Tipizzazione HLA mediante
sonde oligonucleotidiche
sequenza specifiche
(PCR-SSO)
Laboratorio di Immunologia Clinica e Tipizzazione
Tessutale
Reverse SSO: sistema Luminex
Strumento Luminex per l’acquisizione del
campione da una piastra a 96 pozzetti;
analizzatore a flusso per l’analisi del
campione, dotato di 2 lasers e 3
fotorilevatori.
PCR-SSO HLA
La tecnica PCR-SSO prevede l’uso di oligonucleotidi
sequenza-specifici (biglie) in grado di riconoscere
ed ibridarsi al segmento di DNA complementare alla
loro sequenza.
Reverse SSO: sistema Luminex
Alle microsfere di polistirene (5.6 micron di
diametro) sono adese sonde sequenza–
specifiche.
Ogni set di microsfere è coniugato con un
unico oligonucleotide che si legherà
all’amplificato
1 test = 100 colori = 100 set di biglie
100 distinti set di biglie diversamente colorate
sulla sfumatura del rosso che possono legare fino
a 100 differenti oligonucleotidi
100 distinti set di biglie possono legare fino a
100 differenti oligonucleotidi
DRB1*01
DRB1*04
Reverse SSO-Luminex HLA typing - Procedura
1. Amplificazione
3. Aggiunta
microsfere
8.
4. Ibridizzazione
Lettura
(20 min. a
60ºC)
6. Agg.
SAPE
Reverse SSO: sistema Luminex
Il laser reporter (verde) eccita le molecole
fluorescenti (sonda/DNA biotinilato) sulla
superficie delle microsfere;
Il laser di classificazione (rosso) eccita i
fluorocromi incorporati nelle microsfere.
Reverse SSO: sistema Luminex
L’acquisizione del campione avviene con frequenza
costante e a bassa velocità (1l/secondo).
Ciascuna microsfera è illuminata singolarmente dai
laser.
LUMINEX CORPORATION >>
Per il dettaglio dei passaggi
tecnici vedi file:
”HLA Luminex – procedura
operativa”
Durante l’acquisizione le biglie ci appaiono su questa
schermata :
Locus
DRB1
Reverse SSO-Luminex HLA typing
Il primo grafico indica il numero di eventi che
possiedono una certa fluorescenza.
Reverse SSO-Luminex HLA typing
Il secondo grafico rappresenta le zone all’interno
delle quali devono cadere i valori identificati,
incrociando i dati di due rilevatori.
Accorgimenti Luminex: SSO
La tipizzazione con il Luminex è un processo
molto sensibile alla temperatura, è quindi molto
importante osservare i tempi e le temperature
della metodica;
Le microsfere utilizzate sono sensibili alla luce e
devono essere protette dalle fonti luminose;
Per la massima durata del kit, evitare il ripetuto
scongelamento e ricongelamento dei reagenti;
procedere quindi allestendo delle aliquote.
PCR-Luminex
Vantaggi riscontrati
– Tempo di preparazione (30-35 min)
– Tempo della procedura manuale e di analisi (1h 15min - 1h 30
min)
– Possibilità di testare fino a 96 campioni contemporaneamente
– Rapidità di acquisizione
Svantaggi riscontrati
– Metodica manuale (al momento)
– Necessità di personale altamente formato sia
tecnico per l’esecuzione della metodica che
laureato per l’interpretazione dei risultati che
viene controllata per ogni paziente.
– Impossibilità di utilizzo per analisi individuali o
urgenti.
