Igiene lezione 5: Andamento naturale delle infezioni.

Diffusione di una malattia in seno di una popolazione, alla base della

conoscenza è molto importante lo studio epidemiologico, che osserva
qual è il periodo di incubazione, come gli individui rispondono,
considerando la recettività dell’organismo o la sua refrattarietà ad un
determinato agente eziologico, quali sono le frequenze con cui le
malattie si presentano e le incidenze di una malattia nella popolazione.
Tutte queste informazioni vengono inserite in modelli matematici per
trarre determinate conclusioni, che servono per capire quali sono gli
interventi da fare affinchè una popolazione sana rimanga tale. Quando si
va a studiare una malattia, quindi, la cosa importante è determinare
quali sono i suoi punti deboli, la causa d’infezione e quindi l’insorgenza
della malattia, così che lo studioso riesce a suggerire i punti dove
intervenire per promuovere una tecnica di prevenzione. Es. l’OMS temeva
una grossa pandemia di SARS (sindrome acuta respiratoria severa, una
brutta polmonite), con i primi casi in Cina -> si notava una grossa
contagiosità, per cui si è temuto che da che era una epidemia locale,
potesse in breve tempo trasformarsi in un problema mondiale. Hanno
infatti sorvegliato tutte le persone che arrivavano da quei paesi negli
aeroporti e quei pochi malati sono stati messi in isolamento. Ciò è stato
possibile grazie allo studio che hanno fatto sulla contagiosità della
malattia nella popolazione, sui suoi metodi di diffusione e si è riuscito a
bloccare quella che potesse diventare un problema mondiale.

[La prevalenza: numero di casi in una determinata popolazione, un

rapporto dove al numeratore ci sono i casi che presentano quei sintomi,
mentre al denominatore l’intera popolazione. L’incidenza: non è riferita
alla totale popolazione, ma soltanto a quella a rischio, con quindi al
numeratore i nuovi casi e al denominatore c’è l’intera popolazione meno
quelli già malati -> solo quelli a rischio.]
La malattia all’interno di una popolazione si distribuisce in diversi modi:
1. SPORADICA: è una malattia che non si sa bene cosa ne condizioni
lo sviluppo, nè qual è il tempo o il territorio. Si presenta con
piccolissimi casi, non avendo appunto una regola nè temporale nè
spaziale, non è limitato nel tempo e nello spazio. (Es: le malattie non
contagiose, come il tetano, dove l’uomo non è sorgente e il serbatoio è
l’ambiente, oppure come la febbre gialla, perchè prevede l’entrata in
gioco di un determinato vettore che dalle nostre parti non c’è, nè
tanto meno l’agente eziologico -> se si dovesse quindi presentare un
caso di febbre gialla in Italia, costui è un individuo che è stato in
vacanza dalle parti in cui è possibile contrarre l’agente eziologico e
presenterà i sintomi)
2. ENDEMICA: è una malattia costantemente presente nel tempo, con
un numero non eccessivo di casi, ma sempre presenti. Limitata nello
 spazio, ma non nel tempo, in un determinato spazio è sempre
presente. (Esempio: la brucella, i colera, dove in un anno c’è un
numero costante di casi)
3. EPIDEMICA: è una malattia improvvisa, in cui in un determinato
arco di tempo e spazio, si presenta con un numero di nuovi casi molto
più elevato di quell’atteso -> PICCO EPIDEMICO. Fenomeno limitato nel
tempo e nello spazio. (Esempio: l’influenza)
4. PANDEMICA: è una malattia limitata nel tempo, ma non nello
spazio, interessa più paesi, in alcuni casi, anche il globo -> è
necessario che ci siano anche delle condizioni favorevoli, come gli
scambi commerciale oppure dal fatto che ci si sposta molto
facilmente e in tempi brevi e questo può favorire il trasferimento
dell’agente eziologico da una nazione all’altra e quindi essere alla
base di un fenomeno pandemico.

L’endemia è fortemente influenzata anche dalle condizioni climatiche,

per esempio ci sono infezioni respiratorie quali il raffreddore, faringiti,
sintomi influenzali che in una popolazione possono essere anche sempre
presenti in un numero basso di persone, non avendo quindi mai una
popolazione sempre perfettamente sana per questo tipo di malattia.
In quella che è una malattia endemica, si possono avere però anche dei
picchi epidemici->
Ciclo stagionale: esempio il raffreddore, in cui ci sono delle situazioni
nell’arco di un anno in cui ci sono dei picchi, degli incrementi notevoli di
nuovi casi, specialmente in periodi di basse temperature. In malattie
dove c’è un vettore invece i picchi corrispondono ai periodi caldi, estivi,
perchè le alte temperature favoriscono lo sviluppo degli insetti.
Ciclo poliannuale: propri delle malattie esantematiche (morbillo,
varicella, rosolia, in cui l’uomo è serbatoio e sorgente, per cui è difficile
che subiscano delle mutazioni) dove i picchi si manifestano ogni 3/4 anni,
dovuti al fatto che non tutte le persone vengono vaccinate, dopo che si è
accumulato un numero sufficiente di nuovi nati suscettibili.
L’epidemia si presenta con picchi sia nelle malattie costantemente
presenti, sia in una popolazione, che non è mai venuta a contatto con
determinati patogeni, come nei casi dei germi emergenti, tipico delle
nostre zone, dove nessun individuo è tutelato, neppure dal nostro
sistema immunitario non abituato -> facili picchi epidemici.
Il primo caso di un episodio epidemico prende il nome di CASO INDICE,
mentre i successivi, SECONDARI, e il periodo che intercorre tra il primo e
i successivi è detto INTERVALLO SERIALE. La diffusione delle malattie
epidemiche può essere lenta se la trasmissione è interumana,
progressiva in maniera repentina (malattie delle vie aeree) oppure
esplosiva quando ci sono più focolari differenti all’interno di una
popolazione e in questo caso entrano in gioco i veicoli (alimenti e acqua
contaminata).
Si possono avere picchi in epidemie a sorgente comune (grafico 1) in
popolazioni ristrette oppure picchi in epidemie a propagazione (malattie
esantematiche) dove abbiamo un picco con pochi casi che però hanno
contagiato nel periodo d’incubazione altri individui e quindi si ha un
picco epidemico più alto (grafico 2).

COME SI RIPRODUCONO I GERMI?

Quello che favorisce la malattia è ovviamente la moltiplicazione del
germe (virulenza e patogenicità molto elevata) -> deve raggiungere una
carica infettante. Questo fu scoperto dagli studiosi tanti anni fa,
capirono infatti che alla base dell’insorgenza della malattia c’è la
capacità replicativa del germe (germe: causa necessaria, ma non
sufficiente).
Un’altra importante intuizione è che era possibile coltivare questo
germe, una volta isolato, in laboratorio garantendogli tutte le sostanze
replicative, i nutrienti, di cui ha bisogno per trarne energia per crescere.
Sappiamo che se seguiamo una cultura batterica del tempo ci rendiamo
conto di come la crescita può variare, che esistono tanti fattori che
influenzano la curva di crescita batterica, i quali cambiano a seconda del
tipo di batteri -> serve agli igienisti per capire come controllare quella
popolazione batterica, come si può controllare la diffusione della
malattia infettiva. (La carne e il latte si conservano in frigo, perchè
contengono dei saprofiti, e a volte anche la possibilità di organismi
patogeni, e così si rallenta la loro attività metabolica, capacità
replicativa... informazioni ottenute grazie allo studio dei microbiologi nel
tempo)
Le cellule batteriche crescono attraverso dei nutrienti (principali
carbonio, azoto e fosforo), senza i quali appunto non si moltiplicano e
non crescono. Gli vengono forniti mediante l’acquisto di determinati
terreni, che vanno sotto il nome di terreni o mezzi di coltura (in un
terreno liquido si capisce la presenza del germe perchè diventa torbido).
Ci sono tanti condizioni da rispettare, come il nutrimento. All’inizio i
microbiologici non sapeva che i batteri avevano bisogno di C, N, P per cui
nutrivano i batter nel brodo di carne, che è ricco di questi componenti
(bollendo la carne nell’acqua fredda, perchè solo facendo così escono i
nutrienti, mentre l’acqua calda chiude tutti i nutrienti, rimangono
intrappolati nel pezzo di carne). Il germe richiede un quantitativo dei tre
principi nutritivi che deve rispettare una proporzione ben precisa =
100:10:1 (100 parti di carbonio, 10 di azoto e 1 di fosforo), se un terreno
di

coltura non rispetta questo rapporto il germe viene bloccato nella sua
crescita. Per esempio: si può utilizzare un terreno con una proporzione di
50:5:0,5 in cui il germe cresce bene perchè ogni elemento è presente in
un rapporto giusto rispetto all’altro, se invece si ha un terreno dove le
componenti essenziali non sono presenti in un rapporto giusto, come
50:5:1 il fosforo diventa il fattore limitante, cioè è troppo rispetto agli
altri e questo va a condizionare lo sviluppo del germe.
INOCULO: introduzione nella provetta una certa quantità di batteri. Di
solito il rapporto è: in 10 mL di terreno, 100 microL o max 500 microL di
una cultura batterica, della quale se ne può utilizzare così poca perchè
in laboratorio viene congelata con un numero di cellule molto elevato (1
mL contiene 10^4 o 10^5 cellule) per cui è sufficiente prendere anche
una parte piccolissima, per essere sicuri che in un arco di tempo si viene
ad avere una giusta torbidità.
Tutte queste operazione vanno fatte ovviamente in condizioni di sterilità,
per poter anche isolare il solo germe voluto.

Terreno liquido: terreno che sicuramente non solidificherà mai, in cui ci

sono i nutrienti, cmq limitati, infatti se non si rinnova la coltura, i germi
moriranno venendo meno i nutrienti. E’ un terreno che per la conta delle
cellule non è molto utile, nè pratico -> si può determinare, più che la
quantità di cellule, quanta massa cellulare c’è grazie la densità ottica.
Con le capsule pelvi, invece, si ha un terreno solido, dovuto all’aggiunta
di Agar, polimero estratto da alghe che ha la funzione di gelificare, con
una proporzione ben precisa (1,5-2% , ovvero 2 g di agar in 100 mL di
brodo), solidifica a temperatura minore di 40°C, mentre è liquido a temp.
superiore a 50-60°C. Questa temp. è molto favorevole perchè intorno ai
50°C il germe riesce ancora a non soccombere, se ovviamente il contatto
è per breve tempo, o se è psicrofilo -> ciò, negli esperimenti di
laboratorio, permette di poter analizzare terreni solidi dove, all’interno
della capsula, è possibile avere una certa quantità di cell batteriche di
un campione di acqua.
Il terreno solido dà tanti vantaggi, in quanto ha una consistenza giusta
che permette di manipolarlo con facilità, con un’ansa, con una spatolina,
non è nè troppo molle nè rigido, altrimenti i nutrienti non passerebbero
mai nel germe e questo non avrebbe mai l’energia per potersi
moltiplicare. Inoltre le maglie del terreno sono tali che se si immette 1
mL di acqua di pozzo, senza fare diluizioni (un’acqua difficilmente
contaminata da una flora di germi a trasmissione oro-fecale, per cui no
diluizioni) -> 1 mL dell’acqua nella capsula vuota. Dopo, il terreno ancora
liquido, viene mosso delicatamente in direzione diverse, per far sì che
quell’1 mL, che contiene un tot numero di cellule sia completamente
inglobato all’interno del terreno -> PIASTRAMENTO PER INCLUSIONE =
l’1 mL è incluso nel terreno, che infatti ha delle maglie che permettono
l’inclusione anche dei nutrienti che vengono assorbiti dall’agente.
Il terreno è anche umido, ovvero preparato con acqua, solvente
universale (terreno in polvere, quindi per 500 mL servono 5 g...se
servono 100 mL si prende 1 g) l’acqua serve a far sì che i nutrienti
vengano solubilizzati, l’umidità infatti permette la diffusione dei nutrienti
e in più assorbe anche le scorie che la cellula produce in seguito al suo
metabolismo.
La sterilizzazione è fondamentale: il metodo più utilizzato in laboratorio è
l’autoclave, lo strumento che sfrutta il calore umido.
Il piastramento ci dà tantissimi vantaggi: questo tipo di piastra permette
di riuscire ad ottenere una coltura PURA, ovvero una cultura dove si ha
la certezza che hai a che fare con una sola specie di germe. I terreni
solidi ci permettono di lavorare fino ad ottenere colture pure, infatti non
è detto che tutti i campioni siano perfettamente puri (es. in un campione
d’acqua che si mette in termostato, ovvero in condizioni ottimali di
crescita del germe, 35-36°C, non è detto che si avrà un solo germe, ma si
avranno tantissimi germi diversi. Se infatti si va a strisciare su questo
campione si formeranno tante diverse colonie). Un altro vantaggio del
terreno solido è il fatto che si riescono a differenziare i germi, perchè
facendo lo strisciamento, si trovano tante colonie che già ad occhio nudo
si capisce che sono diverse, con colori e margini diversi.
COLONIA: si vede come un puntino = una sola cellula ha cominciato a
moltiplicarsi, arrivando a 10^6-10^7 cellula e si riesce a vedere ad
occhio nudo.
=> Perché riusciamo ad ottenere una coltura pura? Perchè dalle tante
colonie nate, se ne può prendere con l’ansa una sola, che sicuramente
ha un’unica origine comune, ovvero una sola cellula che si è divisa e
perciò si è formata la colonia. Se si prende quella colonia e la si immette
in un terreno liquido, incubandola alle giuste condizioni, crescerà e
rifacendo lo striscio, si noterà che si avranno colonie tutte uguali,
possibilmente singole.
E’ importante negli accertamenti di malattie, dov’è necessaria
l’identificazione del germe e per face ciò si deve avere la certezza di
avere a che fare con un unico germe preciso, quello che si vuole
caratterizzare da un punto di vista biochimico e molecolare.
Col passare del tempo, nel terreno, lo strato si assottiglierà sempre di
più, perchè i nutrienti si riducono, assorbirti dai germi, fino a che si
seccherà, non avendo più energia per moltiplicarsi e il terreno è ormai
povero di nutrienti.

Un’altra differenza importante tra un terreno liquido e uno solido è anche

la velocità con la quale le cellule si moltiplicano. In linea di massima una
cell per moltiplicarsi impiega dalle 10 alle 60 min, in media intorno ai 20-
30 min per avere due cellule perfettamente identiche da una singola. Per
poter evidenziare facilmente una colonia si deve raggiungere 10^6-^7
cellule -> una piastra quando viene strisciata o viene usata per un test di
inclusione, deve essere incubata e per poter vedere le colonie passano
almeno 24 ore.
Nel caso di un terreno liquido la torbidità, che indica la presenza di
germi, dipende dalla quantità di inoculo che s’immette, se s’immettono
100 microL, che derivano da una coltura cellulare ad una densità molto
elevata, 100 microL conterranno un n° di cellule molto elevato. Se invece
la coltura cell. di partenza ha una densità più bassa, anche se si
introducono 100 microL (quindi alle stesse condizioni), la crescita sarà
più bassa, perchè ho messo un n°num di cellule minore -> in ogni caso la
torbidità per un inoculo più o meno proporzionato, si osserva dopo 48 ore
max.
Com’è formato un BRODO? Un brodo normale cotiene lo 0,5% di piptoni,
lo 0.3% di estratto di carne, NaCl per garantire l’isotonicità della cellula
e contiene un pH neutro. Il brodo normale può solidificare grazie
all’aggiunta di Agar. Questi sono i componenti di base, ma a seconda
delle diverse specie di germi che si mantengono in coltura, ci saranno
aggiunte non solo di fattori nutritivi, ma anche di crescita.

I terreni vengono classificati:

1. per composizione: NATURALI= sono terreni che vengono preparati
in laboratorio a partire da estratti di carne, da latte. SINTETICI= quelli
che realmente vengono utilizzati, sono commerciali e sono costituiti
da una componente di nutrienti ben precisa (es. per far crescere un
cocco servono delle componenti specifici e il terreno sintetico
altamente specifico per questo ceppo batterico è un terreno in cui
tutti i fattori di crescita e nutrimento sono contenuti in concentrazioni
ben precise, ovviamente la composizione C, N e P deve essere sempre
rispettata. Quindi ci sono terreni più o meno specifici, quest’ultimi
non hanno un problema nella crescita del germe, ma non sono
particolarmente precisi, da un punto di vista della composizione
chimica (hanno tutti i componenti, ma non in concentrazioni presise).
SEMISINTETICI.
2. per caratteristiche colturali: terreni ELETTIVI (o DI
ARRICCHIMENTO) = non limita e inibisce la crescita dei germi, ma
favorisce lo sviluppo di tutte le forme viventi, cerca di far venir fuori
anche quelle specie che si trovano in un particolare stato di stress, in
quantità più piccola, perchè in una popolazione eterogenea di germi si
avranno le condizioni che favoriscono di più lo sviluppo e quelle
invece che favoriscono di meno. Un terreno elettivo non uccide e
soccombe nulla, funziona per tutte le specie batteriche e ha una
composizione tale da garantire che anche la nicchia di germi presenti
in un n° più basso abbia la possibilità di moltiplicarsi. SELETTIVI =
terreno a cui già sono stati aggiunti delle sostanze batterio-statiche,
così da favorire una selezione. Lo scopo è quello di valutare la
presenza di una sola specie di germe, favorendo la sua riproduzione,
rallentando quella di altri. DIFFERENZIALI = discorso molto simile. Es.
acqua di pozzo, in cui c’è sicuramente la contaminazione di materiali
fecale e di sicuro c’è la presenza di E.Coli, ma essendo un saprofita,
non dice niente di più. Il problema sussiste se ci sono altri tipi di
germi, come gli eterococchi, patogeni che non ci devono essere,
infatti se ci sono, indicano che l’acqua è contaminata. Allora si mette
l’acqua a contatto con un terreno (l’acqua a meno che non c’è un’iper
carica di germi, è improbabile che nel giro di pochi giorni crei una
popolazione di colonie, a meno che la carica infettante dell’acqua non
sia ad un livello tale che riescono a moltiplicarsi velocemente). Per
cui non si faranno delle diluizioni, ma si farà uno striscio, utilizzando
un terreno differenziale, perchè quando si va a strisciare il campione
sulla piastra, contenente lattosio, che viene fermentato dagli
eterococchi, non dagli E.Coli, si va a variare il pH -> il terreno subirà
un viraggio di colore, così da indicare la presenza di E.Coli; se questo
non si verifica, vuol dire che ci saranno anche degli eterococchi. Si
vedrà che le colonie dell’E.coli avranno un colore giallino, mentre le
altre colonie assumeranno un colore biancastro. Sfruttiamo quindi due
 diverse caratteristiche del germe, utilizzando un terreno differenziale,
ricco di lattosio.
3. per stato fisico: LIQUIDI, SOLIDI e SEMISOLIDI

La SEMINA di un terreno: nel terreno liquido, con l’ansa si preleva la

colonia da un terreno solido e stemperarlo all’interno della provetta; nel
terreno solido -> striscio, spatolamento, inglobamento.
Lo scopo dello striscio è quello di avere una singola colonia, che
sappiamo, si è formata da una singola cellula. Per favorire la formazione
delle colonie si può fare lo “striscio a tre”.
E’ necessario anche affinchè il germe si possa moltiplicare, che ci siano
condizioni di incubazione (temperatura ottimale, presenza o meno di
ossigeno e di CO2).

DILUIZIONI: la cosa importante è il volume finale con cui si lavora e il

fatto di diluizione che si vuole applicare.
Es. diluizione 1:10 = volume finale 10, 1 parte del campione e 9 parti
devono essere di qualche altra cosa (soluzione fisiologica, acqua con
0,1% di NaCl, o acqua sterile). Diluizione 2:10 (1:5) , con 8 mL di
fisiologica e 2 mL di campione. Diluizione 1:4, 1 mL di campione e 3 di
fisiologica -> se non si hanno queste quantità di terreno, per mantenere
questi rapporti lavorando con i microL, cosa si fa? Si ha in totale 1 mL di
campione, ma se si vogliono fare delle repliche,ovvero ripetere
l’esperimento con altri terreni preparati freschi, bisogna conservarne
una parte, per cui si prendono 100 microL di campione e 300 microL di
fisiologica.
DILUIZIONI SERIALI: prima diluizione 1:10, per diluirla ancora, si prende
1mL dalla soluzione già diluita e metterla in un’altra contenente già 9
mL, facendo quindi un ulteriore diluizione 1:10, ma anche una diluizione
totale 1:100 -> Diluizione in serie secondo un fattore di 1:10.

1000 microL = 1 mL