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Lezione 15 | Immunologia | 03/05/2017

Docente: Sozzani
Revisore: Giuli

Tolleranza immunologica e autoimmunità

Introduzione
Affinché un linfocita T si attivi, il TCR deve riconoscere il peptide non-self ed epitopi polimorfi della molecola
MHC self (è quindi un doppio riconoscimento). Gli MHC hanno una specificità relativa per il peptide, ovvero
lo stesso MHC può alloggiare diverse decine di peptidi differenti, a patto che questi presentino caratteristiche
strutturali che permettano loro di rimanere ancorati nella tasca dell’MHC. Al di là di questo, è importante
sottolineare che le molecole MHC non distinguono il self dal non-self. Di conseguenza, tutto ciò che per
dimensioni e caratteristiche fisiche può essere ospitato nella tasca dell’MHC, viene effettivamente alloggiato
al suo interno. In condizioni normali, quindi in assenza di peptidi non-self, la maggioranza delle molecole
MHC presenti sulle nostre cellule ospita peptidi self. Proprio per questo, l’unico elemento in grado di
discriminare tra self e non self è il linfocita T, tramite il suo TCR.
Affinché il linfocita T si attivi, non basta l’interazione TCR-peptide-MHC, ma è necessario anche il
riconoscimento di molecole costimolatorie. Ad esempio, il linfocita T esprime in modo costitutivo molecole
costimolatorie, come CD28; tuttavia i suoi ligandi, B7.1 e B7.2 (detti anche CD80 e CD86), non sono espressi
costitutivamente dall’APC, ma solo dopo l’attivazione dell’APC stessa.
L’ultimo segnale necessario per l’attivazione del linfocita T, è la produzione di citochine, che istruiscono il
linfocita T, da parte dell’APC attivata.
Quindi, i segnali mediati dalle molecole costimolatorie e dalle citochine sono fondamentali per evitare
un’attivazione impropria e potenzialmente dannosa della risposta immunitaria, in presenza di APC che
esprimono sulla propria superficie complessi MHC con peptidi self. L’espressione di tali segnali, infatti,
dipende strettamente dall’attivazione dell’APC, che avviene in situazioni riconosciute come pericolose.

Tolleranza centrale
Nelle fasi terminali del processo di maturazione timica dei linfociti T, si riconoscono due momenti di
selezione: positiva e negativa. La selezione negativa ha il compito di eliminare tutti i cloni che reagiscono con
alta affinità contro antigeni self. Questo processo avviene quando il linfocita T è quasi maturo, quindi quando
esprime il TCR, è singolo positivo, esprime (fin dall’inizio) il complesso del CD3 e si è già testato che il TCR
possa riconoscere MHC self. La selezione negativa è quindi il modo principale per evitare che i cloni
autoreattivi vengano messi in circolo.
Esiste, tuttavia, una seconda possibilità: una piccola quota di cellule autoreattive non vengono eliminate, ma
vengono convertite in linfociti T regolatori (Treg), con azione inibitoria verso la risposta immunitaria.
Riassumendo, una cellula autoreattiva può: andare incontro a morte, diventare un linfocita T regolatore (se
è un CD4+) o, nel caso dei linfociti B, cambiare specificità del B cell receptor.
Questi meccanismi definiscono la strategia denominata tolleranza centrale, la quale tende a limitare
l’autoreattività ed avviene negli organi linfoidi primari.
Essendo il timo un organo chiuso e particolare, come è possibile che il test di autoreattività che avviene al
suo interno valga per tutte le proteine del nostro organismo? Una parziale risposta è data dall’esistenza del
gene AIRE (Auto Immune Regulator), un fattore trascrizionale attivato nelle cellule dell’epitelio timico e, in
misura minima, anche negli organi linfoidi secondari. Tale gene induce, a livello timico, la trascrizione di un
enorme numero di geni, compresi quelli che tipicamente sono specifici di un certo distretto. Di conseguenza,
il repertorio di proteine prodotte nel timo si arricchisce tanto da diventare effettivamente rappresentativo
per la maggior parte dei distretti corporei. Una mutazione del gene AIRE porta alla APS (sindrome
poliendocrina autoimmune), una severa sindrome autoimmune.

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Tolleranza periferica
Immunizzando un animale sano con una proteina self (ad esempio proteina basica della mielina, oppure
insulina) ed un adiuvante, l’animale genera una malattia autoimmune verso la proteina utilizzata per
immunizzarlo. Questo vuol dire che, nonostante la tolleranza centrale, un animale normale, così come
l’uomo, presenta in circolo delle cellule che riconoscono il self; tali cellule, se stimolate in condizioni
opportune, possono dar luogo ad una risposta contro il self.
Tuttavia, pur avendo in circolo delle cellule che hanno il potenziale di riconoscere antigeni self, nella maggior
parte dei soggetti non si sviluppano patologie autoimmuni. Questo significa che, poiché la tolleranza centrale
non basta, deve esistere un secondo meccanismo di regolazione, ovvero la tolleranza periferica.
Mentre la tolleranza centrale si attua negli organi linfoidi primari, la tolleranza periferica ha luogo negli organi
linfoidi secondari e consiste in una serie di strategie:
1. ignoranza immunologica, ovvero incapacità di risposta;
2. anergia, ovvero un’inattivazione funzionale dei linfociti;
3. delezione clonale;
4. linfociti T regolatori.

Ignoranza immunologica
Si basa su due criteri principali:
 Separazione fisica tra antigene e SI. Alcuni organi sono storicamente noti come santuari
immunologici, o organi privilegiati (cervello e testicolo), in quanto il sistema immunitario non riesce
ad entrarvi. Ad esempio, pur avendo in circolo cloni reattivi contro la proteina basica della mielina,
questi non riescono ad entrare nel cervello, dove si trova l’antigene. Tuttavia, in situazioni
patologiche, in cui la permeabilità della barriera ematoencefalica viene alterata, i linfociti T riescono
ad arrivare al cervello e si ha una reazione, con sviluppo di malattie neurodegenerative, come la
sclerosi multipla.
 Scarsa concentrazione dell’antigene. Un linfocita T non si attiva quando un singolo TCR riconosce
l’antigene, bensì quando un certo numero di TCR sulla stessa cellula vengono attivati
contemporaneamente. Infatti, è l’attivazione di più TCR a far sì che la cellula raggiunga uno stato di
attivazione che supera una certa soglia. Se tale soglia non viene superata, l’attivazione abortisce.
Quindi, antigeni espressi ad una concentrazione estremamene bassa non riescono a generare lo stato
di attivazione del linfocita T. Questo è ciò che avviene per molti tumori, i quali esprimono antigeni
tumorali, ma a livelli talmente bassi da non attivare la risposta del SI.

Anergia
Anche l’anergia è una mancata risposta contro gli antigeni, ma presenta caratteristiche completamente
diverse dall’ignoranza immunologica. Infatti, per anergia non si intende semplicemente la mancata
attivazione e risposta del linfocita T, ma anche l’inattivazione permanente del linfocita T che non risponde in
seguito al riconoscimento dell’antigene. In altre parole, il linfocita T che riconosce l’antigene in condizioni
anergiche, non solo non risponderà in quel dato momento, ma non potrà mai più rispondere. Questa è la
principale differenza tra anergia ed ignoranza.
Una situazione di anergia si instaura quando l’antigene viene riconosciuto in assenza delle molecole
costimolatorie. Se, in un secondo momento, la stessa cellula venisse stimolata in presenza di molecole
costimolatorie, allo stesso modo la cellula non si attiverebbe (è stata permanentemente inattivata).
Questo sistema risulta estremamente semplice, ma altrettanto geniale; infatti, come già detto, le molecole
costimolatorie vengono espresse sull’APC solo in seguito alla sua attivazione. Ciò significa che in condizioni
normali, quando non ci sono antigeni non-self disponibili e gli MHC accolgono peptidi self, le APC non
esprimono molecole costimolatorie. Se tali APC venissero riconosciute da linfociti T autoreattivi, questi non
solo non sarebbero attivati, ma sarebbero addirittura neutralizzati.
Si parla anche di tolleranza, intesa come un’attivazione imperfetta del linfocita T, ovvero in assenza di
molecole costimolatorie, che determina una disattivazione permanente.

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Esperimento in vivo nel topo: si osserva un linfonodo, evidenziando i linfociti T specifici per un determinato
antigene. Se l’animale viene immunizzato con tale antigene ed un adiuvante, si ha un’espansione clonale dei
linfociti T. Invece, se l’antigene viene somministrato in condizioni tollerogeniche (senza adiuvante), si osserva
una piccola espansione clonale, molto più limitata rispetto al precedente caso, che poi si riduce, in quanto i
linfociti T non diventano effettori e non si genera una risposta immunitaria.

Esiste un secondo caso in cui vengono indotti linfociti T


tollerogenici, il quale prevede l’intervento di molecole
che inibiscono l’attivazione dei linfociti T, come CTLA-4 e
PD-1.
CTLA-4 riconosce gli stessi ligandi di CD28 (B7.1 e B7.2),
mentre PD-1 ha dei propri ligandi, ovvero PD-L1 e PD-L2.
Questi due recettori, espressi dai linfociti T, quando
vengono ingaggiati mandano un segnale inibitorio. Se un
linfocita T riconosce l’antigene in presenza di queste
molecole, invece che delle molecole costimolatorie,
diventa anergico.
I linfociti T, in fasi tardive di attivazione, iniziano ad
esprimere CTLA-4, oltre a CD28. CTLA-4 lega gli stessi
ligandi di CD28, ma con una affinità maggiore. Questo
significa che se un linfocita T esprime sia CTLA-4 sia CD28, prevarrà l’effetto inibitorio di CTLA-4. Inoltre, CTLA-
4 instaura un legame così forte con B7.1 e B7.2, che quando CTLA-4 viene endocitato all’interno della cellula,
porta via dall’APC il proprio ligando. Di conseguenza, CTLA-4 priva l’APC di molecole costimolatorie, che
potrebbero essere ingaggiate da CD28; l’APC diventa tollerogenico. Riassumendo, il ruolo di CTLA-4 si svolge
su due livelli: l’invio di un segnale inibitorio e la sottrazione di molecole costimolatorie dall’APC.

CTLA-4 e PD-1, essendo entrambi recettori inibitori, svolgono funzioni simili, ma in momenti diversi della
risposta immunitaria. CTLA-4 è coinvolto nelle fasi relativamente iniziali dell’attivazione del SI ed è cruciale
nella funzione inibitoria dei linfociti T regolatori. PD-1, invece, entra in gioco in una fase più avanzata della
risposta immunitaria. Infatti, facendo un knockout di CTLA-4, si ottiene un fenotipo di patologie autoimmuni
che si sviluppano spontaneamente nettamente superiore ad un knockout di PD-1. Questo dipende dal fatto
che CTLA-4 ha un ruolo predominante in tutte le risposte. Ad esempio, CTLA-4 entra in gioco nel declino della
risposta immunologica: quando un antigene, che è stato riconosciuto, diminuisce, i cloni devono essere
eliminati, affinchè la risposta torni a condizioni omeostatiche.

Un linfocita T anergico presenta un TCR incapace di trasdurre in maniera adeguata il segnale di attivazione.
Probabilmente proprio per questo il linfocita T anergico non produce IL-2, il fattore di crescita del linfocita.
Inoltre, il linfocita T anergico esprime bassi livelli di TCR, rendendo più difficile il raggiungimento del livello
soglia di attivazione.

Le cellule dendritiche, che normalmente risiedono in tutti i tessuti (es. cellule di Langerhans nella pelle), in
assenza di condizioni reattive, di patologie, sono tollerizzate, in quanto non esprimono molecole
costimolatorie. Quello che Ralph Steinman, premio Nobel per la medicina, ha dimostrato è che in realtà una
frazione di cellule dendritiche migra costantemente ai linfonodi regionali, in assenza di attivazione. Anche
nei linfonodi, tali cellule non esprimono molecole costimolatorie, proprio per mantenere l’ambiente
tollerogenico, non reattivo. In questo modo, anche se dovessero arrivare piccole quantità di cloni autoreattivi
nel linfonodo, questi verrebbero disattivati.

Da un punto di vista terapeutico, sono di interesse sostanze (es. farmaci corticosteroidi) che inducono cellule
dendritiche tollerogeniche, ovvero con bassi livelli di espressione di B7.1 e B7.2, mentre stimolano
l’espressione di CTLA-4. Esistono anche molti studi in merito alla vitamina B3, che riesce a conferire il fenotipo
tollerogenico alle cellule dendritiche.

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Inoltre, molecole chimeriche in cui CTLA-4 viene coniugato con la porzione Fc delle immunoglobuline (per
aumentare l’emivita in circolo) sono in via di studio per il trattamento di patologie autoimmuni, come artrite
reumatoide giovanile, psoriasi, lupus e sclerosi multipla.
e PD-1 sono bersaglio di terapie oncologiche in quanto inibitori del checkpoint.

Delezione clonale
Il linfocita T che riconosce un antigene self in periferia (linfonodo) viene indotto a morire.
Normalmente, un linfocita T naive riconosce l’antigene sulla superficie dell’APC, in presenza di molecole
costimolatorie, quindi viene prodotta IL-2; questa agisce in modo autocrino, attivando il recettore per IL-2,
diventato ad alta affinità per l’espressione della catena CD25. Poi, inizia l’espansione clonale, mentre la
stimolazione da IL-2 agisce in favore dei geni anti-apoptotici. Quando invece avviene solo il riconoscimento
inziale ed il linfocita T diventa anergico, non aumenta la quota di geni anti-apoptotici. La prevalenza dei geni
pro-apoptotici determina nel giro di qualche giorno/settimana l’apoptosi della cellula. Di conseguenza, un
riconoscimento imperfetto di un antigene self determina l’anergia, ma anche la delezione clonale.
Esiste poi un secondo modo in cui il linfocita T può andare incontro a morte, ovvero attraverso recettori di
morte superficiali, come Fas. Fas appartiene alla famiglia dei TNF ed agisce come trimero. Tutte le cellule
esprimono Fas, ma solo alcune cellule, o in alcuni momenti di attivazione di alcune cellule, viene espresso
FasL (ligando di Fas). È proprio FasL a determinare l’ingaggio di Fas e l’inizio di segnali verso l’apoptosi. Un
linfocita T, nelle sue fasi tardive di attivazione, esprime il ligando di Fas, il quale può legare Fas sulla stessa
cellula, oppure legare Fas su altri linfociti T.
Entrambe le modalità di morte prevedono l’apoptosi, ma differiscono per la modalità con cui essa viene
attivata. Nel primo caso, si tratta di un’apoptosi intrinseca o passiva, detta anche deaht by neglect (morte da
deprivazione), che dipende strettamente dall’assenza di segnali di sopravvivenza. In questa situazione, si
osserva una maggior permeabilità delle membrane mitocondriali, seguita dal rilascio del citocromo C, che
lega una proteina adattatrice (ORF1), la quale attiva la caspasi-9. Questa caspasi inizia il processo di apoptosi,
attivando a cascata le caspasi effettrici. Nel caso di Fas, invece, l’apoptosi è indotta da un recettore di morte,
che nelle sue code citoplasmatiche presenta dei domini di morte (death domain). I domini di morte legano
delle proteine (FADD, Fas associated death domain) dotate di un dominio di morte, che inducono l’attivazione
delle caspasi.

Linfociti T regolatori
I linfociti T regolatori sono linfociti T che assumono la funzione di inibire altre risposte di linfociti T.
Come già detto, immunizzando un animale con un antigene self e adiuvante, si genera una risposta
autoimmune. Tuttavia, se la somministrazione dell’antigene non continua, tale risposta regredisce
spontaneamente. Se lo stesso esperimento venisse fatto su un animale a cui fossero stati tolti i linfociti T, la
risposta autoimmune non scomparirebbe. Da questo si deduce che, tra i linfociti T, esiste una popolazione in
grado di inibire la risposta degli altri linfociti. Tali linfociti iniziarono ad essere studiati negli anni ’80 e vennero
denominati linfociti T soppressori; solo successivamente, però, furono effettivamente caratterizzati, grazie
anche a nuovi strumenti tecnologici, e rinominati linfociti T regolatori.
I linfociti T regolatori sono dei linfociti T CD4+ (anche se ne esistono alcuni CD8+) e sono stati ben
caratterizzati in un modello animale, i topi NOD. Questi animali hanno spontaneamente sviluppato una
mutazione che li porta (in età adulta, circa 8-12 settimane) a sviluppare il diabete di tipo 1, perdendo in tal
modo le isole pancreatiche. Se a questi topi si inoculano dei linfociti T CD4+ prelevati da topi normali, il
diabete non si sviluppa. Questo dipende dalla presenza di cellule inibitorie che agiscono sulle cellule attivate
che distruggono le isole di Langerhans.
I linfociti Treg sono anche CD25+ (CD25 è la catena α del recettore per IL-2); questo significa che, a differenza
di un normale linfocita T, i Treg esprimono costitutivamente CD25 e sono sempre pronti a rispondere a IL-2,
anche a basse concentrazioni. Infatti, IL-2 rappresenta il fattore cruciale dell’esistenza dei linfociti T
regolatori. Addirittura, Abul Abbas sostiene che la produzione di IL-2 non serve ad attivare la risposta, bensì
ad espandere i Treg, che garantiranno che la risposta non sia eccessiva.
I linfociti T regolatori hanno una duplice funzione: inibire l’attivazione dei linfociti T naive ed inibire la
funzione dei linfociti T effettori.

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Ad essere cruciale per il differenziamento dei Treg è l’espressione di un fattore trascrizionale: FOXP3.
L’assenza totale o parziale di FOXP3, dovuta a mutazioni, generano una malattia autoimmune detta IPEX
(Immune dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-linked syndrome).
I linfociti T regolatori che si generano a livello del timo sono detti centrali, o innati, o naturali.
Esiste una seconda possibilità di generazione dei linfociti T regolatori, che non avviene nel timo, bensì a livello
degli organi linfoidi secondari. Questo si verifica quando il linfocita T viene attivato in condizioni non ottimali,
ovvero in assenza di molecole costimolatorie. In questo caso si parla di linfociti T regolatori periferici, o
adattativi.
Esiste una terza popolazione di linfociti T regolatori, detti Tr1 (o indotti), facilmente generati in vitro, ma
riconoscibili anche in vivo. Per far diventare un linfocita T un linfocita T regolatorio in vivo, bisogna metterlo
a bagno di grandi quantità di TGF- β e IL-2.
I linfociti T regolatori riescono a svolgere la loro azione inibitoria tramite due strategie:
- Contatto cellulare: è stato dimostrato che, in alcune condizioni, la capacità dei linfociti Treg di inibire
una risposta T dipende dal contatto tra le membrane del linfocita Treg e della cellula target. Questo
avviene perché il linfocita regolatorio esprime elevate quantità di CTLA-4, IL-10 e TGF- β.
- Produzione di citochine anti-infiammatorie.

L’importanza dei linfociti T regolatori si riflette anche in campo terapeutico, attraverso l’impiego di due
strategie:
1. Purificare T da un soggetto ed utilizzarli per generare grandi quantità di Treg, da reinfondere. Tuttavia
questo trattamento, data la sua complessità, viene poco utilizzato.
2. Espandere la popolazione di linfociti Treg in vivo, nel soggetto (es. somministrando vitamina B3).

Esistono molte altre cellule in grado di inibire, magari in modo più selezionato, le risposte immunitarie. Ad
esempio, i linfociti Th3 (esprimono citochine anti-infiammatorie), i linfociti T γ/δ, i linfociti Th2 (in certe
condizioni, inibiscono risposte Th1).
Di particolare importanza sono poi i linfociti B regolatori, che stanno assumendo un ruolo fondamentale nella
regolazione di malattie autoimmuni.

Linfociti B regolatori
Quanto detto in precedenza sui linfociti T, si applica anche ai linfociti B. Tuttavia, a livello della tolleranza
centrale, i linfociti B hanno un’opzione in più, ovvero riattivare l’espressione dei geni coinvolti nella
mutazione somatica e rifare un riarrangiamento somatico del recettore. In altre parole, un recettore che
riconosce il self viene cambiato, affinchè non lo riconosca più. Comunemente questo riarrangiamento
avviene a livello della catena leggera. Ricordiamo che la catena leggera degli anticorpi può essere k o λ:
inizialmente viene fatta k, riarrangiando il primo allele e, qualora il processo non andasse a buon fine,
riarrangiando il secondo allele; se anche il secondo tentativo non funzionasse, si passerebbe a λ, con modalità
analoga. Ovviamente, il recettore che si ottiene deve essere funzionante e non riconoscere il self. Sempre a
livello della tolleranza centrale, il riconoscimento dell’antigene self ad alta affinità induce delezione clonale,
mentre a bassa affinità determina anergia o la formazione di cloni di linfociti B regolatori.
A livello periferico è noto un processo detto di esclusione follicolare. Se un linfocita B riconosce il self in un
organo periferico, migra dal follicolo per trovare dialogo con un linfocita T; tuttavia, tale dialogo non avviene
in modo ottimale, poiché si tratta di antigeni self. Allora, il linfocita B, non trovando un segnale di
costimolazione importante, non acquisisce la capacità di ri-esprimere CXCR5 e viene escluso dal follicolo.

Autoimmunità
Fino ad ora, la tolleranza è stata inquadrata in un fenomeno protettivo, positivo. Tuttavia, si tratta di
meccanismi che possono anche risultare dannosi, poiché la tolleranza può instaurarsi verso cellule tumorali,
o infezioni virali. Invece, un malfunzionamento della tolleranza porta all’autoimmunità.

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Un difetto della tolleranza centrale (molto grave) può essere dovuto alla mutazione di MHC o del gene AIRE,
mentre un difetto di quella periferica è correlato ad un difetto genetico che coinvolge molecole inibitorie o
costimolatorie. Inoltre, si tratta di difetti che riguardano l’ignoranza o la generazione di Treg.
In assenza di difetti genetici, ci sono altri elementi di rottura della tolleranza (es. grave infezione). Ad esempio,
durante una forte risposta antivirale, una APC che presenta un antigene self può essere attivata dal microbo
ed esprimere molecole costimolatorie. In questa situazione, il peptide self verrà presentato in un contesto
adeguato di costimolazione, inducendo l’attivazione di linfociti autoreattivi.
Può anche verificarsi che la risposta contro un microbo instauri la capacità di rispondere contro antigeni
microbici molto simili ad antigeni self (mimetismo molecolare). Una volta debellata l’infezione, rimarranno
dei cloni che potranno riconoscere antigeni self. È il caso ad esempio delle miocarditi virali.
Esistono anche antigeni criptici che sono self, ma non vengono riconosciuti tali in quanto normalmente
nascosti dentro una proteina nella sua conformazione naturale.