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Igiene lezione 6: Riproduzione del germe, crescita microbica

e
curva di crescita

Il germe per provocare una malattia deve potersi replicare e per farlo ha bisogno di
nutrienti da cui può ricavare energia affinché tutti i processi di biosintesi avvengano, e
quindi si accresce, iniziando così un processo di divisione cellulare. Tali nutrienti sono
ricavati sia da un substrato naturale (alimenti, organi e tessuti dell’ospite) che artificiale per
i terreni di coltura, ma la cosa fondamentale è che questi nutrienti devono essere disciolti
in un solvente acquoso, al fine di aumentare la diffusibilità e per trasportare dall’interno
della cellula all’esterno, le scorie che sono il prodotto del catabolismo cellulare. I principi
nutritivi sono rappresentati dal carbonio (100 parti), azoto (1 parte) e fosforo (10 parti). Il
tempo di riproduzione (10 minuti ad un massimo di 1 ora) varia a seconda della
disponibilità dei nutrienti, la quale a sua volta va a condizionare la velocità della cellula con
cui si divide in due cellule figlie. Il processo di divisione di una cellula prende il nome di
scissione binaria (ripr. asessuata): avvengono processi specifici in maniera tale che
dopo la duplicazione del materiale genetico si vengano a formare due cellule figlie
perfettamente identiche tra di loro; inizialmente il materiale genetico si trova in un punto
fisso, poi man mano la cellula si allunga, il DNA si duplica e i due genomi si ancorano in
due distinti punti, intanto si assiste ad un’invaginazione delle membrane e si forma il setto
che coinvolge la membrana cellulare, la membrana plasmatica e la parete cellulare, ed è
normalmente perpendicolare all’asse centrale della cellula. Importante è soprattutto
l’aspetto numero di tale divisione perché da una cellula se ne formano due, da due
quattro, da quattro otto e così via, e quindi si ottiene una moltiplicazione esponenziale;
ad esempio considerando che una cellula si divide ogni mezz’ora, dopo 10 ore, il che
equivale a 20 repliche, si ottengono ben 10 ⁶ cellule. Da qui si parla di:
CRESCITA MICROBICA -> abbiamo un numero N0 di cellule iniziali, ognuna delle quali si
riproduce in due cellule figlie (x 2) e questo processo si ripete un numero “n” di volte,

trovando così il numero finale di cellule Nf => si ha Nf = N0 x 2 .
Gli studiosi del tempo, pur non avendo a disposizione i mezzi, hanno capito l’importanza
dei nutrienti e la capacità dei batteri di crescere sui vari substrati, in modo tale da intuire la
relazione che intercorre tra il tempo e la loro moltiplicazione. Altrettanto importanti sono:
il numero di generazioni che matematicamente lo si può ricavare (dalla formula
precedente) tramite i logaritmi, ovvero logNf = logN0 + nlog2 => si esplicita n e si ottiene
che n = (logNf – logN0) /log2, che in effetti indica il numero di volte con cui una cellula si
è riprodotta e quindi il numero di generazioni ottenute; il tempo di generazione (G) è il
rapporto tra il tempo, espresso in minuti, e il numero di generazioni, quindi G= t/n . Esso
indica il tempo impiegato dalla cellula per moltiplicarsi, o meglio la durata della fase di
moltiplicazione di ogni generazione (es. voglio vedere in 6h quindi in 360 minuti,
ipotizzando di aver ottenuto 18 generazioni, quanto tempo ha impiegato per moltiplicarsi:
basta fare 360/18= 20 minuti); il tasso di crescita (T) rappresenta l’incremento del
numero di cellule per ore, quindi T= n/t(h). Ritornando al tempo di generazione, esso
equivale al tempo necessario affinchè da una cellula se ne generino due; dipende dalla
disponibilità dei nutrienti. Indicato con α il numero di generazioni per unità di tempo, il
numero di repliche sarà pari ad αt, per cui il numero di batteri al tempo t sarà dato da:
Nt = N0 x 2αt, dove αt rappresenta il numero di generazioni che si verifica in un
determinato tempo t; tale equazione è rappresentata da un grafico, ove sull’asse delle
ascisse è posto il tempo e sull’asse delle ordinate, il numero di cellule (-> grafico
esponenziale) o il log del numero di cellule (-> retta):
y al variare del tempo, aumenta il numero
di cellule all’interno della popolazione;
Logaritmo in base a ciò è stato possibile costruire
O.D. (densità ottica) la curva di crescita (-> cinetica
della
popolazione), la quale può essere
suddivisa in più fasi:
Aritmetica
x y
7 E
6 D F
Asse x: tempo (h) 5
4 C G
Asse y: log batteri vivi/ml 3
2 B H
1 A
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
x
La curva non parte da zero altrimenti le cellule sarebbero tutte morte;
A = FASE DI LATENZA -> nessun aumento della densità cellulare, in tale fase si assiste
solo ad un aumento della massa cellulare poiché il germe deve avere il tempo necessario
affinché sintetizzi gli enzimi per poter metabolizzare un determinato substrato;
B = FASE DI ACCELERAZIONE -> un piccolo numero di cellule inizia a duplicarsi;
C = FASE ESPONENZIALE -> massima velocità di crescita (simile ad una retta), e tutte le
cellule hanno a disposizione tutti gli enzimi, quindi tutti i nutrienti forniti dal substrato, e
ogni cellula si può moltiplicare;
D = FASE DI DECELERAZIONE -> i nutrienti cominciano a scarseggiare ed entrano in
gioco anche le scorie;
E = FASE STAZIONARIA -> anche definita plateau, qui le cellule che si riproducono sono
uguali alle cellule che cominciano ad andare incontro a morte;
F = FASE INIZIALE DI DECREMENTO -> i nutrienti diminuiscono, le cellule che muoiono
sono in numero maggiore rispetto a quelle che si formano;
G = FASE DI RAPIDO DECREMENTO -> i nutrienti mancano sempre di più, si assiste ad
una caduta del numero di cellule ed è completamente sovrapponibile alla fase
esponenziale;
H = FASE DI MORTE -> una parte delle cellule batteriche va incontro ad autolisi, gli
elementi morti non sono compensati da quelli nuovi e la morte della popolazione può
avvenire lentamente, richiedendo anche settimane.

Ritornando all’equazione di crescita, essa è strettamente dipendente dal numero di cellule


di partenza; è stata anche ricavata in altro modo: in un determinato lasso di tempo si ha
una variazione infinitesimale di cellule in una popolazione => usando i differenziali si parla
di integrali e attraverso una serie di passaggi si ottiene l’equazione; il numero di cellule è
direttamente proporzionale al numero di cellule iniziali secondo una funzione
esponenziale. Dietro all’elaborazione di quest’equazione, integrando le varie funzioni,
ossia una derivata (dN/dt= kN0), si ottiene: N = N0 x ekt, dove t è una variabile e k è una
costante di crescita, la quale caratterizza la velocità con la quale il germe è capace di
riprodursi, dunque ogni germe ha una propria “k”, e più è elevato maggiore è la velocità di
crescita. Quale categoria di germi, a questo punto, dovrebbe crescere più velocemente? I
gram negativi perché hanno una parete cellulare più sottile e di conseguenza hanno una
diffusibilità più elevata. È importante, per poter distinguere le varie classi di germi, riuscire
ad identificare k e come la si ricava? Si considera l’equazione precedente, da cui si ha:

Nt /N0 = ekt, entrano in gioco i logaritmi -> logNt /N0 = logekt => poiché loge=1, si ha che
Log (Nt /N0) = kt, da qui ricaviamo k = (logNt – logN0) /t.
Considerando l’uguaglianza logNt – logN0 = kt , essa somiglia all’equazione di una retta
( y= mx), ove “k”, paragonabile ad “m”, è il coefficiente angolare di quella retta (-
>pendenza) rappresentante la fase esponenziale di una curva di crescita. Se abbiamo a
che fare con due popolazioni di germi differenti, A e B, si riesce a capire quale delle due si
replica con maggiore velocità perché possiede un coefficiente angolare, k, più elevato e di
conseguenza è la popolazione più pericolosa, perciò bisogna trovare anche il modo di far
sì che la tale popolazione miri quantomeno a comportarsi come l’altra, nel senso che
occorre condizionarla. Alla fine questo è alla base dello scopo dell’igienista, ovvero
prevenire, salvaguardare la salute poiché in tali casi può modulare la velocità di
riproduzione di un determinato germe; ad esempio, si sa che i patogeni si sviluppano
soprattutto a temperature di 37 gradi, se un alimento si conserva ad una temperatura non
di 37 gradi ma più bassa, posso rallentare di molto la crescita dei germi su tale substrato e
quindi vado a condizionare il loro sviluppo. Per arrivare a fare tutte queste determinazioni,
le cellule in qualche modo devono essere contate, quindi bisogna quantizzarle, e spesso si
parla di conta microbica che può essere fisica (non ho idea con che tipo di cellule ho a
che fare, se sono vive o morte, e quindi vengono contati tutti gli elementi cellulari) o
biologica (sono considerati solo gli elementi cellulari capaci di riprodursi, quindi viventi).

CONTA FISICA: si effettua spesso tramite la camera


di Burker, che è un pezzo di vetro massiccio munito di
due canali, seguiti da altri due più piccoli ove va messo
il campione, e il tutto va a costituire la camera, la quale
ha un’area di 9 mm2 ed un volume di 1 mm3.

Tale camera va caricata con una quantità minima, si


parla di 10-20 µl, inoculando la sospensione cellulare nei canaletti; poiché la camera è
piccola, si diffonde tutto per capillarità; dopodiché viene poggiato un vetrino copraoggetto,
così l’intero materiale si è equamente distribuito. Quando si osserva al microscopio si vede
una fitta rete di piccole maglie, di quadrati,
precisamente 9 (un unico grande quadrato diviso in
nove quadrati, delimitati da linee più spesse);
l’intera area è di 9 mm2 per cui ciascun quadrato ha
un’area di 1 mm2; il volume, come detto prima, è di
1 mm3, di conseguenza le cellule le si contano in
uno di questi quadrati.

La metodica dice che bisogna contare almeno


4-5 di questi quadrati e per ognuno annotare il
numero di cellule che si sta contando.

Esercizio: supponiamo di aver contato cellule pari a


17, 13, 16, 14, 15; poi metto una sospensione (circa
20 µl) e voglio sapere quante cellule ci sono in tale
sospensione. A questo punto effettuo la media aritmetica: (17+13+16+14+15) /5 = 15, che
è il valore medio del numero di cellule presente in uno di questi quadrati; però so che quel
quadrato ha come area 1/25 di tutta l’area della camera, perciò per avere il numero di
cellule fino a questo punto occorre moltiplicare per 15 l’inverso dell’area del quadrato che
sto osservando, quindi 15 x 25= 375 cellule; invece, il volume di ciascun quadrato è 1/10
del totale, che è 1 mm3, dunque bisogna moltiplicare per 10 il valore trovato prima,
ottenendo il numero di cellule nell’intero volume (375x10); volendo esprimere il dato in
cm3(ml) si deve moltiplicare per 1000. Cosa però importante è tener conto del fattore di
diluizione; la formula finale è:
Nf = Nmedio x 1/fa x 10 x 103 x 1/dil
Nf -> numero finale di cellule;
Nmedio -> numero medio di cellule contate nei 4-5 quadrati;
fa -> 1/ area del quadrato che sto leggendo, questo perché cambia, non è sempre 1/25;
10 -> volume;
103 -> fattore di transizione da mm3 a cm3;
1/dil -> fattore di diluizione.
Quindi nell’esempio precedente, considerando che la diluizione sia 1: 100, il numero totale
di cellule è: Nf = 15 x 25 x 10 x 103 x 1/10-2 = 3.75 x 108.

Poiché questo tipo di conta non permette di distinguere cellule vive da quelle morte, si può
apportare una correzione, ossia colorare le cellule, ad esempio usando il blu di metilene
che ha la peculiarità di penetrare all’interno delle cellule aventi una struttura esterna
danneggiata, e cioè la cellula che è morta.
Altro tipo di conta fisica è rappresentata dai contatori elettronici -> Coulter: è un elettrodo
che viene immerso in una sospensione cellulare, e quando lo si accende succhia circa
1ml; esso è settatto in maniera tale che permette il passaggio di cellule aventi determinate
dimensioni e man mano che passano, viene interrotta la trasmissione del segnale elettrico
e c’è un sistema che registra ogni qualvolta che si ha l’interruzione, così da ottenere il
numero di cellule per ml.

CONTA BIOLOGICA: si contano le cellule realmente vive, quindi ciò che bisogna tener
conto per poterle contare, sono le cosiddette unità formanti colonie( UFC), partendo dal
presupposto che da ogni colonia il punto iniziale è una sola cellula, la quale si è
moltiplicata e così si è formata una colonia, visibile ad occhio nudo, almeno caratterizzata
da 106-107 cellule. Generalmente questo tipo di conta la si fa su un terreno solido dove la
cellula ha tutte le condizioni ottimali per crescere. Il conteggio delle UFC in piastra su
terreno solido, dipende dal numero iniziale di cellule, tant’è che se il numero di cellule è
piuttosto decente, né troppo grande né troppo piccolo, si fa un conteggio diretto altrimenti
esistono altri due diversi modi: o posso piastrare le cellule dopo averle diluite
(sospensione cellulare avente densità elevata) oppure posso concentrare attraverso le
MEMBRANE FILTRANTI (sospensione con densità più bassa).

Il principio è sempre lo stesso: c’è una beuta con un imbuto su cui viene adagiata una
membrana; queste membrane si comperano, sia da 0.45 µm il che significa che cellule più
piccole passano mentre quelle più grandi rimangono intrappolate, sia da 0.22 µm (più
usate in tale contesto). Dopo aver quindi messo la membrana sull’imbuto, si pone un
bicchiere sopra (c’è una pinza che la fa mantenere) e si versa la sospensione di cellule, il
tutto viene collegato ad una pompa da vuoto per cui risucchia il liquido e tutto ciò che ha
dimensioni più grandi di 0.22 µm rimane attaccata alla membrana, la quale viene prelevata
e la si mette su una capsula dove all’interno si trova il terreno solido, per diffusione i
nutrienti passeranno e si cominciano a sviluppare queste colonie; poi, avviene la conta di
tali colonie sulla membrana e quindi quante cellule vi sono. Pertanto nei laboratori,
soprattutto di microbiologia, si fa uso delle cosiddette rampe (più usate sono quelle a 3 e
a 7), ovvero dei sistemi messi in serie che, una volta attaccati alla pompa, risucchiano la
soluzione, ottenendo così le membrane.
SISTEMA MPN: è un altro metodo di conta delle cellule viventi che consente di
determinare il numero di cellule presenti in un terreno liquido; MPN sta per “Most Probable
Number”, quindi è una tecnica che dà un’idea del numero di cellule, dell’ordine di…(->
determinazione probabilistica); si sfrutta il “vedo non vedo” perché si basa sul considerare
i tubi, ove per tubo si intende la provetta, in cui si è sviluppata o meno crescita batterica, e
ciò è identificabile nel vedere se ho a che fare con un terreno torbido o no, poiché se il
terreno è torbido vuol dire che è avvenuta crescita batterica, viceversa se non lo è. Anche
alla base dell’MPN c’è il concetto delle diluizioni; supponiamo di avere un campione che lo
indichiamo con 100 (100=1) e che non ha subìto diluizioni, quindi si fanno una serie di
diluizioni seriali secondo un fattore dieci; lo scopo è quello di trovare il numero di cellule
più probabile presente in quel 100, e come si procede? Sempre osservando se c’è o meno
torbidità, ad esempio fino a 10-3 vi è torbidità, mentre da 10-4 in poi non c’è più torbidità; in
questo modo si può definire quella che è nota come diluizione limite, ossia 10-4, e
corrisponde alla più alta diluizione che dà ancora crescita batterica.
La tecnica ben precisa, però, si basa anche sul numero di repliche, ovvero occorre
determinare il cosiddetto NUMERO CARATTERISTICO, il quale consente di entrare in
delle specifiche tabelle (valori) e di conseguenza riuscire anche a capire il numero di
cellule presenti in 100 ml del campione di partenza. Generalmente le tabelle sono a 3, 5 o
a 10 numeri, dove quel 3, 5 e 10 sono le repliche che metto in essere di ciascuna
diluizione.
Esempio: abbiamo 3 repliche (per ogni diluizione allestisco tre repliche), dopodiché si
passa all’incubazione per 24-48h al fine di dare il tempo alle cellule di replicarsi; dopo aver
cacciato questi tubi, li comincio ad osservare e l’obiettivo è quello di trovare il numero
caratteristico grazie al quale posso entrare nella tabella. Tale numero, poiché in questo
caso lavoriamo con 3 tubi, è costituito da 3 cifre, di cui la prima corrisponde al numero più
elevato di tubi positivi che identificano la diluizione limite che è la diluizione più spinta in
corrispondenza della quale noto torbidità (nel nostro caso il numero è 3), le altre due cifre
rappresentano il numero di tubi positivi corrispondenti alle diluizioni successive (es. 2 e 0);
dunque il nostro numero caratteristico è 3, 2,0. Ora siamo entrati nella tabella con questo
numero ed il numero di cellule probabili in 100 ml di campione corrisponde a quello che in
statistica è la moda, ossia il valore che, ripetendo l’esperimento, si ripresenta più volte, è
quello più frequente. Accanto al valore modale vi sono i limiti fiduciali o range di
fluttuazione e quanto più stretto è tale range, più attendibile sarà il risultato; essi stanno
a significare che, ripetuto l’esperimento 100 volte, 95 volte il risultato è compreso in quel
determinato range. Il valore finale è espresso spesso per 100 ml, se lo si vuole in litri basta
moltiplicarlo per dieci, ma bisogna tener conto del fattore di diluizione, perché l’entrata in
queste tabelle si ha proprio considerando la diluizione limite trovata all’inizio (es. 10 -4), così
si arriva al numero più probabile di cellule presenti nella provetta di partenza; tra l’altro il
fattore di diluizione è quello che distingue perché possono anche esserci casi in cui i
numeri caratteristici sono uguali.