Enzimi

Gli enzimi sono proteine specializzate per la funzione catalitica

Struttura generale degli enzimi

Prodotto

sito attivo

OLOENZIMA
Parte non-proteica nonParte proteica: Apoenzima Cofattore (ione metallico) Gruppo Prostetico coenzima (legato covalentemente) (vitamina o altro)

gli enzimi sono suddivisi in 6 classi

Nel 1961 la Commissione per gli Enzimi dellUnione Internazionale di Biochimica (IUB) propone un sistema di nomenclatura e classificazione basato sul tipo di reazione catalizzata e sul nome del substrato di ciascun enzima

Una importante propriet degli Enzimi

Gli enzimi: creano un ambiente specifico, chiamato sito attivo, in cui una data reazione

"energeticamente favorita SUBSTRATO

la molecola che si lega al sito attivo il

Propriet dei Catalizzatori

Non modificano lequilibrio della reazione Aumentano la velocit di una reazione Si ritrovano inalterati al termine del processo

LA VARIAZIONE DI ENERGIA LIBERA STANDARD E CORRELATA ALLA Keq

Consideriamo la generica equazione:

a A + b B c C + d D
Definiamo

costante di equilibrio Keq

[C ]c [ D]d K eq = [ A]a [ B]b

a temperatura costante!

Le concentrazioni nellespressione sopra sono riferite allequilibrio.

Uso qualitativo della costante di equilibrio Per una data reazione di equilibrio:

a A + b B c C + d D
si pu affermare che

Keq

Se Keq grande (Keq>>1) lequilibrio spostato verso i prodotti, cio nella miscela di equilibrio le concentrazioni dei prodotti sono maggiori di quelle dei reagenti Se Keq piccola (Keq<<1) lequilibrio spostato verso i reagenti

Quando un sistema non allequilibrio, la tendenza a spostarsi verso lequilibrio diventa la forza trainante della reazione la cui intensit misurata dalla variazione di energia libera
G= in condizioni standard: 25C, 1M G - R T ln Keq =

A(S)

B(P)

Effetto di un generico catalizzatore che abbassa lenergia di attivazione

perch favoriscono lo stato di transizione formando il complesso ES

A(S)

B(P)

Complesso EnzimaSubstrato
Lenergia usata per aumentare la velocit enzimatica deriva dalle interazioni deboli (legami idrogeno, interazioni ioniche e idrofobiche) che si formano tra enzima e substrato ENERGIA di LEGAME

Lenzima si deve combinare chimicamente col substrato Modello serratura e chiave, (Fisher 1894): Lenzima contiene nel sito attivo il complementare al substrato Si formano legami ionici esatti fra enzima e substrato

Nelson-Cox, INTRODUZIONE ALLA BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2010

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Modello per le interazioni substrato-enzima Teoria delladattamento indotto:

Lavvicinamento del substrato "induce" la formazione del sito attivo

Gli enzimi sono caratterizzati da elevata specificit

Meccanismo della catalisi enzimatica

Gli enzimi in quanto catalizzatori: Aumentano la velocit di una reazione abbassando laltezza della barriera dellenergia di attivazione Non modificano lequilibrio della reazione.

CINETICA ENZIMATICA Determinare come varia la velocit delle reazioni enzimatiche in funzione della variazione dei parametri sperimentali.

Velocit iniziale V0
Nelle analisi delle reazioni enzimatiche si utilizzano soltanto le velocit di reazione iniziali (v0), quelle cio che si misurano non appena si mescolano lenzima ed il substrato. In tal modo la variazione di [S] pu essere considerata trascurabile.

FATTORI CHE MODIFICANO LA VELOCITA DELLE REAZIONI ENZIMATICHE: 1) pH (curva a campana) 2) temperatura (curva bifasica a causa della denaturazione) 3) [S] (iperbole rettangolare a causa della saturazione) 4) inibitori

1) pH
Ciascun enzima ha un pH ottimale al quale la reazione catalizzata con la massima efficienza. Esso in genere rispecchia quello dellambiente in cui lenzima svolge normalmente le sue funzioni. La concentrazione degli H+ (pH) influenza lattivit

enzimatica modificando la geometria del sito attivo e la distribuzione delle cariche elettriche dei
gruppi coinvolti nel legame del substrato o nel processo catalitico stesso. Valori di pH estremi possono anche provocare la denaturazione dellenzima.

2) Temperatura
La velocit di reazione aumenta con laumentare della temperatura fino a raggiungere un picco. Un ulteriore innalzamento della temperatura provoca una diminuzione della velocit di reazione a causa della denaturazione dellenzima.

3) Concentrazione del substrato

velocit di una reazione (v): il numero di molecole di substrato che si trasformano in prodotto nellunit di tempo. (v) si esprime come mol/L di prodotto formatosi in un minuto (M/min). La velocit di una reazione catalizzata da un enzima

aumenta allaumentare della concentrazione del substrato fino a raggiungere una velocit massima (Vmax) che riflette la saturazione con il substrato
dei siti attivi delle molecole di enzima presenti.

Quando tutto lenzima saturato con il substrato: ES = E tot e la V0 = Vmax

Costante di Michaelis e Menten

La Km quella concentrazione di substrato che consente di raggiungere la met della Vmax

Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli

Lequazione di Michaelis-Menten
Essa descrive la variazione della velocit di reazione al variare della concentrazione

del substrato.
Vmax [S] v0 = Km + [S]
v0 = velocit iniziale della reazione Vmax= velocit massima Km = costante di Michaelis-Menten [S] = concentrazione del substrato

 La Km pari alla concentrazione di substrato alla quale la velocit della reazione (v0) 1/2 della Vmax. La Km riflette laffinit dellenzima per il substrato:
Km piccola, alta affinit dellenzima per il substrato Km grande, bassa affinit dellenzima per il substrato.

Caratteristiche della Km

Ogni enzima ha una Km caratteristica per un particolare substrato. La Km non varia al variare della [E].

I PARAMETRI CINETICI POSSONO ESSERE USATI PER CONFRONTARE LE ATTIVITA DEGLI ENZIMI

Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli

Inibitori Enzimatici
Un inibitore enzimatico una molecola che interferisce con lattivit catalitica di un enzima, rallentandola o bloccandola completamente. Gli inibitori possono essere:
REVERSIBILI (Inibizione Reversibile) IRREVERSIBILI (Inibizione Irreversibile)

a) Inibizione competitiva

Linibitore, legandosi reversibilmente al sito normalmente occupato dal substrato, compete con il substrato per il legame a quel sito. Aumentando la [S] leffetto di un inibitore competitivo si attenua fino ad annullarsi.

Inibizione competitiva

Alcol deidrogenasi Metanolo>>formaldeide

a) Inibizione competitiva
La Km aumentata (Km apparente): necessaria una maggiore quantit di substrato per raggiungere 1/2 Vmax. Per una [S] sufficientemente elevata, la velocit di reazione raggiunge ugualmente la Vmax.

enzima chiave della sintesi del colesterolo

Inibizione mista

Inibitori irreversibili
Si legano allenzima con legami stabili (covalenti) Non possono essere rimossi con mezzi semplici sono utilizzati
nello studio dei siti catalitici come farmaci (anti-metaboliti) come anti-parassitari

diisopropilfluorofosfato Inibitori irreversibili gas nervini

ENZIMI REGOLATORI

regolazione dellattivit enzimatica

un enzima regolatore quello che controlla le quantit di sostanze che devono essere trasformate in una via metabolica (catalizza la reazione pi lenta in genere la prima di una serie ) tali enzimi non seguono la cinetica di Michaelis Menten e sono responsabili della modulazione della velocit con cui decorre lintero processo metabolico

ENZIMI ALLOSTERICI

struttura quaternaria (due o pi subunit proteiche) in essi esistono pi siti chimicamente attivi effettore o MODULATORE: molecola che interagendo in siti lontani dal sito attivo di un enzima, esercita un qualche effetto sulla sua attivit (positivo o negativo)

1) Modificazione non covalente o allosterica

In alcuni sistemi multienzimatici gli ENZIMI REGOLATORI sono inibiti dai prodotti terminali della via metabolica, se la concentrazione di questi superiore al fabbisogno cellulare

INIBIZIONE RETROATTIVA (A FEEDBACK NEGATIVO)

 Effettori omotropici: il substrato esso stesso un effettore (effetto omotropico). Il substrato funge spesso da effettore positivo: la presenza di una molecola del substrato in un sito dellenzima fa aumentare lattivit catalitica degli altri siti, che funzionano in modo cooperativo. Gli effettori positivi e negativi degli enzimi allosterici possono influenzare la Vmax, la Km o entrambe. In tali enzimi la relazione tra velocit di reazione (v0) e [S] ha un andamento sigmoidale. Effettori eterotropici: sono diversi dal substrato ed il loro effetto si dice eterotropico. Linibizione retroattiva di una via metabolica ne un esempio.

Gli enzimi ALLOSTERICI non seguono la cinetica di Michaelis-Menten Curva di saturazione con il substrato sigmoidale: interazione cooperativa tra le subunit

modulatore positivo

modulatore negativo

modificazione covalente reversibile

modificazione covalente irreversibile

Coenzimi
Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la presenza di ioni metallici o di altre molecole, talvolta legate con legami covalenti. Queste molecole vengono indicate come cofattori o coenzimi. 1) Cofattore: ione o molecola NON PROTEICA la cui presenza indispensabile perch lenzima possa svolgere la sua attivit catalitica. Tra i cofattori hanno rilevante importanza gli ioni di alcuni elementi metallici, in particolare Ca, Mg, Mn, Zn, Cu (p.es. tutti gli enzimi che utilizzano ATP richiedono la presenza di ioni Mg2+). 2) Coenzimi: sono molecole organiche (alcuni di essi derivano da vitamine). prendono parte direttamente allazione catalitica dellenzima spesso si ritrovano modificati chimicamente al termine della reazione (es. NAD+ / NADH).

 I coenzimi da soli sono cataliticamente inattivi ma, unendosi allapoenzima, formano lenzima cataliticamente attivo. Uno stesso coenzima pu essere unito a diverse proteine per cui si deduce che la specificit dellazione enzimatica propriet dellapoenzima e non del coenzima. La maggior parte dei coenzimi strettamente legata alle vitamine. Per diventare coenzima, la vitamina subisce delle trasformazioni che vanno dalla semplice fosforilazione (uno dei casi pi comuni) a trasformazioni pi complesse. La trasformazione della vitamina in coenzima avviene allinterno delle cellule ed di natura enzimatica. I coenzimi possono essere classificati in gruppi diversi, in base al tipo di reazione catalizzata.

Coenzimi derivati dalle vitamine Le vitamine sono necessarie per la sintesi di coenzimi e devono essere ottenute con la dieta Piante e microorganismi sono produttori di vitamine La maggior parte delle vitamine deve essere ulteriormente trasformata per generare coenzimi

Niacina (Vit. B3 o PP) e coenzimi NAD e NADP La niacina (acido nicotinico) un precursore di NAD e
NADP NAD = Nicotinamide Adenina Dinucleotide NADP = Nicotinamide Adenina Dinucleotide Fosfato NAD+ e NADP+ fungono da coenzimi in molte reazioni di ossidoriduzione nelle quali il coenzima si riduce acquistando uno ione idruro (:H-) (un atomo di idrogeno pi un elettrone) e si libera nel mezzo un H+. Mancanza di niacina provoca la pellagra cereali, carne, legumi

Struttura e biosintesi del NAD+ e del NADP+.

Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli

Riboflavina (Vit. B2 ) e coenzimi FAD e FMN

FAD = Flavin Adenin Dinucleotide FMN = Flavin mono-nucleotide I coenzimi Flavinici sono coinvolti in reazioni di ossidoriduzione catalizzate da molti enzimi (flavoenzime o flavoproteine)

Uova , latte, carne , cereali

Acido Pantotenico (Vit B5) e Coenzima A (CoA)

Partecipa alle reazioni di trasferimento di radicali ACILICI, come quelli che avvengono nellossidazione di carboidrati, acidi grassi e amino acidi. I gruppi acile sono legati covalentemente al gruppo SH del CoA a formare tioesteri Cereali, legumi, carne