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Microscopia a fluorescenza

Microscopia a fluorescenza
Microscopia ottica convenzionale
Il problema principale della
microscopia convenzionale in
trasmissione il contrasto
Normalmente le immagini vengono
prese in trasmissione, e quindi il
contrasto e` dato dal maggiore o
minore assorbimento di luce
Inoltre la luce proviene da diversi
piani del campione, creando disturbo
soprattutto se il campione non e`
sottile
Si ottengono proiezioni di diversi piani
ortogonali alla linea di propagazione
del fascio.
Microscopia a fluorescenza
Microscopia ottica convenzionale
Per aumentare il contrasto:
Prendere immagini fuori
dalla linea del fascio
incindente (dark field)
Usare luce polarizzata
Usare le differenti fasi della
luce proveniente da diversi
punti del campione (c)
Contrasto ad interferenza differenziale DIC (simile al contrasto di fase, ma
registra la velocita` di variazione del cammino ottico piu che la differenza di
cammino ottico)
Microscopia a fluorescenza
Il target prescelto (proteina da visualizzare)
viene marcato con una sonda fluorescente
Le sonde possono essere proteiche (GFP,
marcatura genetica), o specifiche molecole
fluorescenti (biologiche o non biologiche; in
questo caso la marcatura viene effettuata con
funzionalizzazione chimica del target)
Il target marcato viene inserito nel campione (ad
es cellule); il tipo di inserimento dipende dalla marcatura:
ad es nelle marcature con GFP le cellule esprimono
direttamente le proteine marcate; altrimenti va iniettato e
internalizzato in qualche maniera
La fluorescenza viene eccitata con laser e/o sorgenti
opportunamente filtrate e osservata con un microscopio
ottico e/o raccolta da una CCD
Microscopia a fluorescenza
Microscopia a fluorescenza
La risoluzione ha gli stessi limiti di quella ottica, ma rispetto ad un normale
microscopio ottico c un guadagno nellinformazione dovuto a due fattori
1. I target marcati localizzano solo in specifici settori cellulari, che quindi
vengono distinti dagli altri perch si colorano (contrasto)
2. possibile marcare con colori
diversi target diversi e poi
sovrapporre le immagini; in questo
modo si ha maggiore informazione
e si ottengono immagini pi nitide,
nella misura in cui una stessa
immagine a colori appare pi
nitida della sua versione in toni di
grigio
Cellula cancerosa durante la divisione
Le tre immagini sono ottenute con
diverse combinazioni di filtri in
eccitazione ed emissione e poi
sovrapposte. Blu=DNA,
rosso=microtubuli (tubulina), verde
proteina intercentromerica
Microscopia a fluorescenza
Microscopia confocale
La variante confocale della microscopia a fluorescenza fu introdotta per aumentare la
risoluzione in generale, e in particolare per discriminare le informazioni a seconda della
profondit, in modo tale da essere in grado di ricostruire immagini tridimensionali
Il fascio del laser viene allargato conicamente da una apertura a pinhole e focalizzato
con un obiettivo
La focalizzazione del fascio incidente
seleziona una specifica zona del
campione, dalla quale proverr il
segnale osservato
Il fascio di luce di fluorescenza viene
anchesso focalizzato e selezionato dal
pinhole; inoltre la geometria del setup
seleziona un particolare piano focale;
limmagine bidimensionale viene
costruita operando uno scanning del
fascio laser sul piano focale e
raccogliendo la luce proveniente dai vari
punti in un rivelatore (di solito un
fotomoltiplicatore); limmagine cos
costruita viene detta sezione ottica,
perch il segnale proviene solo da punti
sul piano focale
Microscopia a fluorescenza
Le singole sezioni ottiche sono pi nitide
rispetto ad analoghe immagini a
fluorescenza ottenute con il microscopio
convenzionale, perch viene eliminato il
segnale proveniente dalle regioni fuori
dal fuoco
Inoltre le varie
sezioni ottiche
possono essere
combinate al
calcolatore per
costruire immagini
tomografiche
Nucleo in fase di
duplicazione
Microscopia a fluorescenza
One photon vs two photons
Leffetto di selezione spaziale dovuto ad una
concentrazione del campo EM della
radiazione incidente nel punto focale; la
risposta in fluorescenza proporzionale
allintensit del campo incidente e quindi
proviene preferenzialmente dal punto focale
Leffetto di selezione spaziale dovuto alla
confocalit amplificato se leccitazione
avviene tramite processi a due fotoni: in quel
caso infatti la sezione durto di eccitazione
quadratica con lintensit del campo anzich
lineare e quindi in pratica quasi totalmente
soppressa fuori dal punto focale
Quindi la tecnica a due fotoni aumenta la
risoluzione, anche se abbassa lintensit
globale del segnale.
Per ovviare a questo problema si dovrebbe
aumentare lintensit della radiazione
incidente, che per danneggerebbe il
campione. Allora usa preferenzialmente un
laser impulsato, che, a parit di potenza
media assorbita, ha media quadratica della
potenza (e quindi sezione durto a due fotoni)
maggiore.
Microscopia a fluorescenza
TIRFm
Sempre allo scopo di ridurre la
regione da cui proviene il segnale
per ridurre il background e
migliorare la risoluzione, si pu
considerare una variante del
microscopio a fluorescenza che
funziona a riflessione totale
Una particolare geometria e la
presenza di mezzi ad opportuni
indici di rifrazione assicurano che
il raggio incidente (e quello di
risposta, la fluorescenza)
seguano un percorso a
riflessione totale
Siccome la riflessione totale pu
avvenire solo in una zona limitata
sotto la superficie (londa
evanescente) questo seleziona
la zona da cui proviene il segnale
1. Campione
2. Zona da cui proviene il segnale
3. Piatto di copertura
4. Olio di immersione
5. Obiettivo
6. Segnale emesso (fluorescenza)
7. Radiazione incidente
Microscopia a fluorescenza
Campo largo
Campo largo
con campione
sottile
TIRFM
In pratica la TIRFM da risultati simili alla microscopia a
campo largo su campione sottile, ma anche con campioni
non sottili
Microscopia a fluorescenza
Tecniche microscopiche
tradizionali e di microscopia a
fluorescenza sono spesso
accoppiate per dare immagini pi
definite/dettagliate/contrastate e
pi ricche di informazione
Microscopia a fluorescenza
(G)FP: proteine intrinsecamente
fluorescenti
! Possono essere fuse
geneticamente alla proteina da
marcare
! Si crea una linea di cellule o
organismi transgeginici che
esprimono direttamente la proteina
marcata anzich quella normale
! La fisiologia della cellula o
dellorganismo non viene
significativamente alterata, quindi
sono sonde ideali per losservazione
in vivo
Tipi di marker fluorescenti


GFP
protein
Proteina GFP
Microscopia a fluorescenza
Molecole organiche:
Molecole organiche con sistema elettronico
delocalizzato
Fluoresceina (o la sua variante istiocianato)
assorbe nellUV ed emette nel rosso con alta resa
quantica
Questi vengono associati chimicamente alle
molecole da marcare e poi internalizzati in qualche
modo nelle cellule, oppure utilizzati in tecniche
specifiche che non necessitano internalizzazione
Sono attualmente allo studio marcatori specifici
per le tecniche a due fotoni, che sono
generalmente molecole pi complesse con
strutture di risonanza diradicaliche, o strutture
dendrimeriche
Microscopia a fluorescenza
Quantum dots a semiconduttore
! Strutture sferiche a strati nano-cristallini di
semiconduttori (ZnSe, CdS, )
! La fluorescenza dovuta alla formazione di coppie
elettrone-buca (eccitoni)
! Le lunghezze donda di assorbimento-emissione sono
strettamente correlate con le dimensioni lineari del Qdot
! Vengono prodotti commercialmente gi funzionalizzati
con una biomolecola che lega specificamente a certi
target biologici (biotina-streptavidina; anticorpo-antigene
Microscopia a fluorescenza
Le (G)FP hanno
Fluorescenza meno stabile dei Qdots e propriet ottiche
meno controllabili
Vanno geneticamente fuse al target
MA
Sono assolutamente biocompatibili e il legame al target
forte
Le loro propriet fotodinamiche (la foto-cromicit e anche la
la foto-instabilit) possono essere utilizzate in specifiche
tecniche avanzate di microscopia di fluorescenza
Microscopia a fluorescenza
(G)FP tagging
Il gene della GFP
viene fuso a quello
di una proteina
prima della
sequenza di stop
La cellula produrr
proteine con GFP
come
prolungamento
Microscopia a fluorescenza
Localizzazione; multicolor labeling
Proteine diverse localizzano in diversi comparti
cellulari; scegliendo gli opportuni target si
possono visualizzare separatamente
Informazioni pi complete si ottengono sovrapponendo
le immagini di fluorescenza a quelle di normale
microscopia ottica
Microscopia a fluorescenza
Protein trafficking
Traslocazione di proteine dal citoplasma al nucleo
Microscopia a fluorescenza
Limite di singola molecola
In linea di principio sarebbe possibile anche raggiugere la risoluzione di
singola molecola (singola proteina, pochi nm), ma ci sono delle difficolt
pratiche
1. In soluzione le proteine si muovono, diffondono e quindi il segnale
mediato sullo spazio oltre che sul tempo
2. Il segnale di una singola proteina molto debole
Tuttavia, in certe condizioni questo limite
viene quasi raggiunto: le GFP vengono
intrappolate in un gel nanoporoso di
poliacrilammide; I pori sono dellordine
delle decine di nm-m e quindi possono
intrappolare (e tenere spazialmente
confinate) da alcune decine fino al limite
singole GFP idratate
In queste condizioni possibile osservare
fenomeni tipo il blinking che invece in
soluzione non si osservano perch
mediati sul tempo
Microscopia a fluorescenza
Colocalizzazione
Multicolor labeling, aumenta la risoluzione
+ =
Proteine marcate di colori differenti che co-
localizzano dano come output un terzo
colore, ad esempio verde+rosso=giallo
V
R
Microscopia a fluorescenza
Che significa la colocalizzazione di due proteine?
Si trovano solamente vicine oppure stanno interagendo
strettamente tra loro?
Esiste una tecnica specifica per osservare interazioni strette e
prolungate tra oggetti marcati:
Il FRET = Fluorescence resonant energy transfer
Microscopia a fluorescenza
FRET
FRET = Fluorescence resonant energy transfer
! Un cromoforo viene eccitato (Donore D)
! La fluorescenza non viene emessa, ma leccitazione
trasferita allaccettore (A)
! Laccettore emette
D
A
Il FRET si inquadra nella teoria di Frster del trasferimento di energia tra
eccitazioni di singoletto e si assume che il trasferimento avvenga tramite
linterazione di dipolo: nello schema classico, leccitazione di D descritta
come unoscillazione del dipolo elettrico di D; se A sufficientemente vicino,
sentir il campo di dipolo di D ed il suo dipolo entrer a sua volta in
oscillazione, e infine emetter secondo le regole dei dipoli oscillanti
Tradotto in termini quantistici la probabilit del trasferimento risonante di
eccitazione

!
V =
1
R
3

A
"
D
# 3(
A
"
!
R )(
D
"
!
R )
[ ]
D
D*
A
A*
!
k
T
" #
D
#
A*
V #
D*
#
A
2
In tutto ci si assume che D ed A abbiano la stessa energia di
eccitazione (risonanza)
Microscopia a fluorescenza
Se D ed A sono I marcatori di due
proteine differenti, il FRET avverr
solo se le due proteine
interagiscono in modo da
mantenere D ed A a distanza
ravvicinata e orientazione fissata
per un tempo sufficientemente
lungo
Il FRET dunque una condizione pi restrittiva della semplice
colocalizzazione, ed indica di solito una vera interazione di tipo associativo
tra proteine
Il FRET pu essere usato anche per
monitorare cambiamenti conformazionali tra
proteine
Microscopia a fluorescenza
Voltage-gated Kv2.1 potassium channels
Small ubiquitin-like modifier proteins (SUMOs)
SUMO and Kv2.1 are
shown to interact within
and outside channel
clusters at the neuronal
surface
Microscopia a fluorescenza
Microscopia a fluorescenza
FRET
FRET = Fluorescence resonant energy transfer
! Un cromoforo viene eccitato (Donore D)
! La fluorescenza non viene emessa, ma leccitazione
trasferita allaccettore (A)
! Laccettore emette
D
A
Il FRET si inquadra nella teoria di Frster del trasferimento di energia tra
eccitazioni di singoletto e si assume che il trasferimento avvenga tramite
linterazione di dipolo: nello schema classico, leccitazione di D descritta
come unoscillazione del dipolo elettrico di D; se A sufficientemente vicino,
sentir il campo di dipolo di D ed il suo dipolo entrer a sua volta in
oscillazione, e infine emetter secondo le regole dei dipoli oscillanti
Tradotto in termini quantistici la probabilit del trasferimento risonante di
eccitazione

!
V =
1
R
3

A
"
D
# 3(
A
"
!
R )(
D
"
!
R )
[ ]
D
D*
A
A*
!
k
T
" #
D
#
A*
V #
D*
#
A
2
In tutto ci si assume che D ed A abbiano la stessa energia di
eccitazione (risonanza)
Microscopia a fluorescenza
!
k
T
"
#
2
R
6
$
D

D
$
D*
2
$
A*

A
$
A
2
Inserendo tutti gli effetti dellorientazione relativa dei dipoli in una costante ! e
assumento che le funzioni donda di A e D siano separabili si ha
In questa formula, apparte gli effetti geometrici in ! e la dipendenza dalla
distanza derivante dallaccoppiamento di dipolo, entrano i momenti di dipolo tra
stati fondamentale ed eccitato di D ed A, ovvero le forze di oscillatore, che sono
esattamente le stesse quantit che determinano le ampiezze degli spettri di
assorbimento o fluorescenza, a meno di costanti moltiplicative come il
coefficiente di estinzione ", la resa quantica # e la vita media di fluorescenza $
!
k
T
"
#
2
R
6
$
D
%
D
&
A
'
4
Questa formula associa il rate di FRET con R e con altre quantit note o
misurabili, nellipotesi che D ed A abbiano la STESSA energia di emissione-
assorbimento
Microscopia a fluorescenza
Nella realt ci non accade mai, ma c una
parziale sovrapposizione tra lo spettro di
emissione di D e lo spettro di assorbimento
di A; tenendo in conto questo la formula
diventa
!
k
T
"
#
2
R
6
$
D
%
D
d&f
D
(&)
'
(
A
&
4
=
#
2
R
6
$
D
%
D
J
=
1
%
D
R
0
6
R
6
J = integrale di sovrapposizione
R
0
= raggio caratteristico di trasferimento (10-50 )
Efficienza di trasferimento: E=k
T
/(k
T
+1/$
D
)
!
E =
R
0
6
R
6
+ R
0
6
Quindi in linea di
principio il FRET un
sistema molto valido
non solo per
visualizzare linterazione
tra due proteine, ma
anche per valutarne la
distanza
Microscopia a fluorescenza Problema del Cross-Talk
Risolvibile studiando mutanti con
grande stokes shift
1. Ingegnerizzazione di mutanti specifici con
grande stokes shift
2. Utilizzo di altre propriet delle FP, come la
fotonvertibilit in schemi FRET
Ad esempio la mutante gialla
fotocromica EYQ1 fotoconverte in
maniera reversibile tra lo stato
fondamentale (anionico cis,
emittente a ~520nm) ad un neutro
trans (assorbente a ~400).
Quindi se viene usata come
accettore nel FRET evita il cross-
talk.
Tuttavia questo uso del FRET pi
complicato perch servono cicli di
fotoconversione ripetuti
Microscopia a fluorescenza
R
0
si pu valutare da misure di efficienza di FRET, ma contiene !, che
dipende dallorientazione relativa dei dipoli (va da 0 a 4); nelle misure
normali si media sullorientazione, e quindi si assume che !
2
~2/3
Questa assunzione la fonte principale di errore nella valutazione delle
distanze con FRET
Tuttavia in linea di principio sarebbe possibile,
mantenendo esplicito nella formula langolo tra i
dipoli oltre che la loro distanza, tentare una
valutazione di entrambi
Per questo necessario per lapporto di un
modello (CG?) che studi le possibili orientazioni
relative del complesso
D-Proteina-Proteina-A e simuli i risultati del
FRET
FRET: metodo potenzialmente molto accurato
per indagare la struttura, ma necessario
lapporto modellistico
R
%
Microscopia a fluorescenza Tecniche per la microscopia di
fluorescenza
Le (G)FP hanno molto difetti come marcatori, che si traducono
in scarsa fotostabilit rispetto alla fluorescenza stabile e
prolungata dei Qdots
1. La fluorescenza diminuisce esponenzialmente per
illuminaizione prolungata (photobleaching) e viene anche
mediamente diminuita da eventi di intermittenza
2. In alcuni mutanti pu essere riattivata
3. Alcune FP cambiano colore in risposta a certi stimoli
Tutte queste caratteristiche possono essere sfruttate in modo
da diventare potenziali strumenti per lanalisi della diffusione
di proteine allinterno della cellula
Microscopia a fluorescenza FRAP
Fluorescence Recovery After Photobleaching
Partendo da condizioni stazionarie, una parte della della cellula viene
completamente spenta tramite illuminazione intensa e prolungata
Si misura, nella stessa zona, il recupero di fluorescenza in funzione del tempo
Si ottengono generalmente due dati:
Il tempo di recupero, correlato al coefficiente di diffusione
la percentuale di recupero, correlata alla concentrazione di fluorofori
Microscopia a fluorescenza
Nellipotesi pi semplice di processo
dominato dalla diffusione e di spot
circolare, il recupero della
fluorescenza in funzione del tempo
vale
I
n
=funzioni di Bessel modificate
!
f (t) = e
"
r
2
2Dt
I
0
r
2
2Dt
#
$
%
&
'
(
+ I
1
r
2
2Dt
#
$
%
&
'
(
)
*
+
,
-
.
In generale per possono essere presenti altri processi importanti o dominanti
nel recupero della fluorescenza
Ad esempio, se le proteine per diffondere e ripopolare lo spot devono passare
attraverso membrane, oppure se si legano a strutture presenti nello spot
bleachato o intorno ad esso
Se i processi di legame sono dominanti su quello diffusivo, allora la dinamica di
recupero pi convenientemente descritta da
!
f (t) =1" Ae
"kt
dove k la costante di dissociazione del processo di
binding coinvolto e A la frazione di molecole legate
allequilibrio
Microscopia a fluorescenza
In generale sia diffusione in ambienti non uniformi che legami (magari pi di
uno) contribuiscono ed interagiscono in maniera complessa
In questo caso il calcolo diretto molto complesso e pu essere utile una
simulazione
Dinamica: browniana o MC
In rappresentazione particellare
o continua
Condizioni al contorno:
posizione e struttura di
membrane e altri ostacoli
interni estratte da dati
sperimentali
Ancora una volta, il supporto
della modellizzazione
risulta molto importante per
linterpretazione e la quantificazione
dei dati sperimentali
Endoplasmic reticulum
Microscopia a fluorescenza FLIP
Fluorescence loss in photobleaching
Simile al FRAP, ma la regione in cui si opera il photobleaching fuori dalla
regione di interesse, e si applicano ripetuti cicli, fino, eventualmente, a ridurre o
spegere la fluorescenza di tutta la cellula
Viene misurato il segnale di perdita di fluorescenza nella regione di interesse
per ricavare informazioni sulla diffusione da essa a quella bleachata
In aggiunta questo metodo non disturba la regione di interesse
Microscopia a fluorescenza
possibile ricavare ulteriore informazione dalla distanza tra la zona bleachata
e quella di misura: la velocit di perdita di fluorescenza dipende da questa
distanza
Microscopia a fluorescenza iFRAP
FRAP inverso:
Si spegne tramite photobleaching tutte unarea grande (al limite
tutta la cellula) tranne uno spot e poi si misura la diffusione fuori
da essa (o la perdita di fluorescenza allinterno)
Da informazioni pi dettagliate del FRAP perch segue
direttamente una popolazione localizzata di proteine
Proteine specifiche per ifrap, guardare nel PRIN.
Microscopia a fluorescenza
Alcune FP possono essere attivate (stato normale inattivo)
o riattivate dopo il bleaching
Normalmente lattivazione avviene per illuminazione
nellUV o ne blu
Esiste unaltra serie di tecniche specifiche basate su
questa propriet
Proteine fotoconvertibili:
Naturali: DROMPA
Mutanti della GFP: EYQ1
Microscopia a fluorescenza PA
Photo-Activation
Da informazioni simili
al iFRAP, ma ha il
vantaggio di poter pi
facilmente rivelare
popolazioni di
proteine veloci che
vengono
completamente
spente nella fase di
bleaching di iFRAP
Si misura la diminuzione di fluorescenza allinterno dellarea attivata, o il
recupero fuori da essa
Microscopia a fluorescenza
FRAP: due diverse mobilit (Rosso: 100% di molecole diffondono con D= 0.5 m
2
s
-1
;
Verde: 80% di molecole diffondono con D=0.2 m
2
s
-1
)
FLIP: popolazioni uniformi (verde) o misture di popolazioni con diverse mobilit (rosso)
i-FRAP, PA: Tempo di residenza in due diversi compartimenti (rosso 1, verde 2)
Confronto delle varie tecniche
Microscopia a fluorescenza
Le proteine vengono marcate con due differenti FP
Una delle due viene bleachata e laltra server per
seguire la diffusione delle proteine corrispondenti
Di solito viene utilizzato un
segnale differenza
piuttosto che il segnale
assoluto perch da
maggiore sensibilit
Le informazioni che si
possono ricavare sono simili
a quelle di PA e iFRAP
FLAP
Fluorescence localization after photobleaching
Segnale assoluto Segnale differenza
Microscopia a fluorescenza
Alcune GFP cambiano colore quando irradiate nellUV
Unarea pu essere fotoconvertita e la
dinamica di diffusione delle proteine
provenienti da essa pu essere
studiata attraverso i cambiamenti di
colore
Informazioni simili a PA
Tecniche basate sulla
fotoconversione (PC)
Microscopia a fluorescenza
Variazioni di colore nel tempo
Alcune varianti di DsRed gradualmente cambiano colore da verde a
rosso nel corso di alcune ore
Il rapporto relativo tra fluorescenza verde e rossa potrebbe essere usato
per acquisire dati temporali sullespressione genica
Microscopia a fluorescenza
Le tecniche (i)FRAP, FLIP, PA, PC si basano sul recupero (o la
perdita) di fluorescenza dovuta alla diffusione dei fluorofori (o
delle proteine ad essi associate) da una zona allaltra (o da un
compartimento allaltro) della cellula
& si applica il modello a compartimenti con cinetica del primo
ordine
Zona marcata
Zona bleachata
k
12

k
21

Microscopia a fluorescenza
!
dn
dt
= "Kn

!
n = (n
1
,!, n
N
)
vettore delle popolazioni dei compartimenti
K = k
ij
= matrice delle costanti cinetiche, = tassi di transizione tra
compartimento i e compartimento j, ed un input del modello, come il
coefficiente di diffusione per lequazione di diffusione normale
n
1
n
N
n
2

k
1N

k
N1

k
12

k
21
k
2N

k
N2


Questo tipo di dinamica la generalizzazione continua del modello a
compartimenti, largamente usato per descrivere la diffusione di particelle,
fluidi o altro tra compartimenti chiusi e collegati tra loro da cinetiche del
primo ordine
I compartimenti possono essere compartimenti cellulari (ad es nucleo-
citoplasma) oppure anche oggetti pi macroscopici, ad es, organi, tra i quali
si vuole studiare la diffusione di un farmaco, oppure anche stati di una
molecola, tra i quali si vogliono studiare le transizioni
Microscopia a fluorescenza
dn
1
/dt=k
11
n
1
+k
12
n
2
++k
1n
n
n
.
.
.
dn
n
/dt=k
n1
n
1
+k
n2
n
2
++k
nn
n
n
X
I
(t)=X
I,0
exp(-K
I
t)
La soluzione si trova diagonalizzando la matrice:
ciascun autostato X
I
evolver in forma
esponenziale semplice con tempo di decadimento
corrispondente allinverso dellautovalore K
I

Per avere landamento temporale dei singoli
comparti da confrontare con lesperimento, essi
andranno scritti come combinazione lineare degli
autostati
Da questo confronto si ottiene una stima
sperimentale delle costanti cinetiche k; esse
sono legate con il coefficiente di diffusione D, ma
il legame non ovvio: dipende da come sono
scelti i compartimenti, dalla loro forma, dalle
superfici che li separano: ad es, in un
esperimento di FRAP semplice i due comparti
sono zona bleachata e zona non bleachata, e
sono separti da una superficie virtuale, quindi la
costante dipende solo dalla geometria della zona
bleachata e da D; in questo caso il problema
diventa semplice e dipende da ununica costante
cinetica
Zona marcata
Zona bleachata
=k
12
=k k
21

dn
1
/dt=-kn
1
+kn
2

dn
2
/dt=kn
1
-kn
22

n
1

n
2

Microscopia a fluorescenza
Zona marcata
Zona bleachata
nucleo
k
32
,k
23

Nel caso generale la dinamica
influenzata dalla presenza di altri
compartimenti cellulari con una
propria dinamica (spesso non
simmetrica)
Reticolo
endoplasmatico
Ancora peggiore il caso in cui la
zona bleachata attraversa un altro
compartimento (ad esempio il
reticolo endoplasmatico); in quel
caso il calcolo con il modello a
compartimenti diventa molto
complesso ed pi conveniente
ricorrere direttamente ad una
simulazione
Microscopia a fluorescenza
Uso differente del modello a compartimenti:
I compartimenti possono essere qualsiasi cosa per cui si possa
definire una concentrazione oppure una popolazione che cambia
con una dinamica del primo ordine
Dinamica del primo ordine = processo per cui si definisce una
probabilit di transizione per unit di tempo = inverso del tasso
(rate) di transizione
Microscopia a fluorescenza
A
B
Due stati principali chiamati
A e B con cromoforo neutro
ed anionico
Stati delle GFP
Terzo stato intermedio I
con cromoforo anionico ma
struttura simile ad A
Microscopia a fluorescenza
ESPT=excited state proton transfer
GSPT=ground state proton transfer
NRC=non radiative conversion
GSST=ground state structural transition
ESST=excited state structural transition
EP=external protonation
Zoologia degli stati delle FP
A
I
B
ESPT
C
NRC
A
EP
Z
NRC
GSST
neutral
anionic
anionic
GSPT
ESST
GSST
Neutral (?) flickering
neutral trans (?)
Zwitterionic (?) blinking
NRC
NRC
anionic trans (?)
Bt
GSST
D
(?)
NRC
Microscopia a fluorescenza
Cinetica semplice a due stati
T203Y mutants: the state I coincide with B
Thermal equilibrium: no excitations are present, in normal conditions
only A and B are populated and transitions occur
on the ground states
A
B
neutral
anionic
kAB
kBA
dnA/dt= - nA kAB + nB kBA
dnB/dt= +nA kAB nB kBA

kAB=10
-3
ns
-1
kBA=10
-1
ns
-1

The final ratio of population is nA/nB=kBA/kAB=100
The time constant for the equilibrum to be reached is 1/(kAB+kBA)
Microscopia a fluorescenza
Analisi quantitativa del photo-switching
dnA/dt = -(KAB+kA) nA + kBA nB + kAt nAt
dnB/dt = +kAB nA kBA nB
dnAt/dt= +kA nA - kAt nAt
KAB=kAB+kA*B* (def)
A
B
neutral
anionic
kAB
kBA
C=At
kA*B*
kA
kAt
neutral trans
Photobleaching:
excitation on A ' kA*B*>kBA,kAB
kA>kAt
Re-Activation
Excitation on C ' kA*B*<<kAB
kAt>kA
Nel fenomeno del photoswitching si osserva che per illuminazione prolungata
dello stato normale la proteina si spenge
Si pu per riattivare illuminandola nellUV; lo schema pi semplice a tre stati
Si assume che le transizioni verticali
(fluorescenza ed eccitazione) avvengano
istantaneamente; in caso contrario il loro
effetto sar implicitamente contenuto nelle
costanti KAB, KA e KAt
Microscopia a fluorescenza
Excitation on A Stop excitation Excitation on At Stop excitation
Photobleaching
Re-ativation
Microscopia a fluorescenza
Esperimento reale
T=0h T=15h@476nm
A
C
abs (t=8h)-abs (t=0)
C
A
B
B
Andamento delle popolazioni degli stati A,
B,C in soluzione (diffusione pura, senza
problemi aggiuntivi dovuti a barriere etc)
Dal fit delle costanti cinetiche si ottengono
stime dei tempi di transizione tra gli stati
Queste, accoppiate a modellizzazione,
possono dare indicazioni sulla natura
degli stati dark o di struttura ignota
Microscopia a fluorescenza
In un esperimento di PA, FRAP, gli effetti della dinamica
complessa della diffusione si mescolano con quelli della dinamica
intrinseca della fluorescenza nel dare landamento temporale della
fluorescenza
Dunque le due cose andrebbero combinate nel confronto con
lesperimento
I calcoli possono essere molto complessi, ma per fortuna nella
maggior parte dei casi (ma non sempre) si possono fare ipotesi
semplificatrici e trascurare luno o laltro degli effetti
Microscopia a fluorescenza FISH
Fluorescence in situ hybridization
DNA probe DNA to be analyzed
Fluorescent labeling denaturation
Hybridization
Una sequenza, corta ma significativa, di DNA viene preparata come sonda
Sequenze di questo tipo (pezzi significativi di geni) sono gi esistenti in molti database,
precendentemente studiate in connessione con la mappatura del genoma umano
La sequenza viene poi etichettata con una molecola fluorescente (di solito di tipo
organico, ad es fluoresceina)
Quando la sonda viene mescolata al DNA in fase di duplicazione, si legher
specificamente alle sequenze complementari
Microscopia a fluorescenza
! La denaturazione del DNA locale
! FISH identifica la posizione di un gene
! usato anche per identificare specifici
mRNA e quindi monitorare spazio-temporalmente
lespressione di specifici geni
! Esiste la versione lab on a chip in cui il DNA
viene incanalato verso le sonde tramite una rete di microcanali, con
guadagno di tempo per laumentata concentrazione di sonde e DNA
! Varianti
" Per aumentare la risoluzione in posizione
possibile fare FISH su fibre di DNA
allungato e fissato
" Uso di sonde di lunghezza diversa
" Uso di sonde con label di diversi colori
Microscopia a fluorescenza DNA microarray
Come il FISH, sfruttano libridizzazione del DNA con sonde specifiche, ma al
contrario
Le sonde sono fissate su delle matrici (plastica, vetro, silicio) e identificate
dalla loro posizione
Il DNA da studiare marcato ed identificato dal colore
Questo tipo di lab on a chip molto usato per lanalisi del DNA e anche
dellmRNA che viene di solito prima convertito in cDNA
Microscopia a fluorescenza FLIM
Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
! Viene prodotta unimmagine basata sulla differenza nel decadimento
esponenziale della fluorescenza proveniente dai diversi punti del
campione
! Il contrasto basato sul cambiamento della vita media di fluorescenza
! Questa uguale per tutte le molecole dello stesso tipo, quindi il
segnale indipendente dalla concentrazione
! Per dipende da fattori ambientali come forza ionica, concentrazione
di ossigeno, idrofobicit, interazioni tra il fluoroforo e altre molecole,
specialmente se queste danno vita a FRET
! Quindi il FLIM d informazioni importanti sullambiente cellulare da cui
proviene il segnale
! In un certo senso lanalogo delle immagini NMR basate sulla misura
dei tempi di ritorno del magnetismo
! Il FLIM proprio un caso in cui gli effetti di diffusione e di dinamica
intrinseca di fluorescenza non solo vanno tenuti in conto, ma sono
proprio utilizzati per estrarre informazioni
Microscopia a fluorescenza
Due modalit di misura: nel dominio temporale e nel dominio delle frequenze
Si manda un segnale impulsato
e si misura direttamente il tempo
di decadimento
Si manda un segnale modulato e si
misura lo sfasamento e la variazione di
ampiezza dellonda di risposta
!~0.37 F
0
!~"
-1
tan(#$)

Microscopia a fluorescenza
Sezione di vena
Cellula tumorale
Il FLIM pu venire accoppiato con il FRET, perch il passaggio
risonante di fluorescenza ovviamente diminuisce il tempo di vita
di fluorescenza del donore
Microscopia a fluorescenza
PALM
Esiste il modo di superare il limite di diffrazione?
Ovviamente non direttamente, ma alcune tecniche possono
aiutare a scendere verso il limite di singola molecola
fluorescente
Poich le GFP hanno dimensioni nanometriche, se si riesce a
distinguere il segnale proveniente
dalle singole GFP, in linea di
principio possibile scendere a
livelli di risoluzione nanometrica
(o decine di nm), ovvero sotto il
limite di diffrazione
Microscopia a fluorescenza
Point Spread Function
In generale, limmagine di un oggetto puntiforme passando
attraverso il sistema di specchi e lenti del microscopio viene
trasformato in una figura di diffrazione detta Point Spread
Function psf(r); la PSF in generale molto complessa, e la sua
larghezza
determina il limite
di risoluzione:
due oggetti si
possono
distinguere se e
solo se sono pi
lontani della
larghezza della
PSF
Microscopia a fluorescenza
Tuttavia, in linea di principio possibile localizzare un oggetto isolato pi
precisamente della larghezza della PSF deconvolvendo il segnale in uscita
con la PSF stessa
!
I(R) = psf (
"
R# R' )O(R' )dR'
dove R la coordinata sul piano dellimmagine (tenuto conto
dellingrandimento), I limmagine registrata dal microscopio e O
lintensit proveniente dalloggetto nel piano focale
O(r)
I(r) psf(r)
convoluzione
deconvoluzione
Le stime della psf sono difficili, di solito meglio fittarla sui dati sperimentali
Microscopia a fluorescenza
! Nella tecnica PALM Photoactivated
localization microscopy si marcano i target con
proteine fotoattivabili
! queste vengono fotoattivate a bassa intensit
cosicch se ne accendono poche alla volta
! la loro posizione viene localizzata con tecniche
di deconvoluzione; ripetendo la procedura molte
volte possibile avere una mappatura completa
ad alta risoluzione delle zone dove i marcatori
sono localizzati
! La tecnica pu essere accoppiata alla
microscopia confocale o TIRF per ottenere anche
risoluzione verticale
! La risoluzione (= capacit di distinguere due
oggetti vicini) di decine di nm, sotto il limite di
risoluzione ottica pura
! In un qualche senso anche il FRET va sotto il
limite di risoluzione perch in linea di principio
permette di misurare distanze di decine di nm
TIRF
PALM
microtubuli
Microscopia a fluorescenza FCS
Fluorescence Correlation Spectroscopy
Analisi della funzione di correlazione temporale del segnale di fluorescenza
Il segnale viene registrato con un apparato del tutto simile al microscopio a
fluorescenza confocale, anche se la risoluzione spaziale in uscita non ha
importanza: una tecnica di spettroscopia, non di microscopia
Microscopia a fluorescenza
!
G(") =
#F(t + ")#F(t)
F(t)
2
=
F(t + ")F(t)
F(t)
2
$1
Funzione di (auto)correlazione temporale delle fluttuazioni di fluorescenza
La fluorescenza fluttua per vari motivi
1. Perch le particelle entrano ed escono dal volume attivo (volume in cui la
fluorescenza viene eccitata)
2. Perch la molecola osservata varia in natura (subisce reazioni chimiche)
3. Perch la fluorescenza intrinseca varia, o a causa di variazioni nella
sezione durto di assorbimento, oppure a causa di variazioni di resa
quantica, dovute allambiente o intrinseche
& dallanalisi delle fluttuazioni uno pu ricavare informazioni sulla mobilit e
concentrazione dei fluorofori e sulle sue propriet intrinseche di
fluorescenza
A differenza del solito, in questo tipo di esperimenti uno interessato ad
amplificare le fluttuazioni della fluorescenza (che invece negli esperimenti
usuali di fluorescenza producono rumore, e quindi vanno depresse)
<> = media temporale
Microscopia a fluorescenza
La fluttuazione relativa del numero di molecole allinterno del volume
attivo va come 1/(N (distribuzione di Poisson), quindi per aumentarle
bisogna mantenere N molto basso
! Concentrazioni bassissime di fluorofori (nano - micromolari)
! Volume attivo pi piccolo possibile, focalizzazione estrema
(~femtolitro)
! Possibilmente uso della spettroscopia a due fotoni
! La riduzione della
concentrazione e
del volume di
osservazione
inducono
losservazione di
poche molecole per
volta e quindi
equivalgono in
qualche modo a
scendere al limite di
singola molecola
Microscopia a fluorescenza
Considerando le cause che determinano le fluttuazioni della fluorescenza si
pu scrivere:
!
"F = W (r)"#
V
eff
$
"C(r, t)dV
Volume efficace di eccitazione
da stimare, dipendente dal
setup sperimentale
!
W (r) = S(r)
I(r)
I
0
Distribuzione spaziale della
luce emessa = combinazione
della distribuzione spaziale
della radiazione incidente
responsabile delleccitazione
(normalizzata) e
dellemissione
!
" = I
0
#$%
n. medio di fotoni emessi per
secondo per molecola, combinazione
di intensit della radiazione incidente,
efficienza di rivelazione, sezione durto
dassorbimento e resa quantica
Concentrazione locale
Microscopia a fluorescenza
La funzione di correlazione pu essere calcolata analiticamente in alcuni casi
particolari
Assumendo ad esempio che ) sia costante nel tempo, si ottiene una forma
per la funzione di autocorrelazione dovuta solamente alle fluttuazioni di
concentrazione; assumendo ancora che il moto sia browniano
!
G(") =
1
V
eff
C
1
1+
"
"
D
1
1+
r
0
z
0
#
$
%
&
'
(
2
"
"
D
r
0
e z
0
derivano dallassunzione di forma
gaussiana che si fa per la fuzione W(r) e
corrispondono alle larghezze della
distribuzione nel piano focale e lungo lasse
verticale; si determinano, come il volume
efficace, da misure di calibrazione
$
D
=r
0
2
/4D
tempo di residenza
laterale
deriva dallassunzione di
moto Browniano
Microscopia a fluorescenza
!
G(0) =
1
V
eff
C
& Se il volume efficacie accuratamente
determinato, la misura di G(0) fornisce un valore
accurato per la concentrazione delle molecole
La formula precedente vale per
diffusione normale tridimensionale;
in generale si pu considerare una
formula con un parametro * che
descrive diffusioni anomale o
trasporti attivi
& Dalla misura della G si
possono ricavare informazioni
sul tipo di processi diffusivi
!
G(") =
1
V
eff
C
1
1+
"
"
D
#
$
%
&
'
(
)
1
1+
r
0
z
0
#
$
%
&
'
(
2
"
"
D
#
$
%
&
'
(
)
Microscopia a fluorescenza
LFCS pu venire usato in alternativa al FRAP per analisi del
moto diffusionale nelle cellule
Il vantaggio rispetto al FRAP che lavora a concentrazioni
bassissime del fluoroforo e in volumi efficaci piccolissimi, quindi
si pu avere un guadagno in risoluzione
Microscopia a fluorescenza
Da misure successive delle G con tempi di integrazione brevi si possono
monitorare variazioni di coefficiente di diffusione dovuto per esempio al
binding
In questo senso lFCS unalternativa al FRET
Microscopia a fluorescenza
Lo stesso vale per proteine che variano il loro raggio
idrodinamico (e quindi le costanti diffusive): lFCS pu essere
usato per monitorare questi cambiamenti
!
D=
kT
6"#R
R = Raggio idrodinamico
)=viscosit
Microscopia a fluorescenza
Per misure che riguardano la diffusione chiaramente la
fotostabilit un requisito molto importante, perch tutte le
formule valgono nellassunzione che )=0 (fluttuazioni
intrinseche assenti)
Per questo motivo quando si vogliono fare misure specifiche
sulla mobilit si evita di usare le GFP e si tende di pi a usare
cromofori organici opportunamente progettati per lo scopo
(fluoresceine modificate)
Ma la FCS sulle GFP e su altre molecole con fluttuazioni
intrinseche di fluorescenza viene comunque utilizzata anche
proprio per analizzare la fotodinamica interna dei fluorofori
Microscopia a fluorescenza
Se la dinamica di fluorescenza intrinseca molto pi veloce della dinamica
diffusiva si pu scrivere, separando i due effetti
!
G(") = G
diff
(")G
kin
(")
La parte di cinetica interna la si approssima assumendo che il processo che
produce la fluttuazione sia dovuto a transizioni verso uno stato dark collegato
allo stato bright da cinetica del primo ordine
B
D
k
D

k
B

In questo caso la cinetica di collegamento tra i due
stati esponenziale e la G
kin
si pu calcolare
analiticamente
!
G
kin
(") =1# F 1#exp(" /"
F
( )
$
F
=1/(k
D
+k
B
)
F=k
D
/(k
D
+k
B
)
F = frazione media di molecole spente
Microscopia a fluorescenza
La G combinata assume una forma complessa, dalla quale per si possono
ricavare i parametri F e $
D

Dark fraction
Microscopia a fluorescenza
Pi in generale si possono distinguere diversi processi
con diversi tempi di rilassamento coinvolti
Microscopia a fluorescenza
Inoltre, siccome le propriet di dinamica di fluorescenza
delle GFP dipendono anche dallambiente (ad es, pH) la
misura del tempo di flickering o blinking tramite FCS pu
essere usata anche come sensore di ambiente cellulare
Altre varianti dellFCS contemplano la possibilt di studiare
la cross-correlation tra due classi di cromofori diversi
oppure tra due zone diverse, anche se gli apparati di analisi
sono complessi
Microscopia a fluorescenza
Riassunto delle varie tecniche raggruppate
per tipologia
Microscopia a fluorescenza
Fluorescent Labeling
The protein to be monitored is
labeled with a (G)FP and
visualized with fluorescence
microscopy techniques
Multi-color labeling is
possible using different FPs to
tag different proteins
Co-localization
When two different proteins
localizing in the same cell
compartment are tagged with
FPs of two different colors, if
FRET does not occur, the
detected emission will be the
sum of the two (green + red =
yellow)
FRET In similar conditions as
those of co-localization, if the
two proteins interact and FRET
occurs only the emission of the
acceptor will be detected





Marcatura semplice
Microscopia a fluorescenza
FRAP
An area with tagged proteins is
photobleached and the
fluorescence recovery is
measured. Recovery occurs by
diffusion of unbleached proteins
from adjacent areas
iFRAP
Inverse version of FRAP: all
areas are bleached except a
small spot; diffusion out of the
spot is measured
FLIP
Bleaching is made repeatedly
with pulsed radiation and the
loss of fluorescence in a region
out of the bleached region is
measured
PA
The proteins to be monitored
are tagged with proteins
initially dark or completely
photobleached. Then an area is
photo-activated and the
diffusion is followed
Bleaching-fotoattivazione
Microscopia a fluorescenza
FLAP
The protein is tagged with two
FPs, one is bleached, the signal
from the second can be used to
follow the tagged protein after
photobleaching
PC
The proteins are tagged with
photoconvertible (changing
color upon irradiation) FPs. A
restricted area is potoconverted
and diffusion observed
PALM
Proteins are tagged with
photoactivatable fluorophores,
that are activated very a few at
time; they are localized up to
the single level molecule;
images are build superimposing
data from different
photoactivation cycles

Variazioni di colore
limite di singola molecola
Microscopia a fluorescenza
FLIM
The fluorescence decay time is
measured in different areas and
a map based on its value is
build
FCS
The time correlation function of
the fluorescence fluctuation is
measured and analyzed;
information on the diffusional
and internal fluorescenc
dynamics are obtained,
possibly as a function of the
position
Misura di tempi di
fluorescenza o
rilassamento
Microscopia a fluorescenza
FISH
A DNA short sequence
complementary to the seq to
be analyzed is labeled
Afted denaturation, it will
hybridize with the part of DNA
of interest and indicate its
location
Microarrays
Similar to FISH, but the probe
sequences are fixed on a
matrix in specific positions and
the DNA to be analyzed is
marked: it will hybridize in the
location where its
complementary probe sequence
is located


Ibridizzazione di DNA