emivita e in particolar modo il fattore VII
(proconvertina) è quello con emivita minore (solo sei ore), quindi necessita di più turnover.
La cascata coagulativa è fondamentale per preservare l’organismo da perdite di sangue, ma può anche essere
pericolosa perché se viene attivata impropriamente ovviamente produce danni importanti. È importante che
la cascata coagulativa funzioni e operi bene, ma soltanto in condizioni appropriate. Per questo motivo
l’organismo produce anche inibitori della cascata coagulativa che la bloccano quando viene attivata in
maniera inappropriata. È fondamentale che ci sia un equilibrio tra fattori che accelerano la cascata
coagulativa (procoagulanti) e fattori che la fermano (anticoagulanti).
È lo stesso discorso visto per i fattori pro-infiammatori: l’infiammazione è uno strumento importante che
l’organismo ha nei confronti dei microrganismi patogeni, ma un’eccessiva infiammazione può causare dei
danni e quindi esistono una serie di proteine che la controllano e la inibiscono.
161
Patologia clinica
Gli inibitori della cascata coagulativa sono:

• l’antitrombina III, che non inibisce solo la trombina attivata, ma anche il fattore X della coagulazione
e i fattori di innesco della via intrinseca (XII, XI, IX). L’azione dell’antitrombina III è promossa
dall’eparina (farmaco anticoagulante);
• la proteina C attivata7 e la proteina S, che vengono invece attivate dalla trombomodulina, una
sostanza presente sulla superficie delle cellule endoteliali. Normalmente è inattiva, ma viene
innescata quando si produce trombina. La proteina C inibisce i fattori V e VIII agendo con un
meccanismo simile a un feedback negativo: con l’attivazione della cascata coagulativa si forma la
trombina che sicuramente trasforma il fibrinogeno in fibrina (azione proaggregante), ma attiva anche
una via inibitoria mediata dalla trombomodulina che blocca la cascata coagulativa sui fattori V e VIII
(azione anticoagulante).
Esistono perciò due modalità, tra loro complementari, per inibire la cascata coagulativa. Questo garantisce
un perfetto equilibrio tra fattori procoagulanti e anticoagulanti.
Se si mette in una provetta di vetro o di plastica un campione di sangue, questo coagula e diventa
inutilizzabile in laboratorio. È quindi importante che il sangue arrivi liquido in laboratorio e per raggiungere
questo scopo all’interno delle provette si rimuove il fibrinogeno oppure si aggiungono anticoagulanti.
Si distinguono due principali gruppi di sostanze ad azione anticoagulante utilizzate nelle strategie
anticoagulative:
• sostanze chelanti il calcio che, di fatto, sottraggono il calcio alla cascata coagulativa rendendolo
indisponibile:
o citrato;
o ossalato;
o EDTA (acido etilendiaminico tetracetico) sotto forma di sali di sodio e di potassio.
7
La proteina C attivata è DIVERSA dalla proteina C reattiva, indice di flogosi.
162
Patologia clinica
• inibitori della trombina:

o eparina: esalta l’attività antitrombinica dell’antitrombina III.
In laboratorio si prediligono le sostanze chelanti il calcio, mentre l’eparina può essere utilizzata sia in vitro
che in vivo amplificando l’azione dell’antitrombina III.
Inoltre, le provette in cui viene depositato il sangue in seguito ad un prelievo, hanno tappi diversi. Il colore
del tappo esprime l’anticoagulante contenuto e quindi determina il tipo di esame che è possibile effettuare
con quella determinata provetta.
Fattori vitamina K-dipendenti

Vi sono quattro fattori della coagulazione (II, VII, IX e X) che sono chiamati vitamina K-dipendenti perché una
volta prodotti dal fegato (come gli altri fattori, indipendentemente dalla vitamina K) hanno bisogno di
un’ultima modificazione post-traduzionale che è mediata dalla vitamina K.
I fattori vitamina K-dipendenti funzionano soltanto

se carbossilati in posizione γ dalla γ-
glutamilcarbossilasi che ha come coenzima
indispensabile la vitamina K: quindi, in sintesi, senza
vitamina K non si ha questa carbossilazione e quei
quattro fattori della coagulazione, seppur
sintetizzati dal fegato, non funzionano perché non
riescono ad attaccarsi alle piastrine.
Come si vede nell’immagine, le piastrine hanno dei

fosfolipidi di membrana carichi negativamente ai quali
si lega il calcio, mentre i fattori della coagulazione si
legano allo ione grazie al gruppo carbossilico prodotto
dalla γ-glutamilcarbossilasi: quindi il calcio è un ponte
fondamentale che garantisce il legame dei fattori della
coagulazione con le piastrine.
Ricapitolando, dopo la sintesi di questi fattori
della coagulazione, una carbossilasi epatica vitamina
K-dipendente catalizza un’unica modificazione post-
traduzionale che aggiunge un secondo gruppo
carbossilico a specifici residui di acido glutammico: a
coppie, i residui di acido γ-carbossi-glutammico
legano il calcio, consentendo a questi quattro fattori di
ancorarsi ai fosfolipidi piastrinici carichi
negativamente e di poter svolgere, di fatto, la loro
azione sulla cascata coagulativa.
In assenza di vitamina K, i fattori II, VII, IX e X vengono ugualmente sintetizzati dal fegato, ma risultano
funzionalmente inattivi (PIVKA: proteins induced by vitamine K antagonists).
Sebbene anche le proteine inibitrici la cascata coagulativa C ed S siano vitamina K-dipendenti, il deficit di
vitamina K produce una sintomatologia emorragica.
La vitamina K viene assunta con la dieta e appena arrivata subisce una riduzione (tramite la vitamina K
reduttasi) poiché solo nella forma ridotta può funzionare come coenzima per la γ- glutamilcarbossilasi.
Dopo aver partecipato alla reazione di carbossilazione, la vitamina K ha bisogno di due riduzioni in cui la
prima (esercitata dalla epossido reduttasi) serve per riportarla in condizioni simili a quelle di partenza: in
sintesi, la vitamina K esogena ha bisogno di una sola riduzione mentre a quella endogena (che viene riciclata)
ne servono due.
163
Patologia clinica
principali condizioni cliniche associate a deficit

dei fattori vitamina K-dipendenti
nel neonato: meccanismo patogenetico
prematurità dificit di vitamina K, ridotte riserve, immaturità dei meccanismi di

carbossilazione
assunzione di anticoagulanti o anti- inibizione dell’enzima vitamina K epossido reduttasi
convulsivanti da parte della madre
nell’adulto:
deficienza dietetica di vitamina K malnutrizione, nutrizione parenterale, ridotte riserve in pazienti

portatori di malattie croniche e/o epatopatici
ostruzione delle vie biliari ittero colestatico con ridotta escrezione dei sali biliari e del secreto
pancreatico
sindromi da malassorbimento malattie infiammatorie croniche dell’intestino, fibrosi cistica, sprue
tropicale, morbo celiaco, coliti batteriche
epatopatie difetto di sintesi dei fattori, difetto dei meccanismi di carbossilazione,
difetto dell’enzima vitamina K epossido reduttasi, ridotte riserve
pancreatiti acute o croniche ridotta produzione del secreto pancreatico
assunzione di dicumarolici a scopo inibizione dell’enzima vitamina K epossido reduttasi
terapeutico, suicida o accidentale
terapie antibiotiche protratte distruzione della flora anaerobica intestinale, inibizione dell’enzima
vitamina K epossido reduttasi da parte di alcune cefalosporine
sindrome nefrosica eliminazione dei fattori per via urinaria
L’esistenza e la funzione della vitamina K sono state scoperte

dal biochimico danese Henrik Carl Peter Dam.
Fu chiamata “K” perché la parola coagulazione in danese
comincia con questa lettera dell’alfabeto [koagulering].
ciclo della vitamina K e meccanismo d’azione dei farmaci dicumarolici

(Warfarin – coumadin)
I farmaci dicumarolici (in particolare il

Coumadin, nome commerciale del warfarin)
sono una classe di farmaci chiamati
“anticoagulanti orali” che svolgono la loro
azione inibendo la riduzione della vitamina K e
sono tra i più importanti farmaci
anticoagulanti perché bloccano la cascata
coagulativa. In questo caso i fattori di
coagulazione non vengono carbossilati e non
riescono a legare il calcio e ad ancorare la
membrana piastrinica, rimanendo quindi
inattivi.
164
Patologia clinica
Gli inibitori della vitamina K agiscono bloccando la sintesi di nuovi fattori funzionali, ma quelli già presenti nel
sangue permangono attivi fino alla loro fisiologica degradazione; ciò comporta che:
• l’inizio dell’attività anticoagulante sia ritardato rispetto al momento dell’assunzione del farmaco a
seguito del graduale turnover dei fattori preesistenti;
• dopo l’interruzione del trattamento l’effetto persista fino alla sintesi graduale di nuovi fattori
funzionali.
N.B. È bene non confondere i farmaci:

• antiaggreganti: agiscono nell’emostasi primaria (aspirina) sull’aggregazione delle piastrine;
• anticoagulanti: agiscono nell’emostasi secondaria (Coumadin, eparina) sulla cascata coagulativa.
Figura a sinistra: in rosso gli eritrociti, in viola un linfocita, in giallo le piastrine, in verde acqua la fibrina.
Figura a destra: in rosso gli eritrociti, in violetto un leucocita, in giallo la fibrina.
Osserviamo nelle figure soprastanti due “istantanee” al microscopio elettronico del processo di formazione
del tappo emostatico secondario. In particolare, osserviamo una situazione in cui la fibrina sta cominciando
a organizzarsi in tralci filamentosi e una seconda situazione in cui i tralci sono ampiamente formati e stanno
intrappolando gli eritrociti e i leucociti, andando a formare la struttura definitiva del tappo emostatico
secondario.
P2.2 SISTEMA FIBRINOLITICO – FIBRINOLISI

In seguito alla formazione e accumulo di fibrina in un vaso,
si ottiene un tappo emostatico definitivo resistente alle
sollecitazioni pressorie date dal flusso sanguigno
ripristinato, che determina un ingombro sterico
importante nel vaso sanguigno. Una volta che le cellule
endoteliali si sono rigenerate, dunque, tale impalcatura
deve essere rimossa tramite il processo della fibrinolisi.
La fibrinolisi è il processo di dissoluzione dei trombi e
coaguli di fibrina, attraverso il quale viene smontata l’impalcatura preposta alla riparazione del danno
endoteliale.
Plasmina (plasminogeno = forma inattiva circolante nel sangue) à enzima strategico della fibrinolisi, una
proteasi che dissolve il tappo emostatico secondario degradando fibrina e fibrinogeno.
L’attivazione del plasminogeno può avvenire tramite due diverse vie di attivazione: una intrinseca e una
estrinseca.
165
Patologia clinica
Nella via estrinseca il segnale che attiva la fibrinolisi è liberato dalle cellule endoteliali e si chiama attivatore
tissutale del plasminogeno (t-PA). Questo mediatore sintetizzato dall’endotelio rigenerato determina
l’attivazione del precursore ematico inattivo plasminogeno in plasmina. La plasmina degrada la fibrina,
dissolve il tappo emostatico secondario che viene spazzato via dal flusso ematico ormai ristabilito, si
riproduce quindi la stessa situazione funzionale e morfologica del vaso prima del danno.
Il plasminogeno è il proenzima, mentre la plasmina è l’enzima fondamentale della fibrinolisi.
Nella via intrinseca l’attivazione avviene ad opera dei fattori di contatto, che sono il fattore XIIa, XIa, il
chininogeno ad alto peso molecolare e la callicreina. Questi fattori inizialmente erano stati associati alla via
intrinseca della cascata della coagulazione, successivamente si è visto che il loro ruolo è nell’innesco della
fibrinolisi. I fattori di contatto attivano una sostanza chiamata urochinasi, isolata per la prima volta nelle
urine, dove ha la funzione di dissolvere i coaguli di fibrina che potrebbero ostruire le vie di deflusso renali. È
una sostanza ubiquitaria (è secreta anche da fibroblasti, cellule epiteliali e macrofagi) che attiva il
plasminogeno in plasmina.
La fibrinolisi è modulata precisamente attraverso la presenza di varî inibitori, tra cui l’inibitore dell’attivatore
del plasminogeno (PAI), prodotto dalle cellule endoteliali (come l’attivatore tissutale del plasminogeno), l’α2-
antiplasmina e l’α2-macroglobulina che inibiscono l’azione della plasmina.
Disciolto il tappo emostatico, il flusso ematico può rispristinarsi correttamente e la parete del vaso riparata
sarà identica a quella precedente la lesione.
Chi ha un deficit di fattore XII non presenta problemi di tipo strettamente emostatico, ma di dissoluzione dei
coaguli, in quanto questo fattore è molto più determinante nell’attivazione del sistema fibrinolitico di quanto
lo sia nell’attivazione della cascata coagulativa.
P2.2.1 Regolazione del sistema fibrinolitico

Il sistema fibrinolitico è regolato da alcuni inibitori della fibrinolisi:
• il più importante è l’inibitore dell’attivatore tissutale del plasminogeno (inibitore del t-PA), o PAI,
prodotto come il t-PA stesso dalle cellule endoteliali; pertanto, le cellule endoteliali producono
contemporaneamente un fattore fibrinolitico e un fattore antifibrinolitico;
166
Patologia clinica
• α2-macroglobulina, che, come visto precedentemente, è un’anti-proteasi aspecifica e agirà pertanto

anche sulla plasmina, un enzima ad azione proteasica;
• α2-antiplasmina.
P2.2.2 Farmaci fibrinolitici

Utili nel trattamento dell’infarto del miocardio, dell’embolia polmonare e della trombosi venosa profonda.
Anziché prevenire la formazione di trombi, come i farmaci antiaggreganti, i farmaci fibrinolitici sono pensati
per trattare la trombosi (terapia trombolitica).
In passato si utilizzavano l’urochinasi umana o un suo equivalente batterico (streptochinasi): oggi si preferisce
utilizzare l’attivatore tissutale del plasminogeno, sintetizzato con tecniche di DNA ricombinante in
laboratorio (rt-PA o Alteplase). La caratteristica che lo fa preferire all’urochinasi e i suoi equivalenti è la
capacità di azione mirata: si lega alla fibrina, non al fibrinogeno, pertanto si attiva determinando fibrinolisi
solo dove effettivamente si è formato un coagulo.
P2.2.3 Emostasi fisiologica

Bisogna tenere presente che la discussione del processo emostatico come è stata affrontata è il frutto di una
semplificazione didattica atta a facilitarne la comprensione. Le dicotomie “emostasi primaria-secondaria”,
“via intrinseca-estrinseca” sono strumenti esplicativi, in quanto le diverse fasi del processo emostatico e
fibrinolitico sono strettamente interdipendenti e non rigidamente sequenziali, e anche le vie intrinseche ed
estrinseche sono interconnesse tramite una serie di feedback. L’emostasi fisiologica richiede una complessa
serie di interazioni tra glicoproteine plasmatiche, piastrine circolanti e cellule dell’endotelio vascolare, e non
tutti i meccanismi sono ancora stati chiariti.
P2.2.4 Modello di attivazione della cascata coagulativa a una via

Inizialmente ricercatori e medici
pensavano che solo la via estrinseca
fosse importante nella cascata
coagulativa, ma erano ipotesi in
contraddizione con l’esistenza
dell’emofilia, patologia genetica X-
linked che favoriva emorragie per
mancanza dei fattori VIII e IX. Si è
cercato un nuovo modello per
rappresentare la realtà dei fatti, esposto
nello schema.
In questo modello integrato si osserva
come la cascata coagulativa parta per
azione del complesso Fattore tessutale
+ Fattore VII, con attivazione della
trombina che andrà a sua volta ad
attivare i Fattori XI, VIII e IX.
Si deduce dunque che la via estrinseca
abbia un ruolo di innesco nel processo e che la via intrinseca agisca da amplificatore (feedback positivo).
Inoltre, questo modello è coerente con la situazione in vivo in cui il Fattore XII non è necessario.
P2.2.5 Manifestazioni cliniche associate a deficit dell’emostasi

Le alterazioni dell’emostasi si manifestano dal punto di vista clinico con l’emorragia, di varia entità, ma in
genere sproporzionata al trauma che la provoca, quando non addirittura spontanea (più raramente).
Esempi di manifestazioni tipiche in soggetti affetti da alterazioni dell’emostasi:
167
Patologia clinica
• petecchie: piccole emorragie

capillari con diametro di circa 1-
2 mm di colorito rosso violaceo,
frequenti nelle zone dove
maggiore è la pressione
idrostatica o dove c’è pressione
o frizione esterna (es. dove
poggia l’elastico dei calzini o della biancheria, palato ecc.);
• porpore: emorragie con diametro di 3 mm costituite da un insieme di

petecchie;
• ecchimosi: chiamati comunemente “lividi”, sono

versamenti emorragici sottocutanei di diametro tra 1 e 2
cm, inizialmente di colore rosso-blu, poi verde-blu e quindi
giallo-oro, in relazione ai vari stadi del metabolismo
dell’emoglobina;
• ematomi: versamenti emorragici profondi che spesso dissecano le fasce

muscolari (molto dolorosi); possono avere esiti clinicamente insignificanti così
come gravissimi, finanche mortali (versamento retroperitoneale da
dissecazione di un aneurisma dell’aorta);
• versamenti ematici in cavità dell’organismo: emotorace,

emopericardio, emoperitoneo, emartro (versamento di sangue
nella cavità articolare, raffigurato a lato);
• sanguinamenti da determinati distretti dell’organismo: gengivorragia,

epistassi (perdita di sangue dal naso), ematemesi (vomito ematico),
melena (sangue nelle feci), ematuria (sangue nelle urine), menorragia
(emorragia uterina legata al flusso mestruale), metrorragia (emorragia
uterina non legata al flusso mestruale), emospermia (sangue nel liquido
seminale).
168
Patologia clinica
Bisogna tenere presente che ogni sanguinamento è per definizione patologico, ma questi fenomeni
emorragici sono talvolta erroneamente chiamati “sanguinamenti patologici”, in riferimento alla presenza di
una causa patologica a monte, ovvero l’alterazione dell’emostasi, che ne determina la spontaneità o l’entità
sproporzionata al trauma. Per questo motivo sarebbe più corretto chiamarli sanguinamenti, o emorragie,
associate a patologie a carico dell’emostasi.
P2.2.6 Diagnosi di deficit dell’emostasi

Dal punto di vista clinico, la diagnosi e la caratterizzazione dell’alterazione dell’emostasi che uno specifico
paziente presenta non possono prescindere dalle analisi di laboratorio.
Tuttavia, a livello puramente clinico, in attesa degli esami di laboratorio, il tipo di emorragia può aiutare a
capire se si tratta di un deficit dell’emostasi primaria o secondaria.
Note:
• l’emofilia è la più importante fra le coagulopatie legate a deficit della dell’emostasi secondaria;
• il sanguinamento tipico dei deficit piastrinici è immediato e profuso perché nell’immediato non si
riesce a formare il tappo emostatico primario; quello tipico dei deficit della coagulazione è più
modesto e riprende dopo rimozione della pressione locale perché il tappo emostatico primario si è
formato, ma non è stato rinforzato dalla fibrina, e non resiste pertanto al flusso ematico normale che
si viene a formare dopo la fine dell’effetto di vasocostrizione;
• i deficit dell’emostasi primaria sono principalmente acquisiti e più frequenti nelle femmine, mentre
i deficit della coagulazione, primo fra tutti l’emofilia, sono tipicamente ereditabili e legati al sesso
maschile.
Le analisi di laboratorio sono fondamentali per confermare una eventuale ipotesi di diagnosi, in quanto
permettono di discriminare tra alterazioni dell’emostasi primaria e secondaria, e fra i vari deficit specifici di
entrambi i gruppi.
Se un paziente presenta un’emorragia che non ha natura post-traumatica, ma è causata da un’alterazione
dell’emostasi, sono necessarî diversi esami di laboratorio per la diagnosi. In questo caso si verificano
emorragie spontanee o che non sono proporzionali al danno subito.
In attesa dei risultati degli esami di laboratorio, dal punto di vista clinico il medico può scorgere delle
indicazioni che lo possono orientare verso un deficit dell’emostasi primaria o secondaria. Si fa riferimento,
ad esempio, a eventuali operazioni ai denti; infatti, in caso di un’alterazione dell’emostasi primaria
l’odontoiatra se ne accorge durante la seduta, a causa di un sanguinamento immediato eccessivo. In caso di
169
Patologia clinica
un’alterazione dell’emostasi secondaria il sanguinamento si manifesta successivamente all’operazione, una

volta che il paziente è già a casa, per questo motivo l’odontoiatra si raccomanda di tornare subito se ciò si
verifica. Questo fattore permette al clinico di avere una prima discriminazione del deficit del paziente;
tuttavia, per una effettiva diagnosi è comunque necessario attendere gli esami di laboratorio.
P2.3 INDAGINI DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE DELL’EMOSTASI PRIMARIA
P2.3.1 Tempo di sanguinamento

Il tempo di sanguinamento (o tempo di emorragia), in realtà,
è un esame che non si esegue in laboratorio, ma al letto del
paziente. Si applica un bracciale gonfiabile al braccio del
paziente e lo si gonfia fino a 40 mmHg, grazie a uno
sfigmomanometro, per regolare e mantenere costante la
pressione venosa, evitando che sue variazioni interferiscano
nel risultato dell’esame. Con uno strumento apposito, un
bisturi automatico dotato di due lame, si produce, a livello
dell’avambraccio, una lesione standardizzata in larghezza e profondità.
In particolare, si tratta di una piccola incisione superficiale sulla rete
capillare della faccia volare dell’avambraccio, in una zona pulita, esente
da malattie della pelle e lontano dalle vene superficiali.
Successivamente, con carta bibula (carta assorbente per liquidi organici,
usata in laboratorio) si deterge la ferita per evitare il possibile impatto
emotivo legato alla caduta del sangue, ma senza toccare i lembi della
ferita stessa, azione che rallenterebbe l’interruzione dell’emorragia.
Utilizzando una metodica più raffinata che necessita di una cartina
apposita, si può anche verificare la diminuzione nel tempo della
quantità di sangue assorbita (figura a lato).
In sostanza quindi si produce una lesione al paziente e si misura il tempo
in cui l’emorragia si interrompe (tempo di emorragia TE). Il limite perché questo tempo rientri in condizioni
fisiologiche è di 6-7 minuti:
• se supera i 10 minuti significa che c’è un deficit dell’emostasi primaria (sospetto alterazione delle
piastrine) à può essere causata da un deficit nel numero (piastrinopenia) o nella funzionalità
(piastrinopatia) delle piastrine;
• se invece il tempo di sanguinamento è minore di 10 minuti si tratterà di una alterazione dell’emostasi
secondaria.
Pur essendo un esame molto semplice, la standardizzazione lo rende un esame che comunque ci fornisce un
primo discrimine tra le due classi di alterazioni patologiche.
P2.3.2 Emocromo
Il conteggio del numero di piastrine, eseguito con un normale esame emocromocitometrico, va considerato
insieme al tempo di sanguinamento per la valutazione dell’emostasi primaria.
• 150.000 - 400.000/μL: valori di riferimento;
• > 100.000/μL: i pazienti sono asintomatici e il tempo di sanguinamento rimane nella norma;
• 50.000-100.000/μL: il tempo di sanguinamento è lievemente allungato, ma senza alcuna
sintomatologia emorragica;
• < 50.000/μL: il tempo di sanguinamento è allungato significativamente; si osservano porpore
cutanee dopo traumi minimi e sanguinamenti a livello mucoso in seguito a piccoli interventi
chirurgici;
• < 20.000/μL: notevole rischio di sanguinamenti spontanei intracranici e in altre sedi interne, con
conseguenze gravi, potenzialmente letali se coinvolgono distretti sensibili dell’organismo.
170
Patologia clinica
Esiste una correlazione tra numero delle

piastrine e tempo di sanguinamento: quando il
numero di piastrine si riduce, il tempo di
sanguinamento aumenta.
Esempio di situazione clinica: il conteggio

delle piastrine è nella norma (ipotizziamo
350.000/μL), ma il tempo di sanguinamento è
allungato. Deduciamo che il problema che porta
ad allungamento del tempo di sanguinamento
non è legato al numero di piastrine, ma alla loro
funzionalità.
Def. Piastrinopenie: alterazioni dell’emostasi dovute a un’insufficiente quantità di piastrine;

caratterizzate da conta piastrinica non nella norma e tempo di sanguinamento allungato.
Def. Piastrinopatie: alterazioni dell’emostasi dovute a un’alterata funzionalità delle piastrine;
caratterizzate da conta piastrinica tendenzialmente nella norma, ma tempo di sanguinamento allungato.
Esempio: sindrome di Bernard-Soulier: sia una piastrinopatia che una piastrinopenia.

Per questo motivo è importante combinare i due esami: il tempo di sanguinamento ci permette di distinguere
alterazioni dell’emostasi primaria e secondaria; la conta piastrinica ci permette di distinguere, all’interno
delle alterazioni dell’emostasi primaria, le piastrinopatie dalle piastrinopenie.
Una volta che si ha la distinzione tra piastrinopatia e piastrinopenia (in seguito alla conta piastrinica) ci si
rivolge all’ematologo per esami più specifici che possono aiutare a capire che tipo di piastrinopatia ha il
paziente.
P2.3.3 Test di aggregazione piastrinica

Il test di aggregazione
piastrinica serve a stabilire se le
piastrine hanno un problema di
aggregazione o di adesione.
Esso consiste nel far
attraversare da un fascio di luce
una sospensione di plasma ricco
di piastrine in cui è stata attivata
artificialmente (tramite una
sostanza aggregante come, ad
esempio, ADP) l’aggregazione
piastrinica. La quantità di luce
che passa attraverso il
preparato è misurata da un
fotometro. Per eseguire questo
test è opportuno sospendere
ogni terapia anti aggregante.
Se la capacità di aggregazione è
mantenuta, l’ADP farà
aggregare le piastrine che
tenderanno a precipitare sul fondo e, di conseguenza, passerà più luce attraverso la provetta. Se le piastrine
non si aggregano c’è un'alterazione in questo processo; una possibile causa di ciò può essere la mancanza di
fibrinogeno, oppure la malattia di Glanzmann (molto rara) in cui viene a mancare il complesso recettoriale
GpIIb o GpIIIa.
Se un paziente assume antiaggreganti deve interrompere la terapia per eseguire questo esame di laboratorio.
171
Patologia clinica
Il test di aggregazione può anche essere utilizzato per valutare l’adesione piastrinica. Utilizzando un
antibiotico, la ristocetina, che in vitro ha la capacità di attivare i recettori di adesione GpIb, avverrà il legame
con il fattore di von Willebrand, con conseguente adesione delle piastrine. Se dal test emerge che l’adesione
è alterata, le cause possono essere due: la mancanza del recettore di adesione (malattia di Bernard-Soulier),
oppure un deficit del fattore di Von Willebrand.
Se un paziente che presenta sanguinamento mostra risultati normali a tutti questi esami si può escludere
un’alterazione dell’emostasi primaria e si effettuano degli esami per valutare eventuali deficit dell’emostasi
secondaria. A questo punto sarebbe necessario dosare i fattori della coagulazione, ma questo non sarebbe
possibile economicamente. Questi test, infatti, vengono effettuati preventivamente per tutti i pazienti che
saranno sottoposti a interventi chirurgici. Si analizzano perciò di tempi della coagulazione.
P2.4 INDAGINI DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE DELL’EMOSTASI SECONDARIA

L’esame logicamente più plausibile sarebbe il dosaggio dei fattori della coagulazione. Nonostante sia un
esame impegnativo in termini economici, vi è un utilizzo diffusissimo dato che deve essere eseguito per legge
prima di ogni procedura con rischio emorragico, sia essa un intervento chirurgico o una procedura
microinvasiva, oltre che in pazienti con alterazione dell’emostasi.
L’alternativa a questo esame è l’analisi dei tempi di coagulazione, esami di laboratorio semplici e a basso
costo che richiedono un’approfondita conoscenza del processo coagulativo:
• aPTT: tempo di tromboplastina parziale attivata;
• PT: tempo di protrombina o tempo di Quick.
P2.4.1 Tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT)

Questo è un test che valuta l’efficacia della via intrinseca e comune della coagulazione (fattori I, II, V, VIII, IX,
X, XI, XII, chininogeno ad alto peso molecolare HMWK e precallicreina PK).
L’esame viene eseguito a partire dal plasma-citrato, ossia plasma a cui è stato aggiunto in provetta il citrato,
l’anticoagulante per eccellenza; il citrato, inoltre, è un chelante del calcio che verrà poi somministrato
successivamente assieme ai sostituti piastrinici (il plasma non ha piastrine), ossia fosfolipidi.
Si attiva così la via intrinseca della cascata coagulativa, essendo il plasma a contatto col vetro della provetta
e, quindi, mediante fattore XII. Inoltre, si può aggiungere un agente attivante, come il caolino, che velocizza
la reazione, andando ad agire sui tempi di esecuzione del test stesso. È importante ricordare che senza calcio
e sostituti piastrinici è impossibile attivare in vitro la cascata coagulativa, la quale porta alla formazione di un
172
Patologia clinica
alone di fibrina. L’intero procedimento viene cronometrato, ottenendo così il tempo trascorso, in secondi,
tra l’aggiunta dei reagenti sopracitati e la visualizzazione del “tappo” di fibrina in provetta.
Il tempo di coagulazione fisiologico va da 28 a 40 secondi, sebbene nel referto venga espresso con un
rapporto, aPTT ratio, in modo tale da annullare eventuali differenze dovute a variabili, come reagenti,
temperatura, operatore e che viene definito come il rapporto tra l’aPTT del plasma-citrato in analisi e l’aPTT
di un campione sicuramente sano. Il valore di riferimento di aPTT ratio è pari a 1; un innalzamento del valore
dell’aPTT ratio indica un allungamento di PTT e, di conseguenza, un paziente coagula in modo inappropriato.
P2.4.2 Tempo di protrombina (PT) o tempo di Quick

Il PT valuta l’efficacia della via estrinseca e comune della coagulazione (fattori I, II, V, VII e X) e viene usato
anche per il monitoraggio delle terapie anticoagulanti.
L’esame viene sempre effettuato a partire da un campione di plasma-citrato a cui si aggiungono calcio e
tromboplastina che, essendo di per sé una sostanza fosfolipidica, non richiede l’utilizzo di sostituti piastrinici,
e attiva il fattore VII. Essendoci meno fattori coinvolti, il tempo di coagulazione sarà minore di aPTT e pari a
un valore compreso tra 11 e 13 secondi, espresso anche questo in PT ratio.
APPT ratio e PT ratio sono esami di laboratorio fondamentali per studiare l’emostasi spontanea.
L'efficacia diagnostica di questi due esami sta nel ricercare con grande precisione il deficit di quale/i fattore/i
causa la patologia senza andare a dosare direttamente fattore per fattore, che risulterebbe troppo costoso.
Il massimo dell’informazione diagnostica si riesce ad ottenere solo considerando entrambe le variabili.
In questo schema viene riassunta la via intrinseca (in rosso), espressa dall’aPTT ratio, e la via estrinseca (in
giallo), indicata dal PT ratio, con i rispettivi fattori di coagulazione coinvolti.
Avendo a disposizione due esami di laboratorio, combinando tutti i risultati possibili, si otterrebbero
quattro diversi quadri:
173
Patologia clinica
1. aPTT normale e PT normale: non c’è nessuna alterazione dei fattori della coagulazione;
2. aPTT allungato e PT normale: (linea gialla normale, linea rossa alterata) le ipotesi diagnostiche sono
riguardanti un’assenza dei fattori non comuni alle due vie, ma appartenenti solo alla via intrinseca e,
quindi, ai fattori XII, XI, IX, VIII;
3. aPTT normale e PT allungato: assenza del fattore VII (sola via estrinseca);
4. aPTT e PT entrambi allungati.
Nello specifico, in caso di aPTT allungato e PT normale, si ha un deficit dei fattori implicati nella via intrinseca,
XII, XI, IX e VIII. Il deficit del fattore XII non determina un’alterazione della cascata coagulativa, perché essa
viene comunque attivata dal prodotto stesso della via estrinseca (la trombina).
La carenza del fattore XI esiste, ma è rarissima, per cui la si considera in seconda battuta.
Rimangono, pertanto, il fattore VIII e IX, la cui assenza è caratteristica dell’emofilia.
P2.4.3 Patologie correlate a aPTT e PT alterati
Emofilia
In un paziente si misura un PT normale e un aPTT allungato, questo denota una mancanza di fattori a monte
esclusi quelli comuni alle due vie (XII, XI, IX, VIII). Considerando che il XII non è necessario per la cascata
coagulativa in vivo può essere escluso, perciò sono da valutare i rimanenti tre fattori (XI, IX, VIII). Il deficit di
XI è una condizione genetica molto rara, sono molto più frequenti deficit di VIII e IX, ovvero il quadro clinico
di un soggetto emofiliaco.
L’emofilia è una malattia emorragica congenita dovuta al deficit quantitativo o qualitativo del fattore VIII
(emofilia A, più frequente) o del fattore IX (emofilia B, più rara); entrambe le forme sono recessive e legate
al cromosoma X, pertanto la malattia si manifesta quasi esclusivamente nei maschi (eredità diaginica).
La condizione più frequente è quella di maschio sano e donna portatrice, da cui verosimilmente si avrà il 50%
dei figli maschi sani, l’altro 50% malato; il 50% delle figlie donne sane e l’altro 50% portatrici.
Nel caso di padre malato e madre sana, tutti i figli maschi saranno sani e tutte le figlie femmine portatrici.
Nell’ultimo, seppur più raro, caso di donna portatrice e padre malato, il 50% dei figli maschi sani e l’altro 50%
malato; il 50% delle figlie donne malate e l’altro 50% portatrici.
Il quadro clinico, identico nei due tipi di emofilia, è caratterizzato da emorragie spontanee o traumatico-
chirurgiche:
• tipiche manifestazioni della malattia emofilica sono gli emartri (versamento di sangue in
un’articolazione), più frequentemente localizzati alle articolazioni sottoposte a carico (ginocchio,
gomito, spalla e anca);
• altrettanto frequenti sono gli ematomi intramuscolari, che compaiono qualche giorno dopo un
trauma con tumefazione, indurimento ligneo, dolenzia del muscolo interessato ed eventuali sindromi
da compressione a carico di fasci nervosi o vasi arteriosi che, in specifiche localizzazioni, possono
assumere aspetti di particolare gravità.
• fra le emorragie mucose, frequenti e spesso copiose sono le epistassi; possono inoltre presentarsi
ematuria (sangue nelle urine) ed emorragie del cavo orale conseguenti anche a minimi traumi;
174
Patologia clinica
• le ecchimosi (emorragie cutanee) sono frequenti, ma non pericolose;

• particolare attenzione deve essere rivolta alle estrazioni dentarie, che possono provocare emorragie
cospicue e persistenti;
• vanno infine segnalate le emorragie cerebrali per la loro gravità (principale causa di morte per
emorragia nei soggetti emofilici) e per la necessità di una diagnosi precoce; un trauma cranico,
seppur di lieve entità, in un paziente emofilico richiede sempre un accesso a un Pronto Soccorso.
La cura per questa malattia consiste nella somministrazione selettiva per via endovenosa dei fattori deficitari
VIII o IX (in passato si trattava con trasfusioni di sangue).
Prima di somministrare uno dei due fattori bisogna però capire di che tipo di emofilia si tratta; per legge
vanno eseguiti dei test di dosaggio di entrambi i fattori, in realtà ci sono dei test di laboratorio molto più
semplici e meno costosi del dosaggio. Basta infatti prendere
una provetta di plasma del paziente con emofilia ignota e
aggiungere il plasma di un paziente con emofilia A, a questo
punto i possibili scenarî sono due:
• l’aPTT rimane allungato: il paziente con emofilia ignota
ha certamente un’emofilia di tipo A;
• l’aPTT diventa normale: il paziente con emofilia ignota
ha certamente un’emofilia di tipo B.
Per motivi medico-legali, però, non si può utilizzare questa
metodologia.
[Da dispensa Murciano:]

Precedentemente abbiamo affermato che nel caso di aPTT allungato, l’assenza del fattore XII era da
escludere, si è visto infatti come questo fattore, se assente o mutato non causi problemi.
Le ipotesi che sono state fatte a proposito di questa osservazione sono tante e diverse: la prima fu che la via
intrinseca fosse inutile e che in vivo servisse solo la via estrinseca. Questa ipotesi però non reggeva dal punto
di vista logico-fattuale, se la via intrinseca non fosse stata utile, non ci sarebbero stati i pazienti emofilici.
I ricercatori hanno quindi studiato uno schema diverso, più moderno della cascata della coagulazione.
Possiamo notare da questo schema come la via estrinseca sia in effetti più importante in quanto è il punto di
attivazione della cascata coagulativa.
La tromboplastina entra in circolo e va ad attivare il fattore VII che fa partire la via estrinseca, la trombina
(prodotto della via estrinseca avviata dal fattore VII) poi, andrà ad attivare il fattore XI e la via intrinseca che
potenzierà la cascata coagulativa.
Studî successivi hanno poi dimostrato interazioni tra il fattore VII e il fattore IX o tra quest’ultimo e il fattore
X, dimostrando come le vie siano molto più intersecate di quel che si credeva.
175
Patologia clinica
In sostanza per carenza di XII non si ha aPTT allungato non perché la via intrinseca non si attivi (nonostante
la sua poca rilevanza in vitro rispetto a quella estrinseca), ma piuttosto perché essa viene attivata dal prodotto
stesso della via estrinseca (la trombina).
aPTT normale e PT allungato

Si analizza ora il caso reciproco per cui si ha aPTT normale e PT allungato che vede il coinvolgimento della
via estrinseca e, in particolare, del fattore VII.
Senza dosare i fattori, l’alterazione emostatica viene ricondotta a una sola carenza, qualitativa o quantitativa,
muovi per cui il punto di forza di questa metodica sta proprio nella profonda conoscenza della cascata della
coagulazione.
La condizione di aPTT normale e PT allungato però è molto frequente in laboratorio, questo perché nel caso
di epatopatie, il primo fattore della coagulazione a mancare è il fattore VII: ciò è dovuto al fatto che il fattore
VII è quello con minor emivita e sarà quindi il primo a risentire di un danno epatico. Nonostante in vivo questo
fattore agisca su entrambe le vie, in laboratorio la prima via che risulta danneggiata è quella estrinseca.
aPTT e PT entrambi allungati

Per ultimo, si analizza la condizione in cui si ha un’alterazione sia dell’aPTT sia del PT, entrambi allungati.
Le cause possono essere molteplici:
• carenze dei fattori di coagulazione comuni ad entrambe le vie, X, V,II e I, condizione estremamente
rara;
• carenza del fattore VII associata ad un quadro emofilico (condizione molto rara);
• insufficienza epatica, perché è il fegato a produrre i fattori di coagulazione. Infatti, aPTT e PT sono
considerati indici della funzionalità epatica;
• carenza della vitamina K, che va ad agire su entrambe le vie, da cui dipendono quattro fattori che
bloccano la cascata coagulativa: due della via comune, II-X, uno della via intrinseca, IX, e uno della
via estrinseca, VII.
Riprendendo il concetto di emivita dei fattori della coagulazione, è importante ricordare che il fattore VII ha
l’emivita più breve, pari a 6 ore, motivo per cui un’insufficienza epatica oppure una carenza di vitamina K
porta in prima battuta all’allungamento del PT.
I tempi di coagulazione vanno ragionati, proprio perché non vengono dosati tutti i fattori.
P2.4.4 Utilizzo del PT come metodo di monitoraggio

Il PT ha un’applicazione importante nel monitoraggio di pazienti che fanno uso di anticoagulanti orali, ossia
antagonisti della vitamina K (farmaci dicumarolici – Coumadin), utilizzati per ridurre la capacità di
coagulazione del sangue in pazienti a rischio di sviluppare trombi o coaguli all’interno del sistema
cardiocircolatorio: in particolare viene utilizzata nella prevenzione dell’ictus in pazienti a rischio di embolie
cardiogene (fibrillazione atriale, protesi valvolari) o derivanti da arterie vertebrali o da carotidi
aterosclerotiche parzialmente stenotiche.
Si tende a scoagulare il paziente, rallentando la cascata coagulativa, che risulterà essere meno attivabile. Il
dosaggio del farmaco sarà diverso da paziente a paziente, grazie a una terapia personalizzata. (Aspirina e
antiaggregante uguali per tutti, anticoagulante no!)
Il concetto non è dissimile dal diabete: un diabetico assume una dose di insulina strettamente dipendete
dall’effetto del pasto, la sua glicemia. Infatti, nel caso degli anticoagulanti, la quantità di farmaco che viene
somministrata dipende da quanto si è allungato il tempo di coagulazione e, poiché, il fattore VII ha l’emivita
più breve, si utilizza il PT.
Questi farmaci risultano particolarmente difficili da gestire perché la vitamina K interagisce sia sulla via
intrinseca che sulla estrinseca e i livelli di questa vitamina dipendono dall’alimentazione, perciò non vengono
somministrate le stesse dosi di anticoagulante a tutti i pazienti. I dosaggi dei farmaci impiegati vengono
definiti sulla base delle variazioni indotte sui tempi di coagulazione e, in particolare sul PT, in quanto il fattore
VII è quello con minore emivita. Questo esame di laboratorio permette di capire se la terapia è inefficace (PT
praticamente invariato), nel giusto dosaggio (PT leggermente allungato) o a dosaggi troppo elevati con rischio
di favorire un’emorragia (PT molto allungato).
176
Patologia clinica
Sistema INR
Per garantire una standardizzazione universale di questo valore si opera tramite il sistema INR (International
Normalised Ratio); l’INR prevede che il PT ratio sia corretto per la sensibilità della tromboplastina utilizzata
in quel laboratorio per attivare la via estrinseca, determinata sulla base dell’ISI (International Sensitivity
Index); il codice ISI viene quindi applicato ad ogni lotto di tromboplastina prodotta commercialmente per
indicarne la diversa capacità di attivare in vitro la cascata coagulativa.
INR = (PTpaziente /PTcontrollo) ISI
L’INR prevede che il PT ratio sia corretto per la sensibilità della tromboplastina utilizzata in quel laboratorio
per attivare la via estrinseca, motivo per cui il rapporto tra il PT del paziente e il PT di controllo viene elevato
a ISI, International Sensivity Index, caratteristico di ogni lotto per indicarne la diversa capacitò di attivare in
vitro la cascata coagulativa.
L’INR di un paziente in terapia, indipendentemente dalla sua patologia, deve avere valori compresi tra 2 e
3,5.
Di fronte a un paziente con un INR = 1,2 in cura con Coumadin, è necessario aumentare il dosaggio dato che
il paziente non viene scoagulato correttamente à la terapia non è efficace.
Viceversa, un INR = 4,5 indica un alto rischio di emorragia, motivo per cui risulta essere una situazione più
pericolosa.
L’INR è fondamentale nel trattamento di pazienti con alterazioni della coagulazione, condannati a un
continuo rapporto col laboratorio, ponendo l’attenzione su diversi fattori, tra cui la corretta interpretazione
degli esami stessi, la quantità della vitamina K che il paziente la assume per via alimentare.
P2.4.5 Farmaci anticoagulanti

In alternativa a TAO, terapia anticoagulante orale con inibitori della vitamina K, sta prendendo piede una
nuova categoria di farmaci, denominati NAO, nuovi anticoagulanti orali, o più recentemente DOAC,
anticoagulanti orali ad azione diretta, che agiscono sulla cascata coagulativa bloccando selettivamente la
trombina (Dabigatran) o il fattore X attivato (Rivaroxaban, Apixaban). Questi, infatti, agendo su un singolo
fattore della coagulazione, hanno una prevedibilità maggiore e possono essere somministrati a dosi fisse,
senza alcun monitoragggio di laboratorio. Gli studî in corso tendono a confrontare l’efficacia terapeutica dei
NAO e dei TAO nelle diverse patologie. Inizialmente, si pensava che i NAO soppiantassero definitivamente i
TAO, invece è stato dimostrato che è necessario attenersi alle singole specificità e, quindi, alla terapia
personalizzata.
Lo schema della cascata coagulativa ha dei punti di criticità.

Il fattore XII, infatti, non serve per attivare la cascata
coagulativa, questo, però, non implica l’inutilità della
cascata intrinseca. Questa contraddizione ha portato alla
formulazione di una nuova ipotesi, ampiamente
consolidata, secondo la quale la situazione in vitro risulta
essere diversa risposto a quella in vivo, per cui si avrà una
via di attivazione, la via estrinseca, e una di potenziamento.
La cascata coagulativa in vivo si attiva per la liberazione del
177
Patologia clinica
fattore tissutale, il fattore VII che attiva il fattore X, quest’ultimo attiva il fattore V e questo, a sua volta, il
fattore II. Invece di essere obliqua, la via estrinseca si sviluppa in verticale. Ciò che ha consentito di
comprendere questa ipotesi è che la trombina, oltre ad attivare il fibrinogeno e la fibrina, attiva il fattore XI,
questo attiva il fattore IX che, insieme al fattore VIII, attivano il fattore X. In questo schema, si osserva
l’esclusione del fattore XII e l’inclusione di tutti i restanti in un unico modello unificato, in cui l’ex via
estrinseca è la via di attivazione, potenziata dalla via intrinseca, portando alla massima efficacia della cascata
coagulativa in vivo.
P2.5 TROMBOFILIA
Il termine trombofilia, chiamata anche stato ipercoagulabile o di ipercoagulabilità, si riferisce a una
condizione clinica legata solitamente a pazienti giovani, di età inferiore ai 45 anni, che hanno una inusuale
predisposizione al tromboembolismo arterovenoso, con episodî recidivanti e anamnesi familiare positiva,
per cui questi pazienti hanno diverse manifestazioni trombotiche nella loro vita e solitamente hanno un
parente con la stessa alterazione.
Nelle condizioni di trombofilia si possiede una ridotta capacità diagnostica, per questo motivo risulta più
semplice effettuare approfondimenti su un paziente con un’alterata capacità di interrompere un
sanguinamento. Ci sono molti pazienti con trombofilia di cui non si conosce la causa, per cui non si può
eseguire una valutazione di laboratorio. Nonostante ciò, è opportuno sottolineare che emorragia e trombosi
hanno la stessa rilevanza clinica.
La trombofilia è una condizione estremamente frequente, responsabile di almeno il 10% delle morti in
ospedale ed è una concausa in un ulteriore 15% dei casi. Quindi si parla di una condizione non
particolarmente diffusa, ma particolarmente pericolosa.
Il termine “trombofilia” è stato introdotto nel 1965 dall’ematologo Olav Egeberg, contrapponendolo al
termine “haemofilia”, utilizzato per la prima volta nel 1828 dal tedesco Friedrich Hopff, studente di medicina
all’Università di Zurigo.
Le cinque principali variabili che si possono valutare in laboratorio per identificare la causa della trombofilia
(solitamente pz < 45 anni, con storia familiare positiva per trombofilia e con episodî ricorrenti di trombosi)
sono:
• determinazione della attività degli anticoagulanti naturali antitrombina III, proteina C e S;
• ricerca delle mutazioni del gene del fattore V;
• ricerca delle mutazioni del gene della protrombina;
• determinazione dei livelli ematici di omocisteina;
• ricerca di anticorpi antifosfolipidi.
P2.5.1 Difetti ereditarî degl’inibitori naturali della coagulazione

Olav Egeberg scoprì la prima causa identificata storicamente di trombofilia, ovvero l’alterazione degli
inibitori naturali della coagulazione. Come detto in precedenza, la cascata coagulativa ha dei feedback
negativi: antitrombina III, proteina C, proteina S. Venendo a mancare questi freni, perché il gene che li
codifica è alterato, la cascata ha minori freni e più acceleratori, quindi il paziente rischia di attivarli in maniera
inappropriata, per cui la manifestazione clinica sarà una trombosi ricorrente. Essendo la mutazione
ereditaria, le stesse manifestazioni cliniche all’anamnesi familiare saranno riconosciute.
Ricapitolando: si tratta di fenomeni di tromboembolismi in pazienti giovani, con anamnesi patologica
familiare positiva. Inoltre, il deficit di uno di questi fattori anticoagulanti è documentabile nel 6-7 % dei
pazienti con trombosi, con una prevalenza complessiva nella popolazione generale inferiore allo 0,5 %, si
parla di una condizione sicuramente importante, ma particolarmente rara (nds. non sono da ricordare tutti i
dati di incidenza, è necessario comprendere esclusivamente la rilevanza clinica ed epidemiologica di quella
mutazione).
178
Patologia clinica
Queste condizioni sono ereditate come tratti autosomici dominanti a penetranza variabile; lo stato di
omozigosi è incompatibile con la sopravvivenza, mentre i soggetti eterozigoti presentano o una riduzione
(tipo I) o un deficit funzionale (tipo II) della proteina interessata. Il rischio relativo di trombosi venosa per
questi pazienti è 5 volte (deficit di antitrombina III), 6 volte (deficit della proteina S) e 7 volte (deficit della
proteina C) superiore a quello della popolazione che non presenta deficit ereditari dei rispettivi fattori.
P2.5.2 Mutazione del fattore V di Leiden

Più recentemente, nel 1994, è stata identificata una condizione molto più frequente di trombofilia, la
mutazione del gene che codifica il fattore V. Questa mutazione è stata identificata per la prima volta nella
città di Leiden (Olanda), per cui oggi è chiamato “fattore V di Leiden”.8
Si potrebbe pensare che la mutazione di un fattore della coagulazione potrebbe avere come manifestazione
clinica un’emorragia, proprio come un paziente emofilico con la mutazione del fattore IX, perciò
sembrerebbe paradossale che la mutazione di un fattore possa causare la trombofilia.
Il paradosso è svelato dal punto del fattore V che è mutato, infatti il fattore V viene inibito dalla proteina C.
La mutazione non interessa l’attività enzimatica del fattore o cofattore, ma impatta sulla sua capacità di
essere inibito, quindi la parte della proteina mutata è quella che viene riconosciuta dalla proteina C.
La proteina C non riconosce il fattore V e non lo può inibire, prolungando in questo modo l’effetto
trombogenico del fattore V e determinando, di conseguenza, uno stato di ipercoagulabilità.
La mutazione presenta un gradiente di frequenza geografica che va dal NORD (15% della popolazione in
alcune regioni della Svezia) al SUD (2-3% nell’Italia Settentrionale, fino a 1% nell’Italia Meridionale). Si tratta
pertanto di una condizione molto più frequente della precedente, perché ci si riferisce all’intera popolazione.
I soggetti eterozigoti hanno un rischio relativo di trombosi da 5 a 7 volte superiore a quello della popolazione
che non presenta la mutazione, mentre nei soggetti omozigoti (2% circa dei pazienti affetti) il rischio diventa
fino a 80 volte superiore; gli omozigoti sviluppano fenomeni tromboembolici ricorrenti.
P2.5.3 Mutazione del gene della protrombina

La mutazione del fattore II non avviene nella sequenza codificante del gene, bensì nella regione promoter,
questo fa sì che l’mRNA diventi più stabile, perciò questa mutazione determina una maggiore efficacia del
fattore II, sia in termini qualitativi che quantitativi; questo fa sì che la manifestazione clinica non sia una
carenza della protrombina, ma un suo potenziamento, difatti si ha un aumento della concentrazione ematica
di protrombina di circa il 30%.
La prevalenza della mutazione nella popolazione generale oscilla tra l’1 ed il 2%, con un gradiente di
frequenza geografica che appare inverso a quello del fattore V Leiden (più frequente cioè nel Sud Europa che
nel Nord); i soggetti eterozigoti hanno un rischio relativo di trombosi venosa 3 volte superiore a quello che si
riscontra nella popolazione che non presenta la mutazione.
P2.5.4 Iperomocisteinemia
L’omocisteina è uno degli ultimi marker di trombofilia studiati, è un importante amminoacido che può essere
metilato a metionina o transulfurato a cisteina grazie agli enzimi e relativi coenzimi che sono la vitamina B12,
la vitamina B6 e l’acido folico (vitamina B9)9. Una mancanza di questi enzimi (mutazione genetica) e coenzimi
8
Per ricordartelo pensa ad Andrea Landi.
9
Viene rimetilata a metionina per azione di due diversi enzimi: la metionina sintasi (MS), che necessita della presenza
di vitamina B12 e di acido folico (metilentetraidrofolato: MTHF) come coenzimi, e la betaina-omocisteina
metiltransferasi. Viene transfulfurata a cisteina per azione dell’enzima cistationina β-sintetasi, che necessita della
presenza della vitamina B6 come coenzima.
179
Patologia clinica
(carenza alimentare) determina un accumulo dell’omocisteina che non può essere convertita. Altri motivi per
cui l’omocisteina si accumula sono:
• l’insufficienza renale, a cui si accompagna un calo drastico della clearance della sostanza;
• lo stile di vita (fumo, caffè, stress, sedentarietà);
• l’età avanzata;
• sesso maschile.
L’iperomocisteinemia è associata a un’aumentata incidenza di aterosclerosi e trombosi venosa.
L’aterosclerosi viene favorita poiché alti livelli di omocisteina provocano un danno tossico endoteliale
tramite:
• riduzione della sintesi di monossido di azoto e dell’azione vasodilatatoria a esso legata;
• produzione dell’anione superossido e aumento dello stress ossidativo, con effetto sulla ossidazione
delle LDL;
• promozione dei processi infiammatorî.
La trombosi origina dall’iperomocisteinemia perché questa determina:
• liberazione del fattore tissutale dai monociti;
• riduzione della espressione della trombomodulina;
• attivazione dei fattori XII e V;
• inibizione della proteina C.
Il numero di soggetti affetti da iperomocisteinemia è più alto di quanto ci si possa aspettare (la prevalenza
nella popolazione generale è del 4,8%) e sarà probabilmente sempre più associata alla trombosi
arterovenosa, oltre che a promuovere l’aterosclerosi, prima causa di morte nei paesi occidentali.
P2.5.5 Sindrome da anticorpi antifosfolipidi

Un’altra causa di trombofilia è la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS), che è una malattia autoimmune
solitamente secondaria che accompagna una malattia autoimmune primaria, come il lupus eritematoso
sistemico, ma può essere anche primitiva. È caratterizzata da ipercoagulabilità, perdita fetale ricorrente e
piastrinopenia. Gli anticorpi antifosfolipidi che vengono a formarsi sono un gruppo eterogeneo di IgG (più
raramente IgM o IgA) che interferiscono col normale processo di coagulazione e la cui risposta non è uguale
in vivo e in vitro: in vitro i tempi di coagulazione si allungano, in particolare si allungherà il test aPTT; in vivo
invece abbiamo trombofilia.
Per la diagnosi di laboratorio ricerchiamo tre specifici anticorpi: l’anticoagulante lupico (LAC), gli anticorpi
anti-cardiolipina (aCL) e gli anticorpi anti-β2-glicoproteina-1 (β2-GPI). La prevalenza dell’APS nella
popolazione generale spazia tra il 2-5% e si tratta dell’unico caso di trombofilia acquisita.
P2.5.6 Associazione di fattori trombogenici

È importante ricordare la possibilità di una coesistenza di più fattori trombogenici in un paziente. In questi
casi, il rischio di trombosi è molto più che additivo; ad esempio, se il fattore V di Leiden è associato al deficit
di antitrombina, di proteina C o di proteina S, l’incidenza di trombosi venose ricorrenti diventa,
rispettivamente, il 92%, il 73% ed il 72%. Allo stesso modo, se uno dei fattori precedentemente descritti si
associa a un’altra condizione predisponente la trombosi, quale la gravidanza, l’assunzione di contraccettivi
orali, la terapia estrogenica sostitutiva, la presenza di una neoplasia, l’immobilità o il decorso post-
operatorio, il rischio di trombosi aumenta in maniera esponenziale.
Concludendo, quelle esposte sono le cinque condizioni conosciute, diagnosticabili in laboratorio che possono
determinare una trombofilia, ma non sono sufficienti, ci sono infatti altri pazienti con trombofilia che hanno
una causa diversa da queste e che ancora deve essere indagata. La capacità di approfondimenti diagnostici
di laboratorio delle trombofilie è molto più ridotta, a differenza delle emorragie di cui si ha una migliore
capacità diagnostica.
180
Patologia clinica
P2.6 COAGULAZIONE INTRAVASALE DISSEMINATA (CID)
P2.6.1 Coagulazione, fibrinolisi e indagini di laboratorio correlate

Il fibrinogeno è costituito da un dominio centrale “E” e da due dominî periferici “D”. La trombina attiva i
monomeri di fibrinogeno staccando i due dominî fibrinopeptide A e fibrinopeptide B (corte sequenze
amminoacidiche del fibrinogeno), convertendo il fibrinogeno in fibrina: in questo stadio la fibrina polimerizza
e verrà stabilizzata dal Fattore XIII realizzando così il tappo emostatico secondario e completando il processo
di coagulazione.
Quando la fibrina cesserà di essere utile, si attiverà la plasmina, che taglierà proteoliticamente il polimero
determinando fibrinolisi. La degradazione della fibrina porta alla formazione di due molecole che sono le FDP
(prodotti di degradazione della fibrina) e il D-Dimero.
Gli FDP sono più aspecifici, il D-dimero è più
specifico.
I fibrinopeptidi A e B, gli FDP e i D-Dimeri sono
importanti indicatori: i primi (fibrinopeptidi A e B)
si esaminano in laboratorio, misurando solo la
concentrazione del fibrinopeptide A (per
ottimizzare i costi) nel sangue periferico, e indicano
un’intensa attività coagulativa; gli ultimi (gli FDP e i
D-Dimeri) si esaminano sempre tramite
concentrazione ematica e indicano un’intensa
fibrinolisi. In ogni caso, se vi è un’intensa fibrinolisi
significa che è stata creata anche una grande
quantità di fibrina, sinonimo di un’intensa attività
coagulativa, quindi questi meccanismi trovano un
elevato riscontro in una patologia chiamata coagulazione intravasale disseminata (CID).
181
Patologia clinica
P2.6.2 Patogenesi della CID

La CID (anche detta coagulopatia da consumo o sindrome da defibrinazione) è una patologia trombo-
emorragica in cui, come si deduce dal nome, coesistono i fenomeni emorragici e i fenomeni di emostasi,
rendendo il lavoro diagnostico e terapeutico assai arduo per questa malattia mortale. Nonostante questa
condizione, in un primo momento possa sembrare contradditoria, ha nella sua patogenesi un filo logico. I
fenomeni emostatici, nel caso della CID, sono indotti da un’attivazione della via estrinseca tramite o un danno
diffuso endoteliale o rilascio sistemico di fattore tissutale. La coagulazione, per sua natura, dovrebbe essere
limitata a singoli distretti corporei in cui è avvenuta una lesione o una microlesione, invece nella CID la
coagulazione è sistemica e può evolvere in una disfunzione multiorgano.
Se poi si consumano tutti i fattori della coagulazione in trombi sparsi non si avranno più gli elementi necessarî
per la coagulazione dove questa serve, causando eventualmente anche emorragie diffuse che difatti
rappresentano buona parte della letalità nella patologia.
Le cause scatenanti più importanti nella CID sono dunque il massiccio rilascio di Fattore Tissutale e i danni
endoteliali diffusi.
Fisiopatologia: la formazione
intravascolare di trombi avviene o per attivazione
della via estrinseca, cioè si libera in circolo in
maniera diffusa tromboplastina, oppure per un
danno endoteliale diffuso, ciò causa occlusione
vascolare e quindi danno tissutale ischemico. Le
prime manifestazioni cliniche sono dunque le
ischemie, conseguenti alla trombosi diffusa, ma
subito dopo per consumo di fattori della
coagulazione si passa alla fase emorragica. È
difficile capire cosa ha un paziente che ha
contemporaneamente fenomeni di emorragia e
trombosi, ed è ancora più difficile il trattamento.
Il massiccio rilascio di fattore tissutale (attiva via estrinseca) è determinato da:

• incidenti ostetrici: la causa più frequente (più del 50% dei casi); riguardano distacco di placenta,
embolia di liquido amniotico, ritenzione di feto morto o aborto nel secondo trimestre di gravidanza;
• neoplasie: dalla proliferazione e dalla necrosi delle cellule neoplastiche, in una popolazione di cellule
che è sostenuta da una neo-vascolarizzazione, si possono liberare in circolo grandi quantità di
tromboplastina. Inizialmente ci si è concentrati soprattutto sulle neoplasie ematologiche, in
particolare la leucemia promielocitica acuta, mentre oggi stanno emergendo tumori solidi, come
carcinomi del polmone, del pancreas, del colon e dello stomaco;
• danno tissutale esteso: ustioni, congelamenti, traumi, ferite d’arma di fuoco;
• sepsi da batterî Gram–: in particolare l’endotossina induce nei monociti la liberazione del fattore
tissutale e la sintesi di monochine, quali IL1 e TNFa, che inibiscono la produzione di trombomodulina
da parte delle cellule endoteliali;
• embolia adiposa;
• emolisi intravascolare acuta: trasfusione di sangue incompatibile, interventi in circolazione
extracorporea, malaria, emoglobinuria parossistica notturna.
Il danno endoteliale diffuso (attiva piastrine, via intrinseca e estrinseca) è determinato da:
• immunocomplessi circolanti: ci sono malattie autoimmuni (es LES) che producono complessi
antigene-anticorpo che se circolanti si depositano nell’endotelio casualmente in diversi tessuti,
causando una endotelite;
• infezioni (meningococco, vaiolo...);
• shock: termico, settico;
• vasculiti;
182
Patologia clinica
• anossia;
• acidosi.
Anche il Covid-19 causa danno endoteliale che evolve poi in trombofilia, aumentandone la letalità.
La CID può essere causata anche dall’immissione in circolo di sostanze ad azione diretta:
• veleni di serpente: il veleno della vipera Russel attiva direttamente il fattore X, altri veleni attivano
il fattore II;
• pancreatiti acute: la tripsina attiva direttamente i fattori X e II.
Bisogna ricordare che la CID è sempre conseguente ad un’altra patologia, non esiste una CID primaria, ma
esclusivamente secondaria. Alla base di una CID c’è sempre una condizione in cui si è liberato in circolo una
grande quantità di tromboplastina oppure ha determinato un grande danno endoteliale.
P2.6.3 CID: forme cliniche

La CID può palesarsi in più forme:
• forme acute: quadro clinico dominato da manifestazioni emorragiche, a volte imponenti;
• forme subacute: quadro clinico caratterizzato da sintomi ischemici a carico di varî organi (cervello,
cute, rene, polmone, intestino) conseguenti alla trombosi del microcircolo e/o da emorragie di lieve
entità conseguenti al consumo di fattori della coagulazione;
• forme croniche: quadro clinico silente, in cui l’attivazione della coagulazione è documentabile solo
in base ai dati di laboratorio; tali forme possono scompensarsi dando luogo a sindromi acute o
subacute.
Gli esami di laboratorio possono aiutare non solo a diagnosticare una CID, ma anche tentare di interpretare
se in quel momento sono prevalenti le connessioni che determinano l’emorragia o quelle che determinano
trombosi. Nella fase produttiva, c’è un’attivazione della cascata coagulativa e si ha una grande produzione di
fibrinopeptidi A e B, degli FDP e del D-dimero, si ha una riduzione dell’antitrombina III che non riesce a
svolgere la sua funzione. Questi sono esami di laboratorio che caratterizzano la fase trombogenica.
Nella fase emorragica, dunque un aumento del consumo delle piastrine e dei fattori della coagulazione, si
avrà un crollo della concentrazione di fibrinogeno, diminuzione dei fattori e soprattutto un allungamento di
PT e aPTT, infine anche piastrinopenia.
Tra questi indici di laboratorio, il più importante ultimamente è stato il D-Dimero, che sta venendo sempre
più considerato come indice di riferimento per la CID. L’interpretazione dei dati di laboratorio possono
indicarci il rischio di CID e direzionarci verso le corrette prognosi e terapie, anche se non è facile discriminare
i valori di laboratorio per questa patologia.
P2.7 CONCLUSIONI
Nella riga verde sono mostrati i quattro
esami cardine che servono per studiare un
paziente con un disordine dell’emostasi:
numero di piastrine, tempo di
sanguinamento, PT e aPTT.
In verticale le varie patologie che possono
determinare una alterazione dell’emostasi
primaria e secondaria.
C’è un esame di laboratorio che risulta
essere costante e caratterizza più degli altri
l’alterazione dell’emostasi primaria. Si
tratta del tempo di sanguinamento, che
sarà sempre allungato.
183
Patologia clinica
Il fattore di Von Willebrand serve per l’adesione delle piastrine, ma stabilizza anche il fattore VIII, quindi
impatta anche con la funzionalità del fattore VIII, che riguarda la via intrinseca e dunque un aPTT allungato.
Quindi si ha alterazione dell’emostasi primaria, perché media l’adesione delle piastrine, ma anche alterazione
dell’emostasi secondaria, perché interferisce con la funzionalità del fattore VIII, quindi aPTT sarà allungato.
Il tempo di sanguinamento nell’emofilia sarà normale.
Esempio: in un paziente con emofilia e una lesione, si formerà il tappo emostatico primario, il
sanguinamento si interromperà, però riprenderà a sanguinare dopo un po' quando si è ripristinata la
pressione. Quindi il tappo emostatico primario interrompe l’emorragia e perciò il tempo di sanguinamento
Indici di attivazione del sistema della coagulazione e del sistema fibrinolitico:

• aumento dei fibrinopeptidi A e B;
• aumento degli FDP;
• aumento del D-dimero;
• diminuzione dell'antitrombina III.
Indici di consumo dei fattori della coagulazione e delle piastrine:

• ipofibrinogemia;
• diminuzione degli altri fattori della coagulazione (in particolare V e VIII);
• allungamento di PT e aPTT;
• piastrinopenia.
184
Patologia clinica
P3. DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE DISLIPOPROTEINEMIE

(prof. Treré)
P3.1 MACROMOLECOLE BIOLOGICHE
P3.1.1 Proteine
Le proteine sono grandi molecole costituite da sequenze di amminoacidi legati uno all’altro da un legame
peptidico, ossia un legame tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico
dell’amminoacido successivo, con la perdita di una molecola d’acqua (reazione di condensazione).
Il termine “proteina” (πρώτειος: "primario", "in testa" o "in piedi davanti") è stato introdotto da J. J. Berzelius
nel 1838 per sottolineare l’importante ruolo di queste molecole, corrispondente a quella del DNA (oggi
secondo questa logica dovremmo chiamare “proteine” il DNA perché è questa la molecola primaria da cui si
producono le proteine).
P3.1.2 Glucidi
I glucidi (da γλυκύs: dolce), o carboidrati, sono composti chimici organici caratterizzati da una proporzione
delle tre componenti fondamentali, ovvero atomi di carbonio, di idrogeno e di ossigeno secondo la formula
(CH2O)n,, dove n è un numero che va da un minimo di 3 (triosio) a un massimo di 7 (eptosi). I monosaccaridi
che hanno questa forma possono poi formare strutture complesse.
P3.1.3 Lipidi
Per i lipidi non siamo in grado di identificare un denominatore comune strutturale o funzionale perché non
esiste. Sono infatti un gruppo eterogeneo di composti organici caratterizzati da insolubilità in acqua: sono
185
Patologia clinica
infatti insolubili in solventi polari come l’acqua (e per questo definiti idrofobi), mentre sono solubili in solventi
organici come etere dietilico o acetone, alcoli e idrocarburi.
A causa della loro natura idrofoba, i lipidi non sono in grado di circolare liberamente nel sangue, ma hanno
bisogno di trasportatori, ossia le lipoproteine.
P3.2 LIPOPROTEINE
P3.2.1 Struttura delle lipoproteine

Possiamo ricondurre la struttura delle lipoproteine a due componenti fondamentali:
1. una superficie esterna (che costituisce lo scheletro della macromolecola) formata da:
• colesterolo non esterificato, con la componente idrofilica rivolta all’esterno e quella
idrofobica rivolta all’interno;
• fosfolipidi, con la testa idrofilica all’esterno e le gambe idrofobiche all’interno
• apolipoproteine, ovvero le proteine delle lipoproteine.
2. un nucleo o core, costituito dai lipidi che devono essere trasportati nel sangue tra cui è possibile
trovare:
• colesterolo esterificato con acidi grassi;
• trigliceridi (glicerolo esterificato con tre molecole di acidi grassi).
La componente proteica, in particolare, oltre a svolgere un ruolo strutturale ha anche altre due funzioni
fondamentali:
• è la parte che viene riconosciuta dai tessuti periferici mediante lo specifico recettore:
l’apolipoproteina è quindi il target del recettore che direziona la lipoproteina nei tessuti (ne
determina il destino metabolico);
• le apolipoproteine fungono infine da coenzimi: quando transitano nei tessuti sono in grado di attivare
enzimi normalmente silenti.
Tutto questo assicura un trasporto efficiente della componente lipidica nel sangue.
Per questo motivo, l’interesse dei ricercatori è oggi rivolto a questa componente delle lipoproteine al fine di
intervenire nelle alterazioni delle lipoproteine plasmatiche, chiamate dislipoproteinemie.
186
Patologia clinica
P3.2.2 Classi di lipoproteine

Le lipoproteine possono essere classificate in base a diversi criterî, fra i quali il più utilizzato è basato sulla
densità, che è determinato dal rapporto tra la componente proteica e la componente lipidica. Tanto maggiore
sarà la componente lipidica, tanto più bassa sarà la densità della lipoproteina.
Classificazione in base alla densità

Le lipoproteine vengono classificate in base alla densità in cinque classi principali:
- chilomicroni;
- VLDL (very low density lipoproteins);
- IDL (intermediate density lipoproteins);
- LDL (low density lipoproteins);
- HDL (high density lipoproteins);
La densità di una lipoproteina dipende dal rapporto tra la componente lipidica e quella proteica:
- i chilomicroni sono costituti al 99% da lipidi, mentre le proteine sono solo l’1%;
- le VLDL sono costituite per il 92% da lipidi e per l’8% da proteine;
- le IDL sono costituite per l’85% da lipidi e per il 15% da proteine;
- le LDL sono costituite per l’80% da lipidi e per il 20% da proteine;
- le HDL sono costituite per il 50% da lipidi e per il 50% da proteine.
Quindi la densità aumenta all’aumentare della

componente proteica e al diminuire della
componente lipidica.
L’ultracentrifugazione (a gradiente variabile) è la
tecnica con cui le lipoproteine vengono separate in
base alla densità: occorre cambiare continuamente i
varî gradienti, facendo così fluttare, ovvero emergere
in base alla diversa densità, le lipoproteine. Questa
metodica è però piuttosto impegnativa in termini
economici, quindi non viene usata nella routine
laboratoristica diagnostica. Facciamo comunque
riferimento a questa classificazione per comprendere
il ruolo e la composizione delle diverse lipoproteine.
Classificazione in basse alla separazione elettroforetica

Un altro metodo per studiare il contenuto di lipoproteine è quello elettroforetico, confrontando la loro
mobilità elettroforetica.
La mobilità elettroforetica delle lipoproteine dal catodo all’anodo dipende dalla composizione proteica:
maggiore è la quota di apoproteine, più velocemente la lipoproteina si sposterà verso l’anodo, mentre le
lipoproteine contenenti una scarsa quantità di apoproteine migreranno più lentamente (i chilomicroni, infatti,
avendo una scarsissima componente proteica, rimangono quasi immobili).
Quindi si avrà che:
• le HDL migrano tra le α1-globuline;
• le LDL migrano tra le β-globuline;
• le IDL e VLDL si fermano a metà tra le α- e le β-globuline (“pre-β” indica che si posizionano tra le α-
e le β-globuline, non si riferisce alla migrazione elettroforetica);
187
Patologia clinica
• i chilomicroni hanno l’1% di proteine, quindi in pratica non si muovono e rientrano nelle γ-globuline.
Il risultato dell’elettroforesi è un
lipidogramma colorato specificatamente per
i lipidi che rifletterà le diverse frazioni
lipoproteiche presenti nel sangue.
L’ordine con cui si separano le diverse

lipoproteine con le due tecniche
appena viste non è uguale:
• con l’ultracentrifugazione si
avranno in ordine
chilomicroni, VLDL, LDL e
HDL;
• con l’elettroforesi si avranno
invece chilomicroni, β-
lipoproteine (LDL), pre-β-
lipoproteine (VLDL) e α-
lipoproteine (HDL), quindi
VLD e LDL si scambiano.
188
Patologia clinica
P3.2.3 Caratteristiche delle principali classi lipoproteiche
Nella prima colonna sono visibili le lipoproteine ordinate in base alla densità, espressa in g/L, e al diametro
dell’ordine degli Å.
• I chilomicroni hanno dimensioni pari alla metà o ad un terzo di quelle delle piastrine, quindi sono
sostanze relativamente grandi. Hanno una densità bassissima, inferiore a quella dell’acqua.
• Le VLDL hanno una densità lievemente maggiore (corrispondente circa a quella dell’acqua) e
dimensioni più piccole.
• Le IDL hanno una densità lievemente maggiore dell’acqua e dimensioni ancora più piccole.
• Le LDL hanno una densità maggiore e una dimensione minore.
• Le HDL sono quelle con la densità maggiore e le dimensioni minori.
Riassumendo quindi maggiore è la dimensione, minore è la densità à dai chilomicroni alle HDL la densità
aumenta progressivamente fino ad arrivare a circa 1200 g/L; dai chilomicroni (fino a 12.000 Å circa, quindi 1
µm, dimensioni paragonabili a quelle di una piastrina) alle HDL si riduce progressivamente (le HDL, infatti,
circa sono 100/150 volte più piccole dei chilomicroni).
All’aumentare della densità, diminuisce sia la dimensione che l’eterogeneità (LDL e HDL sono molto più
omogenee rispetto a chilomicroni e VLDL).
In quest’immagine si vedono le dimensioni delle lipoproteine al

microscopio elettronico (fare attenzione allo scarto di
ingrandimento tra chilomicroni e altre lipoproteine, chilomicroni ad
ingrandimento minore).
L’ultima colonna rappresenta invece l’espressione percentuale delle

cinque componenti principali delle lipoproteine.
• Nei chilomicroni e nelle VLDL la componente prevalente è
data dai trigliceridi.
• Nelle IDL e, soprattutto, nelle LDL la componente prevalente
è data dal colesterolo esterificato.
• Nelle HDL la componente prevalente è data dalle proteine, che conferiscono la maggiore densità.
189
Patologia clinica
Per ogni lipoproteina è importante ricordare la componente principale, ossia quella indicata in rosso:
trigliceridi per quanto riguarda chilomicroni e VLDL (rispettivamente 90 e 55), colesterolo esterificato per
quanto riguarda IDL ed LDL (39 e 42), proteine per quanto riguarda le HDL (50).
P3.3 METABOLISMO DEI LIPIDI

Una delle acquisizioni più importanti nello studio delle lipoproteine è derivata dall’aver stabilito che il loro
trasporto nel plasma non è un processo passivo nel quale le diverse lipoproteine si comportano come particelle
inerti; il trasporto delle lipoproteine nel plasma deve invece essere considerato un processo dinamico, durante
il quale le lipoproteine sono continuamente degradate e risintetizzate, con passaggio di componenti proteiche
e lipidiche dalle lipoproteine di una classe alle lipoproteine di classi diverse.
Il metabolismo dei lipidi può essere schematicamente riassunto in tre tappe fondamentali:
- trasporto dei lipidi esogeni;
- trasporto dei lipidi endogeni;
- trasporto inverso del colesterolo.
NB: Questa è una schematizzazione usata per semplificare la spiegazione didattica, ma in realtà il
metabolismo dei lipidi è un meccanismo unico e ben armonizzato.
P3.3.1 Trasporto dei lipidi esogeni

Questo sistema di trasporto distribuisce i trigliceridi assunti con la dieta (circa 100 g/giorno) alle cellule
adipose e muscolari ed il colesterolo assunto con la dieta (circa 1 g/giorno) al fegato (le dosi appena citate
sono state fornite in quanto facili da ricordare, ma sono elevate per una dieta sana).
Tutto il processo di trasporto è mediato dai chilomicroni ed è divisibile in varie tappe:

1. i lipidi vengono assunti con la dieta e assorbiti a livello intestinale grazie ai sali biliari;
2. gli enterociti sintetizzano i chilomicroni, costruendo il rivestimento esterno intorno al nucleo di
trigliceridi e colesterolo;
3. i chilomicroni neosintetizzati presentano in superficie delle apolipoproteine: la apoB48 e la apoA1;
190
Patologia clinica
4. da qui i chilomicroni
entrano in circolo
dove cedono la
apoA1 alle HDL,
dalle quali ricevono
invece la apoC2 e la
apoE;
5. la apoC2 è un
coenzima che attiva
l’enzima LPL
(lipoprotein-lipasi),
espressa sulle cellule
endoteliali dei
capillari del tessuto
adiposo e
muscolare, che
catalizza l’idrolisi dei
trigliceridi trasportati dai chilomicroni;
6. gli acidi grassi passano quindi dal chilomicrone al tessuto adiposo, dove vengono immagazzinati, o
al tessuto muscolare, dove hanno un ruolo energetico;
7. cedendo progressivamente trigliceridi a questi tessuti i chilomicroni diventano piccoli e densi e si
trasformano in residui (chilomicroni remnants) particolarmente ricchi di colesterolo;
8. grazie alla presenza della apoE i chilomicroni remnants vengono riconosciuti da specifici recettori
epatici e captati dal fegato;
9. i trigliceridi che non sono stati ceduti al tessuto adiposo e al tessuto muscolare e tutto il colesterolo
assunto raggiungono quindi il fegato.
Resa calorica dei lipidi

Nel tessuto muscolare i lipidi hanno principalmente una funzione energetica, in quanto questi sono composti
altamente energetici che possono dare fino a 9,4 cal/g, più del doppio di quelle rese da 1 g di glucosio (4,1
cal/g). La resa calorica dei lipidi è, dunque, molto più elevata di quella degli zuccheri, che hanno invece la
caratteristica di essere subito disponibili. Mentre nel tessuto muscolare, quindi, i lipidi fungono da
carburante, che consente il funzionamento del muscolo, nel tessuto adiposo i lipidi vengono depositati per
essere poi utilizzati quando ve n’è la necessità.
Riassumendo, il tessuto muscolare e il tessuto adiposo sono i target dei trigliceridi assunti con la dieta
e trasportati dai chilomicroni. Durante questo tragitto, i chilomicroni perdono trigliceridi e si trasformano in
chilomicroni remnants, che contengono tutto il colesterolo assunto con la dieta (in quanto non viene ceduto
a livello adiposo o muscolare) e una minore quota di trigliceridi. I chilomicroni sono poi destinati al fegato.
Le funzioni fondamentali dei chilomicroni sono quindi
• fornire i trigliceridi alimentari direttamente ai tessuti muscolare e adiposo;
• trasportare tutto il colesterolo alimentare al fegato.
Destino metabolico del colesterolo

Arrivato al fegato, il colesterolo ha diversi destini metabolici:
• una piccola quota viene utilizzata per il turnover della membrana plasmatica degli epatociti, in
quanto esso è un costituente molto importante delle membrane cellulari, quindi le cellule che sono
191
Patologia clinica
in continua proliferazione o che vanno incontro a un frequente turnover delle membrane hanno
bisogno di colesterolo;
• viene utilizzato per la sintesi degli acidi biliari primarî (acido colico e acido chenodesossicolico),
necessarî per l’assorbimento intestinale dei grassi presenti negli alimenti;
• una quota viene eliminata direttamente con la bile, la quale contiene quindi sia gli acidi biliari che
derivano dal colesterolo che colesterolo libero;
• viene redistribuito dal fegato ai tessuti periferici, dopo essere stato montato su un’altra classe di
lipoproteine, le VLDL.
Il nostro organismo è in grado di sintetizzare a livello del fegato il colesterolo a partire da molecole di acetil-
CoA, grazie all’enzima idrossi-metil-glutaril-CoA reduttasi o HMG-CoA-reduttasi (nome da ricordare), che ha
un ruolo molto importante soprattutto nell’approccio terapeutico attualmente più in uso per combattere le
dislipoproteinemie e l’ipercolesterolemia in particolare. In ultima analisi il colesterolo a disposizione è sia
endogeno, cioè prodotto grazie all’HMG-CoA reduttasi, che esogeno, quindi introdotto con la dieta.
A questo punto i trigliceridi, il colesterolo esogeno e quello sintetizzato ex novo dal fegato vengono montati
su un’altra tipologia di lipoproteine: le VLDL, prodotte dal fegato stesso, che ripartono dal fegato e tornano
in circolo.
P3.3.2 Trasporto dei lipidi endogeni

Le VLDL partono dal fegato con una
composizione simile a quella dei
chilomicroni. Come per questi ultimi infatti:
• la componente principale è data
dai trigliceridi;
• ricevono apoE e apoC2 dalle HDL;
• l’apoC2 attiva la LPL;
• scaricano trigliceridi nei tessuti
muscolare e adiposo, che quindi
ricevono i trigliceridi prima dai
chilomicroni e poi dalle VLDL.
Le VLDL hanno come apolipoproteina

strutturale ApoB100, sintetizzata dagli
epatociti. Analogamente a quello che
accade nei chilomicroni (idrolisi dei
trigliceridi ad opera della LPL attivata da
apoC2), le VLDL cedono acidi grassi alle cellule adipose e muscolari impoverendosi di trigliceridi e
trasformandosi in IDL.
Le IDL cedono l’apoC2 alle HDL e

• in parte (50%) vengono ricaptate dal fegato;
• in parte rimangono in circolo e scambiano componenti con le HDL tramite l’enzima CETP (o ApoD)
che consente il trasferimento di fosfolipidi e di trigliceridi dalle IDL alle HDL, ma soprattutto il
trasferimento di colesterolo esterificato dalle HDL alle IDL. Queste ultime, quindi, perdono trigliceridi
e fosfolipidi e si arricchiscono di colesterolo esterificato e si trasformano in LDL.
Le LDL contengono quindi il colesterolo alimentare, il colesterolo acquisito dalle HDL e il colesterolo
neosintetizzato dal fegato (tre fonti diverse); sono infatti le lipoproteine con la percentuale maggiore di
colesterolo e quindi sono anche quelle più pericolose per quanto riguarda la colesterolemia.
Da un punto di vista fisiologico, il colesterolo è fondamentale per il corretto funzionamento delle cellule, ma
può risultare dannoso se presente in quantità eccessiva.
Le LDL hanno come ruolo principale la distribuzione del colesterolo ai vari tessuti, in particolare: ai tessuti
periferici che utilizzano il colesterolo come precursore per la sintesi degli ormoni steroidei (surreni e gonadi),
192
Patologia clinica
per la sintesi di vitamine liposolubili (ad esempio la vitamina D prodotta dalla cute) o per il turnover della
membrana plasmatica (cellule nucleate del sangue, renali, muscolari lisce, endoteliali e fibroblasti). Le LDL
non sono quindi per loro natura “cattive” perché svolgono un ruolo fisiologico fondamentale, diventano
“cattive” quando sono particolarmente concentrate o modificate.
Una volta svolta la loro funzione tornano al fegato che le riconosce grazie al recettore per le LDL, recettore
che riconosce apoB100.
Il rilascio intracellulare di colesterolo che consegue alla captazione delle LDL per endocitosi produce 3
principali effetti:
• l’attivazione dell’enzima acetilCoA-colesterolo aciltransferasi (ACAT), che favorisce l’esterificazione
ed il deposito di colesterolo all’interno degli epatociti;
• l’inibizione dell’enzima HMG-CoA-reduttasi, con conseguente blocco della sintesi intraepatica di
colesterolo;
• l'induzione della espressione della proteina SRE (sterol response element) che agisce sulla regione
"promoter" del gene per il recettore delle LDL, disattivandolo; pertanto, maggiore è la concentrazione
di colesterolo nell’epatocita, minore sarà il numero di recettori per le LDL espressi dall’epatocita
stesso, e viceversa.
Ipercolesterolemia
Una buona parte delle LDL viene ricaptata dal fegato grazie al recettore per le LDL,
in grado di riconoscere l’ApoB-100 e consentire l’ingresso di tali lipoproteine negli
epatociti. La scoperta di questo recettore ha consentito di capire molto sul
metabolismo delle lipoproteine e i ricercatori che lo hanno scoperto durante i loro
studi sull’ipercolesterolemia familiare, Joseph Goldstein e Michael Brown, nel 1985
hanno ricevuto il premio Nobel per tale scoperta.
Sulla membrana degli epatociti è presente il recettore per le LDL che capta selettivamente le LDL circolanti. I
ricercatori hanno scoperto che tale recettore viene espresso in maniera quantitativamente diversa dagli
epatociti, che quindi ne presenteranno sulla membrana una quantità estremamente variabile. La quantità di
recettore espresso dipende dalla quantità di colesterolo contenuto all’interno dell’epatocita stesso: più bassa
sarà la quantità di colesterolo presente all’interno dell’epatocita, maggiore sarà l’espressione del recettore
sulla sua superficie e viceversa. Il blocco del recettore, in caso di elevata quantità di colesterolo all’interno
dell’epatocita, fa sì che le LDL rimangano in circolo determinando un aumento della colesterolemia. Esiste
quindi un rapporto diretto tra quantità di colesterolo intraepatocitario, espressione del recettore delle LDL e
colesterolemia. La colesterolemia dipende quindi in un’ultima analisi dalla quantità di colesterolo presente
all’interno degli epatociti. Per ridurre la colesterolemia, la strategia più efficace è quella di ridurre la quantità
di colesterolo assunta con la dieta.
Meno colesterolo assunto à meno colesterolo trasportato dai chilomicroni negli epatociti à maggiore
espressione del recettore per le LDL à riduzione delle LDL nel sangue periferico.
Viceversa, una dieta ricca di colesterolo farà sì che il colesterolo circolante rimanga più elevato.
Il primo approccio utilizzato per ridurre l’ipercolesterolemia è quindi ridurre la quantità di colesterolo
assunto con la dieta. Quando la dieta non è sufficiente, si può intervenire con dei farmaci. I primi farmaci a
essere stati utilizzati sono stati la colestiramina e il colestipolo (ora non sono più utilizzati per gli importanti
effetti collaterali) ed erano sequestratori di acidi biliari primarî, che sono prodotti dal fegato e contengono
un’elevata quantità di colesterolo; essi vanno nell’intestino, dove vengono riassorbiti, e poi tornano nel
fegato (circolo enteroepatico degli acidi biliari). Interrompendo il ciclo, essi rimangono a livello intestinale e
vengono escreti con le feci e con essi il colesterolo contenuto al loro interno. Questo approccio, pur
risultando utile per ridurre la colesterolemia, presenta però diversi effetti collaterali.
193
Patologia clinica
I farmaci attualmente più utilizzati per ridurre la colesterolemia sono le statine, che inibiscono la HMG-CoA
reduttasi impedendo così la neosintesi di colesterolo endogeno da parte degli epatociti. Si riduce quindi la
quantità di colesterolo all’interno degli epatociti, aumenta l’espressione dei recettori per le LDL e si riduce la
colesterolemia.
Quindi, per ridurre i livelli di colesterolemia, è importante ridurre sia il colesterolo endogeno (tramite statine)
che quello esogeno (dieta controllata).
Partendo dal recettore è stato possibile sviluppare questa terapia farmacologica.
P3.3.3 Trasporto inverso del colesterolo

Questo sistema consiste nel trasporto del colesterolo dai tessuti periferici al fegato (inverso quindi rispetto
a quello descritto precedentemente) ed è mediato dalle HDL.
1. Le HDL si formano “magicamente” in circolo dalla coalescenza di fosfolipidi e apolipoproteine
(quindi si forma prima la superficie esterna), in particolare vengono utilizzate le proteine apoA1
(prodotta dal fegato e dall’intestino) e apoA2 (prodotta solamente dal fegato).
2. Le HDL neoformate, che si possono paragonare a “contenitori vuoti” (HDL nascenti), circolano nel
sangue e prelevano il colesterolo non esterificato dai tessuti periferici (ad esempio dai macrofagi).
Le HDL sono in grado di esterificare il colesterolo prelevato grazie all’azione di un enzima specifico,
la LCAT (lectina- colesterolo aciltrasferasi), di cui l’apoA1 costituisce un cofattore essenziale.
3. Le HDL ora ricche di colesterolo esterificato (HDL mature) si dirigono al fegato e vengono rimosse dal
plasma mediante captazione epatica attraverso recettori specifici per le apoA (scavenger receptor
class B1 – SR-B1).
In realtà le HDL hanno almeno altre due funzioni fondamentali che non emergono dalla denominazione di
“trasporto inverso”:
• garantiscono il trasferimento del colesterolo alle IDL, ricevendo dalle IDL trigliceridi e fosfolipidi:
passaggio fondamentale per la trasformazione delle IDL a LDL, ricche di colesterolo. [In circolo, grazie
all’azione dell’enzima CETP (cholesterol ester transfer protein, oggi identificato con la apoD), le HDL
possono trasferire esteri del colesterolo su altre lipoproteine (sistema VLDL-LDL) ricevendo in cambio
trigliceridi e fosfolipidi.];
194
Patologia clinica
• sono un serbatoio di apolipoproteine che vengono cedute alle altre tipologie di lipoproteine; in
particolare sia i chilomicroni che le VLDL acquisiscono in circolo l’apoC2 e l’apoE dalle HDL.
Riassumendo, le funzioni principali delle HDL sono quindi tre:
1. prelevare il colesterolo che deriva dai processi catabolici dei tessuti periferici e trasportarlo al
fegato (trasporto inverso del colesterolo);
2. garantire il passaggio da IDL a LDL, cedendo alle IDL

colesterolo esterificato, grazie al trasferimento a
esse di colesterolo esterificato contenuto
all’interno delle HDL tramite l’enzima CETP o
ApoD;
3. costituire un serbatoio di apolipoproteine

(principalmente apoC2 e apoE) che scambiano con
chilomicroni e VLDL. ApoC2 e apoE sono infatti
veicolate dalle HDL, ma non servono a esse, che
quindi le cedono a chilomicroni e VLDL per
l’attivazione della LPL e l’idrolisi dei trigliceridi
(apoC2) e il riconoscimento dei chilomicroni da
parte del fegato (ApoE).
(N.B. Le ApoE che vengono cedute dalle HDL
alle VLDL non sono utilizzate per il
riconoscimento da parte dei recettori a livello
epatico, ma vengono restituite alle HDL).
P3.4 DISLIPOPROTEINEMIE
Come ben sappiamo, la condizione di dislipoproteinemia è uno dei fattori di rischio principali per lo sviluppo
di aterosclerosi, che è alla base delle patologie cardiovascolari (cardiopatia coronarica e malattie
cerebrovascolari), le quali rappresentano la più frequente causa di morte nel mondo occidentale. Oggi non
ci sono dubbî sul fatto che una riduzione dei livelli lipoproteici riduce significativamente la mortalità
cardiovascolare; questo è stato dimostrato sia in studî di prevenzione primaria (pazienti che non hanno avuto
precedenti fenomeni cardiovascolari) sia in studî di prevenzione secondaria (pazienti che hanno avuto
almeno un episodio cardiovascolare).
Anche in questi pazienti, ovvero quelli che hanno già avuto un evento cardiovascolare, ridurre la
concentrazione di lipoproteine significa ridurre il rischio di un secondo evento cardiovascolare. È chiaro che
il metabolismo delle lipoproteine, visto in precedenza, ha un ruolo fondamentale nella insorgenza
dell’aterosclerosi e nel determinare quei numeri impressionanti legati alla mortalità cardiovascolare nel
mondo occidentale.
[Un grande numero di prove sperimentali e di dati epidemiologici hanno dimostrato che il processo
aterosclerotico, principale responsabile del danno ischemico che si determina nei pazienti con malattie
cardiovascolari, è accelerato dalla presenza di una iperlipoproteinemia e che la correzione, anche parziale,
della iperlipoproteinemia riduce significativamente la mortalità cardiovascolare].
195
Patologia clinica
P3.4.1 Evidenze emerse dagli studî prospettici
Studio di Framingham
Prima di arrivare alle conclusioni sopra citate è stato necessario svolgere studî molto impegnativi, iniziati nel
1947 nella piccola città di Framingham [Pr: Fremingam], Massachussetts (USA), diventata famosissima nella
storia della medicina. Lo studio di Framingham è un classico esempio di studio prospettico: si esegue un
prelievo di sangue a un certo numero di soggetti (in
questo caso i 5000 abitanti di Framingham) e si
valutano una serie di parametri e indicatori (ad
esempio il peso, l’altezza, il sesso…); a questo punto
è necessario attendere numerosi anni e solo quando
i soggetti svilupperanno una serie di patologie si
potrà tentare di correlarle agli indicatori rilevati
all’inizio dello studio al tempo zero.
[Lo studio di Framingham ha dimostrato che ogni
incremento dell’1% della colesterolemia è associato
a un aumento di incidenza di cardiopatia ischemica
del 2-3%]. Lo studio di Framingham sta andando
avanti ancora oggi: i ricercatori sono arrivati a studiare i nipoti dei primi soggetti analizzati.
Gli studî prospettici sono fondamentali anche per definire la validità di un approccio terapeutico e capire se
un farmaco è efficace: si può, ad esempio, somministrare un determinato farmaco a un gruppo di pazienti e
un farmaco di altro tipo (o un placebo) a un altro gruppo; dopodiché si attendono diversi anni fino a che non
sarà possibile trarre delle conclusioni. Pensando all’attualità, degli esempî di studî prospettici sono quelli in
corso sui vaccini anti-Covid-19: infatti, solo una volta terminati gli studî sarà possibile conoscere con certezza
gli eventuali effetti collaterali a lungo termine (per ora sappiamo solo gli effetti nel primo anno post vaccino).
Gli studî prospettici prendono quindi questo nome proprio perché prima di poter concretizzare i risultati è
necessario attendere molti anni. Si tratta dunque di studî molto impegnativi e che richiedono numerosi
finanziamenti (è necessario eseguirli in diversi paesi e ripeterli nel tempo). Questi studî sono iniziati dopo la
Seconda Guerra Mondiale ed è stato possibile realizzarli proprio grazie alla ripresa economica avvenuta in
quegli anni.
Sistema di conversione per i valori di colesterolo

In Italia si esprimono i campioni analizzati in laboratorio in mg/dL (sistema tradizionale). In realtà questa
espressione non è perfettamente corretta, infatti questa unità di misura rappresenta più una densità
piuttosto che una concentrazione; quest’ultima viene infatti espressa in mmol/L; quindi il S.I. raccomanda
l’utilizzo della seconda unità di misura, utilizzata infatti sia dagli anglosassoni che dagli americani. Nel grafico
precedente si indica quindi la concentrazione in mmol/L, ma si ha tra parentesi l’unità di misura in mg/dL,
utilizzata quotidianamente in Italia.
Per passare da un’unità all’altra bisogna moltiplicare i
mg/dL per 10 e dividere per il peso molecolare.
Viceversa, per ottenere i mg/dL bisogna moltiplicare
le mmol/L per il peso molecolare e dividere per 10.
Specificamente per il colesterolo il fattore di
conversione pre-calcolato è 0,0259, quindi
moltiplicando i mg/dL per questo fattore di
conversione si otterranno le mmol/L.
Esempio: colesterolemia di 200mg/dL = 5,18 mmol/L.
196
Patologia clinica
Studio MRFIT (Multiple Risk Factor Interventional Trial)

Da uno studio condotto successivamente a quello di Framingham è emersa una correlazione molto stretta
tra i livelli di colesterolo e la mortalità cardiovascolare. In particolare, maggiore è il colesterolo misurato al
tempo 0 e maggiore è la probabilità nei 6 anni successivi di andare incontro ad un evento cardiovascolare.
Studio PROCAM (Prospective Cardiovascular Münster)

Studî successivi dimostrarono però che non tutto il colesterolo
è “cattivo”: quello pericoloso è infatti quello delle LDL. In
questo particolare studio, che ha coinvolto 4263 uomini, si è
notato che nei 6 anni successivi si sono verificati 221 eventi
coronarici e che in più della metà dei casi i pazienti coinvolti
avevano valori di colesterolo LDL particolarmente elevati. Al
contrario, nei pazienti con bassi livelli di colesterolo LDL si
sono registrati pochi eventi coronarici.
Allo stesso modo, è stato possibile ricavare delle conclusioni anche

sul colesterolo HDL, di cui ancora non era nota la funzione. In
particolare, si è osservato che il colesterolo HDL ha un ruolo
protettivo, dal momento che nei pazienti con elevati valori si sono
registrati meno eventi coronarici rispetto a quelli che presentavano
valori inferiori.
In conclusione, si è compreso che non è il colesterolo in generale a
essere pericoloso, ma solo il colesterolo LDL, che rappresenta un
importante fattore di rischio per l’insorgenza di aterosclerosi e,
quindi, di malattie cardiovascolari. Al contrario, il colesterolo HDL ha
addirittura un importante ruolo di prevenzione dalle malattie cardiovascolari. Si è quindi iniziato a indagare
sui meccanismi molecolari che fanno sì che le LDL siano un fattore di rischio mentre le HDL siano un fattore
protettivo.
L’aumento dei livelli di trigliceridi rappresenta una condizione di rischio per l’insorgenza di aterosclerosi, ma
l’associazione con le malattie cardiovascolari risulta meno evidente di quella dimostrata per il colesterolo LDL.
c-LDL, c-HDL, trigliceridi e malattie cardiovascolari

Tutti questi studi prospettici ci hanno consentito di concludere che:
• il colesterolo-LDL rappresenta ad oggi il più importante fattore di rischio, tra quelli legati alle
lipoproteine, per l’insorgenza di aterosclerosi e quindi malattie cardiovascolari;
• l’aumento dei livelli di colesterolo-HDL rappresenta un forte indice di protezione, per questo si parla
colesterolo “cattivo”, legato alle LDL e “buono”, legato alle HDL;
• i trigliceridi sono stati per molti anni considerati più pericolosi del colesterolo, tuttavia i numerosi
studi svolti in tutto il mondo hanno ridotto il rischio associato ai trigliceridi; sicuramente questi
impattano sull’aterosclerosi ma hanno un peso notevolmente inferiore rispetto al colesterolo-LDL.
Lipoproteina a – Lp (a)
[Dalle slide] La lipoproteina a – Lp (a) rappresenta una frazione lipoproteica con densità tra le IDL e le HDL e
migrazione elettroforetica di tipo pre-β.
197
Patologia clinica
La Lp (a) è una componente quantitativamente minore nella popolazione lipoproteica generale: la sua
importanza clinica deriva dal fatto che un incremento su base genetica dei livelli sierici di questa lipoproteina
è stato associato a un forte aumento del rischio di sviluppare cardiopatia coronarica.
La pericolosità delle Lp (a) è presumibilmente dovuta alla omologia tra la sequenza amminoacidica della apo
(a) e il plasminogeno: la Lp (a) potrebbe pertanto competere con il plasminogeno nel legame con il tPA
(attivatore tessutale del plasminogeno), inibendo l’attività fibrinolitica basale del tPA.
Effetto promuovente delle LDL

È di fondamentale importanza che le LDL rimangano all'interno dei vasi e non passino attraverso l'endotelio;
tuttavia, il passaggio delle LDL dal lume vascolare alla tonaca intima dei vasi si può verificare se:
• le LDL sono particolarmente concentrate nel sangue periferico;
• l'endotelio subisce un danno e perde la sua impermeabilità;
• Entrambe le cose (concentrazione elevata + danno endoteliale);
• si modifica la struttura delle LDL tramite glicazione (ad esempio nel diabete).
In questi casi, le LDL cominciano a

passare attraverso l'endotelio (in
genere si utilizza il termine
"insudare") e raggiungono la tonaca
intima, dove i sistemi di protezione
(contro l’ossidazione oppure contro
la glicazione) non possono agire.
[Nell’intima dei vasi le LDL sono
meno soggette al controllo degli
agenti antiossidanti che sono a
disposizione nel sangue periferico].
Di conseguenza, le LDL si modificano
e non possono essere regolate. Le
LDL modificate attivano una
proteina importante chiamata MCP-
1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) che richiama i monociti, normalmente situati nei vasi. I monociti,
a seguito di questo stimolo, cominciano a rotolare sull'endotelio per poi entrare nella parete del vaso e
diventare macrofagi. A sua volta, questo innesca la produzione di una serie di citochine (ad esempio TNF-α
e IL-1) che aumentano l'espressione sull'endotelio delle molecole di adesione (E-selectine, VCAM e ICAM).
Queste ultime rallentano i monociti, facilitandone l'introduzione nella parete del vaso e innescando così un
circolo vizioso: i monociti arrivano nell'intima, si trasformano in macrofagi e richiamano altri monociti. Il
problema però è che i monociti non sono in grado di digerire le LDL e questo porta alla formazione delle
cosiddette cellule schiumose (monociti o macrofagi che non sono riusciti a digerire le LDL), all'origine del
processo di formazione della placca aterosclerotica.
Tutto il processo parte dalle LDL che quindi sono “cattive” non di per sé, ma lo diventano quando sono
altamente concentrate oppure c’è un danno endoteliale.
Ricapitolando, le LDL promuovono l’aterogenesi perché:

• alterano la funzione endoteliale e si accumulano nell’intima, dove vanno incontro a modificazioni
principalmente ossidative;
• inducono le cellule endoteliali ad esprimere citochine chemiotattiche e molecole di adesione per i
monociti;
• inducono il differenziamento dei monociti in macrofagi e la loro trasformazione in cellule schiumose.
198
Patologia clinica
Effetto protettivo delle HDL

Le HDL sono definite "buone", in
contrapposizione alle LDL, perché:
• promuovono l'efflusso di
colesterolo (quindi portano via il
colesterolo da cellule e tessuti e lo
riportano al fegato), riducendo la
deposizione nei vasi e la
formazione delle cellule
schiumose;
• inibiscono l'espressione delle
molecole di adesione
sull'endotelio impedendo
l’extravasazione dei monociti e
interrompendo quel circolo vizioso
che si viene a formare e che
determina l’accumulo di cellule macrofagiche e quindi cellule schiumose, che sono le responsabili
dell’attivazione del processo aterosclerotico;
• inibiscono l’ossidazione delle LDL, che è la modificazione più importante che le trasforma e le rende
in grado di richiamare monociti e macrofagi. Uno dei meccanismi studiati è quello dell’enzima
paraoxonasi ma ne esistono altri riportati nella letteratura scientifica.
In sostanza, le HDL riescono a interrompere quel circolo vizioso visto in precedenza che tenderebbe a
richiamare monociti quando si accumulano le LDL nell'intima e a portare alla formazione delle cellule
schiumose.
Ricapitolando, le HDL prevengono l’aterogenesi in quanto:

• inibiscono l’ossidazione delle LDL grazie alla attività dell’enzima paraoxonasi e all’azione riducente
delle apolipoproteine A;
• inibiscono l’espressione di molecole di adesione per i monociti sulla superficie delle cellule endoteliali;
• promuovono l’efflusso di colesterolo dai macrofagi, riducendo la formazione delle cellule schiumose.
P3.4.2 Aterosclerosi e infiammazione

In passato, l'aterosclerosi era considerata esclusivamente una patologia degenerativa dei vasi; solo
recentemente si è scoperto che l'infiammazione ha un ruolo fondamentale nell'aterogenesi e che quindi
l’aterosclerosi può essere definita anche come una malattia infiammatoria (processo infiammatorio
sistemico che si esplica con questi meccanismi a livello vascolare). Effettivamente, questo non stupisce se si
pensa che la maggior parte dei fattori citati in precedenza (monociti, macrofagi, citochine) sono caratteristici
proprio del processo infiammatorio.
[Esistono evidenze molto chiare che dimostrano un ruolo centrale del processo infiammatorio non solo
nell’insorgenza della placca aterosclerotica, ma anche nel suo accrescimento e nello sviluppo delle
complicanze, rottura in primis.]
Considerare l'aterosclerosi tra le malattie infiammatorie ha due implicazioni importanti:

• è possibile pensare di sfruttare gli antinfiammatori in ambito terapeutico per la prevenzione.
In realtà, da un punto di vista pratico, gli antinfiammatori normalmente utilizzati nella pratica clinica
(aspirina, FANS...) non hanno dato buoni risultati. Tuttavia, questo non significa che la battaglia sia
persa, ma semplicemente che sarà necessario continuare a realizzare studî su altri antinfiammatori
(campo di ricerca molto attuale).
199
Patologia clinica
● gli indici di flogosi possono essere considerati indici di aterosclerosi. [Si è ipotizzato che i marcatori
di flogosi possano rappresentare indicatori indiretti di aterosclerosi silente, costituendo uno
strumento aggiuntivo per la definizione del rischio cardiovascolare individuale.]
Anche in questo caso, però, c'è un problema: gli indici di flogosi sono aspecifici, dunque si possono
modificare anche per altre cause oltre all'aterosclerosi. Al momento si sta quindi cercando di trovare
una specificità da un punto di vista quantitativo, cioè si sta cercando di identificare un livello oltre il
quale sia possibile correlare gli indici di flogosi esclusivamente all'aterosclerosi e non ad altri processi,
oppure trovare indici di flogosi specifici per l’aterosclerosi. Un'attenzione particolare è rivolta alla
proteina C reattiva (PCR), che potrebbe rappresentare un importante indicatore di rischio di
aterosclerosi e un importante fattore prognostico. Sono in corso degli studî prospettici a riguardo,
per cui è necessario attendere ancora qualche anno prima di poter trarre delle conclusioni. [Risultati
ancora preliminari, ma già consistenti sul piano del numero dei pazienti analizzati, hanno dimostrato
che i livelli di proteina C reattiva sono significativamente associati allo sviluppo di malattie
cardiovascolari, mostrando un potere predittivo indipendente e, talvolta, addirittura superiore a
quello espresso dai tradizionali fattori di rischio. Secondo alcuni autori, la PCR potrebbe addirittura
avere un ruolo “diretto” nello sviluppo e nella progressione delle lesioni aterosclerotiche, costituendo
quindi non tanto un marcatore di rischio, quanto piuttosto un vero e proprio fattore di rischio
cardiovascolare.]
In conclusione, considerare l’aterosclerosi una malattia infiammatoria consente di poter approfondire la

patologia sia dal punto di vista terapeutico, tramite la ricerca di antinfiammatori efficaci, sia dal punto di vista
diagnostico, tramite la corretta interpretazione dei marcatori di flogosi.
P3.5 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE IPERLIPOPROTEINEMIE

Valutare le lipoproteine in base alla loro densità risulta troppo dispendioso, per cui non è possibile renderlo
un esame di routine (viene comunque eseguito in alcune circostanze).
L'alternativa è basata su tre esami di laboratorio, che consistono nel dosaggio di:
• trigliceridi totali;
• colesterolo totale;
• colesterolo HDL (NB: non si dosano le HDL, ma il colesterolo contenuto nelle HDL).
Per quanto riguarda colesterolo frazionato, la frazione di colesterolo riferibile alle HDL si ricava misurando
prima il colesterolo totale e poi usando anticorpi anti-apoB, che determineranno la precipitazione di tutte le
altre classi di lipoproteine (VLDL, IDL, LDL). Eseguendo questo esame la mattina a digiuno non saranno
presenti chilomicroni, per cui rimarranno in sospensione esclusivamente le HDL e basterà dosare il
colesterolo presente nel sovranatante.
Per calcolare il colesterolo LDL, invece, si utilizza la formula Friedewald [Pr: Fridvold]:
(la mattina a digiuno)

col. totale = col. LDL + col. HDL + col. VLDL + col. IDL
da cui consegue che:
col. LDL = col. totale – col. HDL – col. VLDL – col. IDL
Per risolvere questa equazione è necessario ridurre al minimo le incognite. Il colesterolo totale è noto perché
il valore viene ricavato tramite esame di laboratorio; lo stesso vale anche per il colesterolo HDL, ricavato con
il metodo analizzato precedentemente. Il colesterolo VLDL e il colesterolo IDL, invece, non sono noti.
200
Patologia clinica
Tuttavia, Friedewald ha scoperto che la somma tra colesterolo VLDL e colesterolo IDL corrisponde ai
trigliceridi (mg/dL) diviso 5 (o trigliceridi diviso 2,2 se consideriamo mmol/L) [tale approssimazione è da
ritenersi valida quando la concentrazione dei trigliceridi risulta inferiore a 400 mg/dL].
A questo punto, possiamo risolvere l'equazione:
col. LDL = col. totale – col. HDL – trigliceridi (mg/dL) / 5

oppure
col. LDL = col. totale – col. HDL – trigliceridi (mmol/L) / 2,2
P3.5.1 Esiste un valore di riferimento per il colesterolo?

Il valore tipicamente indicato come riferimento per il colesterolo è 200 mg/dL,
valore che è ormai diventato dominio di conoscenza pubblica anche a causa di
pubblicità che insistono su questo valore [nds: a destra, esempio di pubblicità].
Questo valore è diventato talmente

noto tanto che in passato la pubblicità
di uno yogurt [nds: a sinistra, foto
tratta dalla pubblicità10] lo ha
utilizzato in maniera scorretta. La
pubblicità è stata in seguito ritirata
perché giudicata ingannevole (la
bevanda in questione era stata
sponsorizzata come un farmaco), ma in realtà presentava anche un altro difetto,
forse persino più grave: alimentava l'idea che 200 mg/dL fosse il valore di riferimento per il colesterolo, e
quindi che al di sotto di questo valore il rischio di aterosclerosi fosse minimo. In realtà, per il colesterolo non
è possibile identificare un valore di riferimento. Questo perché, mentre per altre condizioni è possibile
confrontare gli esami di laboratorio di pazienti sani e pazienti malati e i relativi livelli, in questo caso non è
possibile fare una distinzione così netta tra sani e malati: qui non si parla di sani e malati, ma di un indice di
rischio.
Il valore di 200 mg/dL non è altro che una decisione arbitraria (potrebbe ad esempio essere ridotto a 180
mg/dl in futuro), e non può essere considerato come un valore che separa i pazienti sani da quelli malati.
Questo valore non è stato calcolato, è stato deciso arbitrariamente considerando che per valori al di sotto di
200 mg/dL il rischio, pur non essendo zero, è accettabile.
Addirittura, però, il grafico a lato mostra come il

tasso di mortalità sia maggiore in un soggetto
con un valore di colesterolemia totale
leggermente inferiore a 200 mg/dL rispetto a un
soggetto con un valore di poco superiore a 200
(entrambi sono morti per fenomeni
cardiovascolari, nonostante livelli diversi di
colesterolemia, uno sotto e l’altro sopra il rischio
accettabile).
Proprio per questo, dobbiamo essere
consapevoli che non ci può essere un valore di
riferimento per la colesterolemia (diffidare dei
10
Per quelli contro il politically correct: si tratta del “Danacol”!
201
Patologia clinica
valori tondi in medicina). L'indicazione migliore sarebbe quella di mantenere i livelli di colesterolo il più bassi
possibile ("low is better", come dicono gli americani), anche perché bassi livelli di colesterolo non sono
associati ad alcuna patologia. Lo stesso discorso si può fare ad esempio per i livelli di radioattività considerati
accettabili in un determinato ambiente (valore arbitrario). Questa indicazione ("low is better") non è però
valida per tutti i fattori: ad esempio, non vale per il secondo fattore di rischio dell'aterosclerosi, ovvero
l'ipertensione (in questo caso, sarebbe meglio dire "medium is better").
P3.5.2 Valori "accettabili" di colesterolo e trigliceridi

Per i trigliceridi si considerano accettabili valori
compresi tra 150 e 200 mg/dL.
Per il colesterolo totale (somma di colesterolo

buono e colesterolo cattivo) i valori accettabili sono
al di sotto dei 200 mg/dL nell'adulto e al di sotto dei
180 mg/dL nel giovane.
Oltre al colesterolo totale, bisognerebbe però

monitorare anche e soprattutto i livelli di
colesterolo LDL, quello "cattivo". In particolare, per
il colesterolo LDL si considerano desiderabili valori
al di sotto dei 130 mg/dL, valori limite quelli
compresi tra 130 e 159 mg/dL e valori associati a un
rischio elevato quelli superiori ai 160 mg/dL.
Per il colesterolo HDL si considerano auspicabili valori superiori a 35 mg/dL nell'uomo e a 45 mg/dL nella
donna. Nel caso in cui i valori non siano sufficienti si può consigliare al paziente di svolgere attività sportiva,
proprio per aumentare le HDL.
Oltre ai valori assoluti, è importante anche valutare il rapporto tra colesterolo LDL e HDL, che dovrebbe
essere inferiore a 3, e quello tra il colesterolo totale e il colesterolo HDL, che dovrebbe essere inferiore a 5.
L’indicatore tondo di 200 mg/dL continua ad essere usato perché più facile da comunicare al paziente ma
dobbiamo essere consapevoli che è nella valutazione dei livelli del colesterolo frazionato HDL e LDL e
soprattutto nel loro rapporto che si trovano indicatori di rischio più utili ed efficaci.
Esempio: In questo esame di laboratorio il

colesterolo totale è pari a 211 mg/dL, ma non è
l'unico valore che bisogna considerare. Infatti, il
colesterolo LDL è pari a 133 mg/dL e quello HDL a
59 mg/dL e il rapporto tra i due corrisponde a 2,25
(il valore accettabile è inferiore a 3).
Inoltre, anche il rapporto tra il colesterolo totale
e il colesterolo HDL è al di sotto di 5.
Ovviamente questo non significa che non si debba
consigliare al paziente in questione di ridurre
l'assunzione di colesterolo, ma che è necessario
valutare tutti i parametri e non fermarsi solo al
valore di colesterolo totale.
202
Patologia clinica
P3.5.3 Fattori di rischio cardiovascolari

Il colesterolo è sicuramente importantissimo nella determinazione di rischi cardiovascolari, ma deve essere
valutato in un contesto generale che tiene conto di tutti i fattori di rischio per malattie cardiovascolari. Questi
si dividono in:
● fattori non modificabili: età, sesso, fattori genetici;
● fattori modificabili: iperlipidemia, ipertensione (causa danno endoteliale e favorisce insudazione
delle LDL), diabete (favorisce modificazione delle LDL), fumo di sigarette (produce danni endoteliali,
modifica permeabilità dei vasi), obesità e sedentarietà (legati allo stile di vita), iperomocisteinemia
(ultimo fattore individuato).
È molto importante che a tutti i fattori venga data la stessa importanza e non bisogna soffermarsi sul fattore
di rischio con cui si ha maggiore familiarità. Ad esempio, un cardiologo non deve attribuire più importanza
all'ipertensione solo perché è il fattore di rischio con cui ha più familiarità, ma vanno considerati tutti (e così
via per chi si occupa di nutrizione, diabete ecc.).
Ovviamente il paziente dovrà monitorare soprattutto il parametro che risulta più modificato, ma è comunque
necessario fornirgli un indicatore che tenga conto anche degli altri fattori.
Un tempo si utilizzavano queste tabelle

colorimetriche, molto difficili da interpretare: sulla
base di fattori quali età, sesso, ipertensione,
diabete, fumo, colesterolemia e altri, si indicava il
rischio cardiovascolare attraverso l’intensità della
colorazione (da viola, rischio massimo, fino
all’azzurro chiaro, rischio minimo ma mai zero).
Oggi invece si tende a utilizzare siti che calcolano il
rischio in percentuale sulla base degli stessi fattori.
Il professore suggerisce a questo proposito di visitare i seguenti siti web, dove poter verificare come varia il
rischio di eventi cardiovascolari in base ai diversi fattori (età, sesso, abitudine al fumo, ipertensione...):
1. http://www.cuore.iss.it/valutazione/calc-rischio (istituto superiore di sanità)
2. https://siia.it/per-il-pubblico/calcolo-del-rischio-cardiovascolare
3. https://www.siditalia.it/clinica/formule-e-calcolatori (sito italiano di diabetologia)
203
Patologia clinica
Questi siti fanno comprendere come l’aterosclerosi sia sempre il risultato di una molteplicità di fattori, tutti
ugualmente interessanti nel definire un rischio complessivo. Ci si può inoltre rendere conto del peso specifico
di ciascun fattore.
P3.6 CLASSIFICAZIONE “DI LABORATORIO” O “FENOTIPICA” DELLE

IPERLIPOPROTEINEMIE SECONDO FREDERICKSON (NON TRATTATA A LEZIONE)
[Non trattata a lezione]
Questa classificazione si basa ancora oggi sullo schema proposto da Frederickson nel 1970; essa prevede la
ripartizione delle varie forme di iperlipoproteinemia in 6 fenotipi distinti in base:
• all’aspetto del siero (dopo una notte a +4°C);
• alla composizione di colesterolo e trigliceridi;
• all’analisi elettroforetica delle lipoproteine.
204
Patologia clinica
P4. IL LABORATORIO NELLA VALUTAZIONE DIAGNOSTICA DEL DIABETE

(prof. Treré)
P4.1 CENNI STORICI SUL DIABETE

Il diabete è una patologia molto antica, descritta le prime volte a partire dal 1600 a.C. in alcuni geroglifici (già
nel papiro di Ebers si trova la descrizione di un bambino probabilmente affetto da diabete), ma considerata
nota solo dal III secolo a.C.
L’etimologia della parola “diabete” deriva dal greco “διαβαίνω” [scorrere attraverso], a causa dei due
sintomi più evidenti a cui la patologia fu associata: elevata assunzione di acqua [polidipsia] ed elevata
produzione di urine [poliuria]. Le principali cure dell’epoca erano diete particolari a base di datteri, ginepro,
lievito di birra, e altre cose totalmente inadeguate, dato che l’eziologia della malattia non era conosciuta.
L’impatto sociale del diabete era importante: i bambini malati, i cui sintomi erano facilmente individuabili
(assunzione elevata di acqua, importante produzione di urine, dimagrimento), venivano considerati spacciati,
privi di alcuna speranza di recupero.
Paul Langerhans, durante la discussione della sua
tesi di laurea nel 1869, individuò alcune “isole” di
cellule nel parenchima pancreatico che differivano
dalla maggior parte delle altre. Del pancreas erano
ben note solo le funzioni esocrine, quindi
inizialmente queste “isole” cellulari non vennero
associate né alla produzione di ormoni, né
tantomeno al diabete. Solo alcuni anni dopo (1889),
i ricercatori Josef Von Mehring e Oscar Minkowsky,
sulla base delle sperimentazioni iniziate da Johann
Conrad Brunner, riuscirono a indurre il diabete in
alcuni cani asportando il pancreas. Capirono quindi
che la componente parenchimatosa individuata da
Langerhans all’interno del pancreas, produceva
secrezioni endocrine che, se assenti, causavano
l’insorgenza del diabete. Una delle prime foto mai scattate: mostra le conseguenze del
diabete indotto da rimozione del pancreas in un cane.
Iniziarono quindi ampie ricerche sperimentali per curare questa patologia: nel 1893 Ferdinando Battistini
iniettò un estratto di pancreas bovino in due giovani pazienti affetti da diabete senza però avere successo,
data l’elevata presenza di enzimi attivi in grado di inattivare l’insulina, derivanti dal pancreas esocrino. A
seguito di questi tentativi si capì la necessità di separare la componente endocrina del pancreas da quella
esocrina, operazione tentata per anni da molti biochimici.
Il chirurgo canadese Frederick G. Banting, di ritorno dal fronte della Prima guerra mondiale a seguito di una
ferita, non trovando impiego negli ospedali, iniziò a lavorare come medico della mutua (analogo dell’attuale
medico di base). Ebbe successivamente un’intuizione geniale a cui dedicò il resto della sua vita: isolare il
pancreas endocrino in vivo, legando il dotto pancreatico e inducendo di conseguenza, una progressiva atrofia
della porzione esocrina. I biochimici del tempo non presero realmente in considerazione l’idea di Banting:
solo a seguito di fortissime pressioni, il biochimico John J.R. Macleod fornì gli strumenti per proseguire le
ricerche, senza però, inizialmente, prenderne parte. Banting e un laureando in medicina di nome Charles Best
iniziarono così a sperimentare questa tecnica di isolamento in vivo su alcuni cani.
La principale incognita per Banting e Best era capire per quanto tempo il dotto pancreatico dovesse rimanere
legato per consentire una sufficiente atrofia della porzione esocrina del pancreas: provando casualmente con
tempi progressivamente crescenti e iniettando gli estratti di pancreas ad altri cani in cui il diabete era stato
indotto, riuscirono, alla novantaduesima cavia, a trovare la formula temporale ideale. A seguito di questo
grande successo, Macleod e un altro biochimico di nome James Collip collaborarono al progetto cercando di
produrre un siero puro e iniettabile a partire da pancreas con componente esocrina atrofizzata.
205
Patologia clinica
Nel 1921 Frederick G. Banting e Charles Best scoprirono l’insulina, vincendo due anni dopo il premio Nobel
per la Fisiologia e la Medicina, insieme a John J.R Macleod e James Collip.
Banting morì durante la Seconda guerra mondiale.
Leonard Thompson fu il primo paziente trattato con “l’insulina di Banting”, nel 1922.
Segue una foto che fu famosissima: la prima bambina malata di diabete che, a seguito del trattamento con
l’insulina di Banting, riuscì a sopravvivere fino all’età adulta e a divenire madre.
P4.2 DIABETE
Il termina diabete oggi viene identificato con due patologie:
• diabete mellito: diffuso, è causato da una ridotta attività biologica dell’insulina; si definisce mellito
perché le urine risultano dolci al gusto;
• diabete insipido: molto più raro, causato da un deficit di ADH; si definisce insipido perché le urine
sono insapori e ipotoniche. Le urine sono “insipide” proprio perché contengono molta acqua (la
poliuria non è conseguenza di glicosuria).
In mancanza di specifiche, quando si parla di diabete ci si riferisce al diabete mellito.
P4.2.1 Diabete insipido

Ne esistono due forme:
• neurogenica o centrale: dovuta a lesioni ipotalamiche o lesioni cerebrali compressive o traumatiche.
L’ADH non viene prodotto à poliuria;
• nefrogenica o periferica: mancata recettività dell’ormone a livello dei recettori del tubulo renale.
L’ormone, quindi, viene prodotto, ma non è efficace à poliuria.
Dal punto di vista laboratoristico le due forme si distinguono dosando l’ADH: se l’ADH è alto, si tratta di un
diabete nefrogenico e viceversa. La neuroipofisi rilascia in circolo due ormoni ricevuti dai nuclei secretori
dell’ipotalamo: l’ossitocina e l’ADH, ormoni con struttura simile che differiscono solo per due amminoacidi:
• l’ossitocina è legata alla sfera sessuale-riproduttiva e favorisce la contrazione della muscolatura
uterina e la funzionalità delle ghiandole mammarie;
206
Patologia clinica
• l’ADH ha come bersaglio le cellule del tubulo renale e ha la funzione di favorire il riassorbimento di
acqua. In caso di deficit, l’acqua viene filtrata dai glomeruli, non viene adeguatamente riassorbita e
viene quindi eliminata con le urine.
P4.2.2 Diabete mellito

Il diabete mellito è caratterizzato da un’aumentata concentrazione di glucosio nel sangue, prodotto da una
carenza assoluta o relativa dell’attività biologica dell’insulina. Questa patologia abbraccia tutti gli aspetti
patologici dell’organismo, anche se da un punto di vista clinico risulta prevalente l’effetto che ha sul
metabolismo glucidico.
L’insulina svolge sempre un’azione anabolizzante nei confronti del metabolismo glucidico, lipidico e proteico:
• stimola l’ingresso di glucosio nelle cellule riducendo la glicemia;
• stimola la glicogenosintesi e inibisce la glicogenolisi;
• stimola la glicolisi e inibisce la gluconeogenesi;
• stimola la sintesi di acidi grassi e trigliceridi e inibisce il catabolismo lipidico;
• riduce la chetogenesi favorendo l’ingresso dell’acetil-CoA nel ciclo di Krebs;
• stimola l’ingresso di aminoacidi nelle cellule (soprattutto muscolari) riducendo l'amminoacidemia;
• facilita l’avvio della formazione di catene peptidiche, stimolando quindi la sintesi proteica, e riduce
la proteolisi;
• favorisce l’ingresso cellulare di potassio e l’uscita di sodio;
• favorisce la sintesi degli acidi nucleici → impatto sulla proliferazione cellulare;
• stimola la crescita dei tessuti esercitando un’azione anabolizzante.
Nonostante l’azione anabolizzante su lipidi, glucidi e proteine svolta dall’insulina, il sintomo principale del
diabete è l’innalzamento della sola glicemia. Questo perché nella regolazione del metabolismo lipidico e
proteico l’insulina ha vari agonisti in grado di bilanciarne la mancanza; il metabolismo glucidico invece non
ha agonisti dell’insulina, ma solo una vasta gamma di molecole antagoniste.
Nel metabolismo glucidico non c’è una contrapposizione equilibrata di ormoni catabolizzanti ed
anabolizzanti: l’insulina è l’unico ormone ipoglicemizzante e ci sono invece 7 ormoni iperglicemizzanti
(glucagone, adrenalina, cortisolo, GH, somatostatina, ACTH, tiroxina).
207
Patologia clinica
P4.2.3 Insulina
L’insulina è un ormone peptidico sintetizzato dalle cellule β pancreatiche ed è costituito da due catene A e
B, rispettivamente di 21 e 30 amminoacidi, unite tra loro da tre ponti disolfuro.
Viene sintetizzata sotto forma di un precursore di 110
aminoacidi, la pre-proinsulina, dotato di una sequenza
amminoterminale di 24 amminoacidi, detta peptide leader o
segnale; nel reticolo endoplasmatico la sequenza segnale viene
rimossa per formare la proinsulina, costituita dalle due catene
A e B unite da un peptide di connessione di 35 amminoacidi,
indispensabile per il corretto ripiegamento dell’insulina.
Dopo la formazione dei ponti disolfuro, la proinsulina viene
traslocata nell’apparato del Golgi dove il peptide di connessione
viene rimosso per taglio proteolitico con perdita di 4 amminoacidi, formando il peptide C, di 31 aminoacidi;
insulina e peptide C vengono quindi immagazzinati nei granuli secretori fino alla liberazione in circolo.
A seguito di appropriati stimoli, tra i quali principalmente l’innalzamento dei livelli di glucosio nel sangue
periferico (che entra nella cellula attraverso GLUT 2), l’insulina e il peptide C vengono rilasciati
equimolarmente dalle cellule β-pancreatiche. In circolo l’insulina viene velocemente catabolizzata dal fegato
e dal rene; la sua emivita è quindi breve, di circa 6 minuti.
L’azione dell’insulina si estrinseca nei tessuti periferici

(principalmente fegato, muscolo e tessuto adiposo) mediante un
recettore specifico costituito da un eterodimero transmembrana
formato da due subunità α e β: la subunità α è extracellulare ed è
preposta al legame con l’insulina, mentre la subunità β è costituita
da una porzione transmembrana e da una citoplasmatica, coinvolta
nella trasduzione del segnale e quindi nelle manifestazioni
metaboliche innescate dal legame.
Relativamente al metabolismo glucidico, l’azione scaturita dal

legame insulina-recettore si traduce nella mobilizzazione di un
recettore chiamato GLUT 4, normalmente contenuto all’interno
della cellula. Quando l’insulina si lega al recettore, il trasportatore
viene traslocato sulla membrana, così permettendo l’ingresso di
glucosio nelle cellule e diminuendo la glicemia.
La secrezione di insulina è caratteristicamente bifasica, con un primo picco precoce dovuto alla liberazione
in circolo dell’insulina preformata e un secondo picco tardivo conseguente alla sintesi di insulina ex novo. Il
secondo picco avviene se necessario ed è derivato dal permanere di valori di glicemia elevati.
Il glucosio presente nel sangue viene filtrato dal glomerulo e, in condizioni di normoglicemia, passa nel tubulo
per poi essere riassorbito a livello tubulare. Essendo il numero di carrier in grado di recuperare il glucosio
limitato, se la glicemia aumenta patologicamente lo zucchero rimane nelle urine, dove determina un richiamo
osmotico portando alla poliuria e successivamente alla polidipsia.
In condizioni normali, dopo un pasto, il trasportatore del glucosio verrà nuovamente captato all’interno della
cellula e al pasto successivo sarà nuovamente esposto sulla membrana. Ciò ovviamente non succede con il
diabete, in cui il trasportatore rimane sempre intracellulare.
208
Patologia clinica
P4.2.4 Epidemiologia
Il diabete è diagnosticato nel 3% della popolazione italiana. A questa quota di diabete diagnosticato si deve
aggiungere una quota, dello stesso ordine di grandezza, di diabete non diagnosticato, rappresentato
esclusivamente dal diabete di tipo 2: ciò significa che l’incidenza del diabete è doppia rispetto ai casi
diagnosticati; quindi, nel nostro paese vi sono non meno di 3.000.000 di soggetti diabetici, solo per la metà
riconosciuti come tali. Nelle diverse aree geografiche, si prevede un diverso incremento del diabete: minore
in Europa e nel Nord America, dove probabilmente è già aumentato in modo significativo, mentre si prevede
più di un raddoppio in Africa e Asia.
Complessivamente, si stima il seguente incremento: 415 milioni nel 2015 à 642 milioni nel 2040.
Questi numeri hanno fatto sì che il diabete abbia assunto una rilevanza socioeconomico-sanitaria pari a
pochissime altre condizioni. Il diabete più frequente (di tipo 2) tende ad incrementare con l’età, quindi
l’invecchiamento impatta sull’aumento della diffusione di questa patologia. Il diabete viene considerato
dall’OMS come la prima
emergenza sanitaria.
[Del 3% di pazienti diabetici,
il 10% soffre di diabete di
tipo 1 ed è in trattamento
insulinico, il restante 90%
soffre di diabete di tipo 2 ed
è in trattamento con
insulina (10%), con
ipoglicemizzanti orali (60%)
o con la sola dieta (30%).
La prevalenza del diabete di
tipo 2 aumenta con l’età: al
di sopra dei 65 anni oltre il
10% della popolazione
italiana risulta affetta da
diabete.]
P4.2.5 Diagnosi
Il presupposto fondamentale per diagnosticare il diabete è la valutazione della glicemia a digiuno (FPG,
ovvero “Fasting Plasma Glucose”):
• normale metabolismo glucidico: sotto i 100-105 mg/dL;
• diabete: sopra i 126 mg/dL. È consigliabile un secondo prelievo perché gli ormoni contro regolatori
dell’insulina possono influenzare il risultato;
• alterata omeostasi glucidica: il paziente ha una FPG tra 105 mg/dL e 126 mg/dL. Sono necessarî
ulteriori approfondimenti (OGTT o 2hrPPG).
Test da carico orale di glucosio

Il principale esame è stato per molti anni il test da carico orale di glucosio (OGTT, oral glucose tolerance test).
Nell’OGTT si esegue un prelievo di sangue periferico a digiuno e si somministrano al paziente 75 g di glucosio.
Si prosegue misurando la glicemia ogni mezz’ora con ulteriori prelievi in modo da poter costruire nell’arco di
tre ore una curva glicemica coi dati raccolti. Il test può anche essere accompagnato dalla misurazione
dell’insulinemia.
209
Patologia clinica
Purtroppo, questo test ha una scarsa complianza, dove per complianza11 si intende il grado di collaborazione
da parte del paziente nel seguire più o meno scrupolosamente le prescrizioni del medico curante.
crescente, per poi restringersi restituendo il volume di sangue accumulato sotto l’effetto di una pressione
sanguigna decrescente.
2-Hours Post-Prandial Glucose

In America si tende quindi a preferire il 2hrPPG (“2-Hours Post-Prandial Glucose”), in cui si misura la glicemia
a digiuno e dopo due ore dal pasto, saltando le fasi intermedie del test precedentemente descritto. Seppure
le tappe intermedie permetterebbero di fare una diagnosi più raffinata, perché si potrebbe valutare il
rapporto che può esserci tra obesità o sovrappeso, intolleranza al glucosio, deficit di insulina dovuti ad altri
motivi ecc., i pazienti sono risultati molto
più complianti al 2hrPPG. In questo caso:
• normale metabolismo glucidico:
sotto i 140 mg/dL;
• diabete: sopra i 200 mg/dL;
• intolleranza al glucosio: il paziente
ha una 2hrPPG tra 140 mg/dL e 200
mg/dL. Per intolleranza si intende
un’alterata capacità di mantenere
un’adeguata omeostasi glucidica.
Questi pazienti sono ad alto rischio
di sviluppo di diabete, quindi oltre
all’adozione di un buono stile di
vita, dovranno sottoporsi al test
ripetutamente nel tempo (ogni 6-12 mesi).
In sintesi, i criterî della diagnosi del diabete sono:

1. Diabete mellito: (riscontro in almeno due occasioni)
a. sintomi di diabete mellito associati al riscontro casuale di valori ematici di glicemia ≥ 200
mg/dL;
b. glicemia a digiuno (FPG: fasting plasma glucose) ≥ 126 mg/dL;
c. 2hrPPG (two-hour post-prandial
plasma glucose) ≥ 200 mg/dL due ore
dopo un carico di 75 g di glucosio.
2. Alterata omeostasi glucidica:
a. glicemia a digiuno tra 110 mg/dL e
125 mg/dL.
3. Intolleranza al glucosio:
a. 2hrPPG tra 140 mg/dL e 200 mg/dL.
4. Soggetto con normale metabolismo
glucidico:
a. glicemia a digiuno < 110 mg/dL;
b. 2hrPPG < 140 mg/dL.
11
Concetto da non confondere con la complianza o capacitanza in fisiologia, ossia la capacità che hanno i vasi sanguigni
di dilatarsi elasticamente sotto l’effetto di una pressione sanguigna
210
Patologia clinica
[La formula di conversione da mg/dL a mmol/L è: mmol/L = (mg/dL x 10) : peso molecolare; che nel caso del
glucosio è 180,095.]
P4.3 CLASSIFICAZIONE DEL DIABETE MELLITO

L’OMS distingue quattro tipi di diabeti:
• diabete di tipo 1 (T1DM);
• diabete di tipo 2 (T2DM);
• diabete gestazionale: legato alla gravidanza;
• diabeti da causa nota: possono essere prevenuti e gestiti, ma sono rarissimi (nella maggior parte dei
casi di diabete non ne si conosce la causa) [meno dello 0,1%]:
o difetti genetici della funzione delle cellule β (MODY ed altri);
o difetti genetici dell’azione insulinica;
o malattie del pancreas esocrino (pancreatiti, traumi, pancreasectomia, neoplasie, fibrosi
cistica, emocromatosi, altre);
o endocrinopatie (acromegalia, sindrome di Cushing, glucagonoma, feocromocitoma,
ipertiroidismo, aldosteronoma, somatostatinoma);
o indotto da farmaci o da sostanze chimiche (vacor, pentamidina, acido nicotinico,
glucocorticoidi, ormone tiroideo, agonisti β-adrenergici, tiazide, fenitoina, interferone α,
altre);
o infezioni (Rubella congenita, Citomegalovirus, altre)
o altre forme non comuni immuno-mediate;
o altre sindromi genetiche talvolta associate al diabete (sindrome di Down, sindrome di
Klinefelter, sindrome di Turner, atassia di Friedreich, corea di Huntington, sindrome di
Lawrence-Moon Beidel, distrofia miotonica, porfiria, sindrome di Prader-Willi, altre).
Per quanto riguarda le prime due classificazioni, sono inappropriate definizioni come “giovanile” e “senile”,
in quanto non esiste una reale distinzione tra età giovanile e senile, o come “insulino-dipendente” e “insulino-
indipendente”, dato che qualsiasi forma di diabete mellito può richiedere una terapia insulinica.
P4.3.1 Diabete di tipo 1 (T1DM)

Il diabete di tipo 1 deriva da una grave mancanza di insulina dovuta alla riduzione della massa globale di
cellule β. I termini “diabete giovanile” e “diabete insulino-dipendente” (IDDM: insulin-dependent diabetes
mellitus) sono imprecisi e fuorvianti e ne viene quindi sconsigliato l’uso.
Patogenesi
Questa patologia insorge soprattutto nei bambini e adolescenti. L’elemento fondamentale di questa forma
di diabete è rappresentato dalla distruzione delle cellule β-insulari. Il meccanismo è autoimmune,
probabilmente scatenato da agenti ambientali in soggetti geneticamente predisposti.
L’importanza dei fattori genetici è documentata dalle seguenti osservazioni:
• i bambini che hanno un parente di primo grado affetto presentano un maggiore rischio di sviluppare
la malattia rispetto ai coetanei che non hanno parenti di primo grado affetti (fenomeno della
aggregazione familiare);
• l’incidenza di concordanza cumulativa in fratelli di pazienti affetti da diabete di tipo 1 è del 10%, cioè
20 volte superiore a quella della popolazione generale della stessa età;
211
Patologia clinica
• l’incidenza di concordanza cumulativa fra gemelli omozigoti è tra il 35 e il 50% (a seconda delle
diverse casistiche), e può arrivare al 70% nei soggetti che hanno entrambi gli alleli del sistema HLA
ad alto rischio di malattia → se la patologia non fosse influenzata anche da fattori ambientali, la
concordanza sarebbe del 100%;
• il diabete di tipo 1 risulta fortemente associato con specifici antigeni di istocompatibilità di classe II
(in particolare HLA-DR3, HLA-DR4 e HLA-DQ2); l’allele HLA-DR2 avrebbe invece un ruolo protettivo.
Fattori ambientali
Tra i fattori ambientali potenzialmente responsabili abbiamo un’infinità di virus, però sappiamo
perfettamente che i pazienti infettati non sviluppano diabete. Tra le infezioni virali che oggi si ritengono
maggiormente associate al diabete è quella da Coxsackie B4 (da ricordare, perché è l’associazione più forte
tra quelle trovate).
Altri fattori potenzialmente responsabili (associazioni non del tutto confermate):
• infezioni batteriche, forse da micobatterî;
• alimenti, forse le proteine del latte vaccino assunte prima del quarto mese di vita (c’è una grande
diatriba a riguardo);
• tossine (?).
Tuttavia, fattori ambientali associati all’insorgenza del diabete sicuramente ci sono, ma non sono ancora stati
identificati.
[L’importanza dei fattori ambientali è documentata dalle seguenti osservazioni:
• i casi di T1DM aumentano nelle popolazioni che migrano verso aree geografiche ad alta incidenza;
• in alcune nazioni quali Polonia, Nuova Zelanda, Estonia e Stati Uniti, nella prima metà degli anni ’80
sono state registrate “epidemie” di T1DM;
• nei mesi invernali si osserva un aumento dell’incidenza della malattia.]
Meccanismi autoimmunitarî
Attraverso esperimenti ed esami autoptici (condotti su bambini che avevano sviluppato diabete di tipo 1) si
è scoperto che, prima della distruzione, le cellule β del pancreas vengono accerchiate da linfociti,
prevalentemente CD8+ e CD4+, e da macrofagi. Per cui sicuramente si tratta di una risposta autoimmune di
tipo cronico cellulo-mediata che ha un’azione distruttiva sulle cellule β pancreatiche: questi pazienti
sviluppano anticorpi contro le cellule β o contro l’insulina. Tuttavia, ad oggi, non conosciamo che cosa scatena
questa reazione autoimmune.
[Sebbene l’esordio del T1DM sia solitamente improvviso, la malattia risulta da un attacco autoimmune delle
cellule β di tipo cronico, presente da anni prima dell’inizio delle manifestazioni cliniche; iperglicemia e chetosi
si determinano quando più del 90% delle cellule β è stato distrutto.
Il ruolo dei meccanismi autoimmunitari è sostenuto da diverse evidenze:
• insulite: l’infiltrato cellulare che si osserva nei modelli animali durante le fasi iniziali del diabete
consiste per lo più di linfociti CD8+ e da un numero variabile di CD4+ e macrofagi; i linfociti CD4+ di
animali malati possono trasmettere la malattia ad animali sani, confermando il ruolo importante
dell’autoimmunità T mediata; inoltre, una infiltrazione linfocitaria è sempre documentabile nei
soggetti morti con diabete di recente insorgenza;
• autoanticorpi circolanti diretti contro le cellule insulari (ICA) e altri autoanticorpi si ritrovano nella
maggior parte dei soggetti con T1DM di recente diagnosi e sono spesso presenti nel periodo di
“prediabete”; inoltre, circa il 10% dei soggetti con diabete T1DM è portatore di altri disordini
autoimmuni organo-specifici quali la malattia di Graves, la malattia di Addison e la tiroidite di
Hashimoto.]
212
Patologia clinica
Caratteristiche cliniche
Il diabete di tipo 1 è fortemente sintomatico, si manifesta nel 95% dei casi prima dei 25 anni e comunque
sempre prima dei 35. Lo zucchero assunto con la dieta viene eliminato con le urine (glicosuria), il che porta,
in un paziente diabetico non trattato, a quella che è conosciuta anche come sindrome delle tre P:
• poliuria → aumento diuresi osmotica provocata dal richiamo osmotico del glucosio nelle urine
(glicosuria), talvolta associata a sintomi di disidratazione;
• polidipsia → sete intensa conseguente alla perdita di acqua ed elettroliti;
• polifagia → aumento dell’appetito, dovuto al fatto che il glucosio introdotto con la dieta non può
essere utilizzato come combustibile; quindi, il soggetto mangia molto, ma dimagrisce. Questo
aumento dell’appetito è conseguente al passaggio da una fase anabolica insulino-dipendente a una
fase catabolica da deficit insulinico.
In mancanza di zucchero vengono utilizzate fonti energetiche alternative:
1. Per primo viene attaccato il tessuto adiposo, con conseguente progressivo calo ponderale: gli acidi
grassi escono dal TA e si portano al fegato dove vanno incontro alla β-ossidazione per produrre
energia.
2. Dalla β-ossidazione degli acidi grassi si produce acetil-CoA che entra nel ciclo di Krebs reagendo con
l’acido ossalacetico. In caso di eccessivo catabolismo lipidico e un’accelerata β-ossidazione si produce
molto Acetil-CoA, che non trova una quantità sufficiente di ossalacetato con cui reagire; per cui si
accumula e dalla condensazione delle molecole di Acetil-CoA si ottengono i corpi chetonici: acido
acetoacetico, β-idrossibutile e acetone. Questi tre acidi determinano acidosi metabolica
(chetoacidosi) – un’alterazione dell’equilibrio acido-base che è la responsabile, insieme a condizioni
intercorrenti come infezioni o stress, del coma chetoacidosico. Prima dell’insulina di Banting, infatti,
i pazienti con diabete di tipo 1 morivano per scompenso dell’acidosi metabolica seguita dal coma.
Oggi i corpi chetonici sono uno strumento diagnostico per identificare lo scompenso metabolico
legato al diabete di tipo 1.
3. Dopo gli acidi grassi, vengono utilizzate come
substrato energetico le proteine provenienti dal
tessuto muscolare, il che comporta debolezza
muscolare.
[Per “luna di miele” si intende quel periodo di remissione

transitoria, che può durare alcune settimane, talora mesi,
in cui c'è una ripresa funzionale delle cellule β del pancreas,
che producono insulina.]
P4.3.2 Diabete di tipo 2 (T2DM)

Il diabete di tipo 2 è una patologia completamente diversa dal diabete di tipo 1. In questo caso le cellule β
pancreatiche non hanno subito nessun danno, ma sono i tessuti periferici che non riescono a recepire
adeguatamente l’effetto dell’insulina. Il risultato finale è lo stesso: l’iperglicemia.
Non si sa esattamente quale sia la causa di questa ridotta ricezione del segnale insulinico: può essere
un’alterazione del recettore per l’insulina o del legame recettore-insulina o dell’insulina stessa; sta di fatto
che nonostante sia prodotta, l’insulina ha una ridotta attività biologica.
Il diabete di tipo 2 è molto più frequente del tipo 1 (90% dei pazienti diabetici) ed è una patologia dell’adulto
(comparsa dopo i 40 anni), caratterizzata da 3 fasi che possiamo monitorare laboratoristicamente
semplicemente dosando l’insulina e la glicemia dopo un carico di glucosio.
213
Patologia clinica
1. La glicemia è normale, ma per mantenerla tale il paziente diabetico deve produrre più insulina. È per
questo motivo che col test da carico di glucosio, valutando l’insulinemia, si riesce a intercettare
questa condizione (si raccomanda di fare il test da carico di glucosio ogni mezz’ora). Si ha glicemia
normale e insulinemia elevata.
2. Aumentano le resistenze periferiche all’insulina; di conseguenza, oltre a un’iperglicemia
postprandiale, l’insulina continua ad aumentare, ma la glicemia non si risolve nei tempi in cui
dovrebbe risolversi dopo un test da carico di glucosio. Si ha insulinemia sempre più elevata e
iperglicemia post-prandiale.
3. Si verifica una sorta di scompenso legato al fatto che le cellule β pancreatiche, forse stressate per
diversi anni nel produrre troppa insulina, non riescono più a tenere il passo. Dunque, in questa fase
anche l’insulinemia si riduce, con conseguente notevole aumento della glicemia. Si ha ridotta
insulinemia e, di conseguenza, iperglicemia a riposo e diabete franco.
Non chiamiamo il diabete di tipo 2 “patologia dell’adulto” o “diabete non insulino- dipendente”, infatti molti
di questi pazienti assumono insulina come terapia; alcuni pazienti possono inoltre presentare i primi sintomi
anche in età giovanile.
Caratteristiche cliniche
L’evoluzione metabolica naturale del diabete di tipo 2, nei pazienti non adeguatamente trattati, prevede il
raggiungimento di valori di iperglicemia così elevati da produrre una poliuria tale che il paziente va incontro
a disidratazione – mancato equilibrio tra le enormi perdite di liquidi, dovuti agli elevatissimi valori di glicemia
raggiunti nella fase finale della malattia, e l’assunzione di liquidi. La disidratazione ha un effetto diretto sulle
cellule del SNC, inducendo coma iperosmolare. Oggi, grazie alle terapie, siamo in grado di scongiurare sia il
coma chetoacidosico (associato al diabete di tipo 1), sia quello iperosmolare, che dunque non rappresentano
più un rischio per il paziente diabetico. Gli elementi di pericolosità oggi associati al diabete sono le
complicanze che si sviluppano a seguito dell’iperglicemia.
[Il coma iperosmolare è caratterizzato da una disidratazione imponente prodotta da una diuresi eccessiva
non controbilanciata da un apporto idrico adeguato. Clinicamente si manifesta con iperglicemia gravissima
(anche > 1000 mg/dL), iperosmolarità, ipovolemia e ipernatriemia, insieme a segni di interessamento del
sistema nervoso centrale, che possono andare dall’obnubilamento del sensorio fino al torpore e al coma: sono
spesso presenti malattie concomitanti di vario genere e il coma può essere precipitato dalla somministrazione
di farmaci quali diuretici, corticosteroidi e fenitoina.]
P4.3.3 LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults)

In questo tipo di diabete, considerato il quinto tipo (ma potrebbe rientrare nel diabete di tipo 112), la
distruzione delle cellule β è molto più lenta, per cui si manifesta solo nell’adulto (oltre i 25 anni). Questi
soggetti sono sempre stati identificati come pazienti con diabete di tipo 2, perché la patologia si sviluppa
nell’adulto e per l’assenza di chetoacidosi; tuttavia, non presentano le caratteristiche del paziente diabetico:
non sono obesi e non presentano familiarità. Dunque, in realtà, si tratta di pazienti con diabete di tipo 1
latente, che si manifesta più tardi, poiché il meccanismo patogenetico è lo stesso. Sono positivi agli auto-
anticorpi anti-GAD65 e sono caratterizzati da bassi livelli di insulina (ha bisogno di un supporto di insulina
significativo) e bassi valori di peptide C.
12
Questo tipo di diabete è, infatti, chiamato diabete di tipo 1 lento oppure diabete di tipo 1.5, poiché le sue
caratteristiche sono una via di mezzo tra i due tipi principali di diabete.
214
Patologia clinica
P4.3.4 Diabete gestazionale

Il quarto e ultimo tipo di diabete è il diabete gestazionale,
di rilevanza emergente: colpisce il 7% delle donne in
gravidanza. Non se ne conoscono le cause; probabilmente
sono legate alle variazioni endocrine che compaiono
durante la gravidanza, ma non si sa quale sia esattamente
l’ormone che in qualche modo possa modificare il
metabolismo glucidico. Queste donne sviluppano il
diabete dopo qualche mese dall’inizio della gravidanza, il
che comporta una condizione di iperglicemia. [Il diabete si
risolve non molto tempo dopo il parto, ma è probabile che
si ripresenti a una successiva gravidanza; inoltre, dal 30 al
60% delle donne sviluppa un diabete di tipo 2 nei 10-15 anni successivi]. L’elevata concentrazione di zuccheri
viene trasmessa attraverso la placenta e raggiunge il feto che, dopo una certa fase di sviluppo, è in grado di
produrre insulina. Il feto, dunque, si sviluppa sotto un bombardamento di insulina endogena che ha un
effetto anabolizzante, motivo per cui tutti i neonati nati da madri con diabete gestazionale sono sovrappeso
(feto macrosomico). Questo non solo costituisce un rischio per la gravidanza, ma i neonati sovrappeso sono
sottoposti a un maggiore rischio di sviluppare un diabete di tipo 2 in età adulta.
Test di screening
È importante, quindi, sia per la madre che per il feto, diagnosticare precocemente e trattare l’iperglicemia
durante la gravidanza. Il test di screening deve essere eseguito tra la 24ª e la 28ª settimana di gestazione,
intervallo in cui si verifica il picco di incidenza di questa condizione.
Si somministrano 50 g di glucosio alla futura mamma e si osservano i risultati entro un’ora:

• se la glicemia non supera i 140 mg/dL, la donna non ha sviluppato il diabete;
• se la glicemia supera i 140 mg/dL, è
necessario procedere con un test
diagnostico: si somministrano 100 g di
glucosio e se al primo, al secondo, al
terzo prelievo i valori di glicemia
superano quelli riportati in tabella,
allora è diagnosticato il diabete in
gravidanza e trattato per evitare le
complicanze soprattutto sul feto.
Questa donna sicuramente svilupperà il
diabete gestazionale anche durante le
gravidanze successive e, allo stesso
tempo, avrà un maggiore rischio di sviluppare un diabete di tipo 2 dopo la gravidanza. Per questi
motivi è importante un attento monitoraggio sia durante che dopo la gravidanza.
P4.3.5 Perché il diabete è un’emergenza sanitaria?

Ad oggi, il diabete è un’emergenza sociosanitaria per via delle sue complicanze, per l’impatto che queste
hanno a livello sanitario, ma anche socioeconomico. Per complicanze s’intendono i due tipi di coma legati al
diabete di tipo 1 e 2, ma i danni vascolari che i pazienti diabetici sviluppano nel tempo. Si possono distinguere
due macrogruppi di condizioni vascolari:
215
Patologia clinica
• Microangiopatia diabetica → danno sistemico a carico dei piccoli vasi conseguente a iperglicemia
persistente, la quale determina un ispessimento della membrana basale che modifica gli scambî tra
il sangue e i tessuti. La localizzazione più frequente è a livello della retina (retinopatia diabetica) e ciò
ha determinato in passato un’elevata percentuale di cecità nei pazienti diabetici. Potenzialmente
tutti i capillari possono essere colpiti, ma quelli più vulnerabili sono, oltre a quelli della retina, i
capillari del sistema nervoso e i capillari renali con conseguente neuropatia diabetica e nefropatia
diabetica (responsabile di insufficienza renale).
• Macroangiopatia diabetica → interessa i grandi vasi ed è alla base dell’aterosclerosi. I pazienti con
elevata glicemia tenderanno ad alterare le LDL circolanti che, così modificate, sono in grado di
innescare il processo aterosclerotico. In questi pazienti, l’aterosclerosi si sviluppa più facilmente e
crea danni importanti a livello cerebrovascolare, a livello delle arterie coronarie e dei vasi periferici,
con una serie di conseguenze rilevanti (malattia cerebrovascolare, coronopatia e vasculopatia
periferica).
Tutte queste complicanze associate al diabete
sicuramente impattano in maniera significativa
sulla salute e sulla mortalità del paziente
diabetico, ma anche sulla sfera sanitaria.
[L’aspettativa di vita nei cinquantenni con il
diabete diminuisce di 7,5 anni negli uomini e 8,2
nelle donne]. L’impatto sanitario è, infatti,
enorme, visto l’elevatissimo numero di pazienti
diabetici, tanto che si stanno facendo i conti della
sostenibilità dell’ulteriore aumento del numero
di pazienti nei prossimi anni.
P4.4 INDAGINI DI LABORATORIO
P4.4.1 Indagini di laboratorio per la diagnosi di diabete

Le indagini di laboratorio sono fondamentali nel paziente diabetico, innanzitutto per la diagnosi, e consistono
in:
• Glicemia a digiuno e 2 ore dopo il pasto (2hrPPG) [analizzate precedentemente] → costituisce il
punto di partenza per la diagnosi di diabete. Può essere svolto anche dal paziente stesso ogni giorno
tramite “digitopuntura”, per mantenere monitorata la glicemia ed eventualmente modificare la
terapia.
• Glicosuria → importante per la “diagnosi occasionale” (non motivata) di diabete. Essendo il diabete
di tipo 2 inizialmente asintomatico, di conseguenza difficile da diagnosticare, la valutazione del
glucosio è entrata nell’esame delle urine di routine. Dunque, la glicosuria non è un fondamento per
la diagnosi di diabete – per diagnosticare il diabete bisogna valutare la glicemia, ma viene sfruttato
il fatto che il paziente fa un esame delle urine per qualsiasi motivo (viene ospedalizzato o decide di
fare una propria valutazione) per valutare l’eventuale presenza di zucchero nelle urine.
• Insulinemia basale e 2 ore dopo il pasto (2hrPPG) → utile per valutare in che fase del diabete di tipo
2 si trova il paziente (variazioni della curva insulinica nelle tre fasi del T2DM).
216
Patologia clinica
• Chetonemia e chetonuria → sono caratteristiche del diabete di tipo 1: se nel sangue periferico o
nelle urine sono presenti corpi chetonici, vuol dire che la patologia è già in una fase piuttosto
avanzata (accelerato catabolismo dei lipidi).
• Ricerca di auto-anticorpi specifici:
o anti-cellule pancreatiche (ICA: Islet Cell Antibodies);
o anti-insulina (IAA: Insulin Auto Antibodies);
o anti-acido glutammico decarbossilasi (GADA: Glutamic Acid Decarboxylases Autoantibodies,
o anti-GAD65);
o anti-tirosinfosfatasi (IA2);
o anti-ZnT8 → ZnT8 è una proteina di membrana presente nei granuli secretori contenenti
insulina all’interno delle cellule β pancreatiche. Come gli altri bersagli elencati, è un target
della risposta anticorpale che caratterizza il diabete di tipo 1.
N.B. Da un lato alcuni pazienti con diabete di tipo 1 non hanno gli anticorpi; dall’altro lato,
ancora più frequentemente, pazienti che hanno altre malattie autoimmuni presentano gli
stessi auto-anticorpi senza avere il diabete. Dunque, è bene conoscere questi indicatori
diagnostici, ma è importante tenere a mente che la loro sensibilità e specificità diagnostica
non è così elevata da poter costituire uno strumento diagnostico certo per il diabete.
• Tipizzazione per gli antigeni HLA → vi sono degli alleli associati al diabete di tipo 1: ne esiste uno
solo protettivo, mentre quelli che conosciamo maggiormente sono favorenti il diabete.
• Diagnosi molecolare delle forme genetiche → utiizzato nelle pochissime forme genetiche
conosciute, si tratta di una minima percentuale di pazienti che hanno un diabete da causa nota.
N.B. I più importanti indicatori diagnostici sono i primi due, utilizzati nella pratica clinica.
P4.4.2 Indagini di laboratorio per il monitoraggio del paziente diabetico

Oltre che per fini diagnostici, le indagini di laboratorio sono fondamentali anche per il monitoraggio del
paziente diabetico, cui sarà sottoposto per il resto della vita, per valutare l’evoluzione della malattia. Inoltre,
è molto importante conoscere i livelli di glicemia ogniqualvolta il paziente debba autosomministrarsi
l’insulina: esistono device sempre più raffinati che consentono al paziente di automonitorare la propria
glicemia. Possiamo definirlo un esame di laboratorio che è uscito dal laboratorio per permettere al paziente
di gestirsi autonomamente, in accordo col medico sulla dose di insulina da assumere.
Indagini di laboratorio per il monitoraggio del diabete:
• Glicemia/glicosuria.
• Insulinemia à nei pazienti con diabete di tipo 2 ha un andamento cronologicamente associato
all’evoluzione della malattia: molto alto nella fase iniziale, un plateau nella fase intermedia, cui segue
una decrescita nella fase finale.
• Peptide C à utilizzato per la determinazione dell’insulinemia endogena nei pazienti in trattamento
con insulina.
• Emoglobina glicata (HbA1c) à il più importante per il monitoraggio dei pazienti diabetici. Infatti,
per capire se il paziente si sta autogestendo in maniera corretta (complianza del paziente), la glicemia
a digiuno è un valore indicativo solo delle ultime 24 h; invece, molto più significativo è il valore dell’Hb
glicata. L’emoglobina è una molecola con emivita di 120 giorni presente all’interno dei globuli rossi,
i quali sono talmente dipendenti dallo zucchero, che possono trasportarlo al loro interno
indipendentemente dalla presenza del recettore GLUT4 (presentano il recettore ubiquitario GLUT1).
Questa proprietà è giustificata dall’assenza dei mitocondrî, che impedisce loro di compiere la
respirazione cellulare; di conseguenza producono energia solo attraverso la glicolisi anaerobia che,
essendo un processo biochimico molto dispendioso, rende indispensabile l’ingresso libero di
217
Patologia clinica
glucosio. Quando il glucosio è molto concentrato nel sangue periferico entra all’interno degli
eritrociti in grandi quantità e lega l’emoglobina.
N.B.: In qualche testo, ma anche in qualche esame di laboratorio, è possibile trovare il termine
emoglobina glicosilata anziché glicata, ma non è del tutto corretto – la glicosilazione è una reazione
che prevede l’intervento di un enzima e non è questo il caso. Il vantaggio di questo esame è la
possibilità di valutare qual è stata la glicemia media degli ultimi 30-40 giorni (tecnicamente gli ultimi
60 giorni, la metà di 120 giorni che è l’emivita dell’Hb).
• Indici di funzionalità renale à non è utilizzato per monitorare il metabolismo glucidico, ma per
valutare possibili complicanze come nefropatie o glomerulopatie. Gli indici di funzionalità renale
sono:
o microalbuminuria;
o BUN (blood urea nitrogen);
o creatininemia.
• Assetto lipidico (colesterolo totale e frazionato, trigliceridi) à è un altro fattore di rischio importante
da monitorare.
Albumina glicata
Tuttavia, in alcuni pazienti l’indicatore dell’emoglobina glicata può essere mal interpretato, per esempio nei
pazienti anemici. Per cui quando c’è un’alterazione qualitativa e quantitativa dell’Hb, prevalentemente nelle
malattie ematologiche, essendo questo parametro inattendibile, si ricorre all’albumina glicata. L’albumina è
una proteina plasmatica con un’emivita di 12-20 giorni, anch’essa si lega agli zuccheri circolanti quando questi
sono molto concentrati.
Il valore dell’albumina glicata si utilizza solo in alternativa all’Hb glicata nei pazienti con emopatie legate ai
globuli rossi perché la sua capacità retroattiva è molto minore (15- 20 giorni di emivita a fronte dei 120
dell’Hb). È possibile trovare anche il termine generale fruttosammine che sta a indicare un pool di proteine
plasmatiche, cui fa parte anche l’albumina, che legano il glucosio circolante.
[I dettagli biochimici dell’Hb glicata sono forniti solo

per un eventuale approfondimento personale. Le slide
più importanti sono: il planetario che rappresenta
come ci aspettiamo che aumenterà nel mondo
l’incidenza del diabete e gli obiettivi del trattamento
del paziente diabetico, di cui è importante ricordare i
valori.]
P4.4.3 Obiettivi nel trattamento del paziente diabetico

Per ridurre in maniera significativa lo sviluppo delle complicanze nel diabete, che non possono comunque
essere completamente eliminate, ci dobbiamo adoperare perché i pazienti diabetici mantengano due
standard di laboratorio, da cui dipende l’incidenza delle complicanze.
• glicemia a digiuno < 120 mg/dL;
• HbA1c < 7%
Questi sono gli obiettivi del trattamento del paziente diabetico condivisi dall’OMS.
218
Patologia clinica
P4.4.4 Test di screening per il diabete

Per far fronte a questa emergenza sociosanitaria, oltre al trattamento dei pazienti diabetici, è molto
importante anche la prevenzione. L'introduzione di uno
screening per la diagnosi di diabete di tipo 2 in soggetti
asintomatici viene fortemente incoraggiato dalle seguenti
considerazioni:
• il 50% dei pazienti con diabete sono inconsapevoli
della loro malattia. Non hanno valutato la glicemia
e hanno forse sottovalutato la glicosuria, ma sono
affetti da diabete e non si stanno curando;
• studî epidemiologici suggeriscono che,
relativamente al diabete di tipo 2, l’intervallo tra
insorgenza e diagnosi della malattia potrebbe
essere intorno ai 10 anni. Questo significa che per
circa 10 anni un paziente diabetico non trattato
rischia di andare incontro a complicanze;
• il 50% dei pazienti con diabete di tipo 2 presenta,
già al momento della diagnosi, una o più
complicanze specifiche del diabete mellito.
l costo di questo screening sarebbe bassissimo rispetto ad
altri test di screening come mammografia, Pap test, sangue
occulto nelle feci o altro. Quelli elencati sono tre buoni
motivi per introdurre il test di screening a minor costo: la glicemia a digiuno, effettuabile in ospedale
mediante un prelievo di sangue periferico. Il suggerimento è di farlo ogni 3 anni nei soggetti di età superiore
ai 45 anni, in questo modo il gap medio tra insorgenza e diagnosi della malattia da 10 anni si ridurrebbe
mediamente a un anno e mezzo e comunque a un massimo di 3 anni. Questo permetterebbe di diagnosticare
precocemente il diabete così da ridurre non solo il rischio di sviluppare complicanze, ma anche l’impatto
economico sul sistema sanitario nazionale.
Fattori di rischio per il diabete di tipo 2

[Da diapositive]
• Familiarità per il diabete (parenti di primo grado affetti da diabete mellito di tipo 2);
• obesità: IBW (ideal body weight) > 120% o MBI (body mass index) > 27 kg/m2;
• appartenenza a popolazioni a rischio: afroamericani, ispano-americani, americani autoctoni,
americani-asiatici, abitanti delle isole del Pacifico;
• precedente riscontro di alterata tolleranza al glucosio o alterata glicemia a digiuno;
• madri di feti macrosomici (con peso > 4,032 kg) o con diabete gestazionale;
• ipertensione (PA > 140/90);
• colesterolo HDL < 35 mg/dL e/o trigliceridi > 250 mg/dL.
219
Patologia clinica
P5. IL LABORATORIO NELLA VALUTAZIONE DELLE ALTERAZIONI

DELL’EQUILIBRIO ACIDO-BASE
(prof. Treré)
P5.1 GLI IONI H+ E IL pH

L’equilibrio acido-base è tutto incentrato sugli ioni
H+.
Una delle loro caratteristiche principali è quella di
avere una bassissima concentrazione, migliaia di
volte inferiore rispetto a quella degli altri ioni più
importanti per il nostro organismo. A fronte di
questa bassa concentrazione, lo ione H+ ha
tuttavia un’altissima reattività. Per controllare
quest’altissima reattività ci sono nel nostro
organismo una serie di complessi sistemi atti a
mantenere costante la concentrazione degli ioni
H+: essa deve infatti rimanere entro un
ristrettissimo range proprio a causa dell’elevata
reattività.
Infatti [H+] è compresa tra 35 e 45 nmol/L: se si calcola la differenza tra le molarità degli altri ioni risulta
attorno a 106. Questa sua bassa concentrazione è spiegata dalla sua alta reattività ed è fondamentale che
essa rimanga costante.
Proprio per la sua bassa concentrazione, la sua presenza è espressa con la formula del pH:
pH = –log10 [H+] moli/L
In pH la lettera “p” sta per “logaritmo negativo in base 10” e “H” per “concentrazione degli ioni H+ espressa
in moli/L”.
Questa formula è stata introdotta perché l’espressione in moli/L comporta un elevato numero di zeri dopo
la virgola, quindi, per semplicità e praticità di calcolo è stata adottata la formula del pH.
Il professore esprime la sua opinione contraria riguardo questa convenzione: la formula del pH
comporterebbe semplicità di calcolo perché permette di avere un numero adimensionale e con solo due cifre
decimali. Tuttavia, la definizione stessa del logaritmo comporta delle complessità: “si dice logaritmo in base
A di un numero B l’esponente da dare ad A per ottenere B, con B che viene detto argomento del logaritmo”,
ad esempio il logaritmo in base 3 di 81 è 4 in quanto 4 è l’esponente da dare a 3 per ottenere 81. Questa non
è una semplificazione immediata. Vanno fatte inoltre due considerazioni:
1) utilizzando il pH, si sta valutando un parametro diverso rispetto alla concentrazione di ioni H+: quando
gli ioni H+ aumentano, il pH si riduce; quando gli ioni H+ diminuiscono, il pH aumenta. Esprimere una
grandezza in modo inverso alla quantità che si sta considerando non è d’aiuto;
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Patologia clinica
2) l’utilizzo della scala logaritmica impone che le

differenze in alto alla scala siano molto differenti
dalle differenze in basso alla scala: non c’è
proporzionalità tra la variazione di pH e la
variazione di concentrazione di ioni H+ (in pratica,
la concentrazione di ioni H+ raddoppia per ogni
riduzione dei valori di pH di 0,3) → ad esempio,
guardando in alto alla scala, a un pH di 8,00
corrisponde una concentrazione di 10 e a un pH di
7,90 corrisponde una concentrazione di 13,
mentre, guardando in basso alla scala, a un pH di
7,00 corrisponde una concentrazione di 100 e a un pH di 6,90 una concentrazione di 125.
La stessa variazione di pH non corrisponde alla stessa variazione di concentrazione scendendo lungo
la scala logaritmica: chiaramente anche questo rappresenta uno svantaggio.
La speranza è che la formula del pH venga abbandonata e venga adottata come unità di misura per la
concentrazione degli ioni H+ in nmol/L (d’altronde in laboratorio tutte le concentrazioni ioniche vengono
espresse in frazioni di moli su frazioni di litri e anche le concentrazioni di alcuni ormoni vengono già espresse
in questo modo, ovvero riferendosi al sistema internazionale).
Dunque, la scala del pH è una scala inversa, non proporzionale e adimensionale.
P5.1.1 L’omeostasi del pH

La concentrazione fisiologica di ioni H+ (misurata considerando il sangue arterioso), corrispondente a
0,00000004 moli/L, viene pertanto espressa con un valore di pH di 7,4, e le due concentrazioni limite
compatibili con la sopravvivenza sono espresse con valori di pH, rispettivamente, di 6,8 e 7,8.
È molto importante che il pH sia costante per tre motivi principali:

• l’attività enzimatica dipende prevalentemente dalla concentrazione di ioni H+ (dipende anche da altri
fattori come la temperatura, ma il pH è molto più
importante). Infatti, la maggior parte degli enzimi
necessarî ai processi vitali ha una cinetica di attivazione
con massima attività a pH 7,4; essa diminuisce
progressivamente col variare del pH verso l’alto o verso
il basso, fino ad azzerarsi completamente ai limiti
estremi di 6,8 e 7,8 (a questi valori gli enzimi non
funzionano più e le cellule muoiono);
• l’equilibrio acido-base è gestito da sistemi tampone, che sono costituiti da una molecola che
acquisisce protoni e da una molecola che cede protoni; quando gli ioni H+ aumentano, essi vengono
legati dalla molecola che li acquisisce, quando diminuiscono vengono invece rilasciati dalla molecola
che li cede. In questo modo viene regolata la quota di ioni H+ liberi nel sangue periferico. Però i
sistemi tampone hanno anche altre funzioni (ad esempio, nel sistema tampone proteine/proteinati,
in cui le proteine non hanno come unica funzione la regolazione del pH, anzi hanno altre funzioni
molto più importanti), quindi una variazione importante del pH compromette una delle due
componenti del sistema tampone e di conseguenza compromette anche tutte le altre funzioni che
essa ha nel nostro organismo;
• nel nostro organismo vi è la necessità di mantenere lo stesso numero di cariche da una parte e
dall’altra di un certo compartimento: se la concentrazione di ioni H+ si modifica, si modifica il numero
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di cariche positive da quel lato del compartimento, il che impatterà sul movimento di altre cariche
positive (come il calcio, ma soprattutto il potassio) e si creerà una diversa concentrazione di esse da
un lato e dall’altro del compartimento. Quindi il pH influenza i flussi transmembrana del potassio e
del calcio modificando la regolazione dell’attività cardiaca e neuromuscolare.
P5.2 LA REGOLAZIONE DELL’EQUILIBRO ACIDO-BASE

La trattazione di tali meccanismi è un argomento molto complesso, pertanto verrà suddiviso in tre parti: è
chiaro che questa operazione viene fatta per garantire una maggiore chiarezza, ma è importante sottolineare
che quando si attua questa schematizzazione si è inevitabilmente imprecisi, poiché i tre meccanismi non sono
separati, ma coordinati e interdipendenti. Bisogna quindi fare lo sforzo, una volta capito il funzionamento di
ogni meccanismo, di integrare tra loro tutte e tre le parti.
I tre sistemi che regolano l’equilibrio acido-base sono tradizionalmente distinti in:
• sistemi ematici (sistemi tampone);
• sistema polmonare;
• sistema renale.
Dal punto di vista clinico, è importante considerare i tempi di azione di questi sistemi, poiché non si attivano
con la stessa velocità:
• i sistemi tampone sono immediati, si attivano in pochi secondi e arrivano al massimo della loro
efficienza entro la prima ora;
• il sistema polmonare ci mette diversi minuti ad attivarsi e raggiunge la sua massima efficacia nell’arco
della giornata, entro le 24 ore;
• il sistema renale è il più lento, impiega delle ore per attivarsi e raggiunge la sua massima efficacia in
3-4 giorni.
Siamo quindi di fronte a una cronologia di attivazione molto differenziata, che va tenuta in conto a livello
clinico e laboratoristico.
P5.2.1 Sistemi ematici (sistemi tampone)

Un sistema tampone è costituito da due componenti: una che può acquisire ioni H+ e una che può cedere ioni
H+ e in questo modo ne mantiene costante la concentrazione nei fluidi biologici (si fa riferimento al sangue,
ma è chiaro che la regolazione a livello ematico si riflette su tutti i fluidi corporei). Tale acquisizione/cessione
avviene in modo istantaneo, per cui i sistemi tampone si attivano immediatamente.
Le soluzioni tampone più efficaci possono essere di due tipologie:
• costituite da un acido debole e dal suo sale con una base forte;
• costituite da una base debole e dal suo sale con un acido forte.
Entrambe hanno la stessa potenza, ma nel nostro organismo prevalgono quelle costituite da un acido debole
e il suo sale con una base forte (per cui verrà descritta solo questa tipologia). In questa situazione, l’acido
debole cede ioni H+ mentre la base forte li acquisisce, quindi a seconda delle variazioni di [H+] si attiverà una
specie o l’altra per neutralizzare tali variazioni.
I sistemi tampone vengono tradizionalmente divisi in due gruppi:
1) sistemi chiusi (esauribili), meno importanti. In questo caso quando o l’acido o la base sono
quantitativamente esauriti, il sistema tampone smette di funzionare. Fanno parte di questo gruppo
i seguenti sistemi tampone: H-proteina/Na-proteina, emoglobina ridotta/emoglobina ossigenata,
fosfato bisodico/fosfato monosodico, fosfato monopotassico/fosfato bipotassico.
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2) sistemi aperti (rigenerabili): di questo gruppo fa parte solo un sistema, il sistema bicarbonato/acido
carbonico, ma è il più importante che abbiamo per mantenere costante il pH. Esso ha la caratteristica
di essere rigenerabile, ovvero la base e l’acido possono essere rigenerati oppure eliminati in base alle
esigenze, poiché vengono scambiati con l’ambiente esterno.
Sistema bicarbonato/acido carbonico
[𝑯𝟐 𝑶] + [𝑪𝑶𝟐 ] ↔ [𝑯𝟐 𝑪𝑶𝟑 ] ↔ [𝑯# ] + [𝑯𝑪𝑶$

𝟑]
Ci sono tre motivazioni per cui questo sistema tampone sovrasta tutti gli altri descritti:
1) è quantitativamente più rappresentato.
Infatti, il 65% di tutti i sistemi tampone sono
costituiti da bicarbonato/acido carbonico; il
sistema proteine/proteinati è invece il 35%,
tutti gli altri meno dell’1%;
2) è ubiquitario, ovvero si trova in quasi tutti i tessuti e compartimenti del nostro organismo, a
differenza degli altri sistemi tampone, che sono più o meno compartimentalizzati. Il sistema
bicarbonato/acido carbonico è invece in grado di funzionare in tutti i fluidi biologici;
3) può rigenerarsi scambiando le sue componenti

con l’esterno [importante]. In particolare,
osservando la reazione, si può vedere che la 𝐶𝑂!
con l’𝐻! 𝑂 sono in equilibrio con l’acido carbonico
(𝐻! 𝐶𝑂" , la componente acida del sistema
tampone) che a sua volta si scompone in H+ e
𝐻𝐶𝑂"# (ione bicarbonato, la componente basica
del sistema tampone). La componente acida si
rigenera grazie alla ventilazione polmonare: noi
possiamo emettere all’esterno più o meno 𝐶𝑂! rispettivamente ventilando di più o ventilando di
meno. In questo modo possiamo modificare la parte sinistra dell’equazione in modo da spostare
l’equilibrio secondo le necessità. Il bicarbonato viene invece scambiato con l’esterno grazie alla
funzionalità renale: regolando l’escrezione urinaria di bicarbonato, è possibile modificare l’equilibrio
dell’equazione secondo le esigenze di questo sistema tampone. Questo fa sì che il sistema sia aperto,
cioè se una componente si esaurisce, può essere rigenerata, oppure se una componente è in eccesso,
può essere eliminata. Non esiste un altro sistema tampone che abbia questa caratteristica.
223
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Quindi il sistema polmonare, il sistema ematico e il sistema renale sono strettamente connessi e
interdipendenti nel loro ruolo di mantenimento del pH al valore di 7,4.
Equazione di Henderson-Hasselbach
I rapporti quantitativi tra le diverse componenti del sistema tampone sono regolati da questa equazione.
Essa stabilisce che, quando un sistema tampone è costituito da un acido debole e una base forte, come nel
caso di bicarbonato/acido carbonico (ma come anche la quasi totalità dei sistemi tampone del nostro
organismo), il pH corrisponde al logaritmo negativo della costante di dissociazione dell’acido costituente il
sistema tampone, sommato al logaritmo del rapporto tra la componente dissociata e la componente
indissociata:
[𝑨# ]
𝒑𝑯 = 𝒑𝑲 + 𝒍𝒐𝒈
[𝑨𝑯]
Tale equazione, riportata sul sistema bicarbonato (componente dissociata)/acido carbonico (componente
indissociata), diventa:
[𝑯𝑪𝑶# 𝟑]
𝒑𝑯 = 𝒑𝑲 + 𝒍𝒐𝒈
[𝑯𝟐 𝑪𝑶𝟑 ]
È quindi il rapporto tra bicarbonato e acido carbonico presente nel sangue periferico a determinare la
concentrazione degli ioni H+ (e di conseguenza il pH del sangue e dei fluidi biologici).
Per quanto riguarda la storia di questa equazione, essa fu inizialmente formulata da Henderson, che era un
biochimico, nel 1908, con un’espressione lievemente diversa: la concentrazione degli ioni H+ era uguale a K
(la costante di dissociazione) moltiplicata per il rapporto tra la concentrazione di acido carbonico e la
concentrazione di ione bicarbonato. Era quindi una formula molto più semplice.
Intervenne poi Hasselbach, che invece era un medico, proponendo di aggiungere il logaritmo negativo in
base 10 all’equazione per ottenere dei numeri più semplici, con meno zeri, arrivando nel 1916 a quella che è
la formulazione attuale dell’equazione. Questa formulazione permette sì di avere come risultato numeri con
meno zeri dopo la virgola, ma complica molto di più i calcoli.
Il professore sostiene che se si ritornasse all’equazione di Henderson, si faciliterebbe sia il lavoro di coloro
che stanno in laboratorio e sia il nostro approccio all’argomento.
È possibile ora ricavare il valore del normale pH del nostro sangue:

• in primo luogo, si scompone l’acido carbonico in anidride carbonica e acqua; questo ci permette
anche di sostituire K con K’;
• successivamente, si utilizza la legge di Henry, secondo la quale la quantità di un gas fisicamente
disciolto in una soluzione è direttamente proporzionale alla sua pressione parziale; applicando
questa legge alla CO2, si può sostituire la sua concentrazione con la sua costante di solubilità α (che
a 37°C è uguale a 0,031) moltiplicata per la pressione parziale della CO2;
• infine, si sostituiscono nell’equazione i valori fisiologici normali: K’ = 6,1; [𝐻𝐶𝑂"# ] = 24 mEq/L;
α = 0,031; PaCO2 = 40 mmHg.
• in questo modo si ottiene che: pH = 6,1 + log (20) = 6,1 + 1,3 = 7,4
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Patologia clinica
In questo modo, partendo dalla teoria

(cioè l’equazione di Henderson e
Hasselbach), si arriva alla pratica (cioè i
valori che si riscontrano sui pazienti).
Intuitivamente, il pH vale 7,4 quando il
bicarbonato ha una concentrazione di 24
mEq/L e la CO2 una pressione parziale di
40 mmHg. In realtà, ciò che davvero è
importante è il rapporto tra la
concentrazione di bicarbonato e la
pressione parziale dell’anidride
carbonica: il pH vale 7,4 ogniqualvolta il
bicarbonato e l’anidride carbonica siano
in un rapporto di 20:1, in modo che
l’argomento del logaritmo sia sempre 20 così da garantire un pH di 7,4. Quindi non è necessario che il
numeratore e il denominatore siano sempre gli stessi; chiaramente in condizioni fisiologiche i valori saranno
sempre quelli (24 mEq/L e 40 mmHg), ma in condizioni non fisiologiche o parafisiologiche o patologiche per
garantire un pH di 7,4 è necessario e sufficiente che il rapporto tra numeratore e denominatore sia sempre
20:1, indipendentemente dal valore che assumono.
[𝑯𝑪𝑶#𝟑] [𝑯𝑪𝑶# 𝟑] 𝟐𝟎
7,4 = 6,1 + 𝑙𝑜𝑔 = 6,1 + 𝑙𝑜𝑔 = 6,1 + 𝑙𝑜𝑔
[𝑯𝟐 𝑪𝑶𝟑 ] 𝛼 𝑃𝑎𝑪𝑶𝟐 𝟏
Ogni rapporto di 20:1 tra bicarbonato e anidride carbonica garantisce un pH di 7,4: quando aumenta il
numeratore, i meccanismi di compenso agiranno in modo tale da aumentare della giusta proporzione il
denominatore; quando aumenta il denominatore, dovrà aumentare il numeratore e così via. I meccanismi
che regolano l’equilibrio acido-base cercano sempre di spostare i valori in modo tale da mantenere il pH a
7,4; quando questi meccanismi per varî motivi non riescono più a mantenere quel valore, il pH aumenta o
diminuisce e il nostro organismo va in alcalosi o acidosi.
Questo è quindi un unico sistema integrato, che ha come centro il sistema tampone, che però da solo non
riuscirebbe a garantire quella stabilità che invece garantisce grazie alla possibilità di interagire e scambiare
col polmone e col rene i componenti che stanno al numeratore e al denominatore di questa equazione.
P5.2.2 Sistema polmonare

È un meccanismo molto semplice da comprendere: tramite la ventilazione polmonare viene garantito lo
scambio della CO2 con l’esterno:
• se si iperventila, la CO2 diminuisce;
• se si ipoventila, la CO2 aumenta.
Il compenso respiratorio subentra nelle alterazioni metaboliche, sia per contrastare l’alcalosi tramite
ipoventilazione sia, più marcatamente, tramite iperventilazione per compensare l’acidosi.
L’acidosi stimola la ventilazione mentre l’alcalosi la reprime.
Il limite di questo sistema è che la ventilazione non è volta unicamente al mantenimento del pH: il sistema
respiratorio ha anche altre funzioni, quindi la capacità del compenso polmonare sarà limitata. In altre parole,
il compenso polmonare è un meccanismo che interviene molto velocemente, ma non può superare i limiti
funzionali del sistema respiratorio. Quindi quando non si riesce a eliminare CO2 in eccesso o non si riesce
ad accumularne nel sangue periferico, questo sistema perde di efficacia e il pH si modifica.
225
Patologia clinica
P5.2.3 Sistema renale

Più raffinato e complesso del compenso polmonare, ma anche più efficace.
Il rene, pur intervenendo più lentamente, ha minori limiti funzionali e risulta essere particolarmente efficace
nel compensare variazioni del pH ematico; la funzione renale nell’equilibrio acido-base si attua attraverso tre
diversi meccanismi:
• riassorbimento di bicarbonato à neutralizzazione del HCO3– urinario con H+ e sintesi HCO3–;
• generazione di bicarbonato ex novo à neutralizzazione del HPO4– urinario con H+ e sintesi HCO3–;
• escrezione di acidi à sintesi di NH3 e sua neutralizzazione con H+.
Tuttavia, è necessario prestare attenzione perché la denominazione di questi tre meccanismi non è
propriamente corretta, quindi potrebbe indurre in errore.
Riassorbimento di bicarbonato
Ha una denominazione fortemente sbagliata.
Prendendo in considerazione l’immagine, al centro si
trova la cellula del tubulo renale, a sinistra il
compartimento del sangue periferico e a destra il lume
del tubulo renale.
I primi ricercatori che studiarono questo processo
videro che, per compensare un’alterazione
dell’equilibrio acido-base, scompariva del bicarbonato
dal tubulo renale e ricompariva nel sangue, quindi
immaginavano che ci fosse un processo di
riassorbimento analogo a quello del glucosio:
pensavano che ci fosse una molecola carrier che
trasportasse il bicarbonato dal lume tubulare all’interno della cellula tubulare e poi dalla cellula al sangue
periferico. Pertanto, chiamarono il meccanismo “riassorbimento del bicarbonato”. Successivamente si scoprì
che il processo non è di questo tipo, ma il nome rimase sbagliato, quindi ancora oggi lo utilizziamo
impropriamente, poiché il processo non prevede nessun riassorbimento.
Il processo parte in realtà da un enzima che si trova all’interno delle cellule tubulari che prende il nome di
anidrasi carbonica: esso garantisce la costituzione di acido carbonico all’interno della cellula partendo da
CO2 e acqua come substrati. Questo non è presente in tutte le cellule, è una caratteristica delle cellule renali.
L’acido carbonico così formato all’interno della cellula si scompone in ioni H+ e ione bicarbonato: gli ioni H+
escono dalla cellula e giungono nel lume tubulare, attratti dal bicarbonato presente all’interno del lume
tubulare; lo ione bicarbonato invece va nel sangue periferico.
Gli ioni presenti nel sangue vengono tutti filtrati dal rene e poi gestiti a livello tubulare; questo vale anche
per lo ione bicarbonato, che quindi non va incontro a riassorbimento, ma una volta nel tubulo renale viene
neutralizzato dagli ioni H+ provenienti dalla scomposizione dell’acido carbonico all’interno delle cellule
tubulari. In altre parole, il motivo per cui i primi ricercatori pensavano che lo ione bicarbonato scomparisse
dal lume tubulare è che esso non si trova più nel lume come ione, ma viene legato dagli ioni H+ e neutralizzato,
mentre il motivo per cui “compare” nel sangue periferico è che proviene dalla scomposizione dell’acido
carbonico nelle cellule tubulari.
Tornando alla reazione iniziale, essa è regolata dalla presenza di ioni bicarbonato nella preurina: tanto più
bicarbonato sarà presente nel lume tubulare, tanto meno ce ne sarà nel sangue e tanto più quello nel tubulo
attrarrà ioni H+ fuori dalla cellula. In questo modo è stimolata l’azione dell’anidrasi carbonica e la successiva
dissociazione dell’acido carbonico.
226
Patologia clinica
Pensando a quale potrebbe essere il limite di questo sistema, intuitivamente viene da pensare che una volta
esaurito il bicarbonato nel tubulo renale (ovvero una volta che tutto quello disponibile è stato neutralizzato)
il sistema si blocchi, poiché la reazione catalizzata dall’anidrasi carbonica non è più stimolata.
In realtà non è così, poiché gli ioni H+ non sono assolutamente selettivi, quindi si legano benissimo a qualsiasi
ione negativo. Pertanto, una volta esaurito lo ione bicarbonato, sfruttano altri ioni negativi presenti nel lume
tubulare, in particolare lo ione fosfato 𝑯𝑷𝑶𝟐# 𝟒 .
Si arriva così al secondo meccanismo, in cui i primi ricercatori osservavano che, nonostante nel lume tubulare
il bicarbonato fosse esaurito, esso continuava a comparire nel sangue periferico: decisero di chiamare
pertanto questo processo, sempre impropriamente (ma bisogna ricordare che essi avevano a disposizione
strumenti molto limitati), “generazione di bicarbonato ex novo”.
Generazione di bicarbonato ex novo

Il processo è esattamente identico a quello appena
descritto, con la differenza che lo ione negativo che
neutralizza gli ioni H+ che escono dalla cellula tubulare
e che quindi agisce da motore per l’anidrasi carbonica
è lo ione fosfato invece dello ione bicarbonato. In
questo caso, quindi, si ha sempre la dissociazione
dell’acido carbonico con gli ioni H+ che vengono attratti
nel lume tubulare dagli ioni fosfato e lo ione
bicarbonato che va sempre nel sangue periferico.
Una volta, quando c’era maggiore disponibilità
economica, all’esame delle urine oltre che il pH si
misurava anche l’escrezione di fosfati, con un esame
chiamato valutazione dell’acidità titolabile (dove con “acidità titolabile” si intende “quantità di basi che
servono a portare il pH delle urine al pH del sangue”). Ora questa valutazione non si esegue più nella routine
diagnostica, anche se sarebbe utile, poiché permetterebbe di quantificare questo specifico tipo di compenso.
Di nuovo, si potrebbe pensare che questo sistema si interrompa quando si esaurisce anche lo ione fosfato
nel lume tubulare o quando si esauriscono tutti gli ioni negativi presenti nella preurina.
Invece, c’è un ulteriore sistema che entra in gioco quando i due sistemi precedenti si sono esauriti ed è
l’escrezione renale di acidi.
Escrezione di acidi
Una volta che gli ioni negativi presenti nel lume tubulare
si sono esauriti, le cellule renali mettono in atto questo
meccanismo per produrre esse stesse degli ioni che
attraggano gli ioni H+ nel lume tubulare, in modo che
l’anidrasi carbonica possa continuare a funzionare.
Ad esempio, le cellule tubulari possono metabolizzare gli
aminoacidi, primo fra tutti la glutammina. La
glutammina viene scissa in acido α-chetoglutarico e
ammoniaca; l’ammoniaca esce per gradiente di
concentrazione verso il lume tubulare, dove può legare
gli ioni H+ producendo lo ione ammonio, che diventa poi
cloruro di ammonio.
227
Patologia clinica
Quindi sono le cellule tubulari stesse che producono l’accettore di protoni in grado di legare gli ioni H+ che
loro stesse producono.
Dosando l’escrezione di cloruro di ammonio nelle urine è possibile quantificare questo terzo sistema di
compenso.
Quando anche gli aminoacidi si sono esauriti, anche il meccanismo di compenso renale si esaurisce
definitivamente.
In conclusione, la capacità di compenso renale è molto più articolata, tuttavia va ricordato che questi
meccanismi non sono istantanei: il rene esprime la sua massima efficacia dopo giorni.
Questo è molto importante a livello clinico e laboratoristico, perché quando si legge un’emogasanalisi va
messa in conto la possibilità che il rene non abbia ancora messo in atto il suo sistema di compenso.
Considerare questo è fondamentale per interpretare correttamente quel tipo di esame.
P5.3 ACIDOSI E ALCALOSI RESPIRATORIE E METABOLICHE

Quando questi sistemi di compenso (i sistemi tampone, ma soprattutto i sistemi di compenso renale e
polmonare) non riescono più a garantire la rigenerazione delle componenti bicarbonato/acido carbonico, il
rapporto non è più di 20:1 e il pH si modifica.
Si utilizza il termine “acidemia” quando il pH scende sotto 7,36 e il termine “alcalemia” quando il pH sale
sopra 7,44. In realtà questi termini vengono usati solo nell’ambito laboratoristico, altrimenti solitamente si
parla di acidosi e alcalosi rispettivamente quando aumentano o diminuiscono gli ioni H+ e il pH si modifica.
Capire se un paziente è in acidosi o alcalosi non è complicato, basta misurare il pH del sangue periferico; più
difficile è capire se si tratta di un’alterazione metabolica o respiratoria.
Un’alterazione è definita metabolica quando il rapporto 20:1 si modifica a causa del bicarbonato.
Un’alterazione è invece definita respiratoria quando il rapporto bicarbonato/acido carbonico si modifica a
causa di un’alterazione primitiva dell’acido carbonico, quindi della CO2.
Sono quindi quattro i disturbi dell’equilibrio acido-base:
• acidosi respiratoria;
• acidosi metabolica;
• alcalosi respiratoria;
• alcalosi metabolica.
P5.3.1 Acidosi respiratoria

Nel nome stesso è contenuta la definizione: il termine “acidosi” indica che il pH si è ridotto, il termine
“respiratoria” indica che la causa è da ricercare in un’alterazione a carico dell’anidride carbonica. In
particolare, la CO2 è aumentata: essa si trova al denominatore nell’equazione di Henderson-Hasselbach,
quindi se il pH si è ridotto, il denominatore deve essere aumentato.
L’acidosi respiratoria è conseguente a tutte quelle condizioni che determinano un aumento dell’anidride
carbonica nel sangue periferico. Le cause sono molteplici: possono derivare da un’ostruzione delle vie
respiratorie, disordini degli scambî gassosi (come nel caso di una fibrosi polmonare) oppure può essere
implicato il SN (nel caso di assunzione di barbiturici). Quindi quando c’è una patologia che riduce la
ventilazione alveolare, il paziente ipoventila, accumula CO2 (ipercapnia) e matematicamente il pH si riduce.
A questo punto l’organismo si trova a dover compensare l’aumento del denominatore aumentando della
giusta proporzione il numeratore, quindi mette in atto tutti quei meccanismi che fanno aumentare il
228
Patologia clinica
bicarbonato nel sangue periferico. Tanto più l’aumento del

bicarbonato riporterà il rapporto vicino a 20:1, tanto
maggiore sarà l’avvicinamento del valore del pH al valore di
riferimento di 7,44.
Per quanto riguarda gli esami di laboratorio, in caso di

acidosi respiratoria si osserva che:
• nel sangue arterioso:
§ il pH è diminuito (˂7,36);
§ la PaCO2 è aumentata (˃42 mmHg);
§ i bicarbonati sono necessariamente aumentati (compenso) → l’aumento del bicarbonato non è
casuale né dipendente dal paziente, ma è finemente regolato da un rapporto matematico: a ogni
aumento di 10 mmHg della PaCO2, l’aumento dei bicarbonati è in acuto di 1 mEq/L e in cronico
di 3-4 mEq/L (questo perché il rene impiega tempo per attivare il compenso quindi nella fase
iniziale non riesce a compensare; questo va tenuto in conto anche quando in seguito a
emogasanalisi si calcola il compenso, perché a seconda di quanto tempo è passato vanno usati
valori di riferimento diversi per il calcolo);
§ si osserva frequente iperkaliemia, ovvero aumento del potassio nel sangue: nell’acidosi
aumentano gli ioni H+ nel sangue periferico, di conseguenza gli ioni cercano di compensare la
loro concentrazione anche negli altri compartimenti, quindi tenderanno anche a entrare dentro
le cellule; tuttavia, se nelle cellule entrano ioni positivi, per mantenere la neutralità dovranno
uscire altrettanti ioni positivi, e dal momento che all’interno della cellula lo ione positivo
preponderante è il potassio, sarà proprio il potassio a uscire dalla cellula ed essere quindi lo ione
“sacrificato” per garantire l’ingresso dello ione H+. Questo comporta un doppio disagio: in primo
luogo l’ingresso di ioni H+ nella cellula altera il pH intracellulare determinando anche l’attivazione
di alcuni enzimi; dall’altro lato l’aumento del potassio nel sangue ha ripercussioni negative, ad
esempio, a livello cardiaco o neuromuscolare.
• nelle urine:
§ il pH è acido;
§ i bicarbonati sono diminuiti;
§ l’acidità titolabile è aumentata (anche se attualmente non viene più misurata);
§ l’eliminazione di cloruro di ammonio è aumentata (anche se attualmente non viene più
misurata).
[A livello urinario la cosa più importante è osservare il pH acido, infatti l’unico indicatore tuttora
utilizzato è il pH urinario].
P5.3.2 Alcalosi respiratoria

L’alcalosi respiratoria è provocata da una diminuzione di
anidride carbonica nel sangue arterioso (ipocapnia)
conseguente a un aumento della ventilazione alveolare.
Si potrebbe pensare che l‘acidosi respiratoria sia molto
frequente in quanto le patologie polmonari inducono una
ridotta ventilazione alveolare, e che l’iperventilazione di
conseguenza sia un effetto abbastanza raro. Invece
l’iperventilazione è un riflesso che si associa a due condizioni
molto frequenti nella pratica clinica: la febbre e il dolore. Di
229
Patologia clinica
conseguenza, anche pazienti con altre patologie possono avere un’alcalosi respiratoria non necessariamente
per una patologia polmonare.
La PaCO2 si riduce perché aumenta l’iperventilazione (anche lievemente superiore ai dati di riferimento).
Tanto più si riduce la bicarbonatemia (gli ioni bicarbonato nel tubulo vengono eliminati con le urine), tanto il
pH si avvicinerà ai valori di riferimento.
Per quanto riguarda gli esami di laboratorio, in caso di alcalosi respiratoria si osserva che:
§ il pH è aumentato (>7,44);
§ la PaCO2 è diminuita (<38 mmHg);
§ i bicarbonati sono ridotti seguendo sempre un’equazione di compenso che tiene conto del fatto
che la condizione si sia instaurata acutamente o cronicamente: per ogni riduzione di 10 mmHg
della PaCO2, la riduzione dei bicarbonati è in acuto di 2 mEq/L e in cronico di 5 mEq/L;
§ frequente ipokaliemia (con ioni H+ in uscita dalla cellula che causano l’ingresso di potassio).
• nelle urine:
§ il pH è alcalino;
§ i bicarbonati sono aumentati;
§ l’acidità titolabile è diminuita;
§ l’eliminazione di cloruro di ammonio è diminuita.
P5.3.3 Acidosi metabolica

L’acidosi metabolica è caratterizzata da una riduzione del pH
conseguente a una riduzione della concentrazione ematica di
bicarbonati. Un paziente compensa l’acidosi metabolica
iperventilando.
Se il rene non è responsabile di questa alterazione metabolica
anch’esso può compensare. Le alterazioni metaboliche hanno
un doppio compenso se il rene non è compromesso. Da un lato
la PaCO2 tenderà a ridursi ma, dall’altro, il rene metterà in atto
un meccanismo di compenso che tenderà ad aumentare il bicarbonato (tramite il riassorbimento di
bicarbonato).
Per quanto riguarda gli esami di laboratorio, in caso di acidosi metabolica si osserva che:
§ il pH è diminuito (<7,36);
§ la PaCO2 è diminuita (<38 mmHg) a secondo del compenso: a ogni riduzione dei bicarbonati di 1
mEq/L corrisponde una riduzione della PaCO2 di 1,2 mmHg;
§ i bicarbonati sono diminuiti (23 mEq/L);
§ frequente iperkaliemia.
• nelle urine:
§ il pH è acido;
§ i bicarbonati sono diminuiti;
§ l’acidità titolabile è aumentata;
§ l’eliminazione di cloruro di ammonio è aumentata.
230
Patologia clinica
P5.3.4 Alcalosi metabolica

L’alcalosi metabolica è caratterizzata da un aumento del pH
conseguente a un aumento della concentrazione ematica dei
bicarbonati. Per compensare il paziente ipoventila, consentendo di
trattenere anidride carbonica. Il rene contribuisce a diminuire la
concentrazione di ioni bicarbonato, sempre che non sia il primo
responsabile dell’alcalosi.
Per quanto riguarda gli esami di laboratorio, in caso di alcalosi respiratoria si osserva che:
§ il pH è aumentato (>7,44);
§ la PaCO2 è aumentata (>42 mmHg) di 0,5-0,7 mmHg (in media 0,6 mmHg) a ogni aumento dei
bicarbonati di 1 mEq/L;
§ i bicarbonati sono aumentati (>25 mEq/L);
§ frequente ipokaliemia.
• nelle urine:
§ il pH è alcalino
§ i bicarbonati sono aumentati;
§ l’acidità titolabile è diminuita;
§ l’eliminazione di cloruro di ammonio è diminuita.
Di seguito, un’immagine che riassume i meccanismi compensativi precedentemente citati.
P5.4 EMOGASANALISI
L’esame di laboratorio utilizzato per valutarne i disturbi all’equilibrio
acido-base si chiama emogasanalisi (EGA).
L’EGA si esegue su un prelievo di sangue arterioso13 eseguito
sull’arteria radiale con inclinazione dell’ago a 30 gradi, tenendo la
mano del paziente in lieve dorsiflessione; in alternativa si utilizzano
l’arteria femorale (profonda e poco comprimibile) o l’arteria brachiale
(molto innervata e quindi dolorosa). Questo tipo di prelievo è
impegnativo perché, a differenza delle vene, le arterie non si vedono.
Per identificare l’arteria radiale allora bisogna identificare il punto di
pulsazione di questa.
13
L’EGA è uno dei pochi esami che si esegue tramite il prelievo di sangue arterioso
231
Patologia clinica
Il campione deve essere analizzato immediatamente per evitare gli effetti del metabolismo cellulare che ne
modifica il pH; se il campione viene raffreddato in ghiaccio il risultato è comunque ritenuto attendibile anche
dopo 30-60 minuti dal momento del prelievo.
[“Immediatamente” è una parola incompatibile con la
diagnostica di laboratorio in quanto il dato di laboratorio
presuppone il prelievo, l’arrivo del materiale di
laboratorio, l’esecuzione del test, una validazione e il
ritorno dell’informazione. Tutto ciò chiaramente non è
possibile.
Un’ulteriore difficoltà è rappresentata dal fatto che non
tutti gli ospedali sono dotati di strumenti per il
raffreddamento delle provette in ghiaccio, questo significa
che possono esserci alterazioni del metabolismo
all’interno della provetta.]
L’emogasanalisi, dunque, deve uscire dalla routine di
laboratorio in quanto il medico di laboratorio non è in
grado di ottenere il risultato immediatamente. Per tale motivo, adesso è possibile trovare degli
emogasanalizzatori portatili appositi per l’emogasanalisi, almeno nei reparti di emergenza. Di conseguenza,
questo esame non si esegue più in laboratorio.
Dopo l’analisi ciò che esce da questi device è una sorta

di “scontrino” che contiene tutte le informazioni
necessarie. Inoltre, è necessario che questi “scontrini”
vengano fotocopiati in quanto tendono a scolorirsi col
tempo. I dati che vi si trovano sono divisi in: dati
misurati, valori di riferimento14 e dati calcolati.
È importante concentrarsi sui valori di pH, di pCO2 e
dei bicarbonati.
Per calcolare i bicarbonati attuali (HCO3 att) è
necessario applicare l’equazione di Henderson-
Hasselbach.
La scelta di calcolare alcuni parametri è volta a
risparmiare: sono stati scelti da calcolare valori o poco attendibili o molto costosi da misurare. Dei tre valori
che interessano (pH, PaCO2, bicarbonato) quindi se ne misurano solo due, per poi calcolare il terzo.
P5.4.1 Lettura ACIDI EQUILIBRIO BASI
Per leggere l’emogasanalisi è necessario partire dal pH per

capire di che disturbo soffre il paziente.
ACIDI BASI ACIDI BASI
Già dal pH è possibile capire se ci si trova in una condizione
ACIDOSI: ALCALOSI:
di acidosi (pH <7,36) o di alcalosi (pH > 7,44). pH ¯ pH
In condizioni di acidosi una PaCO2 ridotta (<38 mmHg) è
indice di eziologia metabolica, mentre una PaCO2 elevata
(>42 mmHg) è indice di eziologia respiratoria; in condizioni
RESPIRATORIA : METABOLICA: RESPIRATORIA: METABOLICA:
PaCO2 ¯ PaCO2 ¯ PaCO2 PaCO2
HCO3- ¯ HCO3- ¯ HCO3- HCO3-
14
Non viene utilizzato il termine “normale” perché la normalità non è definibile.
232
Patologia clinica
di alcalosi una PaCO2 aumentata (>42 mmHg) è approccio di laboratorio

indice di eziologia metabolica, mentre una ai disordini emogasanalitici
PaCO2 diminuita (<38 mmHg) è indice di
eziologia respiratoria. disordine alterazione alterazione effetto
primaria secondaria finale
È necessario prestare particolare attenzione alla
acidosi respiratoria PaCO2 [HCO3-] [H+] ¯ pH
direzione delle frecce. L’emogasanalisi infatti ha
questa caratteristica, ovvero di avere delle acidosi metabolica ¯ [HCO3-] ¯ PaCO2 [H+] ¯ pH
frecce che stabiliscono se il valore misurato è
alcalosi respiratoria ¯ PaCO2 ¯ [HCO3-] ¯ [H+] pH
più alto o basso rispetto al valore di riferimento.
Quando le frecce indicanti valori di pH e pCO2 alcalosi metabolica [HCO3-] PaCO2 ¯ [H+] pH
vanno nello stesso verso, l’alterazione è sempre
metabolica, quando vanno in verso opposto l’alterazione è sempre respiratoria.15
P5.4.2 Disordini semplici e complessi

In patologia umana, soprattutto con l’aumentare dell’età, vi sono pazienti con alterazioni dell’equilibrio
acido-base doppie o triple, dovute a compromissioni e/o co-interessamento di più organi (es. scompenso
cardiaco in un paziente con broncopneumopatia cronica e/o insufficienza renale e/o perdita di liquidi per
diarrea o vomito). In questo caso l’interpretazione è meno diretta rispetto ai casi precedentemente osservati.
In tali condizioni ci si trova di fronte a quelli che vengono definiti “disordini complessi” o “misti”. Nei disordini
misti dell’equilibrio acido base il compenso atteso non è rispettato.
Per capire se un paziente ha un disturbo semplice o un disturbo complesso è necessario fare il calcolo del
compenso.
L’approccio è dunque il seguente:
1. leggere l’emogasanalisi;
2. dedurre se il paziente ha un’acidosi o un’alcalosi;
3. valutare la direzione delle frecce per riconoscere se il disturbo è respiratorio o metabolico;
4. fare il calcolo del compenso, matematicamente.
Se il calcolo del compenso torna,

cioè se il numero riferito riepilogo dei compensi renali e respiratori ai disturbi
dall’emogasanalisi corrisponde primari dell’equilibrio acido-base
matematicamente al numero
disordine Alterazione Risposta compensatoria attesa limiti
che si ottiene risolvendo primaria
Acidosi respiratoria:
l’equazione, il disturbo è -Acuta - Aumento di 1 mEq/L dei bicarbonati per ogni 10 30 mEq/L
pCO2 mmHg di aumento della anidride carbonica
semplice. -Cronica - Aumento di 3,5 mEq/L dei bicarbonati per ogni 10 45 mEq/L
mmHg di aumento della anidride carbonica
Se invece i conti non tornano,
Alcalosi respiratoria
significa che il disturbo è -Acuta: - Riduzione di 2 mEq/L dei bicarbonati per ogni 10 18 mEq/L
pCO2 mmHg di diminuzione della anidride carbonica
complesso. -Cronica: - Riduzione di 5 mEq/L dei bicarbonati per ogni 10 12 - 15 mEq/L
mmHg di aumento della anidride carbonica
Quando il quadro è complesso Diminuzione di 1,2 mmHg della anidride carbonica per 10 – 15 mmHg
bisogna ragionare tenendo Acidosi metabolica [HCO3-] ogni mEq/L di caduta dei bicarbonati
conto della clinica, delle Aumento di 0,7 mmHg della anidride carbonica per ogni 55 mmHg
Alcalosi metabolica [HCO3-] mEq/L di aumento dei bicarbonati
condizioni del paziente, ecc.
15
Il professore aggiunge di non essere completamente d’accordo con questa definizione in quanto banalizza
l’argomento.
233
Patologia clinica
P5.5 APPLICAZIONI DELLA TEORIA A CASI CLINICI
Primo caso clinico

Una donna di 33 anni si presenta in pronto soccorso
accusando una dispnea insorta da alcuni giorni.
L’anamnesi patologica è negativa e gli ultimi esami,
eseguiti al momento del parto, erano nella norma.
All’esame obiettivo non presenta febbre né tosse,
né dolore toracico, escludendo così possibili
alterazioni polmonari. La pressione è 120/80 mmHg
e la frequenza cardiaca è di 85 pulsazioni/minuto.
Il medico per prima cosa sospetta un disturbo
emotivo, probabilmente successivo al parto.
Secondo lui la dispnea è psicogena. Se così fosse
dall’emogasanalisi si potrebbe rilevare un’alcalosi
respiratoria.
Il risultato dell’EGA è mostrato nell’immagine a destra.
Dall’EGA è evidente che invece l’acidosi sia di tipo

metabolico.
Dagli esami del sangue e da quello dell’urine
(immagine a sinistra) si osserva che la causa di
questa alterazione metabolica sia il diabete, il quale
è probabilmente dovuto allo stress subito dal corpo durante la gravidanza.
Non è dunque un problema di tipo psicologico.
Secondo caso clinico

Una donna di 72 anni si presenta al pronto soccorso
per un trauma contusivo avuto su un autobus in
seguito a una brusca frenata.
Dall’anamnesi patologica remota risulta che la
paziente è cardiopatica, è in trattamento con β-
bloccanti, ACE-inibitori e diuretici. Riferisce inoltre di
aver aumentato di sua iniziativa il dosaggio dei
diuretici a causa della comparsa, da qualche giorno,
di edemi declivi.
234
Patologia clinica
La paziente inoltre lamenta astenia e all’esame obiettivo appare disidratata con labbra secche e cute
anelastica, sollevabile in pliche. È inoltre ipotesa (95/65 mmHg), tachicardica (FCM 98 battiti/minuto) e
bradipnoica (FR 10 atti/min).
Da un paziente disidratato ci si aspetterebbe un’alcalosi metabolica. Questo perché un paziente disidratato
cerca di riassorbire più acqua possibile attraverso il sodio. Se il sodio entra, lo ione H+ deve uscire.
A questo punto si esegue un’EGA da cui si ottiene la conferma

dell’ipotesi precedentemente fatta: è un’alcalosi di tipo
metabolico. Però al medico di PS sorge il dubbio che la paziente
possa avere anche qualcos’altro e per questo esegue il calcolo del
compenso.
Per eseguire il calcolo del compenso è bene tenere presente che
a ogni aumento dei bicarbonati di 1 mEq/L corrisponde un
aumento della PaCO2 di 0,5-0,7 mmHg.
I bicarbonati sono aumentati di 31,6 mmol/L – 24 mEq/L = 7,6 mEq/L.

Mentre la PaCO2 è aumentata di 45,5 mmHg – 40 mmHg = 5.5 mmHg.
Questo significa che il disturbo è di tipo semplice. Smettendo di autoprescriversi i diuretici il disturbo si
attenuerà.
Terzo caso clinico

Un uomo di 42 anni si reca in PS per persistenza di
iperpiressia da tre giorni associata a stranguria (dolore
alla minzione) e pollachiuria (minzione frequente),
dolore in regione lombare destra e diarrea. L’analisi
patologica remota è negativa.
All’esame obiettivo risulta una temperatura ascellare
di 39,5 gradi, un’ipotensione (PA 110/65), una
tachicardia (FC 112 battiti/minuto) e una frequenza
respiratoria aumentata (FR 20 atti/minuto).
Dall’emocromo si evidenza una leucocitosi neutrofila
dovuta ragionevolmente a un’infezione batterica delle
vie urinarie. Dall’esame delle urine invece si riscontra
un pH di 7,12 con proteinuria, leucocituria ed ematuria.
Se il paziente ha un’infezione da qualche giorno,
ragionevolmente, iperventila da qualche giorno, di
conseguenza ci si aspetta di trovare un’alcalosi di tipo
respiratorio.
Questa diagnosi viene confermata dai risultati dell’EGA
(immagine a destra).
A questo punto è necessario svolgere il calcolo del compenso

tenendo presente che a ogni diminuzione di 10 mmHg della
PaCO2 corrisponde una diminuzione dei bicarbonati di 2 mEq
in acuto e 4-5 mEq in cronico.
235
Patologia clinica
La PaCO2 è ridotta di 40 mmHg – 25 mmHg = circa 15 mmHg.

Se fosse un’alterazione acuta ci si aspetterebbe un aumento dei bicarbonati di 3 mEq, mentre se fosse cronica
tra i 6 e i 7 mEq.
Anche se fosse acuta il risultato non corrisponde, infatti è aumentata di 25,3 mmHg – 24 mmHg = 1,3 mmHg.
A questo punto è necessario ragionare: se il calcolo del compenso in un paziente con alcalosi respiratoria non
torna, significa che è presente anche un altro disturbo.
Matematicamente essendo i bicarbonati più alti ed essendo il paziente disidratato, la seconda alterazione è
di tipo metabolico.
Quarto caso clinico

Un uomo di 81 anni si presenta al pronto soccorso per
febbre da 3-4 giorni, non risponde ai FANS, tosse e dispnea
ingravescente.
All’anamnesi patologica remota riferisce una BPCO
enfisematosa. Ha già dunque una patologia che gli produce
un’ acidosi respiratoria.
L’RX del torace evidenzia un marcato quadro di BPCO con
verosimili bronchiectasie e segni di ipoventilazione destra.
Facendo l’EGA viene confermata l’ipotesi di acidosi

respiratoria.
A questo punto si può evitare di fare il calcolo del
compenso, perché ci si aspetterebbe un aumento dei
bicarbonati, ma questo non avviene. Di conseguenza il
disturbo è doppio.
La seconda acidosi sarà di tipo metabolico, per cui si
eseguono gli esami del sangue.
Da questi risulta che il paziente abbia

un’ insufficienza renale, che conferma
quindi il problema di tipo metabolico.
236
Patologia clinica
P6. ESAMI DI PRIMO LIVELLO PER LO STUDIO

DELLA FUNZIONALITÀ EPATICA
(prof. Treré)
P6.1 GENERALITÀ SUL FEGATO

Il fegato rappresenta l’organo più importante del nostro organismo dal punto di vista metabolico.
Si consiglia di pensare sempre al fegato se non si sa dove avviene una certa reazione, poiché si ha il 95% di
probabilità che sia la risposta corretta. Il fegato svolge tutte le funzioni metaboliche relative al metabolismo
lipidico, glucidico e proteico. Pesa circa 1-1,5 kg e riceve il 30% della gittata cardiaca: 1,5 L di sangue al minuto
passano per il fegato, dunque 2000 L di sangue processati in un giorno.
Queste sono le sue funzioni principali:
• metabolismo dei carboidrati: glicogenosintesi, glicogenolisi, gluconeogenesi, conversione in
glucosio di altri monosaccaridi;
• metabolismo dei lipidi: biosintesi e trasformazione degli acidi grassi, sintesi di trigliceridi,
colesterolo, fosfolipidi, lipoproteine e corpi chetonici;
• metabolismo proteico: sintesi e degradazione delle proteine, catabolismo degli amminoacidi;
• metabolismo degli ormoni steroidei;
• metabolismo ed escrezione della bilirubina;
• sintesi ed escrezione degli acidi biliari;
• coniugazione e detossificazione: bilirubina, acidi biliari, farmaci, ecc.;
• biosintesi dell’urea;
• formazione dell’acido urico;
• deposito: vitamine (A, D, K, B12), minerali (ferro, rame), ecc.
L’avere tutte queste funzioni fornisce al clinico un grande numero di parametri per valutare la funzionalità
epatica. Tuttavia, è importante prescrivere gli esami in maniera appropriata, sia per contenere la spesa, sia
perché alcuni esami sono più informativi di altri e sono indici più accurati della funzionalità epatica. Inoltre,
prescrivere tanti esami senza avere in mente un ragionamento per la diagnosi è molto dispersivo.
Negli ultimi anni si stanno sviluppando degli algoritmi di previsione che, per esempio, permettono di
prevedere accuratamente il meteo, questo stesso concetto è stato applicato alla medicina, e presto
potremmo avere dei computer che tramite algoritmi possono fare previsioni di diagnosi al paziente. In questo
caso ogni informazione in più aiuta il computer e l’algoritmo; per le persone però è diverso: servono
informazioni più importanti e accurate, derivate da un ragionamento diagnostico.
Quindi, in considerazione della grande varietà di funzioni svolte dal fegato e del fatto che una richiesta di
tutti i test disponibili sarebbe onerosa per il paziente e dispersiva per la diagnosi, nella pratica clinica in
presenza di una malattia epatica accertata o sospetta si selezionano solo alcune indagini essenziali, indicative
delle funzioni epatiche fondamentali; tali indagini sono costituite dalla valutazione degli indici di primo
livello16, che – per accordo internazionale – sono:
• della bilirubina totale e frazionata;
• degli enzimi sierici indicatori di danno epatocellulare e di colestasi;
• delle proteine sieriche;
• dei fattori della coagulazione.
16
Per esami di primo livello si intende la presenza di un sospetto di alterata funzionalità epatica: si fanno questi esami
per avere un’idea di base per poi valutare l’ipotesi diagnostica tramite esami di secondo livello, i quali possono essere
di laboratorio o di altro tipo. “Di primo livello” indica anche che tali esami vengono svolti tutti e quattro
contemporaneamente, indipendentemente dal motivo per il quale si sta visitando il paziente: sia se si ha la certezza di
una malattia epatica da monitorare nel tempo, sia se si ha il sospetto di una malattia epatica, occorre prescriverli tutti
e quattro, attendere il risultato e iniziare a ragionare.
237
Patologia clinica
P6.2 BILIRUBINA
La bilirubina è il prodotto di degradazione dell’eme: la produzione giornaliera di bilirubina (250-350 mg)
deriva in massima parte (80-85%) dal catabolismo dell’emoglobina degli eritrociti invecchiati riconosciuti
dal sistema reticolo-endoteliale, presente principalmente nella milza, ma in maniera minore anche nel resto
del corpo. Un globulo rosso invecchiato [i globuli rossi vivono circa 120 giorni] sclerotizza e perde quella tipica
flessibilità della membrana facendo fatica a passare per i sinusoidi, quindi verrà riconosciuto e digerito da un
macrofago. Per il restante 15-20% la bilirubina deriva dall’eritropoiesi inefficace; una minima quota di
bilirubina deriva inoltre dal ricambio di proteine contenenti eme, quali mioglobina, citocromi e catalasi. Nel
fagocita del sistema reticolo-endoteliale l’emoglobina viene catabolizzata separando l’eme dalla globina,
dall’eme viene estratto il ferro dell’anello tetrapirrolico che viene consegnato alla transferrina e riportato al
midollo per la formazione di nuova emoglobina/globuli rossi. Quello che resta dell’eme viene catabolizzato a
bilirubina.
La bilirubina non coniugata è liposolubile e, pertanto, potenzialmente tossica; essa viene immessa in circolo
dalle cellule del sistema reticolo-endoteliale legata all’albumina (il carrier) e, in questa forma, raggiunge il
fegato. Nel fegato la bilirubina viene veicolata all’interno degli epatociti dove si lega a proteine citosoliche
(ligandina e proteina Z) che prevengono il suo rientro nel circolo ematico e la sua diffusione all’interno di
compartimenti epatocitari non idonei (si stacca una volta coniugata); viene quindi trasferita nel reticolo
endoplasmatico dove l’enzima uridina difosfato-glucuronil transferasi (UGT) provvede alla sua coniugazione
con acido glucuronico: la bilirubina coniugata è idrosolubile e, in questa forma, può essere eliminata con la
bile.
La bilirubina coniugata viene secreta dagli epatociti nei canalicoli biliari attraverso un processo ATP-
dipendente mediato da un trasportatore multispecifico di anioni organici chiamato MRP2 (Multidrug
Resistance-Associated Protein 2); giunta nel lume intestinale con la bile, la bilirubina viene degradata
(deconiugata e ridotta da parte di batterî anaerobî presenti nell’intestino) a urobilinogeno, prodotto piccolo,
incolore e idrosolubile. L’urobilinogeno ha tre diversi destini metabolici:
• la quota maggiore viene
ossidata a stercobilina e
urobilina ed eliminata con
le feci, alle quali
conferisce il caratteristico
colore bruno à questo
significa che ci si limita a
osservare il colore delle
feci: le feci poco colorate
(con poco urobilinogeno)
sono dette feci ipocoliche,
mentre le feci del tutto
decolorate (assenza di
urobilinogeno) sono dette
feci acoliche;
• una quota minore viene riassorbita a livello intestinale e ritorna al fegato tramite il circolo portale
(circolo entero-epatico dell’urobilinogeno), non è funzionale, è solo un riassorbimento passivo
insieme ad altre sostanze à dal fegato verrà poi escreta di nuovo ed eliminata;
• una piccola quota dell’urobilinogeno che viene riassorbito salta il filtro epatico. Esistono circoli
collaterali che fanno sì che non il 100% del sangue venga filtrato dal fegato. Una piccola quota di
sangue, che contiene urobilinogeno, lo salta entrando in circolo. L’urobilinogeno è una piccola
molecola che arrivata al rene viene filtrata ed eliminata con le urine à ciò che scappa al fegato viene
compensato dal rene. È, dunque, normale ritrovare tracce (ridotta quantità) di urobilinogeno nelle
urine.
238
Patologia clinica
P6.2.1 Determinazione della bilirubina diretta e frazionata

La stima della concentrazione ematica della bilirubina viene determinata in laboratorio mediante metodo
fotometrico, misurando gli azo-derivati ottenuti dalla reazione (detta di “Van der Bergh”, dal nome del
medico olandese che l’ha messa a punto) tra la bilirubina e lo ione diazonio dell’acido sulfanilico
(diazoreattivo di Ehrlich). La bilirubina coniugata è idrosolubile e reagisce direttamente con lo ione diazonio
(bilirubina diretta); la bilirubina non coniugata, invece, è insolubile in acqua e reagisce con lo ione diazonio
solo se viene prima solubilizzata con alcoli o con altri solventi (bilirubina indiretta). Si chiama indiretta perché
reagisce solo dopo che viene coniugata.
È molto più intuitivo parlare di bilirubina coniugata e non coniugata, piuttosto che diretta e indiretta. Quindi:
• bilirubina diretta à coniugata con acido glucuronico;
• bilirubina indiretta à non coniugata con acido glucuronico.
Nella pratica di laboratorio non è possibile determinare la sola bilirubina indiretta; pertanto, si determina
prima la bilirubinemia diretta, poi si rende solubile la bilirubina libera e si determina la bilirubina totale, e
infine si calcola la bilirubina indiretta per sottrazione.
In un soggetto con una normale funzionalità epatica solitamente si ritrova nel sangue periferico solamente
una piccola quantità di bilirubina indiretta, quella che è stata prodotta dal sistema reticolo-endoteliale,
poiché quella diretta si trova nell’intestino.
Quindi, in condizioni fisiologiche, la bilirubina che si dosa nel sangue periferico è tutta nella forma indiretta,
ovvero è la bilirubina legata all’albumina che si sta dirigendo dai tessuti periferici al fegato. Mentre la
bilirubina diretta la dosiamo perché aumenta in condizioni patologiche, in condizioni fisiologiche non c’è
motivo di trovarla se non in tracce. Il valore di riferimento della bilirubina, che non deve superare in
condizioni fisiologiche, è 1 mg/dL.
P6.2.2 Ittero
Ittero è un termine clinico: si tratta dell’acquisizione di un colorito giallastro prima delle sclere (che si
colorano prima nella parte periferica, quindi può essere utile invitare il paziente a guardare verso l’alto;
condizione definita subittero), poi della cute e delle mucose, conseguente a un eccesso di bilirubina
(condizione definita ittero franco). Quindi il termine ittero si utilizza per l’esame obiettivo. In laboratorio si
parla di ittero da iperbilirubinemia, ovvero aumento dei valori di bilirubinemia.
Le manifestazioni cliniche iniziano a vedersi quando i valori di bilirubina superano i 2,5 mg/dL, ma si parla di
iperbilirubinemia già oltre 1 mg/dL (quindi già a 1,2 mg/dL).
La classificazione di laboratorio degli itteri li divide in base al rapporto tra i due tipi di bilirubina:
• itteri da iperbilirubinemia prevalentemente non coniugata – in cui l’80-85% della bilirubina sierica
è non coniugata à stessa condizione che si ha in buono stato di salute, ma i valori sono più alti;
• itteri da iperbilirubinemia combinata – la bilirubina è sia diretta che indiretta e quella diretta supera
il 50% (forma che normalmente non è presente).
Itteri da iperbilirubinemia prevalentemente non coniugata

Gli itteri da iperbilirubinemia prevalentemente non coniugata si dividono in tre tipi:
A. Itteri da iperproduzione di bilirubina, non è il tipo più frequente ed è dovuto a cause preepatiche di
tipo ematologico, quali:
- emolisi: la produzione di eritrociti da parte del midollo in seguito a emolisi può aumentare
al massimo fino a 8 volte; pertanto, l’emolisi da sola non produce mai valori di bilirubinemia
superiori a 4-5 mg/dL. Nei casi di emolisi protratta si possono formare calcoli costituiti da sali
di bilirubina nella colecisti o nelle vie biliari. Le anemie emolitiche che più spesso provocano
239
Patologia clinica
questa forma di ittero sono la sferocitosi ereditaria, l’anemia falciforme e l’anemia da deficit
enzimatici (G6PD);
- eritropoiesi inefficace: alcune anemie (principalmente la talassemia maior e le anemie
francamente megaloblastiche) sono caratterizzate da un significativo aumento
dell’eritropoiesi inefficace, che può arrivare a produrre fino al 70% della bilirubina totale;
- degradazione dell’eme in raccolte extravascolari di eritrociti, quali estesi infarti tessutali
(soprattutto polmonari), emorragie interne (dalla rottura di un aneurisma dell’aorta allo
stillicidio da errate manovre per il posizionamento di un catetere) o ematomi di grandi
dimensioni.
Nello schema si ha l’epatocita al

centro, a sinistra il sangue, sulla
destra le vie biliari. La bilirubina col
sangue arriva nel fegato, viene
captata, coniugata e sottoposta a
tutto il processo già visto.
Normalmente si hanno feci normo-
coliche e tracce di urobilinogeno
nell’urina.
Nei pazienti con ittero emolitico o
eritroblastolitico (itteri che
vengono chiamati preepatici, ma il
prof preferisce il termine itteri da
cause ematologiche) si produce più
bilirubina, che viene catabolizzata dal fegato e quindi si produce più urobilinogeno. Questo però è un dato
che si perde perché le feci sono già scure, non possono diventare ancora più scure (possono diventare nere,
ma solo in caso di emorragia).
La cosa più importante che si vede è l’aumento della bilirubina indiretta nel sangue periferico. Inoltre, più
urobilinogeno si trova nell’intestino, più ne viene riassorbito, più urobilinogeno salta il filtro epatico,
maggiore quantità se ne ritrova nelle urine. Nell’esame delle urine si riscontreranno infatti i valori di
urobilinogeno aumentati rispetto alle tracce di riferimento, mentre non si trova la bilirubina perché questa
può andare nelle urine, ma solo nella forma coniugata. Quella in questione invece è una bilirubina coniugata
con l’albumina, che quindi non passa attraverso il filtro glomerulare.
Il quadro di laboratorio di un ittero emolitico è caratterizzato da: feci normali (che contengono più
urobilinogeno, ma non si coglie questa differenza), bilirubina nel sangue periferico aumentata, urobilinogeno
nelle urine aumentato in maniera significativa.
B. Itteri da difetti della captazione epatica (rarissimi), dovuti a:

- assunzione di farmaci o mezzi di contrasto che provocano un’inibizione competitiva del
legame tra bilirubina e ligandina à situazione transitoria, non impegnativa;
- deficit di ligandina (sindrome di Gilbert)
C. Itteri da ridotta o assente attività glucuronil-transferasica, i più importanti. Causato da:
- ittero fisiologico del neonato: questa forma di ittero è provocata da un deficit transitorio di
glucuroniltransferasi. Il 97% dei nati a termine ha una iperbilirubinemia tra la seconda e la
quinta giornata che nel 65% dei casi supera i 5 mg/dL e che, solitamente, regredisce
spontaneamente nel corso delle due settimane successive. In casi eccezionali (soprattutto in
neonati prematuri) i livelli di bilirubina possono essere superiori. Questo accade perché il
fegato fino al momento della nascita non ha svolto la funzione di eliminazione della
bilirubina, ma ci ha pensato la mamma a prendere la bilirubina del feto, a coniugarla
mediante il suo fegato e a eliminarla attraverso la placenta (l’intestino non può eliminare
240
Patologia clinica
tutto prima della nascita). Dopo il parto, il neonato si autonomizza per questa funzione e gli
enzimi hanno bisogno di un po’ di tempo per essere attivati e quindi occorre da qualche
giorno fino a qualche settimana affinché la glucuronil-transferasi epatica arrivi a regime. Nel
frattempo, si accumula un po’ di bilirubina indiretta, che però nel giro di 15 giorni si riduce e
torna ai valori di riferimento. Quando i livelli di bilirubina superano i 20 mg/dL si può avere
l’ittero nucleare, causato dal passaggio di bilirubina attraverso una immatura barriera
ematoencefalica e precipitazione della stessa nei nuclei encefalici della base, ricchi di
componenti lipidiche, e in altre aree cerebrali à si viene a causare danno cerebrale che
dev’essere evitato. La “maturazione” enzimatica può essere stimolata dalla
somministrazione di barbiturici al neonato o alla madre (come si faceva in passato, pratica
ormai abbandonata perché causa parecchi effetti collaterali). Nei pazienti con valori
particolarmente alti di bilirubinemia si ricorre alla fototerapia, basata sul principio che,
sottoposta a intensa illuminazione con luce bianca o azzurra, la bilirubina si trasforma in una
serie di isomeri idrosolubili (fotoisomerizzazione) che vengono eliminati con la bile anche
senza coniugazione direttamente dal neonato.
- Sindrome di Gilbert: è una malattia autosomica recessiva con prevalenza relativamente alta,
intorno all’8%, e incidenza maggiore nel sesso maschile. È causata da una mutazione del gene
UGT1 (uridina difosfato glucuronil transferasi 1) che riduce l’attività transferasica dal 65 al
90%, mentre altre forme sono dovute a un deficit di ligandina. In questa sindrome i valori di
bilirubina sono solitamente tra 1,2 e 3 mg/dL e solo raramente superano i 5 mg/dL, restando
comunque sempre inferiori ai 6 mg/dL per tutta la vita. Quindi è una condizione benigna, ma
cronica, che si manifesta raramente prima del secondo decennio di vita, spesso in maniera
occasionale. L’ittero è asintomatico e l’iperbilirubinemia è accentuata da stress, malattie
infettive, febbre, sforzo fisico, ecc. La diagnosi è solitamente fatta per esclusione e
coadiuvata dall’anamnesi familiare.
- Sindrome di Crigler-Najjar I: condizione autosomica recessiva causata da una mutazione del
gene UGT1 che determina la completa assenza di attività glicuronil transferasica.
L’iperbilirubinemia è elevata (20-50 mg/dL); si presenta nel neonato ed è permanente. Prima
della fototerapia, la malattia portava alla morte nei primi anni di vita per encefalopatia da
bilirubina; con l’avvento della fototerapia e del trapianto di fegato la prognosi di questi
pazienti è notevolmente migliorata. In questo caso il trattamento con il fenobarbital non ha
effetto.
- Sindrome di Crigler-Najjar II: malattia autosomica prevalentemente recessiva causata da
una mutazione del gene UGT1 che determina un deficit enzimatico severo ma non assoluto.
Il quadro clinico può variare da paziente a paziente. L’encefalopatia da bilirubina è rara.
Solitamente l’ittero può rimanere latente fino all’adolescenza, con valori di bilirubinemia tra
6 e 20 mg/dL. La terapia è con fenobarbital, che riduce la bilirubinemia del 25%.
Per distinguere i varî tipi di ittero non è necessario analizzare quali enzimi sono deficitarî o altro, basta
misurare la bilirubinemia e, valutata questa, si può fare un’ipotesi diagnostica e procedere con la terapia. In
questi casi non c’è bilirubinuria. In queste situazioni l’urobilinogeno è aumentato nell’ittero ematologico, ma
non è aumentato nelle forme in cui sono alterati gli enzimi.
Questi sono i valori di riferimento:
• sotto i 6 mg/dL à sindrome di Gilbert;
• tra 6 e 20 mg/dL à sindrome di Crigler-Najjar di tipo II;
• sopra i 20 mg/dL à sindrome di Crigler-Najjar di tipo I.
241
Patologia clinica
Approfondimento: Sindrome di Gilbert

È una malattia autosomica recessiva con un’incidenza particolarmente alta, dell’8% (uno dei motivi che
aveva contribuito a classificarla come dominante). Più precisamente viene classificata come una
malattia pseudodominante perché si comporta da dominante nel trasmettersi nelle generazioni, ma a
livello molecolare si tratta di una malattia recessiva (per cui per sviluppare la malattia è necessario che
entrambi gli alleli siano mutati). Il gene mutato è infatti presente nel 35% della popolazione, e questo
rende estremamente facile che due eterozigoti si incrocino e che nasca un individuo affetto. Questo
spiega l’elevata prevalenza della malattia.
Il fatto che ci sia una maggiore incidenza nel sesso maschile è associato principalmente al genoma e in
particolare ai geni modificatori, che hanno la caratteristica di modificare il fenotipo di diverse condizioni
patologiche (per esempio della fibrosi cistica), per cui in base alla presenza di particolari geni
modificatori (che possono differire tra i due sessi) ci può essere una incidenza diversa della malattia nei
due sessi.
Un esempio può essere il diabete, una patologia multifattoriale con una componente genetica, che
presenta una maggiore incidenza nel sesso femminile. La prevalenza nel sesso femminile può essere
legata all’azione degli androgeni sui geni modificatori che regolano l’espressione dei geni coinvolti nello
sviluppo della malattia.
Itteri da iperbilirubinemia combinata

La bilirubina diretta non compare in condizioni fisiologiche o negli itteri precedentemente descritti, ma
piuttosto in queste forme di ittero (al 50% sarà diretta), che distinguiamo in:
• itteri da difetti ereditarî della funzione escretoria epatica (rarissimi);
• itteri da difetti acquisiti della funzione escretoria epatica.
Itteri da difetti ereditarî della funzione escretoria epatica

Sono due patologie rarissime ed ereditarie, legate alla ridotta capacità epatica di eliminare la bilirubina
attraverso il circuito biliare, sebbene il fegato la coniughi correttamente. Hanno trasmissione autosomica
recessiva e solitamente portano a una buona prognosi.
• Sindrome di Dubin-Johnson: l’ittero è causato dall’alterazione della proteina MRP2 (multidrug
resistance-associated protein 2). Questa trasferisce molte sostanze, tra cui la bilirubina, dall’interno
dell’epatocita al dotto biliare. La bilirubina dunque arriva al fegato, viene captata dalla ligandina,
coniugata con acido glucuronico per poi essere escreta dall’epatocita nei canalicoli biliari grazie alla
proteina MRP2 (trasportatore polifunzionale). Se questa non funziona, la bilirubina rimane
nell’epatocita e refluisce nel sangue periferico. L’epatocita acquisisce un caratteristico colore bruno-
nerastro che è dovuto all’accumulo di pigmenti (probabilmente metaboliti dell’adrenalina).
È una rara malattia autosomica recessiva a buona prognosi. Si manifesta con un ittero ricorrente,
raramente accompagnato da nausea, vomito, dolore addominale e debolezza. I valori di
bilirubinemia sono solitamente intorno ai 2-5 mg/dL, e solo raramente raggiungono i 20-25 mg/dL.
• Sindrome di Rotor: presenta a grandi linee la stessa sintomatologia della sindrome di Dubin-Jonson,
ma ad oggi non se ne conosce la causa: si ritiene che la sindrome sia dovuta non tanto a un deficit di
escrezione, quanto piuttosto a un’alterazione dei processi di deposito intraepatocitario della
bilirubina, dunque la bilirubina coniugata si accumula e refluisce nel sangue.
Itteri da difetti acquisiti della funzione escretoria epatica

Si tratta di forme molto più frequenti e clinicamente importanti.
In questo caso sono le epatopatie che alterano la funzionalità dell’epatocita o le sindromi ostruttive che
determinano un’impossibilità, totale o parziale, per la bilirubina di essere escreta.
Queste forme di ittero sono chiamate rispettivamente epatocellulare e ostruttivo.
• Ittero epatocellulare: questa condizione si determina a seguito di un danno epatocellulare che può
essere di diversa natura: cause fisiche, chimiche, biologiche, intossicazioni da funghi, epatiti virali.
242
Patologia clinica
L’epatocita viene danneggiato à modificazione

dell’orientamento cellulare: la cellula riesce ad acquisire
una certa quota di bilirubina, è in grado di coniugarla, ma
la elimina dal polo sbagliato à reflusso di bilirubina
coniugata che viene rimessa in circolo. Per semplificare il
concetto si può fare riferimento a un’epatite virale: il virus
attacca gli epatociti, ma il danno non è uguale in tutte le
cellule poiché alcune andranno in necrosi, altre saranno
mediamente compromesse o non compromesse in alcun
modo. Il danno clinico dipende dalla sommatoria di
queste tre diverse possibilità: se la gran parte degli
epatociti non è danneggiata, avremo un’epatite
asintomatica, diagnosticabile attraverso studî di
laboratorio. Nel caso in cui il numero di epatociti in
necrosi sia molto elevato, si avrà epatite fulminante,
trattabile solo con trapianto di fegato. Se infine il danno
ha determinato la delezione di un numero ridotto di
cellule, si avrà riparazione/parziale rigenerazione. Una
cellula del fegato danneggiata ma non necrotica perde l’orientamento: fa entrare la bilirubina e la
coniuga, però invece di farla uscire dal polo biliare la fa uscire dal polo vascolare, facendo riversare
questa bilirubina diretta nel circolo periferico (assieme alla bilirubina indiretta normalmente
presente). Questa ridotta capacità di coniugazione si traduce in una minor escrezione di bilirubina,
perciò le feci saranno ipocoliche (meno colorate). Ci si potrebbe aspettare che formandosi meno
urobilinogeno questo sia assente nelle urine, ma questo al contrario aumenta poiché, per quanto
possa essere poco, non viene più ricaptato dal fegato ed è dunque immesso tutto in circolo (questo
non è un indicatore affidabile). La bilirubina indiretta passa nel glomerulo, perciò quando passa nel
sangue periferico autonomamente la si ritrova nelle urine, che assumono il caratteristico color
marrone scuro (Coca-Cola). Queste urine sono dette ipercromiche.
• Ittero ostruttivo: è dovuto ad alterazioni delle vie biliari che ostruiscono il decorso della bile dal
fegato all’intestino. Le cause possono essere: neoplasie delle vie biliari, stenosi cicatriziale post-
infiammatoria, calcoli nelle vie biliari (causa più frequente), neoplasie della testa del pancreas.
In questo caso la bilirubina coniugata viene eliminata dal polo giusto perché l’epatocita non è
danneggiato, ma quando incontra l’ostruzione torna indietro fino a refluire nel sangue. Anche in
questo caso si troveranno sia la bilirubina diretta che l’indiretta nel sangue periferico e le urine
saranno ipercromiche.
243
Patologia clinica
Se l’ostruzione delle vie biliari è completa non è prodotto urobilinogeno, quindi le feci saranno
totalmente acoliche; se l’ostruzione è parziale la sintomatologia è molto simile a quella dell’ittero
epatocellulare. In entrambe le condizioni la quota di bilirubina diretta nel circolo periferico sarà
proporzionale all’intensità del danno.
Il laboratorio, attraverso la bilirubina, non discrimina l’ittero ostruttivo ed epatocellulare, perciò
entrano in gioco gli enzimi sierici.
P6.3 ENZIMI SIERICI INDICATORI DI DANNO EPATOCELLULARE O COLESTATICO

Gli enzimi sono molecole con funzione catalizzatrice che garantiscono funzioni biologiche fondamentali. Gli
enzimi si trovano in elevate concentrazioni nel citoplasma (attaccati alle membrane, nei reticoli
endoplasmatici, contenuti in organuli o semplicemente liberi, ecc.), ma nel plasma possono essere presenti
in piccole quantità: tra essi ritroviamo enzimi che svolgono funzioni specifiche (fattori di coagulazione),
enzimi secreti o riassorbiti (quali enzimi digestivi, pancreatici e salivari) ed enzimi dismessi dalle cellule e
riversati in circolo in seguito a normale turnover (in situazioni in cui la divisione cellulare è esasperata, come
nelle neoplasie, la conta e la rilevazione di questi enzimi può essere utile).
Gli enzimi hanno grandi dimensioni: sono macromolecole difficili da sintetizzare, per cui la cellula consuma
buona parte delle sue riserve energetiche di ATP per il loro turnover. Essendo macromolecole, sono
impossibilitate ad attraversare la membrana cellulare se non in caso di gravi danni alle membrane.
Se si trova un enzima ubiquitario nel sangue periferico, se ne deduce che c’è stato un danno tissutale, ma se
si trova in circolo un enzima specifico di un tessuto o di un organo, si può localizzare la sede del danno
facilmente. In laboratorio oggi c’è una sensibilità analitica impressionante in questo ambito e si arriva a
individuare una bassissima concentrazione di enzimi nel sangue periferico, quantità liberate anche da un
numero molto ridotto di cellule danneggiate.
L’enzimologia clinica è uno strumento diagnostico di altissima affidabilità, utilità e di grandissima sensibilità.
In passato per indicare un enzima era sufficiente inserire il suffisso “-asi” al suo substrato, tuttavia è stata poi
introdotta una nuova classificazione degli enzimi da parte dei biochimici, che ha rimosso il suffisso “-asi” e
ha rinominato gli enzimi in base alla reazione da essi catalizzata (ossidoreduttasi, transferasi, idrolasi, liasi,
isomerasi, ligasi). Entrambe le classificazioni sono valide, ma nell’ambiente medico è maggiormente in uso la
denominazione antica, anche nei referti.
P6.3.1 Enzimi sierici indicatori di danno epatocellulare

Gli enzimi epatospecifici che consentono di diagnosticare un danno epatico sono le transaminasi (la
nomenclatura più recente è aminotransferasi). Le transaminasi sono:
• transaminasi glutammico-ossalacetica sierica (SGOT) o aspartato aminotransferasi (AST):
trasferisce il gruppo amminico dall’acido aspartico all’acido α-chetoglutarico determinando la sintesi
di acido ossalacetico; è presente sia nei mitocondrî sia nel citosol delle cellule di diversi tessuti, tra
cui fegato, miocardio, muscolo scheletrico, reni, cervello, pancreas, polmoni, leucociti ed eritrociti
(in ordine decrescente di concentrazione);
• transaminasi glutammico-piruvico sierica (SGPT) o alanina aminotransferasi (ALT): trasferisce il
gruppo amminico dall’alanina all’acido α-chetoglutarico determinando la sintesi di acido piruvico; è
presente principalmente nel citosol degli epatociti e delle cellule renali.
Se un soggetto ha le transaminasi alte significa che qualche epatocita è stato danneggiato.
La sensibilità della valutazione è molto elevata, per cui i valori di riferimento sono bassissimi, vicini allo zero:
è facile osservare una variazione.
Il rapporto AST/ALT è importante, ma va valutato con cautela perché deve però essere sempre confermato
da altre analisi. Significato generale:
• £ 1 è ragionevole pensare a un danno di origine virale;
• > 2 è indicatore di epatite alcolica.
244
Patologia clinica
Le AST sono meno specifiche: sono presenti sia negli epatociti che in molte altre cellule e hanno due
localizzazioni principali: citoplasma e mitocondri. L’ALT invece è più epatospecifica.
In caso di danno aumentano le epatospecifiche, quindi il denominatore del rapporto (ALT); il rapporto tende
a essere inferiore a 1. Delle AST si libera in circolo solo quella citoplasmatica. Con il perdurare del danno inizia
ad uscire anche la forma mitocondriale, che ha maggiore emivita; quindi, il rapporto tende ad aumentare.
Diventa superiore a 2 in caso di abuso di alcool perché esso non ha un’azione inducente, ma ha un’azione più
tossica e diretta sui mitocondrî, e quindi distruggendo i mitocondrî libera la parte mitocondriale del
numeratore della frazione. Con cautela si può interpretare questo rapporto: quando è minore di uno, è
ragionevole pensare a un’epatite nella fase acuta; quando si inverte e supera il 2, si può pensare che sia un
danno da alcol.
P6.3.2 Enzimi sierici indicatori di danno colestatico

Questi enzimi aumentano in caso di colestasi (stasi di bilirubina nelle vie biliari). Gli enzimi sierici sono:
• fosfatasi alcalina (ALP), il più specifico. Appartiene alla classe delle idrolasi (a pH alcalino rimuove i
gruppi fosfato da proteine e da altre molecole, prodotte da fegato, osso, placenta e intestino [qui si
fa riferimento all’isoforma epatica]) e viene indotta in seguito a una colestasi per facilitare il trasporto
dei Sali biliari nelle vie biliari. È molto sensibile e si trova sulla membrana cellulare, ma, in caso di
colestasi, la bile che si accumula nel canalicolo biliare ne induce sia la liberazione dalla membrana,
sia la sintesi ex-novo, aumentandone la concentrazione ematica;
• γ-glutammil-transpeptidasi (γ-GT): indice di danno sia epatocellulare sia di colestasi. Molto sensibile,
ma poco specifico, possono modificarsi anche in altre patologie (l’obesità, il diabete e l’alcolismo
cronico, e in corso di malattie pancreatiche, cardiache, renali e polmonari [sono maggiormente
concentrate nelle cellule dei tubuli renali]). Aumentano in pazienti che fanno abuso di alcol (è un
marker dell’alcolismo cronico). Esse sono indicatore di alcolismo perché l’alcol ha un’azione di
induzione enzimatica sull’enzima glutamil-transferasi. I farmaci che si usano (fenobarbiatal) hanno la
funzione di attivare l’enzima. Vi sono anche altri farmaci (es. fenotoina, un anticonvulsivante) con
un’azione inducente l’enzima; l’alcol svolge la stessa azione, quindi nel paziente alcolista le γ-GT
aumentano per questo fenomeno.
Grazie a questi valori è possibile differenziare tra loro le due forme di ittero viste in precedenza
(epatocellulare e ostruttivo).
La bilirubina è dunque importante per differenziare le forme di ittero preepatiche (cioè le forme di ittero da
iperbilirubinemia prevalentemente non coniugata) [il prof contesta la nomenclatura perché manca la
bilirubina transferasi che è intraepatica] dalle due forme di iperbilirubinemia mista: per queste ultime due
forme però si necessitano i valori di transaminasi, che aumentano in caso di danno epatocellulare, e di
fosfatasi alcalina, indice di forme di tipo ostruttivo.
P6.4 PROTEINE SIERICHE

Sono proteine sieriche l’albumina, α1- e α2-, β- e γ-
globuline. Le prime quattro sono sintetizzate dal
fegato, la quinta dalle plasmacellule.
Un paziente epatopatico avrà diminuzione di
albumina, α1-, α2- e β-globuline accompagnato da un
aumento a base larga di γ-globuline sia relativo che
assoluto in alcuni casi (è sempre relativo perché le
altre si riducono, ma può essere anche assoluto
perché il fegato svolge un ruolo fondamentale nella
clearance degli anticorpi e, se non funziona, queste
rimangono più a lungo in circolo. Se la causa è virale,
245
Patologia clinica
c’è un fenomeno infiammatorio e aumentano gli anticorpi in circolo in assoluto).

Si misura la variazione delle proteine sieriche attraverso il rapporto albumina/globuline (vn=1,2-1,7), che è
però indicativo, scende facilmente sotto l’unità nelle epatopatie (può anche arrivare a 0,5).
Nelle epatiti da alcolismo vi può essere la scomparsa delle bande β, poiché vi è un aumento delle IgA.
P6.5 FATTORI DELLA COAGULAZIONE

Sono tutti prodotti dal fegato e in caso di insufficienza epatica se ne diventa carenti.
L’emorragia è una manifestazione classica che sussegue a un’insufficienza epatica, soprattutto quando il
fegato ha ridotto la sua funzionalità sotto il 50-60 %, nella fase terminale della patologia à si ha riduzione
della produzione di fattori della coagulazione e aumento di PT e aPTT.
Il fattore VII è il primo a calare perché è, tra i fattori della coagulazione, quello con emivita più breve, per
questo motivo PT è un indicatore più precoce di aPTT di epatopatia.
P6.6 APPLICAZIONI DELLA TEORIA A CASI CLINICI

Per il paziente epatopatico, o quando vi sia sospetto di epatopatia, bisogna richiedere questi 4 esami e devono
essere valutati assieme. Sull’analisi del quadro si fa la diagnosi più mirata, ovviamente se necessario con
ulteriori approfondimenti o con altre tipologie di analisi. Questo è però sempre il punto di partenza: motivo
per cui si chiamano esami di primo livello della funzionalità epatica. È una convenzione condivisa a livello
internazionale.
Primo caso clinico

Paziente di 31 anni si presenta in pronto soccorso per ittero comparso da una settimana, prima sclerale poi
cutaneo; analisi patologiche negativa; saltuario uso di sostanze stupefacenti; analisi patologiche recenti: da
due settimane astenia ingravescente (si aggrava rapidamente) e anoressia; il paziente riferisce urine
ipercromiche e feci ipocoliche; non lamenta dolore addominale; senza febbre.
Sappiamo che ha un ittero, quindi è presente sicuramente una iperbilirubinemia. Analizziamo alcune variabili:
• Tempi di coagulazione: dall’emocromo possiamo osservare che la aPTT Ratio rientra nei valori di
normalità, mentre la PT Ratio (attività protrombinica) è ridotta in maniera significativa (dunque il PT
è allungato);
• Bilirubina: osserviamo una iperbilirubinemia combinata in cui aumenta prevalentemente la forma
diretta;
• Enzimi: la fosfatasi alcalina è aumentata, ma solo di tre volte. Invece le transaminasi sono aumentate
di centinaia di volte quindi possiamo dedurre che si tratta di un danno epatocellulare;
• Elettroforesi proteine sieriche: parametri da tenere in considerazione sono il rapporto
albumina/globuline e le varie proteine viste in precedenza (albumina, α1-, α2-, b-, γ-globuline). Le γ-
globuline sono aumentate al 27%, l’albumina è ridotta, l’α1 è aumentata (di poco). Il rapporto
albumina/globuline è molto sotto l’unità (conferma che è un ittero epatocellulare siccome il fegato
non produce proteine);
• Esame delle urine: è presente bilirubina nelle urine.
Per comprendere la causa di questo ittero epatocellulare servono esami di secondo livello. Tramite
quest’ultimi, richiedendo marcatori virali, si dimostra la presenza di infezione acuta da HCV (è per questo
motivo che aumentano le a1 globuline, sono infatti proteine della fase acuta).
Secondo caso clinico

Signore di 89 anni lamenta una dolenzia in ipocondrio destro e saltuariamente in epigastrio, insorto da circa
20 giorni ed associato ad anoressia e calo ponderale di 4 kg sviluppatosi negli ultimi 2 mesi; analisi patologiche
246
Patologia clinica
remote negative. Intanto all’esame obiettivo non risulta ittero. Prima sapevo che la bilirubina fosse
aumentata, qui invece devo andare ad indagare. Analizziamo:
• VES: dall’emocromo risulta aumentata in maniera significativa (aumenta con l’età, ma non è
compatibile in questo caso con una condizione fisiologica);
• Bilirubina: risulta un valore di bilirubina totale di 1,63 dunque ci troviamo di fronte ad un
subittero. Osserviamo una iperbilirubinemia combinata;
• Enzimi: la fosfatasi alcalina e le γ-GT sono aumentate in maniera significativa, mentre le
transaminasi variano poco. Sospetto dunque che il paziente abbia una ostruzione. Un altro
elemento che mi fa arrivare a questa conclusione è il valore del colesterolo (la bile, infatti,
contiene questa sostanza, dunque in seguito ad una ostruzione delle vie biliari possiamo
notare ipercolesterolemia);
• Elettroforesi delle proteine sieriche: il rapporto albumina/globuline è lievemente ridotto,
tuttavia le γ-globuline risultano normali quindi non è presente un’alterazione da ittero
epatocellulare. Si riduce un pochino l’albumina, ma aumentano le β- e soprattutto le α1-
globuline.
In un paziente con queste caratteristiche (subittero da ostruzione, VES aumentata, indici di flogosi aumentati,
calo ponderale) posso pensare, come causa dell’ostruzione, ad una neoplasia. L’ecografia (esame di secondo
livello) dell’addome conferma una colestasi da ostruzione delle vie biliari extra-epatiche, mentre ulteriori
esami radiografici attribuiscono ciò alla presenza di un colangiocarcinoma extra-epatico.
247
Patologia clinica
P7. ESAMI DI LABORATORIO PER LO STUDIO DELLA FUNZIONALITÀ RENALE

(prof. Treré)
P7.1 STUDIO DELLA FUNZIONALITÀ RENALE

Se per eseguire una diagnosi sulla funzionalità epatica è necessario effettuare tutti i quattro esami epatici di
primo livello (sono visite o esami utili per un primo orientamento diagnostico) e solo in seguito ai risultati
ragionare sulla diagnosi, per lo studio della funzionalità renale invece non si fanno tutti, ma bisogna prima
aver effettuato delle ipotesi e, a seconda del problema e del quesito diagnostico, si applicherà uno o l’altro
esame. Gli esami per lo studio della funzionalità renale, infatti, non sono di primo di livello, ma esami che il
laboratorio propone per gestire problematiche diverse.
Gli esami di laboratorio che si hanno a disposizione per valutare la funzionalità renale sono quattro:
1. Esame delle urine:
a) esame delle caratteristiche fisiche;
b) esame delle caratteristiche chimiche;
c) esame microscopico del sedimento urinario.
2. Determinazione della concentrazione ematica di composti azotati non proteici:
a) uremia (BUN: Blood Urea Nitrogen);
b) creatininemia;
c) uricemia.
3. Clearance renali:
a) clearance dell’inulina e della creatinina per la determinazione del filtrato glomerulare;
b) clearance del PAI per la determinazione della portata renale plasmatica.
4. Prove funzionali:
a) prova di diluizione;
b) prova di concentrazione.
P7.2 ESAME DELLE URINE

L’aspetto delle urine ha rappresentato il pilastro della
semeiotica medica nel Medioevo. Durante le lezioni di
patologia si cercava di correlare il colore, l’aspetto e le
caratteristiche delle urine a particolari patologie.
In generale l’esame delle urine è considerato parte delle

indagini di laboratorio sulla funzionalità renale, ma
permette di analizzare la funzionalità anche di altri organi:
l’esame è richiesto magari per un motivo, ma permette di fare diagnosi occasionale di altre patologie. Questo
è il motivo per cui è l’esame più frequentemente richiesto (non c’è cartella clinica senza esame
emocromocitometrico e delle urine), oltre al fatto che si tratta di un esame a basso costo, ad ampio spettro
diagnostico e la cui procedura è stata concordata a livello internazionale. Insieme all’esame dell’emocromo,
rientra nel “profilo d’ingresso”, ossia quegli esami di laboratorio che vengono fatti indipendentemente dal
motivo per cui il paziente è giunto all’osservazione del medico.
Di seguito delle raccomandazioni su prelievo e conservazione delle urine (in realtà non sono molto seguite
né troppo raccomandate):
248
Patologia clinica
- si prendono le urine della prima minzione della mattina perché sono più concentrate, aiutando
l’aspetto analitico;
- accurata igiene delle mani e dei genitali prima del prelievo, senza però usare saponi antisettici perché
potrebbero eliminare batterî;
- raccogliere il mitto intermedio, perché il primo mitto potrebbe essere contaminato;
- nelle donne fertili evitare il periodo mestruale, in quanto ci potrebbe essere una contaminazione di
globuli rossi;
- raccolta delle urine nei lattanti: esistono device appositi con un adesivo che dovrebbero garantire il
prelievo il più possibile sterile;
- dovrebbero essere valutate immediatamente dopo il prelievo, anche se ciò non è sempre possibile,
o al massimo entro 2 ore mantenendo il campione conservato nel frigorifero.
Si compone di tre parti:

• esame delle caratteristiche fisiche;
• esame delle caratteristiche chimiche;
• esame microscopico del sedimento urinario.
P7.2.1 Esame delle caratteristiche fisiche

Le caratteristiche fisiche sono:
• colore;
• aspetto;
• volume;
• peso specifico.
Le prime due caratteristiche vengono refertate in maniera discorsiva: l’operatore osserva il campione di urina
e descrive il colore e l’aspetto.
Colore
Il colore dipende sempre dalla
presenza di un analita, quindi è cause di anomale colorazioni dell’urina
l’esame chimico che, individuando gli colore cause patologiche cause non patologiche
analiti, fornirà la spiegazione del rosso - emoglobina - farmaci
perché le urine hanno acquisito un - mioglobina - coloranti
- porfirine - bietole
determinato colore. Inoltre, anche in - rabarbaro
condizioni non patologiche, come nel arancio - pigmenti biliari - farmaci contro infezioni
caso dell’assunzione di farmaci, il vie urinarie
giallo intenso - urina molto - carote
colore è alterato. concentrata - fenacetina
Teoricamente dovrebbe essere - nitrofurantoina
giallo/giallo-oro/giallo-paglierino. giallo chiaro - diabete - nessuna
verde - biliverdina - vitamine
- batteri - farmaci psicoattivi
(pseudomonas) - diuretici
Aspetto
marrone - mioglobina - nitrofurani
Le urine devono essere limpide. In - pigmenti biliari - alcuni sulfamidici
alternativa possono essere torbide o blu - nessuna - diuretici
presentare schiuma. Una schiuma
biancastra è associata alla presenza di proteine che riducono la tensione superficiale, mentre la schiuma
giallo-verdastra o arancione scuro è legata alla presenza di pigmenti bilirubinici.
249
Patologia clinica
Peso specifico
Il peso specifico di una sostanza è il rapporto tra il peso in grammi della sostanza (urina raccolta) e il peso di
un uguale volume di acqua distillata a 4°C. In condizioni normali oscilla tra 1,014 e 1,026 [leggendosi tuttavia
millequattordici e milleventisei per semplificare, evitando la virgola], ovvero è simile a quello dell’acqua.
Se il peso specifico scende sotto 1,014 si parla di ipostenuria, situazione che si verifica quando il rene perde,
in parte, la sua capacità di concentrare e diluire le urine; quando i reni perdono completamente questa
capacità, il peso specifico delle urine rimane costantemente uguale a quello del filtrato glomerulare, cioè
intorno a 1,007 (isostenuria). Entrambi i termini sono riferiti a una ridotta capacità di filtrare le urine.
Nelle poliurie le urine hanno solitamente basso peso specifico (con l’eccezione importante del diabete),
mentre nelle oligurie il peso specifico delle urine è solitamente aumentato.
Siccome la struttura che concentra le urine è il tubulo renale, il peso specifico si può considerare come un
indicatore (aspecifico in quanto ne esistono di più specifici) della funzionalità tubulare.
Volume
Il volume urinario viene solitamente valutato a letto del paziente, soprattutto se ricoverato e cateterizzato.
Il volume delle urine, che viene valutato raccogliendo le urine nelle 24 ore, oscilla tra 800 e 1800 mL (circa
1,5-2 L al giorno). In generale la quantità di urina prodotta nell’arco della giornata non è costante: la notte
viene prodotta meno urina rispetto al giorno, con un rapporto giorno/notte di 2/1, consentendoci di riposare
per un lungo periodo di tempo, ma ci porta anche ad avere al risveglio un’urina più concentrata (motivo per
cui nell’esame delle urine viene utilizzata quella della prima minzione).
• Arresto completo della produzione di urina à anuria;
• < 800 mL à oliguria;
• > 2000 mL à poliuria (molto frequente in caso di diabete).
La diminuzione del volume urinario (oliguria) si osserva come conseguenza di una diminuita filtrazione
glomerulare che può essere dovuta a una alterazione anatomica dei glomeruli o a una riduzione del flusso
ematico. L’arresto completo della formazione di urina (anuria) si può verificare nella insufficienza renale
acuta in conseguenza di gravi lesioni tubulari o per ostruzione delle vie urinarie. L’aumento del volume
urinario (poliuria) si osserva in varie affezioni renali nelle quali il rene ha perso la capacità di concentrare i
soluti entro un certo limite.
Odore
Non viene refertato, ma può essere utile soprattutto quando si apre la stanza di un paziente che ha dormito
e non ha cambiato aria. L’odore delle urine viene definito lievemente aromatico. In condizioni di infezione
delle vie escretrici l’odore può acquisire una venatura fetida. La presenza di corpi chetonici fornisce alle urine
un odore fruttato, caratteristico quindi di pazienti affetti da diabete di tipo 1 o pazienti in digiuno prolungato
(energia prodotta a partire da substrati lipidici, porta all’eccessiva produzione di corpi chetonici). L’odore
ammoniacale è invece indice di urine mal conservate, quindi non più adatte alla valutazione analitica.
P7.2.2 Esame delle caratteristiche chimiche

Le caratteristiche più informative dal punto di vista diagnostico sono quelle chimiche. In questo caso i
parametri valutati sono stati condivisi a livello internazionale, per dare un esame delle urine standard.
Gli indicatori sono i seguenti:
• pH;
• glucosio;
• proteine;
• emoglobina;
• corpi chetonici;
• bilirubina;
• urobilinogeno;
250
Patologia clinica
• nitriti.
Oltre a questi, si può richiedere qualunque tipo di analita nelle urine, si può richiedere per esempio la
concentrazione di un ormone o un metabolita. L’esame standard di default prevede l’esecuzione e la
valutazione degli analiti elencati sopra.
pH
È debolmente acido, con un valore medio intorno al 6 (varia fisiologicamente da 4,5 a 8, oscillando tra 5,5 e
6,5). È un’espressione dei sistemi di compenso che cercano di mantenere costante il pH del sangue:
quest’ultimo è mantenuto a 7,4 proprio grazie alle variazioni del pH urinario. Per mantenerlo costante deve
buttare fuori più acidi o più basi a seconda delle situazioni, quindi è assolutamente normale trovare questa
variabilità. Il pH urinario pari a 6 indica che l’organismo produce più sostanze acide che basiche e il
metabolismo è a pH acido, non neutro. Quindi il pH urinario risulta leggermente acido per mantenere basico
o neutro il pH ematico. La valutazione del pH è fondamentale per studiare le alterazioni dell’equilibrio acido-
base; va sempre valutato in un contesto generale di equilibrio acido-base. Costituisce la parte
complementare dell’emogasanalisi. Vi sono anche condizioni alimentari che possono modificare
transitoriamente il pH urinario.
L’acidità urinaria aumenta in caso di digiuno, se si segue una dieta particolarmente ricca di cibi carnei e di
grassi, in caso di prolungato esercizio muscolare o in seguito all’assunzione di farmaci acidificanti; viceversa,
la reazione delle urine sarà alcalina se si segue una dieta vegetariana, se si assumono farmaci alcalinizzanti o
nel caso di ritenzione urinaria con urine che ristagnano a lungo nella vescica (ipertrofia prostatica).
Glucosio e corpi chetonici

Normalmente il glucosio non è presente nelle urine se non in tracce, proprio perché viene riassorbito tutto a
livello tubulare; quando la glicemia supera i 180-200 mg/dL, la capacità del carrier specifico per il
riassorbimento tubulare del glucosio viene superata e, pertanto, si osserva la comparsa di glucosio nelle urine
(glicosuria).
Molto importante per diversi motivi, tra cui facilitare la diagnosi del diabete solitamente tardiva (per una
diagnosi ufficiale però si utilizza la misurazione della glicemia): nel paziente che arriva in ospedale viene
valutata anche l’eventuale presenza di glicosuria per diagnosticare un diabete fino a quel momento
asintomatico.
I corpi chetonici originano dall’incompleto catabolismo dei lipidi; nelle urine sono rappresentati per il 78%
da acido b-idrossibutirrico, per il 20% da acido acetacetico e per il 2% da acetone. I corpi chetonici sono
invece analiti presenti nelle urine [chetonuria] nel diabete di tipo 1 (o nello stato di digiuno prolungato).
Ancora una volta vengono valutati parametri non direttamente legati alla funzionalità renale, non acquista
tanto un significato diagnostico di per sé, ma diventa essenzialmente un fortissimo strumento di screening.
È questa la caratteristica dell’esame delle urine: non è specificatamente legato alla funzionalità dei reni, ma
insieme a parametri di funzionalità renale ne vengono misurati molti altri che non si riflettono direttamente
sulla funzionalità di quell’organo. Questo ampio spettro diagnostico, che non comprende solo il rene,
giustifica il motivo per cui molte persone vengono sottoposte all’esame delle urine, spesso non per
insufficienza renale ma per valutare altri parametri.
Proteine
La loro cospicua presenza è tra le poche caratteristiche associate quasi esclusivamente alla funzionalità
renale. La filtrazione a livello glomerulare si fonda sulle dimensioni: in particolare, le proteine di piccole
dimensioni filtrano liberamente e andranno a far parte della preurina, mentre le molecole di dimensioni
maggiori non vengono filtrate, ma escono tramite l’arteriola efferente, per cui ritrovare proteine di grosse
dimensioni nelle urine può essere associato a un danno alla barriera di filtrazione. Il limite di filtrazione è
definito dall’albumina: questa è la prima proteina che per dimensioni non viene filtrata e che quindi non si
trova nelle urine se non in tracce (in base all’impatto sterico che ha quel glomerulo, cioè le molecole di
albumina che arrivano perpendicolarmente al filtro passano, quelle con inclinazione minore non passano). In
generale comunque, come visto per il glucosio, l’organismo non si può permettere di perdere e sprecare
251
Patologia clinica
proteine, quindi nelle urine si riscontrano solo tracce (tra 40 e 80 mg al giorno, comunque non più di 150 mg
in condizioni fisiologiche) perché la maggior parte di queste viene riassorbita a livello tubulare: per cui, le
grandi proteine non vengono nemmeno filtrate, invece le piccole proteine con una dimensione inferiore ai
69000 Da vengono filtrate, ma vengono quasi completamente riassorbite; a livello urinario ne resta una
quantità minima (si parla di proteinuria fisiologica).
Quando la quantità di proteine filtrate supera i 150 mg, si parla di proteinuria.
Le cause possono essere diverse:
• alterazione glomerulare à se c’è un danno glomerulare la prima proteina ad essere filtrata è
l’albumina, quindi l’albuminuria è un indice sensibile di glomerulopatia;
• danno tubulare à in questo caso le proteine non vengono più riassorbite, quindi si ha proteinuria.
Per capire se c’è stato un danno glomerulare o un danno tubulare bisogna valutare il peso molecolare delle
proteine. Quindi l’analisi qualitativa della proteinuria aiuta a capire se essa è di origine glomerulare (proteine
di grandi dimensioni, dall’albumina in su) o tubulare (proteine di piccole dimensioni).
Le proteinurie vengono classificate secondo due scale:

• una quantitativa che distingue le proteinurie in lievi (< 1 g/die), moderate (1- 3 g/die), e gravi (> 3
g/die); ovviamente maggiore è la proteinuria più grave è la patologia.
• una qualitativa (più informativa):
o proteinurie fisiologiche à il tracciato elettroforetico della proteinuria fisiologica deve
essere eseguito su proteine fortemente concentrate e presenta le seguenti caratteristiche:
l’albumina è poco evidente e in quantità minore (30-40%) rispetto alle globuline; le globuline
anziché presentarsi come frazioni ben distinte, appaiono come una zona continua
indifferenziata.
o proteinurie glomerulari à problema solo di filtrazione à proteine ad alto PM:
- altamente selettive se viene escreta quasi esclusivamente albumina (PM 69.000);
- selettive quando assieme all’albumina sono escrete proteine con PM tra 70.000 e
100.000 (ad esempio la transferrina, con PM 90.000);
- non selettive quando sono escrete proteine con PM superiore a 100.000, fino al
passaggio nelle urine di quasi tutte le proteine plasmatiche.
o proteinurie tubulari à problema solo di riassorbimento à proteine a basso PM:
le proteinurie tubulari sono caratterizzate dalla presenza nelle urine di proteine a basso PM
(tra 10.000 e i 30.000), dette microglobuline, quali la β2-microglobulina (PM 11.000), il
lisozima (PM 14.500) e la α2-microglobulina o RBP (retinol binding protein: PM 21.000); sono
generalmente di modica entità e testimoniano una ridotta capacità del tubulo renale di
riassorbire le proteine a basso peso molecolare normalmente filtrate del glomerulo.
o proteinurie miste à alterazione glomerulare e alterazione tubulare à proteine ad alto e
basso PM:
presenza nell’urina di un notevole numero di frazioni proteiche, comprendenti: albumina,
frazioni proteiche plasmatiche, frazioni proteiche caratteristiche della proteinuria tubulare
(microglobuline).
o Overflow proteinuria à questo tipo di proteinuria è anche detta pre-renale per sottolineare
che non è dovuta a nefropatia; compare quando si determina l’aumento della
concentrazione plasmatica di una proteina con basso peso molecolare (PM). La proteinuria
di Bence Jones (PM tra 25.000 e 40.000) rappresenta un esempio classico di overflow
proteinuria, caratteristica di una neoplasia delle plasmacellule (plasmocitoma): sproporzione
tra la produzione di catene pesanti e catene leggere, con accumulo di queste ultime nelle
urine; altre proteine interessate possono essere la mioglobina (PM 17.000), l’emoglobina
(PM 64.000), il lisozima (PM 14.500), la α1-antitripsina (PM 45.000) e la α1-glicoproteina acida
(PM 44.000).
252
Patologia clinica
Emoglobina
È una molecola di dimensioni tali da passare il filtro glomerulare, tuttavia normalmente ciò non avviene in
quanto l’emoglobina è contenuta all’interno dei globuli rossi e anche quando i globuli rossi vengono fagocitati
dalle cellule del sistema del reticolo endoteliale (emolisi extravascolare), l’emoglobina viene trasformata in
bilirubina, ma queste reazioni non si svolgono a livello ematico per cui libera nel plasma non dovrebbe
esserci.
Essa si troverà libera nel sangue periferico solo in seguito a emolisi intravascolare (lisi dei globuli rossi in
circolo), per cui ritrovare emoglobina nelle urine in assenza di ematuria significa essere in condizioni di
anemia; l’anemia che ha determinato l’emolisi inoltre, viene aggravata dal fatto che l’emoglobina riesce a
passare la barriera di filtrazione glomerulare, viene eliminata, portando di conseguenza all’eliminazione del
ferro associato, necessario per la biosintesi.
Nel nostro organismo, tuttavia, esiste un sistema che ha il ruolo di evitare la dispersione dell’emoglobina con
le urine, basato sull’aptoglobina, una proteina della fase acuta in grado di legare l’emoglobina libera ed
evitare che quest’ultima venga ultrafiltrata dal glomerulo. Qualora tutta l’aptoglobina fosse impiegata
nell’attività di recupero ([aptoglobina] = 100-150 mg/dL) e la condizione di emolisi persistesse, allora avremo
emoglobinuria; pertanto, il riscontro di emoglobina nelle urine è indice di una anemia emolitica grave che
ha superato la capacità di recupero dell’aptoglobina.
[Da notare come si possa avere emoglobinuria anche nei casi di sanguinamento delle vie urinarie, che prevede
l’eliminazione di globuli rossi con le urine; in questa situazione gli eritrociti si trovano in una condizione di
osmolarità diversa rispetto a quella del sangue periferico e frequentemente vanno incontro a lisi. In questo
caso l’emoglobinuria si associa ai globuli rossi lisati nelle vie urinarie e non ad anemia emolitica.
Concludendo, l’emoglobinuria va interpretata come indice di una crisi emolitica in assenza di ematuria, se
presente ematuria va associata a emorragia delle vie urinarie.]
La ricerca dell’emoglobina nelle urine è quindi un test che non serve per valutare la funzionalità renale, ma
è utile per valutare eventuali condizioni anemiche patologiche.
Bilirubina e urobilinogeno
Si valutano per studiare il metabolismo della bilirubina, quindi eventualmente alterazioni della funzionalità
epatica. È fisiologico ritrovare tracce di urobilinogeno nelle urine e la bilirubina che si ritrova è solo quella
diretta (coniugata). Queste due considerazioni aiutano ad abbinare l’esame delle urine con l’esame del
sangue e col colore delle feci.
La bilirubina non coniugata (indiretta) è insolubile in acqua e non passa il filtro glomerulare, mentre la
bilirubina coniugata (diretta) è idrosolubile e può quindi passare il filtro glomerulare; in condizioni normali
la bilirubina circolante è per la maggior parte nella forma non coniugata e, pertanto, non si riscontra nelle
urine. Quando aumenta la bilirubina diretta (itteri epatocellulare e ostruttivo) si avrà bilirubinemia, urine di
colore scuro e a seconda dell’entità del danno si potranno avere feci acoliche o ipocoliche. Invece negli itteri
in cui aumenta la bilirubina indiretta (ittero emolitico o associato a deficit di coniugazione con l’acido
glucuronico), nelle urine non si trova perché non passa il filtro glomerulare, nemmeno aumentando la
concentrazione di molte volte.
L’urobilinogeno si forma nell’intestino per riduzione della bilirubina libera: per lo più viene eliminato con le
feci, mentre una piccola quota viene riassorbita ed eliminata poi con la bile e, in minima parte, attraverso il
rene (0,5-1,5 mg/24 ore); pertanto, in condizioni normali l’urobilinogeno è presente nelle urine solo in tracce.
Nitriti
Sono molecole che l’organismo fisiologicamente non produce, per cui la loro presenza nelle urine è indice
di un’infezione delle vie urinarie. Il nostro metabolismo, infatti, fisiologicamente produce nitrati (partendo
dalle verdure), che verranno quindi convertiti in nitriti da eventuali batterî (Escherichia coli, Aerobacter,
Proteus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococci, Staphylococcii ed altre) presenti a livello delle vie urinarie.
253
Patologia clinica
È importante ricordare che la positività al test è affidabile e sempre associata a un’infezione in atto, mentre
la negatività non consente di escludere la presenza di infezioni delle vie urinarie.
Si tratta quindi di un indicatore che non dà mai falsi positivi, ma può dare falsi negativi in caso di:
o l’esistenza di batterî incapaci di ridurre i nitrati in nitriti (si tratta di pochissimi batterî);
o elevato flusso urinario che non dà il tempo ai batterî di produrre una quantità tale di nitriti
determinabile laboratoristicamente.
Le esterasi leucocitarie sono enzimi contenuti nei granuli azzurrofili dei granulociti neutrofili. Quando c’è
un’infezione da queste cellule vengono liberate le esterasi leucocitarie, le quali sono quindi un ottimo
indicatore indiretto di infezione delle vie urinarie.
La caratteristica principale dell’esame delle urine è la sua aspecificità. Per cui se si ha un sospetto di
insufficienza renale non si parte dall’esame delle urine perché troppo generico.
P7.2.3 Esame microscopico del sedimento urinario

Il sedimento urinario è ciò che rimane nel campione di urina in seguito a una centrifugazione. Il sedimento
viene successivamente risospeso in due gocce di urina e viene esaminato al microscopio e viene osservato
come tale, senza colorazione.
Questa procedura necessita della presenza di un operatore. In realtà, negli ultimi anni, anche questa parte
dell’esame delle urine si sta automatizzando, siamo in una fase di transizione.
In condizioni fisiologiche il sedimento urinario è scarsissimo: possiamo trovare poche cellule epiteliali isolate,
oppure sostanze minerali amorfe od organizzate in cristalli.
Parametri fisiologici del sedimento urinario
Cellule epiteliali isolate

Le cellule vengono dallo sfaldamento delle vie urinarie e in base alla loro
morfologia si può desumere se sono:
• cellule dei tubuli renali (cellule molto piccole che sembrano leucociti,
con un nucleo grande e ovale);
• cellule degli epiteli transizionali delle basse vie urinarie (più irregolari
come dimensioni e con un nucleo proporzionalmente più piccolo);
• cellule epiteliali squamose (ancora più grandi e ondulate, più irregolari
come dimensioni e con un nucleo molto piccolo). Sono cellule che si
possono trovare a causa dello sfaldamento delle vie urinarie. Vengono
eliminate con le urine esattamente come le cellule dell’epitelio
intestinale vengono eliminate con le feci.
Cristalli
I cristalli sono delle concrezioni che si formano nelle urine,
influenzate sia dalla dieta che dal pH. In ambiente acido
tendono a formarsi cristalli di acido urico, urati amorfi e
ossalato di calcio. In ambiente basico i cristalli più frequenti
sono i cristalli di fosfato triplo (ammonio, magnesio e
calcio) e fosfati amorfi.
È importante ricordare che la loro presenza nelle urine è
fisiologica e non ha nessun significato patologico, infatti
molto spesso non vengono nemmeno citati nei referti
(trovare o non trovare un cristallo non ha nessun
significato dal punto di vista clinico).
254
Patologia clinica
[Se la lettura è a carico di una macchina, sicuramente la

presenza di cristalli non è nemmeno citata nei referti e non
crea confusione; il problema emerge nel caso in cui il referto è
elaborato da un laboratorista in modo discorsivo: l’operatore,
annoiato dalla ripetitività dell’attività svolta, tende ad
annotare qualsiasi cosa vede, cristalli compresi, seppur inutili
dal punto di vista diagnostico. Siccome il referto viene molto
spesso intercettato dal paziente, la presenza di queste
componenti suscita panico: bisogna saper trasmettere al
paziente che la presenza di cristalli non ha valore patologico!]
Ciò che permette di differenziare la composizione di un
cristallo da un altro è la morfologia: ad esempio i cristalli di
ossalato di calcio hanno una forma detta a “retro di busta”
oppure i cristalli di acido urico sono “a foglia d’acero”, mentre
i cristalli di fosfato di calcio hanno aspetto aghiforme; i cristalli
di fosfato triplo (di calcio, ammonio e magnesio) sono detti a
“tetto di bara”.
C’è una sola applicazione di questo parametro in patologia.

L’applicazione è alla litiasi delle vie urinarie, una condizione
frequente, caratterizzata da formazione di calcoli nelle vie
urinarie. Spesso dà dolore, coliche renali, ed è quindi
importante gestirla con appropriatezza. I calcoli renali si
trattano in base alla loro composizione: se la composizione è
di un certo tipo, allora si agirà sulla dieta; se è di un altro tipo,
si può ricorrere alla frantumazione del calcolo, mettendo il
paziente in una vasca e usando ultrasuoni che abbiano una
lunghezza d’onda idonea per frammentarli; in altri casi ancora
bisogna intervenire chirurgicamente. La terapia della litiasi
delle vie urinarie è molto variegata. In questi casi la presenza
di un cristallo aiuta a capire la composizione del calcolo. Non
è detto che se un paziente ha un cristallo rischia di avere un
calcolo, ma se ha un calcolo per altri motivi, il sedimento
urinario può aiutare a capirne la composizione e questa è
l’unica raccomandazione di applicazione delle conoscenze sui
cristalli. In generale la presenza di un calcolo non ha nessun
rapporto con il rischio di sviluppare patologie.
Parametri patologici del sedimento urinario

I parametri del sedimento urinario che costituiscono reperti patologici sono:
• cilindri;
• muco;
• globuli rossi;
• globuli bianchi;
• batterî
• parassiti.
Cilindri
I cilindri sono formazioni che riproducono a stampo il lume dei tubuli distali dei dotti collettori, quindi sono
proteine che precipitano nel lume tubulare, o perché sono particolarmente concentrate (e quindi quando c’è
255
Patologia clinica
danno glomerulare), o perché c’è una stasi della preurina in particolari condizioni di pH. Si distinguono in
cilindri ialini (amorfi), costituiti solo dalla matrice proteica, e cilindri cellulari, a seconda delle cellule che
contengono (epiteliali, ematiche, leucocitarie). I cilindri granulosi sono costituiti da proteine e detriti di
emazie o cristalli. Per l’osservazione si mette una goccia di urina, si sceglie a piacere un colorante e si osserva
il campione. Nel sedimento urinario si possono osservare cristalli amorfi e sporcizia (perché non si è nelle
condizioni dei preparati istologici); si possono vedere cilindri contenenti cellule polimorfonucleate, o cilindri
ematici contenenti globuli rossi. Bisogna vedere il motivo per cui le proteine sono precipitate (danno
glomerulare, stasi di urina, pH alterato, ittero...) guardando quindi la causa che ha determinato la formazione
del cilindro. La loro natura molecolare indica che sono reperti frequenti in caso di patologie glomerulari:
l’alta concentrazione proteica nell’ultrafiltrato, unita a disidratazione, scarso flusso urinario e particolari
valori di pH, può favorirne infatti la formazione.
Muco
I cilindroidi sono invece cilindri costituiti da muco. Il muco nelle vie urinarie ha lo stesso significato del muco
nelle vie respiratorie. È l’espressione di uno stimolo irritativo; quando c’è una infiammazione dell’albero delle
vie respiratorie le cellule caliciformi mucipare producono muco a scopo protettivo. Lo stesso avviene nelle
vie urinarie. I cilindroidi di muco presenti nel sedimento urinario indicano un’irritazione a carico delle vie
urinarie, che deve essere indagata.
Globuli rossi
È importante ricordare la differenza tra emoglobinuria ed ematuria: la prima è presenza nelle urine di
emoglobina che può indicare patologie emolitiche.
L’elemento su cui riporre maggiormente l’attenzione, perché talvolta viene non adeguatamente considerato,
è l’ematuria. L’ematuria indica la presenza di sangue nelle urine, in particolare globuli rossi, dovuta a
emorragia.
L’ematuria macroscopica è quella che conferisce alle urine il colore rosso, quella che si vede e che preoccupa
il paziente. Il colore delle urine (e delle feci) ha un impatto importante, solitamente viene notificato subito al
medico di base.
L’ematuria microscopica invece si rileva solo al microscopio ed è divisa in macroematuria o microematuria
a seconda del numero di globuli rossi identificati al microscopio.
Questa è una raffinata classificazione quantitativa: macroscopica e microscopica, macroematuria (globuli
rossi distribuiti a tappeto) e microematuria (basso numero di globuli rossi). È importante tenere conto che
questa classificazione non ha significato qualitativo poiché l’ematuria è potenzialmente pericolosa
indipendentemente dall’entità. Anzi, paradossalmente una macroematuria può essere espressione di uno
sforzo fisico, di una perdita di massa particolarmente impegnativa o essere conseguenza di un trauma, quindi
essere transitoria. Ciò che può preoccupare di più è una microematuria consistente; anche pochi globuli rossi
nel campo microscopico (visti dall’operatore o valutati automaticamente), se persistenti e quindi presenti
256
Patologia clinica
nell’esame delle urine, devono preoccupare. Non si può dimettere un paziente con ematuria fintanto che
non si è capita la causa e auspicabilmente si è risolto il problema. Quindi è necessario porre attenzione e
adottare un percorso diagnostico efficace, utilizzando diagnostica per immagini, altri esami di laboratorio,
ecc. Ci può essere per esempio una neoplasia del tratto urinario in cui i vasi danno un piccolo sanguinamento,
che quindi va identificata e ne va specificata la localizzazione. Tra tutti gli esami delle urine quello nella pratica
clinica che talvolta viene sottovalutato è questo, anche se non si dovrebbe, soprattutto se si tratta di una
microematuria. Può aiutare a diagnosticare precocemente una patologia che potrà dare segni di sé dopo
qualche anno, in uno stadio più avanzato.
In caso di ematuria classica il globulo rosso si presenta non colorato e quindi traslucente, questi raramente
si presentano con la loro tipica forma a disco biconcavo, ma molto più spesso sono rigonfî (urine ipotoniche)
o disidratati (urine ipertoniche): la loro morfologia dipende quindi dall’osmolarità dell’urina.
L’ematuria ha questa caratteristica: è molto sensibile, ma poco specifica. Molto sensibile perché si è in grado
di identificare anche una bassa concentrazione di globuli rossi nelle urine; poco specifica perché in realtà non
dice nulla di più se non che ci potrebbe essere un’emorragia nelle vie urinarie. Ci può essere una molteplicità
di cause che devono essere indagate che possono essere alla base di una potenziale ematuria.
Due condizioni invece che possono rappresentare una contaminazione: sono le mestruazioni (l’ematuria in
una donna durante il periodo mestruale non deve preoccupare, per evitarla si possono fare le analisi al di
fuori di questo periodo) oppure un paziente che è stato cateterizzato (anche dopo 15-20 giorni nel paziente
ci possono essere tracce di globuli rossi); quindi in questi due casi l’ematuria non deve preoccupare;
dev’essere ripetuto l’esame delle urine per delle conferme, per vedere se si tratta di ematurie da
contaminazione.
In teoria le urine non dovrebbero contenere eritrociti; tuttavia, qualche globulo rosso può essere talvolta
riscontrato anche nelle urine di soggetti in buono stato di salute. Le principali cause di ematuria sono
rappresentate da: glomerulopatie, tumori delle vie urinarie, traumi renali, litiasi delle vie urinarie, infarti
renali, necrosi tubulare acuta, infezioni delle alte e basse vie urinarie e stress fisici.
Leucociti, batterî, parassiti

Non devono essere presenti nelle urine, che dovrebbero essere sterili. In realtà un po’ di batterî si possono
trovare, ma teoricamente non ci dovrebbero essere.
La leucocituria è indice di un’infezione delle vie urinarie conseguente alle reazioni immunitarie. Quando i
leucociti sono particolarmente numerosi le urine assumono un colore biancastro e un aspetto torbido; si usa
il termine piuria per indicare la presenza di pus nelle urine, espressione dell’azione dei leucociti a seguito di
un’infezione o risposta leucocitaria importante.
Alcuni batterî hanno dimensioni compatibili con la risoluzione di un microscopio, e quindi si possono vedere.
Se si trovassero dei batteri nelle urine (batteriuria), bisognerebbe fare subito un approfondimento
microbiologico, per capire il ceppo ed eventualmente rilevare antibiotico-resistenze ecc. Si definisce
patologica una batteriuria con > 105 CFU/mL di urina.
Si possono trovare anche microrganismi, quali funghi (Candida) e parassiti (Trichomonas vaginalis,
Trichomonas hominis), visibili anch’essi al microscopio.
257
Patologia clinica
Il colore del preparato non dà nessuna indicazione, dipende semplicemente dal colorante scelto
dall’operatore che compie l’analisi.
P7.2.4 Esempî di esami

L’esame delle urine è semplice, ma è molto importante. Tutti questi indicatori vanno opportunamente
memorizzati e compresi. Fanno parte della routine della pratica clinica. Con l’emocromo e l’esame delle urine
hanno a che fare tutti i medici, indipendentemente dalla specializzazione. È bene acquisire confidenza con
questo tipo di analisi e risultati.
Primo esempio
Esame delle urine standard,
in cui sono riportati colore
e aspetto (refertati in
maniera discorsiva). Sono
riportati anche tutti gli altri
indicatori (glucosio,
proteine, emoglobina,
corpi chetonici, bilirubina,
urobilinogeno, nitriti, peso
specifico, leucociti, cellule
epiteliali). Nella sezione
“metodo” può essere
riportata la dicitura
citometria a flusso: questo indica che il sedimento viene letto da una macchina, un citometro a flusso. Non
ci sarà una valutazione discorsiva, ma si troverà il numero di leucociti e cellule epiteliali contati dalla
macchina. Questa è una fase di transizione: in qualche laboratorio si guarda ancora al microscopio il
sedimento, mentre in altri si usano macchine; questa seconda componente è economicamente più
vantaggiosa e probabilmente in futuro sarà tutto automatizzato. La situazione riportata in questo esempio è
di piena normalità. L’esame delle urine non richiede grandi capacità interpretative; è facile capire se c’è
qualcosa che non va guardando i valori di riferimento. Tutti gli indicatori devono essere assenti; si può solo
trovare qualche traccia di urobilinogeno. Il pH deve rientrare nell’intervallo di valori sopracitato e il resto
deve essere tutto pari a zero. Fare una diagnosi a partire dall’esame delle urine è facile.
258
Patologia clinica
Secondo esempio
In questo esame si nota
l’eccessivo valore di
glucosio, che indica
diabete; osservando il
peso specifico (normale)
si capisce che per
espellere l’enorme
quantità di glucosio si avrà
sicuramente poliuria. La
produzione dei corpi
chetonici giustifica
l’abbassamento del pH,
indice di acidosi
metabolica.
Se c’è un aumento di
glucosio (5000 mg/dL) si può pensare a un diabete all’esordio; di tipo I se c’è un aumento di corpi chetonici.
Il pH è basso a causa dei corpi chetonici che danno acidosi.
Si può trovare eventualmente anche una refertazione discorsiva: “rare cellule delle basse vie urinarie, viste
al microscopio”.
Se c’è aumento di bilirubina si sa che questa sarà di tipo diretto. Si scartano gli itteri da bilirubinemia indiretta
e ci si concentra sulla tipologia epatocellulare e sulla ostruttiva, con altri esami di laboratorio.
Terzo esempio
Osservando questo esame, si può
escludere l’ittero a iperbilirubinemia
indiretta, perché in tal caso sarebbe
assente bilirubina nelle urine. Il valore di
urobilinogeno esclude l’ostruzione
delle vie biliari (l’urobilinogeno non
dovrebbe esserci). In caso di ittero
epatocellulare invece si interrompe il
ricircolo entero-epatico di
urobilinogeno ed esso si ritrova nelle
urine. Questo ragionamento non è
sufficiente per fare diagnosi, però dà
delle indicazioni cliniche importanti per
la scelta degli esami di secondo livello. Si osserva anche che il valore del peso specifico è inferiore a quello
del filtrato glomerulare (1.007): in questo caso non desta preoccupazione poiché in soggetti con
iperbilirubinemia combinata il rischio è il danneggiamento delle cellule tubulari da parte della bilirubina, per
cui si interviene con l’iperidratazione del paziente.
Quarto esempio
Aumento di emoglobina, ma anche di globuli rossi. L’emoglobinuria è indice di una emolisi. C’è una trappola:
si potrebbe pensare a una malattia ematologica, ma in questo caso l’emoglobina deriva dalla lisi dei globuli
rossi (lisati a causa dell’osmolarità delle urine: questo avviene se c’è una ematuria importante). L’osmolarità
delle urine non corrisponde a quella del sangue: i globuli rossi si lisano perché sono in un ambiente che non
è il loro. Quindi l’emoglobinuria, in presenza di ematuria, non deve creare problemi di interpretazione.
259
Patologia clinica
Resta da capire perché c’è

sangue nelle urine, ma bisogna
ricordare che l’emoglobina
deriva dalla lisi dei globuli rossi
già nelle urine. L’emoglobinuria
diventa invece rilevante in
assenza di ematuria, caso in cui
si pensa a una emolisi. Questo
è il caso di più difficile
interpretazione che si possa
riscontrare, per il resto la
gestione di un esame delle
urine è estremamente semplice.
P7.2.5 Strisce reattive

Esistono strisce reattive che permettono di fare l’esame delle urine in maniera autonoma, senza coinvolgere
il laboratorio. Esse contengono tanti quadratini che corrispondono a tutti i parametri sopra elencati (nitriti,
urobilinogeno, proteine, pH, globuli rossi, corpi chetonici, bilirubina, glucosio, peso specifico...); tutti i
parametri vengono valutati in maniera semiquantitativa con queste strisce. In base alla modificazione del
colore dei quadratini si può capire se c’è un’alterazione di un certo
parametro, capendo anche se si allontana poco o molto dal valore di
riferimento in maniera semi quantitativa (es. +1, +2, +3, +4).
L’esame viene eseguito prendendo il campione di urina, immergendo
il bastoncino, aspettando un minuto e infine confrontando il colore del
quadratino con una scala colorimetrica che è presente all’esterno della
confezione; non bisogna toccare a mani nude la confezione, bisogna
usare sempre i guanti. Questo delle strisce è un sistema molto veloce
che consente di fare valutazioni, non con la precisione del laboratorio,
ma comunque risolvendo eventuali dubbî sulle urine in maniera molto
veloce. Hanno buona affidabilità e si possono acquistare in farmacia
per uso personale, quindi sono commercializzate.
P7.3 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE EMATICA DI COMPOSTI AZOTATI

NON PROTEICI (AZOTEMIA)
Se si vuole valutare la funzionalità renale perché vi è un problema specifico (es. insufficienza renale), l’esame
delle urine aiuta solo parzialmente, molto più utile è l’esame dell’indice di funzionalità renale (ovvero la
concentrazione ematica di composti azotati non proteici): questo esame non si fa sulle urine, bensì su
campione di sangue periferico.
Il rene elimina queste tre sostanze:

• urea;
• creatinina;
• acido urico.
Esse hanno caratteristiche e vie metaboliche diverse tra loro, ma hanno in comune il fatto di essere eliminate
dal rene, quindi se aumenta la concentrazione di tutte e tre contemporaneamente nel sangue periferico vuol
dire che il rene non riesce a gestirle. Si considerano contemporaneamente perché qualora vi sia un aumento
di concentrazione di una singola sostanza, questo può essere dovuto a una sua iperproduzione, ma se
260
Patologia clinica
l’aumento riguarda tutte e tre, allora è un indice preciso di malfunzionamento renale. Il termine usato nella
pratica clinica per indicarle tutte e tre è azotemia. In realtà è un termine improprio: di per sé azotemia
significa “concentrazione di azoto nel sangue”, ma si fa riferimento all’azotemia dopo l’allontanamento delle
proteine.
P7.3.1 Urea e uremia

L’urea è il prodotto di fissazione della ammoniaca che deriva dalla
transaminazione e dalla deaminazione ossidativa degli aminoacidi,
unità costitutive delle proteine; è prodotta a livello epatico tramite il
ciclo dell’urea, va nel sangue periferico, arriva al rene ed è eliminata
con le urine. Tale catabolismo però può essere associato alla dieta: una
dieta particolarmente ricca di carne può determinare un aumento
dell’urea, per questo, oltre a essere indice di funzionalità renale, può
essere associata a una dieta particolare.
In soggetti con un normale apporto proteico giornaliero nella
alimentazione (1 g/kg di peso) i valori ematici di urea (uremia) sono
compresi tra 20 e 45 mg/dL.
Alternativamente alla concentrazione ematica dell’urea, nella diagnostica di laboratorio viene più spesso
determinata la concentrazione ematica dell’azoto ureico (BUN: Blood Urea Nitrogen). Dato che nella
molecola di urea (PM 60) sono contenuti due atomi di azoto (PA 14), il rapporto urea/azoto ureico
corrisponde a 60/28, cioè a 2,14; pertanto, in soggetti con un normale apporto proteico giornaliero nell’
alimentazione (1g/kg di peso) i valori ematici di azoto ureico sono compresi tra 9 e 20 mg/dL.
L’uremia può aumentare sia quando il rene non funziona, sia in un soggetto che ha un’alimentazione molto
ricca di carne e di conseguenza di proteine; questa è la ragione per cui all’uremia si associa la misurazione di
un altro parametro completamente diverso: la creatinina.
P7.3.2 Creatinina e creatininemia

La creatina si forma a livello epatico dal metabolismo di tre amminoacidi (arginina, glicina e metionina), si
porta al muscolo dove viene fosforilata con un legame altamente energetico, quindi si forma la fosfocreatina,
un’importante riserva energetica per il muscolo (tant’è che può essere utilizzata come sostanza dopante). La
creatinina è il prodotto finale del catabolismo muscolare della fosfocreatina e il rene è l’organo preposto alla
sua eliminazione, quindi se quest’ultimo non funziona, la creatininemia aumenta (vr. 0,84-1,21 mg/dL).
Ci sono due differenze sostanziali rispetto all’urea:
• l’urea ad alte concentrazioni diventa tossica, la creatinina invece non diventa mai pericolosa, anche
se deve comunque essere eliminata;
• la produzione di creatinina è esclusivamente endogena, quindi la sua concentrazione non è
influenzata dall’apporto alimentare, mentre l’uremia è legata all’assunzione di proteine.
La creatininemia può aumentare dopo un certo lavoro muscolare (si fa riferimento a livelli professionali, non
a un esercizio fisico svolto due volte a settimana).
Tuttavia, qualora considerassimo un soggetto che mangia molta carne e svolge un intenso esercizio fisico,
potrebbe presentare valori aumentati sia di uremia che di creatininemia; quindi, viene aggiunto un terzo
parametro: l’acido urico.
261
Patologia clinica
P7.3.3 Acido urico e uricemia

L’acido urico è il prodotto terminale del catabolismo purinico nell’uomo. La sintesi di acido urico, catalizzata
dall’enzima xantina ossidasi, si compie soprattutto nel fegato. Immesso nel sangue, dove per il 96% si trova
sotto forma di urato monosodico non legato a proteine, arriva ai reni dove viene filtrato, parzialmente
riassorbito e, di nuovo, parzialmente secreto prima di essere definitivamente eliminato con l’urina. La
concentrazione ematica di acido urico corrisponde a 2,5-7 mg/dL. L’acido urico è poco solubile in acqua; se,
nelle urine, raggiunge elevate concentrazioni, precipita rapidamente sotto forma di cristalli di urato,
determinando la formazione di calcoli renali. Similmente, in pazienti con alti livelli di acido urico nel sangue
(uricemia), cristalli di urato si depositano nei tessuti molli, in modo particolare nelle articolazioni: ciò
determina una sindrome clinica denominata gotta. Al di fuori della gotta, se l’acido urico aumenta con un
aumento anche di creatinina e urea si ha sicuramente insufficienza renale.
Se aumentano tutte e tre contemporaneamente non può che essere a causa di danno renale, quindi questo
è il più importante esame di valutazione dell’indice di funzionalità renale che viene applicato
quotidianamente nella pratica clinica su di un campione di sangue periferico.
P7.4 CLEARANCE RENALI

Esistono poi altri esami, non di routine, che vengono eseguiti in reparti specialistici (nefrologia, urologia,
medicina interna...); si tratta di metodiche più raffinate e complicate, dalla maggiore sensibilità, che di
conseguenza forniscono risultati più precisi.
Tra questi vi è la valutazione della clearance: si definisce clearance (to clear: depurare) di una sostanza la
quantità di plasma che viene depurata di quella sostanza nell’unità di tempo: il calcolo della clearance si basa
sull’assunto che ogni sostanza rimossa dal plasma si ritrova simultaneamente nelle urine; pertanto, la
concentrazione nel plasma di una certa sostanza (P), moltiplicata per il volume di sangue depurato di essa in
1 minuto (vale a dire il valore della clearance - C) deve essere uguale alla concentrazione della stessa sostanza
nelle urine (U) moltiplicata per la quantità di urina eliminata nell’unità di tempo (V).
Se si prende in considerazione una sostanza eliminata dal rene, la clearance diventa indice della funzionalità
renale.
Quindi sarà sufficiente applicare la formula usando come concentrazioni quelle di una sostanza adeguata allo
scopo.
Le prove di clearance vengono utilizzate principalmente per la valutazione del filtrato glomerulare (e per
diagnosticare eventuali glomerulopatie), cioè del volume di preurina prodotta dal glomerulo nell’unità di
tempo per ultrafiltrazione del sangue circolante. La sostanza ideale da utilizzare a questo scopo dovrebbe
presentare le seguenti caratteristiche:
• essere filtrata completamente dal glomerulo;
• non essere né riassorbita né secreta dal tubulo;
• non legarsi a proteine plasmatiche;
• non essere metabolizzata dall’organismo;
• non essere eliminate attraverso altri emuntori o dispersa nei tessuti;
• essere priva di tossicità e ben tollerata;
262
Patologia clinica
• poter essere dosata con facilità e sicurezza;

Sulla base di questi requisiti si possono usare due sostanze:
• creatinina (endogena): non è perfetta perché viene parzialmente secreta, quindi in base alle
condizioni ottimali non è al 100% adatta, i “puristi” sostengono che questa non dovrebbe essere
utilizzata, ma in laboratorio si fa un errore analitico che controbilancia questa caratteristica di
secrezione;
• inulina (esogena): non essendo normalmente presente nell’organismo deve essere iniettata nel
paziente, bisogna attendere il tempo che si distribuisca in maniera omogenea nell’organismo e poi
effettuarne la misurazione. Si tratta quindi di un procedimento più complesso, che può fare ritenere
accettabile la piccola approssimazione operata sulla creatinina.
Ricapitolando, la sostanza che meglio risponde ai suddetti requisiti è l’inulina, polisaccaride esogeno
costituito prevalentemente da unità di D-fruttosio (PM 5.000): l’inulina viene completamente filtrata dal
glomerulo ed eliminata con le urine senza essere né riassorbita né secreta dal tubulo; pertanto, la sua
clearance corrisponde esattamente alla quantità di liquido filtrato dai glomeruli nell’unità di tempo. Per
comodità di esecuzione, nella pratica clinica si ricorre più spesso alla creatinina, sostanza endogena che
presenta però il limite di essere parzialmente secreta dalle cellule del tubulo renale, soprattutto quando i
valori ematici si alzano per un deficit di filtrazione; tale limite viene comunque controbilanciato da un errore
tecnico relativo alla metodica utilizzata per la determinazione della creatinina che tende a sovrastimare la
concentrazione di creatinina sierica rispetto a quella urinaria.
P7.4.1 Clearance della creatinina

Per calcolare la clearance della creatinina in un paziente servono tre dati:
• concentrazione urinaria: ottenibile dal laboratorio tramite valutazione di un campione di urina;
• concentrazione plasmatica: ottenibile dal laboratorio tramite valutazione di un campione di sangue
periferico;
• flusso urinario: valutazione clinica, bisogna calcolare quanta urina produce il paziente nell’unità di
tempo, per farlo si chiede al paziente di svuotare completamente la vescica, dopodiché si aspettano
un paio di ore e si invita nuovamente lo stesso a svolgere la stessa operazione (spontaneamente o
con un catetere), questa volta raccogliendo il volume di urine, è così possibile ricavare il flusso
urinario ovvero la quantità di urine prodotte nell’unità di tempo (2 h).
La creatininemia è più semplice da ottenere, ma le prove di clearance
sono più sensibili (i valori di clearance si modificano prima di quelli di
creatininemia): schema esplicativo à la clearance della creatinina è 110
(vr), e man mano che il rene perde la sua funzionalità diminuisce; solo a
circa 40 comincia ad aumentare la creatininemia, valore alla quale si ha
già una capacità di filtrazione glomerulare dimezzata. Ciò dimostra che le
prove di clearance esogene sono più informative, ma sono più
complicate; occorre quindi fare un bilancio ogni volta, per determinare
quale esame effettuare per ciascun paziente.
Riepilogando, per valutare la funzionalità

glomerulare si può usare canonicamente la clearance
dell’inulina, più rutinariamente quella della creatinina.
Esempio: creatinina nelle urine = 59 mg/dL;
flusso urinario = 2,16 ml/min;
creatinina nel plasma = 1,2 mg/dL.
Per calcolare il valore di clearance è sufficiente applicare
la formula à Cc=59 x 2,16: 1,2 = 106, 2 mL/min
263
Patologia clinica
Questo valore corrisponde ai mL di plasma che il rene riesce a depurare

dalla creatinina nell’unità di tempo.
Quindi mentre l’azotemia nei pazienti con insufficienza renale aumenta,
la clearance diminuisce, perché un rene che non funziona correttamente
riesce a depurare una minore quantità di sangue.
La valutazione della clearance deve essere rapportata alla superficie

corporea; i valori di riferimento (tra 70 e 135 mL/min per l’uomo e tra
70 e 120 mL/min per la donna) sono riferiti a un paziente con una
superficie corporea di 1,73 m2.
Questo valore è calcolabile sulla base di normogrammi facilmente
consultabili (tabulati di Dubois e Dubois) che mettono in relazione
l’altezza con il peso; permettono quindi di correggere la valutazione
qualora si stesse prendendo in considerazione un paziente obeso o ad
esempio in età pediatrica. È una particolarità, in quanto è uno dei pochi
esami di laboratorio che richiede una valutazione della superficie
corporea.
Cause di riduzione del filtrato glomerulare

[Dalle diapositive] Una riduzione del filtrato glomerulare può verificarsi in seguito a una:
• riduzione della portata renale plasmatica, che si verifica, ad esempio, nei casi di grave caduta della
pressione arteriosa in seguito a stati di shock, emorragie acute o disidratazione;
• riduzione della superficie filtrante dei glomeruli, che si verifica ad esempio in corso di
glomerulonefrite cronica, glomerulosclerosi diabetica, pielonefrite cronica.
P7.4.3 Determinazione della PRP (portata renale plasmatica)

[Dalle diapositive] La portata renale plasmatica (PRP) è data dalla quantità di plasma che circola attraverso
l’apparato escretorio renale nell’unità di tempo. Condizione basilare per la determinazione della PRP è
l’impiego di una sostanza che, in un solo passaggio attraverso il rene, venga completamente estratta dal
sangue (non importa se ad opera del tubulo o del glomerulo) e totalmente escreta con le urine; la clearance
di tale sostanza, vale a dire la quantità di plasma depurata dalla stessa nell’unità di tempo, corrisponderà al
volume di plasma che attraversa il rene nell’unità di tempo cioè, appunto, alla PRP. La sostanza che meglio
risponde ai suddetti requisiti è il sale sodico dell’acido para-ammino-ippurico (PAI), sostanza esogena che
viene eliminata dal sangue sia per filtrazione glomerulare sia per secrezione tubulare; una condizione
fondamentale per l’uso del PAI nella determinazione delle PRP è che la sua concentrazione ematica rimanga
sotto i 10 mg/mL: oltre questo valore, infatti, si supera sia la capacità di filtrazione glomerulare sia la capacità
di secrezione tubulare.
P7.5 PROVE FUNZIONALI PER TUBULOPATIE

La creatinina è la sostanza che permette di valutare la funzionalità del glomerulo, se si volessero invece usare
le prove di clearance per valutare la funzionalità del tubulo, ovvero la capacità dei reni di adattare
l’eliminazione urinaria a condizioni di sovraccarico o carenza d’acqua, la sostanza scelta dovrebbe essere o
completamente secreta o completamente riassorbita dallo stesso; un composto che risponde a questi
requisiti è il glucosio, quindi applicando al glucosio la formula di clearance indicata prima si potrebbe
potenzialmente valutare la funzionalità tubulare (attenzione, per fare questo tipo di valutazione
bisognerebbe prima accertarsi della funzionalità glomerulare a monte). In realtà nella pratica clinica vengono
utilizzate due strategie differenti:
264
Patologia clinica
• Prova di concentrazione: si opera una disidratazione volontaria del paziente non facendogli ingerire
liquidi per 12 ore: il paziente deve svuotare la vescica e consumare una cena priva di liquidi alle 18,
senza assumere altro alimento liquido o solido; alle 6, alle 8 e alle 10 della mattina successiva si
raccolgono tre campioni di urina: in condizioni di normale funzionalità tubulare, negli ultimi due
campioni, o almeno in uno di essi, il peso specifico deve superare 1,025; questo perché in una
condizione di carenza di liquidi ci si aspetterà un’urina molto concentrata dal peso specifico molto
alto. Se invece il peso specifico sarà normale, vorrà dire che il paziente non ha concentrato le urine
e quindi che il tubulo non ha funzionato correttamente. Questo è un indicatore meno raffinato di
quello della clearance del glucosio, ma usato spesso nella pratica.
• Prova della diluizione (prova inversa): al soggetto a digiuno dalla sera precedente si fa svuotare la
vescica e quindi si somministrano 1200 cL di acqua che devono essere bevuti in 30 minuti
(iperidratazione); nelle successive 4 ore, ogni 30 minuti si raccolgono separatamente le urine
formate: in condizioni di normale funzionalità tubulare, il peso specifico di almeno uno dei due primi
campioni deve scendere a un valore di 1,003; anche in questo caso, se le urine non sono diluite,
significa che il tubulo non ha funzionato. Questa metodica è meno utilizzata in quanto
frequentemente i pazienti che vi vengono sottoposti sono allettati e faticano a bere un quantitativo
di acqua così importante in soli 30 minuti, in più dare un carico d’acqua a un paziente con un
problema renale potrebbe causare un blocco renale e di conseguenza la cosiddetta “intossicazione
da acqua”.
Da un punto di vista teorico questi due esami sono equivalenti, ma il secondo è sconsigliato per i motivi
sopracitati: la scelta spetta comunque al medico in seguito alla sua personale valutazione.
265
Patologia clinica
266
PARTE III
BIOCHIMICA
CLINICA
Biochimica clinica
268
Biochimica clinica
B0. INTRODUZIONE ALLA BIOCHIMICA CLINICA

(prof. Morandi)
La medicina di laboratorio, che costituisce la base della cosiddetta “medicina personalizzata” o “medicina di
precisione”, studia i campioni biologici provenienti dall’uomo:
• in vitro: sangue, feci, urine, liquor (per patologie associate a SNC), liquido sinoviale, tessuti;
• in vivo: direttamente sull’uomo, tramite spettroscopia di risonanza magnetica nucleare.
In questi campioni biologici, in particolare, analizza quei parametri biologici e chimico-fisici che possono
fornire informazioni su processi fisiologici e patologici che avvengono a varî livelli di organizzazione
strutturale (sistemi, organi, tessuti...).
La medicina di laboratorio oggi ha un ruolo centrale nella realtà sanitaria, come strumento fondamentale
nell’ambito della diagnostica e non solo, e ciò è possibile grazie ai grandi progressi che si sono fatti negli anni
per quanto riguarda le tecniche utilizzate. Ad esempio, il sequenziamento genico è diventato talmente
preciso da permettere di sequenziare il genoma o il trascrittoma di una singola cellula in poco tempo (nei
primi anni ’00 era necessario isolare molte cellule per estrarre il genoma e sequenziarlo).
Si è stimato che la medicina di laboratorio incida solo per il 2% sul budget, pur essendo implicata nel 70%
delle decisioni mediche, in campo diagnostico, prognostico, terapeutico e di monitoraggio delle patologie. In
qualsiasi campo medico, quindi, è necessario saper interpretare dei risultati di laboratorio, per avere una
visione globale dei sintomi e della patologia.
I test biochimici sono fondamentali per la medicina moderna. La maggior parte dei test biochimici viene
eseguita sul sangue usando plasma o siero.
Il plasma è il costituente liquido del sangue, in cui è presente nella percentuale del 55% della massa totale: è
una soluzione acquosa, di colore giallo e di carattere colloidale, contenente proteine, glucidi, lipidi, sali, che
differisce dal siero per il contenuto di fibrinogeno; si usa spesso nelle trasfusioni invece del sangue intero.
Per molti (ma non tutti) i test biochimici sul sangue, il plasma e il siero sono intercambiabili. Un’eccezione
può essere la biopsia liquida (liquid biopsy) in cui è meglio utilizzare il plasma come materiale di partenza
piuttosto che siero. Durante la formazione del coagulo molti linfociti sono sottoposti a lisi e rilasciano il loro
DNA nel siero, cosa che non succede nel plasma. Se bisogna cercare dei biomarcatori (es. DNA circolante
tumorale con delle mutazioni) è molto meglio utilizzare il plasma, in quanto si ha meno DNA derivante dalle
cellule normali e quindi la concentrazione di DNA tumorale in proporzione è maggiore rispetto che nel siero,
dove c’è anche DNA derivante da cellule normali, come i linfociti che vanno incontro a lisi.
Molti degli altri test più specialistici sono limitati a più grandi laboratorî o centri specializzati che offrono un
servizio nazionale o regionale.
Nell'affrontare il gran numero di richieste di test di routine, i laboratorî di biochimica dipendono fortemente
dalla strumentazione automatizzata legata al sistema informatico di laboratorio. Un buon esempio dietro
l'angolo: LUM, Ospedale Maggiore che processa 22 mln di test/anno. I costi sono di 18 mln € per 1500 tipi di
test provenienti da S. Orsola, ISBN, Maggiore H, Imola, Rizzoli e altri ospedali della provincia.
269
Biochimica clinica
Approfondimento: Elizabeth Holmes e la “Theranos”

Episodio accaduto in California, nella Silicon Valley, riguardante una giovane imprenditrice statunitense,
Elizabeth Holmes. Holmes è la fondatrice ed ex amministratrice delegata di Theranos, una società ormai
scomparsa nota per le sue improbabili affermazioni di aver rivoluzionato gli esami del sangue usando
volumi sorprendentemente piccoli di sangue, ad esempio da una puntura sul dito. Il declino di Theranos
iniziò nel 2015, quando una serie di indagini giornalistiche e ispettive avevano sollevato dubbî sulle
affermazioni tecnologiche dell'azienda e la possibilità che Holmes avesse ingannato gli investitori e il
governo. Nel 2018 la US Securities and Exchange Commission accusò Theranos e la Holmes di ingannare
gli investitori con "ingenti frodi" attraverso affermazioni false o esagerate sull'accuratezza della sua
tecnologia di analisi del sangue; Holmes aveva liquidato le accuse pagando una multa di $ 500.000,
restituendo le azioni alla società, rinunciando al controllo di Theranos e vietando di assumere ruoli di
controllo in società per azioni per dieci anni. Nel giugno 2018, un gran giurì federale incriminò Holmes e
l'ex Chief Operating Officer di Theranos, Ramesh Balwani, su nove capi di frode e due capi di associazione
a delinquere finalizzata alla truffa a seguito della distribuzione ai consumatori di falsi risultati di esami del
sangue. Il "menù" di test di Theranos offriva più di 240 test, e solo una manciata sono stati fatti sul
macchinario Edison con bassa precisione.
270
Biochimica clinica
B1. I TEST DI LABORATORIO

(prof. Morandi)
B1.1 CICLO DI LUNDBERG

[Dalla dispensa vecchia]
Il processo “brain to brain loop”, o ciclo di
Lundberg, dall’ideatore George D. Lundberg,
descrive l’itinere che il medico clinico segue in
collaborazione col laboratorista per avere risultati
rapidi e accurati; infatti il referto di laboratorio
non è un semplice report di numeri, ma la
trasmissione di una serie di informazioni
biochimiche che risponde a precise motivazioni
cliniche e ha come scopo il miglioramento
dell’accuratezza della diagnosi e del trattamento
terapeutico, ossia dell’outcome (il risultato
dell’intervento medico dal punto di vista dei costi,
dell’efficacia dell’intervento sulla salute del
paziente e della stessa qualità di vita del
paziente).
Come espresso nello schema, il clinico, di fronte a
una serie di sintomi e segni individuati nel paziente, deve scegliere quali test di laboratorio richiedere; in base
alla richiesta avverrà poi la raccolta del campione, l’identificazione e il trasporto al laboratorio, e in seguito i
procedimenti di analisi specifici per ogni tipo di esame. Il medico di laboratorio referterà le analisi e le
presenterà al paziente e al medico clinico, che ne trarrà le informazioni ricercate.
Attualmente si sta cercando di centralizzare i laboratorî che eseguono i test, in modo da permettere una
sempre maggiore automazione e l’acquisto di strumentazioni sempre più all’avanguardia. L’automazione, in
particolare, garantisce maggiore standardizzazione, riproducibilità e attendibilità dei test eseguiti.
Questa tendenza all’automazione e alla centralizzazione ha sia buoni esempî, come il laboratorio LUM
(Laboratorio Unico Metropolitano) dell’ospedale Maggiore di Bologna, che ogni anno svolge 22 milioni di
test, di 1500 tipi differenti grazie a processi di automazione, sia pessimi esempî, come il Theranos Sample
Processing Unit, un tentativo fallimentare di miniaturizzare il procedimento di analisi, facendo centinaia di
test mediante un unico macchinario compatto, su microlitri di campione (solitamente i vacutainer dei
laboratori utilizzano 2-8 mL di campione); questo progetto ha riscontrato un enorme successo tra i
finanziatori, ma i risultati dei test si sono rivelati per la maggior parte inattendibili.
B1.1.1 Fasi del ciclo di Lundberg

Oggi si raggruppano le fasi del ciclo di Lundberg in tre macrofasi:
1. fase pre-analitica: prima dell'esecuzione del test (identificazione del paziente, valutazione della
richiesta delle analisi, prelievo e raccolta del materiale biologico, trasporto del campione al
laboratorio, accettazione del campione, preparazione del campione prima dell’esecuzione
dell’analisi);
2. fase analitica: si riferisce alle prestazioni effettive del test (esecuzione delle analisi, misura e calcolo
dei risultati);
3. fase post-analitica: implica la trasmissione dei risultati del test nella cartella clinica (validazione dei
risultati, analisi della loro coerenza, refertazione, invio del referto al medico richiedente).
L'introduzione di questo concetto ha portato a un sistema per identificare e classificare gli errori associati
alle prestazioni dei test di laboratorio. Gli errori si verificano raramente e questi possono essere suddivisi in
base alla fonte di errore:
271
Biochimica clinica
• pre-analitici: questi
sorgono prima del test vero
e proprio e possono
avvenire a livello clinico o di
laboratorio. La maggior
parte degli errori rientra in
questa categoria. Ad
esempio, l’utilizzo
dell’eparina come
anticoagulante è
fortemente sconsigliato
perché va a inibire la DNA
polimerasi che amplifica il
DNA, oppure fare un test di
pomeriggio piuttosto che di
mattina a digiuno, scambiare un’etichetta, sbagliare la tempistica del prelievo, ecc. questi errori sono
dovuti a mancanza di comunicazione tra gli operatori sanitari coinvolti nel processo. A volte si
prescrivono test in eccesso, aumentando solo il costo sanitario, senza avere un effettivo vantaggio
dal punto di vista dell’outcome, oppure test facilmente sostituibili con pratiche meno costose e
altrettanto efficaci;
• analitici: gli errori analitici di laboratorio sono rari: contaminazione del reagente, errori di pipettaggio
relativi a piccoli volumi di campioni, errori di calcolo;
• post-analitici: questi sono sempre più rari, ma includono, per esempio: errori di trascrizione durante
l'immissione dei risultati da un altro laboratorio nel computer manualmente, risultati mal compresi
quando questi vengono dettati telefonicamente al clinico, ecc.
I test biochimici sono per lo più discrezionali, ossia sono richiesti per:
• un fine diagnostico predefinito;
• lo screening di una patologia, senza ancora alcun indizio della sua presenza nell’individuo;
• definire il futuro rischio di una particolare patologia;
• definire la prognosi.
B1.1.2 Esempio: campione di tessuto in anatomia patologica

Nell’ambito dell’anatomia patologia un errore potrebbe
essere la cattiva conservazione dei tessuti. Di solito si
utilizza la formalina per fissare i tessuti, che è altamente
tossica, e l’elevata esposizione dei tessuti alla
formalina, anche per più giorni, può iperfissare il
tessuto e frammentarlo, rendendo il preparato non
utilizzabile per alcun tipo di test. La iperfissazione può
dare anche dei falsi positivi se si ricercano delle
mutazioni all’interno di quel tessuto. Per conservare
perfettamente gli acidi nucleici di un tessuto si
potrebbero sfruttare anche le basse temperature, che
inattivano le RNAsi.
L'intervallo di tempo tra l'intervento chirurgico e la
corretta fissazione del campione rimosso è definito
come "tempo di ischemia" ed è cruciale, poiché
l'ischemia consente l’attivazione di enzimi tissutali,
272
Biochimica clinica
autolisi e degradazione di proteine e acidi nucleici. Durante questo intervallo di tempo può verificarsi una
sostanziale degradazione dell'RNA. Il “tempo di ischemia” è attualmente suddiviso in “tempo di ischemia
calda” che si verifica durante l’operazione, dopo la legatura dell'afflusso di sangue fino alla rimozione del
campione dal corpo, e il "tempo di ischemia fredda". Il primo varia notevolmente (da pochi minuti fino a
ore), a seconda della complessità della procedura chirurgica, l'abilità del chirurgo, la modalità di intervento.
Il tessuto rimane vivo e reattivo, ma subirà un progressivo stress metabolico da ipossia.
Le modalità di trasferimento dei campioni chirurgici variano in base alla disposizione architettonica e alla
distanza tra sale chirurgiche e laboratorî di patologia. È pratica comune in molti ospedali immergere i
campioni di resezione chirurgica (o direttamente gli organi) in grandi contenitori pieni di formalina, che
vengono poi trasferiti al laboratorio di patologia a tempo debito, di solito una volta al giorno. Questa pratica
comporta dei problemi, poiché:
• i contenitori di plastica sono grandi e relativamente pesanti: possono verificarsi fuoriuscite;
• l'immersione dell'intero campione in formalina impedisce la raccolta di materiale fresco per la banca
dei tessuti; inoltre, la fissazione inizia, ma solo alla periferia;
• un ritardo nel trasferimento è in qualche modo giustificato dal fatto che “il tessuto è già in formalina”;
• gli infermieri chirurgici sono sempre più preoccupati per la potenziale tossicità e cancerogenicità
della formalina, poiché il fluido deve essere manipolato all’esterno della cappa;
• quando il contenitore arriva al laboratorio di patologia, l’apertura delle scatole e la manipolazione
del campione è la principale causa di diffusione dei fumi di formaldeide.
L'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul
Cancro ha classificato la formaldeide come
agente cancerogeno di classe 1. Un
collegamento tra formalina e sintomi respiratorî
sono stati riportati non solo nei lavoratori delle
fabbriche di fiammiferi, ma anche nei membri
del personale ospedaliero professionalmente
esposti a questa sostanza. Sono state presentate
prove statistiche per un possibile collegamento
tra esposizione alla formaldeide e neoplasie
linfo-emopoietiche, un'osservazione che
potrebbe adattarsi ai dati che riportano un
eccesso di decessi dovuti al cancro del sistema
linfatico ed ematopoietico tra i patologi
britannici.
Si utilizza anche la tecnica del sottovuoto:
quando il tessuto viene prelevato dal paziente
viene inserito in buste, messo sottovuoto e
mantenuto a freddo per conservare il tessuto e
prevenire l’autolisi. La sigillatura sottovuoto
(UVS) mediante rimozione dell'aria previene la
disidratazione e favorisce il raffreddamento, e
quest'ultimo è il principale fattore di
conservazione che blocca l'autolisi enzimatica.
In effetti, è stato dimostrato sperimentalmente
che il raffreddamento a 4 °C è più veloce nei
tessuti trattati con UVS. Inoltre, il
raffreddamento dei campioni sigillati può essere
accelerato con procedure specifiche. Ulteriori
vantaggi sono legati alla possibilità di
standardizzare i tempi di fissazione e di
273
Biochimica clinica
implementare la banca dei tessuti. In effetti, si può determinare l’ora di inizio della fissazione in formalina,
evitando così una fissazione eccessiva, che può influenzare l’immunofenotipizzazione del campione.
Questi tessuti non vengono analizzati solo da un punto di vista morfologico, ma si effettuano anche dei test
molecolari, cioè si estrae o il DNA o l’RNA per analizzare mutazioni presenti all’interno del tessuto tumorale,
per poi dare informazioni all’oncologo che deciderà la terapia corretta per il paziente con quel tipo di tumore.
B1.1.3 Interpretazione dei test clinici biochimici

[Dalle slide]
La maggior parte dei referti dei laboratorî di biochimica clinica contiene misure numeriche di concentrazione
o attività, espresse in unità di misura appropriate. Tipicamente, il risultato è interpretato in relazione a
intervalli di riferimento per l’analisi in questione.
L’intervallo di riferimento è determinato nella pratica misurando una serie di valori di riferimento su un
campione di popolazione, generalmente di individui sani. La natura della popolazione di riferimento
dovrebbe essere rilevata ogni volta che vengono rilevati gli intervalli, ma spesso la popolazione viene
considerata sana arbitrariamente. Anche gli intervalli di riferimento legati a età e sesso sono spesso difficili
da ottenere, necessitando di un gran numero di individui. Nella pratica, i donatori di sangue sono selezionati
molto spesso come la popolazione di riferimento più prontamente disponibile.
B1.2 VARIABILITÀ E STANDARDIZZAZIONE NEI TEST DI LABORATORIO

I risultati analitici sono soggetti a errori, non importa quanto sia buono il laboratorio e quanto abile sia
l'analista. Questi errori possono essere dovuti alla mancanza di precisione o possono essere dovuti a effetti
casuali. Due sono i concetti che definiscono i dati di laboratorio, ovvero l’accuratezza e la precisione.
Def. Per accuratezza si intende la valutazione della vicinanza di un valore di prova al valore atteso. Il
valore atteso può essere ottenuto da uno standard di riferimento noto. Un metodo accurato produrrà, in
media, risultati vicini al valore reale di ciò che viene misurato. Quindi è la possibilità di ottenere come risultato
un valore il più vicino possibile a quello atteso, ovviamente coi macchinarî a disposizione.
Def. La precisione è il grado di dispersione (come varianza, deviazione standard o coefficiente di

variazione) all'interno di una serie di misurazioni dello stesso campione testato in condizioni specificate.
Un metodo preciso produce risultati vicini (ma non necessariamente

vicino al valore vero) su analisi ripetute. Se più misurazioni sono
effettuata su un esemplare, la dispersione dei risultati sarà piccola per
un metodo preciso e grande per uno impreciso. L'analogia del
"bersaglio" è spesso usata per illustrare i diversi significati dei termini
accuratezza e precisione, e questo è illustrato di seguito. In alto a
sinistra si ha la condizione in cui il dato è preciso (le tre x sono
sovrapponibili l’un l’altra), ma non accurato (lontano dalla realtà del
paziente): la macchina è precisa (la riproducibilità è ottima), ma i valori
si discostano molto dal valore reale. In alto a destra abbiamo invece dati
accurati, quindi molto vicini al valore reale, ma imprecisi, perché c’è
variabilità. In basso a sinistra si ha la situazione peggiore, ovvero dati
imprecisi e poco accurati, mentre in basso a destra si ha la situazione ideale, con dati precisi e accurati, anche
se non sempre, soprattutto dal punto di vista tecnico, si ha la possibilità di raggiungere questa condizione.
274
Biochimica clinica
Per i dati che hanno una distribuzione gaussiana, come è quasi sempre nel caso di errori analitici, la forma
della curva è completamente definita dalla media e dalla SD
(deviazione standard), e queste caratteristiche sono tali che:
• circa il 67% dei risultati risiede nella media
dell'intervallo ± 1 SD;
• circa il 95% dei risultati risiede nella media
dell'intervallo ± 2 SD;
• oltre il 99% dei risultati rientra nella media
dell’intervallo ± 3 DS.
I medici devono spesso interpretare due o più serie di risultati
per la stessa analisi o gruppo di analisi eseguite in differenti
occasioni sullo stesso paziente. Una domanda importante è se un cambiamento analitico è dovuto
principalmente a imprecisioni di laboratorio o a un vero cambiamento nella condizione clinica del paziente.
Senza approfondire gli aspetti statistici di ciò, può essere applicata la seguente regola: se i risultati per analisi
eseguite su campioni prelevati in differenti occasioni, ma in condizioni identiche, differiscono per più di 2,8
volte la SD analitica, allora c'è una possibilità di oltre il 95% che un reale cambiamento nella concentrazione
della sostanza si sia verificata.
Fonti di variabilità individuale possono essere:

• dieta: le variazioni nella dieta possono influenzare i risultati di molti test, compreso il siero
[trigliceridi], la risposta ai test di tolleranza al glucosio e all'escrezione urinaria di calcio;
• ora del giorno: diversi costituenti del plasma mostrano una variazione diurna (variazione con l'ora
del giorno) o a ciclo sonno/veglia. Gli esempî includono ferro, ormone adrenocorticotropo (ACTH) e
cortisolo;
• postura;
• esercizio muscolare: l'esercizio recente, specialmente se vigoroso o non abituato, può aumentare
l’attività della creatina chinasi (CK);
• ciclo mestruale: diverse sostanze mostrano variazioni con la fase del ciclo. Gli esempî includono il
siero [ferro], e le concentrazioni sieriche delle gonadotropine ipofisarie, degli steroidi ovarici e dei
loro metaboliti, nonché le quantità di questi ormoni e dei loro metaboliti escreti nelle urine;
• droghe e farmaci.
Le differenze tra gli individui, come l’età, il sesso e l’etnia, possono influenzare le concentrazioni di analiti nel
sangue.
Quando si osservano i risultati, è necessario confrontare ciascun risultato con un insieme di risultati di una
popolazione di riferimento. Dovrebbe essere indicata la natura della popolazione di riferimento ogni volta
che vengono citati gli intervalli di riferimento, anche se di solito è una popolazione sana. Anche gli intervalli
di riferimento abbinati per età e sesso sono spesso difficili da ottenere, poiché c’è bisogno di un numero
abbastanza elevato di individui. Per interpretare adeguatamente i risultati sui pazienti, è necessario sapere:
• il range di riferimento per individui sani della fascia di età appropriata e dello stesso sesso;
• i valori da aspettarsi per i pazienti con la
malattia, o le malattie, in esame;
• la prevalenza della malattia, o delle malattie,
nella popolazione di appartenenza del paziente.
Il diagramma rappresenta le distribuzioni dei risultati
ottenuti con un test (a) che separa completamente le
persone sane da persone con una malattia senza
sovrapposizione tra le curve di distribuzione (es. un test
ideale con 100% di sensibilità e 100% specificità) e un
test (b) meno sensibile e meno specifico, in cui vi è
un'area di sovrapposizione tra le curve di distribuzione per persone sane e persone malate.
275
Biochimica clinica
B1.3 CARATTERISTICHE DI UN TEST DI LABORATORIO

Alcune variabili che definiscono l’efficacia e le caratteristiche di un test di laboratorio sono specificità,
sensibilità, valori predittivi, curve ROC e validazione clinica.
In questa tabella ci sono:
• veri positivi, cioè positivi al test
(che quindi hanno superato la
soglia prefissata) e che hanno la
malattia;
• falsi positivi, cioè positivi al test
ma sani;
• veri negativi, cioè negativi al test
e sani;
• falsi negativi, cioè negativi al test
ma malati.
Ma qual è la differenza tra specificità e sensibilità di un test?

Def. La sensibilità del test si riferisce all'efficacia del test di individuare le persone che hanno la
malattia in questione. Esso è espresso come percentuale di veri positivi in tutti gli individui che hanno una
malattia (tutti gli individui con malattia comprenderà i veri positivi (TP) e falsi negativi (FN)).
Sensibilità = TP/ (TP+ FN) × 100%
Def. La specificità del test è una misura della qualità del test fornendo un risultato negativo in assenza
di malattia. È espresso come percentuale dei veri negativi in tutti quelli senza la malattia (tutti gli individui
senza malattia comprenderà i veri negativi (TN) e i falsi positivi (FP).
Specificità= TN/ (TN+ FP) × 100%
Def. L'efficacia di un test può essere definita anche con il valore predittivo di un risultato positivo e
il valore predittivo di un risultato negativo.
Ci sono quindi altri due criterî per valutare l’affidabilità di un test:

Def. Valore predittivo positivo = percentuale di veri positivi tra i positivi totali, quindi la capacità del
test di dare risultati realmente positivi; in altre parole, se il risultato è positivo, esprime quale effettivamente
sia la probabilità che il paziente sia davvero malato.
Positive Predictive Value = TP / (TP+ FP) × 100%
Def. Valore predittivo negativo = percentuale di veri negativi tra i negativi totali, quindi se il risultato
è negativo, quale effettivamente sia la probabilità che il paziente sia davvero sano.
Negative Predictive Value = TN / (TN+ FN) × 100%
A fianco troviamo una curva ROC (Receiver Operating

Characteristic). Si tratta di un grafico che esprime la qualità, la
performance del test. In ascissa troviamo il contrario della
specificità (quindi la % dei falsi positivi tra i sani) e in ordinata la
sensibilità. Se il grafico è a 45°, il test non è performante perché i
falsi positivi crescono insieme alla sensibilità; mentre quando la
curva cresce più rapidamente, significa che la sensibilità è alta per
incrementi piccoli di x, ovvero per piccoli decrementi di specificità,
quindi il test è molto performante (alta specificità e alta sensibilità).
Se l’area sotto la curva è 1, il test è perfetto e la soglia viene
calcolata con un algoritmo particolare. Ci sono dei siti web in cui si
276
Biochimica clinica
inseriscono i dati e si calcola il grafico (curva ROC) con la soglia ideale che genera uno “spartiacque” tra i
negativi e i positivi, avendo il minor numero di falsi positivi e falsi negativi. Si ha anche la possibilità di
scegliere se spostare un po' la curva e avere più falsi positivi o più falsi negativi. Di solito è preferibile avere
più falsi positivi piuttosto che falsi negativi, perché avere molti falsi negativi sarebbe un problema.
B1.4 MATERIALE D’INDAGINE

[dalla dispensa vecchia]
Il sangue può essere raccolto in diversi tipi di provette, con la presenza o meno di anticoagulanti.
Si distinguono liquidi sierosi (peritoneale, pleurico, pericardico), sinoviale e cefalorachidiano.
I fluidi presi in esame derivano essenzialmente da un processo di ultrafiltrazione del plasma, perciò le
caratteristiche chimico-fisiche saranno molto simili, ma nonostante questo ci saranno delle differenze da
analizzare.
Il campione deve essere raccolto in provette con anticoagulante, ad eccezione del liquor, e conservato a
temperatura ambiente, con un tempo massimo che può intercorrere tra prelievo e analisi di circa due ore.
La prima analisi corrisponde all’analisi macroscopica, che mette in mostra aspetto e colore (es. colore
brunastro corrispondente alla melanina per metastasi nel liquor di melanoma).
In seconda analisi si esegue l’esame citometrico per mezzo del quale si contano gli elementi nucleati in
microscopia ottica/analizzatori automatici e si differenziano in base alle caratteristiche morfologiche
(leucociti, macrofagi, cellule tumorali nel liquor in tumori primitivi nel SNC o per metastasi da altre zone).
Infine, si ha l’esame biochimico e microbiologico.
B1.4.1 Liquido sinoviale

Viene ultrafiltrato dal sangue periferico a carico delle sinovie ed è caratterizzato dalla presenza di acido
ialuronico (prodotto dalle cellule sinoviali) con azione lubrificante, ritroveremo anche glucosio, proteine,
lipidi, elettroliti, enzimi e cellule: all’aspetto ha un’elevata viscosità, limpidezza, ma un colore giallognolo e
una scarsa cellularità sia eritrocitaria che leucocitaria. L’articolazione più frequentemente sottoposta ad
artrocentesi è quella del ginocchio. In alcune condizioni, quali un versamento abbondante da artropodie
infettive, l’artrocentesi può avere anche un valore terapeutico.
Conta leucocitaria:
• < 2000 cellule/mm3: si considera in genere di natura non infiammatoria e si osserva con maggiore
frequenza in patologie di tipo degenerativo-artrosico;
• > 2000 cellule/mm3: depone per un quadro infiammatorio. >5000 cellule/mm3: vi è forte sospetto di
artrite settica.
B1.4.2 Liquor cefalorachidiano

Si preleva in genere tramite puntura tra L4-L5 e L5-S1, in posizione supina o seduta, con ago a punta d’uccello
atraumatico. L’esame del liquor si può fare poche volte nella vita, per i potenziali rischi connessi. Si fa sempre
in associazione un prelievo del siero per una comparazione tra i due liquidi. Si sta lavorando per introdurlo
per i glioblastomi. Esso normalmente è “ad acqua di roccia”, cioè limpido, privo di sangue, se non in
condizione patologiche come un’emorragia subaracnoidea (ad esempio a causa di tumori primitivi o
secondarî). Viene richiesto per sospetto di meningiti, meningoencefaliti, mieliti batteriche o virali,
encefalomieliti demielinizzanti (cioè sclerosi multipla in cui si ha la produzione di autoanticorpi contro la
guaina mielinica), poliradicolonevriti (ovvero la sindrome di Guillain-Barré), malattie infiammatorie o
neurodegenerative come Parkinson, Alzheimer, SLA.
Dal punto di vista biochimico non ci sono sostanziali differenze dal siero se non per le proteine: 15-50 mg/dL
del liquor contro i 7/8 g del siero. [Domanda molto gettonata all’esame] L’albumina fa da padrone, poi le
proteine in percentuali più basse. Il glucosio è più o meno la metà. I lipidi sono molto più bassi.
277
Biochimica clinica
Quando si fa l’esame citometrico si vanno ad analizzare le soglie (10 eritrociti/mm3, 5 leucociti/mm3); nei
neonati sono leggermente più alte perché la BEE non è completamente formata.
Le proteine totali sono molto importanti perché indicano la permeabilità della membrana, il glucosio e il
lattato invece per valutare se ci sono alterazioni dovute a metabolismi di batterî e l’emoglobina con la
eventuale degradazione in bilirubina per emorragie subaracnoidee.
Altri test sono il dosaggio:
• delle IgG per la sclerosi multipla;
• delle IgA in meningite purulenta e neotubercolosi;
• delle catene libere delle immunoglobuline in un’attivazione del sistema immunitario del SNC;
• degli anticorpi specifici: dosaggi sintesi intratecale col calcolo indice anticorpale Antibody index (AI=
anticorpo specifico/immunoglobuline totali della stessa classe) (es. morbillo, varicella zoster);
• dei marcatori tumorali: CA15.3, CA125, CA19.9;
• di β-amiloide, proteina Tau fosforilata per la malattia di Alzheimer;
• della proteina 14,3,3 non correlata al prione, ma indice di necrosi neuronale nella malattia di Creutzfeldt-
Jacob (CJD); la presenza di prioni la possiamo stabilire solo con Western Blot che è molto preciso in
questo caso.
Prelievo del liquor

Il liquor non viene mai aspirato, bensì lo si raccoglie per caduta spontanea all’interno di 3 o 4 provette diverse,
senza anticoagulante. Questo perché, quando si va a perforare la dura madre, si attraversa il derma e nel
farlo si potrebbe rompere un vasellino sanguigno, falsando le analisi.
Utilizzando invece diverse provette, la contaminazione avverrà solo nella prima provetta, che sarà scartata,
e si potrà quindi procedere analizzando le restanti tre, evitando una diagnosi falsamente positiva di
emorragia sub-aracnoidea (ESA). Normalmente la quantità prelevata di liquor è tra 6 e 12 mL, anche se in
casi rarissimi si può arrivare anche a 20 mL (nel nostro corpo ci sono al massimo 150 mL di liquor; ovviamente
nei neonati e negli anziani la quantità disponibile e consecutivamente la quantità prelevata è minore).
Analisi del campione

Il primo step è la valutazione visiva: in caso di emorragia sub-aracnoidea, ad esempio, si ritroveranno tracce
di sangue in tutte le provette, sia macroscopicamente che in maniera fisico-chimica con l’analisi
spettrometrica. Si può riconoscere la presenza di desossiemoglobina, metaemoglobina o bilirubina, qualora
l’emorragia sia avvenuta ad esempio alcuni giorni prima del prelievo. Il colore vira verso il giallo, per via della
conversione metabolica dell’emoglobina in bilirubina assumendo una colorazione detta xantocromica.
Un test successivo, ad esempio in caso di Lupus eritematoso o Sclerosi multipla, è la comparazione col siero,
andando a cercare delle bande oligoclonali. Queste sono IgG che risaltano nell’elettroforesi come bande
omogenee, strette e ravvicinate che in caso di Sclerosi Multipla si trovano solamente nel liquor, perché non
è una patologia sistemica; nel Lupus eritematoso invece le si ritrovano sia nel siero che nel liquor, e questo
permette di eseguire una diagnosi differenziale. Ancora, altri test eseguibili sul liquor sono:
• elettroforesi à dosare le proteine sieriche (albumina, globuline α1-, α2-, β- e γ-);
• saggi immunoenzimatici à tramite un macchinario di circa 20x20 cm utilizzando solamente 1 μL di
campione è possibile stimare la concentrazione di acidi nucleici, proteine e altre sostanze;
• spettrofotometria à quantificare le proteine del campione: questo permette di identificare ad
esempio emoglobina, metaemoglobina o desossiemoglobina o altre proteine;
• analisi dell’attività enzimatica.
278
Biochimica clinica
B2. MEDICINA PERSONALIZZATA

(prof. Morandi)
B2.1 INTRODUZIONE AL CONCETTO DI MEDICINA PERSONALIZZATA

L’iniziativa nota come medicina personalizzata è stata introdotta dall’amministrazione Obama, ormai
qualche anno fa (gennaio 2015). Non ha coinvolto solo gli Stati Uniti, ma anche l’Europa, e altri paesi come il
Giappone. Soprattutto in Europa e negli Stati Uniti sta prendendo sempre più piede l’idea di arrivare alla
medicina personalizzata in tempi adeguati, si pensa entro il 2030, ma in realtà già al giorno d’oggi esistono
una serie di test che si rifanno a questo tipo di idea. L’idea si basa sul fatto di trattare il paziente e non la
malattia, come disse già Ippocrate nel quinto secolo a.C. Naturalmente, Ippocrate non aveva a disposizione
le tecnologie odierne, soprattutto i sistemi di Next Generation Sequencing, che invece attualmente sono
arrivati anche negli ospedali medio-grandi. Grazie a queste tecnologie, infatti, possiamo caratterizzare, per
esempio, un singolo tumore del singolo paziente, e comunicare così all’oncologo quali sono le mutazioni che
scatenano interazioni in determinati pathway, in modo da utilizzare un determinato farmaco (ad esempio un
anticorpo monoclonale) contro quel determinato pathway. Questo modo di agire è estremamente preciso,
tanto che oltre a parlare di personalized medicine si parla anche di precision medicine.
Già oggi, grazie alla biologia molecolare, e domani, grazie agli investimenti di numerose case farmaceutiche,
ci sarà la possibilità reale di beneficiare di farmaci specifici e selettivi verso particolari pathway cellulari
presenti in particolari tipologie di malati: infatti, nella medicina tradizionale, i trattamenti sono pensati per
il cosiddetto average patient (paziente medio) adottando un approccio generalizzato, che può essere valido
per alcuni individui, ma non per tutti: nella medicina personalizzata si vuole migliorare questo aspetto
integrando tra loro le informazioni sul paziente, come il corredo genetico, l’ambiente in cui vive, l’interazione
ambiente-genoma e infine il suo stile di vita, per identificare il trattamento più adeguato.
Nell’immagine in alto si schematizza quello che avviene oggi in confronto a ciò che si auspica per la medicina
di precisione:
• oggi: oltre al paziente medio (in azzurro), tra i malati sono presenti anche altri soggetti con
caratteristiche diverse (gialli e rossi). Trattare questi individui allo stesso modo può portare a tre
diversi scenarî:
1. un outcome migliore per la maggior parte dei pazienti (i pazienti medî), perché nel corso dei
decenni si sono sviluppati farmaci sempre più performanti;
2. nessun beneficio per alcuni pazienti;
3. effetti collaterali per altri pazienti: questa è la situazione peggiore, che vuole essere evitata
dalla medicina personalizzata.
279
Biochimica clinica
• nel 2030: l’obiettivo è quello di arrivare a una condizione dove l’analisi di genoma, ambiente e
caratteristiche della popolazione stessa, tramite l’ausilio dell’intelligenza artificiale (IA), porti alla
terapia più efficace per ogni paziente. In particolare, la IA diventerà uno strumento di elaborazione
imprescindibile delle molte informazioni provenienti dalle scienze omiche (genomica, proteomica,
ecc.), consentendo di adottare la strategia più corretta per ogni individuo.
Ciò che vuole comunicare la medicina di precisione e personalizzata (non solo nel futuro, ma anche adesso)
è che bisogna considerare il genoma del paziente, l’ambiente (dieta, stili di vita), e tutti i dati che arrivano
dagli studî popolazionistici di genetica che si hanno a disposizione. Attualmente inoltre è disponibile un
arsenale di farmaci più fornito e più traghettato nel bersaglio del pathway che si vuole intercettare. È quindi
possibile somministrare un certo farmaco a pazienti che hanno un certo pathway alterato. Si avrà dunque un
outcome incrementato in diverse tipologie di pazienti, con un calo degli effetti collaterali dovuti al farmaco
normale che si somministrava precedentemente.
B2.1.1 L’esempio dei tumori

Oggi, con la medicina classica, succede di trattare il paziente già malato, e magari già in fase avanzata; ad
esempio, se si parla di tumori, spesso si arriva a diagnosticarli già in stato avanzato quando è troppo tardi.
Prendendo come esempio il test ideato dal prof. Morandi per i tumori del cavo orale, uno dei suoi obiettivi è
intercettare i tumori molto precocemente, al massimo agli stadî 1 e 2. In questo modo il paziente, rimuove il
tumore in day hospital, quando è ancora molto ridotto, e non avrà recidive nell’arco della vita. Se invece,
come avviene oggi, 2/3 dei pazienti affetti dal carcinoma del cavo orale sono già in stadio 3 e 4, il tumore è
troppo grande, infiltra le regioni sottostanti e dà metastasi ai linfonodi del collo. Pur rimuovendo quanto più
possibile, entro un anno si ha la recidiva, e il paziente muore. Nel 50% dei casi un paziente con tumore al
cavo orale muore a 5 anni dalla diagnosi, quindi è un tumore molto aggressivo. Anche i pazienti affetti da
tumori al cervello (glioblastomi) in due anni muoiono, molto spesso addirittura entro un anno. Quindi bisogna
sfruttare le tecnologie che consentono di intercettare molto precocemente i tumori, in modo da intervenire
subito. Sono quindi necessarî dei programmi adeguati di diagnosi precoce, ma non solo. Si possono anche
utilizzare dei marcatori durante il follow up, che prevedano la prognosi del paziente.
Dal punto di vista genetico, oggi sono disponibili tecnologie con potenzialità incredibili.
Riassumendo, lo scopo della medicina personalizzata è trovare il giusto trattamento per quel
determinato tipo di popolazione. Questo concetto si applica non solo ai tumori, ma anche diabete, malattie
croniche e ad altri tipi di patologie.
NCI-MATCH (Molecular Analysis for Therapy Choice)

Un altro trial americano per il trattamento del cancro è NCI-MATCH (Molecular Analysis for Therapy Choice)
in cui i pazienti ricevono un trattamento basato sui cambiamenti genetici riscontrati nei loro tumori
attraverso il sequenziamento genomico e altri test: i soggetti i cui tumori hanno cambiamenti genetici che
corrispondono a uno dei trattamenti nel trial possono ricevere quel trattamento se soddisfano altri criterî di
ammissibilità.
Il trial cerca di determinare se il trattamento del cancro basato su questi specifici cambiamenti genetici è
effettivo, indipendentemente dal tipo di cancro.
Ha l’obiettivo di caratterizzare il tessuto tumorale del paziente, valutare che tipo di mutazioni ha e sulla base
delle mutazioni che si trovano si stabilisce il trattamento più corretto con tutti i farmaci che si hanno a
disposizione. Alcuni farmaci svolgono al meglio il proprio ruolo soprattutto se c’è una condizione genetica
particolarmente affine ai pathway che va a inibire. L’obiettivo è quello di avere dopo il trattamento il
cosiddetto tumor shrinkage, ossia il ridimensionamento del tumore. Successivamente si può fare la terapia
neoadiuvante e anche l’escissione chirurgica.
Si possono sequenziare varî geni, in cui si possono trovare determinate mutazioni, e in base alle mutazioni
che si trovano si sceglie la terapia più idonea. Ad esempio, si sa che se il gene EGFR è mutato nel tumore al
polmone, con particolari mutazioni. Si ha a disposizione un pannello di farmaci che vanno a inibire EGFR che,
essendo mutato, attiva la cascata delle MAPK. Se si inibisce EGFR con piccole molecole, come gefitinib ed
280
Biochimica clinica
erlotinib, il trattamento è efficace e si verifica un abbassamento delle potenziali recidive nel paziente. C’è
invece una mutazione chiamata T790M, nello stesso EGFR, che provoca resistenza a questi farmaci. Se si
identifica questa mutazione, si devono dunque utilizzare altri farmaci, come AZD9291. Quindi, in base alle
mutazioni trovate in geni cosiddetti driver, che veicolano la malattia, si deve somministrare il corretto
farmaco a disposizione. I Big Pharma stanno sviluppando sempre di più nuovi farmaci che abbiano come
target tutti i pathway legati ai varî tipi di tumore.
Nella tabella a lato sono presenti alcuni dei geni valutati con
questa metodica.
Nella pratica quindi:
• si sequenzia il genoma di un paziente,
• si identificano le mutazioni che il tumore porta
• si associa il farmaco più opportuno in relazione a quel tipo
di mutazione.
Quest’ultimo passaggio è a discrezione dell’oncologo che, in
base alle linee guida stabilite sui trial effettuati nel corso degli
anni e in quel momento, valuterà nell’arsenale di farmaci a
disposizione quali siano quelli più efficaci a colpire il pathway
coinvolto
nella popolazione tumorale.
[Dalle diapositive] L’obiettivo primario di MATCH è determinare
la percentuale di pazienti che risponde ai trattamenti, con una
regressione tumorale di una certa quantità. È chiamato objective
response rate. Il trattamento sarà considerato promettente se
almeno il 16% dei pazienti avrà regressione tumorale. L’obiettivo secondario del trial è determinare la
percentuale dei pazienti la cui malattia non peggiora nei successivi sei mesi. Questo è detto progression-free
survival. In aggiunta i ricercatori andranno a determinare anche il tempo di progressione del tumore e
valutare gli effetti collaterali del trattamento.
Un tempo si adoperava unicamente la chemioterapia portando alla morte di tutte le cellule in continua
proliferazione: da una parte si riduceva la massa tumorale, ma dall’altra si avevano effetti collaterali, tra cui
la perdita dei capelli oppure la morte delle cellule staminali. Adesso spesso si associa la chemioterapia a nuovi
farmaci o addirittura in alcuni trials ci si focalizza su questi fino ad arrivare a vere e proprie targeted therapies
(terapie a bersaglio molecolare), dove il farmaco, ad esempio l’anticorpo monoclonale, inibisce il pathway di
innesco della cancerogenesi.
Due trial a confronto: Umbrella trial e Basket trial

Negli ultimi anni, sono emersi due tipi di trial:
1) Umbrella Trial: si considera un tipo
di tumore, ad esempio il tumore al
polmone. Nel paziente A è
coinvolta una mutazione, nel
paziente B vi è un’altra mutazione
in un altro gene, nel paziente C
un’altra mutazione ancora. Ai tre
diversi pazienti, si somministrano
tre farmaci diversi in base alle
mutazioni riscontrate.
2) Basket Trial: si considerano diversi
tipi di tumore, ad esempio
polmone, fegato, cervello, colon. In
questi diversi tipi di tumore è
coinvolto lo stesso gene, ad
281
Biochimica clinica
esempio b-RAF, un oncogene mutato spesso nel codone 600, la cui mutazione più frequente è la
V600E, presente spesso in tutti questi quattro tipi diversi di tumore. Utilizzando come target lo stesso
driver gene che veicola la patologia, si utilizza lo stesso farmaco, ad esempio un anticorpo
monoclonale, che riconosce la mutazione V600E in tutti e quattro i tipi di tumore. Quindi, in questo
caso, il concetto è opposto: i diversi tipi di tumore vengono trattati non con diversi trattamenti, come
succedeva una volta, ma con lo stesso farmaco, perché si vuole inibire l’oncogene che scatena la
malattia, ossia b-RAF con mutazione V600E.
Una volta che i tessuti tumorali vengono portati in anatomia patologica, sarà il sequenziamento genomico a
permettere l’identificazione dei driver gene, ovvero i geni che guidano il processo di cancerogenesi.
B2.2 METODI D’INDAGINE

È chiaro quindi che oggi i test di medicina personalizzata hanno sempre maggiore impatto nella decisione
finale del trattamento.
Tra i numerosi metodi di indagine, i più usati in oncologia (e non solo) sono:
• FISH;
• Microarray: sia di espressione che la cosiddetta comparative genomic hybridization (CGH);
• Nanostring, che in realtà è una piattaforma;
• PCR, RT-PCR (real time PCR), qPCR (quantitative PCR), ddPCR (droplet digital PCR);
• Next Generation Sequencing (NGS), che ultimamente è una tecnica fondamentale. Ci sono voluti più
di 10 anni per sequenziare tutto il genoma umano, partendo dagli anni ‘90 fino alla pubblicazione
finale nel 2003 da parte di due consorzî, uno pubblico e uno privato. I team di ricerca hanno potuto
usufruire del metodo Sanger, una macchina legata appunto alla prima generazione di
sequenziamento; dal 2005 in poi però si sono sviluppate delle nuove metodiche di sequenziamento,
in particolare definite di sequenziamento in parallelo, capaci di sequenziare l’intero genoma di una
persona in una notte. Questa nuova frontiera non solo ha abbattuto i tempi, ma anche i costi,
passando da miliardi di dollari a meno di €1000.
B2.2.1 Companion diagnostic test

Si è visto che al giorno d’oggi si hanno a disposizione diversi tipi di farmaci, che hanno diversi bersagli
molecolari all’interno della cellula. Questi farmaci, ad esempio anticorpi monoclonali, piccole molecole
inibitrici ecc. normalmente sono molto costosi, perché ci sono voluti investimenti notevoli per arrivare a
svilupparli. Tuttavia, spesso hanno effetto solo su alcuni pazienti che hanno alterato quel determinato tipo
di pathway che il farmaco va a bersagliare. Questi nuovi farmaci non possono quindi essere somministrati a
tutti, ma si devono stratificare i pazienti in base alle caratteristiche del tumore.
Un concetto chiave legato alla medicina di precisione è quello di companion diagnostic test (test diagnostico
complementare) ovvero uno strumento adoperato in vitro che fornisce informazioni essenziali per l'uso
sicuro ed efficace di un farmaco o prodotto biologico. Il test aiuta un operatore sanitario a valutare il rapporto
rischi/benefici, ovvero a determinare se i benefici di un particolare prodotto terapeutico per i pazienti
supereranno i potenziali effetti collaterali o rischi gravi.
Per comprendere meglio l’applicazione di tale test si legga il seguente esempio: per alcune tipologie di
tumore al polmone che prevedono una mutazione del gene di fusione EML4-ALK (5% dei tumori ai polmoni
ha quest’alterazione) si utilizza il crizotinib. Si tratta di un farmaco a bersaglio molecolare che fino a poco
tempo fa costava €200.000 a paziente a causa della scarsità di pazienti che ne avevano bisogno, ma che è
riuscito ad abbattere i costi grazie alla dimostrazione di un suo utilizzo anche per altri arrangiamenti. In tutte
queste situazioni il farmaco è molto efficace, ma solo in questi pazienti, per cui tramite il Next Generation
Sequencing è necessario individuare la percentuale di soggetti che ne può realmente beneficiare limitando
anche i costi per l’azienda ospedaliera. In sintesi, la companion diagnostic consiste nella verifica di utilità di
un farmaco, soprattutto se a bersaglio molecolare, attraverso un test diagnostico.
La companion diagnostic può:
282
Biochimica clinica
• identificare i pazienti che hanno maggiori probabilità di beneficiare di un particolare prodotto

terapeutico;
• identificare i pazienti che possono essere maggiormente a rischio di gravi effetti collaterali a
seguito del trattamento con un particolare prodotto terapeutico;
• monitorare la risposta al trattamento (seguire il follow-up) con un particolare prodotto terapeutico
allo scopo di adattare il trattamento per ottenere una maggiore sicurezza o efficacia. Ad esempio, il
test elaborato dal professor Morandi per il carcinoma del cavo orale, oltre ad avere una capacità di
diagnosi precoce (cioè identifica i pazienti a rischio di sviluppare un tumore nel cavo orale), è molto
utile anche nella prognosi, ossia capire tramite test su un paziente già operato il rischio di recidiva:
infatti, prelevando la mucosa orale adiacente alla lesione che è stata rimossa dal chirurgo, se il test
è:
o positivo, allora è alta la probabilità di recidive legate alla neoformazione di tumori vicini alla
lesione giungendo quindi alla prognosi peggiore: sarà necessario effettuare il test ogni 3 mesi
sempre a livello della lesione per monitorare l’andamento del nuovo tumore;
o negativo, allora è bassissima la probabilità di recidive dato che non ci sono cellule in
alterazione, giungendo quindi alla prognosi migliore.
B2.2.2 FISH
Uno tra i test diagnostici storicamente e clinicamente più impiegati è la FISH (Fluorescence in situ
hybridization). Il saggio FISH è semplicemente la costruzione di una sonda a DNA (o RNA in alcuni casi) che
riconosce in modo specifico e selettivo alcune regioni del genoma: quindi, si sintetizza un patch di DNA che
corrisponde a uno specifico gene localizzato su un cromosoma, ad esempio il cromosoma 1 braccio corto
(1p), e lo si marca con un fluorocromo (una molecola che emette fluorescenza se eccitata a una determinata
lunghezza d’onda), ovvero il frammento di DNA e il fluorocromo vengono uniti chimicamente.
Normalmente i pezzi operatori arrivano all’anatomopatologo, vengono fissati in formalina e inclusi in
paraffina, poi delle sezioni del tessuto vengono fatte aderire a un vetrino che viene colorato ad esempio con
ematossilina-eosina, permettendo un’attenta valutazione del patologo. Dove è presente il tumore si possono
ibridare le sonde fluorescenti che sono rappresentative della porzione genomica di interesse.
283
Biochimica clinica
Nelle immagini soprastanti si mostra come si presenta l’ibridazione: in questo caso le sonde fluorescenti sono
sul cromosoma 1, braccio corto e banda 36 (1p36). Di norma si marca in verde la regione che si intende
analizzare e in rosso, per controllo interno, un’altra regione all’interno dello stesso cromosoma. Nell’esempio
riportato la sonda di controllo riconosce il braccio lungo e la banda 25 (1q25). Questo meccanismo permette
di avere un riferimento interno durante il processo del saggio.
È bene ricordare che il corredo genomico umano è diploide, per cui ci si aspetta due cromosomi 1 e che la
sonda vada a ibridarsi su due posizioni diverse a livello di singola cellula: in questo caso al microscopio
saranno visibili due pallini verdi (1p36) e due pallini rossi (1q25).
Nel caso di tumore sono possibili però degli scenarî differenti:
• una delezione, ad esempio di 1p36, determinerà la visione di un solo pallino verde a causa della
perdita di un braccio corto di un cromosoma 1;
• un’amplificazione, ad esempio di HER2, uno dei geni maggiormente amplificati nel tumore alla
mammella: quindi, effettuando la FISH in quella regione cromosomica invece di avere due pallini
verdi o rossi se ne avranno di più.
Riassumendo, la FISH serve essenzialmente per valutare perdita o guadagno di materiale genetico.
Esempio dei gliomi

[Da slide] Per la prima volta la classificazione dei tumori del SNC nel 2016 usa parametri molecolari in aggiunta
a quelli istologici per definire l’entità di molti tumori, formulando così un concetto di come dovrebbe essere
effettuata una diagnosi di questi tumori nell’era molecolare. L’aggiornamento corrente (2016 CNS WHO)
rompe così il centenario principio di diagnosi basato interamente sulla microscopia.
Si prendano come esempio i gliomi di basso grado, tumori del sistema nervoso centrale. Essi sostanzialmente
hanno una prognosi abbastanza buona nell’arco di 5 anni, mentre i gliomi di alto grado, (grado 4) o
glioblastomi, sono molto aggressivi e uccidono il paziente nel giro di un anno, massimo due. Ci sono dunque
pochissimi lungo-sopravviventi, anche perché in alcuni casi addirittura si può aver sbagliato la diagnosi.
Nel caso dell’oligodendroglioma, per verificare la codelezione 1p 19q (perdita del braccio corto del
cromosoma 1 e del braccio lungo del cromosoma 19) si utilizza la FISH.
Nell’immagine a lato è
mostrata una
risonanza magnetica di
un oligodendroglioma,
una tipologia di
tumore cerebrale, ed è
ben visibile la massa
estesa. Dopo
l’operazione chirurgica
il pezzo operatorio
arriva nel reparto di
anatomia patologica,
viene fissato in
formalina e incluso in
paraffina, vengono
fatte le sezioni e si può
ibridare il preparato
con due sonde, una nel braccio corto del cromosoma 1 e l’altra nel braccio lungo del cromosoma 19,
utilizzando sempre un riferimento sullo stesso cromosoma rosso e verde. A questo punto si valuta se ci sia
una perdita di entrambi i cromosomi o di uno solo dei due, perché in letteratura è riportato che molto spesso,
in concomitanza con gli oligodendrogliomi, ci sia la delezione dell’1p 19 q, portando a una specifica prognosi.
284
Biochimica clinica
Come si può capire se si hanno delle delezioni, ossia se è stato perso un pezzo di cromosoma in uno dei due
alleli?
- La sonda viene marcata con un fluorocromo, ad esempio rosso.
- Parallelamente si utilizza un’altra sonda, nello stesso cromosoma ma nel braccio lungo, e la si marca
con un fluorocromo verde.
- Si co-ibrida con le due sonde, una su 1p l’altra su 1q
- Nell’analisi di fluorescenza, se il paziente non ha perdita di materiale genetico, in ogni cellula si
vedranno due pallini perché sono presenti due alleli, quindi ci sono due pallini rossi e due pallini
verdi.
- Se il paziente avrà alcune cellule che hanno un solo pallino rosso (i verdi li ha sempre perché sono un
controllo, anche per stabilire quanti cromosomi 1 si ha in una cellula, dal momento che si può avere
anche una poliploidia, alcuni tumori sono poliploidi) significa che c’è stata una perdita.
- La stessa cosa avviene per quanto riguarda il 19q: si utilizzano due sonde, una rossa e una verde e si
vede se c’è stata perdita di materiale genetico.
Nel grafico di Kaplan-Meier in ordinata è indicata la sopravvivenza (espressa in %) e in ascissa il tempo,

ovvero il follow up nel tempo (espresso in mesi).
Sono presenti due curve con andamenti ben distinti:
• i pazienti 1p/19q LOH hanno avuto una delezione di 1p 19q. LOH sta per loss of heterozygosity, ovvero
perdita dell’eterozigosi, dato che normalmente sono presenti un allele materno e uno paterno del
gene. Se c’è delezione, come nell’oligodendroglioma, succede che invece di avere 2 alleli se ne ritrova
solo uno: quindi nelle cellule normali del corpo si è in eterozigosi, ma nel tumore si può avere
omozigosi cioè si è perso uno dei due alleli;
• i pazienti 1p/19q
Intact non hanno
avuto una delezione
di 1p 19q.
Dal grafico si evince che i
primi abbiano
generalmente un tasso
sopravvivenza decisamente
maggiore dei secondi: la
curva dei pazienti con
1p19q intatti cala
bruscamente entro i 50
mesi, perciò i pazienti
muoiono entro i 50 mesi,
mentre quelli con delezione
sono vivi, per la maggior
parte, dopo 100 mesi.
B2.2.3 DNA Microarray

Se nella FISH ogni saggio corrisponde a una porzione genomica ben definita, il microarray consente in un
unico saggio di valutare la presenza di delezioni o amplificazioni in tutto il genoma contemporaneamente.
Metodica nata agli inizi degli anni ‘90, permette di depositare in un classico vetrino di anatomia patologica
centinaia di migliaia di sonde ben ordinate: ciascun pallino equivale a una sonda e quella sonda è
rappresentativa di una porzione genomica mappata esattamente sul genoma. Ad esempio, la sonda numero
1 è in posizione 1 in alto a destra ed è rappresentativa e riconosce il genoma sul cromosoma 1p25. Le
applicazioni sono diverse:
• array CGH: questa analisi è utile per analizzare attraverso le sonde per ciascun esone le differenze
tra le copy numbers e quindi se varia il numero di copie di un gene. In alcuni tumori vi sono alcuni
285
Biochimica clinica
geni amplificati (es. EGFR nei tumori cerebrali, ErbB2 nel tumore della mammella), in altri, delezioni
in cui si perde uno dei due alleli;
• expression arrays;
• tissue microarray: l’anatomopatologo seleziona mediante “carotaggio” campioni dello spessore di
0,5 mm da 100 pazienti diversi con lo stesso tipo di tumore che vengono posizionati in un unico
microarray; a questo punto, attraverso anticorpi monoclonali o sonde specifiche come nella FISH, si
valuta l’espressione genica di 100 pazienti diversi in un unico saggio. Questo serve essenzialmente
per standardizzare i casi;
• analisi di SNP, cioè analizzare diversi pattern di nucleotidi in punti specifici del genoma di individui
diversi.
Specialmente quando si ha poco materiale di partenza (una small biopsy) il numero di cellule che si può
utilizzare non è estremamente grande, e quindi, se si hanno, ad esempio, 100 target, è impossibile svolgere
l’analisi. In casi come questo, sono più utili i DNA microarray. Possono svolgere analisi di perdita o guadagno
di materiale genetico e anche di espressione genica su tutto il genoma in parallelo, con un singolo
esperimento.
Nell’immagine sono presenti i robot che inizialmente preparano i microarray. In basso a destra è raffigurato
il classico microarray, dove ogni pallino corrisponde a una sonda a DNA, un oligonucleotide di 50-70 bp che
è stato disegnato in modo tale da rappresentare una porzione genomica precisa mappata sul genoma umano.
I microarray possono ospitare anche 200.000 sonde per ogni vetrino, e si possono quindi disegnare 200.000
sonde, che sono mappate lungo tutto il genoma di cui si sanno esattamente le coordinate.
Array CGH
Grazie al saggio CGH array (Comparative
Genomic Hybridization), si marca il DNA tumorale
con dei fluorocromi verdi, mentre il DNA normale
dello stesso paziente viene marcato in rosso.
Vengono inseriti sul vetrino i due DNA verde e
rosso in uguale quantità e qui si ibridano alle
sonde presenti. I due frammenti, in base alla
complementarità e al numero delle copie del
gene target, potranno non legarsi o legarsi in
maniera più o meno forte alla sonda, emettendo
fluorescenza a diverse lunghezze d’onda, che
potranno essere rilevate da una ccd camera e
tramite software si stabilisce il rapporto
286
Biochimica clinica
rosso/verde. Nei pozzetti si potranno quindi osservare diverse situazioni, elaborate da un software che
scansiona e determina i rapporti (su scala logaritmica) tra le due copie per singola posizione:
• se non si hanno né perdite né guadagni di materiale genetico, il rapporto di verde e rosso per singola
sonda sarà pari a 1 perché si hanno 2 copie di ciascun gruppo e il pozzetto apparirà giallo;
• se si ha più verde, allora sta prevalendo il DNA tumorale e questo significa che c’è stata
un’amplificazione o una duplicazione di quel gene in quella particolare posizione del cromosoma e il
pozzetto apparirà verde (rapporto maggiore di 1);
• se si ha più rosso, allora sta prevalendo il DNA normale e questo significa che c’è stata una delezione
di quel gene in quella particolare posizione del cromosoma e il pozzetto apparirà rosso (rapporto
minore di 1).
Esistono altri metodi per valutare delezioni e mutazioni, ma l’approccio più completo è l’aCGH, perché valuta
in un saggio tutto il genoma. La FISH è solo per piccole porzioni di genoma.
Nell’immagine a lato si osserva una rappresentazione del

cromosoma 19, dove si presenta uno shift sulla sinistra di
un gran numero di sonde mappate in quella posizione.
Quando si ha una perdita di una parte di cromosoma,
come ad esempio negli oligodendrogliomi, non basta solo
una sonda che shifta normalmente, in genere se ne
hanno tante. Con 200.000 sonde, se ne possono
disegnare lungo tutti i cromosomi in gran numero, e si ha
dunque una risoluzione molto elevata in base al numero
di sonde che si costruiscono. Quindi ci saranno tante
sonde, che mostrano se, ad esempio, si è spostati a
sinistra e verso una parte di genoma. In questo modo si
capisce che si ha una delezione su 19q.
Come precedentemente illustrato, si
possono avere anche delle amplificazioni:
ad esempio, nel carcinoma alla mammella
HER2 può essere amplificato, e avere
diverse copie, anche 10. Il vantaggio del
microarray è che consente di osservare
tutto il genoma in contemporanea e avere
una visione globale di ciò che accade nel
tumore.
Ci sono anche altre tecniche che non
verranno illustrate.
Expression arrays
Nel genoma umano sono presenti
21306 geni, sulla base degli ultimi dati,
risalenti al 2020. In un singolo
esperimento è dunque possibile
valutare il livello dell’espressione
genica. Si possono valutare anche i
trascritti: nei tumori c’è una certa
variabilità di espressione genica che
può essere usata come valore
prognostico, partendo dal tumore
primitivo si possono individuare i
287
Biochimica clinica
pazienti con migliore o peggiore prognosi. Si utilizza lo stesso approccio degli array: invece di ibridare il DNA
si valuta l’mRNA. In generale si fa una retrotrascrizione con una “reverse” trascrittasi (presente, ad esempio,
nei retrovirus) che sintetizza il cDNA partendo da RNA. Il cDNA tumorale viene marcato in rosso e quello
normale in verde. Si ibrida sul pozzetto e si valuta l’espressione genica di ciascuna sonda. Spesso ciascun gene
è rappresentato da più sonde (ad es. una per ogni esone) per valutare anche le varianti di splicing alternative.
Si può anche fare un die swap, quindi, nello stesso paziente, marcare prima il tumore col rosso e poi col verde
e viceversa, per confermare i dati. Infatti, a volte i fluorocromi hanno problematiche correlate alla
temperatura e alle condizioni meteorologiche: spesso in estate si ha un tasso di ozono elevatissimo a
Bologna, che degrada il fluorocromo rosso più velocemente del verde e questo altera i dati.
Alla fine, si ha una valutazione quantitativa del trascrittoma, con un panorama completo di tutti i trascritti
che esistono nella popolazione tumorale dell’individuo.
Esempio del glioblastoma

Il prof. Morandi ha pubblicato un
lavoro sui gliomi valutando il profilo
di espressione genica dei
glioblastomi (i più gravi, uccidono i
pazienti nell’arco di un anno o
anche meno) per capire quali sono i
geni maggiormente espressi o quelli
ipoespressi, valutando tanti casi in
parallelo dato che l’espressione
genica varia in base a diversi aspetti.
Si ottiene un ritratto della
popolazione tumorale identificando
una serie di geni imputabili alla
generazione del tumore. Si può
creare un albero genetico per raggruppare i tumori: si possono confrontare ad esempio il glioblastoma (ad
alto grado) e gli oligodendrogliomi, e valutare se in termini di espressione genica ci sono differenze.
Uno dei geni più significativi è IGFBP2,
overespresso nei glioblastomi.
Per confrontare questo dato con quello degli
array si fa prima una real time PCR a singolo
gene a livello dell’RNA, che valuta
quantitativamente il trascritto, e poi si dimostra
che a livello proteico IGFBP2 è overespresso nei
glioblastomi e assente nei gliomi di basso grado
tramite l’immunoistochimica (si depone su una
sezione del tumore un anticorpo specifico per la
proteina ricercata, coniugato a una sostanza
colorata: se la proteina è presente, verrà
riconosciuta e messa in evidenza). Si nota quindi
(nell’immagine a destra) che in alto a sinistra c’è
un oligodendroglioma e in basso a destra un glioblastoma con colorazioni differenti. Per il tempo di
sopravvivenza è anche importante la presenza di IGFBP2. La curva dei glioblastomi è molto ripida. Il grafico
di Kaplan-Meier indica che è possibile usare IGFBP2 per capire la prognosi: i bassi gradi, negativi per IGFBP2
hanno una prognosi migliore rispetto agli alti gradi, che muoiono in pochi mesi se positivi a IGFBP2.
Esempio del tumore alla mammella

È molto importante inquadrare la prognosi, per capire quali donne hanno un tumore molto aggressivo che
darà metastasi nell’arco di poco tempo durante follow up. Queste, infatti, andranno trattate in modo molto
più aggressivo, con tutti i farmaci che si hanno a disposizione, rispetto a donne che hanno un tumore alla
288
Biochimica clinica
mammella estremamente poco aggressivo, con dimostrate nei follow up delle percentuali di recidiva
bassissime. Infatti, in questo caso a volte, dopo il trattamento con rimozione chirurgica, si può anche evitare
di insistere con la chemioterapia, dato che dà effetti collaterali importanti.
Coi test che si hanno a disposizione attualmente, si riesce a prevedere il futuro? Per quanto riguarda la
mammella, questo spesso è possibile. Diverse compagnie (tra cui quella del professore, che fondò anni fa a
Trieste, Alpha Genics) hanno lavorato per sviluppare test prognostici legati alla tipologia di tumore, grazie
alle nuove tecnologie di biologia molecolare. Anche in questo caso si parla di array d’espressione.
Ci sono tanti test molecolari che si basano su array disponibili sul mercato, in cui si marca con rosso o verde
il tessuto tumorale o quello normale e si ottiene il ritratto dei tumori. In verde sono rappresentati i geni
ipoespressi, in rosso invece i geni iperespressi. Ci sono algoritmi particolari che permettono l’analisi del
panorama generale in un cluster di pazienti.
Nella figura a destra, il gruppo in
verde rappresenta un cluster di
pazienti che hanno gli stessi
geni down-regolati, invece a
destra c’è un gruppo di pazienti
che per gli stessi geni ha un up
regolazione, e così via per altri
geni.
Grazie a questo primo paper
pubblicato su Nature all’inizio
degli anni 2000, i collaboratori
hanno cercato di raggruppare
dal punto di vista
dell’espressione genica varî tipi
di tumori alla mammella,
comparando l’espressione
genica con i marcatori classici usati abitualmente nella pratica clinica comune, soprattutto ER, PgR, Ki-67 ed
HER-2, tramite l’immunoistochimica. Ci sono una serie di farmaci contro questi marcatori (hanno analizzato
diversi tipi di tumore: carcinoma duttale invasivo, due carcinomi lobulari, un carcinoma duttale in situ, un
fibroadenoma benigno e varî casi normali).
La correlazione è stata trovata e hanno coniato quattro gruppi di tumori alla mammella che compariranno
nel referto dell’anatomopatologo:
1) Luminal A: normalmente hanno prognosi buona, sono quelli a prognosi migliore rispetto alle altre
classi. Tutti i tumori alla mammella vengono analizzati subito per la presenza, attraverso
l‘immunoistochimica, di recettori dell’estrogeno, del progesterone, HER2 e ki67, una molecola
legata alla proliferazione tumorale. Più è alto ki67 più il tumore prolifera e avrà più potenziale di
invasione dei tessuti circostanti e di metastatizzare. Luminal A [pr. Luminal ei] è positivo al recettore
di estrogeno e progesterone, è HER2– e presenta ki67 basso, significa che ha un tasso di
proliferazione basso, e per questo ha una prognosi abbastanza buona
2) Luminal B: sono identici ai luminal A, ma con ki67 più alto, quindi la prognosi è peggiore di luminal
A.
3) Triple negative: sono i peggiori. Normalmente sono negativi sia al recettore di estrogeno, sia al
recettore del progesterone, sia a HER2 e hanno ki67 alto.
4) HER2-enriched: se non trattati hanno cattiva prognosi, ma oggi esiste un farmaco che ha come target
HER2 amplificato, ossia un anticorpo monoclonale contro HER2, e quindi quando si sa che HER2 è
amplificato si tratta questo tumore con questo farmaco, e la prognosi è migliorata.
5) Normal-like breast cancer: questa classe è stata tolta.
289
Biochimica clinica
Esiste quindi una correlazione tra

espressione genica e prognosi. Nei
grafici Kaplan-Meier sono
rappresentati in blu i luminal A che
hanno una prognosi buona, con tasso
di sopravvivenza elevato. Le altre classi
hanno una sopravvivenza più bassa e le
curve scendono, soprattutto i triple
negative. C’è una correlazione tra
espressione genica e mutazioni che si
trovano in questi pazienti. I luminal A,
infatti, molto spesso sono mutati per
un gene chiamato PI3k ed esistono
anche dei farmaci per inibire il pathway
legato a mutazioni di PI3k. P53
praticamente è sempre wild type
(anche nei luminal B), mentre è mutata
nelle classi con prognosi negativa, quindi triple negative e HER2-enriched. Altre mutazioni sono meno
correlate, anche perché la mammella è un tumore po’ particolare.
Un gruppo di ricerca olandese, di Amsterdam, di cui fa parte la ricercatrice Laura J. van’t Veer, segue un
approccio basato sull’idea di partire da un tessuto fresco, proveniente direttamente dalle mastectomie che
arrivano dalla sala operatoria (MammaPrint). Questi campioni di tessuto vengono portati in anatomia
patologica, dove il patologo individua la lesione e, ancor prima di analizzare istologicamente il campione, ne
preleva una porzione, che viene messa in una provetta in cui si trova una soluzione preservante, che stabilizza
gli acidi nucleici, in particolare l’RNA che è molto instabile. A questo punto la provetta viene spedita in un
laboratorio centralizzato ad Amsterdam, che ogni giorno processa i campioni che vi arrivano e dà come
risultato uno score alto/basso rischio di sviluppare metastasi.
Ciò è possibile tramite un’analisi dell’espressione genica, svolta su 70 geni, che, secondo un algoritmo, è in
grado di prevedere in modo molto affidabile il rischio di metastatizzazione.
Quando si effettua un prelievo macroscopico, quello che si ottiene non sono soltanto le cellule tumorali, ma
potrebbero esserci all’interno del campione anche altri tipi di cellule: linfociti, cellule endoteliali, cellule
stromali, che ‘’contaminano’’ la popolazione di cellule tumorali.
Attualmente si sa che il microambiente circostante il tumore, collabora e comunica col tumore stesso, al fine
di facilitare la proliferazione tumorale. Per questo motivo, dal punto di vista dell’analisi, è positivo il fatto di
raccogliere nel campione anche le cellule non tumorali, poiché permette un’analisi più precisa e dà una
visione più ampia sulla situazione del tumore.
Grazie a questo algoritmo bioinformatico è quindi possibile stabilire una
soglia che stratifica le pazienti nei gruppi sulla base di un’analisi che viene
effettuata sul tumore primitivo; questo è un evento rivoluzionario,
poiché prima si riteneva che il potenziale metastatico venisse acquisito
dalle cellule tumorali soltanto nelle fasi avanzate della cancerogenesi.
Dunque, l’innovazione portata da questo studio non è stata soltanto
l’individuazione di 70 geni, che stratificano le pazienti nei due gruppi, ma
anche la consapevolezza che il tumore primitivo aveva già l’impronta per
decidere se il potenziale metastatico era alto o basso.
Tutti i pazienti sopra la linea gialla [a dx] hanno una prognosi positiva,
quelli sotto la linea gialla hanno una prognosi negativa. La prognosi
290
Biochimica clinica
riguarda in particolare il rischio di sviluppare metastasi entro 5 anni dal test [domanda d’esame frequente].
Stratifica i pazienti in base alla prognosi.
Osservando i grafici di sopravvivenza di Kaplan-Meier [a sx]
si osserva che c’è una notevole differenza tra le donne che
hanno una good signature e quelle che hanno una poor
signature.
In seguito, ci sono stati tutta una serie di lavori che hanno
confermato i dati iniziali.
Tuttavia, uno svantaggio di questo test è dato dal fatto che
la donna deve sapere già prima di essere operata se ha
intenzione di effettuare il test oppure no, poiché altrimenti
non è possibile avere i campioni idonei. Inoltre, questo test
ha un costo che non viene coperto dal servizio sanitario
nazionale e che è una spesa nell’ordine di grandezza dei
3000€, a causa dell’elevato costo legato alla strumentazione
necessaria per effettuare questi test.
Un’ulteriore difficoltà è legata al fatto che è necessario avere
campioni di tessuto fresco, poiché non si può partire da
tessuti conservati in paraffina, dato che l’RNA si degrada;
infatti è necessario avere RNA integro e in elevate concentrazioni, al fine di avere un risultato affidabile con
la tecnologia del microarray. Se si utilizza un processo di standardizzazione con un controllo della
temperatura, l’RNA si trova tutto frammentato e non è quindi idoneo per le analisi di microarray, anche se si
possono fare le analisi di PCR.
La limitazione legata alla necessità di partire da un tessuto fresco impedisce quindi di fare analisi
retrospettive, ma si possono svolgere soltanto analisi prospettiche.
Un altro gruppo, questa volta californiano, ha invece sviluppato un test alternativo, che si effettua utilizzando
la real time PCR, che valuta quantitativamente il DNA o l’RNA di un certo numero di geni. In questo caso si
possono analizzare pochi geni alla volta, ma sapendo quali geni si devono analizzare è un meccanismo molto
utile e permette di partire da paraffina, se è stata rispettata correttamente la standardizzazione nel processo
di fissazione dei tessuti.
In questo lavoro sono stati analizzati soltanto 16 geni, utilizzando quindi un approccio molto diverso rispetto
a quello degli olandesi (che hanno invece analizzato tutti i 21.000 geni del genoma umano e hanno poi
selezionato i 70 più significativi: si tratta quindi di un’analisi non supervisionata, in quanto non si conoscono
a priori quali geni andare a indagare, ma facendo un’analisi globale di tutto il genoma si arriva poi a capire
quali geni fossero rilevanti).
L’ approccio dei californiani è basato sul fatto che in letteratura erano noti 16 geni che risultano alterati nei
casi di tumori della mammella, e sulla differente espressione di questi geni nei casi di tumori metastatici/non
metastatici: questi geni analizzati sono i classici geni noti per essere associati alla proliferazione cellulare.
Inoltre, è necessario avere dei geni normalizzatori, ovvero geni che sono costitutivamente espressi anche nei
tessuti sani, che servono per valutare il normale livello di espressione genica.
Anche con questo studio è stato possibile suddividere le pazienti in alto, medio e basso rischio di sviluppare
metastasi, come si osserva dalla curva di Kaplan-Meier [pagina seguente] derivata da questo studio.
In questo studio i casi analizzati sono molti di più poiché, potendo utilizzare i campioni conservati in paraffina,
si avevano molti più campioni idonei, giacché i reperti di anatomia patologica devono sempre essere
conservati per almeno 20 anni e quindi si è potuti andare a ritroso studiando un enorme numero di campioni.
Infatti, è importante considerare che è estremamente importante la fase di processazione dei campioni,
291
Biochimica clinica
durante la quale possono essere fatti danni irreversibili, che

rendono i campioni inutilizzabili. Se invece un campione è
trattato e poi conservato correttamente esso potrà essere
utilizzato anche fino a molti anni dopo la sua preparazione.
Anche con questa seconda metodica il costo del test è di
circa 3000€, sebbene in questo caso il costo di esecuzione
sia sicuramente inferiore, per il minor numero di geni che
vengono analizzati e per la diversa tecnologia utilizzata.
Chiedendosi quante tra le donne malate di tumore al seno
possono permettersi di effettuare questi due test ci si rende
conto che non sono moltissime, poiché essi in Italia non
sono coperti dal Servizio Sanitario Nazionale, mentre in
America o in Svizzera al massimo possono essere coperti da
alcune assicurazioni.
Dunque, si è cercato di riunire gli aspetti positivi

dei due progetti, quello olandese e quello
californiano, cercando di proporre un test che
sia affidabile ma comunque accessibile alle
persone meno abbienti. Il nuovo test si basa
sull’analisi non supervisionata di tutto il
genoma, utilizzata nello studio olandese, ma
utilizza la RT-PCR, in modo da non essere
costretti a partire da un preparato a fresco.
Inizialmente si è partiti dall’analisi di 20 geni
significativi, fino a poter arrivare ad analizzarne
soltanto 5, riuscendo comunque a stratificare le
pazienti nei 3 gruppi di rischio. In questo modo
è stato quindi possibile ottenere un test
affidabile, ma a un prezzo abbordabile.
Esempio del tumore al colon-retto metastatico e paradigma del Cetuximab

Il Cetuximab è un anticorpo monoclonale che riconosce selettivamemte l’EGFR, recettore per l’Epidermal
Growth Factor, una molecola correlata a molti tipi di tumore, poiché si tratta di un recettore che, quando
viene stimolato dal proprio ligando (EGF), dimerizza e va ad attivare il pathway della MAPK, mandando
segnali al nucleo cellulare e regolando i meccanismi di sopravvivenza, progressione del ciclo cellulare e
angiogenesi.
L’anticorpo monoclonale Cetuximab riconosce e blocca EGFR, il quale così non può più dimerizzare e mandare
segnali a valle, dove sono presenti oncogeni come RAS e RAF.
Tuttavia utilizzando il Cetuximb, che blocca la via al livello del EGFR, se si ha una mutazione che rende
costitutivamente attivo un oncogene a valle, non si ottiene alcun effetto terapeutico con l’utilizzo di tale
farmaco.
292
Biochimica clinica
Dunque prima di somministrare il farmaco, è necessario effettuare un test

mutazionale a ogni singolo paziente, al fine di valutare la presenza di
un’eventuale mutazione di RAS o RAF. Essa infatti renderebbe inutile la
sommistrazione dell’anticorpo monoclonale, che essendo una terapia
molto costosa (10.000€ a paziente quando è uscito il Cetuximab) deve
essere utilizzata soltanto nei pazienti che ne potrebbero trarre un effettivo
beneficio, anche al fine di evitare l’esposizione dei pazienti a inutili effetti
collaterali legati alla somministrazione del farmaco.
È quindi essenziale associare ogni nuovo farmaco che esce all’utilizzo di test
che permettano di capire quali sono i pazienti che potranno beneficiare o
no di quella specifica terapia. Non si va più a trattare un ‘’tumore medio’’,
ma lo specifico tumore, di ogni specifico paziente, con le sue speficifiche
mutazioni e caratteristiche genetiche.
RAS ha mutazioni soprattutto nei
codoni 12, 13, 61, 147. Nella tabella a fianco è possibile visualizzare le
mutazioni più frequenti: nel codone 12 si ha, dopo una glicina, un acido
aspartico nel 35% dei casi, una valina nel 28% .
Come la maggior parte degli oncogeni, RAS ha degli hotspots cioè dei
punti caldi in cui possono esserci più frequentemente mutazioni che
danno un’attivazione costitutiva dell’oncogene.
Approfondimento: Nomenclatura delle mutazioni

Le mutazioni, dal punto di vista delle linee guida internazionali, vengono annotate con delle particolari
convenzioni. Normalmente nei referti si annota la mutazione a livello della proteina. Vengono indicati i codoni
coinvolti nella mutazione e il cambio amminoacidico.
(p [sta per proteina] – nome dell’amminoacido wild type – numero del codone – amminoacido mutato)
Esempio: p.G12D indica una mutazione di una glicina sostituita con un acido aspartico sul codone 12.
Gli amminoacidi possono essere indicati con la nomenclatura a una o a tre lettere.
Meno frequentemente si trova la nomenclatura riferita al DNA.
Esempio: c.76A>T o g.476A>T
C.=coding; 76= base mutata contata dall’inizio della trascrizione, A=base wild type, T=base mutata, g.=
genomic.
Attualmente per la lettura dei referti esistono dei software che aiutano a comprendere il potenziale cambio
nella funzione di una proteina a seguito di una mutazione missenso, in base alla differenza tra l’AA wild type
e quello mutato.
Questi algoritmi si basano sulla storia delle mutazioni di moltissime proteine, analizzando anche quanto è
conservata la funzione di una proteina a seguito di una specifica mutazione aminoacidica. Chiaramente in
alcune proteine particolarmente studiate, come RAS gli effetti delle varie mutazioni sono più noti che in altre.
In ogni caso una specifica mutazione può dare risultati molto diversi in base alla proteina in cui essa si trova.
293
Biochimica clinica
Tornando al discorso su Cetuximab, oltre a KRAS anche

BRAF, leggermente più a valle, è un oncogene e il
codone problematico per eccellenza, in cui sono
frequenti mutazioni è la mutazione p.V600E, che è
presente in più del 90% dei casi.
Infatti è possibile distinguere pazienti non responder al
trattamento con Cetuximab, ossia i pazienti che hanno
KRAS mutato (40% dei tumori colorettali metastatici),
pazienti con BRAF mutato (10%) e altri pazienti in
percentuali non note che sono non responder a causa di
una mutazione a livello di PTEN o per ragioni
attualmente sconosciute.
Tra i pazienti che invece rispondono efficacemente alla
Wong & Cunningham 2008
terapia vi è il 22% di pazienti che rispondono alla dose standard e il 5% che rispondono a una dose lievemente
aumentata. Al momento alcuni meccanismi di risposta/non risposta non sono ancora chiari, ma è importante
effettuare questa tipologia di test al fine di prevedere la risposta il più possibile. È importante sottolineare
che devono essere analizzate le mutazioni somatiche, poiché RAS non è mutato alla nascita del paziente (non
è una mutazione germinale, come ad esempio quella di BRCA nel tumore alla mammmella). Le analisi devono
quindi essere fatte a partire da una biopsia del tumore, dal quale viene estratto il DNA, che viene poi
sequenziato, oppure si utilizza la RT-PCR. KRAS ha solo alcuni codoni che vanno incontro a mutazione e quindi
non è necessario effettuare un sequenziamento di tutto il genoma, ma è sufficiente utilizzare la RT-PCR, che
riesce a quantificare gli alleli mutati nel tessuto in esame.
B2.2.4 Real time-PCR

Nella PCR vengono utilizzati due primer, frammenti di 20-25 bp, che sono in
grado di riconoscere selettivamente una porzione del genoma per la loro
sequenza. Nella prima fase si ha una denaturazione del DNA, con la separazione
del doppio filamento. Poi si ha la fase di annealing, in cui i primer si legano ai
singoli filamenti nella regione di interesse e infine si ha la fase di allungamento
in cui la polimerasi ciclo dopo ciclo inizia a sintetizzare nuovo DNA a partire dal
filamento stampo. In questo modo si ha un’amplificazione esponenziale del DNA
e partendo da pochissimo materiale iniziale dopo 35-40 cicli si hanno milioni di
copie identiche di una specifica sequenza di 100-200 bp.
La RT-PCR serve sostanzialmente per analizzare la quantità iniziale di DNA. Ciò
avviene utlizzando un’ulteriore sonda interna, che riconosce selettivamente una
specifica porzione di genoma. Attaccati alla sonda interna sono presenti da un
lato un fluorocromo, che emette fluorescenza e dall’altro lato un quencher che
nasconde l’emissione del fluorocromo, se essi sono vicini. Quindi più il quencher e il fluorocromo si trovano
vicini e più è bassa l’emissione di fluorescenza. Quando la sonda a DNA è integra, si hanno minime quantità
di fluorescenza emesse, proprio perché il quencher è vicino al fluorocromo. Tuttavia, quando la polimerasi
inizia a sintetizzare il nuovo filamento, incontrerà la sonda durante il suo tragitto e siccome la polimerasi ha
un’attività 5’à3’ esonucleasica, essa taglia la sonda e la frammenta in piccoli pezzettini, portando al
distanziamento del fluorocromo rispetto al quencher, perché la sonda a cui appartengono viene degradata.
Perciò, ciclo dopo ciclo, si avrà sempre l’emissione di una maggiore fluorescenza, poiche si ha sempre una
maggiore quantità di DNA neosintetizzato e quindi di fluorocromi staccati dal quencher. La tecnica si chiama
“real time” proprio perché ciclo dopo ciclo si osserva la fluorescenza emessa da ogni pozzetto e da ciò si può
stimare la quantità di DNA di partenza, poiché avendo ad esempio 10 copie di materiale di partenza, saranno
necessarî molti cicli per superare la soglia, mentre se si hanno molte copie iniziali, sono necessarî meno cicli
per raggiungere la stessa soglia.
294
Biochimica clinica
Tipologie di RT-PCR
Esistono due tipologie di RT-PCR, quella assoluta e quella relativa.
La PCR assoluta viene utilizzata per l’identificazione dei virus, ad esempio SARS-CoV-2, per il quale vengono
utilizzate tre regioni del genoma virale. Si analizzano contemporaneamente degli standard, ossia dei virus o
degli artefatti che simulano la presenza del virus, in concentrazioni note in 4 pozzetti diversi. Si delimita così
una sorta di curva standard che poi deve essere confrontata con quella dei pazienti per capire quante copie
per campione o per ml sono presenti.
HIV, HBV e HCV vengono valutati per mL di plasma, mentre per l’analisi di SARS-CoV-2 si utilizza un campione
differente; in ogni caso la PCR assoluta indica il numero di copie presenti in un determinato campione.
La RT-PCR relativa invece serve a quantificare l’espressione genica dei geni di interesse, come ad esempio è
stato fatto nello studio californiano precedentemente descritto per lo studio della prognosi dei tumori al
seno. Si devono utilizzare dei normalizzatori, ossia dei geni che sono costitutivamente espressi e che quindi
fungono da controllo, per valutare se gli altri geni sono espressi o down-regolati. Si valuta quindi quante volte
un gene è espresso rispetto al normalizzatore.
RT-PCR e analisi mutazionali

Per le analisi mutazionali ci sono due modi di identificare le mutazioni con la RT-PCR. Il metodo peggiore è
quello di utilizzare una sonda per identificare le mutazioni. Ci sono sonde in grado di riconoscere il gene wild
type e altre sonde che invece riconoscono la mutazione. Dato che la sonda si lega solo quando c’è una
perfetta corrispondenza col suo target, si riesce a identificare la presenza o meno della mutazione. Tuttavia
questa metodologia ha un bassa sensibilità perché non si riesce a trovare la presenza di una piccola quantità
di mutazioni in una situazione in cui siano più numerose le cellule coi geni wild type.
Al fine di avere invece una maggiore sensibilità, si devono utilizzare dei primer capaci di riconoscere
nell’ultima base la presenza di una mutazione. Ad esempio, per KRAS si utilizzano 7 primer diversi che
riconoscano le 7 mutazioni più frequenti e poi i primer che riconoscano il wild type. In questo caso dunque si
utilizzano 8 diverse provette, ognuna con un primer diverso, in modo tale che essendo i primer a riconoscere
la specifica mutazione per cui sono costruiti, si ottiene una sensibilità molto maggiore rispetto a quella col
metodo delle sonde. È infatti possibile trovare anche una sola cellula mutata tra 1.000 -10.000 normali.
Facendo dei test di sensibilità si osserva che per KRAS si arriva anche allo 0,1-0,01% di sensibilità.
Il metodo delle sonde è un metodo che viene ancora commercializzato, ma dal momento che col metodo dei
primer si ha una sensibilità estremamente maggiore è meglio utilizzare quello, anche perché permette di
evidenziare proprio le mutazioni.
La real time-PCR offre dei vantaggi perché riesce a essere sensibile e specifica nello stesso modo, però
presenta un limite: non è possibile analizzare tante mutazioni in contemporanea, poiché è necessario
disegnare tanti primers di riconoscimento delle varie mutazioni. Questo approccio resta, quindi, valido per
gli oncogèni, ma per gli oncosoppressori, che presentano un numero elevato di mutazioni, risulta impossibile
effettuare un test allele-specifico mediante i primers. Si vedrà che il sequenziamento di Sanger ha una
sensibilità molto bassa, tale per cui devono esserci almeno 20 cellule mutate per poter essere identificate.
B2.2.5 PCR-LOH (loss of heterozygosity)

[Dalla dispensa vecchia]
La PCR-LOH analizza i microsatelliti, porzioni di genoma che possono essere mononucleotidici, costituiti da
tante timine in tandem ripetute n volte (tandem repeats), o anche dinucleotidici (ACACAC..), trinucleotidici,
tetranucleotidici (molto utilizzati in medicina forense: si utilizzano una ventina di marcatori tetranucleotidici
la cui variabilità consente di verificare l’identità dell’incriminato nella scena di un crimine; si preleva il DNA e
si valutano le combinazioni di polimorfismi, che essendo molto variabili sono un ottimo indice per risalire
all’identità; unico caso di non variabilità sono i gemelli omozigoti).
295
Biochimica clinica
I microsatelliti sono altamente polimorfi: ad esempio, la

timina può essere ripetuta 20 volte nel padre e 25 nella
madre: ereditando i due alleli si crea una variabilità.
Questo è utile anche nella ricerca di marcatori tumorali.
Ad esempio, se vi è eterozigosi per un determinato
microsatellite che è mappato sul cromosoma 1p, allora
naturalmente tutte le cellule saranno in eterozigosi; se vi
è una delezione solo nelle cellule tumorali, si può perdere
un allele.
Se si esegue una PCR fiancheggiante il microsatellite, ossia
con dei primer che si legano a regioni fiancheggianti la
regione di interesse, si può risalire all’esistenza di due alleli
o di uno solo in base alla lunghezza dell’amplicone. Si
confrontano il DNA normale e il DNA tumorale: nel DNA
normale si presentano due picchi (150 e 164), mentre nel
DNA tumorale è presente solo il picco da 150. Questo
significa che c’è stata una delezione nella cellula tumorale.
B2.2.6 Sequenziamento di Sanger

Il Sanger sequencing prende il nome dal suo sviluppatore, Frederick Sanger, il quale, nel 1980, ricevette il
secondo premio Nobel per questa creazione; il primo premio Nobel fu, invece, relativo al sequenziamento
dell’insulina.
Funzionamento
Quando una polimerasi crea un nuovo filamento
effettua una reazione di condensazione tra due basi
con formazione di un cosiddetto ponte ossigeno e
liberazione di pirofosfato. Nell’immagine si vede una
guanina presentante un gruppo ossidrilico e
un’adenina trifosfato: avviene una condensazione
con distacco di due fosfati.
Sanger ebbe l’idea di introdurre due molecole
didesossinucleotidi (ddNTP), ossia delle molecole che
non hanno un gruppo ossidrile (presentano -H
anziché -OH). Inserendo queste molecole nella
reazione la catena di allungamento si ferma in
corrispondenza di una base, poiché la polimerasi non
riesce a formare un ponte ossigeno tra il fosfato e il
ribosio.
296
Biochimica clinica
Ad oggi si impiega l’utilizzo di fluorocromi:

ognuna delle 4 basi didesossinucleotidi è legata
a un fluorocromo di colore diverso. All’interno
della provetta non si inserisce tutto il genoma,
ma si va prima ad amplificare la regione di
interesse con la PCR; solitamente si utilizzano
sequenze con un numero di paia di basi
compreso tra 100 e 600. Si purifica la PCR e si
inserisce un solo primer; in genere si fanno due
reazioni di sequenziamento: una col forward
primer e una col reverse primer. Mediante
l’utilizzo del forward primer si ricostruisce la
sequenza, mentre col reverse primer si ottiene
la sequenza opposta che permette di verificare
il risultato. L’analisi di entrambe permette una corretta analisi mutazionale della sequenza di interesse.
Dopodiché si inserisce nella provetta la miscela contenente desossinucleotidi e didesossinucleotidi.
Se vengono inserite, ad esempio, 600 paia di basi si otterranno molecole di lunghezza diversa da 20 bp,
corrispondente al primer, fino a 600 bp, perché la catena si blocca in corrispondenza di ciascuna delle basi
che sussegue il primer.
Per ricostruire la sequenza è fondamentale
che i quattro didesossinucleotidi abbiano
colore diverso.
Le catene di DNA bloccate vengono fatte
correre lungo un capillare elettroforetico con
una matrice, la quale permette la corsa della
molecola in base alla loro lunghezza: più è
corta la molecola, più velocemente
raggiungerà il punto finale, il cosiddetto
detector. Alla fine del capillare si trova un laser
che eccita i quattro fluorocromi ed è in grado
di rilevare i colori.
La prima molecola che raggiunge il detector
sarà la base successiva al primer, ne viene
individuato il colore e si assegna la base
corrispondente. Si viene così a creare un file di
testo che rappresenta la sequenza del DNA.
Nell’immagine sono presenti una sequenza
forward, in alto, e una reverse, in basso. Si può
notare una sovrapposizione di due colori in
una stessa posizione di base. Il picco verde
corrisponde alla guanina, il picco rosso
all’adenina. Dato che dovrebbe esserci una
sola base, questo indica la presenza di una
mutazione.
Per eseguire correttamente quest’analisi è
importante avere a disposizione molte cellule
mutate, poiché il Sanger sequencing ha una
detection del 20%, il che significa che il 20%
delle molecole di DNA da sequenziare devono
297
Biochimica clinica
contenere la mutazione per essere rilevate in modo affidabile. In alternativa si possono comparare i risultati
di un sequenziamento Sanger con quelli ottenuti da una real time-PCR, dato che quest’ultima è in grado di
studiare correttamente tessuti con una mutazione inferiore al 20%.
[Agli esami chiede spesso la detection del Sanger sequencing.]
La RT-PCR è più sensibile del Sanger (O.1% vs 20%).
Ci sono molti tumori che hanno eterogeneità tumorale: ovvero non tutte le cellule della popolazione
tumorale condividono le stesse mutazioni. Ci sono cloni diversi che hanno caratteristiche genetiche diverse
e questo crea problemi nella terapia.
Il sequenziamento di Sanger ha una sensibilità molto bassa e quindi si fa fatica a identificare i cloni e i sub-
cloni, anche perché nella porzione di tessuto selezionato dall’anatomopatologo non ci sono solo cellule
tumorali ma anche infiltrato linfocitario che è normalmente wild type e che contamina il tessuto tumorale.
Il NGS riesce ad essere molto sensibile (arriva all’1%) quasi come la Real Time PCR, e va a vedere tutto il
genoma in una sola volta.
Uno svantaggio del sequenziamento di Sanger è che, dovendo svolgere un gran numero di reazioni, impiega
tempi molto lunghi per realizzare un sequenziamento. Per questo motivo ad oggi viene frequentemente
utilizzata la NGS sequencing, presente in tutti gli ospedali medio-grandi.
Nell’immagine sottostante viene rappresentato lo studio fatto su un tumore al polmone in cui inizialmente
si testavano solo KRAS e EGFR in analisi mutazionali: EGFR aveva 4 esoni implicati (esoni 18, 19, 20, 21), KRAS
ne aveva 3 (esoni 2, 3, 4).
Oggi si ha la necessità di avere dei pannelli di geni analizzati in parallelo, sono necessari almeno 20-30 geni
per capire che farmaco dare al paziente. Diviene troppo oneroso il sequenziamento di Sanger e si preferisce
NGS, più idonea.
298
Biochimica clinica
B3. NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)

(prof. Morandi)
B3.1 INTRODUZIONE
Il Progetto Genoma Umano è partito negli anni ’90, anche grazie a un italiano, Renato Dulbecco, il quale ha
ricevuto un premio Nobel, ed è durato circa 13 anni. Le prime due pubblicazioni apparvero su Nature e su
Science nel 2001, dove era stato sequenziato il DNA; ci vollero altri due anni e mezzo per assemblare il
genoma. Furono coinvolti due consorzî, uno pubblico e uno privato (Celera Genomics fondato da Craig
Venter) e furono impiegati 3 miliardi di dollari.
Parlando di numeri, l’uomo possiede 22 cromosomi oltre XY, le basi sono circa 6,4 miliardi; l’esoma, che
rappresenta l’1,5% del genoma totale, è di circa 34 Mb.
All’inizio degli anni 2000 Jonathan Rothberg, ingegnere biomedico americano, ebbe in famiglia un grave
problema di salute per cui il figlio venne portato in
terapia intensiva. I clinici gli dissero che per trovare una
soluzione avrebbero dovuto sequenziare il DNA del
bambino e che avrebbero impiegato 13 anni e 3 miliardi
di dollari. Questo lo spronò a creare una propria
piattaforma di sequenziamento, che venne terminata
nel 2007 e prese il nome di 454 FLX System. Questa
piattaforma permise una riduzione drastica dei costi e
dei tempi. Riuscì a sequenziare il genoma di Watson in
6 mesi, spendendo 2 milioni di dollari.
Ad oggi sequenziare un’esoma costa circa 250 euro.
Ci sono diverse piattaforme sul mercato oggi. Il numero di Gb per singola corsa per il Sanger è piccolissimo.
Con NGS ci sono talmente tante sequenze in parallelo da leggere (escono dalla piattaforma decine e centinaia
di milioni di sequenze) che si può leggere tutto il genoma almeno 100 volte in una sola notte.
• Piattaforma Illumina: ha il 90% del mercato perché è la più efficiente e la più attendibile.
• Piattaforma Roche: creata dallo stesso inventore del 454-NGS, Jonathan Rothberg, prevede la stessa
tecnologia del FLX ma utilizza variazioni di pH per leggere l’incorporazione dei nucleotidi. Questo gli
permise di risparmiare molti soldi per quanto riguarda il prezzo della singola corsa.
B3.2 454-NGS – PARALLEL SEQUENCING

Parallel Sequencing: DNA paziente X, si frammenta in piccole porzioni da 400-500 basi tramite una
“sonificazione”, si attaccano a destra e a sinistra degli adattatori (sequenze di DNA note e universali) con la
ligasi, ciò permette la deposizione del DNA del paziente sulle cosiddette “flow cell” [vedi più avanti
“Piattaforma Illumina”].
Il “454” (four-five-four) è una sistema per NGS che funziona tramite “biglie”, sfruttando il concetto di
miniaturizzazione. Il genoma da analizzare viene spezzato in piccoli frammenti lunghi circa 300 bp e inserito
in queste biglie. I frammenti, tramite l’enzima ligasi, vengono attaccati a adattatori universali, sia a destra
che a sinistra a ogni molecola di DNA del paziente. Nel 454 questa metodica non avviene una provetta alla
volta, come nel Sanger Sequencing ma, disponendo di un alto numero di biglie (per es. 100 mila), la reazione
avviene in parallelo su ognuna di esse (da qui il termine Parallel Sequencing).
299
Biochimica clinica
Il punto di svolta nello sviluppo della piattaforma fu dato dalla miniaturizzazione e dalla frammentazione del
genoma. Rothberg ebbe l’idea di frammentare il genoma in piccole porzioni, normalmente di 300 bp, grazie
a un sonicatore che svolge questo lavoro per mezzo di ultrasuoni.
Fatto ciò, si procede a unire degli adattatori

universali ai diversi frammenti su ambo i lati,
utilizzando le ligasi. Ogni molecola avrà, quindi,
legati due adattatori. Rothberg pensò di
usufruire di biglie di dimensioni minuscole che
possono essere depositate in pozzetti di
diametro 44 µm.
Vengono presi migliaia di pozzetti, ciascuno dei
quali può ospitare una sola biglia. Dopodiché
vengono uniti i frammenti alle biglie con
rapporto 1:1. Questo legame avviene grazie a
degli oligonucleotidi legati alle biglie, che
risultano essere complementari agli adattatori
dei frammenti. È importante che ciascuna biglia non sia legata a più di un frammento, piuttosto è preferibile
che resti non appaiata, per questo normalmente si aggiungono meno molecole di biglie.
Queste biglie hanno la funzione di amplificare la molecola di DNA appaiata a loro, avviene una sorta di PCR
a emulsione: mediante l’utilizzo di olio si genera una sorta di cameretta attorno alla biglia che permette la
reazione di PCR con coinvolgimento della Taq polimerasi. Si ottengono migliaia di copie identiche al
frammento, tutte legate alla medesima biglia. Si fa la medesima procedura per tutte le biglie.
Le biglie vengono poi depositate su una piastra Pico Titer insieme ai corrispettivi pozzetti, ciascun pozzetto
conterrà una sola biglia.
A questo punto si comincia a sequenziare le migliaia di molecole che sono state amplificate sulla biglia. Viene
dapprima aggiunto un primer che si appaia dopo aver riconosciuto l’adattatore. Vengono poi aggiunte le basi,
una per volta fino a che non si trova quella complementare alla base presente nella sequenza, che verrà
300
Biochimica clinica
legata al primer grazie alla polimerasi. Questo

legame determina la liberazione di
pirofosfato. All’interno del pozzetto sono
presenti altri substrati, quali APS, ATP e
luciferina, enzima presente nelle lucciole che
conferisce luminosità. Avvengono una serie di
reazioni per cui la liberazione di pirofosfato
genera una reazione luminosa, la quale indica
che la base è stata incorporata in quella
determinata posizione. Si utilizza una camera
che è in grado di acquisire queste luminosità.
Ogni qualvolta avviene l’incorporazione di un
nucleotide in un pozzetto, si ha un’emissione
luminosa che viene catturata dalla camera. Il
sistema è in grado di capire in quale posizione
sta avvenendo l’incorporazione e di attribuire
correttamente la base alla sequenza. Il
problema insorge laddove la medesima base
si trovi ripetuta in tandem per più di cinque
volte. Infatti, quando la stessa base è ripetuta
in maniera continua per un numero pari o
inferiore a cinque, viene emessa una
luminosità maggiore ed è possibile rilevare
quante ripetizione sono presenti
(nell’immagine sono ad esempio presenti
quattro adenine di fila). Se le basi ripetute in
tandem sono più di 5, il sistema non è in grado
di capire quante basi ha incorporato.
Questo problema degli omopolimeri è
comune al 454 FLX così come a ION Torrent,
ovvero il secondo sistema sviluppato da
Rothberg. Egli creò questo nuovo sistema per
sopperire allo svantaggio dato dai costi
elevati. ION Torrent presenta un meccanismo
simile a 454 FLX, ma utilizza biglie di diametro
minore e sfrutta la variazione del pH per
sostituire la luciferina, molto costosa. Viene
inserito in ogni pozzetto un pH-metro che
valuta la diversità del pH che si genera
ogniqualvolta viene rilasciato pirofosfato.
Questo nuovo sistema, oltre ad aver
diminuito drasticamente i costi, ha permesso
l’aumento del numero di biglie a disposizione. Permane il problema delle basi in tandem, che è stato risolto
con la piattaforma Illumina.
B3.3 PIATTAFORMA ILLUMINA

Jonathan Rothberg, padre della cosiddetta seconda generazione del sequenziamento del DNA, ha sviluppato
ION torrent, sua seconda piattaforma, che permette di sequenziare porzioni limitate di genoma. La
301
Biochimica clinica
piattaforma è ancora in uso, ma il

suo limite deriva dal numero esiguo
di “biglie” che impedisce di
sequenziare tutto il genoma. Può
infatti sequenziare un esoma, ma
non di più. La piattaforma che
detiene il 90% del mercato è,
invece, Illumina. La sua macchina
più performante in termini di
precisione e numero di sequenze in
output per corsa è NovaSeq 6000 (in
alto a destra nell’immagine); può
sequenziare una cinquantina di
genomi totali in contemporanea e
fino a 400 esoni. Ha inoltre ridotto
drasticamente i costi: il
17
sequenziamento di un esone costa 250€. I vari strumenti della famiglia hanno “throughput ” crescente. (Es.
MiSeq processa fino a 25 milioni di sequenze, NextSeq 500 può sequenziare un genoma intero, fino a
NovaSeq 6000).
B3.3.1 Funzionamento
La piattaforma Illumina è la piattaforma che maggiormente ha preso piede nei laboratori del mondo (per
adesso: l’innovazione infatti, in questo settore, procede a una velocità incredibile: nel 2008 è stato
sequenziato il genoma di Watson in sei mesi con la piattaforma 454, ora con 1000 euro possiamo sequenziare
tutto il genoma). Questa piattaforma permette di sequenziare un intero genoma in una notte.
Ogni pezzetto di DNA purificato dal paziente va frammentato e a ciascun pezzetto (di 300-400bp) vanno legati
due adattatori diversi. La frammentazione avviene spesso per ultrasonicazione, quindi per un principio fisico,
o più raramente tramite enzimi come trasposasi. Con le nuove piattaforme, ad esempio Covaris, si ha una
standardizzazione più elevata: si può aggiustare la lunghezza e frammentare di più o di meno, ma
normalmente si frammenta in 300-400 bp.
Si legano con una ligasi alle due estremità dei frammenti degli adattatori, ossia sequenze nucleotidiche
universali (universali per la piattaforma che si usa, diversi quindi tra Illumina, Ion Torrent ecc.). Tutti i
frammenti, quindi, avranno gli stessi adattatori, in modo tale che questi ultimi possano riconoscere le
sequenze complementari che ci sono sulla flow cell. Sulla superficie del vetro sono depositate le sequenze
complementari agli adattatori, permettendo quindi che si riconoscano e si leghino sulla flow cell.
A questo punto, grazie a una polimerasi, avremo la polimerizzazione e la formazione di un doppio filamento.
Per denaturazione, il filamento originale si stacca e viene lavato via, mentre il filamento reverse appena
formato va a formare una struttura a forcina, riconoscendo l’adattatore complementare sulla flow cell. Grazie
all’aggiunta della polimerasi cominciano quindi a formarsi dei cluster di molecole di DNA identici al primo
frammento (bridge PCR). Quindi, inserendo un milione di frammenti di DNA appartenenti a un paziente sulla
flow cell, dopo alcuni cicli di PCR, si otterranno un milione di cluster relativi a ogni singolo frammento
aggiunto18.
17
Numero di sequenze processate contemporaneamente.
18
https://www.youtube.com/watch?v=HMyCqWhwB8E
302
Biochimica clinica
Ricapitolando:
1) Vengono aggiunte n molecole
(derivate dai genomi delle
cellule del campione,
prelevato e frammentato)
all’interno della flow cell.
2) Tramite gli adattatori, i

frammenti legano gli
oligonucleotidi presenti
sulla piattaforma.
3) Bridge PCR: amplificazione

di ogni molecola sulla flow
cell, in modo da avere un
clone identico partendo
dalla singola molecola, il
risultato sarà un numero di
cluster pari al numero di
oligonucleotidi appiccicati
inizialmente alla flow cell.
Questo procedimento è necessario perché non si può sequenziare una molecola alla volta, ma c’è bisogno di
amplificare i frammenti in modo da avere un segnale “detectable”, ossia un segnale che raggiunga un minimo
di intensità di fluorescenza perché possa essere catturato. Bisogna amplificare clonalmente la singola
molecola, cosa che si fa con la bridge PCR (PCR a ponte), con formazione di una serie di cluster. Il risultato
sarà un segnale identico per ogni molecola del cluster e il numero di cluster sarà pari al numero di sequenze
che avremo alla fine della corsa (run).
Il sequenziamento avviene aggiungendo in soluzione delle basi legate a un fluorocromo, diverso in base al
tipo di base: 4 basi, 4 colori diversi.
303
Biochimica clinica
La polimerasi è presente in fase liquida (avviene tutto in fase liquida, aggiungendo in base alle necessità i varî
componenti) e a ogni ciclo vengono aggiunte le 4 basi coi 4 fluorocromi diversi (mentre con Ion Torrent non
era possibile, bisognava aggiungere una base alla volta).
A ogni ciclo quindi accumuliamo informazioni base dopo base: per esempio, se nel filamento da sequenziare
c’è una A, si appaierà una T e tutte le molecole del cluster emetteranno la fluorescenza relativa alla timina,
rendendo rilevabile il segnale sotto forma di un pallino luminoso. Dall’alto si vedranno quindi dei pallini, ciclo
dopo ciclo: tanti pallini luminosi quanti sono i cluster che abbiamo formato sulla flow cell.
Il sistema cattura la fluorescenza emessa coi 4 colori diversi in ciascuno dei pallini e assegna ciascuna base a
ciascun cluster, perciò base dopo base viene letta la sequenza del frammento del genoma del paziente. Alla
fine di ogni ciclo c’è un enzima che taglia via il fluorocromo appiccicato alla base integrata, che altrimenti
sarebbe un segnale aberrante per la base che viene dopo. Quindi ciclo dopo ciclo si taglia il fluorocromo
appiccicato alla base, si lava via tutto e si continua con il ciclo successivo, si aggiungono 4 basi, i 4 colori
diversi, poi c’è la lettura e l’assegnazione della base.
Il software è nato grazie a una collaborazione tra astrofisici e Illumina, tramite un algoritmo utilizzato per
osservare le collocazioni delle stelle nel cielo.
La caratteristica di Illumina è la
possibilità di poter leggere in
entrambi i versi: a ogni lavoro di
sequenziamento verranno prodotti
due tipi di file che consentiranno una
lettura in entrambi i versi. Grazie a
dei tool del software, il file può
essere utilizzato per confrontare la
sequenza col tratto di genoma
umano di riferimento in modo da
valutare se ci sono mutazioni. I
quattro colori usati per quattro basi
nel sequenziamento richiedono quattro scansioni per ogni ciclo. Questo comporta un tempo maggiore
nell’ottenere i risultati, così nel cercare di ottimizzare i costi dei fluorocromi e il tempo, Illumina ha sviluppato
anche un sistema a due colori:
• timina: verde;
• citosina: rosso;
• adenina: una miscela di rosso e verde;
• guanina: nero.
Il numero di spot dipende dalla flow cell; questo evento
di fluorescenza permette la lettura sia in forward sia in
reverse, per avere una consistenza maggiore
nell’assegnare ciascuna base alla posizione che andiamo
a individuare: in questo caso si parlerà di Paired-End.
Normalmente, la maggior parte delle corse viene
effettuata in Paired-End, per rendere il risultato più
attendibile, ma ci sono alcune eccezioni: per frammenti
molto corti, come i micro-RNA, che misurano 20-22 bp, è
sufficiente la Single-Read, per esempio.
Il sistema può essere impostato in 4 colori, quindi un
colore per base: Illumina invece, per risparmiare, utilizza
2 soli fluorocromi, che sono una componente molto
costosa (timina verde, citosina rossa, l’adenina è una
miscela tra rosso e verde, la guanina è “dark”, non ci
sono fluorocromi: siccome il sistema sa che in un certo
punto c’è un cluster, quando c’è buio, significa che è legata una guanina).
304
Biochimica clinica
Ciascuna base del genoma va letta tante volte per essere sicuri nel caso si trovi una mutazione di punto, per
esempio. Questo significa che bisogna dedicare un certo numero di cluster, e quindi di sequenze, per quella
porzione genomica.
Nelle macchine più recenti si possono analizzare campioni di DNA

di pazienti diversi. Il riconoscimento di più pazienti nella flow cell
è possibile grazie a barcode di DNA, ovvero sequenze note di DNA
diverse tra loro, che stabiliscono un codice di riconoscimento per
ogni paziente. Oltre all’integrazione di adattatori che
riconoscono i frammenti, si possono inserire degli indici a sinistra e a destra del frammento che possono
essere utilizzati per riconoscere un paziente dall’altro. Ogni paziente è individuato da una combinazione di
nucleotidi a destra e sinistra per un totale di 96 combinazioni possibili.
B3.3.2 Depth of coverage

Def. Coverage = regione di genoma o regione target che è stata sequenziata.
Def. Depth = numero di volte in cui una singola base di una regione è stata sequenziata.
Def. La depth of coverage rappresenta quante volte il sistema è in grado di leggere la singola base
presente in una determinata posizione del filamento di DNA. Maggiore è il numero di sequenze che si
assegnano a quella porzione, maggiore è la possibilità di trovare la mutazione che volevo.
I primi sistemi NGS compivano diversi errori, solitamente 1 ogni 10 o 100 basi e, per questo motivo, non ci si
può limitare a una sola lettura per base, ma bisogna effettuarne molte per rilevare eventuali mismatch della
macchina e aumentare l’attendibilità del test. La depth of coverage è quindi lo spazio dedicato durante una
“run” di sequenziamento a ciascuna porzione di genoma.
Def. A causa dei frequenti errori delle macchine sarà necessario leggere diverse volte la sequenza in
esame. Il numero di letture viene definito profondità di lettura (cfr. sopra). La quantità di errori è definita
dalla Quality Score. Q10 significa un errore su 10 paia di basi, quindi accuratezza del 90%, Q20 1 errore su
100, Q30 1 errore su 1000 e così via. Le macchine Illumina sono molto affidabili, quasi sempre sul Q30.
In figura viene mostrata una porzione del gene K-RAS: in questo caso la depth of coverage è 15, ossia ogni
base del tratto di genoma è stata riletta 15 volte. L’alternanza di citosine e adenine indica una mutazione,
con una frequenza del 53% per la C e del 47% per la A. È probabile che si tratti di uno SNP, una eterozigosi
dei cromosomi in quella porzione di genoma, dato che le due percentuali sono vicine al 50%. In alto troviamo
la sequenza di riferimento, presente nei database, che noi tutti condividiamo (con qualche accezione data
dai polimorfismi), a cui andiamo a confrontare la sequenza ottenuta.
305
Biochimica clinica
B3.3.3 Ricerca di mutazioni germinali e somatiche con NGS

Mutazioni germinali: ereditate dei genitori, già presenti nelle cellule germinali. Tutte le cellule condividono
questa mutazione in uno dei due alleli, dunque si avrà almeno una rappresentanza del 50% per ogni allele,
in caso di eterozigosi, o del 100% in caso di omozigosi, e si può tenere una depth of coverage abbastanza
bassa (50-100 letture) poiché sufficienti a evidenziare la mutazione.
Mutazioni somatiche: che avvengono solo in una determinata porzione di tessuto, ad esempio nei tumori: il
chirurgo opera un paziente con tumore al cervello, arriva il pezzo operatorio in anatomia patologica;
prelevato un pezzettino, a fresco o dopo fissazione in formalina e inclusione in paraffina, il patologo verifica
che ci siano cellule tumorali. A questo punto estraiamo il DNA e lo sequenziamo, andando a cercare le
mutazioni tipiche del tumore in questione. Si andrà in questo caso ad assegnare un numero di letture almeno
pari a 1000 per ciascuna porzione, questo perché potrebbe esserci eterogeneità tumorale, quindi potrebbero
esserci in una stessa popolazione tumorale cellule che non condividono le stesse mutazioni. Ci sono in genere
cloni dominanti, che portano mutazioni simili, ma spesso anche cloni e subcloni che portano altri tipi di
mutazioni. Ci sono mutazioni driver, che guidano il tumore, lo portano a proliferare e ad avere un vantaggio
sulle altre cellule, e mutazioni passenger, mutazioni casuali che spesso nell’evoluzione del tumore si perdono,
non rientrano nei cloni principali.
Nella ricerca di mutazioni somatiche, bisogna assegnare più sequenze alla regione genomica, per far sì che
se anche solamente il 10-15% delle sequenze portano quella variazione genomica, si è in grado di
determinarlo. Ecco perché sono necessarie 1000 reads: capita spesso di avere percentuali anche del 5%, ma
essendo che il 5% di 1000 è 50, si avranno 50 letture che porteranno quella mutazione.
Ecco la differenza tra analisi di mutazioni somatiche e germinali: per quelle germinali, dato che le sequenze
mutate sono il 50%, sono sufficienti 100 letture, per quelle somatiche invece servono almeno 1000 letture
per arrivare a una sensibilità dell’1-5%.
[Domanda d’esame: Qual è la differenza tra coverage depth per mutazioni germinali e mutazioni somatiche?]
B3.3.4 Dati quantitativi

I sistemi NGS sono quindi quantitativi: danno informazioni sulla presenza della mutazione, ma anche sul
numero di cellule che la portano, perché il tutto si basa sul numero di reads che presentano quella mutazione
(se si hanno 50 letture su 1000 con una mutazione, si sa che il 5% delle cellule porta quella mutazione).
Un sequenziatore medio-piccolo da banco ospita una flow cell che può dare da 1 milione di cluster, che quindi
fornisce alla fine un milione di sequenze (o letture o reads), fino ad arrivare a 15 milioni di cluster.
Sequenziatori più potenti, avendo una flow cell più
ampia, possono arrivare fino a 400 milioni di reads
(col Sanger ci si metterebbe 10 anni).
Il NovaSeq 6000 è capace di arrivare fino a 20
miliardi di reads per run, quindi può leggere tanti
genomi o esomi in contemporanea a costi anche
piuttosto ridotti (il macchinario costa però un
milione di euro).
Il NextSeq 550 può leggere con una flow cell media
2-3 esomi, oppure un genoma intero con la flow
cell più grossa in 30x, ossia assegnando 30 letture
a ogni porzione di genoma, analizzando però il
genoma di un solo paziente (o in alternativa 12
esomi). La tecnologia è in evoluzione, gli strumenti
si sono rimpiccioliti e permettono di ospitare tanti cluster per singola run.
306
Biochimica clinica
La seguente immagine, nella tabella in basso ricapitola il numero massimo di reads per ciascuna delle
macchine.
B3.4 APPLICAZIONI DI NGS

Le potenzialità della piattaforma NGS vanno oltre l’analisi mutazionale. Si possono studiare:
• il trascrittoma, in modo quantitativo (l’analisi NGS può dare dati quantitativi): quando si incontrerà
una sequenza specifica per quel gene, si calcolerà in quante letture è presente nel file e si capirà
l’espressione genica del
dato gene. Se il gene è
molto espresso, si
avranno tante letture
della sequenza; se non è
espresso, non ne se ne
avrà neanche una;
• il profilo di espressione
genica di un tumore,
retrotrascrivendo
l’mRNA a cDNA;
• il metiloma;
• modificazione della
cromatina;
• microRNA;
• variazione del numero
di copie: sempre in base
al numero di lettura, si
può osservare la
307
Biochimica clinica
presenza di delezioni o amplificazioni nel genoma (come nell’array CGH, ma in questo caso si avrà la
sequenza specifica di ciascuna porzione genica);
• geni di fusione: importanti in oncologia, molti sono geni driver che guidano la cancerogenesi.
Inattivandoli, o con anticorpi monoclonali o con inibitori, si può inibire la proliferazione di queste
cellule e avere un beneficio sul paziente;
• indagini forensi;
• reperti archeologici: sequenziare il DNA a partire da ossa, per verificare l’emigrazione di popolazioni
umane;
• microbioma: estrazione di DNA dalle feci per analizzare la popolazione microbica dell’intestino che
può essere associata a determinate patologie: la maggior parte dei batterî ha sequenze molto
conservate nelle regioni 16S e 23S, quindi grazie alla costruzione di primers particolari che
amplificano tutti i batterî (questo appunto perché sono complementari a sequenze presenti in tutti i
batterî), si otterranno degli ampliconi relativi a diversi batterî. Se poi vengono sequenziati, si potrà
riconoscere quali specie batteriche sono presenti nel microbioma (dell’intestino, dello stomaco, della
bocca, della pelle...) ed eventualmente ricollegarle a varie patologie;
• filogenesi dei virus;
• resistenze dei virus a determinati farmaci antivirali (es. HIV può avere resistenze che si possono
scoprire tramite sequenziamento) o resistenze dei batterî ad antibiotici;
• SARS-CoV-2 può essere sequenziato per rilevare eventuali mutazioni che danno un’aggressività
maggiore o minore allo stesso virus
B3.4.1 Genoma
L’esoma rappresenta solo 1,5% del genoma umano, il resto è
rappresentato da:
• sequenze regolatorie, promotori, enhancers, ecc. (5%);
• introni (20%);
• sequenze ripetute (junk DNA, inserzioni ancestrali di
retrovirus) oppure trasposoni (44%);
• non-coding RNA (lnRNA, miRNA, etc.) (15%).
Per questo motivo non si sequenzia tutto il genoma, ma si fa un
‘’Target enrichment‘’ per trovare le sequenze che sono utili.
B3.4.2 Target enrichment

L’esoma comprende solamente l’1,5% del genoma, pochissimo, ecco perché per attività cliniche o per
malattie di cui si sa poco, si sequenzia l’intero esoma, quindi si cerca di “arricchire” il DNA del paziente solo
con le porzioni codificanti. Altre regioni interessanti potrebbero essere le sequenze di regolazione
(promotore, enhancer) e gli introni che sono il 20%, mentre la parte predominante del genoma è il cosiddetto
junk DNA, ossia elementi ripetuti. Gli elementi ripetuti sono soprattutto le L1 (o LINE1, long interspersed
elements 1, 17% del genoma), le sequenze Alu (dal nome dell’enzima di restrizione che taglia queste
sequenze, 10 % del genoma), trasposoni (inserzioni ancestrali di virus, le hanno anche le scimmie: sono eventi
di integrazione virale che ci portiamo avanti durante l’evoluzione e che devono essere silenziate, perché
possono passare da una parte all’altra del genoma e causare mutazioni).
Come si fa ad arricchire il nostro DNA per quelle regioni che ci interessano? Quello che possiamo analizzare
è l’intero esoma oppure un pannello con solamente quelle regioni che ci interessano per una determinata
malattia (es. è già stato pubblicato uno studio in cui sono messi in evidenza i geni driver, assegneremo quindi
tante letture per quei geni di interesse, risparmiando sulle letture di altri geni che risulterebbero inutili).
Ci sono due metodi:

1) PCR multiplex: un’amplificazione specifica per target individuati grazie a primer specifici, in modo da
avere milioni di copie degli esoni del gene di interesse. Alcune PCR multiplex arrivano a sfruttare circa
25000 coppie di primer per provetta, per un totale di 12 provette, coprendo così l’intero esoma.
308
Biochimica clinica
Si consideri l’esone 2 di K-RAS. Ci saranno dei primer che

riconosceranno a sinistra la porzione iniziale dell’esone e
a destra la porzione finale. Questi primer, uno forward e
l’altro reverse, presentano due regioni: una sequenza che
si lega al DNA (in verde) e un adattatore universale che
non riconosce nessuna sequenza sul genoma (in giallo).
Con la prima PCR si amplifica l’esone 2 di K-RAS e i
filamenti prodotti presenteranno anche un adattatore in
posizione terminale.
Segue poi il secondo step: si uniscono dei primer costituiti
da una porzione che riconosce l’adattatore universale
(anch’essa in giallo), una porzione che funge da indice e
infine da un adattatore specifico Illumina, chiamato p5 e
p7.
Avviene una seconda PCR, il cui output presenta in ordine:
adattatore Illumina p5, indice 1, sequenza universale,
primer specifico, esone 2 di K-RAS del paziente, poi ancora
primer specifico, sequenza universale, indice 2 e adattatore
p7. Quindi grazie semplicemente a due PCR si può
sequenziare solo l’esone 2 di K-RAS (target region). Ogni
filamento avrà la sequenza universale p5 e p7 che verrà
riconosciuta sulla superficie della flow cell.
Addirittura, c’è un’azienda chiamata Life Technologies, una
delle più grandi aziende del settore, che vende un kit che si
basa sulla multiplex-PCR di 12 pool diversi. In 12 provette si
hanno 25.000 primer a coppie che amplificano varie regioni
del genoma, di fatto gli esoni dei 21.000 geni del nostro
genoma. Si otterranno quindi al termine 12 provette con in ciascuna 25.000 ampliconi relativi a 25.000 esoni.
Con una seconda PCR o con una ligasi si metteranno gli adattatori Illumina e gli indici.
Gli indici sono necessarî se si sequenzia più di un esoma: se si vuole sequenziare solo una persona, si prende
il DNA, si attaccano gli adattatori e si carca in macchina; questo è sufficiente perché il DNA è tutto di
quell’unico individuo. Se invece si vogliono sequenziare diversi pazienti, bisogna riuscire a capire a quale
paziente appartengano i diversi cluster, per cui si usano degli indici: insieme agli adattatori si legano a destra
e sinistra di ogni frammento di DNA delle sequenze di 10 bp. Questi saranno rappresentati dagli indici dall’1
al 12 da una parte, dall’altra parte lego gli indici da 1 a 8. La combinazione risultante (1-2, 1-3, 1-4...) andrà
a identificare uno specifico paziente. La sequenza nucleotidica degli indici verrà riconosciuta dal
sequenziatore, assegnando a ogni indice un file relativo al suo paziente. Alla fine della corsa basterà
scaricare i file che escono. La combinazione dei varî indici permetterà quindi il raggruppamento di ciascuna
sequenza che esce. Si possono caricare fino a 96 DNA di pazienti, quante sono le combinazioni possibili (12
indici a sx e 8 a dx à 12x8=96).
2) Sonde che riconoscono sequenze di cattura: ci sono aziende che producono in provetta sonde di circa
50-60 bp, ognuna specifica per ciascun esone, tutte miscelate insieme. Una volta attaccati con delle ligasi
gli adattatori a destra e sinistra dei frammenti, ottenuti per ultrasonicazione, si catturano con le sonde
solo le sequenze codificanti, tramite biglie magnetiche.
309
Biochimica clinica
Queste vengono quindi caricate sul sequenziatore dopo aver lavato via tutte le altre sequenze. Queste
ditte offrono anche pacchetti custom e in questo modo posso decidere di sequenziare anche solo 50
geni. Infine, il DNA viene separato dalle biglie e viene sequenziato.
Analisi dei dati

Vi sono dei tool che mappano ogni lettura sul genoma di riferimento. Vengono usati dei visualizzatori nei
quali si trovano in basso la sequenza di
riferimento e gli amminoacidi
corrispondenti. In grigio si hanno le
sequenze analizzate e in esse (in senso
verticale) vengono segnalati dei
cambiamenti rispetto alla sequenza di
riferimento (es. citosina al posto della
timina). Questi tool permettono di risalire
alla frequenza dell’allele variante (VAF,
Variant Allele Frequency), in base alle
mutazioni presenti e raffigurate. La Variant
Allele Frequency si definisce come la
quantità di letture in cui appare la base mutata in rapporto al numero totale di letture. Si esprime
generalmente in percentuale.
Al termine, si ottiene un file chiamato FastQ in cui ci sono tutte le letture di ciascun paziente. Ci sono software
che mappano tramite tool ciascuna sequenza sulla sequenza di riferimento del genoma umano. Per ogni base
si avrà anche il rapporto della qualità con cui viene letta ciascuna di esse, si possono quindi scartare le letture
di scarsa qualità riconosciute dal sistema.
Viene anche assegnata la presenza di una mutazione: utilizzando un visualizzatore IGV, si appaiano tutte le
sequenze che escono di quel paziente, per esempio il gene Notch1, e si vedono rappresentate su più linee le
sequenze che si hanno di quel gene e ogni tanto si può osservare una mutazione, in questo caso
rappresentata con una T sulla linea. Il sistema ogni tanto può dare falsi positivi: essendo infatti segnata
solamente su quella sequenza, la mutazione segnalata viene scartata. Il sistema però segnala anche un’altra
mutazione, in posizione 136.503.269 sul cromosoma 9, e ci informa che il wild type è una G presente nel 94%
delle letture, ma nel 4% delle letture c’è una A, letta 153 volte da una parte e 156 dall’altra: questo significa
che c’è una mutazione in quel punto con frequenza allelica del 6%.
310
Biochimica clinica
B3.5 OXFORD NANOPORE

Progetto molto recente19: è un sequenziatore molto
piccolo, si attacca con una porta USB al laptop e si è
pronti per sequenziare. Il funzionamento di questa
piattaforma si basa sul passaggio del DNA attraverso
un nanoporo, ossia una proteina attraverso la quale
passa una sola molecola di DNA a singolo filamento.
Durante il passaggio del DNA, che avviene ad altissima
velocità (si leggono 400 basi al secondo), il nanoporo
si trova su una superficie di grafene. Il DNA si mette
sopra ai nanopori (nella flow cell ci sono almeno 512
nanopori), ci passa attraverso e un sistema di lettura
riconosce ciascuna base e sequenzia il frammento.
L’unico difetto che ha (o aveva) è che sbaglia più di
Illumina: mentre quest’ultima sbaglia 1 volta su 1.000
o su 10.000, il nanoporo sbaglia 2 o 3 volte ogni 100 (si
attesta intorno a Q10-Q20). I nanopori di nuova generazione hanno però raddoppiato il sistema di detection:
la versione più recente possiede un detector in più che ricontrolla la base letta dal primo, aumentando in
questo modo l’accuratezza ai livelli di Illumina (1 su 1.000/1 su 10.000 – si attesta intorno a Q30).
Questo sistema ha dei vantaggi:

o è semplicissimo da usare;
o sequenzia frammenti molto lunghi, anche di milioni di paia di basi in fila e il prezzo non è troppo
elevato.
o si possono vedere molto meglio le varianti di splicing: se si ha un gene con 10 esoni, si può capire se
tutti gli esoni sono presenti nel trascritto o se manca qualcuno e avendo frammenti molto lunghi è
molto più facile la lettura delle varianti di splicing;
o si possono capire i geni di fusione: presenti soprattutto nei tumori, sono pezzi di cromosoma che si
riarrangiano e generano dei prodotti aberranti. Ad esempio, ci sono alcuni geni che hanno a monte
una porzione di un gene e a valle la porzione di un altro gene, e in genere sono sovraespressi perché
magari il primo gene è sovraespresso normalmente, se viene poi appiccicato all’altro gene che
normalmente è silenziato, il secondo gene verrà amplificato, quindi verrà trascritto tante volte.
19
Video sull’argomento: https://nanoporetech.com/how-it-works 159.
311
Biochimica clinica
B4. PRINCIPÎ DI EPIGENETICA

(prof. Morandi)
B4.1 INTRODUZIONE
Recentemente sono stati conteggiati 21.306 geni nelle regioni codificanti, anche se ci possono essere piccole
variazioni. Parallelamente abbiamo anche, circa altrettanti, non-coding genes che servono per la regolazione
a livello post-trascrizionale; questi sono i cosiddetti long-non-coding RNA, che sono ancora poco noti perché
scoperti e studiati solo recentemente grazie al sistema della Next Generation Sequencing. 21.000 geni non
sono tantissimi, tant’è che nel 1990 si ipotizzava che l’uomo avesse oltre 100.000 e si ipotizzava anche che il
numero di geni fosse in un certo modo correlabile ad un discorso evolutivo; in realtà non è così: lo scimpanzé
ha 25.000 geni, i cani 19.000, i gatti 20.000. In realtà quello che ci favorisce, soprattutto dal punto di vista
intellettivo, è la nostra capacità di modulare questi geni e anche di cambiarne le potenzialità, per esempio
grazie allo splicing alternativo. Questo è uno dei maggiori metodi che ha la cellula per rendere più
vantaggiose tutte le varie combinazioni di esoni che sono rappresentative dei nostri geni. Fondamentalmente
tutte le cellule del nostro corpo (3.7 x 1013) condividono lo stesso genoma, ma abbiamo cellule molto diverse,
per esempio un neurone è molto diverso rispetto a un linfocita o a un globulo rosso, o ancora a una cellula
muscolare, ma tutte queste cellule condividono lo stesso genoma.
Il genoma contiene dunque informazioni in due forme: genetica ed epigenetica.
La seconda gestisce come, dove e quando questo genoma deve essere espresso ed è quindi importantissima;
ciononostante lo studio dell’epigenetica è uno studio di nicchia, perché è ancora molto indietro. Quest’ultima
è importante anche nei tumori, dove l’equilibrio epigenetico è completamente alterato.
B4.2 DEFINIZIONE DI EPIGENETICA

La parola “epigenetica” deriva dal greco: in particolare ἐπί “epí” significa “che sta sopra”, “oltre”, quindi
epigenetica significa “che sta sopra o che va oltre la genetica”. Quindi per definizione l’epigenetica è lo studio
dei cambiamenti nelle funzioni geniche, che sono sia mitoticamente che meioticamente ereditabili, ma che
non riguardano la sequenza diretta del DNA, dunque le basi azotate, ma le modificazioni che possono
modulare l’espressione genica, come la metilazione del DNA e le modificazioni della cromatina in generale e
degli istoni. L’epigenoma è considerato una seconda dimensione del genoma che va poi a modulare il
differenziamento cellulare e quindi spiega perché si abbiano tanti tipi differenti di cellule: infatti, grazie
all’epigenoma, possiamo esprimere determinati geni rispetto ad altri. Per fare in modo che questo avvenga
è necessario sostanzialmente permettere o non permettere l’accesso ai fattori di trascrizione in determinate
regioni del nostro genoma e in determinati geni. La modulazione epigenetica è modificata sia
nell’embriogenesi, ma anche grazie all’ambiente circostante, che può influire sull’espressione genica grazie
alla capacità della cellula di rispondere a diverse situazioni che accadono nell’ambiente o nel microambiente
circostante e all’adattamento della cellula stessa, che modifica opportunamente i livelli di trascrizione di
ciascun gene. L’ambiente può quindi influire sul pattern epigenetico della cellula stessa. L’ambiente
considerato include, ad esempio:
• la dieta, che influisce tantissimo;
• lo stato psicologico;
• le interazioni sociali;
• i farmaci;
• l’esercizio fisico;
• lo stato economico;
• il fumo;
• le infezioni virali;
• il ritmo circadiano;
• la presenza di diversi ormoni.
312
Biochimica clinica
B4.3 MECCANISMI EPIGENETICI

I meccanismi di controllo dell’espressione genica sono fondamentalmente due:
1. le modificazioni istoniche;
2. la metilazione del DNA.
Questi regolano il comportamento della cromatina, la quale viene modulata in base alle necessità di
esprimere o meno differenti regioni genomiche. La cromatina può essere presente in due forme principali:
• eterocromatina: questa è condensata e impedisce fondamentalmente l’accesso ai fattori di
trascrizione;
• eucromatina: la cromatina è abbastanza rilasciata e permette l’ingresso dei fattori di trascrizione che
possono legarsi a precise strutture del genoma e iniziare la trascrizione.
Si sottolinea poi come sia i fattori genetici, ossia la sequenza del DNA, sia i fattori epigenetici, che riguardano
modificazioni istoniche e metilazione del DNA, siano ereditabili.
In questa immagine ottenuta con tecnica SKY

(Spectral Karyotyping), si vedono cromosomi in
metafase colorati con diverse sonde
fluorescenti, dalla cui combinazione si ottiene
questa caratteristica colorazione che permette
un facile riconoscimento dei cromosomi.
Nell’immagine si può osservare l’ultima coppia
formata da due X e di conseguenza se ne deduce
che il cariotipo in questione è di una donna.
Sappiamo che il DNA passa attraverso livelli di
compattazione progressivi, partendo dal
filamento a doppia elica completamente
rilasciato, che presenta 2 nm di diametro,
passando poi alla formazione di cromatosomi, grazie alla presenza soprattutto dell’istone H1, con diametro
di 11 nm, fino a diametri di 700 e poi 1400 nm visibili al microscopio ottico. I tipi di istoni attorno a cui si
avvolge il DNA sono diversi. Si distinguono in
H2A, H2B, H3, H4 e H1 che fa da aggregante. Il
filamento di DNA avvolto attorno al core
proteico contiene 147 paia di basi.
In figura il cromatosoma: l’istone H1 lega i varî
nucleosomi e ci sono varie distanze tra un
nucleosoma e l’altro e diversi livelli di
compattazione del DNA.
Il nucleosoma è costituito da un ottamero
istonico (due istoni H2A, due istoni H2B, due
istoni H3 e due istoni H4) e dal DNA avvolto
attorno ad esso. A ciascun nucleosoma si trova
attaccato un istone linker H1 e ciò porta alla
formazione del cosiddetto cromatosoma.
B4.3.1 Classi di modificatori

Si dividono in tre classi di molecole:
• WRITERS: sono quelle proteine che “scrivono” e che assegnano l’informazione epigenetica in
determinate porzioni del genoma. Di queste fanno parte:
1. la Lisina-Acetil-Transferasi (KATs), che aggiunge dei gruppi acetilici sulla lisina dei varî istoni;
2. la Istone-Lisina-Metiltransferasi (KMTs), che è forse la più importante, che aggiunge gruppi
metilici agli istoni stessi;
313
Biochimica clinica
3. la famiglia delle DNA-Metiltransferasi (DNMTs), che aggiungono gruppi metilici a livello del
DNA: precisamente sulle citosine che precedono le guanine (CpG).
• READERS: sono quelle proteine che leggono le informazioni scritte dai writers e fondamentalmente
possono essere raggruppati nelle Methyl-CpG-Binding-Domain (MBD) proteins.
• ERASERS: lavorano al contrario rispetto ai writerS, esistono quindi:

1. la Lisina-Deacetilasi (KDACs) che toglie ciò che la Lisina-Acetil-Transferasi ha messo;
2. la Lisina-Demetilasi (KDMs) che rimuove i gruppi metilici legati agli istoni
3. la TET family of DNA demethylases (TET= ten-eleven traslocation), demetilasi che tolgono i
gruppi metilici sul DNA.
È quindi una continua modulazione in base alle influenze che l’ambiente esercita sulla cellula.
B4.3.2 Modificazioni istoniche

Ci sono due principali modificazioni a livello degli istoni: l’acetilazione e la metilazione.
Per quanto riguarda l’acetilazione, essa va a promuovere l’espressione del DNA, mentre una deacetilazione
spegne il gene.
La metilazione invece può avere due esiti differenti in base alla posizione su H3:
• sulle lisine in posizione 9 e 27 (H3K9 e H3K27) vengono silenziati;
• sulle lisine in posizione 4 e 36 (H3K4 e H3K36), si ha l’attivazione del gene.
In questo caso non è solo la presenza/assenza di metilazione ma è fondamentale la posizione della lisina che
viene metilata. Questo meccanismo segue le “leggi” del codice istonico.
Tutto ciò avviene principalmente nelle regioni promotrici perché è lì che arrivano i fattori di trascrizione ed
è da lì che parte la trascrizione del gene.
Bisogna tenere anche in considerazione che per molti geni esistono anche sequenze enhancer che stanno a
monte del gene stesso e che possono amplificare l’espressione genica: questi enhancer possono essere
lontani anche migliaia di paia di basi, ma grazie a una conformazione a forcina possono stericamente
riconoscere il promotore del gene a valle. Quindi queste modificazioni istoniche e a livello del DNA in
compresenza permettono di esprimere un gene e di
amplificare questa espressione o di silenziarlo, perché
sia l’enhancer che il promotore possono gestire
questa espressione genica e di fatto normalmente
vanno appaiati: entrambi decidono di esprimere o di
silenziare il gene.
Questi meccanismi epigenetici possono essere
coinvolti in fenomeni patologici. In particolare, in una
cellula tumorale può accadere che ci sia una “loss of
function” di un gene oncosoppressore per via di una
ipermetilazione a livello del promotore del gene, con
conseguente silenziamento, oppure una metilazione
a livello di K9 e K27, che porta allo stesso effetto. Tra
l’altro, queste sono importanti perché avvengono
molto più precocemente rispetto alle classiche
mutazioni che sono alla base di cancerogenesi (utile
per eventuale diagnosi precoce).
Le modificazioni istoniche appena viste prendono il nome di codice istonico da un paper uscito su Science
all’inizio degli anni 2000.
314
Biochimica clinica
B4.3.3 Metilazione del DNA

La metilazione di un promotore va a silenziare il gene associato al promotore (regola universale).
Nelle cellule gli elementi ripetuti (basi ripetute, ecc.) che possono essere pericolosi, vengono silenziati dalla
metilazione; se non vengono silenziati si ha instabilità genomica.
La metilazione del DNA ha infatti profondi effetti sul genoma:
• effetti fondamentali per reprimere la trascrizione;
• inattivazione dell’X: le donne hanno infatti due cromosomi X, uno dei quali viene silenziato grazie
appunto all’ipermetilazione dello stesso;
• imprinting genomico grazie alla metilazione del promotore dell’allele paterno o materno.
Il DNA viene metilato in una posizione precisa: vengono infatti
metilate le citosine che precedono le guanine, questo accade nel
99,9% dei casi nell’uomo (ci sono alcune eccezioni per la Drosophila).
Il gruppo -CH3 è in posizione 5’ e si parla quindi di 5-metilcitosina. Nel
genoma esistono regioni dette isole CpG che sono ricche di citosine
che precedono guanine e spesso si trovano a livello del promotore
dei geni perché lì si andrà a metilare per silenziare il gene intero;
viceversa, demetilando si consente l’espressione
del gene. Nella rappresentazione grafica del gene si
possono disegnare i “lollipop” (vedi immagine p.
46) che corrispondono alle isole CpG presenti,
questi si distinguono in neri à metilati, e bianchi
à non metilati. I lollipop si concentrano
soprattutto nel promotore vicino al primo esone e
poi sono sempre meno concentrati man mano che
si va a valle del gene stesso. Se i lollipop nel
promotore sono neri, quindi le isole CpG sono
metilate, il gene non viene espresso, se invece sono
bianchi il gene viene espresso.
La famiglia di proteine che si occupa di metilare il DNA sono le DNA-metiltransferasi di cui esistono di due
tipi:
• la DNA-metiltransferasi I è quella che si occupa di
mantenere lo stato di metilazione durante la
replicazione cellulare. Questa riconosce dove è
metilato il DNA del filamento stampo e metila
esattamente nel filamento neosintetizzato le
stesse citosine: così si mantiene il pattern
epigenetico del metiloma;
• le DNA-metiltransferasi 3A e 3B che sono le de
novo-metiltransferasi: sono in grado di metilare
de novo, senza DNA stampo, nuove regioni per silenziare alcuni geni. Sono proprio queste ultime
che nei tumori si attivano e portano ad un’alterazione dello stato di metilazione.
Facendo un calcolo globale di tutte le 4 basi in percentuale nel genoma, statisticamente si potrebbe pensare
che ci sia un rapporto 50/50 tra adenine/timine e citosine/guanine, tuttavia non è così: le citosine e le guanine
rappresentano infatti solo il 42 %. Questo è giustificato dal fatto che le citosine metilate hanno un tasso di
mutazione più alto delle citosine normali: queste tendono infatti a trasformarsi molto più spesso in uracili,
che vengono poi letti come timine alla fine della replicazione e saranno quindi appaiate con adenine. Nel
corso dell’evoluzione questo fenomeno ha portato alla maggior comparsa di adenine/timine rispetto a
citosine/guanine. Tuttavia, la cosa importante è che a livello dei promotori, dove è importante che ci siano
le citosine che precedono le guanine e che possano essere metilate per modulare l’espressione genica, le
315
Biochimica clinica
citosine siano state conservate

dall’evoluzione perché servono alla
cellula per regolare l’espressione
genica. In altre regioni del genoma,
anche se c’è stata una mutazione
della citosina in uracile questa non è
importante perché non influisce
sull’espressione genica; l’evoluzione
non ha premiato la conservazione di
queste citosine. Nelle regioni dove
invece è importante che ci siano le
citosine che precedono le guanine,
quindi le isole CpG, la cui
metilazione è importante per decidere se esprimere o meno un determinato gene, lì non c’è stata la
mutazione delle citosine in uracile perché l’evoluzione non ha premiato il tasso di mutazione in quella zona
e non ha fatto selezione e le citosine sono rimaste percentualmente invariate.
Per quanto riguarda invece la regolazione di oncogeni e oncosoppressori, essi hanno una regolazione opposta
a livello di cellule normali e cellule tumorali; normalmente i promotori degli oncogeni sono silenziati e
metilati, mentre quelli degli oncosoppressori non sono metilati e quindi sono espressi; nei tumori invece
avviene il contrario e si ha espressione degli oncogeni e silenziamento degli oncosoppressori. Quindi il gene
può perdere funzione non solo per mutazione puntiforme (che può dare origine, per esempio, a un codone
di stop), ma anche per delezione di una porzione di gene che porta alla perdita completa della proteina,
oppure per ipermetilazione del promotore.
B4.4 MEMORIA EPIGENETICA

Sia la metilazione del DNA sia le modificazioni istoniche possono essere trasmesse dalla cellula madre alla
cellula figlia, l’epigenetica ha quindi una memoria che va oltre il ciclo cellulare. L’epigenoma funge da
“magazzino di eventi”, ricordando le perturbazioni che la cellula ha subito nel tempo. L'epigenoma è in grado
di memorizzare gli eventi dello “stile di vita” praticamente in ogni tipo di tessuto o cellula. Pertanto, non solo
i neuroni immagazzinano la "memoria" di un individuo, ma anche il sistema immunitario memorizza gli
incontri coi microrganismi, mentre gli organi metabolici ricordano le abitudini personali sulla dieta e
sull'attività fisica. Un'interruzione della memoria epigenetica può portare all'insorgenza del cancro.
Informazioni dall’ambiente o dal microambiente possono cambiare il pattern d’espressione epigenetico, è
importante che la cellula mantenga memoria di queste modificazioni. Esistono modificazioni epigenetiche
più stabili e altre meno stabili, pertanto nel campo della memoria epigenetica distinguiamo una short-term
memory e una long-term memory. La short-term memory riguarda l’acetilazione e la deacetilazione degli
istoni, mentre la long-term memory si riferisce a metilazione degli istoni e metilazione del DNA.
B4.4.1 Variabilità genetica ed epigenetica

I risultati del “Progetto 1000 Genomi” indicano che un tipico genoma umano differisce in circa 4,1-5,0 milioni
di siti dai 3,26 Gb (3,26 miliardi di paia di basi) del genoma di riferimento, cioè in non più dello 0,15%. La
maggior parte di queste variazioni sono dovute a polimorfismi del singolo nucleotide (SNPs), ma ci sono
anche variazioni maggiori come delezioni, inserzioni, varianti del numero di copie.
Al contrario, la variabilità epigenetica delle singole cellule dei diversi tipi di tessuti del nostro corpo è molto
più ampia. Infatti, ciascuna cellula di ciascun tessuto deve rispondere a esigenze specifiche e deve svolgere
funzioni specifiche all’interno dell’organismo, e per fare questo sono richiesti diversi livelli di espressione
genica, specifici per le necessità di ciascuna cellula: la variabilità epigenetica è quindi enorme.
316
Biochimica clinica
B4.5 EPIGENETICA NEL CANCRO

Nelle cellule tumorali avvengono delle modificazioni genetiche ed epigenetiche, soprattutto a livello di geni
oncosoppressori e oncogeni, che danno luogo a variazioni dei livelli di espressione genica.
Mutazioni di geni oncosoppressori possono causare loss-of-function e possono avvenire in diversi modi,
infatti, partendo da una mutazione germinale che costituisce il primo hit, il secondo hit potrebbe essere
causato da:
- mutazione puntiforme20;
- delezione;
- ipermetilazione del promotore corrispondente al gene
oncosoppressore interessato.
Fondamentalmente, i due alleli possono essere entrambi non

funzionanti a causa di mutazioni che possono essere diverse da
un allele all’altro.
La DNA polimerasi è un enzima estremamente fedele, ha un’elevata capacità di proof reading, infatti essa
ha un tasso di errore di 1.66 x 10-8 bp-1. L’evoluzione ha premiato questo enzima dotato di estrema fedeltà,
in quanto è fondamentale che il genoma a ogni replicazione venga mantenuto stabile, integro; se così non
fosse e la DNA polimerasi facesse un errore di replicazione in una regione codificante, questo errore si
porterebbe avanti a ogni ciclo replicativo e potrebbe dare origine a diverse mutazioni che potrebbero portare
alla produzione di proteine anomale, causando un problema serio e concreto a quella cellula o a quel tessuto.
Le DNA-metiltransferasi, soprattutto la DNA-metiltransferasi 1, deputate al mantenimento dello stato di
metilazione, a differenza della DNA-polimerasi, hanno un tasso di errore abbastanza alto, attorno al 4%. Per
quanto riguarda il trasferimento del profilo di metilazione, ciò che è importante non è la perfetta
conservazione del pattern originale, ma il mantenimento del significato generale. A livello dei promotori vi
sono moltissime isole CpG, quindi se anche una isola CpG non viene metilata specificamente non è un grosso
problema se le altre isole CpG adiacenti sono metilate.
Per quanto riguarda il pattern di metilazione, nella maggior parte dei geni, la regione chiave per decidere se
esprimere o reprimere la trascrizione si trova a cavallo del “punto zero” o TSS (Transcriptional Start Site).
Solitamente questa zona è ricca di isole CpG e proprio qui la cellula decide se silenziare o meno (esistono
alcune eccezioni, ma sono molto poche, come promotori a valle o a monte). È quindi importante la
localizzazione della metilazione. Inoltre, la metilazione può svolgere un ruolo anche nello splicing: la
metilazione di eventuali isole CpG vicine al sito di splicing può influenzare la decisione della variante di
splicing della proteina ottenere.
La metilazione del DNA ha quindi una duplice funzione:

1. decidere se esprimere o silenziare un gene tramite la
metilazione delle isole CpG presenti nel promotore;
2. decidere che tipo di variante di splicing della proteina
ottenere in base alla metilazione di CpG vicino ai siti di
splicing (exon junctions region).
Nella cellula tumorale si avrà quindi un silenziamento

dell’oncosoppressore sia per ipermetilazione del promotore,
ma anche per metilazione delle lisine K9 e K27.
20
Ad esempio, mutazioni missenso, che provocano la produzione di una proteina con catena amminoacidica alterata,
oppure mutazioni nonsenso che provocano la formazione di un codone di stop prematuro e quindi la produzione di una
proteina tronca.
317
Biochimica clinica
Solo l’1,5% del genoma è codificante, tutto il resto è costituito da quello che viene definito “junk-DNA”.
Il junk-DNA è composto per il 44% da

elementi ripetuti come LINEs e SINEs
(long and short interspersed nuclear
elements). In più ci sono i
retrotrasposoni, gli LTRs (long terminal
repeats): virus, normalmente retrovirus, che durante l’evoluzione grazie a eventi ancestrali si sono integrati
nel nostro genoma. Inoltre, possiamo avere DNA trasposoni e minisatelliti, microsatelliti. Questi elementi
ripetuti, grazie a modificazioni epigenetiche come la metilazione delle isole CpG e la metilazione degli istoni,
vengono mantenuti soppressi. Se si attivassero, sarebbero in grado di migrare in altre porzioni del genoma e
se ciò dovesse avvenire a livello di una porzione codificante, creerebbero dei problemi.
È la macchina epigenetica che cerca di controllare questi elementi ripetuti. Per esempio, le LINE
rappresentano il 21% del genoma, le SINE l’11% i retro-trasposoni con le LTR (simili alla struttura dell’HIV che
presenta le LTR ai lati e GAG, POL ed ENV in mezzo) l’8%, i DNA-trasposoni il 3% e i minisatelliti e microsatelliti
il 3%; tutti questi elementi sono normalmente ipermetilati.
B4.6 APPLICAZIONI CLINICHE DELL’EPIGENETICA
B4.6.1 Epigenetica e nutrizione

Uno studio olandese21, pubblicato anche sul New England, ha valutato l’impatto delle modificazioni
epigenetiche durante un periodo di malnutrizione nell’inverno degli anni 1944-1945. Le conseguenze della
deprivazione di nutrienti fondamentali durante la gravidanza, si riflettevano sui nascituri non solo con effetti
immediati, ma anche con effetti a lungo termine, per i figli di queste donne gli effetti si sono manifestati
anche a distanza di 40-50 anni. La condizione deficitaria di vitamine a livello fetale ha avuto un impatto non
solo sullo sviluppo di malattie congenite, ma ha anche avuto un effetto pesantissimo sull’aumento delle
malattie legate all’obesità e al diabete in tarda età, intorno ai 40-50 anni. Secondo lo studio, il tasso di queste
malattie era molto più alto nei bambini di quella generazione rispetto alla media. Questo effetto è da
attribuirsi alla mancanza di determinati pattern epigenetici che, a causa del mancato di vitamine e acido
folico durante la gravidanza, non si sono potuti formare durante l’embriogenesi. L’effetto della mancanza di
acido folico e vitamine durante l’embriogenesi, l’infanzia e l’adolescenza, ha avuto un impatto non solo
immediato, ma anche prolungato nel tempo, che ha causato a questi individui molti problemi per quanto
riguarda obesità, sindromi metaboliche e diabete di tipo 2.
B4.6.2 Epigenetica e invecchiamento

Modificazioni dei livelli di metilazione e dei pattern epigenetici
avvengono anche nell’invecchiamento.
Il professor Morandi, insieme al suo gruppo di ricerca, sta studiando
un “orologio molecolare epigenetico” grazie al quale, per esempio a
partire da un campione di sangue, è possibile determinare l’età
biologica dei singoli individui. Questo è possibile andando a misurare
il livello di metilazione di alcuni specifici geni, circa una ventina.
Osservando il grafico in figura, che presenta in ascissa l’età

cronologica (anagrafica) e in ordinata l’età biologica, si può dedurre
che:
1. se le due età sono sovrapponibili, non ci sono gravi problemi;
21
https://www.ted.com/talks/moshe_szyf_how_early_life_experience_is_written_into_dna?language=en
318
Biochimica clinica
2. se il rapporto è alterato, ad esempio nel caso in cui l’età biologica risulti più avanzata dell’età
cronologica, l’individuo è invecchiato precocemente; questo tipo di rapporto viene associato a
malattie legate all’invecchiamento come la malattia di Alzheimer o malattie neurodegenerative.
Quanto detto in clinica ha un risvolto enorme: infatti, se utilizzato in modo opportuno, questo metodo
potrebbe permette di diagnosticare precocemente malattia legate all’invecchiamento. Queste malattie,
prima fra tutte la malattia di Alzheimer, con le tecniche diagnostiche attualmente in uso, vengono
diagnosticate tardi, quando sono già molto avanzate. Una diagnosi precoce potrebbe migliorare la prognosi
e le prospettive di terapia di queste malattie.
Al contrario, esistono persone con età biologica più bassa dell’età anagrafica, per cui l’epigenoma è più
giovane (younger epigenome), aspetto assolutamente positivo.
Il fatto che l’analisi sia fatta dal sangue è un enorme passo in avanti, infatti l’alternativa sarebbe procedere
con una biopsia cerebrale, molto più rischiosa; è proprio questo uno dei problemi degli studî della delle
malattie neurodegenerative, la difficoltà nella raccolta dei campioni a causa della necessità di biopsie
cerebrali o prelievi di liquor tramite rachicentesi.
B4.7 BIOMARKER GENETICI ED EPIGENETICI IN ONCOLOGIA

Lo studio dell’epigenoma nei tumori avviene con tre approcci:
1. diagnosi precoce;
2. sviluppo di biomarcatori prognostici;
3. sviluppo di biomarcatori predittivi della risposta alla terapia.
Infatti, le modificazioni della cellula che causano l’insorgenza del tumore sono sì riferibili ad alterazioni
genomiche22, ma spesso anche a modificazioni dell’epigenoma. Un esempio è un’ipometilazione globale a
livello del genoma: solo l’1,5% del genoma è codificante, la restante parte è costituita da long non-coding
RNA, introni, promotori, ma soprattutto da elementi ripetuti (trasposoni o retrovirus endogeni); questi
elementi ripetuti, come detto precedentemente, possono spostarsi da una parte all’altra del genoma
causando mutazione, quindi devono essere controllati e ciò avviene soprattutto grazie all’ipermetilazione del
DNA. Perciò, mentre nelle cellule normali un’ipermetilazione del DNA a livello di queste regioni evita che vi
siano mutazioni, nelle cellule tumorali l’ipometilazione può provocare l’attivazione di questi elementi
ripetuti, che, saltando da una parte all’altra del genoma, possono inserirsi a livello di una porzione codificante
causando mutazioni.
22
Aberrazioni cromosomiche; cambiamenti del numero di copie, quindi delezioni e amplificazioni; inserzioni e delezioni;
traslocazioni; mutazioni.
319
Biochimica clinica
N.B. Un altro aspetto da considerare [frequente

domanda d’esame] è il fatto che i marcatori
epigenetici subiscono modificazioni (soprattutto
istoniche o di metilazione) nelle fasi precoci di
insorgenza del tumore (ovviamente ciò non esclude
che possano avvenire anche in fasi intermedie e
tardive), mentre le mutazioni genetiche
normalmente avvengono successivamente.
Trattandosi quindi di modificazioni precoci, le
mutazioni epigenetiche possono essere usate come
marcatori per diagnosi precoce.
B4.7.1 Biomarker genetici ed epigenetici per diagnosi e prognosi dei gliomi

L’immagine a sinistra rappresenta la
classificazione WHO dei tumori cerebrali
del 2016. Ogni riga indica un tipo diverso
di tumore cerebrale: la maggior parte
sono gliomi. Questi diversi tipi di tumore
differiscono per alcune alterazioni non
solo a livello mutazionale, ma anche a
livello epigenetico.
Esistono una serie di parametri impiegati
per tale classificazione: in passato questa
dipendeva soprattutto da parametri
basati sulla morfologia del tumore (ad
esempio dal rapporto
nucleo/citoplasma), sulla capacità
proliferativa di ciascun tipo di tumore o
da parametri legati
all’immunoistochimica; più
recentemente, grazie allo sviluppo di
tecniche di microbiologia molecolare
riferibili in particolare ad analisi
mutazionali, ci si è resi conto che l’analisi
di mutazioni a livello di particolari geni
consentiva di migliorare nettamente la
diagnosi.
Ad esempio, sono stati individuati due sottotipi di astrocitoma anaplastico (di grado 3): IDH-mutant e IDH-
wildtype, rilevati appunto tramite sequenziamento della famiglia genica IDH (IDH 1 e 2). Si è visto che
mutazioni di IDH 1 sono associate a prognosi migliori.
La stessa classificazione sarà valida per i glioblastomi: è possibile distinguere glioblastomi IDH-mutant e
glioblastomi-wildtype. È interessante notare come i glioblastomi IDH-mutant (soprattutto IDH1-mutant)
frequentemente derivino da un astrocitoma anaplastico di grado 3: quindi in caso di astrocitoma anaplastico
(spesso IDH1-mutant), nell’arco di due anni dopo l’intervento sarà riscontrabile, tramite risonanza
magnetica, una recidiva locale dovuta alla formazione di un glioblastoma di grado 4, di derivazione
dall’astrocitoma, che presenterà mutazione di IDH1.; rispetto ai glioblastomi primari (diagnosticati
direttamente come glioblastomi) che non hanno mutazione in IDH 1, i tumori mutati avranno una prognosi
migliore. I gliomi con prognosi peggiore saranno quindi i glioblastomi di grado 4 IDH-wildtype.
320
Biochimica clinica
Gliomi
I gliomi sono tumori del sistema nervoso centrale che si distinguono in gliomi di basso grado (grado 1 e 2),
di grado 3 e di grado 4. I gliomi di grado 4 sono detti glioblastomi e sono tumori molto aggressivi: la maggior
parte dei pazienti muore ad un anno dalla diagnosi e l’aspettativa di vita massima alla diagnosi è di due anni.
Si considerino tre tipi di glioma:

• glioblastoma;
• astrocitoma anaplastico;
• ependimoma (dovuto a mutazioni delle cellule ependimali, è diagnosticato soprattutto nel
bambino).
Le alterazioni legate allo sviluppo di questi tumori possono essere di tipo genetico (in verde) o epigenetico
(in blu):
• nel glioblastoma gran parte delle alterazioni sono di tipo genetico:
o amplificazione del gene EGFR;
o mutazione del gene del retinoblastoma RB;
o delezione di CDKN2A;
o delezione di PTEN;
o alterazione del promotore di TERT (subunità catalitica della telomerasi): è silenziata nelle
cellule non in attiva proliferazione ed espressa nelle cellule staminali al fine di ripristinare,
grazie alla sua attività di trascrittasi inversa, le microporzioni di sequenze ripetute
telomeriche perse ad ogni ciclo cellulare à è un gene espresso anche dalle cellule tumorali,
che così potranno replicare illimitatamente;
• nell’astrocitoma si ha una situazione a metà, con molte alterazioni di tipo genetico e circa altrettante
di tipo epigenetico (ad esempio l’ipermetilazione del promotore di alcuni geni);
• nell’ependimoma le alterazioni sono di tipo epigenetico.
In quest’immagine sono messe in evidenza le mutazioni

che portano ad insorgenza di glioma nell’adulto (ad
esempio la 1p/19q codelezione o la mutazione del
promotore di TERT) e quelle che causano tumore
embrionale nel bambino. Queste mutazioni vanno
analizzate, tramite sequenziamento dei geni specifici,
per migliorare la diagnosi che deriverebbe dall’esclusiva
321
Biochimica clinica
analisi del vetrino da parte dell’anatomopatologo, in modo tale da poter meglio prevedere il comportamento
del tumore.
B4.7.2 Biomarker predittivo della risposta alla terapia: MGMT e i gliomi

Dall’immagine a lato è possibile notare quanto grande sia la
porzione cerebrale coinvolta nel glioblastoma; si nota peraltro
un’ampia zona di necrosi all’interno. I glioblastomi sono
normalmente molto vascolarizzati; hanno un’elevatissima capacità
proliferativa nell’arco di mesi. Il paziente muore dopo sei mesi dalla
diagnosi senza operazione, con operazione dopo uno o due anni.
L’incidenza di questi tumori è 3/100.000, l’età media di diagnosi è
64 anni. C’è elevata differenza tra glioblastoma primario (IDH 1/2-
wildtype) e secondario (IDH1/2-mutant, derivante da astrocitoma).
I glioblastomi secondari infatti hanno un’insorgenza precedente,
l’età media è intorno ai 42 anni.
Nei gliomi (in particolare nei glioblastomi), uno dei marcatori epigenetici più importanti e analizzati è il grado
di metilazione di DNA a livello del gene MGMT. In particolare, viene considerato marcatore prognostico
positivo la presenza di metilazione sul gene MGMT, quando il gene MGMT è metilato il tumore risponde
meglio alla terapia.
I glioblastomi sono tumori molto aggressivi, a livello terapeutico vengono trattati con agenti alchilanti come
la temozolomide23, in grado di agire a livello del SNC perché oltrepassa senza problemi la barriera
ematoencefalica. In quanto agente alchilante, la temozolomide aggiunge gruppi alchilici alle basi azotate,
solitamente a livello della guanina, formando degli addotti. Questi addotti rendono la replicazione del DNA
difficoltosa, provocando mutazioni e causando apoptosi delle cellule. Ovviamente questo effetto di apoptosi
si esplicherà maggiormente sulle cellule che replicano molto, in attiva replicazione, come le cellule tumorali.
Fisiologicamente, all’interno delle nostre cellule, esistono dei sistemi enzimatici di riparazione che ci
proteggono da questo tipo di danni causati da agenti alchilanti: uno di questi è proprio MGMT, il quale è in
grado di rimuovere il gruppo alchilico dalla base danneggiata. In condizioni fisiologiche questo meccanismo
di riparazione del danno è enormemente vantaggioso, ma diventa un problema nel caso di una terapia
antitumorale tramite agenti alchilanti, perché va proprio a contrastare la funzione del farmaco.
Di conseguenza, se nel tumore il gene MGMT è

attivamente espresso (perché il suo promotore è
ipometilato) si avrà una prognosi peggiore: il
prodotto del gene MGMT contrasterà l’azione del
farmaco e di conseguenza le cellule tumorali non
vengono mandate in apoptosi. Se, invece, il
promotore è ipermetilato e quindi silenziato, la
proteina sarà assente o presente in quantità molto
minore, per cui non sarà in grado di contrastare
l’attività del farmaco e questo porterà a una
maggiore efficacia farmacologica e la prognosi
risulterà quindi migliore.
Valutazione dello stato di metilazione del gene MGMT

Per valutare lo stato di metilazione del promotore è possibile utilizzare un metodo basato sul trattamento
con sodio bisolfito.
23
La temozolomide è uno dei pochi farmaci efficaci contro il glioma.
322
Biochimica clinica
1. Il chirurgo procede con l’asportazione di

un campione del tessuto tumorale, in
questo caso quindi un campione di
glioblastoma. Il campione sarà poi
analizzato dall’anatomopatologo.
2. Dal campione viene estratto il DNA: il
DNA estratto dal campione è trattato con
sodio bisolfito, il quale trasforma le
citosine non metilate in uracili, senza
alterare le citosine metilate.
3. In seguito, si procede col
sequenziamento della regione del
promotore del gene MGMT: si analizzano
quali e quante citosine sono diventate timine24 e quali sono rimaste citosine.
4. Da ciò si deduce quali e quante citosine delle isole CpG sequenziate sono metilate (sono rimaste
citosine) e quali no (sono diventate timine).
Prima dell’utilizzo del sequenziamento, il livello di metilazione del promotore veniva valutato attraverso PCR
con utilizzo di due primer specifici.
1. Una reazione utilizza il primer
che riconosce la sequenza
contenente le citosine che
rimangono tali (quindi le
citosine metilate, non
trasformate dal sodio
bisolfito); questo primer quindi
lega l’allele metilato.
2. Una seconda reazione utilizza il
primer che lega la sequenza
contenente citosine diventate
timine (quindi le citosine non
metilate, che sono state
trasformate dal sodio
bisolfito); questo primer lega
quindi l’allele non metilato.
Tramite questa tecnica si analizza quindi la presenza di alleli metilati e si valuta quante cellule sono metilate
e quante no.
Lo stesso tipo di valutazione può essere eseguita con la Next Generation Sequencing: successivamente a
trattamento con sodio bisolfito, viene sequenziato il promotore del gene MGMT analizzando l’eventuale
presenza di uracile (riconosciuto come timina) al posto di cisteina, nel caso in cui la cisteina non fosse
metilata. [domanda d’esame frequente]
Il trattamento con temozolomide è previsto anche per i pazienti che non hanno il gene metilato, per i quali
tuttavia il farmaco non risulta estremamente efficace. Sono in corso trial clinici che prevedono la
combinazione di più farmaci (tra cui anche la temozolomide), ma non si è giunti ad una cura efficace. Anche
per i pazienti con promotori metilati, per i quali la terapia ha un’azione positiva, l’allungamento
dell’aspettativa di vita è pari a pochi mesi, al massimo uno o due anni.
24
L’uracile nel sequenziamento verrà riconosciuto come timina.
323
Biochimica clinica
In base al rapporto tra i prodotti che si ottengono dalla reazione di PCR è possibile dedurre se il gene è
maggiormente metilato o non metilato.
[Dalla dispensa di Murciano] Quindi, se tramite la PCR si aveva l’amplificazione del solo allele non metilato
(unico prodotto della PCR) voleva significare che quel gene non era assolutamente metilato o almeno che in
quella regione analizzata con PCR non si era verificata metilazione. Se dunque il primer riconosce le citosine
vuol dire che la sequenza a cui si lega è metilata, se riconosce le timine vuol dire che non è metilata. Molto
frequentemente si possono avere anche avere due prodotti di PCR positivi, dal momento che su un cromosoma
può essere avvenuta la metilazione e sull’altro no [mi sembra di aver capito che in questo caso entrambi i
primer (uno che riconosce i siti metilati e l’altro che riconosce le timine, dunque le citosine non metilate) si
legano a due cromosomi differenti che presentano rispettivamente citosine metilate e non, e quindi si
ottengono due prodotti di PCR positivi. Da questo se ne deduce che se il gene è molto espresso, tutti e due gli
alleli non sono metilati.
B4.7.3 Analisi per la diagnosi di glioma
Cosa fare in caso di sospetto glioma?

• Se l’anatomopatologo dal vetrino fa diagnosi di glioblastoma, è necessario il sequenziamento di IDH
1 e 2, per capire se si tratti di glioma wildtype o mutant. Successivamente viene valutata la
metilazione del promotore di MGMT.
• Se si è di fronte ad un glioma di basso grado (ad esempio oligodendroglioma o oligoastrocitoma),
oltre a definire la mutazione di IDH, si analizza con la FISH la co-delezione 1p/19q. Si individuano
anche eventuali mutazioni su altri geni con la Next Generation Sequencing (analisi soprattutto di
TERT, ma anche ad esempio di p53). Un’altra mutazione individuabile è la perdita in omozigosi di
CDKN2A, che può essere verificata con la FISH, con la Array CGH o con la NGS.
B4.7.4 IDH1 e IDH2

Uno dei geni cardine per la classificazione dei
gliomi è IDH, in particolare IDH125, ma anche IDH2.
Nei gliomi di basso grado (grado 1,2,3) è possibile

riscontrare mutazioni di IDH1 e IDH2, mentre nei
glioblastomi (gliomi di grado 4) queste mutazioni
25
Mutazioni di IDH1 sono associate a prognosi migliori.
324
Biochimica clinica
non ci sono. Un’eccezione a questo è rappresentata dal glioblastoma secondario, tumore derivato da un
astrocitoma anaplastico (grado 3): in caso di astrocitoma anaplastico (spesso IDH1-mutant), nell’arco di due
anni dopo l’intervento (solitamente dopo 6 mesi) sarà possibile riscontrare, tramite risonanza magnetica,
una recidiva locale dovuta alla formazione di un glioblastoma di grado 4; questo glioblastoma viene definito
secondario ed essendo di derivazione dall’astrocitoma, presenterà mutazione di IDH1. Questo è l’unico caso
di glioblastoma con mutazioni di IDH.
I geni IDH1 e IDH2 wildtype (wildtype significa non mutato) codificano per enzimi coinvolti nel ciclo di Krebs
che portano alla formazione di α-chetoglutarato. I geni mutati, invece, portano alla formazione di 2-
idrossiglutarato. Il 2-idrossiglutarato è un oncometabolita che va a inibire le proteine TET, che sono delle
demetilasi, quindi proteine coinvolte nella demetilazione del DNA. Se queste proteine sono inibite e quindi
non possono esplicare la loro azione di demetilazione, aumenta il grado di metilazione dell’epigenoma. I
tumori IDH-mutant sono ipermetilati (fenotipo G-CIMP= Glial CpG Island Methylator Phenotipe) e
normalmente questo si associa a una prognosi favorevole; i pazienti con questo tipo di tumori possono
sopravvivere fino a 4/5 anni, al contrario dei pazienti affetti da tumori IDH-wildtype che nella maggior parte
dei casi muoiono a un anno dalla diagnosi.
[Dalle diapositive] Non sorprendentemente le proteine che legano gli istoni per leggere il codice di
modificazione e che lo mettono poi in pratica, sono frequentemente mutate nel cancro, causando un
malfunzionamento del signaling cellulare. Mutazioni in proteine associate alla cromatina o regolatorie sono
diffusissime nei cancri pediatrici, e la loro prevalenza in questi frequenti tumori ne sottolinea l’importanza
nell’oncogenesi. Nel 2012, gli sforzi sul sequenziamento del genoma hanno portato all’importante scoperta
che gli stessi istoni possono essere mutati nei tumori. Due gruppi hanno identificato mutazioni somatiche, con
elevata frequenza, nell’istone H3 nel glioma pediatrico ad alto grado (pHGG). Studi successivi hanno esteso
l’ampiezza di questa mutazione anche a condroblastoma, tumore osseo a cellule giganti, condrosarcoma,
sarcoma pediatrico dei tessuti molli, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo e leucemia.
325
Biochimica clinica
B5. DIAGNOSI PRECOCE DEI TUMORI DEL CAVO ORALE

(prof. Morandi)
B5.1 EPIDEMIOLOGIA DEI TUMORI DEL CAVO ORALE

Con Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) si intendono i tumori del distretto testa-collo, che
comprendono i tumori del cavo orale, del naso e dell’orofaringe. Gli HNSCC sono il sesto tipo di tumore più
comune a livello mondiale (anche se ci sono delle differenze da paese a paese):
• ci sono 600.000 nuovi casi l'anno;
• la maggior parte di questi sono carcinomi squamosi del cavo orale (OSCC);
• sono tumori molto aggressivi con una mortalità del 50% in 5 anni;
• nella maggior parte dei casi, circa i 2/3, sono diagnosticati in stadi avanzati (stadio 3 o 4) con una
prognosi abbastanza cattiva;
• una buona parte di questi tumori è correlata al fumo di sigaretta, all’alcolismo e alle infezioni da HPV;
si ricordi che l’alcol non è di per sé cancerogeno, ma è un ottimo solvente per le sostanze
cancerogene contenute nel fumo di sigaretta, che vengono così amplificate.
Considerando la top list tra tutti i tumori, i tumori delle labbra, del
cavo orale, della faringe e orofaringe si collocano al sesto posto;
quindi, non è un tumore molto comune, ma neanche troppo raro. A
livello globale i paesi col tasso maggiore di questo tumore sono
India, Pakistan, Nuova Guinea, Ungheria, Francia e anche gli Stati
Uniti hanno un’incidenza abbastanza alta. L’incidenza è alta in
questi paesi perché molte persone sono abituate a masticare foglie
di vite o di tabacco che possono portare allo sviluppo di carcinomi
(es. carcinoma della lingua).
In Italia questi tumori sono associati soprattutto al fumo e alle
infezioni da HPV, ma non necessariamente.
Per poter diminuire l’incidenza di questo tipo di tumori si può effettuare:

- prevenzione sulla popolazione, cercando di diminuire l’utilizzo di fumo e alcool;
- igiene orale, visite annuali dal dentista possono rilevare delle lesioni visibili;
- diagnosi precoce;
- ricerca di nuovi marcatori diagnostici e terapeutici.
B5.2 LESIONI ORALI PRENEOPLASTICHE

Spesso queste lesioni tumorali sono associate alla presenza di lesioni preneoplastiche:
o La leucoplachia in alcuni casi può essere una lesione preneoplastica. Si
tratta di una macchia bianca a livello della mucosa buccale che in genere
viene valutata con una biopsia per vedere se ci sono displasie a livello
cellulare, che possono portare in un 3,5% dei casi a lesioni tumorali.
o L’eritroplachia è più spesso associata a tumori. Si tratta di macchie rosse
nella mucosa buccale, con un tasso di trasformazione più alto.
Questi carcinomi sono molto aggressivi e hanno un tasso di proliferazione
molto alto; per questo la tempistica in questi casi è molto importante:
bisogna cercare di agire precocemente per evitare che dalla lesione
preneoplastica si passi nel giro di qualche mese o anno a un carcinoma franco
da trattare chirurgicamente in modo molto aggressivo. Nei tumori del cavo
orale la chirurgia è molto demolitiva. A questo proposito, il prof. Marchetti
utilizza un sistema di ricostruzione tridimensionale computerizzato, per
cercare di rispettare e mantenere la fisionomia del paziente.
326
Biochimica clinica
B5.3 MODIFICAZIONI GENETICHE NEI HNSCC

Questi tumori hanno varie modificazioni genetiche, che sono soprattutto legate ad alcuni geni.
Il grafico a lato mostra la top list dei
tumori per frequenza di mutazioni
(quante mutazioni per singola
megabase): i tumori HNSCC sono più
o meno al 6°-7° posto.
Il melanoma è in prima posizione
(perché è sottoposto a raggi UV e a
sostanza chimiche, e quindi ha un
maggiore tasso di mutazione a
livello cellulare); seguono i tumori
del polmone (sia adenocarcinoma
sia squamous cell carcinoma), della
vescica, dello stomaco, dell’esofago,
del colon e gli HNSCC. Uno dei
tumori con più bassa frequenza
mutazionale per megabase sono i tumori rabdoidi, il sarcoma di Ewing, i tumori alla tiroide, e l’astrocitoma
pilocitico (glioma di grado 1 presente nei bambini che ha pochissime mutazioni a livello genomico).
I geni maggiormente coinvolti nei HNSCC sono:

• p53, mutato nel 72% dei casi;
• CDKN2A, mutato nel 22% dei casi;
• PIK3CA, mutato nel 21% dei casi;
• NOTCH1, mutato nel 19% dei casi;
• CASP8, mutato nel 9% dei casi.
Normalmente i HNSCC si possono dividere in due grossi gruppi:
• HPV (–): normalmente con un numero di mutazioni a livello genomico molto più ampio; prognosi
peggiore.
• HPV (+): normalmente con un numero di mutazioni molto inferiore, l’HPV è di per sé il driver per
portare al tumore; prognosi migliore.
Si può cercare di identificare questi tumori in modo precoce analizzando le mutazioni presenti in questi
carcinomi. Ad esempio, facendo un test per p53 si potrebbe trovare il 72% dei pazienti con la mutazione, ma
si perderebbero i restanti pazienti che non presentano una mutazione per p53. Quindi non è la via giusta
sviluppare un test di diagnosi precoce a livello mutazionale perché questi presentano bassa sensibilità;
possiamo quindi considerare le modificazioni epigenetiche.
B5.4 MODIFICAZIONI EPIGENETICHE NEI HNSCC

Le modificazioni epigenetiche avvengono prima nella cancerogenesi e possono essere utilizzate come
biomarcatori per avere una sensibilità maggiore rispetto a un’analisi mutazionale. Il gruppo di ricerca del
prof. Morandi ha sviluppato un test (pubblicato di recente, brevettato e che sta attendendo l’entrata in
commercio) che non va a considerare le modificazioni genetiche, che avvengono in fase tardiva, ma va ad
analizzare le modificazioni epigenetiche.
Se si sviluppasse un test solo su p53 e PIK3CA non solo si escluderebbero tantissimi pazienti, ma si avrebbero
anche molti falsi positivi, in quanto questo tipo di test avrebbe una sensibilità dell’80%. Considerando che le
mutazioni avvengono in fase più tardiva rispetto alle modificazioni epigenetiche, si è sviluppato un test basato
sulla ricerca della modificazione epigenetica di alcuni geni, in modo particolare di 13 geni distinti.
327
Biochimica clinica
Per effettuare questo test si utilizza uno spazzolino, come quello utilizzato nel pap-test. Dopo aver spazzolato
la mucosa dove si è osservata una lesione, si inserisce la parte terminale dello spazzolino in una provetta
contenente un liquido preservante26 DNA e RNA. Nel laboratorio sul campione è eseguita l’analisi NGS.
Questi 13 geni sono in grado di discriminare il tumore dal tessuto normale ed il test possiede una sensibilità
del 97% ed una specificità del 100%27.
Si tratta di un pannello di 13 geni la cui valutazione quantitativa dell’alterazione epigenetica ci consente di
sviluppare uno score: se il paziente supera una determinata soglia (1.06) sarà positivo e avrà un alto rischio
di sviluppare tumori; andrà quindi direttamente a fare la biopsia e a seguire tutti gli step di diagnostica
classica.
Si è inoltre potuto osservare che il test, oltre a essere importantissimo nel ricercare la positività dei pazienti,
dà indicazioni anche sulla prognosi:
- Il gene LINC0059 (è un long non coding RNA), è stato associato alla grandezza del tumore (T1 e T2
erano molto più metilati);
- Il gene EPHX3 è correlato alla presenza di metastasi (i metastatici erano poco metilati);
- Il gene ITGA-4 indica se la futura lesione può andare incontro a recidive o meno (in base allo stato di
metilazione si è potuto vedere che i pazienti con gene metilato hanno un rischio di recidive molto
più alto rispetto a quelli non metilati).
Un altro dato molto sorprendete riguarda i pazienti operati da questi tumori: prelevando con uno spazzolino
un campione dalla mucosa orale (nel punto dove è avvenuta la resezione) di uno di questi pazienti, se il
chirurgo ha svolto il suo intervento in modo accurato, il paziente si sarà negativizzato; i casi che invece si
positivizzano presentano recidiva.
Quindi questo test ha anche un impatto prognostico: si possono seguire anche pazienti già operati nel follow-
up, cui viene periodicamente effettuato un prelievo di cellule della mucosa buccale in corrispondenza della
zona operata per valutare se queste cellule tornano a essere positive; in quel caso vorrebbe dire che sono
rimaste alcune cellule dopo l’operazione che si stanno continuamente dividendo e che possono dare origine
a recidive loco-regionali o a metastasi, ed è quindi necessario intervenire nuovamente e rimuovere quella
porzione di tessuto.
In conclusione, questo test ha due funzioni:

- diagnosi precoce come screening di secondo livello: un paziente che presenta una lesione alla cavità
orale viene sottoposto a questo test e, nel caso di positività, si eseguono biopsia ed intervento
chirurgico per rimuovere il tumore;
- follow-up in pazienti operati da tumore; in questo caso il follow-up si svolge ogni tre mesi per vedere
se il paziente ha sviluppato recidiva (si stanno valutando anche altri marcatori legati alla terapia
svolta ad esempio con acituximab).
26
Il liquido preservante consente di conservare DNA e RNA per circa un mese a temperatura ambiente.
27
I dati sono stati confermati da un’analisi multicentrica svolta in Italia.
328
Biochimica clinica
B6. ETEROGENEITÀ TUMORALE E BIOPSIA LIQUIDA

(prof. Morandi)
B6. PAN-CANCER ANALYSIS OF WHOLE GENOME

Un importante paper uscito su
Nature, “Pan-cancer analysis of
whole genome”, fa la sintesi della
situazione per tutti i tipi di
tumore: quali sono i geni più
mutati e quali no, quali sono i
driver genes che guidano il
processo di cancerogenesi e che
si ritrovano in tanti tipi di tumori.
Si può affermare che nei tumori il

genoma è mutato e che contiene
in media 4-5 driver mutations.
Nella maggior parte dei tumori
che sono stati analizzati si tratta
di coding mutations (nelle regioni codificanti), e tra le non coding mutations si ha soprattutto la mutazione
sul promotore di TERT.
Ad esempio, p53 si trova mutato in praticamente tutti i tumori, e spesso è mutato in entrambi gli alleli
(entrambi gli alleli devono essere persi per avere loss of funcion); poi ci sono anche altri oncosoppressori
come BRCA1, BRCA2 e ATM che sono coinvolti in una buona parte di queste mutazioni. Lo studio ha permesso
di vedere come le modificazioni nell’87% dei casi sono a carico della zona codificante e solo il 13% delle
mutazioni a carico dei point driver avvengono nelle regioni non codificanti.
TERT si trova mutato soprattutto in quei tipi di tumori con bassa capacità proliferativa. I tumori più frequenti
si presentano dove già di per sé gli epitelî sono proliferanti perché l’epitelio si deve rigenerare (come a livello
di colon, polmone, mammella): qualche cellula, infatti, può acquisire mutazioni e andare avanti nel processo
di cancerogenesi. Nei tessuti che si replicano poco (come i neuroni), non avvengono frequentemente tumori,
ma avvengono piuttosto in cellule che hanno una certa capacità replicativa (es. cellule della glia à gliomi).
Alcuni processi di mutazione somatica generano mutazioni multiple in un singolo evento catastrofico,
tipicamente raggruppate in un’area genomica, portando a una sostanziale riconfigurazione del genoma. La
cromotripsi permette, in alcuni tipi di tumore, di accumulare moltissime mutazioni, per cui tutto il genoma
viene completamente stravolto.
Osservando la top list dei tumori più mutati, il melanoma è il più mutato in generale: per mutazioni
puntiformi, delezioni, inserzioni e retrotrasposizione (dovuta a quegli elementi ripetuti, che vengono
silenziati grazie alla metilazione del DNA, che possono riaccendersi e saltare lungo il genoma dando problemi
specialmente se accadono in porzioni codificanti).
B6.2 ETEROGENEITÀ TUMORALE

In definitiva il processo di cancerogenesi è legato a una sorta di evoluzione tumorale, che spesso segue le
leggi darwiniane dell'evoluzione, in cui i cloni cellulari si devono adattare al microambiente che circonda quel
determinato organo in quel determinato tessuto. Le cellule che hanno un maggior vantaggio proliferativo,
ad esempio grazie all’accumulo di alcune mutazioni, continuano a replicarsi generando un clone
predominante.
Soprattutto nei tumori solidi c’è eterogeneità tumorale, cioè ci sono dei cloni di cellule che possono essere
diversi all'interno dello stesso tumore: la popolazione tumorale che popola quella determinata
329
Biochimica clinica
neoformazione cancerosa può essere anche in parte eterogenea dal punto di vista genetico, ci sono alcuni
cloni con determinate mutazioni e cloni che ne possono portare altre. Il genoma dei tumori perciò è dinamico.
Mutazioni germinali (es. BRCA1 e 2 o p53 nella

sindrome di Li-Fraumeni) e mutazioni somatiche
à formazione del tumore primitivo per
accumulo di queste mutazioni à si possono poi
avere metastasi con l’acquisizione o la perdita di
alcune mutazioni che possono dare un vantaggio
proliferativo alle metastasi stesse.
Ad esempio, il tumore alla mammella
metastatizza soprattutto nell’osso, nel cervello e
nel fegato; le cellule che partono da un tessuto
mammario e finiscono nel cervello si devono
adattare al microambiente del cervello,
completamente diverso da quello mammario,
quindi queste mutazioni generano una sorta di adattamento della cellula ad altre situazioni.
Anche il trattamento chemioterapico genera una sorta di selezione di stampo darwiniano, infatti solo alcune
cellule resistono al trattamento (es. temozolomide). Anche la presenza di recidive segue lo stesso discorso.
Possiamo avere tre modelli di evoluzione tumorale: modello branching evolution, neutral evolution e
punctuated evolution (i più importanti sono i primi due).
• Nella branching evolution (fig. B) c’è una cellula
capostipite che dà origine a un’iniziale massa
tumorale, che porta determinate mutazioni; poi
durante l’evoluzione tumorale si possono
formare alcuni cloni che soppiantano la
popolazione tumorale iniziale (nell’immagine in
verde e azzurro) e nel corso del tempo altre
neopopolazioni portano altre mutazioni nel
genoma. Alla fine nell’immagine ci sono 4
popolazioni tumorali: una viola, una verde, una
azzurra e una gialla. Questo tipo di evoluzione è
soprattutto descritta nei tumori della mammella.
• Nella neutral evolution (fig. C) si ha una
generazione di cloni e subcloni enorme.
Viene descritta soprattutto nei carcinomi
squamosi del cavo orale (che è eterogeneo nella
maggior parte dei casi con un sacco di cloni e
subcloni che popolano la popolazione tumorale).
• La punctuated evolution (fig. D) è descritta solo in alcuni tipi di tumore.
Uno studio28 effettuato sul tumore alla mammella ha dimostrato che analizzando la cellula tumore iniziale,
l’evoluzione branching arriva a sviluppare al massimo 3 o 4 cloni, che condividono solo in parte le mutazioni
iniziali.
Diversi studî29 effettuati dal professore hanno dimostrato come nei tumori del cavo orale sia predittivo
l’analisi del tessuto sano e sia possibile ricostruire l’evoluzione tumorale utilizzando degli alberi filogenetici.
Si è inoltre visto che la presenza di eterogeneità del tessuto sano sia indice di una peggiore prognosi, mentre
se si ha poca eterogeneità del tessuto normale, si avranno pazienti con una prognosi migliore.
28
Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing.
29
Intratumoral Heterogeneity in Recurrent Metastatic Squamous Cell Carcinoma of the Oral Cavity: New Perspectives
Afforded by Multiregion DNA Sequencing and mtDNA Analysis; Prognostic impact of intra-field heterogeneity in oral
squamous cell carcinoma.
330
Biochimica clinica
In fumatori accaniti, si assiste al fenomeno della cancerizzazione a campo30.
B6.3 BIOPSIA LIQUIDA

La liquid biopsy è uno stratagemma che permette di monitorare l’evoluzione del genoma tumorale con una
tecnica minimamente invasiva.
Nella maggior parte dei casi il sangue è il campione di partenza, ma si possono analizzare anche le urine,
applicate soprattutto ai tumori di prostata, vescica e rene, e il liquor cefalorachidiano, per tumori del cervello
o metastasi cerebrali.
I maggiori obiettivi della liquid biopsy sono la:
• diagnosi precoce;
• prognosi: si segue il paziente durante il follow-up dopo l’intervento valutando il DNA circolante
presente all’interno del paziente;
• selezione del trattamento: si può selezionare il trattamento sulla base della presenza di mutazioni a
livello del circolo: nel sangue si vedono pezzettini di DNA derivati dal tumore con determinate
mutazioni che permettono di stratificare i pazienti in base al trattamento più mirato;
• burden disease, ovvero monitorare per esempio quanto hanno inciso le radiazioni sulla
modificazione del genoma.
La liquid biopsy si basa su un prelievo di sangue (in genere 10-20 mL) da cui si ottiene plasma.
Nel plasma si verifica, attraverso sequenziamento di determinati geni, quali sono mutati e quali no, poiché si
può avere un numero crescente di mutazioni nel corso del tempo.
Normalmente si usa il plasma e non il siero perché nel siero c’è più DNA in senso generale, riferibile a una lisi
dei linfociti durante il processo di formazione del coagulo; ma essendo i linfociti normalmente wild-type, cioè
che non fanno parte del tumore, bisogna trovare quelle poche molecole mutate nel sangue riferibili al
tumore. Quindi è meglio usare il plasma, che ha pochi linfociti lisati, poiché la gran parte del DNA è riferibile
al DNA proveniente dalle cellule tumorali che vanno in circolo.
Normalmente in individui sani e non molto anziani il livello di DNA nel plasma è molto basso, mentre col
crescere dell'età aumenta, poiché abbiamo più necrosi e fenomeni apoptotici.
[Dalle diapositive] Un importante fattore di confusione è l'eterogeneità somatica benigna, che è l'accumulo
di mutazioni somatiche nelle lesioni non cancerose durante l'invecchiamento.
Possono verificarsi mutazioni nelle cellule staminali adulte, che possono essere propagate alle cellule figlie
durante l'auto-rinnovamento a un tasso di circa 36 mutazioni all'anno e hanno un grande effetto sul carico
mutazionale dei tessuti. Se si verifica una mutazione in un gene cancerogeno, può conferire un vantaggio di
fitness alla cellula staminale e promuove un'espansione clonale, che può essere rilevata nel ctDNA e attribuita
erroneamente alla tumorigenesi. Le espansioni clonali nel sistema ematopoietico sono state ampiamente
documentate e i geni che sono noti essere frequentemente alterati nell'emopoiesi clonale sono già stati
segnalati come causa di falsi positivi. Le espansioni clonali nei tessuti solidi sono più difficili da rilevare ma
sono state segnalate. In particolare, mutazioni di TP53, che somigliano molto a quelle osservate nei tumori
sono state scoperte in tessuti non cancerosi, e questi hanno il potenziale per essere identificati nel cfDNA (cell-
free DNA) plasmatico di individui senza cancro. Pertanto, il rilevamento di una mutazione in un gene
cancerogeno nel ctDNA non può essere equiparato alla prova certa di neoplasia.
B6.3.1 Perché è presente DNA mutato circolante?

Ci sono tre eventi principali che possono dare origine alla presenza di questi biomarcatori nel sangue:
• Apoptosi: la popolazione tumorale che va in apoptosi genera materiale genetico che poi va nel
circolo. Si trovano quindi pezzettini di DNA di dimensioni ridotte a livello circolatorio, si estrae il DNA
30
Il “concetto della cancerizzazione di campo” (“field cancerization”) consiste nella teoria che, in una certa area della
mucosa orale, le cellule epiteliali subiscono un danno genetico che le induce a proliferare in maniera clonale. Questo
concetto spiega perché certi pazienti sviluppano più di un carcinoma orale con modalità sincrone o metacrone [da
internet].
331
Biochimica clinica
dal plasma e si valuta se un

determinato gene, che è
frequentemente mutato in un
determinato tipo di tumore, è
mutato. Si può anche verificare
quali sono le mutazioni che il
paziente porta durante il follow-up.
• Necrosi: determina il rilascio di
acidi nucleici nel sangue.
• Secrezione o in altri casi cell
detachment: ci sono alcuni tipi di
tumori che perdono le molecole di
riconoscimento delle molecole
fiancheggianti, come E-caderina.
Con la perdita di queste molecole di
adesione la cellula viene rilasciata
dal tessuto e va nel circolo. Così
originano le circulating tumor cells.
Nel plasma si può cercare il DNA tumorale circolante (ctDNA à circulating tumor DNA), le cellule tumorali
circolanti (CTC à circulating tumor cells), l’RNA circolante, o i miRNA; normalmente si cercano le mutazioni
del DNA circolante.
Uno dei problemi di questa metodica è legato all’invecchiamento: questo determina degli effetti confondenti
dovuti a cellule fisiologicamente in apoptosi.
Inoltre, il sistema NGS (Next Generation
Sequencing) può generare qualche errore;
bisognerà quindi distinguere se ciò che si analizza
sia il risultato di una mutazione tumorale reale
oppure un problema “tecnico” del sistema.
È necessario quindi partire da un grande
campione da analizzare (si parla di decine di mL di
sangue) per avere dei risultati consistenti e
veritieri.
Nei tumori cerebrali è molto difficile monitore il
tumore tramite liquid biopsy utilizzando un
prelievo di sangue; tuttavia, è possibile trovare
traccia del materiale genetico tumorale nel liquor che però può essere prelevato una volta (al massimo due
volte) soltanto nel corso della vita del paziente.
B6.3.2 Esecuzione
Per il prelievo del campione, viene utilizzata una particolare provetta che consente di mantenere integri gli
acidi nucleici: in queste provette ci sono delle sostanze specifiche per la preservazione a temperatura
ambiente di DNA e RNA.
Per il prelievo viene usato il plasma e non il siero: anche se nel siero si ha una maggiore quantità di DNA,
quest’ultimo deriverà dalla lisi dei linfociti, aumentando così il background wild-type di materiale genetico,
mentre con il plasma si avrà poco DNA da linfociti.
La standardizzazione deve essere massima, a partire dall’utilizzo degli stabilizzanti per mantenere integri gli
acidi nucleici.
Una ditta chiamata CellSearch propone un test che si basa sul prelievo di 7,5 mL di sangue e che grazie a un
sistema di riconoscimento antigene-anticorpo di cellule EpCAM+ riesce a riconoscere le cellule epiteliali di
origine mammaria e quindi a identificare le cellule tumorali della mammella in circolo.
332
Biochimica clinica
Secondo questo test, trovando almeno 5 cellule tumorali positive in circolo su 7,5 mL di sangue significa che
ci sono tante cellule tumorali in circolo poiché il tumore sta proliferando molto e la prognosi è normalmente
cattiva.
Un numero di cellule > 5 nel campione isolato indicano una prognosi peggiore, quindi in base al numero di
cellule circolanti mammarie si descriverà la prognosi del tumore.
La soglia di 5 cellule nel campione prelevato è variabile da tumore a tumore: per alcuni tumori la soglia è
spostata a 6 cellule, mentre in altri casi resta 5.
Inoltre, si cercherà il circulating circle DNA (DNA circolante in circolo) per determinare se i frammenti in
circolo presentano mutazioni o modificazioni epigenetiche.
Normalmente tutto il DNA che si trova nel

plasma è frammentato: il DNA delle cellule
che sono andate in apoptosi subisce un taglio
da parte delle DNAasi della grandezza di circa
142 bp; questa lunghezza è data dai
nucleosomi che proteggono dalla DNAasi,
quindi il taglio avviene tra un nucleosoma e
quello successivo.
Si utilizzerà una PCR molto corta per
amplificare questi piccoli frammenti di DNA.
Ricapitolando, dopo molti studî si è visto che la soglia 5 determina, se positiva, prognosi peggiore, se
negativa (quindi sotto le cinque cellule), prognosi migliore. Questa soglia non è sempre veritiera, infatti su
numeri molto alti si trovano alcuni falsi positivi e alcuni falsi negativi. Un altro svantaggio è che non si possono
analizzare queste cellule positive tramite NGS. Si stanno sviluppando però altre macchine che catturando
queste circulating tumor cells ne permettono il sequenziamento tramite estrazione del DNA.
B6.3.3 Liquid biopsy per la risposta e il follow-up

Ad esempio, nel polmone si può valutare la presenza di mutazioni legate anche alla terapia, durante il follow-
up (effettuando un prelievo ogni 3 mesi). All’inizio la mutazione trovata nel tumore primitivo che è stato
analizzato è presente a livello del sangue, ma poi cala bruscamente perché con la rimozione chirurgica viene
rimossa la maggior parte delle cellule tumorali; nel corso del tempo alcune cellule sono rimaste in giro e
hanno generato una recidiva, grazie anche alla terapia somministrata al paziente si possono generare dei
cloni resistenti alla terapia.
Esempio: tutte le cellule che portano la
mutazione L858R a livello di EGFR vengono uccise
e vanno in apoptosi, infatti scende il livello di
mutazioni a livello sanguigno, poi qualche mese
dopo si formano altri tipi di mutazioni, come
T790M, che sono resistenti al primo trattamento e
generano una recidiva che deve essere trattata con
altri farmaci.
La liquid biopsy è importante soprattutto nel
tumore al polmone in cui si fa fatica a pungere il
paziente mese dopo mese per capire come sta
andando il tumore perché si possono generare
problemi di emorragia interna. L’obiettivo della
liquid biopsy è quello di seguire il paziente in modo
333
Biochimica clinica
non invasivo; con un prelievo di sangue si vedono le mutazioni che avvengono a livello plasmatico, quali sono
le mutazioni che escono ogni 3 mesi da questo tumore e si valuta se danno resistenza o meno ai farmaci in
uso in modo da modulare la terapia.
B6.3.4 Liquid biopsy per la prevenzione primaria

Grazie alla liquid biopsy prendendo DNA dal sangue si può, ad esempio, analizzare tutto il DNA, la metilazione
del DNA di un certo numero di geni e stabilire se nel paziente è presente un tumore e quale. Con un prelievo
di sangue si estrae il DNA totale e con sodio bisolfito si può sequenziare un certo numero di geni per vedere
se questi pazienti sono positivi o no a determinati tumori.
Questo test (test Gray, sviluppato da Illumina) è sensibile verso molti tipi di tumori (screening multi-tumori):
ad esempio verso il tumore alla mammella, del
colon-retto, dell’esofago, del cavo orale, del
polmone; la maggior parte degli stadî 2 e 3 di
questi tumori possono essere identificati
semplicemente con un prelievo di sangue. Questo
test verrà presto reso disponibile a livello mondiale
come test di analisi precoce di tutti i tumori.
Nell’immagine a lato si nota la sensibilità di questo
test, che raggiunge livelli molto alti (98-99%),
soprattutto per quanto riguarda tumori al
polmone, principalmente negli stadî 2, 3 e 4 della
malattia; questa si abbassa nella fase 1 perché,
date le ridotte dimensioni della massa tumorale, è
meno probabile che in circolo sia presente ctDNA
e che quindi questo venga rilevato dalla biopsia
liquida, con una più alta probabilità di falsi negativi.
B6.3.5 Conclusioni
Attualmente, più di 60 prove con un accumulo previsto di più di 20.000 pazienti con 11 tipi di cancro, stanno
affrontando le sfide poste dalla biopsia liquida.
Limitazioni:
• standardizzazione della procedura di raccolta del sangue per migliorare la stabilità dei campioni a
temperatura ambiente;
• definizione dei metodi di quantificazione del ctDNA;
• standardizzazione dell'isolamento di ctDNA per migliorare la resa e migliorare la sensibilità del
rilevamento di ctDNA per rare alterazioni molecolari per anticipare la farmacoresistenza.
In conclusione, la prossima generazione nell’approccio alla biopsia liquida probabilmente fornirà una migliore
potenza diagnostica, ma la domanda rimane: i trattamenti guidati dalla biopsia liquida si tradurranno in
risultati migliori?
334
Biochimica clinica
APPENDICE: DOMANDE QUIZIZZ

(prof. Morandi)
1. I test biochimici sono svolti su tutto il corpo? No, i test biochimici possono essere svolti solo su
campioni di tessuto.
2. In quale fase solitamente occorrono errori nei test biochimici? La maggior parte degli errori avviene
nella fase pre-analitica.
3. Il siero e il plasma sono completamente identici dal punto di vista biochimico per essere utilizzati in
saggi differenti? Per molti – ma non per tutti – gli esami svolti col sangue, c’è una piccola differenza
se a essere utilizzato è il plasma e non il siero, e viceversa. Il plasma è preferibile per i test di biologia
molecolare.
4. Come si calcola il valore predittivo positivo? Veri positivi / (Veri positivi + Falsi positivi) x 100%
5. Quale strumento statistico può essere utilizzato per identificare la corretta soglia per discriminare
pazienti sani e malati in un saggio valutativo quantitativo? Curva ROC.
6. Cosa è la precisione in un test biochimico? Il grado di dispersione (come varianza, deviazione
standard o coefficiente di variazione) in una serie di misure dello stesso tipo effettuate in specifiche
condizioni.
7. Quale non è un’importante causa di variazioni individuali in un saggio biochimico? L’istruzione, ad
esempio.
8. Come si calcola la sensibilità? Veri positivi / (Veri positivi + Falsi negativi) x 100%
9. Come si calcola la specificità? Veri negativi / (Veri negativi + Falsi positivi) x 100%
10. Come si calcola il valore predittivo negativo? Veri negativi / (Veri negativi + Falsi negativi) x 100%
11. Qual è il concetto dell’Umbrella trial? Un tipo di cancro, differenti mutazioni genetiche, si testano
molteplici farmaci per la specifica mutazione.
12. Cosa è un companion diagnostic test? Identifica i pazienti che sembrano beneficiare di una
determinata terapia. Identifica i pazienti in cui aumenta il rischio di effetti collaterali in seguito a una
specifica terapia. Monitora la risposta al trattamento con un particolare prodotto terapeutico per
adeguare il trattamento al fine di migliorarne la sicurezza e gli effetti.
13. Cosa può valutare la FISH? Copy number variations, larghe delezioni, riarrangiamenti genici, ecc.
14. In quale condizione sono comuni le delezioni 1p, 19q? Oligodendroglioma.
15. Gli expression arrays possono essere informativi sulla prognosi del cancro al seno? Sì, è stato validato
recentemente.
16. Cosa può individuare l’ACGH? Delezioni e amplificazioni nel genoma d’interesse.
17. Cosa individuano i companion diagnostic test di Cetuximab? Le mutazioni di KRAS.
18. Cosa può individuare la real time-PCR allele specifica? Mutazioni in un singolo punto.
19. Qual è il limite del sequenziamento di Sanger? Il 20% degli alleli mutati.
20. Quale potrebbe essere il limite della real time-PCR allele specifica? Solitamente è stimato tra 0,1-1%.
21. Quanti geni codificanti ha l’essere umano? Circa 21000.
22. Cosa s’intende per epigenetica? È lo studio dei cambiamenti nella funzione dei geni che è ereditabile
e non comporta cambiamenti nella sequenza del DNA.
23. Possono le modificazioni epigenetiche essere influenzate dall’ambiente? Sì, l’ambiente e il
microambiente possono cambiare la struttura cromatinica, le modificazioni degl’istoni e la
metilazione del DNA.
24. La metilazione degli istoni è sempre correlata col silenziamento genico? No, la metilazione agl’istoni
su H3-K9 e H3-K27 è stata correlata al silenziamento, mentre la metilazione a H3-K4 e H3-K36 sono
segno di espressione genica.
25. Quale base è solitamente metilata? C che precede G (CpG).
26. Le isole CpG sono importanti nel silenziamento genico? È vero, ci sono specifiche CpG, solitamente a
livello del promotore, ma con alcune eccezioni, che hanno un ruolo chiave nel sopprimere
l’espressione genica.
335
Biochimica clinica
27. L’eterocromatina è sempre associata a uno stato inattivo dell’espressione genica? Sì, nelle regioni di
eterocromatina tutti i cinque strati dell’organizzazione cromatinica assicurano che i geni vicino a
queste caratteristiche stiano inattivi.
28. Le modificazioni istoniche sono dinamiche? Sì, gli istoni possono essere modificati da writers ed
erasers per adattare la cellula alle condizioni ambientali e queste modificazioni possono essere
interpretate da readers.
29. Le isole CpG a liovello del promotore controllano l’espressione genica? È vero, le isole CpG sono
regioni ricche di CpG ipermetilate in geni dow-regolati o silenziati, e ipometilate in geni espressi a
livello del promotore.
30. LINEs e SINEs sono elementi ripetuti nel genoma umano che sono ipermetilati a livello del DNA? È
vero, l’ipermetilazione di LINEs e SINEs sopprime il loro potenziale di trasposizione per evitare
instabilità genomica.
336
Buono studio!

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MEDICINA

UniBo, A.A. 2021/2022 – CdLM in Medicina e Chirurgia

P0. INTRODUZIONE ALLA PATOLOGIA CLINICA .................................................................................................................. 137

B1. I TEST DI LABORATORIO ................................................................................................................................................ 271

Possiate perdonarmi per eventuali sviste, errori o refusi.

M0. INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA CLINICA

M1. CONCETTI BASE DELLA MICROBIOLOGIA CLINICA

M1.1.1 Diversità del microbiota

La condizione di disbiosi intestinale fa sì che:

M1.3.1 Streptococcus pneumoniae

M1.3.2 Staphylococcus aureus

M1.3.3 Neisseria meningitidis

M1.3.5 Colonizzazione vagino-rettale da Streptococcus agalactiae (GBS)

M1.3.6 Colonizzazione da Candida spp

M1.3.7 Quando la colonizzazione ha bisogno di sorveglianza

Sorveglianza attiva CPE

M2. MICROBIOLOGIA DELLE INFEZIONI DELLE ALTE E BASSE VIE AEREE

M2.1.1 Vie di trasmissione

M2.1.2 Difese delle vie aeree

M2.1.3 Popolazione microbica residente

M2.1.4 Patogenesi delle infezioni delle vie respiratorie

M2.2 INFEZIONI DELLE ALTE VIE RESPIRATORIE

Classificazione clinica delle faringo-tonsilliti

Esempio di faringo-tonsillite pseudomembranosa da C. diphteriae (bacillo

M2.2.2 Otite media

M2.2.3 Infezioni rino-sinusali o sinusiti

Otiti medie e sinusiti da funghi filamentosi

Sinusiti: colpiscono soprattutto i pazienti immunocompromessi, indipendentemente dalla causa

M2.3 INFEZIONI DELLE BASSE VIE RESPIRATORIE

Gli agenti eziologici virali delle bronchioliti sono:

Nell’immagine a lato è visibile un

Specificità di un esame diagnostico à Si definisce specificità di un esame diagnostico la capacità di

Polmoniti acquisite in comunità (CAP)

Le caratteristiche epidemiologiche sono:

CAP nell’adulto: nell’adulto, gli agenti eziologici sono:

Polmoniti nosocomiali (HAP)

Principali piastre per semina di materiali biologici

L’immagine rappresenta una coltura di

• Se la carica batterica è >

Questo è un esempio di semina a dispersione, in quanto la

Diagnosi di tubercolosi latente

Test IGRA (Interferon Gamma Release Assay)

Test della tubercolina/intradermoreazione di Mantoux/PPD (Purified Protein Derivative)

Diagnosi di malattia tubercolare

È necessario sottolineare alcuni aspetti per concludere la trattazione della tubercolosi:

Il terreno selettivo per legionella si chiama

L’antigene urinario è un antigene proteico

Fondamentale il concetto dell’interazione tra le proteine spike e ACE2.

Sintomi e fattori di rischio

Altri dati utili

A settembre ci sono stati meno campioni sequenziati e si nota la

M2.4 INFEZIONI FUNGINE

M2.4.1 Aspergillosi – generalità

Questo grafico sulla sinistra

La curva a destra mostra invece il

M2.4.2 Aspergillosi polmonare invasiva

M2.4.3 Altre tipologie di aspergillosi

Dalla tabella possiamo

Criterî clinici à Sono fattori di tipo radiologico,

M2.4.6 Tecniche di diagnosi microbiologica

• Spettrometria di massa MALDI-TOF

• Test sierologici (GM)

M2.4.7 Terapia – farmaci antifungini