BIOLOGIA MOLECOLARE 2-3 MARZO

Stru ura del DNA

Il DNA è considerato il blueprint of life.

Il DNA si trova all’interno del nucleo oppure all’interno dei mitocondri (il DNA mitocondriale
sinte zza per proteine mitocondriali, mentre il dna nucleare sinte zza per tu o il resto).
DNA = acido deossiribonucleico
RNA = acido ribonucleico
Il DNA e RNA sono depositari dell’informazione gene ca.
Le proteine le produciamo seguendo le informazioni che sono scri e all’interno della sequenza del
DNA.
Tu o ciò che all’interno della cellula è preposto a fare delle cose è prodo a a par re da
un’informazione che è scri a nel DNA. La conservazione e la trasmissione dell’informazione gene ca
sono le funzioni peculiari del DNA.
Il DNA è polimero formato da una catena ripetuta di NUCLEOTIDI (monomeri) ciascuno formato da:

- Gruppo fosfato
- Zucchero deossiribosio (DNA) o ribosio (RNA)
- Base azotata
La di erenza di base dei due zuccheri è l’assenza di un gruppo ossidrilico in posizione 2 nel
deossiribosio; questo gruppo ossidrilico è importante per riuscire a fare in modo che la cellula possa
capire quando deve u lizzare dei deossiribonucleo di e quando deve u lizzare dei nucleo di.
Questo perché gli enzimi chiave all’interno della cellula eucario ca sono DNA-polimerasi e RNA-
polimerasi, però leggono o l’uno o l’altro e non possono leggere entrambi sulla base dell’assenza o
presenza di questo gruppo ossidrilico.
Le basi del DNA sono basi eterocicliche, sono presen negli acidi nucleici appartengono a due classi:

- PIRIMIDINE = citosina, uracile e mina

- PURINE (pirimidina+imidazolo) = adenina e guanina
N.B. negli eterocicli come le purine e le pirimidine la numerazione viene fa a a par re dagli atomi
diversi dal carbonio e si fa in modo di dare agli azo le numerazioni più basse
ADENINA = in posizione 6 abbiamo un
gruppo amminico
GUANINA = in posizione 2 abbiamo
un gruppo amminico e in posizione 6
un gruppo carbonilico
CITOSINA = in posizione 4 abbiamo il
gruppo amminico è un carbonio
carbonilico in posizione 2
URACILE = non è presente nel DNA
ma è presente nell’RNA. L’uracile e la mida di eriscono per un gruppo me lico in posizione 5. È
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 presente in posizione 4 il gruppo carbonilico
TIMINA = è una 5-me l-uracile, ovvero ha un gruppo me lico in posizione 5

I monosaccaridi degli acidi nucleici sono:

- 2-deossi-D-ribosio (DNA)
- D-ribosio (RNA), in posizione 2 abbiamo il gruppo ossidrilico che non è presente nel
deossiribosio

DNA vs RNA
-L’uracile e il ribosio sono presen solo nell’RNA
-La mina e il deossiribosio sono presen solo nel DNA
-l’adenina, la guanina, la citosina e il gruppo fosfato sono comuni ad entrambi

NUCLEOSIDI
Il nucleo de è la composizione di zucchero base + gruppo fosfato, ma quando parliamo di
NUCLEOSIDE ci riferiamo solo al legame tra lo zucchero e la base azotata.
Quando al ribosio sarà legata la base azotata avremo i RIBONUCLEOSIDI: adenosina, guanosina,
ci dina e uridina
Quando al deossiribosio sarà legata la base avremo i DEOSSI-RIBONUCLEOSIDI: 2-deossiadenosina,
2deossiguanosina, 2-deossici dina e la midina.
Il legame tra zucchero e base azotata è un legame di po beta-glicosidico (se il gruppo ossidrilico si
trova sopra il piano sarà un legame di po beta, se si trova so o il piano sarà un legame di po alfa).
Il legame beta-glicosidico si forma tra il Carbonio anomerico* (C1) del ribosio e l’azoto in posizione 9
(nelle purine) o in posizione 1 (nelle pirimidine)
*carbonio anomerico = carbonio che nella forma aldeidica aperta era un carbonio achirale mentre
nella forma ciclica diventa chirale.
Il legame può avere due pi di orientazione: Syn e An (me ere immagine). L’orientazione di po
An è quella predominante, in partcolare le pirimidine non si possono disporre in posizione Syn
perché c’è un gruppo carbonilico in posizione 2 che impedisce il posizionamento in Syn (ingombro
sterico tra quel gruppo carbonilico e l’ossigeno del ribosio).

Hanno numerosi gruppi polari e sono solubili in acqua. Sono facilmente idrolizzabili da soluzione
acquose di acidi.
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 NUCLEOTIDI
I nucleo di sono ESTERI FOSFATO dei nucleosidi, quindi per perdita di una molecola d’acqua dal
nucleoside si forma il nucleo de. L’acido fosforico perde una molecola d’acqua e si lega al carbonio 5
dello zucchero.
Il sito di fosforilazione è quindi quasi sempre all’ossidrile del carbonio 5 dello zucchero (ma può
essere anche all’ossidrile del carbonio 3) e la fosforilazione può essere mono-, di- e tri-fosfato (uno,
due o tre gruppi fosfato). Il legame tra il fosfato e l’ossidrile in C5 è un LEGAME ESTEREO, mentre i
vari gruppi fosfato sono lega da un LEGAME FOSFOANIDRIDICO (stabile ed a alta energia). Es. l’ATP
è un nucleo de. In base al numero di gruppi fosfato avremo l’ADENOSINA MONOFOSFATO,
l’ADENOSINA DIFOSFATO e l’ADENOSINA TRIFOSFATO.

NOMENCLATURA

FUNZIONI DEI NUCLEOTIDI

-unità stru urali degli acidi nucleici (quello che a noi interessa di più)
-deposito di energia delle reazioni di trasferimento di fosfato
-mediatore di processi cellulari (cAMP)
-parte di coenzimi (NAD, FAD, CoA)
-intermedi di reazioni sinte che (S-Adenosilme onina che è un donatore di gruppi me lici che poi
vengono dona al DNA per cambiarne la conformazione e che impediranno l’interazione del DNA
con le proteine).
LE STRUTTURE DEL DNA

- PRIMARIA, ossia la sequenza di nucleo di che cos tuiscono la molecola

- SECONDARIA, ossia la con gurazione tridimensionale stabile di una molecola di DNA
- TERZIARIA, ossia il complesso ripiegamento cui il DNA genomico è sogge o all’interno della
cellula.
STRUTTURA PRIMARIA
Si ha la formazione del legame fosfodiesterico, ossia come vanno ad interagire tra di loro due
nucleo di. Questa reazione è possibile se il gruppo ossidrilico in posizione 3 dello zucchero va a
reagire con il fosfato in alfa del nucleo de che dovrà legarsi ad esso, con conseguente rilascio di un
pirofosfato (reazione di sos tuzione nucleo le di po 2). Per cui noi avremo uno scheletro formato
da residui di zucchero e di fosfato alterna , quindi la posizione 3’ di uno zucchero è legata alla
posizione 5’ dello zuccherro successivo mediante un gruppo fosfato; le basi azotate non fanno
parte dello scheletro ma sporgono fuori dallo scheletro. L’alternanza tra zuccheri e fosfa è la
cara eris ca stru urale del DNA COSTANTE, mentre l’ordine delle basi lungo la catena è CASUALE
(questa casualità sarà l’indicazione della diversità tra diverse sequenze).
I legami fosfodiesterici conferiscono una ben de nita polarità alla catena del DNA.
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 Le catene di DNA hanno un’estremità de a 5’ ed un’altra de a 3’ e noi
andremo a leggere il DNA sempre in direzione 5’-3’.
5’ = il carbonio dello zucchero a cui è a accato il gruppo funzionale fosfato
3’ = carbonio dello zucchero a cui è a accato il gruppo funzionale ossdrile

STRUTTURA SECONDARIA
La stru ura secondaria è data dal modello di Watson-Crick, ovvero il DNA è
una molecola formata da due catene di nucleo di appaiate secondo la regola
della complementarietà andando a formare la cosidde a DOPPIA ELICA. Sarà
un’ELICA DESTRORSA, cos tuita da due catene polinucleo diche
an parallele (una catena in 5’-3’ e l’altra in 3’-5’) e le basi sono all’interno
dell’elica allineate ad angolo re o con l’asse dell’elica.

Come si legano le basi tra di loro?

Esse si legano per APPAIAMENTO = ogni base presenta su un lamento forma un legame con la base
posta sul lamento opposto. Tale evento è noto come
APPAIAMENTO COMPLEMENTARE.
I gruppi funzionali che perme ono la formazione di 3 legami a
idrogeno tra guanina e citosina sono: il gruppo carbonilico in
posizione 6 della guanina che formerà un legame con il gruppo
amminico in posizione 4 della citosina, l’azoto in 1 della guanina
che formerà un legame con l’azoto in 3 della citosina a raverso
l’H portato dall’N1 e in ul mo il gruppo amminico in posizione 2
della guanina che formerà un legame con il carbonio carbonilico
in posizione 2 della citosina.
i gruppi funzionali che perme ono la formazione di 2 legami a
idrogeno tra adenina e mina sono: il gruppo amminico in
posizione 6
dell’adenina che formerà un legame con il gruppo carbonilico in
posizione 4 della mina e l’azoto in posizione 1 dell’adenina che
formerà con il suo idrogeno un legame con l’azoto in posizione 3 della mina.
Il legame può avvenire SOLO tra guanina-citosina e adenina- mina perché la distanza tra gli zuccheri
nelle due coppie deve essere molto molto simile, infa in entrambi i casi avremo una distanza di
11,1 A (NB 1 ångström (Å) = 0,1 nm= 10 alla -8).
Le basi azotate si trovano all’interno del DNA nella forma tautomerica preferita.
TAUTOMERIA = condizione in cui una molecola si presenta so o due diverse forme pur avendo lo
stesso numero di atomi.
Questa tautomeria la possiamo ritrovare anche nelle basi azotate e quindi si possono formare dei
nucleo di alterna vi.
Per quanto riguarda la guanina possiamo avere una forma chetonica e una forma enolica
(TAUTOMERIA CHETO-ENOLICA)
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 Per quanto riguarda la citosina possiamo avere una TAUTOMERIA AMMINO-IMMINICA. La forma
amminica ha il gruppo NH2, mentre la forma imminica ha i gruppi NH.

Tendenzialmente le citosine si trovano nella forma amminica e le guanine si trovano nella forma
chetonica, ma sono possibili anche la forma imminica ed enolica.
Questo comporterà che le basi avendo questo po di possibile conformazione per quanto riguarda i
gruppi funzionali, possono perme ere la formazione di legami alterna vi tra le basi azotate. Può
capitare che una Guanina nello stato comune possa interagire con una mina nella sua forma rara
(enolica) andando a formare 3 legami a H e viceversa, oppure che un’adenina comune vada ad
interagire con una citosina rara (imminica) formando due legami a H.

Watson e Crick furono in grado anche di de nire alcune cara eris che stru urali del DNA, ossia:

➢ che la distanza tra due coppie di basi azotate è sempre di 0,34 nm

➢ che per ogni volta che l’elica gira intorno all’asse (giro d’elica) ci sono 10 coppie di basi e
avremo una distanza di 3,4 nm
Il DNA è fa o da due catene fa e da polinucleo di che corrono in maniera an parallela e sono
avvolte a orno ad un asse comune centrale. Queste catene corrono in direzione opposta, e le basi si
trovano all’interno di questa elica mentre i fosfa si trovano all’esterno.
Quello che hanno dedo o Watson e Crick è stato che le due coppie di basi hanno esa amente lo
stesso ingombro trasversale, presentano gli zuccheri in modo tale da avere una distanza non
dissimile dalle due coppie (11,1 A) ed è una cara eris ca costante nel DNA perché i legami a H tra le
basi non sono gli unici legami che stabilizzano il DNA, ma dobbiamo considerare anche tante altre
interazioni che sono quelle che portano all’IMPILAMENTO TRA LE BASI (la disposizione delle basi
all’interno della doppia elica è energicamente favorita). Ossia si stabiliscono tra le basi azotate
disposte una sull’altra delle forze che tendono a fare in modo che le basi rimangano impilate l’una
sull’altra e si dispongano in maniera parallela tra di loro. Lo faranno in maniera tale da evitare che ci
sia un conta o con le basi azotate con l’acqua, in modo da stabilizzare la stru ura del DNA. Tra le
basi impilate si stabiliscono interazioni idrofobiche e delle interazioni di van der Waals.
Questo po di conformazione perme e alla cellula di escludere la massima quan tà di acqua
dall’interno della doppia elica, ridurre il conta o con l’acqua e di stabilizzare la stru ura del DNA.
Può capitare che alcune basi all’interno di questa stru ura siano rivolte verso l’esterno dell’elica,
questo fenomeno prende il nome di BASE FLIPPING ed è un fenomeno che si può veri care quando
il DNA deve essere riparato, ovvero se è una base danneggiata che deve essere rimossa, la base si
sposta verso l’esterno e perme e l’interazione con quegli enzimi che serviranno per ripararla;
oppure può succedere che questa base si spos verso l’esterno perché deve essere modi cata per
rendere il DNA più o meno accessibile alle proteine (es. me lazione del DNA). Questo però è un
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 evento che ha un altro costo energe co (questo perché bisogna andare a rompere i legami ad
idrogeno che si trovano tra le basi e le interazioni) quindi verrà messo in a o solo se necessario
(ovvero in caso di danneggiamento del DNA o in caso di regolazione genica di quel DNA).
All’interno della stru ura del DNA, a parte le interazioni covalen che si veri cano a livello dello
scheletro del DNA (zucchero-fosfato), abbiamo una serie di interazioni non-covalen che sono:
1)forze di van der Waals (interazioni da IMPACCAMENTO fra le basi impilate, sono addi ve)
2) LEGAMI IDROGENO: tra le basi azotate appaiate di lamen oppos
3) E e IDROFOBICI: escludendo molecole H2O dall’impaccamento delle coppie di basi si ra orzano
i legami H
4) Interazioni CARICA/CARICA legata alla presenza di gruppi fosfato all’interno della stru ura del
DNA, che andranno poi ad interagire con delle cariche posi ve presen sugli AA che serviranno
per impacche are il DNA, ovvero gli ISTONI.
Queste interazioni non-covalen vanno a stabilizzare la doppia elica del DNA.

N.B. I LEGAMI H SONO IMPRTANTI NEL DETERMINARE LA

SPECIFICITà
DELLE COPPIE DI
BASI
Tornando al discorso dei legami che si formano tra le coppie di basi, perché una ADENINA e una
CITOSINA non possono legarsi? Perché; pur sempre rispe ando la distanza tra gli zuccheri di 11,1 A,
si troveranno davan due gruppi donatori e all’interno ci saranno due gruppi acce ori (i due azo ) e
quindi non si formano gli appropria legami H e le basi non si legano, per cui la coppia fra queste
basi risulta instabile.
Dato il diametro costante dell’elica le basi si troveranno sempre verso l’interno e avranno limitate
possibilità di combinazione, legata proprio alla possibilità di formare legami H. Avremo sempre una
grossa base purinica che si trova di fronte a una piccola base pirimidinica.
IMPOSSIBILI le combinazioni:

- PURINA-PURINA, anche se teoricamente si potrebbero formare dei legami H, cambiano le

distanze tra gli zuccheri per cui quella stru ura non si forma (si allargherebbe la stru ura)
- PIRIMIDINA-PIRIMIDINA, perché al contrario andrebbero a ristringere la stru ura dello
scheletro
- PURINA-PIRIMIDINA (troppo stre a) incompa bili tra di loro per impossibilità di formare
legami H come ad esempio adenine-citosine.
Quando le catene girano una intorno all’altra si può vedere un’altra cara eris ca importante della
stru ura del DNA che è quella della formazione di due solchi: un SOLCO MAGGIORE e un SOLCO
MINORE che hanno ampiezza diversa. Il solco maggiore avrà una ampiezza di 22 A e sarà più
profondo e largo; mentre il solco minore avrà un’ampiezza di 12 A e sarà più stre o e super ciale.
Ciò signi ca che ci sarà una diversa accessibilità delle basi.
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 È proprio a livello di ques solchi che andranno ad interagire le proteine, vedremo che quasi tu e le
proteine che interagiscono con il DNA lo fanno a livello del solco maggiore perché ci sarà una
maggiore accessibilità da parte delle proteine nel solco maggiore piu osto che nel solco minore.
(sopra u o i fa ori di trascrizione andranno a legarsi nel solco maggiore). Ci sono però anche delle
proteine che legano nel solco minore quando il DNA deve compa arsi all’interno del nucleo oppure
quando deve iniziare il processo di trascrizione.
Il mo vo per il quale le proteine si legano maggiormente al solco maggiore non è solo per una
ques one di accessibilità, ma anche perché nel DNA i gruppi chimici delle basi che sono espos nel
solco minore e nel solco maggiore vanno a creare un codice, e quindi il solco maggiore può essere
le o più facilmente rispe o al solco minore.
Vediamo i diversi casi:

- G-C, i gruppi funzionali delle basi espos nel solco maggiore sono diversi dai gruppi
funzionali espos nel solco minore (come nel caso di A-T). Nel solco maggiore avremo un
gruppo acce ore, acce ore, donatore e un idrogeno non polare (AADH) e nel solco minore
avremo un acce ore, donatore e acce ore.
- C-G, avremo nel solco maggiore un idrogeno non polare, donatore, acce ore e acce ore
(HDAA) e nel solco minore avremo acce ore, donatore e acce ore (come nella coppia G-C)
-A-T, avremo nel solco maggiore un acce ore, donatore,
acce ore e gruppo me lico (ADAM) e nel solco minore
avremo acce ore, idrogeno e acce ore
-T-A, avremo nel solco maggiore gruppo me lico, acce ore,
donatore e acce ore (MADA) e nel solco minore avremo
acce ore, idrogeno e acce ore (come nella coppia A-T)
Possiamo notare che il solco minore se lo leggiamo in
direzione A-T o T-A o in direzione G-C e C-G sono
indis nguibili; quindi una proteina che deve andare ad
interagire con il solco minore se si trova davan una coppia G-
C o C-G si trova davan gli stessi gruppi funzionali e NON LI
DISTINGUE, invece se va ad interagire con il solco maggiore si
trova davan una coppia G-C rispe o a una coppia C-G, o una
coppia A-T rispe o a una coppia T-A , vede gruppi funzionali
diversi e sarà in grado di dis nguerli. Questa proprietà perme e alle proteine di riconoscere senza
ambiguità speci che sequenze di DNA senza che sia necessario aprire la doppia elica.
Quindi riassumendo G-C e C-G li posso dis nguere SOLO nel solco maggiore; A-T rispe o a G-C li
posso dis nguere in entrambi i solchi, mentre A-T e T-A li posso dis nguere SOLO nel solco maggiore
perché nel solco minore il codice è iden co.
Tornando alle di erenze tra DNA e RNA, perché non è presente la mina nell’RNA o viceversa
l’uracile nel DNA? Le citosine spontaneamente tendono a perde il gruppo amminico in posizione 4 e
si ha un fenomeno che si chiama DEAMMINAZIONE SPONTANEA. Questa deamminazione spontanea
porterà la citosina a diventare uracile. Se avvengono queste mutazioni molto frequentemente a
livello del DNA della cellula eucario ca ci sono degli enzimi di riparazione che riportano l’uracile a
citosina. Se l’uracile fosse una base presente nel DNA un enzima di riparazione non sarebbe in grado
di capire quando quell’uracile è veramente una base oppure era una citosina deamminata. Quindi a
quel punto la cellula invece di u lizzare gli uracili all’interno del DNA u lizzare le TIMINE, che non è
nient’altro che una 5-me l-uracile e questo gruppo me lico in posizione 5 perme e alla cellula di
discernere che quando viene deamminata spontaneamente una citosina diventa uracile e
quell’uracile non è una base del DNA e deve essere riparato.
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 REGOLE DI CHARGAFF (1950)
Nel DNA la quan tà di adenina (A) è sempre uguale alla quan tà di mina (T) e la
quan tà di citosina (C) è sempre uguale alla quan tà di guanina (G). Di conseguenza il
quan ta vo di basi puriniche (A+G) è sempre uguale al quan ta vo di basi
pirimidiniche (C+T).
Conoscendo questo saremo sempre in grado di de nire la percentuale di composizioni in basi di un
frammento di DNA. Se la quan tà di Adenina è del 32%, di conseguenza la quan tà di Guanina sarà
18%. Perché Adenina+Timina= 32+32= 64%, 100-64= 36% di Guanina-Citosina, per cui avremo che la
quan tà di Guanina sarà 36/2=18%.
Il rapporto tra le A+T e C+G non è più uguale a 1, ed è cara eris co per ogni specie ed è spesso
u lizzato nella classi cazione degli organismi. Ovvero da questo rapporto siamo in grado di valutare
il contenuto in C e in G; questo contenuto in G e in C sarà diverso nei vari organismi ed è stato
scoperto che il genoma dei vertebra è un mosaico di segmen di DNA che hanno una de nita
composizione in basi e una de nita percentuale di basi G-C, questo modello è stato de nito
MODELLO DELLE ISOCORE che è appunto un modello che ha permesso di classi care i vari
organismi. Nei vertebra la %G-C è sempre nell’ordine dei 40/45%, nei ba eri è molto più variabile
(20-80%). Si è visto che i vertebra hanno una più complessa organizzazione all’interno del genoma
e si è iniziato a studiare la distribuzione dei nucleo di all’interno del genoma. Noi sappiamo che
meno del 5% del genoma è quello che serve per codi care le proteine e no a poco tempo fa veniva
considerato DNA spazzatura; in realtà non è così ma tu a quella parte ha una sua funzione.
Dall’importanza di sapere la composizione in basi del DNA è venuta fuori la TEORIA DELLE ISOCORE
che dice che all’interno di un genoma ci sono dei cluster di frammen che possono essere dis n tra
di loro per la %G-C e la diversa composizione in basi G-C di un genoma cara erizzerà quel genoma.
Per de nire questa stru ura (per la teoria delle isocore) sono sta fa dei frazionamen
composizionali u lizzando delle ultracentrifughe e sono riusci a vedere che ci sono varie famiglie
che loro hanno de nite con i codici L1, L2, H1, H2 e H3 (che stanno ad indicare bassa densità o alta
densità sulla base della %G-C presen ). Questa de nizione di queste varie famiglie ha permesso di
creare dei gra ci in cui si è visto, sulla base della %G-C, quelli che sono a maggiore o minore densità
genica. Hanno quindi de nito che il genoma è un mosaico di segmen di DNA e ogni frammento ha
un suo preciso contenuto in G-C. questo dato è importante saperlo perché in base a questa %
possiamo provare a de nire qual è il ruolo funzionale di quella regione di genoma o possiamo
de nire in che modo e dove vivono gli organismi. Quindi una cosa che hanno fa o ques scienzia è
stato andare a vedere come cambia la presenza di queste famiglie di isocore nei vari organismi e
hanno visto che ad esempio nell’uomo, nello scimpanzè, nel cane, nel topo hanno tu più o meno
una distribuzione quasi simile tra le varie densità di gruppi G-C, ma si sono accor che cambiando
po di organismo (es. pesci) questa composizione cambia molto, ossia si aveva maggior quan tà di
%G-C (il DNA quindi era più stabile poiché vi erano più legami H. Quindi organismi che devono vivere
in condizioni ambientali più estreme hanno più necessità di avere un DNA più stabile (e questa
stabilità sarà legate alla %G-C).
I vari organismi possono essere suddivisi sulla base della maggior o minor presenza nel complesso di
segmen che hanno la diversa percentuale di basi GC.
La classi cazione di organismi in basi GC è stata possibile e ci ha fa o comprendere perché c'è
questa diversa percentuale in basi, sulla base del fa o che alcuni organismi necessitano di vivere in
condizioni più estreme, quindi hanno necessità di avere un DNA che abbia maggiore stabilità e di
conseguenza, gli an bi, i re li o alcuni pi di pesci hanno una composizione più eterogenea rispe o
a quanto può avere un uomo o cane/scimpanzé.
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 Come cambiano da diversi
organismi, le varie isoforme
(low e high) in percentuale
in base GC? In par colare,
cambia la diversa presenza
in ogni singola isocora
possibile alcune coppie di
nucleo di ! Coppie
con gue di basi azotate: è
stato visto quali erano più o
meno presen nelle diverse
famiglie di isocore di cui è
possibile fare una
stra cazione. Tra tu e le
possibili coppie di basi,
quella che è meno presente
in tu gli organismi ed in
tu e le famiglie è il
dinucleo de CG; è molto
importante perché queste
basi CG, questa coppia di
nucleo di, è poco rappresentata per un mo vo: queste citosine che si trovano nella stru ura
genomica, in con guità con delle guanine, in quelli che sono i si CpG, dove la P sta per gruppo
fosfato che lega i due nucleo di che portano queste basi azotate, sono so orappresentate a livello
del genoma, perché queste citosine hanno la tendenza ad essere me late (possono subire una
me lazione). La me lazione che possono subire è a livello del carbonio in 5.
Se avviene questa modi cazione, che avviene spesso nel DNA, una 5me lcitosina, quando subisce
deamminazione, una mutazione spontanea, diventa una mina; diventando una mina, è una base
irriconoscibile come potenziale sito di mutazione, quindi una base che non verrà riparata. Siccome è
una base che probabilmente si può formare, perché il DNA può essere me lato a livello delle
citosine in posizione 5, e il DNA me lato tenderà spontaneamente a deamminarsi, porterà alla
formazione di una mina che non è riconoscibile dai sistemi di riparazione cellulare. Ed è per questo
che nelle cellule, i si CpG sono so orappresenta , altrimen sarebbe molto cao co da parte della
macchina di riparazione del genoma, riuscire a capire cosa e quando deve riparare.

Sono si importan a livello genomico e so orappresenta ! si è visto invece, che quando avviene
questa me lazione a livello dei si CpG, è cruciale per regolare l'espressione genica (a livello dei
promotori dei geni). Si trovano citosine me late a livello dei promotori dei geni, i fa ori di
trascrizione non riusciranno a legarsi al DNA e quel gene non verrà trascri o.
Sono importan si di regolazione, che però tendenzialmente la cellula tende a tenere in bassa
percentuale a livello genomico (tranne che in alcune regioni cara eris che che si trovano sui
promotori dei geni), altrimen se fossero alte sarebbe complicata la loro ges one. Un cambiamento
di basi in percentuali GC cambia a livello di queste regioni par colari dei promotori dei geni che sono
appunto de nite isole CpG, ovvero delle regioni del genoma in cui c'è par colare abbondanza di
ques si CpG. Nel genoma sono rari ma a livello di queste isole sono abbondan , e queste isole si
trovano nella maggior parte dei promotori dei geni (quelli che ci perme ono una maggiore o minore
regolazione dell'espressione del gene che dovrà essere trascri o).
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 Proprietà termiche del DNA
Il DNA può essere manipolato dalla
temperatura. Il DNA portato ad alte
temperature perde stabilità perché i legami
idrogeno che tengono unite le basi azotate
diventano instabili e le due catene si separano
(il DNA con maggiore composizione in base GC
è più stabile del DNA con maggiore
composizione in base AT, perché sono tre
legami idrogeno rispe o a due). La
temperatura alla quale il 50% del DNA risulta
denaturato (a singola elica) si chiama
temperatura di mel ng, ovvero Tm, che
dipenderà dalla composizione in basi, ma
anche dalle condizioni in cui si trova il nostro
DNA (solvente in cui si trova, gli ioni che sono presen ).
Queste proprietà termiche sono importan nel momento in cui diventa necessario manipolare il
DNA, quindi in condizioni di laboratorio, in cui saranno u lizza solven e tamponi diversi (di
conseguenza le temperature di mel ng potrebbero risultare diverse). In questo gra co possiamo
osservare come cambia a seconda della temperatura, la temperatura di mel ng: nell’ascisse
troviamo la temperatura di mel ng e nelle ordinate la percentuale di DNA a singolo lamento. La
temperatura di mel ng è de nita come quella temperatura alla quale il 50% della stru ura ad elica
viene persa (quindi abbiamo 50% di DNA a singolo lamento e 50% di DNA a doppio lamento). Si
può anche misurare la fusione di un DNA misurando l’assorbimento a 260 nanometri.
Sulla lunghezza d’onda sulle ascisse e sull’assorbimento
rela vo ad una determinata lunghezza d’onda sulle
ordinate, si nota in basso un DNA a doppio lamento;
l’altra curva è di un DNA a singolo lamento
(denaturato). A 260 nanometri si ha un picco per
entrambi i DNA, e per quello a singolo lamento c’è un
aumento dell’assorbimento rela vo a questa lunghezza
d’onda. Questo è chiamato EFFETTO IPERCROMICO:
l’aumento di assorbimento della luce a 260 nanometri
da parte di un DNA denaturato.
Questa denaturazione dipende dalla percentuale in
basi, ma anche da dove si trova il DNA, ad esempio
dalla concentrazione salina (ipo zzando di trovarci in condizioni di laboratorio, si u lizzano dei
tamponi e delle soluzioni per estrarre il DNA). Un DNA a bassa concentrazione salina a parità di basi
GC avrà una più bassa temperatura di mel ng. Quindi, i Sali stabilizzano i legami e aumentano la
temperatura di mel ng.
Il DNA cambia nella sua denaturazione sulla base della sua composizione in basi, ma ovviamente
anche sulla base di ciò che viene u lizzato per estrarlo.
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 A seconda della temperatura, si può notare come
varia l’assorbanza e come varia ovviamente sulla
base del contenuto in GC. Aumentando il contenuto
in GC, aumenta la temperatura di mel ng. Quindi,
65 gradi si ha un DNA con GC a 35%, a mano a mano
che aumenta la % di basi GC, aumenta la
temperatura di mel ng.

Come cambia a parità di composizione in base GC sulla

base della concentrazione salina? Nel gra co vi sono
curve in cui sono state u lizzate diverse concentrazioni
di Cloruro di potassio; aumentando la percentuale di
cloruro di potassio, aumenta la temperatura di
mel ng, a parità di assorbanza.

E’ importante sapere che un DNA può essere denaturato, perché può essere rinaturato
manipolandolo e u lizzando tu e le tecnologie di DNA ricombinan . Il nostro obie vo in laboratorio
è perme ere l’apertura della doppia elica, e poi perme ere che ci sia un appaiamento (o con lo
stesso DNA, alzando e
abbassando le temperature, o modularlo e ibridizzarlo con qualcosa di esogeno, come altri
frammen di DNA ! ibridizzazione, conoscendo la temperatura di mel ng e temperatura di
annealing, ovvero la TEMPERATURA DI RIASSOCIAZIONE, legata al materiale che si vuole associare).
Gli studi condo da
Watson e Crick, per la
de nizione della stru ura
del DNA, sono sta
possibili riprendendo gli
esperimen di inizio anni
50’ di Wilkins e Franklin
grazie all’u lizzo la
di razione dei raggi X.
Questa tecnica perme e di determinare la posizione degli atomi che si trovano in un campione
cristallino, come un campione di DNA, sulla base del quadro di di razione ai raggi X che hanno
a raversato questo campione ! hanno preso una fascia di raggi X, l’hanno inviato al cristallo; c’è
uno schermo che perme e di veicolare il fascio di raggi X verso il nostro campione , ques raggi
vengono de essi e vanno a creare un’immagine che viene registrata su una lastra fotogra ca e
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 produce un’immagine di questo po. Da queste macchie hanno capito che il DNA ha una stru ura
estremamente regolare e ripe va.
La di razione avviene quando delle onde che
hanno una lunghezza simile a raversano una
stru ura ordinata, ed in questo caso si parla
di INTERFERENZA. Se queste oscillazioni
delle onde sono in fase, si vanno a rinforzare;
se invece sono allineate con un'altra serie di
onde, si annullano.
Le onde a raversano linee orizzontali e
vanno a produrre spot di questo po su una
lastra fotogra ca; quando invece
a raversano delle linee inclinate, gli spot
sono di un altro po; quando le onde
a raversano linee a zig-zag, gli spot che si
creano sono di questo po.

Da una immagine di questo po, da degli spot di questo po, hanno

capito si tra asse di una stru ura a zig-zag. L’andamento diagonale
delle macchie nere che si allungano dalle 11 alle 5 e dall’1 alle 7, se
paragonate alle lance e dell’orologio, suggerisce la stru ura elicoidale
del DNA. I ri essi allunga orizzontali al margine superiore ed inferiore
della fotogra a indicano che le basi puriniche e pirimidiniche si impilano
l’una sull’altra ogni 0.34 nm e sono disposte perpendicolarmente
rispe o all’asse dell’elica.
Nel 1953, la Franklin scrisse che “il DNA è composto da due catene dis nte”, un giro dell’elica è lungo
34 Angstrom (3.4 nm), con un diametro di circa 20 Angstrom (2 nm). Poiché la distanza tra nucleo di
adiacen è di 34 Angstrom, ogni giro dell’elica con ene circa 10 nucleo di. Si è arriva così alla
stru ura che oggi conosciamo, de nita da Watson e Crick.

Conformazioni del DNA

Quella di Watson e Crick è una delle conformazioni
del DNA, ma non l’unica. A ualmente possiamo
classi care le conformazioni del DNA in tre famiglie
principali: A, B e Z. Quella di Watson e Crick è la
conformazione B, quella classica.
Il DNA di po A che è presente in condizioni di
disidratazione, in condizioni non siologiche (non
esiste in vivo, ma in laboratorio dove c’è minor
contenuto di acqua e maggior concentrazione
salina).
Con questo DNA, si ha una stru ura diversa anche nella sua possibilità di interagire con le proteine
(ad esempio, la diversa conformazione dei solchi, quello maggiore qui è più profondo e più stre o, e
quello minore è ancora meno profondo e si allarga un po’).
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 Un DNA che esiste in vivo è il DNA di po Z, che è stato scoperto nel 1979 al MIT, ed è cara erizzato
da un’alternanza di purine e pirimidine in un’alta concentrazione di Sali. Ha la cara eris ca del fa o
che si possono trovare delle guanidine in posizione SYN ! nella maggior parte dei casi, le basi
azotate si dispongono rispe o allo zucchero in posizione an . Questo po di disposizione delle
guanidine in posizione syn induce un andamento a zig-zag del DNA (da qui il nome del DNA di po Z).
Sulla base di una stru ura diversa di DNA, ne risen ranno i due solchi: quello maggiore sarà molto
più super ciale e quello minore molto stre o (diversa possibilità di interagire con le proteine).
Nella maggior parte dei casi, un DNA di
forma A o B, la base azotata (purina) si
dispone verso lo zucchero in posizione
ANTI; nella forma Z, si dispone in
posizione SYN. Questa è una possibilità
per le purine ma non per le pirimidine !
osservando la stru ura, queste ul me
hanno un gruppo carbonilico in
posizione 2; se dovessero essere in
posizione SYN, il gruppo carbonilico
ingombra l’ossigeno dello zucchero, e
non è permessa. E’ una posizione
eventualmente permessa SOLO per le
purine.

Il DNA assume la conformazione di po A in condizioni

non siologiche, l’RNA ha la conformazione classica di
po A, in cui si ha un solco maggiore profondo e
stre o e un solco minore più largo e poco profondo,
rispe o ad un DNA di po B dove si evidenzia
un’accessibilità del solco maggiore, che diventa
ancora più accessibile nel momento in cui c’è un DNA
di po Z.

Guardando il DNA dall’alto, cambia anche

l’impilamento delle basi tra i tre pi di DNA. Nel
DNA di po A, mentre nel B e nel Z quello che si
evince è che un DNA meno accessibile da parte
dell’acqua, si formano zone in cui c’è una maggior
possibilità di interazione con l’acqua.

Queste sono le forme principali di DNA. Esistono però altre forme indicate come DNA di po G, C e
D, in cui si è visto che il DNA si forma come fosse delle bre.
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 Riassunto cara eris che principali: cambia
la distanza tra le coppie delle basi, il
numero di basi per giro d’elica, come si
forma il legame glicosidico (SIN per le
purine nella Z), diametro e il senso di
rotazione dell’elica (opposto per la forma
Z).

In una
grande
molecola
di DNA
possiamo avere dei tra di DNA Z e tra di DNA B ! il DNA può
essere cara erizzato dalla presenza sia di DNA B che di quello Z.

Esercizio
Calcolare il numero approssima vo di coppie di basi in 4 giri d’elica del DNA, se parliamo di DNA di
po B o di po A; calcolare quale è la lunghezza ver cale di 4 giri d’elica.

• In conformazione B abbiamo 10 basi per giro d’elica ! 40 basi per 4 giri d’elica.
• In conformazione A abbiamo 11 basi per giro d’elica ! 44 basi per 4 giri d’elica.
• Per calcolare la lunghezza dobbiamo mol plicare ques giri d’elica per 3,4 nanometri
(distanza per ogni giro d’elica per un DNA di po B).

STRUTTURE SECONDARIE INSOLITE DEL DNA

La stru ura che può assumere il DNA è legata alla sua composizione in basi; esistono quindi stru ure
che vengono de nite insolite, legate alla par colare stru ura del DNA.

1.DNA A TRIPLA ELICA

Tra di DNA di 20-30 bp, formato da lamento di sole
pirimidine e da lamento di sole purine; ques ul mi
possono accogliere nel loro solco maggiore una terza
catena di DNA fa a da sole pirimidine, quindi si creano dei
legami tra tre basi, di cui due saranno pirimidine e una di
purine, I legami che si andranno a formare, saranno legami
idrogeno non canonici, de LEGAMI DI HOOGSTEN.
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 Qui abbiamo esempi di legami di Hoogsten: la classica
coppia AT, che può interagire con un altro nucleo de che
porta una mina e va a formare degli ulteriori legami
idrogeno, u lizzando un acce ore di legami idrogeno, che
è l’azoto in posizione 7 dell’adenina oppure questo
donatore di legami idrogeno, gruppo amminico in
posizione 9 dell’adenina.

(Da ricordare legami classici tra adenina e mina, non

ulteriori legami Hoogsten che si possono formare, sapere
solo che si formano).

2.QUARTETTI DI G
Tra di DNA (o RNA) che contengono 3 o più G consecu ve. Si generano legami idrogeno tra
qua ro guanine, che formano quella che si chiama TETRADE. Queste tetradi si trovano ad
esempio a livello dei telomeri, quelle regioni terminali dei cromosomi. Questo po di stru ure si
possono trovare a livello del genoma, e sono state individuate la presenza di ques quarte di G
in cellule tumorali (stru ure insolite che possono portare ad una evoluzione potenzialmente
dannosa per il DNA). 3.RIPETIZIONI INVERTITE
Possono essere presen due copie
della stessa sequenza in
orientamento opposto; ripe zioni
adiacen che portano a quella che è
una sequenza palindromica, dove
possiamo leggere il DNA allo stesso
modo da destra verso sinistra.
Queste ripe zioni possono essere adiacen oppure separate da un breve
tra o di DNA in cui non vi è corrispondenza. Quando si veri cano questo
po di conformazioni, si possono formare delle 4. STRUTTURE CRUCIFORMI
! questo frammento di DNA, uno dei due lamen potrebbe associarsi
con sé stesso e non con il complementare dando luogo ad una stru ura di
questo po, ad una forcina (stru ura a croce).
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 5.DNA CURVO
Coppia di basi adiacen non perfe amente parallele
portano a piccoli ripiegamen .
B. Se perturbazioni casuali: stru ura un po’ irregolare ma
dri a
C. Se regolari, gli angoli si sommano e portano a curvatura
DNA.
Coppie di basi AT quando sono vicine tra di loro hanno la
tendenza a piegarsi nella direzione del solco minore, mentre
coppie di basi GC hanno la tendenza a piegarsi verso il solco
maggiore. Quindi la stru ura del DNA è naturalmente ondulata. Se in un tra o di DNA ci sono più di
2 coppie AT o coppie GC ripetute nello stesso giro d’elica, questo DNA si curverà e darà una stru ura
di questo po.

A ualmente l’individuazione di queste sequenze di DNA che possono produrre un’alterazione e che
possono entrare in contrasto con un eventuale esperimento non rappresenta un problema di
primaria importanza poiché sono sta inventa so ware che svolgono questo compito e che
indicano all’operatore quale parte della sequenza di DNA è meglio usare per evitare un eventuale
problema. Sostanzialmente inserendo in ques so ware la sequenza di DNA si hanno tu a una serie
di informazioni su quali par di DNA lavorare e su quali no e sul po di alterazioni che possono
creare le par sulle quali è sconsigliato lavorare. (il so ware quindi non ci dice solamente su quali
par lavorare e quali no ma anche per quale mo vo ci sono delle par sulle quali è sconsigliato
lavorare).
(Il DNA circolare è cos tuito da 84 bp. Rilassato con ene 8 giri di doppia elica. Una rimozione di un
giro porta a deformazione stru urale. La deformazione può essere riequilibrata da: -un super
avvolgimento; -oppure tramite la parziale separazione delle due catene a una distanza di circa 10 bp)
Il DNA dev’essere compa ato per trovare spazio all’interno della cellula, ma dev’essere anche
separato, come avviene durante i processi di TRASCRIZIONE e REPLICAZIONE. Questa separazione di
DNA deve avvenire in maniera tale che né la cellula né il DNA subiscano danni. In un DNA genomico,
si hanno delle tensioni stru urali dovute al fa o che il DNA vive in associazione con le proteine, le
quali rendono la stru ura per quel determinato frammento vincolata. Nel momento in cui il DNA che
si trova in una regione delimitata da due proteine deve essere trascri o, esso si aprirà e subirà delle
TENSIONI STRUTTURALI dovute alle proteine legate al DNA che quindi non è libero di aprirsi
totalmente. Quando il DNA va incontro a duplicazione o trascrizione subisce delle tensioni che
comportano dei SUPERAVVOLGIMENTI della doppia elica che portano la molecola di DNA ad un
livello energe co più alto. (un superavvolgimento può essere de nito come una riserva di energia
che viene acquisita dalla molecola di DNA)
Un DNA può essere de nito matema camente tramite un numero de o numero di legame o
LINKING NUMBER, ovvero il numero di volte che una catena ruota intorno all’altra. IL
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 LINKING NUMBER NON VARIA
MAI, neanche quando la doppia
elica subisce una torsione o una
deformazione.
Il linking number è dato dalla
somma dei TWISTING NUMBER,
ovvero le
torsioni (i giri di elica ogni tot paia
di basi a seconda del po di DNA)
e dei
WRITHING NUMBER, ovvero i
numeri di superavvolgimen .
LINKING NUMBER= n°torsioni+
n° superavvolgimen
Prendiamo in esempio un DNA
circolare che quindi non è
“compromesso” dal legame con delle proteine.
Una molecola di DNA di questo po, formata da 260bp, rilassata (cioè senza torsioni), in cui abbiamo
circa
10bp per giro d’elica (se si tra a di un DNA-B) avrà un twis ng number uguale a 25 e non avrà
superavvolgimen . Quindi il linking number sarà dato da LK= 25+0.

Se noi andiamo a srotolare questo DNA di due giri di elica il linking number non sarà più 25 ma sarà
23, sapendo però che questo numero non può variare, nel momento in cui il DNA viene svolto si
formeranno in maniera naturale dei superavvolgimen che compenseranno lo srotolamento del DNA
e la perdita di due giri d’elica, a questo punto il linking number sarà dato da LK=23+2.

Fondamentalmente il
disavvolgimento di una doppia elica
di DNA può essere “risolta” in due
modi, o si con nua la separazione
delle due catene di DNA (processo
che implica un grande dispendio
energe co e che quindi il DNA non
può a rontare), oppure
superavvolgendo le catene.

(Queste tensioni a cui è so oposto il

DNA sono con nue poiché il DNA è
con nuamente so oposto a even
come duplicazione e trascrizione.)

Quindi quando si parla di lnking number, si parla di PROPRIETÀ TOPOLOGICHE del DNA. La topologia
è uno studio matema co delle proprietà di un ogge o, le quali non cambiano nel momento in cui
questo ogge o viene so oposto a deformazioni. Quindi per quanto riguarda il DNA il linking number
non viene alterato dalla torsione o dal ripiegamento ma può essere modi cato solamente se
andiamo a dividere e poi ricongiungere completamente il DNA.
Lk è una proprietà topologica del DNA
Non varia quando la doppia elica subisce qualunque po di torsione o deformazione.
I super avvolgimen possono essere de ni in due modi; nega vo o posi vo.
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 Superavvolgimento nega vo! Il numero di
incroci tra i due lamen è inferiore rispe o
a quello del DNA lineare, quindi vi sono
meno giri d’elica rispe o a quelli del DNA
lineare

Superavvolgimento posi vo! Il numero di

incroci tra i due lamen è superiore
rispe o a quello del DNA lineare
Ques superavvolgimen , che siano essi
posi vi o nega vi, si veri cano sempre
quando un DNA si disavvolge, in maniera
speci ca i superavvolgimen posi vi si
hanno quando il DNA si apre in direzione
della forca replica va, i superavvolgimen
nega vi si hanno quando la bolla replica va si chiude, quindi in direzione opposta alla forca
replica va.
Man mano che si va avan nella trascrizione o nella duplicazione i superavvolgimen devono essere
risol altrimen il DNA non può con nuare a trascrivere o a replicare perché si creerebbero sempre
maggiori tensioni, i superavvolgimen vengono quindi risol da degli enzimi che sono prepos a
rimuovere i superavvolgimen che si formano man mano che il DNA viene replicato e trascri o,
ques enzimi sono le
TOPOISOMERASI (forme di DNA che di eriscono solo per il numero di legame stessa sequenza
nucleo dica ma diverso grado di superaavolgimento).
I topoisomeri di DNA si possono interconver re soltanto tagliando uno o entrambi i lamen del
DNA e poi ricongiungendoli.
Le topoisomerasi catalizzano questa reazione mediante un processo a tre tappi:
- taglio di uno o entrambi i lamen di DNA
- Passaggio di un segmento di DNA a raverso questa ro ura
- Chiusura della ro ura sul DNA
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 Le topoisomerasi sono di due pi

topoisomerasi di po I ! lavora tagliando un singolo

lamento, il quale una volta tagliato ruota intorno a quello
che rimane inta o per allentare la tensione stru urale
causata dal superavvolgimento e ricreare la situazione
iniziale. Questo po di isomerasi non ha bisogno di un
apporto energe co per svolgere questa azione poiché viene
tagliato un solo lamento e quindi i legami rimangono
“conserva ”.

Topoisomerasi di po II ! agiscono
legandosi e tagliando entrambi i
lamen del DNA i quali ruotano
entrambi allentando la tensione
stru urale ripris nando la
situazione iniziale. In questo caso,
poiché vengono taglia entrambi i
lamen di DNA sarà necessario
l’u lizzo di energia che verrà fornita
dell’ATP, percheè i legami non sono
conserva .

:
Ques passaggi svol dalle topoisomerasi, che avvengono a monte della forcella, sono obbligatori,
cioè devono necessariamente veri carsi altrimen man mano che progredisce lo srotolamento della
doppia elica ci sarebbero sempre più tensioni e l’ulteriore svolgimento della molecola non sarebbe
più possibile.
(N.B. le topoisomerasi non tagliano solamente i lamen di DNA ma li “ricuciono” anche)
(N.B. generalmente una cellula tende ad u lizzare la topoisomerasi di po I poiché non necessita di
un dispendio di energia ma in determinate condizioni in cui la tensione stru urale deve essere
risolta nella maniera più veloce possibile saranno preferite le topoisomerasi di poII)
Possiamo conoscere il grado di superavvolgimento di un DNA andando a monitorare la capacità di
questo di migrare su gel di agarosio, la quale è legata alla carica del DNA stesso, notando così che un
DNA superavvolto migra più velocemente rispe o a uno meno avvolto poiché i DNA superavvol
sono più compa .

Perché ci interessa conoscere il grado di superavvolgimento di un DNA?

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 Perché l’obie vo del biotecnologo è quello di manipolare e lavorare un DNA e di conseguenza
risulterà più di coltoso lavorare su un DNA superavvolto, quindi andando a valutare il grado di
superavvolgimento riesco ad individuare regioni di DNA, la cui sequenza rimane la stessa, più
disavvolto possibile per poterci lavorare. Quindi individuando il grado di superavvolgimento di un
DNA il biotecnologo può andare ad agire in vitro u lizzando delle topoisomerasi per andare a
rendere maggiormente svolto questo DNA, mantenendo inta a la sua sequenza, in maniera da
renderlo più facilmente u lizzabile in laboratorio.

ESERCIZI

➢ Cosa contribuisce alla speci cità dell’accoppiamento tra le basi? ! legami a idrogeno
➢ Hai tra ato due DNA circolari superavvol di diversa lunghezza, uno che ha 5775 bp ed uno
che ha 5781bp, con delle topoisomerasi di po uno e successivamente hai u lizzato una
ligasi per ria accare i due lamen , un tuo amico dice che ques due DNA sono
indis nguibili se fa migrare su gel di agarosio, tu invece a ermi che migreranno in maniera
diversa, perché hai ragione tu? (è un DNA di po B e abbiamo un giro d’elica ogni 10,5bp) !
Lk1= 5775/10,5=550(se il linking number è un numero intero signi ca che il DNA è
completamente rilassato)
Lk2=5781/10,5=550,57 (se il linking number NON è un numero intero vuol dire che il DNA
non è completamente rilassato ma parzialmente superavvolto perché la quan tà di basi che
sono presen non perme ono un disavvolgimento completo nonostante il DNA sia stato
tra ato con topoisomerasi).
Quindi i due frammen di DNA migreranno in maniera diversa poiché uno è totalmente
rilassato mentre l’altro è parzialmente superavvolto.

BIOLOGIA MOLECOLARE 09/03

L’RNA:
Il DNA è portatore dell’informazione gene ca, mentre gli e e ori dei compi della cellula e delle

sue funzioni sono le proteine e gli enzimi.

Si presupponeva che dovevano essere presen sin dall’inizio della vita. Acidi nucleici e proteine sono
molecole COMPLESSE e INTERDIPENDENTI; gli acidi nucleici hanno tu e quelle istruzioni e
informazioni che servono per far sì che si formino le proteine.

Il primo esperimento fa o nel 1953 da Miller-Urey provarono a simulare le condizioni

presen sulla Terra, poiché si cercava di capire in
che modo si potessero formare le
macromolecole e quali molecole fossero
comparse prima; dato che era improbabile che
acidi nucleici e proteine si fossero formate
contemporaneamente.

Riscaldarono con dell’acqua ammoniaca e

idrogeno e ad una miscela alla volta,
vaporizzata, hanno indo o un sistema che
simulava fulmini (scariche ele riche)
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 e hanno visto che dopo ra reddamento si andavano a formare dei compos organici.
Durante l’esperimento di Miller si o ennero alcuni compos come: formaldeide, acido ace co, urea,
acido la co.
Notarono che si formarono alcuni amminoacidi ➞ precursori delle proteine, per cui si pensava che
essi fossero cos tuen facili da sinte zzare in ambiente prebio co (in assenza di vita). Si pensava
dunque che fossero tali compos a dare origine alla vita.

Tale idea però venne ben presto abbandonata, e si guardarono sempre più gli acidi nucleici come
materiali necessari a nché si sviluppasse la vita.
Nasceva quindi l’idea di un mondo ad acidi nucleici, e in primis ad RNA
1. dato che è un acido nucleico meno complesso
2. dato che partecipa alla sintesi proteica
3. dato che si sapeva che era anche il cos tuente del materiale gene co per alcuni virus
L’idea originale quindi era che nel brodo primordiale si fossero formate prima le molecole di RNA,
che contenevano le informazioni gene che e consen vano lo svolgimento di funzioni enzima che.

Infa nel 1983 furono scoper i RIBOZIM , ossia molecole di RNA che hann capacità enzima ca.

Negli anni successivi ci furono però mol dubbi riguardo essi, poiché in realtà hanno proprietà
enzima ca ma non replicano se stessi ➞ si complicò quindi la comprensione dei meccanismi.

Nell’immagine si vede la formazione

dell’RNA, la sua evoluzione e come esso
imparò a duplicarsi e a sinte zzare proteine
che possono funzionare da catalizzatori (i
ribozimi).
Alcune di queste proteine hanno poi
permesso la formazione di acidi nucleici a
doppia elica, più stabili, che diventeranno
DNA ossia il principale portatore
dell’informazione gene ca.

PROBLEMI DEL MONDO AD RNA:

1. Come mai si è veri cata questa
evoluzione che ha portato alla
sos tuzione dei ribozimi con proteine più complesse? I ven amminoacidi AA contengono
una varietà di gruppi funzionali non presen nell’rna.
2. Come ha fa o quindi l’RNA, evolvendo, a creare degli amminoacidi che contengono una serie
di informazioni e gruppi funzionali che in realtà esso non possiede?
3. Perché il DNA ha sos tuito l’RNA? Dato che è più stabile, poiché l’RNA invece è più sensibile
all’idrolisi dato che è catalizzata da una base. Ricordiamo che la di erenza principale tra dna
ed rna è che a livello stru urale l’rna ha un gruppo ossidrilico in posizione 2 che il dna non
ha, quindi la maggiore stabilità è dovuta proprio a questo mo vo.
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 Si capì che nelle miscele del brodo primordiale molte
molecole organiche complesse non riuscirono ad
autoreplicarsi per cui scomparsero, mentre l’rna andò avan
nel tempo. Successivamente dunque si formò il mondo ad
RNA de o a RNP (RNA e PROTEINE), e in ne il DNA sos tuì l’rna dato che più stabile ➞
PORTATORE PRINCIPALE DELL’INFORMAZIONE GENETICA.

Slide con riassunto dei mondi che si sono

venu a creare durante l’evoluzione:
1.Ad RNA
2.Ad RNA e PROTEINE
3.A DNA, che però consente la formazione
di proteine tramite gli rna e quegli enzimi
che interagiscono con esso. L’rna ha
dunque un ruolo chiave, ma non solo per
quanto riguarda la formazione delle
proteine, ma anche poiché abbiamo una
quan tà enorme di piccoli rna (SMALL
NUCLEAR RNA), che sono rna non codificanti ma che hanno un ruolo importante nella
regolazione dell’espressione genica.

Alcuni scienzia , tra cui Watson e Crick, formarono il cosidde o CLUB DELLA CRAVATTA
DELL’RNA ➞ cercarono di capire come si trasme esse l’informazione gene ca, i passaggi a nché
avvenisse la sintesi proteica. Fu un sico teorico, Gamow, che suggerì l’idea per cui la stru ura del
dna fosse lo stampo per la sintesi delle proteine. Secondo lui era necessario che l’informazione
fosse scri a nella sequenza delle basi nucleo diche, ma non si capiva come solo 4 basi potessero
speci care per tu gli amminoacidi possibili. Propose dunque un codice a triplette e che fosse
l’rna a fare da tramite tra dna e proteine nella sintesi proteica. La sua idea fu acce ata e si fondò
tale club, così chiamato dato che nelle loro crava e era disegnata la stru ura dell’rna.

Nota di Crick del 1955: intuì che dovevano esistere degli rna che trasportavano gli amminoacidi

(tRNA) e sviluppò l’IPOTESI DELL’ADATTATORE ➞ ci doveva essere una stru ura che avrebbe
trasportato gli amminoacidi posizionandoli in modo da avere un conta o con l’acido nucleico, l’rna,
per far sì che si formassero le proteine.
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 STRUTTURA CHIMICA DELL’RNA:
● è a singolo lamento
● la stru ura portante è sempre quella
formata da zucchero-fosfato.

Di erenze:

- gruppo ossidrilico in posizione 2

- lo zucchero è il ribosio

- le basi azotate, che fanno parte della

stru ura, sono 4 ma non abbiamo le
timine bensì l’uracile ➞ poiché le
citosine nel dna subiscono una
deamminazione e si trasformano in
uracili, i quali non possono essere
presen in quanto vi sarebbe il mancato riconoscimento tra rna e dna.

➞ interazione tra Adenine e Uracili:

L’azoto in posizione 1 dell’adenina e l’azoto in 3 dell’uracile
formano un legame idrogeno e il gruppo amminico in
posizione 6 dell’adenina e il gruppo carbonilico in posizione
4 dell’uracile formano il secondo legame idrogeno. Abbiamo
sempre 2 legami idrogeno che si formano nonostante l’rna è
a singolo lamento, poiché tende a ripiegarsi per formare
delle stru ure SECONDARIE INTRAMOLECOLARI che sono
cara erizzate proprio dalla formazione di legami idrogeno
tra le basi azotate (G-C e A-U).

L’rna quindi va a formare delle eliche intramolecolari, che non saranno regolari quanto quelle che si
formano nel dna a causa della diversità stru urale (gruppo ossidrilico in posizione 2 nell’rna) che
impedisce all’rna la formazione della conformazione di po B.
Infa , mentre il dna può assumere più conformazioni, una molecola di rna al contrario forma solo
eliche di po A. Poiché l’ossigeno in posizione 2 sarebbe troppo vicino ai gruppi fosforici adiacen e
agli atomi della base successiva, e questo non perme e la formazione di una stru ura ordinata come
nel caso della conformazione di po B.
Nell’elica di po A invece l’atomo di ossigeno del gruppo OH sarà rivolto verso l’esterno, lontano dagli
altri atomi ➞ in questo caso ci sarà la possibilità di formare queste catene intramolecolari.

Principali differenze tra dna di po A e B: la profondità dei solch ➞ nell’rna di po A ci sarà

un solco minore che sarà più accessibile rispe o a quello maggiore.

Nel dna di po A avremmo un solco maggiore stre o e poco accessibile, abbiamo quindi dei
problemi di interazione con le proteine che devono interagire. Quello B invece è il più funzionale,
quello che si trova in vivo, per una corre o passaggio dell’informazione tra dna e proteine. In quello
di po A il solco minore è quello più esposto, sia nel dna che nell’ rna, ma comunque fornisce minori
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 informazioni, minori sequenze speci che rispe o a quello maggiore ➞ minore possibilità di
interazione con le proteine.

3 LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE:
L’Rna assume una stru ura che la induce a formare dei ripiegamen

- la struttura primaria è la sequenza dei ribonucleo di-fosfato ➞ legami covalen zucchero-

fosfato

- quelle secondarie e terziarie invece sono

date dalla formazione di ques legami
intramolecolari ➞ legami non covalen , per
lo più legam idrogeno ma anche interazioni
idrofobiche e di Van Der Waals.

Per cui, come nel dna, abbiamo diversi livelli di

organizzazione. (Primaria: legami covalen ;
Secondaria/terziaria: legami non covalen , legami a
H)

STRUTTURA SECONDARIA

Per stru ura secondaria intendiamo il ripiegamento dell’rna dovuto al legame tra basi
complementari ed è data da una combinazione di diversi even . Nella stru ura primaria dell’ rna si
possono formare tan ssimi legami intramolecolari, e tali legami contribuiranno all’energia libera
di questa stru ura. Tali stru ure saranno tanto più stabili quante più saranno le sequenze
complementari che si potranno formare. La stru ura favorita dell’rna è quella che ci consente di
valutare l’energia libera contenuta nella stru ura nale.

ENERGIA LIBERA: la possiamo calcolare calcolando la variazione dell’energia (Delta G) che ci

consente di valutare la spontaneità di un reazione chimica. Per quanto riguarda l’rna essa è data
dalla sommatoria di Delta Gi, di Delta Gx e di Delta Gu.

- Delta Gi energia necessaria per iniziare a formare la doppia elica, avrà un valore posi vo.

- Delta Gx somma di tu gli appaiamen che si vanno a veri care nella doppia elica, quindi
le interazioni tra le basi azotate. Avrà un valore nega vo.
- Delta Gu energia che si sviluppa ed è data dalle stru ure non appaiate tra loro, che quindi
destabilizzano l’elica intramolecolare dell’rna. Ha un valore posi vo.
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 Valore negativo/positivo:
Una reazione che rilascia energia è una reazione ESOERGONICA e avvien
spontaneamente ➞ Delta G è nega vo.

Le reazioni che richiedono energia sono invece ENDOERGONICHE ➞ Delta G è posi vo.

Più il Delta G è nega vo più sarà stabile questa stru ura.

Tu gli elemen che compongono la stru ura dell’rna contribuiscono alla stabilità della stru ura
secondaria, tu o nel suo complesso consen rà di de nire l’energia libera.

Un lamento di rna va ad assumere una

stru ura secondaria sulla base delle regioni
complementari intramolecolari che si possono
formare.
In questa immagine vediamo tu e le varie
stru ure secondarie che possono portare alla
stabilizzazione/destabilizzazione della
stru ura dell’rna.
Abbiamo per esempio gli STELI che si
producono per appaiamento di coppie di basi
complementari all’interno della stru ura,
sono elemen stabilizzanti , danno un contributo nega vo all’energia libera totale.

Tu e quelle zone che invece portano alla formazione di stru ure a singolo lamento sono invece
stru ure destabilizzanti . Regioni con gue di steli portano alla formazione di protuberanze, il
complesso delle FORCINE . Possono esserci poi delle GEMME ovvero delle basi che
protudono all’esterno e non sono appaiate con nessuna altra base.

Possiamo avere dei MISMATCH ovvero dei nucleo di che non possono formare un legame

canonico ( pico) ma si trovano l’uno di fronte all’altro respingendosi ➞ destabilizzano la

stru ura. Un esempio di appaiamento non canonico molto frequente nell’rna è quello tra le G e le

➞ un rna si posizionerà in modo tale da avere la maggior stabilità possibile.

FORCINE: abbiamo uno stelo con appaiamento di coppie di basi

azotate, poi una regione in cui le basi non sono appaiate e formano
un loop esterno e può essere più o meno grande (3-4-5 nucleo di,
quelli da 5 sono improbabili poiché destabilizzano troppo la
molecola). Se si forma un loop troppo destabilizzante esso viene
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 subito disavvolto perché
l’energia nega va data dallo stelo non viene compensata dall’energia posi va data dalla formazione
del loop.
GEMME: protuberanze che si formano da nucleo di non appaia su un
lamento, possono esserci delle basi non appaiate e maggiore è il numero di tali
basi maggiore è la destabilizzazione. Sono distorsioni che possono essere
presen .
INTERNAL LOOP: si veri cano quando tali gemme si dispongono l’una di fronte
all’altra a formare dei loop (simmetrici o asimmetrici) e destabilizzano la
stru ura dato che portano alla formazione di legami non compensa .
GIUNZIONE: si formano più regioni a doppio lamento in cui all’interno
possono crearsi dei loop interni o delle gemme che possono destabilizzare la
stru ura; ma se sono forma da un singolo nucleo de spaiato tale stru ura
è funzionale e termodinamicamente favorita nell’rna.
APPAIAMENTI NON CANONICI:

- appaiamen canonici di Watson e Crick: C-G e A-U

- appaiamen canonici di Hoogsteen interazione diversa tra A-U con formazione di altri
legami H
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 - appaiamen non canonici GU “Wobble”: interazione tra G-U vacillan , molto importan
perché sono un po di appaiamento che hanno permesso di spiegare perché nella sintesi
proteica alcuni an codoni degli rna transfer perme ono di legare più codoni degli rna
messaggeri. Infa , gli amminoacidi in totale sono 20 mentre i codoni di più (4^3, ossia 64)
dato che il codice è a triple e. I tRNA non sono però 64 (sono meno) e questo perché un
tRNA può legare diversi codoni, ossia più triple e ➞ hanno la possibilità di formare ques
accoppiamen vacillan : ovvero la terza base di una coppia codone-an codone in una
interazione tra tRNA e mRNA è un legame idrogeno alterna vo tra G e U. Spiegano quindi il
perché esistono meno tRNA rispe o al numero di codoni, quindi il mo vo per cui un tRNA
può leggere più codoni e non solo uno.

DIFFERENZE tra gli appaiamenti canonici e non

canonici:

Negli appaiamen canonici l’angolo che si viene a

formare nel LEGAME GLICOSIDICO è di circa 54 °

È invece diverso per quanto riguarda

l’appaiamento non canonico di G-U, ed è di 40 e 65 °. Questo divers
orientamento angolare tra le basi azotate e gli zuccheri è importante perché le proteine e gli enzimi
che legano l’rna legano in maniera unica ques si G-U, andando a riconoscere delle cara eris che
speci che di tali legami che sono chiaramente
diverse rispe o a tu gli altri appaiamen
(canonici e non). Perme ono quindi di avere un
riconoscimento unico da parte delle proteine
che dovranno leggere questo po di stru ura. Vi è
anche un ruolo funzionale.

Nell’rna possono formarsi altre stru ure

secondarie che lo cara erizzano. Quando abbiamo
delle ANSE nella stru ura, dato che portano
alla formazione di legami spaia , queste tendono a
destabilizzare la stru ura; ma esistono alcune anse che hanno la possibilità di andare a stabilizzare
la stru ura ➞ questo perché si vengono a creare delle interazioni idrofobiche di impilamento
tra le basi azotate.

Un esempio di queste stru ure è quella di un TETRALOOP : abbiamo una sequenza di basi
cara eris ca, cara erizzata da accoppiamen classici/non classici, dove si vengono a creare delle
interazioni idrofobiche sulla base della stru ura primaria dell’rna.
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 PSEUDONODI: è un’altra stru ura in cui le anse al posto di
destabilizzare stabilizzano la stru ura dell’rna.

Si formano appaiamen tra le basi dei loop che

cos tuiscono delle forcine vicine, consentendo quindi
delle interazioni. In questo modo due forcine che hanno
regioni destabilizzan , e che potrebbero portare a
destabilizzazione dell’rna, non provocano ciò poiché queste due anse si trovano vicine tra di loro e
consentono la formazione di pseudonodi (legami tra due anse). In condizioni idonee di ripiegamento
tale stru ura porta a una stabilizzazione.
Ques pseudonodi si possono formare anche tra
anse e regioni che non si sono ripiegate per
formare delle reazioni intracatenarie per
renderla una stru ura complessa.

➞ una stru ura secondaria di rna tenderà a

formare un maggior numero di legami
intracatenari legami H) che stabilizzano la
stru ura, oppure forze di impilamento tra le basi che si possono veri care anche in presenza
d stru ure destabilizzan come le anse.

STRUTTURE SECONDARIE RNA ➞ IMPORTANTI FUNZIONI BIOLOGICHE:

Questo accade anche senza che intervengano le proteine ad interagire con esse.

Un esempio, proveniente dalla patogenesi ba erica, è la Listeria

I ba eri patogeni esprimono i geni per la virulenza, responsabili delle mala e negli animali, non
all’esterno dell’ospite bensì questa
espressione deve essere indotta da
s moli all’interno dell’animale. Un esempio di
tali s moli è la temperatura, che è più
elevata all’interno che all’esterno
dell’animale.
Ques geni della virulenza sono a va da un
fattore di trascrizione , de o PrfA, e la
sintesi di questo è controllata da una regione
a monte dell’rn messaggero che
con ene un RBS (ribosome binding site
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 ➞ sito di legame per i ribosomi per iniziare la sintesi). A basse temperature i ribosomi non possono
interagire con RBS e non si avrà la sintesi del fa ore PrfA. A 37 gradi questo meccanismo funziona e i
ribosomi si possono legare all’RBS libero e verrà prodo a la proteina PrfA responsabile della
virulenza.

Per cui la stru ura secondaria ha un importante ruolo biologico , infa la su perdita (a causa
della temperatura) consente la formazione di proteine che altrimen non si sarebbero potute
formare.

La stru ura secondaria del tRNA in realtà è una sempli cazione (stru ura a trifoglio) poiché dal
momento in cui la osserviamo da un punto di vista tridimensionale ci risulta una stru ura più
complessa (L rovesciata).

Le stru ure che cara erizzano una molecola biologica sono quelle a maggior distanza tra di loro
➞ l’an codone si troverà sempre a una massima distanza rispe o al braccio e e ore
ovvero quello che porterà l’amminoacido. Anch nella stru ura tridimensionale queste due
stru ure del tRNA saranno a una distanza maggiore.

L’rna deve subire un ripiegamento per raggiungere una corre a stru ura, ma può succedere che gli
rna assumano una stru ura tridimensionalmente corre a ma non funzionale per quel par colare
rna.

Per far sì che l’rna si ripieghi corre amente per raggiungere una stru ura termodinamicamente
favorita e che sia anche funzionale devono
intervenire alcune proteine, le PROTEINE
CHAPERON.

Queste sono proteine che accompagnano l’rna e

contribuiscono al suo corre o ripiegamento.
Possono legarsi ad esempio a delle anse , che
sono stru ure destabilizzan , in modo da
stabilizzarle e farà assumere un corre o
ripiegamento che por allo
stato funzionale dell’rna.

RIBOZIMI: alcuni rna hanno la proprietà di catalizzare reazioni chimiche. Ques

ribozimi sono in grado di andare a catalizzare il taglio dei legami fosfodiesterici presen
all’interno della stessa molecola di rna o di altre. Un ribozima noto è quello che catalizza la
formazione del LEGAME PEPTIDICO . Un altro ribozima è l’RNASI P
RIBONUCLEASI, che è coinvolto nella formazione e maturazione degli rna transfer e agisce
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 andando a rimuovere un segmento all’estremità 5’
di un rna precursore.

ESERCIZI:
1) - GENOMA : La totalità delle
informazioni gene che presen nel dna di
una cellula o di un organismo;
2) - DOPPIA ELICA : La stru ura
tridimensionale del dna, formata da due catene di dna tenute insieme da legami H tra le basi
e arrotolate una a orno all’altra;
3) GENE: elemento contenente informazioni che controlla una cara eris ca ereditaria
discreta;
4) ANTIPARALLELO: descrive l’orientamento rela vo dei due li in un elica del dna; la
polarità di un lamento è orientata nella direzione opposto a quella dell’altro lamento;
5) COPPIA DI PAIA DI BASI: due nucleo di in una molecola di rna o dna tenu insieme da
legami H.

Le cellule umane non contengono molecole circolari di dna: FALSO , poiché le molecole di dna
mitocondriale sono circolari.

Problema 1:
L’inizio della regione codi cante per il gene della beta globina umana 5’-ATGGTGCAC-3’. Qual è la
sequenza del lo complementare per questo segmento di dna? GTGCACCAT

Problema 2: basarsi sul modello spazio pieno

gura 1 ➞ TA gura 2 ➞ CG

Problema 3:
Il dna isolato dal virus M13 con ene 25% A, 33% T,
22% C e il 20% G. Ques risulta sembrano
par colari? Perché o perché no? Come potres
spiegare ques valori? Sono risulta par colari poiché non vi è il corre o appaiamento tra le basi ➞
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 le percentuali sono diverse dato che si tra a di un dna virale (possono non essere a doppio
lamento).

Problema 4:
A bisogna mol plicare 0,34 nm x 6,4 * 10^9 bp = 2,18 m

(circa)
B per o enere la frazione di V del
nucleo occupato dal dna bisogna fare il
rapporto tra V del dna e quello del
nucleo; sapendo il V della sfera e V del
cilindro e sapendo che i rispe vi raggi
sono la metà dei rispe vi diametri.
Calcoli…

Problema 5:
Il dna è il materiale gene co
perché abbiamo visto nella
progenie la presenza di fosfato e
non di zolfo e, il fosfato è un
elemento degli acidi nucleici,
mentre lo zolfo delle proteine.
È un esperimento importante
per la biologia molecolare, ma
fecero alcuni errori: durante
alcuni passaggi della
manipolazione delle cellule era
presente una certa quan tà di
zolfo 35 nella progenie (non possibile nella realtà) ma ciò era dovuto a errori sperimentali; inoltre
non tu e le proteine in realtà possono essere marcate con lo zolfo 35 portato dalla me onina poiché
non tu e possedevano come aminoacido la me onina nella sequenza. U lizzarono la me onina
marcata con zolfo 35 poiché sappiamo che la me onina è l'amminoacido che viene solitamente
trasportato per primo dal tRNA e quindi solitamente presente, ma ciò in realtà non accade in tu e le
proteine.

Biologia molecolare 16-17 marzo

CROMOSOMI
Noi sappiamo che le dimensioni dell’acido nucleico sono molto maggiori del compar mento in cui
esso è contenuto. Nei diversi organismi abbiamo diversi acidi nucleici (virus, procario e eucario ) e
vediamo come varia la grandezza dell’acido nucleico, ma abbiamo sempre una stru ura che ha
lunghezza superiore al compar mento dove deve essere inserito. Infa , abbiamo de o che nel
nucleo umano il DNA ha quasi 2 metri di lunghezza, che dovrà essere compar mentalizzato in un
nucleo la cui grandezza varia dai 5 agli 8 micron. Quindi il DNA per potersi organizzare all’interno di
questo spazio si distribuisce nei cromosomi (nell’uomo abbiamo 3,2 x 109 coppie di nucleo di
distribuite in 24 cromosomi, ogni coppia di cromosomi con ene un cromosoma di origine paterno e
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 uno di origine materno). Quindi abbiamo i cromosomi presen in coppie nelle cellule soma che e i
membri di ogni coppia sono i cromosomi omologhi. Se una cellula possiede due cromosmi diogni
po si dice che possiede un corredo cromosomico DIPLOIDE. Se è presente un cromosoma di ogni
coppia avremo un corredo APLOIDE. (l’uomo ha un corredo diploide in quanto ha 46 cromosomi).
Di erenza tra genoma cellulare e genoma virale
Nel genoma cellulare le dimensioni sono inde nite, perché la sequenza cambierà anche sulla base di
un riarrangiamento che avviene a livello del genoma con tu quei meccanismi di duplicazione e
delezione che si possono veri care. Per cui nel genoma cellulare il compa amento andrà a
richiedere un metodo generalizzato per compa are il DNA.
Nel genoma virale invece la quan tà di acido nucleico da compa are è predeterminata e deve
ada arsi all’interno di un rives mento pre-assemblato. Non si hanno quei fenomeni di
riarrangiamento che si veri cano nel genoma cellulare
Impacche amento del genoma virale
Il genoma in un virus è contenuto all’interno di un CAPSIDE (stru ura chiusa composta da subunità
iden che che interagiscono a raverso interazioni speci che), che deve essere su cientemente
grande in modo da racchiudere il genoma virale, quindi tendenzialmente il volume del capside è circa
uguale al volume del genoma che va a contenere. Per quanto riguarda i virus la quan tà di materiale
presente è legata alla tendenza ad avere il minor numero di informazioni possibili, ovvero verrà
formato un numero limitato di specie proteiche e saranno quelle che serviranno al virus per
duplicarsi e mantenersi. Possibili stru ure che possono essere presen hanno 3 pi di simmetria:
- Tetraedrica (4 facce triangolari), 12 subunità
- Cubica (6 facce quadrate), 24 subunità
- Icosaedrica (20 facce triangolari), 60 subunità
Per quanto riguarda i virus anche se la simmetria preferita e più e ciente è quella icosaedrica.
I modi in cui il genoma si assembla all’interno di questa stru ura sono
principalmente due:
- Il rives mento proteico si assembla intorno all’acido nucleico: per i
VIRUS A RNA (simmetria elicoidale o icosaedrica)
- L’acido nucleico viene inserito dopo che il capside è stato formato: per i
VIRUS A DNA (simmetria icosaedrica)

Quindi nei virus a RNA sulla molecola di RNA si vanno assemblando in maniera progressiva le varie
subunità iden che delle proteine e che vanno ad interagire on l’RNA. Questo assemblaggio non
avviene in maniera casuale ma avviene in corrispondenza di speci che stru ure secondarie dell’RNA
(stru ure a forcina), che servono come centro di nucleazione per l’assemblaggio della stru ura
proteica che lo dovrà contenere. Queste subunità proteiche si vanno a disporre formando un’elica e
l’RNA si avvolge con un andamento ad elica alla faccia interna dell’involucro.

Nei virus a DNA, quindi virus icosaedrici, la situazione è diversa. In questo caso abbiamo un
precursore della testa del contenitore del virus vuoto, che va ad impacche are e inglobare le
par celle di acido nucleico. Quindi questo guscio della testa pieno precos tuito viene conver to in
guscio vuoto che poi andrà ad incorporare l’acido nucleico; la testa quindi si riempie di acido nucleico
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 e poi si a acca la coda alla stru ura. L’inserimento del DNA all’interno della testa
comporta due reazioni: reazioni di condensazione e reazioni di traslocazione, ovvero il
DNA viene spinto nella testa tramite un meccanismo che sarà dipendente dall’ATP
(quindi è richiesta energia). Un enzima chiave nel processo di inserimento dell’acido
nucleico nella testa di un virus è l’ENZIMA TERMINASI, che è un enzima che andrà a
catalizzare la reazione di taglio del DNA per far sì che venga inserito nel capside.
Quindi le terminasi vanno a reclutare il capside e poi tramite un meccanismo che
dipende dall’ATP viene spinto il DNA all’interno della stru ura proteica.
Impacche amento del genoma ba erico
Nei ba eri il DNA è inserito in una stru ura ben compar mentalizzata come quella
nucleare ma forma quello che viene de o un NUCLEOIDE COMPATTO, ossia una massa
di materiale gene co che va ad occupare 1/3 del volume di una cellula. In questa
immagine vediamo un nucleoide che fuoriesce da una cellula che è stata so oposta a
lisi e quando fuoriesce ha la stru ura di una bra piena di anse.
All’interno della cellula procario ca il cromosoma della cellula è formato da un’unica
molecola di DNA e questa molecola è organizzata in una serie di anse (che sono circa un cen naio).
Ogni ansa sarà stru urata da più o meno 40.000 coppie di paia di basi e ciascuna ansa sarà ancorata
alla base da una stru ura che non è stata ancora ben de nita (pallini) che tende a formare le anse
separate e che hanno una serie di domini indipenden . Queste anse possono subire dei
superavvolgimen (anche se il DNA è più semplice di quello di una cellula eucario ca deve
comunque inserirsi in una stru ura ben de nita e dovrà subire anch’esso delle modi cazioni
stru urali).

Si possono avere due pi di superavvolgimen :

-PLECTONEMICO, la doppia elica si avvolge su sé stessa,
quindi il DNA super avvolto è libero (percorso non
ristre o)
-TOROIDALE, ovvero la doppia elica si avvolge intorno ad
una proteina simil-istoniche (meccanismo simile a quello
delle cellule eucario che in cui il DNA si avvolge intorno
agli istoni). La maggior parte di queste proteine sono
simili agli istoni, di natura basica che formano dei dimeri
che hanno la funzione di andare a compa are il DNA
nelle cellule procario che. (Percorso ristre o).
Impacche amento (ed organizzazione) del genoma eucario co
La lamina nucleare del nucleo eucario co è composta da tu a una serie di bre, inoltre anche nel
DNA eucario co abbiamo tu a una serie di anse e domini che sono a accate ad un’impalcatura. Il
DNA si va a legare a questa impalcatura a livello della stru ura nucleare, a livello di regioni che sono
ben cara erizzate, a livello di speci che sequenza, quelle che vengono chiamate Matrix A achment
Regions (MAR) [o Sca old A achment Regions (SAR)]. Parliamo di MAR quando ci riferiamo a quelle
regioni che legano alla matrice nucleare durante l’interfase; mentre parliamo di SAR quando ci
riferiamo a quelle sequenze che si legano all’impalcatura nei cromosomi durante la fase mito ca (ma
sono sempre lo stesso po di stru ure di ancoraggio). Si ha la possibilità di u lizzare degli enzimi
speci ci (nucleasi di restrizione) che vanno a tagliare soltanto le sequenze MAR presunte che vanno a
restare a accate alla matrice. In biologia molecolare possiamo sfru are ques enzimi per tagliare il
DNA in posizioni speci che, per cui noi sapendo dove tagliamo sappiamo anche la natura del
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 prodo o che ci possiamo aspe are; per cui possiamo estrarre delle sequenze speci che e
analizzarle.
Nei cromosomi abbiamo un singolo duplex di DNA, questo duplex è molto lungo e viene ripiegato in
delle bre che vanno a percorrere completamente il cromosoma.
I cromosmi sono una forma condensata di croma na, formata da DNA e proteine insieme. La
croma na la possiamo dividere in due materiali:
- EUCROMATINA, regioni cromosomiche non condensate che hanno la capacità di essere
a vamente trascri e, per cui sono ricche di geni (alta densità genica)
- ETEROCROMTINA, regioni cromosomiche molto dense e compa e in cui i nucleosomi sono
molto ravvicina (per lo più in corrispondenza dei centromeri). L’eterocroma na nel
complesso va a cos tuire circa l’80% del DNA nucleare. Sono porzioni di DNA ina ve, quindi
non vengono trascri e. Queste bre di eterocroma na possono passare da eterocroma na
ad eucroma na e viceversa, in ogni momento a seconda della necessità della cellula diversi
sta di condensazione del materiale gene co presente.
Tramite un microscopio o co le bre di croma na sono dis nguibili.
L’eterocroma na può esistere in due forme:
- ETEROCROMATINA COSTITUTIVA, stru ura ripe va che non ha valore genico e non andrà
mai a codi care. Rappresenta i segmen iden ci cromosomici che conservano durante tu o
il ciclo cellulare un aspe o condensato. Es. braccio lungo del cromsoma Y nell’uomo;
- ETEROCRMATINA FACOLTATIVA, che può passare ad eucroma na, ovvero a croma na a va.
In questa condizione i geni sono repressi, ma possono essere a va se questa
eterocroma na diventa eucroma na.
Quindi la completa ina vazione di un segmento di cromosoma non porta ad una alterazione della
sua stru ura genica e inoltre le sequenze dei geni che sono accesi o spen in un determinato po di
cellula sono diversi; infa , i geni che vengono espressi dalle varie cellule non sono sempre gli stessi.
Quindi alla base della di erenziazione cellulare c’è l fa o che i geni che ogni singola cellula esprime e
che vanno a produrre determinate proteine sono diverse, perché a quella determinata cellula
serviranno solo quei determina geni (fermorestando che il po di materiale gene co è uguale per
tu e le cellule).

Si può osservare, in questa immagine, un diverso bandeggio dei

cromosomi che vengono colora con delle sostanze apposite e in
questo modo le possiamo andare a visualizzare al microscopio.
[il bandeggio dei cromosomi non lo spiega perché già fa o a
gene ca]
Bandaggio GIemsa: bande chiare, de e G-nega ve e bande scure,
de e G-posi ve.
(Giemsa ha a nità per regioni ricche in AT, le cui proteine associate
sono facili da denaturare e digerire per via enzima ca)
Bandaggio R (reverse): denaturazione al calore (regioni ricche di AT) seguita da colorazione Giemsa.
Le bande scure sono regioni ricche in GC, le bande chiare sono ricche di AT (inverso del bandaggio G).
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 La posizione del centromero perme e di classi care i cromosomi in 4 pi:
- acrocentrici: centromero in posizione terminale
- Telocentrici: centromero in posizione su terminale
- Submetacentrici: centromero in posizione sub mediana
- Metacentrici: centromero in posizione mediana
CARIOTIPO: è l’immagine del completo corredo dei 46 cromosomi . Si o ene:
1. S molazione alla divisione cellulare
2. La colchicina blocca la divisione cellulare nella metafase
3. In soluzione ipotro ca le cellule vengono fa e scoppiare per liberare i cromosomi
4. I cromosomi vengono colora , osserva al microscopio e fotografa
5. Si cercano nelle foto le coppie di cromosomi omologhi e si dispongono in ordine dal più piccolo al
più grande.
Il cario po umano presenta il cromosoma y.
Se un tra o di cromosoma si è perso o si è trasferito su un altro cromosoma, viene rivelato dal
cambiamento del bandaggio.

Quando pensiamo alla stru ura genomica del

DNA, ed i vari cromosomi li immaginiamo come un
pezzo fortemente compa o; i cromosomi
appaiono compa a , ma nella stru ura nucleare
di una cellula tra i vari fenomeni di divisione
cellulare, i cromosomi assumono determinate
cara eris che: vanno ad occupare degli spazi
speci ci, occupano delle regioni dis nte
all’interno del nucleo cellulare, quindi è stato
notato che la localizzazione dei singoli cromosomi
all’interno del nucleo non è casuale (qui i diversi
colori stanno ad indicare la diversa possibile
disposizione all’interno di un nucleo dei vari cromosomi). Ques sono esperimen che sono sta fa
e che hanno mostrato che una diversa occupazione territoriale dei cromosomi all’interno del nucleo,
si parla di TERRITORI CROMOSOMICI, in cui dis n domini di croma na all’interno del nucleo sono
stru ura in maniera tale da avere dei canali di croma na occupa e collega da zone che vanno a
separare i vari cromosomi; nell’immagine si vede come i vari colori stanno ad indicare vari territori
cromosomici nella stru ura nucleare, e poi delle intra-stru ure che si chiamano NUCLEAR SPECKLE,
che sono piccole membranelle sub-nucleari, che tendono a perme ere che ci siano ques domini di
inter-croma na, che perme ono la comunicazione tra i vari territori cromosomiali. Sono importan
perché si sta cercando di capire l’esa o mo vo per cui i cromosomi occupano quello spazio e non un
altro, ma sopra u o si è visto che queste stru ure inter-croma niche sono fondamentali perché
contengono materiali di riserva che serviranno al vario materiale gene co presente nei diversi
cromosomi per portare avan il processo di trascrizione e i processi di maturazione dei messaggeri.
Quindi all’interno della stru ura nucleare c’è una chiara organizzazione croma nica, che porta i vari
cromosomi a dividersi il nucleo e organizzarsi in territori.
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 Vediamo ancora il nucleo, i domini inter-cromosomici, i territori cromosomici: un’organizzazione di
questo po, probabilmente di po radiale, è stata dimostrata per i diversi territori cromosomici ed è
stato visto che questa speci ca composizione territoriale è correlata con la diversa densità genica
(cromosomi che contengono più geni occuperanno uno spazio diverso, quindi cromosomi ricchi di
geni vanno ad occupare regioni interne del nucleo, mentre cromosomi che sono poveri di geni vanno
a localizzarsi intorno alla periferia). E’ una stru ura che porta a compar mentalizzare i vari
cromosomi, ma che è altamente dinamica proprio per le interazioni che può avere con quelle
proteine che sono all’interno di ques domini cromosomici e quindi i geni sono anche in grado, nel
momento in cui vengono accesi, di muoversi dalla periferia verso l’interno, oppure in direzione
opposta se vengono spen ! organizzazione stabilita con posizionamento dei cromosomi a
seconda della loro natura genica in diverse posizioni della stru ura nucleare.
Altra immagine che mostra quali sono i modelli
che descrivono la disposizione di ques territori
cromosomici: questo è un modello proposto che
viene chiamato CT-IC, ovvero CT sta per territori
cromosomici e IC sta per compar mento inter-
croma na che si trova tra i vari territori
cromosomici (una sorta di rete di croma na
associata ad uno spazio inter-cromosomico ICN,
un “network” che si va ad instaurare all’interno
della cellula eucario ca, in cui i vari cromosomi si trovano in determina disposizioni speci che e
sono tra di loro interconnessi grazie a questa rete inter-croma nica che con ene delle proteine
importan anche perché contengono tu o il macchinario fondamentale per la maturazione e al
processamento dei messaggeri, e quindi dei geni).
ALCUNE ORGANIZZAZIONI ATIPICHE DI CROMOSOMI E GENOMI
Cromosomi a spazzola: (croma ci tenu insieme in corrispondenza dei chiasmi) sono presen in
diversi organismi, tra cui negli an bi; sono forme di cromosoma che sono molto estese ed hanno
un’alta a vità trascrizionale (sono molto studia proprio per la natura di alta trascrizione che si
veri ca a livello delle anse che si formano). Queste anse sono circondate da una serie di
ribonucleoproteine che contengono l’RNA, e sono prese come modello per lo studio della
trascrizione.
Cromosomi politenici: (FUNZIONE: aumentare il volume cellulare
ma anche un vantaggio metabolico. L’elevato numero di coppie di
geni perme e un alto livello di espressione genica). Altro modello
u lizzato per lo studio della trascrizione e dell’organizzazione dei
cromosomi perché in ques pi di cromosomi è possibile andare a
studiare le singole unità trascrizionali, quindi un altro possibile
esempio di cromosoma da u lizzare per lo studio della regolazione
dell’espressione genica; si vengono a formare alcune stru ure cara eris che, quando questo
materiale forma delle estrusioni all’interno (queste estrusioni sono di
DNA che risulta molto a vo a livello trascrizionale, ed è cara erizzato
dalla presenza di un gran numero di geni e può essere studiato questo
materiale che si può vedere nell’immagine, chiamato PUFF o ANELLI DI
BALDIANI, da colui che li ha cara erizza ; è un po di cromosoma che
siccome ha queste cara eris che stru urali, viene preso a modello per
studiare la trascrizione).
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 Abbiamo una stru ura cromosomica che è il CENTROMERO, la
regione a cui si a accano le bre del fuso durante la mitosi; è
quella stru ura che assicura una corre a segregazione.
Nell’immagine si può visualizzare oltre al centromero, anche il
CINETOCORE, che è quella stru ura proteica che compone il
centromero (di solito per ogni centromero abbiamo due cinetocori, uno per ogni croma dio). Il ruolo
del cinetocore è di agganciarsi ai microtubuli del fuso mito co.

Sequenze di DNA responsabili della segregazione ! molecole di DNA che devono spostarsi in
maniera appropriata durante la divisione cellulare. Sono i frammen CEN, ovvero frammen di DNA
che contengono i centromeri. Sono cara erizza da tre sequenze speci che, CDE I, CDE II e CDE III
(CDE sta per Centromeric DNA Elements). Sono stru ure che conferiscono stabilità, sono
intercambiabili tra i cromosomi. I centromeri servono solo per a accare i cromosomi al fuso, non per
dis nguere tra di loro i cromosomi. La sequenza che cara erizza il DNA di queste stru ure è
cos tuita per la maggior parte da A e T, sulla base del fa o che ci sono meno interazioni (legami
idrogeno) possibili, quindi è più facile la loro separazione.
In questa immagine vediamo tu e le proteine che sono coinvolte
nell’interazione ai vari frammen CEN (CDE I, CDE II, CDE III),
ovvero proteine responsabili dell’interazione con il DNA
presente nei centromeri, che perme eranno l’interazione con
tu e quelle proteine che saranno responsabili della connessione
al microtubulo.

Il bandeggio C è quello che serve per andare a iden care i centromeri, in cui si andrà a colorare
sele vamente solo l’eterocroma na nelle regioni che si trovano a orno al centromero (si andranno
a colorare quelle sequenze di DNA ricche in AT).
Molecola di DNA mancante del centromero non segrega in modo appropriato.

TELOMERI
Sono le estremità delle molecole di DNA (che essendo instabile ed essendo potenzialmente
so oposte a degradazione da parte di esonucleasi, c’è necessità che queste estremità vadano
prote e con stru ure telomeriche). Per la scoperta e la cara erizzazione del ruolo dei telomeri ques
tre ricercatori (Blackburn, Greider, Szostak) hanno vinto il Nobel nel 2009, per la comprensione del
ruolo che ha l’enzima che consente la formazione ed il mantenimento dei telomeri, ovvero la
telomerasi (come è possibile che i cromosomi vengano prote dalla degradazione).
I telomeri sono forma da una lunga serie di sequenze brevi e ripetute (GGGTTA, GGGTTA, e via
dicendo...). Di ques due lamen di DNA, a livello dei telomeri, uno dei due è de o lamento
sporgente o overhang, perché è più lungo di circa 12-16 nucleo di (termina con un’estremità libera
al 3’ ed è ricco di G).
Con quale meccanismo i telomeri riescono a conferire stabilità alle estremità dei cromosomi? Con
un meccanismo proprio cara erizzante dalla stru ura di questa sequenza telomerica, che porta alla
formazione di quelle forme di DNA insolito (legato alla formazione, per esempio del quarte o di G,
serie di G consecu ve che se ripetute nella stru ura del lamento sporgente, perme ono al
lamento di ripiegarsi su sé stesso, tranne quegli appaiamen che portano a legarsi tra di loro i vari
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 residui G, andando a formare una forcina chiamata quarte o di G. Il quarte o di G è legato a G che
tra loro appartengono a ripe zioni diverse). I quarte di G sono stabilizza a raverso la sequenza di
un ca one monovalente, che si va a disporre al centro della tetrade (nella maggior parte dei casi
questo ca one è il potassio). Il ruolo che hanno la formazione del quarte o di G con l’interazione del
potassio è quello di ridurre l’a vità della telomerasi, che porterebbe ad una estensione con nua dei
telomeri (quando invece è completo, si va a ripiegare andando a formare i quarte di G che
stabilizzano il telomero).

Meccanismi di stabilità alle estremità ! formazione dei quarte di G; formazione di par colari
altre stru ure all’interno del DNA telomerico, che sono delle anse che si chiamano T-loop (protegge
da nucleari e da a vità cellulari potenzialmente dannose, ex le proteine coinvolte nella
riparazione) o D-loop (il lamento ricco in G rimuove un elica e viene a formarsi unaD, o loop di
sfasamento).
In alto il nostro lamento sporgente con le subunità ripetute
TTAGGG; si forma un’ansa quando l’estremità 3’ del telomero,
quella sporgente, sposta la stessa sequenza in una regione a
monte del telomero (quindi la regione a singolo lamento al 3’ si
ripiega e si appaia a delle sequenze esameriche complementari,
ovvero le sequenze AATCCC, che si trovano nella porzione del DNA,
che è ancora a doppio lamento). Viene rimossa una porzione di
elica e si forma una sorta di D (una D rovesciata). Si chiama D-loop
perché appunto ha la forma di una D rovesciata oppure la le era D
può indicare anche Displacement loop, perché va a spiazzare il
doppio lamento, oppure T-loop che può indicare Telomeric loop ! quindi stru ure ad ansa che si
vengono a creare all’interno della sequenza telomerica per andarvi a creare stabilità (queste anse
vanno a proteggere le estremità cromosomica dalle nucleasi e da tu e le a vità cellulari che
possono essere dannose per l’integrità, come proteine che possono essere coinvolte nella
riparazione, perché un DNA a singolo lamento è più esposto e potrebbe essere più susce bile).
Per fare in modo che tu o ciò avvenga, sarà
necessario l’intervento di una serie di proteine
che perme ono la formazione di queste anse: ci
sono proteine che si chiamano TRF1 E TRF2, che
andranno a legarsi alle ripe zioni TTAGGG,
ovvero le sequenze ripetute a livello del
lamento sporgente (si chiamano così perché sta
per Telomeric Repeat binding Factors); le
principali funzioni di un complesso proteico che perme e l’interazione tra le varie proteine TRF1 e
TRF2 con il DNA, è di preservare e proteggere la stabilità del telomero e regolarne l’a vità (le varie
proteine sono necessarie per la formazione dei loop e per stabilizzare i telomeri). Nell’immagine ci
sono altre proteine che intervengono, una da ricordare è quella che si chiama POT1, che sta per
Protec on of Telomeres, e questa proteina si lega alla regione a singola elica quando viene spiazzato
dal 3’ sporgente che va ad interagire con le sequenze complementari e si forma il D-loop. La
formazione di queste stru ure porterà al fa o che non ci sarà un’estremità libera e che il cromosoma
sarà stabilizzato.
I telomeri sono necessari alla sopravvivenza, perché nelle cellule eucario che si ha un problema
rela vo alla duplicazione: durante questo processo, la doppia elica viene denaturata, la polimerasi
va a catalizzare la formazione del DNA di nuova sintesi, ma dei due lamen uno viene sinte zzato in
maniera con nua e uno in maniera discon nua. Nel momento in cui abbiamo la ne della
replicazione, per i procario il problema non sussiste poiché c’è un incontro delle due forcelle
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 replica ve e si ha a livello dei si di terminazione (si
TER); negli eucario , dove la stru ura dei cromosomi è
lineare, non esiste un sito TER, e alla ne della
duplicazione si ha sempre un lamento ritardato che
sarà sempre duplicato in maniera incompleta. Questo
lamento ritardato avrà sempre delle lacune
all’estremità 5’, perché ci sarà la rimozione del primer
di RNA, che era stato necessario per innescare la
polimerasi: qui intervengono le TELOMERASI, che
hanno il compito di andare a creare le condizioni
necessarie per far sì che venga colmata questa lacuna
di DNA, che si è venuta a creare all’estremità
cromosomica (hanno il ruolo di mantenere la lunghezza
delle estremità).
TELOMERI E TUMORI
È stato dimostrato che la telomerasi è espressa nella grande maggioranza dei tumori. Telomerasi
sembra essere necessaria per lo sviluppo e la proliferazione del tumore
APOPTOSI E TELOMERI
L’accorciamento telomerico può indurre apoptosi. L’alterazione della stru ura telomerica può portare
a: - riarda già en cromosomici, - a vazione dei checkpoints, - aumento dell’apoptosi.
TELOMERI E SENESCENZA
La lunghezza dei telomeri rappresenta l’età biologica di un individuo.
Il compa amento del DNA nei cromosomi fa sì che il materiale gene co possa entrare in uno spazio
ristre o in maniera da essere prote o da eventuali danni, da avere una certa stabilità e per
perme ere una corre a espressione dell’informazione.
I gradi di compa amento del DNA sono diversi, esso viene compa ato circa 10.000 volte e passa da
una lunghezza espressa in cen metri ad una espressa in micron. Per raggiungere questo grado di
compa amento bisogna a raversare diversi stadi:

1. ASSOCIAZIONE TRA DNA ED ISTONI! L’associazione di DNA ed istoni va a formare il

NUCLEOSOMA
2. ASSOCIAZIONE TRA I NUCLEOSOMI
Nel momento in cui il DNA si compa a risulterà meno accessibile alle proteine, quindi diminuirà
l’interazione DNA-proteine e diminuirà di conseguenza il metabolismo del DNA.
Possiamo parlare di tre livelli di ripiegamento del DNA all’interno della stru ura nucleare ovvero:
• LA FORMAZIONE DI NUCLEOSOMI
• FILAMENTI DA 30 nm
• ANSE RADIALI
I° LIVELLO DI RIPIEGAMENTO, I NUCLEOSOMI
I nucleosomi sono l’unità di impacche amento della croma na, che si forma a seguito
dell’interazione tra il DNA e le proteine istoniche.
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 Gli istoni sono le proteine più abbondan associate al DNA e sono di 5 pi; H2A, H2B, H3, H4, H1, le
prime qua ro formano il CORE del nucleosoma mentre l’istone H1 interagisce con il DNA che fa da
connessione tra due nucleosomi, ovvero il DNA linker, e non fa parte
del core nucleosomico. Gli istoni sono delle proteine basiche, ovvero
cariche posi vamente poiché presentano una discreta quan tà di
amminoacidi come arginina e lisina che hanno appunto dei gruppi
amminici carichi posi vamente.
Gli istoni che formano il core nucleosomico (H2A, H2B, H3, H4) sono
forma da un dominio ben conservato (histone fold), ovvero tre alfa
eliche separate da due loop non stru ura , poi abbiamo una coda
ammino-terminale ed una testa carbossi-terminale.

Un nucleosoma, quindi, è il prodo o dell’interazione tra DNA ed

istoni, nello speci co circa 200bp di DNA interagiscono con queste o o proteine, che formano un
tetramero poiché ognuno dei qua ro istoni che forma il core è presente in coppia, e il DNA
compiendo dei giri a orno al core nucleosomico si avvolge a orno ad esso. Il core è ampio circa 6nm
e il DNA si avvolge a orno ad esso compiendo due giri ed occupando uno spazio totale di 4nm
rispe o ai 6nm disponibili.
Nel momento in cui il DNA si avvolge intorno al core,
due regioni di DNA che in un DNA lineare sono
separate da circa 80bp si trovano molto vicine l’una
all’altra a livello della super cie del nucleosoma e
questo po di stru ura porta a delle conseguenze
funzionali legate alle diverse sequenze e a come si
organizzano nel momento in cui interagiscono con i
nucleosomi.

Il DNA si associa intorno ai nucleosomi in maniera compa a e possiamo u lizzare degli enzimi per
studiare la stru ura nucleosomica. Ques enzimi sono le ENDONUCLEASI
MICROCOCCICHE (Mnasi) le quali riescono a tagliare il DNA alla giunzione
tra due nucleosomi. Tramite un esperimento di questo po, facendo
interagire il nucleosoma con questo enzima e facendo successivamente
migrare il DNA su un gel di agarosio, o eniamo tu a una serie di bande
rela ve alla grandezza dei frammen che siamo riusci ad o enere
tramite l'interazione del DNA con l’endonucleasi micrococcica.
Esperimen di questo po hanno permesso di dedurre che il DNA è
associato ai nucleosomi in maniera compa a poiché se l’interazione tra
DNA e o amero istonico fosse di po blando nel momento in cui si a ua
una breve “diges one enzima ca” si o errebbero solamente frammen di
200bp perché l’enzima taglierebbe in maniera indiscriminata tu i pezze
di DNA, mentre essendo il DNA compa ato a orno al nucleosoma
l’enzima non sarà in grado di tagliare sempre e soltanto tra i vari nucleosomi ma ci sarà un grado di
compa amento superiore che impedisce all’enzima di andare a dividere esa amente ogni
nucleosoma, quindi si formano più bande.
(il DNA è associato ai nucleosomi in maniera compa a perché facendo degli esperimen di questo
po è stato visto che si producono frammen di lunghezza diversa e quindi vorrà dire che
sicuramente c’è un grado di compa amento superiore rispe o a quello della semplice interazione
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 nucleosomiale altrimen si o errebbero solamente frammen
da 200bp che corrispondono esa amente alla lunghezza di quei
pezzi di DNA che sono associa con l’o amero istonico)
IN BREVE: il DNA è altamente compa ato nell’interazione con i
nucleosomi e la quan tà di DNA associata all’o amero istonico è
di circa 150bp, se consideriamo anche il DNA associato all’istone
H1 abbiamo un DNA bel suo complesso che interagisce con il core
nucleosomico e con H1 di circa 200/210bp

ORGANIZZAZIONE DELL’OTTAMERO ISTONICO:

Al DNA si andranno a legare in maniera di erenziale i vari dimeri di
proteine istoniche (poiché come de o ogni proteina istonica è presente in coppia e quindi sono
dimeri), si legherà per primo un tetramero H3-H4 e poi si legherà il secondo tetramero H2A-H2B.
Avremo, quindi, un “nocciolo” centrale formato dagli istoni H3 e H4 ed a orno avremo gli istoni H2A
e H2B.
Gli istoni interagiscono con il DNA tramite l’interazione tra le
cariche posi ve degli istoni e le cariche nega ve dei fosfa
presen nello scheletro “zucchero-fosfato” del DNA. Il DNA quindi
si avvolge a orno agli o ameri che formano i nucleosomi e i vari
nucleosomi sono separa da uno spazio cos tuito da DNA linker
la cui di dimensione è di circa 60bp, mentre il DNA che si avvolge
a orno alle proteine istoniche (DNA core) è formato da circa
150bp.
Tu gli istoni vanno a stabilire conta con il DNA e si parla quindi
di ripiegamento istonico.
L’interazione tra DNA e core istonico è mediata in genere da circa 40 legami a idrogeno (è importante
so olineare che in una normale interazione tra DNA ed una qualsiasi proteina è mediata da
generalmente da 20 legami a idrogeno, mentre nel caso dell’interazione con il core istonico i legami a
idrogeno sono il doppio!), di ques 40 legami ben 33 sono forma con le cariche nega ve degli
ossigeni dei gruppi fosfodiesterici mentre gli altri 7 sono forma dalle basi del DNA che interagiscono
con le basi del solco minore.
La natura basica degli istoni porta a mascherare le cariche
nega ve dei fosfa dello scheletro del DNA e perme e un
avvicinamento sico che determina una curvatura del DNA,
questa curvatura si forma in maniera preferenziale in quelle
sequenze che sono ricche in AT e che ripiegano il DNA dalla
parte del solco minore (questo è un esempio di stru ura
insolita, nello speci co di DNA curvo).
È importante so olineare anche la presenza della coda
amminoterminale degli istoni, la cui posizione non è stata
ancora ben de nita, ma sembra che la coda degli istoni H3 e
H2B passi tra i giri dell’elica di DNA mentre la coda amminoterminale di H4 sembra vada a formare
dei legami con H2A e H2B.
17/03
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 Nei nucleosomi la rimozione delle code ammino-terminali degli istoni non altera l’interazione degli
stessi con il DNA, però queste code ammino-terminali possono essere modi cate tramite
l’inserimento di diversi gruppi funzionali (fosforilazione, me lazione, ace lazione) a livello di speci ci
residui amminoacidici come lisina e serina; queste modi cazioni sono reversibili che possono
cambiare la proprietà funzionale del nucleosoma.
In che modo gli istoni si associano al DNA per generare i nucleosomi? Tendenzialmente, ci possono
essere due possibilità:

➢ Primo assemblaggio del Nocciolo, formato dal tetramero H3-H4 sul DNA, e poi vi è
l’interazione con i dimeri degli altri due istoni, ovvero H2A e H2B;

➢ Formazione dell’o amero nel suo complesso, e tu o l’o amero poi interagisce con il DNA.
I nucleosomi devono essere sempre presen sul DNA: quando un
DNA viene replicato, è necessaria la rimozione dei nucleosomi;
quindi, la replicazione che separa i lamen di DNA, porterà alla
distruzione dei nucleosomi, ma subito dopo la replicazione i
nucleosomi dovranno immediatamente riformarsi sul DNA.

Quali sono i nucleosomi che si vanno ad assemblare sul DNA

dopo che è stato replicato? (Ovvero gli stessi istoni che si erano stacca , o dei nuovi istoni? E che
cosa succede a quelli che erano sta rimossi?).
Sono sta fa esperimen per cercare di capire cosa succede agli istoni in un DNA replicato: hanno
permesso di andare a valutare la formazione di un complesso DNA-proteine istoniche, e si è visto che
nel momento in cui andiamo a far sì che si o engono dei prodo tramite analisi di densità, ovvero si
o engono dei complessi più pesan e dei complessi meno pesan , si potrà de nire l’idea che un
vecchio o amero istonico si riassocia sul nostro DNA se o eniamo, tramite un’analisi densitometrica,
una banda pesante (il DNA si è riassociato con proteine istoniche da prima erano presen e che
avevano già interagito con il nostro DNA). Se invece o eniamo una banda leggera, quel DNA si è
associato con nuove proteine istoniche.
Perché istoni vecchi danno luogo a bande più pesan e istoni nuovi
danno luogo a bande più leggere? Perché gli istoni, durante la loro vita,
sono so opos a delle modi che; queste modi che, tra cui quelle citate
prima come l’aggiunta di gruppi funzionali, appesan scono l’interazione
con il DNA e danno luogo a prodo più pesan . Un istone nuovo non
ha ancora subito delle modi cazioni e darà luogo a bande più leggere.
In realtà si è visto che l’ipotesi della formazione di bande pesan e di
bande leggere non avviene. Si veri ca una situazione diversa: gli istoni
quando si riassemblano con il DNA, lo fanno in maniera “random” (sia
istoni di nuova sintesi che istoni di vecchia sintesi). Quindi l’assor mento
che si avrà nel momento in cui il DNA verrà replicato sarà assolutamente
casuale.
Replicazione del DNA: a mano a mano che la forcella di replicazione si allarga incontrerà un DNA che
è costre o dal legame con le proteine istoniche, e vengono rilascia i tetrameri di istoni; nel
momento in cui il DNA viene replicato, ques ul mi si riassemblano immediatamente sul DNA di
nuova sintesi e il loro assemblaggio sarà assolutamente casuale (ovvero alcuni istoni vecchi si
riassemblano con il DNA nuovo, e alcuni istoni nuovi si riassemblano con il DNA vecchio, e viceversa).
E’ importante ricordarlo, poiché le modi cazioni che avvengono a carico delle proteine istoniche
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 sono modi cazioni funzionali; quindi si possono trovare presen anche in un DNA di nuova sintesi,
che darà luogo a delle alterazioni funzionali anche su di esso, e non solo in un DNA pre-replicazione.
L’assemblaggio dei nucleosomi sul DNA non è un processo spontaneo, ma saranno necessari dei
fa ori che vanno a trasportare gli istoni sul DNA.
Nell’immagine abbiamo la forcella replica va, gli istoni che si
disassemblano e si vanno a riassemblare. Gli istoni vengono
trasporta sul DNA da delle proteine speci che che sono
trasportatori di istoni (CAF, RCAF o NAP-1) ! sono proteine
che riconoscono il DNA neosinte zzato perché si vanno a
legare alla sliding clamp (un anello che sarà analizzato più
avan quando si parlerà di replicazione).
Questo è un esperimento che perme e di vedere l’importanza delle proteine chaperon degli istoni,
quindi proteine che accompagnano gli istoni sul DNA; la mancanza di queste proteine, si formano di
aggrega di istoni, che si legano al DNA in modo assolutamente casuale. Se si aggiungono queste
proteine, che accompagnano gli istoni, l’assemblaggio sarà più ordinato e preciso.
Con il nucleosoma, siamo al primo livello di ripiegamento della croma na: tra o di DNA, la cui
ampiezza è di circa 2 nanometri. Nel momento in cui questo DNA è assemblato con l’o amero
istonico, si o ene quella che viene chiamata “croma na stru urata a collana di perle”, perché il
legame dei nucleosomi con il DNA forma tu a una serie di “perline”, che porterà a ridurre la
lunghezza di questa stru ura da metri a cen metri, con un ampiezza che sarà di 11 nanometri.
Questa ampiezza dà luogo a questa stru ura a collana di perle, che si chiama bra da 10-11
nanometri, perché una la con nua di nucleosomi. E’ una bra che si o ene in condizioni di bassa
forza ionica e non necessita delle proteine dell’istone H1 (che legherà il DNA linker). Non è chiaro se
questo po di stru ura esiste in vivo, ovvero nel nucleo della cellula, oppure se è sola una stru ura
che può essere generata in vitro, in conseguenza dell’estrazione di croma na.
Una stru ura croma nica può essere modi cata; quindi, un assemblaggio dei nucleosomi sul DNA
può essere modi cato, e questo può essere fa o in diversi modi:

▪ Uso di varian istoniche;

▪ Cambio del posizionamento o della pologia del nucleosoma;
▪ Modi cazioni post traduzionali degli istoni;
1.Varian Istoniche
Quando parliamo di nucleosomi, dobbiamo ricordare che
nonostante la formazione di diversi legami idrogeni e
tra andosi di stru ure stabili, con compa ezza a livello
nucleare della croma na perché deve essere
compar mentalizzato questo enorme quan tà di
materiale all’interno di una stru ura come il nucleo;
questa stru ura è sorprendentemente dinamica e ci
sono vari modi che perme ono di modi care la
croma na e di riuscire a rispondere a tu e quelle
necessità che può avere una cellula per regolare una serie di processi, in primis quello di espressione
genica, oltre che replicazione, ricombinazione e via dicendo… Uno di ques metodi è l’uso di varian
istoniche, in par colare delle varian degli istoni H2A e H3. Le varian istoniche possono essere
coinvolte in vari processi: la variante istonica meglio cara erizzata, ed è stata vista sia nel lievito, che
nella Drosophila che nel mammifero è l’H2A.z. Ha un ruolo in diversi organismi, sopra u o nel
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 silenziamento genico (ovvero la presenza di questa variante istonica è funzionale alla riduzione
dell’espressione di alcuni geni). Abbiamo anche un altro istone, di cui esistono varian par colari,
che è l’H3: c’è un istone par colare, ovvero il CENP-A (CENtromere Protein A), che va a sos tuire
l’istone H3 nei centromeri. Questo istone va a reclutare le proteine che legano il cinetocore, e quindi,
sembra che funzioni come sito di legame per uno o forse più componen del cinetocore (va a
sos tuire l’H3 in quei nucleosomi del DNA centromerico, quindi è importante in questo par colare
po di DNA).
2.Posizionamento dei nucleosomi
Come si vanno a localizzare i nucleosomi su una sequenza di DNA (in pun speci ci o vanno a
legarsi in maniera casuale)?
La precisa associazione tra DNA e proteine istoniche prende il nome di posizionamento di
nucleosomi. Ciò dipenderà dalla stru ura del DNA e da delle proteine che possono trovarsi ad
interagire con il DNA in ogni singolo momento. Il posizionamento dei nucleosomi sul DNA è
importante perché in uenza quali regioni del DNA sono più o meno esposte, va ad in ciare quelle
regioni del DNA che possono essere potenzialmente in relazione con le proteine (ovvero possono
cambiare la parte esposta in un ripiegamento nucleosomico, ovvero la parte del DNA linker, quella
regione che si trova da due nucleosomi). Il posizionamento dei nucleosomi indica dove i nucleosomi
sono localizza rispe o alla loro sequenza genomica. È stato fa o un esperimento per determinare
la posizione rela va di un punto ben de nito del DNA rispe o al nucleosoma. Conoscendo
ovviamente la sequenza, è stato preso una posizione speci ca del DNA (nell’immagine la porzione in
rosso). Immaginiamo che quella sequenza di DNA sia organizzata in nucleosomi solo in una
par colare con gurazione, e quindi che quella regione del DNA abbia sempre la stessa iden ca
posizione sul nucleosoma. Se i nucleosomi sono sempre posiziona in un determinato modo, vorrà
dire che le regioni dei DNA linker, quelle tra due nucleosomi, sono si unici. Tenendo conto di questa
ipotesi, si andrà a prendere il DNA e si andrà a tagliare questa stru ura con la nucleasi micrococcica,
che andrà a rilasciare vari monomeri, poiché quella nucleasi va a tagliare proprio a livello del DNA
linker fra i nucleosomi (generando frammen con una sequenza speci ca).
Dopo aver tagliato i vari nucleosomi, si estrae il DNA dalle proteine e si
sono u lizza enzimi di restrizione che vanno a tagliare a livello di
sequenze bersaglio (gli enzimi di restrizione sono enzimi che tagliano in
posizioni a noi note, quindi noi sappiamo esa amente anche a livello di
quali basi andiamo a tagliare il DNA). Questo comporterà alla formazione
di una serie di frammen che potranno essere monitora nel momento in
cui si ha la possibilità di andare a posizionare delle marcature sui vari
frammen , e facendoli migrare su gel di agarosio. Nel momento in cui si
fanno migrare su gel di agarosio vari frammen o enu dopo reazioni con
enzimi di restrizioni, si potrà o enere una situazione simile, ovvero la
formazione di una banda sola. Questo vorrà dire che sicuramente il
nucleosoma occupa una sequenza ben de nita di DNA.

Con questo esperimento deduciamo che il nucleosoma occupa una posizione ben de nita di DNA. Se
invece il nucleosoma, nel momento in cui andiamo a fare questo po di esperimento, non occupa
una posizione non de nita di DNA non potremmo visualizzare una sola banda perché questo
frammento di DNA che abbiamo marcato e che vogliamo monitorare lo possiamo vedere in più
posizioni, quindi vorrà dire che se o eniamo una banda che non è speci ca non c’è stato
posizionamento di nucleosomi, quindi abbiamo un’ampia strisciata che va da frammen piccoli a
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 frammen grandi. Situazioni di questo po si possono veri care e bisogna tenerne conto per sapere
se una determinata regione può essere studiata in associazione a delle proteine di regolazione.
Ad esempio, in questa immagine vediamo gli o ameri istonici in giallo, il DNA in rosso e varie gure
che rappresentano le varie proteine che vanno a legare sequenze speci che di DNA. Cosa va a
d e t e r m i n a r e s e c ’è o m e n o u n
posizionamento dei nucleosomi? La
compe zione con le proteine! Perché gli
istoni competono con le proteine per il
legame a sequenze speci che, quindi se
una determinata proteina si lega a una
sequenza di DNA su quella stessa
sequenza non vi si potrà legare una
proteina istonica.
Quindi una causa comune di un
determinato posizionamento dei nucleosomi sul DNA è la presenza di proteine legate al DNA che
vanno a de nire una sorta di con ne, quindi un posizionamento va ad in uire sull’accessibilità al
DNA.
(N.B. se due proteine si legano ad una certa distanza
inferiore a 150bp non si può formare un nucleosoma)

(N.B.se alcune proteine vanno a legare il nucleosoma in

maniera forte lo vanno a posizionare vicino a loro e ne
condizionano quindi il posizionamento)

Il posizionamento dei nucleosomi presenta risvol importan per quanto riguarda la trascrizione
genica. Si può parlare di un posizionamento ROTAZIONALE e di un posizionamento TRASLAZIONALE,
il primo è un posizionamento rispe o a un elemento par colare della sequenza genomica (la
sequenza par colare può essere inclusa o esclusa dal nucleosoma a seconda di come si posiziona
l’o amero), il secondo invece dipende dalla fase dell’elica, ovvero da cosa viene esposto al
nucleosoma, se l’esterno o l’interno dell’elica.
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 Sostanzialmente, il posizionamento TRASLAZIONALE va a stabilire quali sono le sequenze che si
trovano nella regione linker. Basta lo spostamento di sole 10bp per portare nella regione linker un
giro d’elica successivo, ciò è importante poiché cambiando la sequenza di DNA che si trova nella
regione linker cambia l’accessibilità delle proteine al DNA.
N.B. sequenze di DNA poste all’entrata o
all’uscita di un nucleosoma sono più accessibili
alle proteine poiché lo srotolamento del DNA in
quei pun è un fenomeno frequente. Una
sequenza di DNA che si trova al centro di un
nucleosoma può diventare accessibile alle
proteine ma ciò comporta un ampio
srotolamento del DNA il quale non avviene
molto frequentemente.)

La stru ura croma nica è una stru ura altamente dinamica, quindi in ogni momento può esserci una
diversa associazione tra proteine e DNA.
[ESERCIZIO 1: 200bp di DNA sono arrotolate intorno al core istonico per formare un nucleosoma. Se
il nucleosoma ha un diametro di 11nm quante volte abbiamo ripiegato il DNA lungo l’asse della bra
da 11nm? RISPOSTA!il fa ore di impacche amento è di 6 volte, perché abbiamo 200bp e
sappiamo che ogni giro d’elica con ene 10,5bp, quindi il numero di giri d’elica è 20. Ogni giro d’elica
è di 3,4nm quindi abbiamo un frammento di DNA di 200bp lungo 68nm dato che la lunghezza nale è
quello della bra, ovvero 11nm, abbiamo 68nm/11nm=6]

[ESERCIZIO 2: il cromosoma 22, completamente sequenziato nel 1999, ha circa 33.5 milioni di basi di
DNA. Qual è la lunghezza di questo cromosoma sapendo che la lunghezza di una singola coppia di
basi è di 0.3nm? RISPOSTA ! 33.5 milionix0.3nm= 10.050.000nm!circa 10mm]
Tramite questo esercizio capiamo quanto sia importante l’impacche amento che avviene tramite
l’interazione del DNA con le proteine, poiché sappiamo che senza questa interazione un gene
sarebbe lungo 10mm, una dimensione non compa bile con quello che è lo spazio disponibile
all’interno di un nucleo.
La cellula u lizza quindi, oltre alle proteine che formano il core istonico, altre proteine per
raggiungere un grado di compa azione maggiore, e la proteina chiave che perme e ciò è l’istone
H1, che va ad interagire sia con il DNA linker, sia con la regione del DNA del core per avvicinare tra di
loro i nucleosomi.
L’istone H1 induce i nucleosomi a raggrupparsi in insieme
ordinato che gli perme erà di raggiungere il livello di
compa azione della croma na successivo, ovvero la bra
da 30nm. L’interazione tra nucleosoma e istone H1 si
chiama cromatosoma, il legame dell’istone H1 è
altamente dinamico. L’H1 viene scambiato di con nuo
all’interno della stru ura croma nica e quindi
contribuisce alla dinamicità della bra da 30nm.
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 Le funzioni dell’istone H1:
• Stabilizzare la bra da 30 nm (punto ancora controverso);
• Minimizzare lo sli amento nucleosomale;
•E e sull’a vità trascrizionale.
Nel momento in cui abbiamo aggiunto gli istoni H1 o eniamo quella che viene chiamata la bra da
30nm, quindi siamo passa da una bra di 11nm a una bra di 30nm.
Questa bra da 30nm può essere di due pi:
- MODELLO A SOLENOIDE, che è cara erizzato
dalla presenza di 6 nucleosomi per giro e il DNA
linker non a raversa mai l’asse di questo
solenoide. Il modello a solenoide è il modello
più cara erizzato.
- MODELLO A ZIG-ZAG, è diverso il
posizionamento del DNA linker che invece in
questo caso a raversa l’asse longitudinale della
bra da 30nm.

Quindi con l’istone H1 abbiamo creato un ulteriore livello di compa azione della croma na;
torniamo a parlare delle code degli istoni (avevamo visto che le code istoniche nella stru ura
cromosomica non hanno un ruolo di rilievo nell’interazione tra i vari istoni, ma sono importan per la
loro capacità di regolare la trascrizione nel momento in cui sono modi cate). Le code istoniche sono
importan nella formazione della bra da 30 perché mediano l’interazione di legami H tra
nucleosomi vicini, cosa che non è possibile in una bra da 11nm. Quindi degli istoni privi di code, si è
visto sperimentalmente che non sono in grado di formare bre da 30nm e quindi si è visto che
l’aggiunta dell’istone H1 è necessaria a nché si formi la bra da 30nm, ma sono altresì importan le
code istoniche (perché queste code istoniche perme ono nella bra da 30nm di formare legami H
tra nucleosomi adiacen ). Quindi la FIBRA DA 30nm è il livello successivo di ripiegamento della
croma na, e nel momento in cui abbiamo una bra da 30nm abbiamo un rapporto di
condensazione della croma na di 40 (nella bra da 11nm, invece, abbiamo un rapporto di
condensazione di 6). Quindi siamo passato, con l’aggiunta dell’istone H1, da una stru ura a collana di
perline ad una stru ura a solenoide o zig-zag, in cui abbiamo una bra da 30nm.
Quindi, riassumendo, avremo:
- sui nucleosomi da 11nm: livello di condensazione=6 volte: passiamo da 1 m a 16 cm
- nelle bre da 30 nm: livello di condensazione=40 volte: da 1 m a 2.5 cm
Saremo quindi sempre ad una lunghezza dell’ordine dei cm, per cui ci rendiamo conto che siamo
ancora ben lontani da quell’impaccamento necessario per far sì che tu o il DNA sia contenuto
all’interno del nucleo; vorrà dire che ci devono essere necessariamente delle stru ure di ordine
superiore della croma na. Queste stru ure di ordine superiore sono delle ANSE, ovvero delle
stru ure (anse di DNA) che sono bloccate da una stru ura proteica denominata sca old nucleare
(impalcatura nucleare).
Quindi abbiamo il nostro DNA a bra da 30nm che forma delle anse (in ogni ansa possono esserci più
geni); le anse possono variare in grandezza dalle 25.000 alle 200.000 bp. Il DNA, quindi andrà ad
interagire con delle matrici proteiche non-istoniche nucleari che perme ono un ulteriore
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 compa amento della croma na all’interno del nucleo. Ognuna
delle anse di DNA è formata da tu a una serie di bre che
contengono le regioni da 30nm e ovviamente andando al livello
più basso di condensazione della croma na delle regioni da 11nm.
Quindi da regioni più condensate a regioni meno condensate sono
presen in una bra croma nica. Il DNA è un lamento con nuo
che interagisce con delle proteine istoniche e con delle proteine
non-istoniche, che hanno un ruolo importante nell’organizzazione
e nel compa amento del cromosoma; quindi, la compressione del
DNA avviene su più livelli:
- NUCLEOSOMA
- FIBRA DA 30nm
- FIBRA AD ANSA
- FIBRA DA 700 nm: la croma na si super avvolge (diametro
dei singoli croma di)
- FIBRA DA 1400 nm: livello di condensazione massimo (cromosomi mito ci)

ESERICIZI
1) Cos’è un nucleosoma?
a. Un complesso di proteine che controlla l’importazione nucleare
b. DNA non cromosomico che è libero galleggiante nel citosol
c. Un organello legato alla membrana che con ene informazioni epigene che
d. Un’unità ripetuta di croma na
2) Quale delle seguen frasi è vera per la croma na?
a. La croma na non viene mai compa ata ulteriormente rispe o alla bra da 10nm
b. La croma na è presente in tu o il DNA eucario co e procario co
c. I modello di me lazione o ace lazione degli istoni possono regolare l’espressione genica
d. I nucleosomi sono cos tui da DNA avvolto in proteine note come fa ori di trascrizione

DEFINIZIONI
CARIOTIPO= Set completo di cromosomi di una cellula dispos per dimensioni, forma, e numero.
CENTROMERO = Regione ristre a di un cromosoma mito co che con ene i croma di fratelli insieme.
ISTONI = piccole proteine ricche di arginina e lisina, che cos tuiscono il livello primario
dell'organizzazione della croma na.
CROMOSOMA = Stru ura composta da una molecola di DNA molto lunga e proteine associate che
con ene parte (o tu o) delle informazioni ereditarie di un organismo.
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 CICLO CELLULARE = La sequenza ordinata di even con cui una cena duplica il suo contenuto e si
divide in due.
CROMATINA = Complesso di DNA, istoni e proteine non istoniche presen nel nucleo di una cellula
eucario ca
CROMOSOMA OMOLOGO = Una delle due copie di un par colare cromosoma in una cellula diploide,
ciascuna copia derivata da un genitore diverso.
NUCLEOSOMA = Stru ura a perline in croma na eucario ca, composta da una breve lunghezza di
DNA avvolto a orno a un nucleo di proteine dell'istone
VERO O FALSO
1) Nell’essere umano, le femmine hanno 23 cromosomi diversi, mentre i maschi 24. VERO,
perché nelle femmine abbiamo 22 autosomi e due X quindi sono 23 i cromosomi diversi,
mentre nell’uomo abbiamo 22 autosomi e X ed Y per cui sono 24 i cromosomi diversi.
2) Nella cellula vivente, la croma na di solito ado a la conformazione a "collana di perle”.
FALSO, perché nella cellula vivente la conformazione minima di impacche amento che
possiamo visualizzare è la bra da 30nm (quella da 11nm, quindi a collana di perle, è una
condizione visibile in vitro e non in vivo.
3) qua ro istoni del core sono proteine rela vamente piccole con una proporzione molto alta i
aminoacidi carica posi vamente; la carica posi va aiuta gli istoni a legare stre amente
DNA, indipendentemente dalla sua sequenza nucleo dica. VERO, perché le carica posi ve
degli aminoacidi arginina e lisina andranno a neutralizzare le cariche nega ve dei fosfa
dello scheletro zucchero-fosfato tramite legami H. questo legame è indipendente dalla
sequenza nucleo dica.
4) I nucleosomi legano il DNA così stre amente che non possono spostarsi dalle posizioni dove
vengono assembla per la prima volta. FALSO, perché ci sono dei meccanismi che
perme ono il rimodellamento della croma na.
PROBLEMI
1) Negli anni '50, le tecniche per isolare il DNA dalle cellule producevano molecole di circa
10.000 a 20.000 coppie di basi. Ora sappiamo che le molecole di DNA in tu e le cellule sono
molto più lunghe. Perché pensi che originariamente solo pezzi cor erano isola ? La
di erenza è data dai metodi u lizza in laboratorio per isolare proteine e DNA. (oggi ci sono
delle tecniche che ci perme ono di o enere dei frammen più lunghi (as es. con gel di
agarosio) che sono più facilmente analizzabili). Il meccanismo che vine u lizzato prima di
andare a fare un sequenziamento del DNA è la SONICAZIONE, che perme e di andare a
frammentare il DNA in pezzi random, che poi nel momento in cui li devi andare sequenziare
perme e di assemblarli, perché ques pezzi random avranno delle sequenze condivise che
saranno u li e fondamentali al loro assemblaggio. [vedremo meglio quando faremo lab]
2) Considera la seguente a ermazione: una cellula umana con ene 46 molecole DNA nel suo
nucleo. Sei d'accordo? Perché sì o perché no? No, perché dipende se la cellula è aploide o
diploide e dal momento del ciclo cellulare (ci sono anche cellule che non hanno DNA per
niente, per esempio, i globuli rossi oppure cellule mul nucleate).
3) Elenca le tre sequenze di DNA specializzate e le loro funzioni che agiscono per assicurare che
il numero e la morfologia dei cromosomi siano costan da una generazione di una cellula alla
generazione successiva. Le sequenze fondamentali sono CENTROMERI, perché perme ono di
interagire con le proteine del cinetocore a nché ci sia una corre a segregazione dei
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 croma di TELOMERI perché perme ono la stabilizzazione del cromosoma e ORIGINI DI
REPLICAZIONE perché sono quelle che controllano l’inizio della replicazione del DNA e che
perme eranno la duplicazione.

BIOLOGIA MOLECOLARE 23/03 e 24/03

GENI E ORGANIZZAZIONE DEL GENOMA:

L’albero della vita è suddiviso in tre raggruppamen principali: eucario , ba eri e archeoba eri.
Gli archeoba eri sono quelli che abitano in ambien estremi e presentano cara eris che diverse dai
ba eri, i quali contengono le cosidde e proteine informazionali che servono alla cellula per la
replicazione, trascrizione e traduzione e sono più simili a quelle delle cellule eucario che. I ba eri
possiedono anche delle proteine simili istoniche non compar mentalizzate all’interno del nucleo; il
materiale gene co deve risiedere in una stru ura più piccola; anche i promotori sono simili a quelle
delle cellule eucario che per esempio abbiamo le sequenze consenso che cara erizzano le cellule
eucario che (es.TATA BOX che si trova a monte della trascrizione). Negli euba eri anche l’inizio della
traduzione coincide con quella degli eucario , infa il primo amminoacido è sempre la me onina
che sarà formilata nel caso dei ba eri.

I genomi ba erici hanno un’alta variabilità nelle loro dimensioni, passano da un cen naio di migliaia
di nucleo di a milioni. I genomi procario ci hanno anche alta plas cità ovvero anche nella stessa
specie hanno dimensioni molto diverse, questo porta a delle cara eris che piche delle cellule
procario che ovvero la possibilità che ci siano degli even di trasferimento genico laterale, in cui il
materiale gene co nel genoma procario co può essere trasferito da un individuo a un altro individuo
(vi è una frequenza molto maggiore rispe o alle cellule eucario che). Questa alta plas cità porta ad
altre proprietà cara eris che procario che come per esempio resistenza agli an bio ci, proprietà
virulente (es. isole di patogenicità).

Nei procario i geni vanno ad occupare una grossa percentuale del genoma, circa l’85%, e di questo
la maggior parte codi ca per Rna o per proteine. Inoltre, i geni procario ci non hanno sequenze
introniche. Hanno anche la cara eris ca di essere policistronici, ovvero uno stesso promotore riesce
a controllare più geni. Questa grandezza diversa nella complessità nel genoma procario co dipende
anche dallo s le di vita del procariota stesso, ci possono essere dei parassi specializza che vanno a
richiedere meno geni, mentre i ba eri più generalis richiedono anche migliaia di geni.

La quan tà di geni quindi cambia a seconda del po di cellula procario ca.

i procario hanno genomi più piccoli poiché sono

parassi intracellulari, vivono all’interno di un
ospite e per questo mo vo dovranno codi care
un minor numero di proteine. Più grande è il
genoma più la cellula è capace di condurre una
vita propria a livello ambientale.

In questa immagine nell'asse delle ascisse

abbiamo la GC% dei genomi sia di euba eri
(rosso) che di archeoba eri (blu); nell'asse
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 delle ordinate abbiamo la frequenza di queste basi GC.
Nelle cellule eucario che il contenuto in basi GC è abbastanza simile (ci sono poche variazioni),
parlando del modello delle isocore abbiamo una percentuale intorno al 35-40%. Nella cellule
procario che queste variazioni sono molto più grandi e possono variare dal
25-80%.
Le diverse specie ba eriche hanno un contenuto proprio cara eris co di basi GC e questo porta a
una diversa capacità di ada amento alle condizioni ambientali speci che per i vari organismi
procario ci.
La variazione nel po e quan tà di basi GC, che esistono all’interno delle diverse specie
procario che, è considerata alla base di un processo evolu vo (o separazione evolu va).

In questa slide, oltre le percentuali di GC vediamo le dimensioni dei genomi: le dimensioni del
genoma di un virus o di un ba erio sono tendenzialmente più piccole di quanto non lo siano quelli
di una cellula eucario ca.
Tu e le cellule all’interno di una
stessa specie contengono una
quan tà costante di dna, che
prende il nome di valore C
(quan tà di dna contenuta in una
cellula), e possiamo
misurarla in bp (base pair) oppure
in picogrammi (1
picogrammo è circa 1 migliaio di
milioni di paia di basi).

Nell’immagine possiamo
vedere che nei
mammiferi, come nell’uomo,
abbiamo una quan tà tra 10^9 e
10^10 bp. Negli altri organismi
invece le quan tà di basi totali possono essere anche più grandi ➞ non vi è una correlazione tra il
valore C e la complessità di un determinato organismo.
Per cui organismi meno complessi possono avere addiri ura una quan tà di dna maggiore rispe o
ad una cellula umana (PARADOSSO DEL VALORE C: mancanza di correlazione tra le dimensioni del
genoma e la sua complessità dal punto di vista gene co). Questa è una cara eris ca sopra u o
delle piante, dove abbiamo una quan tà enorme di genoma, poiché nelle piante la maggior parte
della quan tà di dna è ripe vo, ed esse non hanno tu e quelle cara eris che speci che ad
esempio per il genoma umano.

Nelle cellule eucario che possiamo avere:

- GENI IN COPIE MULTIPLE

- PSEUDOGENI
- SEQUENZE INTRONICHE
- SEQUENZE ESONICHE
I geni sono quelle sequenze genomiche che codi cano
per una par colare proteina, sono cara erizza da esoni
ed introni, sono separa da segmen non codi can .
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 Il genoma eucario co dunque ha una grande complessità rispe o a quello procario co.

Nella slide vediamo vari genomi

eucario ci, in cui possono essere
presen sia sequenze uniche che
dna ripe vo.
In rosso abbiamo sequenze non
ripe ve (in toto nelle cellule
procario che), mentre nelle
eucario che possiamo avere
anche le zone sia , in blu, sia
ripe ve, in verde.
Le sequenze moderatamente
ripe ve sono sequenze
presen in più di una copia e sono
correlate tra di loro;
spesso non sono iden che e
sono intersperse nel genoma.

La percentuale di DNA ripe vo nei genomi dei vari organismi varia molto:
● Nei procario non abbiamo dna ripe vo
● Negli eucario possiamo avere una grande quan tà di dna ripe vo, che varia dal 20%
all’80%. (Eucario inferiori no al 20%, cellule animali no al 50% e oltre il 50% per le piante
e negli an bi).

COME IDENTIFICARE I GENI: dobbiamo riconoscere

determinate cara eris che in una sequenza
genomica.
Possiamo de nire alcune regioni presen a livello
del promotore, le sequenze consenso
(cara erizzan la sequenza promotrice, es:

TATAAT ➞ la TATA BOX, ossia quella consenso

presente a livello del promotore di un gene).
Abbiamo le varie giunzioni di splicing, ossia noi
sappiamo che a livello di una sequenza intronica
l’inizio sarà sempre GT e terminerà al 3’ con le basi
AG.
Vi sono vari segnali, varie cara eris che, che ci aiutano a capire se una determinata frequenza è
e e vamente un gene oppure no ➞ andiamo ad iden care le cosidde e OPEN READING FRAME
(“quadro di le ura aperto”, sequenza che va dall’inizio del trascri o alla ne e tu e quelle sequenze
ancheggian ): ad esempio quelle cara eris che dei codoni delle triple e di inizio, la regione
promotore con le sequenze consenso, le giunzioni di splicing ecc ecc.
Una volta iden cate le varie cara eris che per essere sicuri che si tra di un gene bisogna vedere
se in altre specie è presente quella determinata sequenza, poiché il miglior modo per confermare
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 l'iden tà di un presunto gene è il suo livello di conservazione negli organismi correla , per cui la
sequenza esonica sarà conservata.

La dimensione del genoma, come de o,

non implica la maggiore
complessità e ovviamente anche il
numero di geni non
implica complessità. Vi è il bisogno di
un certo numerodi geni
a nché l’organismo possa svolgere
determinate funzioni, per cui per
quanto riguarda i ba eri il numero di
geni è correlato alla grandezza del
genoma.
Nel gra co abbiamo la grandezza del
genoma in ascisse e in ordinata il
numero di geni.
I parassi obbliga hanno una quan tà
di genoma e di geni più basso rispe o agli altri ba eri. Per quanto riguarda i procario dunque vi è
un numero minimo necessario a nché sia possibile avere le funzioni. Ciò non riguarda le cellule
eucario che, poiché all’interno di esse il numero di geni presenta un’ampia variazione e non vi è una
correlazione con la grandezza del genoma.

Nella slide ad esempio il C.Elegans, un nematode, ha

intorno a 18-20 mila geni e mol sono pici solo di
questo organismo e non presen in altri.
Il riso ha un numero di geni molto più alto dell’uomo e
del topo, e addiri ura il topo ha un numero maggiore
dell’uomo nonostante il genoma complessivo sia più
piccolo.
Questo dimostra che non c è correlazione tra la
grandezza del genoma e la complessità dell’organismo.

FUNZIONI DEI GENI:

Nel gra co a torta vediamo diverse fe e che
rappresentano le diverse funzioni dei vari geni. Mol
sono enzimi, fa ori di trascrizione, proteine di
trasporto transmembrana, canali
transmembrana per gli ioni,
proteine di trasduzione del segnale.
La funzione di più della metà dei geni della
Drosophila non è ancora noto.

Nell’uomo vediamo che la quan tà di geni è tra i

20/30/40 mila geni, e più del 50/60% dei geni
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 viene maturato in maniera alterna va (a raverso lo splicing alterna vo, che porta alla produzione di
proteine diverse). Per questo mo vo la quan tà di proteine sarà più alta rispe o alla quan tà di geni
presen .
Di tu o questo materiale genomico nell’uomo, solo l’1% è formata da esoni ossia quella parte del
gene che codi ca per proteine. Mentre più del 50% è formato da DNA ripe vo, e
circa al 24% è formato da introni. \

Un gene umano è lungo circa 27 mila bp e con ene di media 9 esoni. Esempio di un gene con
sequenze introniche ed esoniche: 7 esoni interni con una lunghezza media di 145 bp.
Gli esoni più lungo di solito si trovano all’inizio e alla ne del gene.

In che modo i geni e le altre sequenze geniche sono distribuite nel genoma?:
Nel dna ripe vo abbiamo per la maggior parte dei casi dei trasposoni, ossia degli elemen gene ci
che sono in grado di spostarsi da una parte all’altra del genoma. Sono porzioni genomiche non
funzionan , ma dato che sono presen in alta % è molto probabile che hanno avuto un ruolo a vo
nella formazione del genoma a uale di una cellula umana.

Quan pi di geni diversi esistono?:

Vi sono i geni unici, ovvero quei geni la cui
funzione non è correlata a nessun altro gene
all’interno del genoma; poi abbiamo le famiglie
geniche, ossia delle famiglie di geni molto
importan per l’evoluzione e per la
specializzazione delle cellule.
Più o meno la metà di tu i geni che codi cano
per proteine è presente in singola copia in un
genoma aploide, mentre gli altri sono presen
in copie mul ple.
Durante l’evoluzione le diverse copie di un
gene possono dare origine, accumulando
mutazioni, a dei gruppi di geni che possono avere cara eris che simili: le famiglie geniche. Vi sono
famiglie con pochi membri, es: geni che codi cano per le globine dell’emoglobina; altre invece
possiedono cen naia di membri, es: geni che codi cano per le immunoglobuline degli an corpi.

A seconda dei vari organismi

vediamo la percentuale di geni unici, di famiglie
geniche con pochi membri e quella di famiglie con mol
membri. La frazione di sequenze uniche va a diminuire
man mano che aumenta la dimensione di un genoma.
Quando i geni fanno parte di una famiglia genica, il
numero di membrisarà più piccolo
quando parliamo di cellule procario che, e più grande
quando parliamo di cellule eucario che.
In proporzione il numero di geni unici va a diminuire
all’aumentare della complessità del
genoma.
GENI ORTOLOGHI:
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 In questa slide vediamo la % di geni
comuni in tu gli eucario , di circa
il 20%, poi vediamo
la percentuale di geni che
sono presen solo negli
eucario mul cellulari, di circa 10%,
mentre il 70% sono speci ci del
genere. Circa il 20% dei geni della
mosca è ortologo sia del C.Elegans che
del lievito. Se paragoniamo la mosca
e il C.Elegans la
percentuale aumenta poiché sono
geni che cara erizzano eucario
mul cellulari.

I geni ortologhi sono geni che codi cano in organismi di eren per le stesse proteine, ovvero sono
quei geni che hanno una percentuale in base maggiore dell’80% omologa. In diversi organismi, una
sequenza genica simile più dell’80% porta alla formazione di proteine che hanno la stessa iden ca
funzione (geni ortologhi). In realtà vedremo che per riconoscere geni ortologhi più che la sequenza in
base è necessario conoscere la sequenza amminoacidica.

A livello evolu vo si è avuta l’aggiunta di geni con nuove

funzioni: aumentando la complessità
dell’organismo aumentano geni che possiedono funzioni
par colari. Vi sono dei geni presen in tu i procario e
in tu gli eucario , il 21%, e sono quei geni che sono
necessari alla funzione della vita.
Poi vi sono geni che servono per codi care le proteine che
cos tuiscono i comportamen cellulari delle cellule
eucario che.
Man mano che aumenta la complessità
dell’organismo aumenta il numero di geni, e nei
vertebra il numero è maggiore poiché abbiamo dei sistemi cara erizzan come quello immunitario
e nervoso.

Le proteine comuni a tu gli eucario sono coinvolte in funzioni cellulari essenziali (1300 funzioni
comuni): circa il 35% sono coinvol nella trascrizione e traduzione.

La complessità è associabile a delle funzioni extracellulari o transmembrana: in un organismo come

l’uomo aumentano le proteine transmembrana all’aumentare della complessità dell’organismo. Esse
sono importan per i meccanismi di trasduzione del segnale. Migliaia di proteine transmembrana
sono state sequenziate ma non si è ancora compreso il ruolo (proteine orfane), hanno sicuramente
un ruolo importante ma deve ancora essere compreso. Cambierà la quan tà di geni che codi cano
per queste proteine a seconda delle funzioni che devono avere in un determinato organismo.
Per cui la complessità dell’organismo e le sue determinate funzioni sono associabili sulla base delle
proteine transmembrana che vengono prodo e.
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 QUANTI SONO I GENI ESSENZIALI?:
Da uno studio condo o su un lievito, basato sulla delezione
dei geni, che sono 5916, è stato notato che
solo il 20% di essi è essenziale per la crescita in un terreno di
coltura. Tra ques geni ci sono quelli per la trascrizione,
traduzione, localizzazione proteine, organizzazione cellulare,
energia e metabolismo.
La selezione naturale ha fa o sì che i geni u li sono sempre
mantenu a livello del genoma, ma le mutazioni avvengono
in maniera casuale.
Se un gene perde la sua u lità vuol dire che accumulerà mutazioni, no a non essere più
riconoscibile come gene fondamentale. Se viene mantenuto vuol dire che sarà u le e non porta
svantaggi all’organismo.
Nel lievito la quan tà di geni essenziali, importan e fondamentali è minore del 20%.

Un’analisi mutazionale condo a sul C.Elegans ha dimostrato che solo nel 10% dei casi, inducendo
mutazioni nei vari geni, si sono osserva e e rilevan sul feno po. Nel 90% dei casi invece le
mutazioni a livello di geni non hanno portato ad alcun e e o.
Si spiega con il fenomeno della ridondanza, ossia vi sono geni coinvol in una funzione che sono
presen in copie mul ple. Un organismo ha modi alterna vi per svolgere una stessa funzione oppure
ha la possibilità di avere copie mul ple di geni.
Per cui anche andando a mutare un gene, potrebbe esserci una copia di quel gene funzionante che
consente di svolgere quella determinata funzione oppure proteine diverse in grado di svolgere la
stessa funzione.

Trascri oma: insieme di tu gli Rna che sono presen . La complessità di un trascri oma dipenderà
dagli mRna.
Abbondanza di un messaggero: quan tà di quel par colare messaggero all’interno della cellula. Un
messaggero può essere abbondante (gruppo rido o di specie di messaggeri presen in tante copie)
oppure scarso (molte specie in poche copie per ogni singola cellula).
Geni housekeeping “mantenitori della casa: geni espressi in ogni cellula poiché forniscono funzioni
di base che servono per il mantenimento della vita cellulare. Es: geni per la sintesi di proteine del
citoscheletro, geni per il metabolismo … Sono geni sempre presen ma non è de o che siano sempre
presen nella stessa quan tà, infa in condizioni ambientali di eren possono variare le quan tà.
Luxury genes: geni che codi cano per funzioni
specializzate e cara eris che solo per alcuni pi di cellule. Non
vengono espressi tu i geni in ogni cellula.

Un gene è un segmento di dna che codi ca per un polipep de

speci co. Ogni gene va a determinare un cara ere ereditario e
quel gene va ad occupare sul cromosoma una determinata
posizione, de a locus.
Il numero di geni contenuto nel dna umano non è ancora ben
de nito (tra i 20/40 mila). Nei geni abbiamo sia sequenze esoniche che introniche.
Nell’uomo:
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 - il 25% del genoma è cos tuito da dna genico
- Il 75% da dna extragenico
- 1.5% va a formare il dna codi cante
- 98.5% del genoma è composto da sequenze non codi can .
Queste regioni di dna non codi can venivano de nite precedentemente Junk dna (dna spazzatura),
ma ora tale de nizione è cambiata poiché in queste sequenze genomiche si nascondono molto
probabilmente le sequenze che trascrivono mol di quei piccoli rna non codi can fondamentali
nella regolazione genica.

LAVORO SUL NATURE DEL 2012:

Un consorzio pubblico americano, l’ENCODE (Encyclopedia of dna elements) pubblicò un lavoro
secondo il quale l’80% del genoma è trascri o ➞ funzionale. Per cui smen la concezione del dna
spazzatura. Di questo 80%, il 60% però non ha una funzione conosciuta ma comunque ha de nito
che un dna non codi cante a livello funzionale deve essere necessariamente coinvolto nella
regolazione dell’espressione genica.

2014: si scoprì che solo l’8% del dna umano era codi cante e non l’80%.
Hanno messo a confronto il dna umano con quello di altri mammiferi e hanno visto che l’8.2% di
ques dna è conservato nei vari gruppi tassonomici ➞ tale percentuale è quella necessaria a nché
si svolgano determinate funzioni.

Tale studio con ene degli ERRORI: semplicemente non capendo la funzione di una sequenza
genomica, questa non si può de nire spazzatura o dire che non abbia ruoli importan . Infa essi
hanno una importanza fondamentale per la regolazione genica.

ESERCIZI:
1) Quello da 1125 kilobyte è dell’E.coli,
mentre il le B (più grande) è della
Drosophila. Questo poiché s amo
parlando di un genoma di un eucariote, più
grande, messo a confronto con quello di un
procariote, più piccolo. Se avessimo
avuto due eucario probabilmente
non sarebbe stato possibile dare
una rispostacerta poiché abbiamo
visto che la complessità è molto
variabile.
2) Il secondo tubo con ene il dna dell'archea
poiché dovrebbe avere una maggiore percentuale
di GC, per cui avendo più legami idrogeno il dna è
più resistente alle alte temperature.

PROBLEMI:
1) La maggior parte degli amminoacidi di una
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amminoacidica è
proteina isotonica hanno funzioni ben
de nite, anche quelli sulle code: che possono
subire modi cazioni covalen e sono molto
importan nel ruolo che ha l’istone nella
stabilità del dna. Al contrario della maggior
parte delle proteine che possono
accumulare a livello evoluzionis co
delle mutazioni, la funzione delle
proteine istoniche deve coinvolgere tu gli
aminoacidi ➞ ogni cambiamento a livello di
ogni singola posizione nella sequenza
potenzialmente deleteria per la cellula.

2) Circa 50.000, proporzione 700:1,5%=x:100. La s ma è errata, il numero è più grande perché

in questo modo s amo presupponendo che la densità genica sia uguale per ogni
cromosoma, ma non è così: la densità genica del cromosoma 22 deve essere

necessariamente più grande degli altri. In generale la densità genica è più bassa rispe o al
cromosoma 22.
3) La nucleasi micrococcica quando va a tagliare il dna consente di o enere, in una cellula
eucario ca, il frammento
più piccolo di dimensioni
di 200 bp, poi i frammen
de ni con dimensioni di
mul pli di 200 bp. Il fa o
che non si formino
frammen più piccoli di
200 bp signi ca che la
stru ura nucleosomica è
presente ma il core
istonico legherà dna in
una una dimensione di
circa 300 bp. Anche
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 aumentando la quan tà di enzima e il tempo non si o engono frammen più piccoli, per cui
quella di 300 bp sarà la subunità più piccola dato che l’enzima va a tagliare a quel livello. La
sbavatura del gel è invece dovuta al fa o che non vi è una spaziatura regolare, ma variabile.
È una stru ura non regolare rispe o a quella che abbiamo nel nucleosoma terrestre.

4) Il mo vo per cui
o eniamo frammen
con dimensione de nita
nel momento in cui
u lizziamo, in una
determinata sequenza
genomica, degli enzimi di
restrizione dopo
tra amento con la
nucleasi (che digerisce il
dna che non si trova
all’interno del
nucleosoma) è dovuto alla
posizione dei nucleosoma. Ossia quel frammento di dna avrà avuto un posizionamento
preferenziale dei nucleosomi ➞ la possibilità di o enere frammen iden ci è dovuto ad un
determinato posizionamento dei nucleosomi su quel segmento di dna. Non è sempre così,
ma in questo caso si.

LE MUTAZIONI ED I SISTEMI DI RIPARAZIONE DEL DNA:

- Possiamo avere danni lega alla ro ura del doppio lamento del dna
- Dovu a modi cazioni chimiche a livello dei nucleo di
- Che portano al legame tra due nucleo di su due lamen complementari.
Vari pi di danno:
1.DANNO IDROLITICO: ossia l’acqua può
provocare mutazioni spontanee del dna. Un
esempio è la deamminazione spontanea delle
citosine che diventano uracili. Oppure possiamo
avere delle depurinazioni delle guanine, ossia
perdono la base azotata. Oppure delle
me lcitosine che per deamminazione
diventano delle mine (le me lcitosine sono
delle basi modi cate che possono essere
presen a livello del genoma, hanno un ruolo
chiave per la regolazione
genica). Queste sono so orappresentate poiché una modi cazione di questo po è possibile
ma potenzialmente pericolosa perché appunto diventa una mina, quindi una base del DNA
che non viene riconosciuta come estranea dai sistemi di riparazione del DNA e quindi
pericolosa.
2. ALCHILAZIONE: quando dei gruppi me lici o e lici vengono trasferi su dei si rea vi delle
basi azotate, oppure sui fosfa dello scheletro ➞ non induce un immediato
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 disaccoppiamento tra le
basi: nell’immagine vediamo
l'accoppiamento citosina guanina e
l’aggiunta di un gruppo e lico su un
gruppo rea vo della guanina, in questo
caso da parte del carcinogeno
EMS
(E lmetanosulfonato) usato in
laboratorio per indurre mutazioni sul
dna. Tale alchilazione non porta al
disaccoppiamento tra le basi ma rende il
legame più labile, il quale può portare
anche a depurinazione (perdita della
base azotata) e se questa perdita non viene riparata si viene ad o enere un sito apurinico e
quindi una mutazione sul dna.
3. OSSIDAZIONE: avviene per lo più sulle guanine, poiché queste rispe o alle altre basi hanno
un potenziale di ossidazione molto più alto. Sono
quindi molto più rea ve nei confron delle
specie rea ve dell’ossigeno (es: H2O2
acqua ossigenata, ione idruro, ossigeno …). Sono
generate da radiazioni ionizzan e agen chimici:
abbiamo delle basi modi cate, come in questo
caso la idrossiguanina (acquisizione di un gruppo
ossidrilico) che non si andrà più
ad accoppiare con le citosine bensì con le adenine
➞ porterà a delle mutazioni che sono le
trasversioni.

4. RADIAZIONI UV: comporteranno

l’induzione di nuovi legami tra due
pirimidine che si trovano adiacen
sullo stesso lamento del dna. Si
formano quindi dei dimeri, degli anelli
ciclobutanici, che
comporterà ad una interruzione del
normale accoppiamento tra le basi ➞
non si potrà avere una corre a
replicazione del dna poiché non si sa
quale base dovrà essere aggiunta di
fronte il dimero (la cellula non
riconosce le basi giuste da aggiungere).
Per cui se viene aggiunta una base sbagliata dalla polimerasi, con scelta casuale, ci sarà la
mutazione. Nell’immagine in alto abbiamo la formazione ad esempio del dimeri di mina.
5. RAGGI X: questo porta alla ro ura del doppio lamento della molecola. È una ro ura più
pericolosa di quanto non lo sia una mutazione o la ro ura ad un singolo lamento che porta
al cambiamento di una base, che invece sono più facilmente riparabili.
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 6. ANALOGHI DELLE BASI: è dato dalla presenza di analoghi delle basi. Nell’immagine abbiamo
la 5-bromouracile che è un analogo della mina. Sono potenzialmente pericolosi per
la cellula poiché hanno stru uralmente delle
proprietà simili alle basi e quindi
possono essere anche incorporate nel dna.
Ma l’incorporazione implicherà anche errori per
quanto riguarda la replicazione. Uno degli agen
mutageni più no è appunto la base scri a
sopra, la quale porterà ad un
mismatch negli appaiamen e indurrà ad
interagire con le guanine ➞ questo porterà ad
un errore nella replicazione. È tendenzialmente
usata come mutageno sperimentale,
ma è possibile che si generi anche
naturalmente
nel corpo a par re dall’uracile per azioni di perossidazione.
7. AGENTI INTERCALANTI: possono essere presen agen intercalan , ossia molecole pia e
cos tuite da diversi anelli policiclici ➞ vanno ad alterare lo spaziamento tra le basi, per cui
inducono la possibilità di inserzioni o
delezioni. Vediamo l’E dio, che viene usato
spesso in laboratorio poiché si intercala tra le
basi azotate e se esposto a radiazioni UV da
origine ad un segnale uorescente. Ora a
causa delle sue cara eris che mutagene non
è più u lizzato. Fu usata ad esempio anche la
pro avina, che ha capacità disinfe an e
di ba eriosta co contro mol gram+ ➞ fu
usata come an se co locale o del tra o
urinario, ma ora non viene più u lizzata dato che ha proprietà di agente intercalante del dna.
Un agente di questo po si intercala tra la doppia catena e può causare delezioni,
duplicazioni o addizioni.

Un danno al dna dunque può portare a diversi e e , come ad esempio portare la cellula ad a vare
dei checkpoint a livello del ciclo cellulare, oppure possono a varsi dei programmi di regolazione
trascrizionale, può portare la cellula ad apoptosi… per cui lo scopo principale nel momento in cui si
ha un danno è quello di far sì che la replicazione del dna venga bloccata.

In questa slide vediamo per esempio quali sono le

funzioni di alcune proteine, come la p53, che vanno a
codi care determina geni e come tali proteine
rispondono in seguito ad un danno: in questo caso il
danno è dato da una radiazione ionizzante IR oppure
da una chemioterapia o da specie rea ve dell’ossigeno
➞ porta ad una serie di even a cascata che porterà
alla stabilizzazione di questa proteina p53, la quale
porterà o all’arresto del ciclo cellulare, o alla
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 riparazione del danno oppure farà in modo che la cellula vada incontro ad apoptosi per far sì che il
danno non venga portato avan .

SISTEMI DI RIPARAZIONE DEL DANNO AL DNA:

Possiamo avere 3 diversi meccanismi:
1. RIPARAZIONE DIRETTA: abbiamo la fotoria vazione e la rimozione del gruppo me lico.

La FOTORIATTIVAZIONE è un processo in cui l’energia che deriva dalla luce visibile viene
u lizzata per rompere l’anello (il ciclobutano) che si era formato in seguito alla
dimerizzazione delle pirimidine, causata dalle radiazioni UV. Grazie a questo meccanismo di
riparazione le basi originarie vengono ristabilite, e questo avviene grazie all’intervento
dell’enzima Dna fotoliasi ➞ si lega alla sezione di dna danneggiato in assenza di luce ma
viene a vato dall’esposizione alla luce, consentendo la ro ura del ciclobutano e quindi il
ritorno delle mine nella loro conformazione iniziale.
Consente quindi di
risolvere i dimeri di
mina.
La riparazione dire a può
essere anche e e uata
tramite

RIMOZIONE DEL
GRUPPO METILICO: in
questo caso si risolve un
danno causato da
alchilazione. Questo è un
meccanismo di
riparazione molto
importante che avviene
nel momento in cui il danno è a carico degli ossigeni in posizione 6 delle guanine (in cui
abbiamo la me lazione) poiché in questo po di danno il nucleo de modi cato va a formare
un complementare con le mine invece di andarsi a legare con le citosine. Viene riparato
dall’enzima O6-me lguanin me ltransferasi che trasferisce il gruppo me lico dall’ossigeno
in 6 della me lguanina ad un sito a vo dell’enzima dove è presente una cisteina ➞ diventa
una me lcisteina. Tali enzimi sono molto presente sia a livello delle cellule procario che che
eucario che.
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 2. RIPARAZIONE PER
ESCISSIONE DELLE BASI: Nella Base Excision
Repair (BER) abbiamo un lamento del dna
in cui abbiamo una base danneggiata. A
riconoscere tale danno interviene un
enzima, la Dna glicosilasi, che taglia tra la
base e lo scheletro (quindi il deossiribosio)
➞ fa in modo di rimuovere la base
danneggiata. Successivamente interviene
una AP endonucleasi (così chiamata poiché
la A è una a priva va,
ap= apurinico o apirimidinico) che va a tagliare lo scheletro a livello della zona in cui era stata
rimossa la base danneggiata. Interverrà poi una polimerasi a riparare, andando a sinte zzare
un pezze o di dna a livello della interruzione, rimuovendo una parte del dna a valle del
danno. In seguito per ripris nare lo scheletro interverrà una ligasi che andrà a perme ere il
chiudersi del lamento. Un altro po di riparazione per escissione è quella dei NUCLEOTIDI
(NER): nel momento in cui abbiamo un danno indo o da una radiazione UV questo porterà
ad una distorsione nella doppia elica. Questa sarà riconosciuta da un complesso di proteine
che vanno ad interagire con il doppio lamento: nei ba eri intervengono 4 proteine (UvrA,
UvrB, UvrC e UvrD) mentre negli eucario il meccanismo è lo stesso ma le proteine sono in
numero maggiore. Nella riparazione prima intervengono dei dimeri di UvrA e UvrB, che
scorrono sul doppio lamento no a quando non trovano la distorsione e reclutano la UvrC,
la quale ha invece il compito di tagliare il lamento
sia a monte che a valle della lesione (fa due tagli,
disegna in giallo). Successivamente interviene
l’ul ma proteina, la UvrD, che ha a vità elicasica ➞
apre il lamento e consente l'intervento della
polimerasi, che va a sinte zzare il nuovo lamento
sulla base dello stampo, e della ligasi che consente
invece la “saldatura”. Quindi
nella NER una serie di nucleo di vengono taglia ,

rimossi e sos tui . Un altro po è quella

della MISMATCH
REPAIR (MMR), che è sempre cara erizzata
dall’intervento di più proteine (un
complesso proteico) che perme erà di
andare a riconoscere la distorsione. In
questo caso tale distorsione è data da un
accoppiamento errato, un mismatch,
quindi non vi è un errore in uno solo dei
due lamen ma su entrambi. Una volta
riconosciuto il mismatch interverrà una
proteina analoga alla UvrC, quindi andrà a tagliare il dna su uno dei due lamen e a
consen re l’intervento della polimerasi per la riparazione. Per rendere noto quale dei due
lamen viene riparato, nelle cellule procario che, viene me lato il lamento vecchio a
livello delle adenine ➞ così che venga riconosciuto quello non me lato, come quello di
nuova sintesi. Quindi ci consente di riconoscere dov’è l’errore e quindi riparare solo quello di
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 nuova sintesi. Un’azione combinata di elicasi, ssb single strand binding proteins ed
esonucleasi rimuovono una porzione del lamento neosinte zzato e perme ono di colmare
questo intervallo grazie all’intervento della polimerasi e poi della ligasi. Risolvendo così
l’errore.
3. RIPARAZIONE PER RICOMBINAZIONE OMOLOGA: Per la riparazione delle ro ure a doppio
lamento. Sono meccanismi molto accura che si basano sull’omologia con il croma de
fratello per dirigere la sintesi di uno dei due
lamen . Per cui anche le ro ure a doppio
lamento sono potenzialmente riparabili
da meccanismi di ricombinazione
omologa. Oppure anche da meccanismi
non omologhi, che sono meccanismi meno
accura e più sogge ad errori dato che le
regioni terminali, della sequenza di dna che
deve essere riparata, devono essere
processa ed è molto più facile che
questo processamento seguito da una
ligazione possa portare ad errori (es: la mancanza di nucleo di in lamen non risol ).

SEQUENZE RIPETITIVE DEL DNA: un genoma eucario co è cara erizzato dalla presenza di un dna
ripetuto che può essere mediamente o altamente ripe vo.
Ci sono quindi sequenze che si ripetono molte volte nel dna di una cellula. Un esempio è la GGGTTA,
ossia le migliaia di sequenze ripetute del dna telomerico, localizzate alla ne di ciascun cromosoma.

Una sequenza ripe va la possiamo studiare poiché ha

delle determinate proprietà siche e quindi siamo in
grado di andare ad isolare u lizzando dei gradien di
densità. Per cui andando a centrifugare in un gradiente di
densità, u lizzando una sostanza come il cloruro di cesio,
possiamo andare a formare frazioni separate in base alla
densità di galleggiamento della sequenza, la quale
dipenderà dal contenuto in basi GC.
Quindi andremo a visualizzare una o più bande: quelle
principali sono quelle con contenuto medio di GC nel
genoma, ma possiamo anche visualizzare delle bande più piccole che corrispondono al dna satellite.

Quando parliamo di TANDEM REPEATS parliamo di ripe zioni consecu ve, incluse in 3 so oclassi:

- SATELLITI ➞ Dna altamente ripe vo

- MINISATELLITI e MICROSATELLITI ➞ Dna mediamente ripe vo.

Nel gra co vediamo i vari pi di satelli , la loro grandezza e il numero di copie presen per ogni po
di dna ripe vo.

SATELLITI: le cui dimensioni vanno da 100Kb no ad un milione di basi.

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 Un esempio molto di dna satellite è il dna alfoide,
localizzato nel centromero di tu i cromosomi. È
cara erizzato da unitá ripe va di 171 bp, e va a
comprendere circa il 3-5% di tu o il dna presente nel
cromosoma.

Sono i più cara erizza dna ripe vi

e sono localizza nelle regioni di eterocroma na
cos tu va, quindi nelle regioni iner che sono di solito le
regioni che si trovano a livello dei centromeri.

MINISATELLITI: da 1 a 20 Kb. Hanno la sequenza centrale che è GGGCAGGAXG, dove x sta per una
base generica.
Un minisatellite è l’unità ripetuta TTAGGG che è localizzata nei telomeri.
Un po di minisatellite sono le VNTR (Variable Number of tandem repeats), ripe zioni che possono
variare dalle 9 alle 80 basi e sono localizzate nelle regioni non
codi can . Sono molto importan poiché sono dei
polimor smi, ossia il numero delle ripe zioni varia tra i vari
individui e per questo mo vo vengono u lizzate per il dna
ngerprin ng ➞ u lizzato in ambito forense, medico,
evoluzionis co … sfru ando quelle cara eris che
che gli perme ono di di erenziarsi in
diversi individui.

Abbiamo due frammen di dna, uno di un

individuo è uno di un altro. Tra ques 3
geni A,B,C ci sono delle sequenze di dna
cara erizzate da un numero di
VNTR diverse.
Nell‘individuo 1 saranno di 8 e 4, nel 2 di 5
e 6 ripe zioni. Sfru ando gli enzimi di
restrizione (che tagliano a livello di
sequenze speci che del dna ➞
conoscendo dove l’enzima va a tagliare)
possiamo tagliare il dna e farlo migrare su
gel di agarosio in base alla sue dimensioni. Se andiamo ad u lizzare delle sonde, che ci perme ono
di legare in maniera speci ca il dna complementare che abbiamo tagliato, possiamo o enere diverse
bande che sono quelle che cara erizzano i diversi individui il cui dna è stato so oposto al taglio con
lo stesso enzima. Nell’individuo 1 o eniamo 2 bande, una più pesante di 8 di dimensione e una più
leggera di 4. Nell’individuo 2 invece abbiamo 2 bande intermedie di 5 e 6 ripe zioni.
Tali bande le possiamo u lizzare poiché sappiamo che il 50% delle bande o enute derivano da un
determinato genitore. Dunque nella progenie di due genitori, che hanno determinate ripe zioni tra
speci ci geni, dovremmo ritrovare nel 50% di ogni individuo le stesse bande.
Dunque analisi di questo po sono u li per i test di paternità (esempio dell’immagine con i 4 gli, di
cui 2 non condividono le bande con i genitori quindi non sono gli di entrambi).
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 Altro esempio: nel caso di un Sexual Assault Case si può andare a valutare la presenza di materiale
rinvenuto sulla scena ➞ possiamo andare a capire quale sospe ato è responsabile dell’assalto
andando a controllare la presenza di frammen speci ci. ➞ dunque con il dna ngerprin ng
sfru amo le cara eris che del dna per de nire
cara eris che individuali.

MICROSATELLITI: mediamente ripe vi, anche no come

Short Tandem Repeats (STR) poiché sono unità di 2-8 bp. Tu a
la regione ripe va sarà al massimo di circa 150 bp. Come i
minisatelli , anche queste sequenze sono polimor che e
anche queste possiamo u lizzarle per il dna ngerprin ng.
Se si hanno mutazioni a livello di tali microsatelli , solitamente
non si hanno e e feno pici ma è stato visto recentemente
che comunque tali mutazioni possono portare all’insorgenza di alcune mala e importan
(sopra u o a livello neurodegenera vo).
Sono molto numerosi nell’uomo, abbiamo circa 1 STR ogni 15-20000 bp.

Analisi di STR:
fa e tramite PCR, ovvero possiamo u lizzare delle coppie di primer che ancheggiano le sequenze
ripetute ➞ la lunghezza dell’ampli cato sarà proporzionale al numero di ripe zioni che sono presen
in un determinato campione.
Quindi in questo caso le analisi sono svolte mediante pcr, mentre nel caso di minisatelli u lizzando
degli enzimi di restrizione.

Abbiamo anche altri dna ripetu : DNA RIPETUTO INTERSPERSO: tali unità ripetute non sono
raggruppate ma sparse in più pun del genoma.
Sono tendenzialmente dei retrotrasposomi, delle sequenze che vengono acquisite a livello
evoluzionis co in seguito a infezioni virali.
Abbiamo:

- SINEs: short interspersed nucleo de elements. Presente in una regione genomica ricca di GC.
- LINEs: long interspersed nucleo de elements. Presente in una regione genomica ricca di AT.
Tendono a disporsi in regioni cromosomiche povere di geni e hanno un impa o minore dal
punto di vista mutazionale sul genoma.

Ma sono comunque sequenze

importan poiché si è visto che hanno un ruolo nella
comunicazione cellulare (anche le SINEs).
Studi recen mostrano come siano
par colarmente espresse in
condizioni par colari di stress e i risultan rna, che
sono trascri da tali sequenze, vanno a legare delle
chinasi come la PKR ➞ bloccando la capacità di
queste chinasi di ina vare la trascrizione. (Ruolo
importante nella trascrizione).
Circa il 21% del dna umano è cos tuito da LINE e
circa il 13% da SINE, per cui è altamente improbabile
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 che non abbiano ruoli.

Diagramma riassun vo del dna umano

LA REPLICAZIONE DEL DNA
Quando e come si è capito che è presente qualcosa nella cellula che deve essere replicato e che è
responsabile delle cara eris che ereditarie?
Esperimento di Gri th (1928): esperimento fondamentale a tali ni. Gri th, in quel periodo,
studiava un ba erio in grado di causare la polmonite➞lo pneumococco. Eseguì degli esperimen su
due ceppi ba erici: il primo ,il ceppo S virulento in grado di provocare la
polmonite (smooth=liscio perché produce
delle colonie lisce e lucen , ciò dovuto alla
presenza della capsula ba erica
polisaccaridica che avvolge le cellule),
quando u lizzava questo ceppo per
inie arlo nei topi ed eseguire
l'esperimento, ques morivano; il
secondo, il ceppo R non vivente
(rough=rugoso poiché manca la capsula e
le colonie che venivano prodo e erano di
po rugoso), e nel caso in cui venisse
u lizzato questo ceppo R i topi riuscivano
a vivere. In seguito Gri th uccise con il
calore i ba eri del ceppo S virulento che
inie ó in altri topi, i quali riuscivano a
vivere. Se venivano mescolate cellule
ba eriche morte del ceppo S con ba eri
vivi non virulen del ceppo R e questo mix venisse inie ato, i topi morivano.
Gri th aveva capito che ci dovesse essere qualcosa che si trasme e da un organismo a un altro, ma
non aveva ancora capito cosa. Dedusse che le cellule ba eriche avevano ricevuto delle istruzioni per
andare a trasformare e quindi produrre delle cellule patogene in grado di causare la polmonite.
Questa era una trasformazione permanente e quindi ereditabile, perché anche i ba eri delle
generazioni discenden dalle cellule ba eriche, che avevano subíto la trasformazione, andavano a
provocare anch'essi la polmonite.

Esperimento di Avery (1943): In questo esperimento Avery andò a frazionare l'estra o cellulare
proveniente dal ceppo letale S nelle diverse classi molecolari. Vide che solo quando venivano inie a
gli acidi nucleici, ma non quando venivano inie a proteine e polisaccaridi, avveniva la morte del
topo. Dedusse il DNA portatore dell’informazione gene ca o informazione ereditabile.
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 In quel periodo però era convinzione di usa
che il materiale gene co doveva essere per
forza di natura proteica; siamo di fronte a un
polimero cos tuito da 20 amminoacidi e ad un
altro da 4 nucleo di, e si era convin che
sicuramente l'informazione doveva essere
contenuta nelle macromolecole che si
prospe ava essere più grandi, che in
combinazione dovevano formare molecole più
complesse, quindi le proteine.
L’esperimento di Avery non fu acce ato poiché
veniva cri cata la non completa purezza degli
acidi nucleici che aveva u lizzato,
probabilmente erano presen tracce di
proteine nella soluzione.

Hershey e Chase (1952): dimostrarono e e vamente che è il

DNA il materiale gene co. Sfru arono le cara eris che del
fago, quindi svolsero i loro studi su un virus in grado di
infe are i ba eri. Il fago di loro interesse fu il T2, il quale
a acca le cellule di E. Coli e da queste capacità intuirono con
un semplice esperimento che doveva per forza essere il DNA il
portatore dell'informazione gene ca.
I due ricercatori prepararono in parallelo due colture di E. Coli. :
1. U lizzarono nel terreno di coltura zolfo marcato radioa vamente (S35): I ba eri che si
trovavano in una coltura di questo po metabolizzavano lo zolfo marcato assimilando ques
atomi radioa vi che venivano introdo nelle biomolecole presen nella cellula. Lo zolfo
marcato lo troveremo nelle proteine, in par colare nell’amminoacido cisteina, ma non lo
andremo a trovare nei nucleo di dove lo zolfo
non è presente. Fecero replicare il fago che ha
bisogno di introdurre nella cellula ospite il suo
materiale gene co, per poter sfru are
l'apparato di biosintesi ba erico. Osservarono
che nella progenie fagica non veniva rilevata la
radioa vità e quindi essendo lo zolfo il
portatore di radioa vità, il quale fa parte delle
proteine, non potevano essere, appunto, le
proteine il materiale gene co.
2.Nel terreno di coltura veniva invece u lizzato
il fosforo marcato radioa vamente (P32): il
fosforo marcato si trova nei nucleo di,quindi di
conseguenza negli acidi nucleici, e non sarà
presente in quan tà signi ca ve nelle proteine.
Nella progenie fagica, questa volta, hanno
veri cato la radioa vità e quindi essendo
radioa vo per presenza di
fosfato P32, a quel punto doveva essere il DNA
portatore dell'informazione gene ca.
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 Dopo questa importante deduzione però, il DNA doveva essere replicato.
Watson e Crick scrivono che a loro non è sfuggita la capacità di accoppiamento tra le basi azotate
poiché ci suggerisce che ci deve essere un meccanismo di copia del materiale gene co. Abbiamo
visto che esistono dei legami H, non covalen deboli, quindi possono essere uni e riuni in modo
abbastanza semplice(es. alte temperature o azioni meccaniche); in questo modo sappiamo che due
lamen possono essere allontana e replica e tu e le informazioni che si trovano in un lamento
possono essere replicate in un altro e ciò porterà alla replicazione del materiale gene co. Questo era
stato già de nito da Watson e Crick, i quali però non avevo ancora stabilito il meccanismo.

Il modello a doppia elica di Watson e Crick suggerisce un meccanismo di replicazione:

Il DNA viene duplicato prima di essere trasmesso da una cellula alle cellule glie nella fase S durante
l’interfase del ciclo cellulare.

La replicazione del DNA è semiconserva va: ad ogni ciclo si ha una

doppia elica che sarà formata da un'elica madre e un’elica glia di
nuova sintesi ad ogni replicazione.
Ciò si è capito da un altro esperimento importante ovvero quello di
Meselson-Stahl nel 1958. Ques due ricercatori fecero crescere dei
ba eri di E. Coli in un terreno di coltura ricco dell’isotopo pesante N15,
i microrganismi metabolizzano questo azoto N15 che quindi viene
introdo o nelle molecole biologiche,
compreso il DNA, il quale presente nei ba eri cresciu in questo ambiente sarà pesante poiché
andrà a inglobare atomi di azoto più pesan rispe o al solito azoto N14.
A questo punto abbiamo due beute che contengono colonie
di cellule cresciute in due condizioni diverse in coltura. Se
facessimo un gradiente di densità in cloruro di cesio, il
quale ci perme e di stra care le bande di DNA sulla base
della loro densità, avremo che cellule cresciute in azoto 15
avranno un DNA più pesante e una maggior densità,
mentre per cellule cresciute in azoto 14 avremo bande di
DNA più leggere➞ per quanto riguarda la generazione 0.
A questo punto trasferirono alcuni ba eri dal primo terreno
di coltura all’altro, quindi da dove era presente azoto 15 a
dove era presente azoto 14: i microrganismi metabolizzano l'azoto nelle basi azotate dei nucleo di
introducendo l'azoto pesante e andranno a formare nuove molecole di DNA; dopo ven minu , il
tempo necessario per formare una nuova generazione
ovvero a nché avvenga la replicazione del DNA nei ba eri,
alcuni di essi sono sta preleva dal terreno standard,
disa ed estra o da loro il DNA.
Nella generazione 1 in seguito a questo processo, viene
svolta nuovamente un'analisi densitometrica su gradiente
di cloruro di cesio e venne visualizzata e cara erizzata la
densità del DNA presente o enendo una banda di
dimensioni intermedie rispe o a quella precedente.
Facendo replicare il DNA e ripetendo ulteriormente il
processo si o engono ancora bande diverse. Questo
dimostra l'azione semiconserva va ( lamento vecchio che
si associa a un lamento nuovo) e non conserva vo altrimen si sarebbero dovute osservare solo
bande pesan o leggere e non anche bande di po intermedio.
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 La chimica della sintesi del DNA

● Deossinucleo de trifosfato con gruppo

ossidrilico in posizione 2
●
DNA che deve essere replicato➞ una
regione a doppio lamento perché ibridata
con un innesco e una regione a singolo
lamento. Per la sintesi di un DNA è sempre
necessaria la presenza di un innesco o
primer.
A nché avvenga la sintesi del DNA deve avvenire la
reazione di sos tuzione nucleo la di po 2 nella
quale il gruppo ossidrilico in posizione 3
dell’innesco leghi con il fosfato in alfa del
deossinucleo de trifosfato che deve essere aggiunto ed
esso sarà scelto sulla base della complementarietà allo
stampo. In questo caso un DATP reagirà con la mina
complementare, verrà a accato dal gruppo ossidrilico
in H libero del primer e liberato un pirofosfato. Lo
stampo determina quale dei deossinucleo di trifosfato
presen e disponibili nella cellula debba essere
aggiunto.

Il meccanismo d'azione della DNA polimerasi

1. La DNA polimerasi è l’enzima chiave che perme e questo po di reazione.
2. Controlla che sia possibile formare il giusto appaiamento, ma non controlla l'ingresso nel sito
a vo.
Nell'immagine di sinistra(pagina successiva), dove c'è l'appaiamento corre o, abbiamo in alto lo
stampo AG, la base dell’innesco collegata allo stampo è la C legata alla G, quindi il gruppo ossidrilico
in posizione 3’ dell’innesco dovrà andare a trovare il deossinucleo de idoneo per poter far avvenire
la sintesi, il quale è chiaramente il DTTP ovvero quello che porta la mina➞ base complementare
all’adenina che è presente sullo stampo. In questo caso la reazione avviene perché un appaiamento
corre o di questo po è nella posizione o male per formare il legame fosfodiesterico.
La polimerasi però non controlla l'ingresso nel sito a vo, per cui potrebbe entrare un altro
deossinucleo de trifosfato ovvero un DATP, che però non può legare l’adenina che si trova sul
lamento stampo poiché non ci sarebbe la possibilità di formare i gius legami H e per questo il
gruppo ossidrilico in posizione 3 dell’innesco si troverà troppo distante per poter legare il fosfato in
alfa e non sarà possibile che avvenga la reazione, infa la polimerasi u lizza un solo sito a vo per
catalizzare l'aggiunta di tu e 4 i nucleo di. Questo è permesso grazie al fa o che le copie che si
possono formare AT e GC hanno la stessa geometria.
Il meccanismo con cui lavora la DNA polimerasi è un esempio di selezione cine ca➞l’enzima
favorisce la catalisi di uno dei substra con cui può interagire aumentando la velocità solo quando è
presente il substrato corre o, se è presente il substrato non corre o la reazione non avviene perché
le condizioni non sono ideali (il nucleo de può inserirsi nella tasca del sito a vo dell’enzima, ma
l’ossidrile non riesce a far par re la reazione oppure potrebbe riuscirci se eventualmente ci fosse il
tempo necessario a nché ciò posso accadere, ma essendo che nella tasca possono entrare anche i
nucleo di corre , appena entrerà quello corre o solo esso verrà riconosciuto e perme e che la
reazione si veri chi).
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 DNA polimerasi discrimina tra dNTP e rNTP
La DNA polimerasi oltre a trovarsi deossinucleo di trifosfato può ritrovare anche ribonucleo di
trifosfato, presen all'interno della cellula 10 volte di più rispe o alle deossi. I ribonucleo di non
vengono incorpora dalla polimerasi o lo farebbero in maniera potenzialmente molto più lenta,
proprio per selezione cine ca, poiché la polimerasi ha in una zona del suo sito a vo la presenza di
amminoacidi discriminatori: sono degli amminoacidi che formano delle interazioni di van der Waals
con lo zucchero deossiribosio e non con il ribosio perché presente il gruppo ossidrilico in posizione 2.
Ques legami non sono possibili poiché il ribonucleo de trifosfato entra nel sito a vo dell’enzima,
l’uracile approva la complementarietà e si può legare, ma il ribonucleo de ha anche un gruppo
ossidrilico in due ➞ciò implicherebbe l'istanza diversa tra lo zucchero e il sito a vo cara erizzato
dalla mancanza di forze di van Der Waals che si possono avere tra zucchero e amminoacidi
discriminan , quindi di nuovo la distanza tra gruppo ossidrilico in 3 dello zucchero e il fosfato in alfa
non sarà o male e non avverrà la reazione.
È il DTTP che perme e non solo di interagire con lo stampo, ma anche di interagire con tasca
enzima ca in cui sono presen gli amminoacidi discriminatori.

Stru ura della DNA polimerasi

La polimerasi è una mano che a erra la giunzione tra innesco e stampo:
1. Le dita sono quelle che entrano in conta o con
lo stampo e formano una curvatura in modo da
andare a esporre al sito a vo solo la prima
base dello stampo e così evita confusione nella
scelta dei deossinucleo di trifosfato che
devono essere aggiun , essendo esposto solo il
primo.
2. Il pollice in questa stru ura ipote ca non vi è
coinvolto nella reazione catali ca, ma è quella
regione dell’enzima che interagisce con il DNA
neosinte zzato e lo man ene nella posizione
corre a.
3. La regione del palmo è quella che controlla il corre o appaiamento e veri ca e e vamente
se può avvenire la reazione sulla base delle opportune distanze tra i gruppi funzionali rea vi.

DNA polimerasi è anche esonucleasi corre ore di bozze La

polimerasi ha, inoltre, un ruolo di esonucleasi corre ore di
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 bozze➞rimuove eventuali nucleo di che sono
sta male accoppia , quindi dà una seconda
possibilità alla cellula (all’enzima stesso di
aggiungere il giusto nucleo de).
Possibilità che ci sia uno scorre o appaiamento
dell'ul ma base:
a. viene aggiunto il nucleo de sbagliato, si
altera la geometria del gruppo ossidrilico
in posizione 3’ e comporterà una
diminuzione dell'interazione tra un
nucleo de e quella regione che controlla
l’appaiamento (palmo) ➞conseguente
riduzione della velocità dell'a vità
catali ca che porterà a preferire un'a vità esonucleasica;
b. La polimerasi, come per la sintesi, non si stacca dal DNA, ma rileva la presenza di un errore,
destabilizza l’innesco stampo che porterà alla formazione di molte basi non appaiate, quindi
non solo l'ul ma base, che viene riconosciuta come sbagliata, verrà eliminata. Viene
destabilizzato dire amente il processo di sintesi(l'interazione tra stampo e primer, c'è una
modi cazione conformazionale dell’enzima che porterà all’interazione con il sito a vo
esonucleasico e si avrà il taglio della porzione del nucleo de errato) e una serie di basi
adiacen (regione con gua che era già stata sinte zzata a buon ne) a quella sbagliata deve
essere disaccoppiata➞ anche quelle vicine.
c. Questo porterà alla rimozione di una porzione di DNA neosinte zzato e verrà rimossa,
tagliata per ricominciare con la sintesi di nuovo DNA, rimuove il nucleo de errato e
riaccoppia poi quello corre o➞ripris no della normale a vità di sintesi con conseguente
rallentamento della polimerasi.

L'a vità esonucleasica è fondamentale agli enzimi, per un enzima come la DNA polimerasi è chiave
poiché essa ha bisogno sempre di
correggersi➞gli errori sono rari, ma non
rarissimi se pensiamo alla complessità del
meccanismo (1 errore ogni 10^7 bp), per
fortuna ques errori possono essere rido
ancora di più sulla base del fa o che la
polimerasi ha questa capacità di
autocorrezione.
La DNA polimerasi presenta si separa per
la sintesi del DNA e per l'a vità di
autocorrezione.
L’enzima cambia di conformazione e
perme e di modi care l'a vità da quella di
polimerizzazione a quella di autocorrezione;
dal momento in cui è presente un nucleo de sbagliato c'è un cambiamento di conformazione che
implica un non appaiamento tra stampo e DNA neosinte zzato e taglia, per a vità esonucleasica, il
nucleo de errato e avvia il ripris no delle condizioni iniziali.
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 L'a vità di autocorrezione spiega perché la sintesi avviene solo in direzione 5’-3’ Il DNA si legge in
direzione 5:-3’ e non 3’-5’. Perché la cellula non usa anche l'altro orientamento? ➞ l'a vità di
autocorrezione è possibile solo se la sintesi avviene in direzione 5’-3’. Vediamo nell’immagine una
crescita ipote ca di un lamento in direzione
3’-5’ (quindi il deossinucleo de trifosfato che
deve essere aggiunto a un lamento di DNA
in crescita). Se questo nucleo de fosse errato
e la polimerasi potesse autocorreggersi, lo
rimuoverebbe➞ al 5’ la rimozione del
deossinucleo de fosfato porterà alla
mancanza del legame ad alta energia che
deve essere idrolizzato ovvero il rilascio del
pirofosfato. Quindi quello corre o in arrivo
non potrà legarsi a causa della mancanza del
fosfato in beta e gamma che sono quelli che
danno il legame ad alta energia idrolizzabile, i
quali perme ono la reazione e di
conseguenza l'errore non può essere
corre o. Ciò può avvenire solo se la crescita ipote ca avviene in direzione 3’-5’ e non se avviene in
5’-3’ perché nel momento in cui viene rimosso il nucleo de erroneamente appaiato e una volta
aggiunto il nuovo deossiribonucleo de trifosfato è possibile l'interazione perché avviene l'idrolisi del
legame ad alta energia. Una reazione energe camente favorita è quindi possibile e ciò può avvenire
solo in direzione 5’-3’.

BIOLOGIA MOLECOLARE 31/03/2021

Nella sintesi del DNA entrambi i
lamen devono esser replica e lo
faranno contemporaneamente e
quindi ci sarà una loro separazione a
livello della FORCA REPLICATIVA,
dove sono a vamente sinte zzate
le catene di DNA. La forca replica va
si sposta verso il DNA non
denaturato quindi verso il DNA che è
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 ancora a doppio lamento. Noi sappiamo che il DNA è di po an parallelo, per cui la polimerasi
lavora in direzione 5’-3’, che vorrà dire che vengono aggiun dei nucleo di all’estremità 3’. Questo
comporterà che solo uno dei due lamen potrà essere replicato in maniera con nua, dato che solo
uno dei due avrà il 3-OH disponibile, l’altro lamento invece impone all’enzima il movimento opposto
rispe o a quello che fa la forca replica va. Per cui avremo: il FILAMENTO GUIDA (che verrà replicato
in maniera con nua) e il FILAMENTO DISCONTINUO (replicato in maniera discon nua). La
polimerasi, quindi sinte zza il lamento guida appena lo stampo è disponibile, perché sarà
disponibile l’ossidrile in 3’ e quindi la reazione potrà procedere; quello discon nuo è invece ritardato,
ovvero la forca dovrà creare una quan tà su cientemente lunga di DNA a singolo lamento che
dovrà essere sinte zzato in direzione opposta rispe o al lamento guida e questo lo farà u lizzando
tan piccoli frammen di DNA discon nui, ossia i frammen di Okazaki. Nella reazione di
replicazione non abbiamo solo bisogno della polimerasi, ma di tu a una serie di enzimi che aiutano
la polimerasi. Infa , sappiamo che la polimerasi non può lavorare su un nuovo lamento senza un
qualcosa a cui ancorarsi, ossia aggiunge nucleo di soltanto su un lamento preesistente e quindi
sono necessari degli inneschi (PRIMER A RNA). I primer a RNA sono dei pezze ni di RNA che sono
sinte zza da degli enzimi de PRIMASI. Le primasi sono delle RNA-polimerasi DNA dipenden , che
perme ono la formazione di cor inneschi a RNA (circa 10 nucleo di). Solo dopo la formazione di
questo primer la polimerasi potrà agire sul DNA per andare ad aggiungere nucleo di. Nel lamento
guida ci sarà bisogno di un solo primer perché la reazione è poi CONTINUA; mentre nel lamento
discon nuo avremo bisogno di tan inneschi (uno per ogni frammento di Okazaki). I primer sono
però a RNA quindi a nché una replicazione del DNA possa essere de nire completa ques primer
dovranno essere rimossi; la loro rimozione avviene ad opera da altri enzimi ossi le RNAsi H (H sta per
Hybride perché è un enzima che va a lavorare solo sull’RNA legato a del DNA). Quindi rimuove l’RNA
quando è legato al DNA andando a creare degli intervalli (GAP) all’interno del doppio lamento;
intervalli che poi potranno essere riempi dalle polimerasi perché in questo caso sa dove appoggiarsi
e quindi può lavorare; poi interverrà un altro enzima (LIGASI) che dovrà andare a chiudere questo
intervallo.
Per esempio, cosa succede nei telomeri? Nei telomeri quando l’innesco a RNA viene rimosso non c’è
nessun innesco a monte dove la polimerasi può legarsi per riempire il vuoto lasciato dalla rimozione
dell’innesco e quindi questo sta ad indicare il potenziale accorciamento del DNA telomerico.
Un altro enzima che deve intervenire è l’ELICASI. Serve a separare i
due lamen , sono enzimi che agiscono in sinergia con le primasi e
poi agiscono in quella che viene de nita modalità processiva, ovvero
sono enzimi che restano associa al substrato (DNA) separando un
numero elevato di coppie di basi. Quindi sono degli enzimi che si
legano e si spostano lungo il DNA, per spostarsi hanno bisogno di
energia che viene fornita dall’ATP. L’enzima, nell’immagine, è una
forma di anello che va a legarsi al DNA (sono di solito delle proteine
esameriche che assumono una conformazione ad anello legndosi al
DNA).

Altri enzimi che servono a nché la replicazione sia e ciente sono le ssDNA Binding protein (SSB).
Quando l’elicasi porta alla formazione del DNA a singolo lamento, ques DNA a singolo lamento
tenderebbero riassociarsi tra di loro e questo non deve accadere, per cui per stabilizzare ques DNA
a singolo lamento intervengono queste proteine. Queste sono proteine che lavorano in maniera
coopera va, ovvero la presenza di una di esse facilita il legame di un’altra. Questo legame
coopera vo da parte delle SSB fa in modo che il singolo lamento venga ricoperto dalle proteine in
maniera molto rapida e il DNA assume la conformazione distesa e con questa formazione è più facile
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 per il DNA svolgere il ruolo di stampo. Queste SSB interagiscono creando delle interazioni
ele rosta che con i gruppi fosfato del DNA, quindi è un’interazione sequenza-indipendente (non
dipende dalle basi azotate, ma dai gruppi fosfato).
Un elemento chiave della processività (ossia capacità di un enzima di essere legato a un substrato in
maniera da poter agire in modo con nua vo su un templato) a livello della forca replica va è data
dall’associazione di diverse proteine che si chiamano DNA SLIDING CLAMP (pinza scorrevole), che
vanno ad abbracciare il DNA e non se ne dissociano mai. Queste proteine si legano al DNA e alla DNA
polimerasi e sono molto importna perché altrimen , in loro assenza, il DNA si dissocerebbe dallo
stampo e di onderebbe nell’ambiente circonstante; se ci sono invece le sliding clamp la DNA-
polimerasi, nel momento in cui ha nito di lavorare, si dissocia dallo stampo ma rimanendo legata
alla sliding clamp non si allontanano dal punto di sintesi, per cui sono rapidamente richiamate
quando devono riiniziare a lavorare. Quindi sono proteine importan perché aumentano la
processività delle polimerasi. Queste sliding clamp riescono a lavorare sul DNA u lizzando altri
enzimi che si chiamano caricatori speci ci delle pinze che posizionano le sliding clamp sul DNA.
Nell’immagine vediamo che ci sono tan piccoli primer nel lamento discon nuo (verde) la
polimerasi agisce su di esso ma nel momento in cui viene raggiunto il frammento successivo, però il
fa o che la polimerasi è tenuta sul DNA dalle sliding clamp fa sì che la polimerasi sia velocemente
disponibile per la sintesi di un nuovo frammento. (per cui queste proteine anche se presen su
entrambi i lamen , sono molto più importan nel lamento discon nuo). Le sliding clamp restano
legate al DNA perché possono interagire anche con altre proteine, oltre alle polimerasi; ad esempio,
se c’è un errore le sliding clamp interagiscono con quelle proteine che sono coinvolte nella
riparazione del DNA. Quindi hanno un ruolo importante nell’aumentare la processività delle
polimerasi, ma anche perché partecipano alla riparazione del DNA.
Processività della DNA-polimerasi = il numero di nucleo di che una molecola di enzima aggiunge
alla catena nascente di DNA prima di staccarsi dal substrato. La polimerasi impiega circa 1 secondo
per legarsi al DNA ed è in grado di aggiungere no a 1000 nucleo di/secondo.
Quindi quando parliamo di replicazione del DNA non ci limi amo a parlare della polimerasi ma
dobbiamo considerare tu o un insieme di proteine importan (elicasi, SSB, pinza scorrevole o sliding
clamp, ssatore della pinza che perme e di posizionare la pinza scorrevole sul DNA). L’insieme di
queste proteine prende il nome di REPLISOMA.
Come fa la DNA-polimerasi a rimanere a livello della forca replica va nel lamento ritardato? Si fa
proprio aiutare dalle sliding clamp. Da Bruce Alberts è stata proposta una soluzione alterna va che
perme e di capire la processività della polimerasi; Alberts ha ipo zzato che la polimerasi nel
lamento ritardato si lega alla forcella di replicazione interagendo con altri elemen stabili della
forcella, tra cui sliding clamp ed elicasi. Disegnò, quindi, un modello che perme esse di visualizzare
la forca replica va, non con la classica stru ura ad Y, ma con una sorta di anello che si va ad
espandere durante la sintesi e che si va a sviluppare nel momento in cui si devono formare i vari
frammen di Okazaki. Sono anelli che quindi vanno ad espandersi e a contrarsi durante la sintesi del
frammento ritardato, che sono possibili grazie alla processività della polimerasi sul lamento
ritardato data da tu e le altre proteine che perme ono l’espansione della forca replica va e la
sintesi del DNA. Questo modello prende il nome di modello a trombone che si apre e si stringe man
mano che la forca replica va si espande e quindi rende disponibili nuovi nucleo di. Ovviamente
questo accade limitatamente al lamento ritardato ma non a quello con nuo.

h ps://www.youtube.com/watch?v=4jtmOZaIvS0

Dal video che abbiamo visto si vedeva in blu l’elicasi che svolge il DNA, un lamento viene
sinte zzato in maniera con nua e l’altro lamento viene sinte zzato in maniera discon nua facendo
indurre al DNA questa stru ura a loop, perme endo che la polimerasi si trovi sempre in condizioni
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 tale da andare a riconoscere il frammento di DNA che deve essere replicato ma che in questo caso è
nella direzione opposta. Questo è possibile grazie al fa o che il macchinario proteico che si assembla
a livello della forca replica va aumenta la processività dell’enzima, poiché la polimerasi lega il
caricatore della pinza, che lega la pinza e perme e al DNA di lavorare sul frammento ! quindi la
polimerasi non si troverà mai distante dal caricatore della pinza, dove è presente il DNA che rimane
sul DNA sempre caricata e perme e alla polimerasi di volta in volta di riposizionarsi velocemente sul
frammento che deve essere sinte zzato. Alberts ha immaginato che per far ciò c’era chiaramente
l’azione di tu o il macchinario proteico a livello della forca replica va e che il DNA dovesse assumere
questa forma a trombone, ovvero che il DNA si accorcia e si allarga con nuamente, man mano che
va ad indurre la formazione di un nuovo lamento di un frammento nuovo nel frammento ritardato.
Per polimerasi, sia per le cellule
procario che sia per le cellule
eucario che, parliamo di un pull
di enzimi che vanno a lavorare
sul DNA: abbiamo 5 polimerasi
nei procario e 15 polimerasi
negli eucario . Quello principale
è uno, l’enzima che serve per la
replicazione del lamento
ritardato che ha la maggior
processività; gli altri sono una
serie di enzimi che aiutano
quello principale, che
perme ono la sintesi dei frammen e degli inneschi e perme ono anche i processi di riparazione del
DNA che è stato danneggiato, (quindi perme ono anche di poter con nuare una sintesi che si è
fermata per un danneggiamento). Sono tu a una serie di enzimi che lavorano insieme all’enzima
principale per perme ere una corre a sintesi del DNA.
DOMANDA
1. Perché è necessaria la replicazione del DNA? Per avere la stessa quan tà di DNA in entrambe
le cellule, dopo la divisione cellulare.
2. Quando avviene la replicazione? Avviene nell’interfase.
3. Come avviene? Parlare degli enzimi principali e il loro ruolo.
Come inizia la replicazione?
Comincia a livello della forca replica va, ma deve iniziare a livello di
una sequenza speci ca, ovvero di sequenze speci che che vanno a
dirigere la replicazione: sono le sequenze REPLICATORE, che saranno
riconosciute da degli INIZIATORI, ovvero da elemen del DNA che si
trovano a livello di queste sequenze, che perme eranno che possa
iniziare il ruolo della GIRASI in primis, e poi di tu o il macchinario
osservato in precedenza. Quindi ci sono sequenze speci che che
perme ono l’inizio della replicazione. Queste sequenze sono le origini
di replicazione; si trovano ad intervalli che possono variare dalle 30 alle
300 base pairs nel DNA. Se vediamo la velocità di replicazione del DNA,
infa , in una cellula eucario ca, è di circa 50 nucleo di al secondo. Il
DNA umano però sappiamo che è formato da 150 milioni di paia di
basi, e se ci fosse una sola origine di replicazione, il tempo di
replicazione sarebbe al ssimo (ci servirebbero 800 per andare a
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 duplicare tu o questo materiale). Siccome la replicazione avviene in un tempo più breve, vorrà dire
che varie unità di replicazione dovranno essere a vate contemporaneamente in una cellula
eucario ca: quando una forcella di replicazione ne trova un’altra, che procede in senso opposto, si
uniscono e si arresta e o mizza il tempo.
Vedete in questa immagine, nel DNA ci possono essere più origini di replicazione e si formano quindi
diverse forcelle di replicazione, che si uniscono tra di loro quando si
incontrano. Quindi ci sono varie origini di replicazione, che
comporterebbero che un genoma di un mammifero potrebbe essere
replicato addiri ura in un’ora: in realtà serve più tempo, circa 8 ore
in una cellula animale per la sintesi. Questo perché, si ci sono unità
di replicazione ogni 30-300 base pairs (dipende dal genoma) ma non
sono tu e a vate insieme. Gran parte sono a vate e perme ono
questa replicazione in circa 8 ore.
Questo vale per il genoma di una cellula eucario ca; per quanto
riguarda quella di una cellula procario ca c’è una sola origine di
replicazione, poiché il genoma è molto più piccolo.
Le di erenze di base tra replicazione tra procario ed eucario sono
queste:

➢ Procario : il cromosoma è circolare, la replicazione comincia in un solo punto e avviene nel

citoplasma (manca il nucleo). L’enzima principale della replicazione è la polimerasi 3; una
sola bolla di replicazione;

➢ Eucario : i cromosomi sono lineari e molto lunghi, ci sono diverse origini di replicazione, e
avviene nel nucleo. L’enzima principale della replicazione è la polimerasi alfa e delta; molte
bolle di replicazione.
DOMANDE
La DNA polimerasi assicura che il nucleo de corre o è incorporato nel crescente lamento di DNA…
- Rilevando l’iden tà del nucleo de in arrivo;
- Legando in modo speci co solo il corre o nucleo de nel sito a vo;
- Selezionando il corre o nucleo de in un sito a vo con a vità esonucleasica della DNA
polimerasi;

- Monitorando la capacità del nucleo de in arrivo di formare legame AT o GC ! perché solo

se si forma l’appaiamento corre o, il gruppo ossidrilico in 3’ del primer e il fosfato in alfa del
nucleo de in ingresso, si trovano nella posizione o male per far sì che avvenga la reazione e
la liberazione del pirofosfato. E’ la reazione favorita a livello cine co ed in questo caso si evita
che un nucleo de sbagliato venga inserito.
Quali delle seguen a ermazioni riguardan la direzione della sintesi del DNA sono vere?
- Sul FILAMENTO DISCONTINUO la DNA polimerasi sinte zza il DNA nella stessa direzione in
cui si muove la forca di replicazione;
- Sul FILAMENTO GUIDA la DNA polimerasi sinte zza il DNA nella stessa direzione in cui si
muove la forca di replicazione;
- Sui due lamen la DNA polimerasi sinte zza il DNA in direzione 5’-3’.
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 - Sul FILAMENTO GUIDA la DNA polimerasi sinte zza il DNA in direzione 5’-3’, mentre sul
FILAMENTO DISCONTINUO la DNA polimerasi sinte zza in direzione 3’-5’.
Quale dei seguen fa ori contribuisce alla capacità delle cellule eucario che di completare la
replicazione del DNA durante il breve lasso di tempo proposto dalla fase S?
- Il successivo ciclo di replicazione prima che la cellula termini la fase S;
- La DNA polimerasi eucario ca ha una processività molto maggiore rispe o agli altri
organismi con genomi più piccoli;
- Per ogni cromosoma sono a vate più origini di replicazione;
- Le origini di replicazione possono cominciare dopo che sono state già replicate e prima della
mitosi.
DEFINIZIONI
PRIMER = breve sequenza di RNA sinte zzata sul lamento in ritardo durante la replicazione del DNA
e successivamente rimosso;
LIGASI = enzima che unisce i due lamen del DNA adiacen insieme;
RIPARAZIONE DEL MISMATCH = processo di riparazione del DNA che sos tuisce i nucleo di erra
inseri durante la replicazione del DNA;
ELICASI = enzima che apre l’elica del DNA separando i singoli lamen
SLIDING CLAMP = complesso proteico che circonda la doppia elica del DNA e si lega alla polimerasi
mantenendo saldamente legato il DNA mentre si muove;
TOPOISOMERASI = enzima che si lega al DNA e rompe in modo reversibile un legame fosfodiesterico
in uno o entrambi i lamen , perme endo al DNA di ruotare in quel punto;
FORCA DI REPLICAZIONE = regione a forma di Y di una molecola di DNA replicante nella quale sono
eviden i due lamen che si devono andare a replicare;
FILAMENTO DISCONTINUO = nuovo lamento di DNA che si trova a livello di una forca di
replicazione che viene prodo a in maniera discon nua e ques frammen vengono uni
successivamente;
VERO O FALSO
• Se le o nella stessa direzione, da 5’ a 3’, la sequenza di nucleo di di un lamento di DNA
appena sinte zzata è la stessa di un lamento parentale usato come modello per la sua
sintesi ! FALSO, non sarà lo stesso, ma sarà complementare.
• Ogni volta che il genoma viene replicato, metà del DNA appena sinte zzato, è cucito insieme
ai frammen di Okazaki ! VERO
• In Escherichia Coli, dove la forcella di replicazione viaggia a 500 coppie di nucleo di al
secondo, il DNA davan alla forcella, se non ci fossero topoisomerasi, dovrebbe tornare a
quasi 3000 giri al minuto ! VERO, se abbiamo 10,5 nucleo di per giro d’elica, bisogna
vedere quan giri d’elica sviluppare per ogni secondo, quindi 500 : 10,5 = 50 rivoluzioni al
secondo x 60 = 3000 (solo in assenza di topoisomerasi, perché altrimen questo po di
rivoluzioni è dovuto all’intervento di queste ul me che introducono dei tagli transitori).
PROBLEMA
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 ▪ Questo frammento di DNA è a doppio lamento ad ogni estremità, ma singolo nel mezzo. È
indicata la polarità del lo superiore, e il fosfato che è mostrato sul lamento inferiore ha
l’estremità 5’ o l’estremità 3’ del frammento a cui è a accato? ! Il fosfato è in 5’, perché
dobbiamo ricordare che sono an paralleli, quindi anche se c’è una porzione di DNA assente,
il fosfato si trova in 5’.

▪ Osserviamo a entamente le stru ure delle molecole nella gura:

Che cosa aspe eres che accada se una di-deossi-ci dinatrifosfato è aggiunta in eccesso
ad una reazione di replicazione del DNA rispe o ad una deossi-ci dinatrifosfato. Questo
nucleo de sarebbe incorporato al DNA, e se lo fosse cosa succederebbe dopo? Spiega
perché. ! Il legame probabilmente si forma ma poi la DNA polimerasi non trova un gruppo
ossidrilico al 3’ per con nuare la replicazione.
Cosa accadrebbe invece se me essimo sia la di-deossi-ci dinatrifosfato ma anche la
deossi-ci dinatrifosfato? (Il 10% di-deossi e il resto deossi) ! Avverrebbe che 1 su 10 di
ques nucleo di verrà incorporato, quando si trova la G di fronte. Alcuni frammen saranno
cor perché in alcuni frammen verrà incorporata la di-deossi, che in assenza di gruppo
ossidrilico impediranno il proseguimento della sintesi.
Se invece venisse aggiunta la di-deossi-ci dinaMONOfosfato, che cosa potrebbe
succedere? Non crea nessun problema, perché manca il pirofosfato, quello necessario
a nché avvenga la reazione, quindi la presenza di un nucleo de di questo po non ha e e
perché comunque sia verranno incorpora i DEOSSI-nucleo di trifosfato e non quelli che
sono monofosfato.
Questo esercizio è importante perché riassume le basi di quello che è il sequenziamento, la tecnica
madre ovvero quello di Sanger, si basa sull’u lizzo nei mix di reazione di di-deossi-nucleo di
trifosfato marca e tagga in maniera speci ca, che si incorporeranno al DNA, e che daranno un
segnale preciso: la reazione si blocca però il poter leggere quale di-deossi nucleo de si incorpora, ci
perme e di iden care la base di riferimento, e quindi è un metodo chiave u lizzato nei
sequenziamen di prima e seconda generazione.

▪ La perdita delle esonucleasi di correzione delle bozze da 3’ a 5’ che cara erizza l’a vità delle
DNA polimerasi, ipo zzi che possa andare ad in uenzare la fedeltà della sintesi del DNA? In
che modo questa perdita di a vità può andare ad in uenzare il tasso di sintesi del DNA?
Spiega il tuo ragionamento ! se l’enzima non fosse più capace di correggersi, ci sarebbero
delle mutazioni perché venendo lega dei nucleo di diversi, il prodo o diverso sarà un
genoma diverso. Bisogna considerare che quando c’è un errore di sintesi, un accoppiamento
sbagliato, in teoria se si perdesse l’a vità esonucleasica dovrebbe aumentare il tasso di
sintesi perché l’enzima nel momento in cui incontra l’errore si ferma e lo ripara. L’enzima
tende ad una posizione di stallo momentaneo, perché deve rimuovere il nucleo de sbagliato
e inserire quello corre o. Se manca l’a vità quello “parte” e con nua e non si ferma, però
non potremmo de nire un ra ng esa o di capacità da parte dell’enzima di mutare il tasso di
sintesi in assenza di esonucleasi. Sarei più propenso a dire, che in presenza di capacità
esonucleasica l’enzima si deve fermare, probabilmente il tasso di sintesi si abbassa un a mo.
Sicuramente la fedeltà è in ciata perché intercorre la potenzialità di un eventuale errore,
quindi di potenziali mutazioni.

▪ La primasi è un’enzima inu le, che produce mol errori: alla ne i primer a RNA, che
vengono prodo , vengono sos tui dal DNA che viene prodo o dalla DNA polimerasi, che
rispe o ad una RNA polimerasi è molto più fedele. Sarebbe stato più e ciente dal punto di
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 vista energe co, se fosse subito stato possibile dalla polimerasi andare a produrre una copia
accurata? A rigor di logica, potrebbe essere corre o; ci sono dei passaggi che a livello
cellulare possono sembrare inu li, ma in realtà sono dei passaggi che servono come un
ulteriore controllo da parte della cellula per vedere se è tu o okay, e di “velocizzare” il
processo: l’RNA polimerasi comme e mol più errori rispe o alla DNA polimerasi, quindi in
quei frammen di RNA lega al DNA ci possono essere degli errori molto più facilmente di
quanto non ce ne siano se li avesse inseri la DNA polimerasi; però fa prima a lavorare e
perme e alla DNA polimerasi, che è molto più accurata e lavorerebbe con più calma di
funzionare in maniera più rapida, anche perché c’è un altro controllo dopo, dato di nuovo
dalla DNA polimerasi che toglie quel pezzo e va a cucire i pezzi ! maggior e cienza del
processo di non doversi stare a preoccupare subito di qualcosa di cui ci si può curare dopo e
per o mizzare i tempi. Quindi un processo apparentemente inu le in realtà è un
“escamotage” della cellula per poter valutare in maniera più “tranquilla” il prodo o e lo fa
post.
DOMANDE

▪ Le proteine SSB si legano al DNA a singolo lamento durante l’a o di replicazione e

prevengono la formazione di eliche a forcina cor che altrimen impedirebbero la sintesi del
DNA. Che po di sequenze nel DNA a singolo lamento potrebbero essere in grado di
formare una forcina? La possibile formazione di stru ure secondarie: quali sono le forcine e
come sono fa e, disegnare una sequenza di DNA che potrebbe dar luogo ad una forcina.

▪ Il danno al DNA può interferire con la sua replicazione. I raggi X, ad esempio, generano
radicali idrossilici altamente rea vi che possono rompere uno o entrambi i lamen del
DNA. La luce ultraviole a genera comunemente dei dimeri di ciclobutano tra basi T
adiacen nello stesso lamento di DNA che blocca la progressione della DNA polimerasi. Se
questo danno non viene riparato si possono avere gravi conseguenze quando viene
incontrata una forca di replicazione. Cosa succede dopo che si è veri cata questa
interruzione a livello del lamento di DNA quindi quando abbiamo i raggi X che formano la
ro ura di uno dei due lamen di DNA, e cosa succede a livello della replicazione? Cosa
succede quando abbiamo l’e e o di una luce ultraviole a che va a formare i dimeri di
mina? La di erenza è che nei raggi X con l’interruzione del lamento guida o nel lamento
ritardato la forca di replicazione andrà a collassare immediatamente e si forma un DNA a
doppio lamento con delle interruzioni; se invece si forma un dimero di mina, prima o poi la
polimerasi sme erà di lavorare, ma uno dei due lamen non viene in ciato e potrebbe
con nuare la sintesi, l’altro si arresta momentaneamente.

BIOLOGIA MOLECOLARE 07/04

LA TRASCRIZIONE

Trascrizione nei procario :

La trascrizione nei procario è un processo più semplice rispe o a ciò che avviene negli eucario .
Il dogma centrale della biologia molecolare: l'informazione gene ca uisce dal DNA, passa per l'rna
no alle proteine e non può andare in direzione inversa (proposto da Francis Crick nel 1958).
Nell'immagine, in alto, vediamo ciò che avviene nelle cellule eucario che, in basso, come invece i
virus abbiano la capacità di portare l'informazione da RNA a DNA grazie alle trascri asi inverse.
Questo dogma che sosteneva l'rna come produ ore proteine è stato revisionato sulla base del fa o
che esistono RNA non codi can importan per la regolazione trascrizionale.
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 All'interno della cellula procario ca non è presente il nucleo, ma la formazione del messaggero ➞
formazione della proteina; nella cellula eucario ca la situazione è più complessa poiché la
trascrizione avviene a livello del nucleo, ma questo messaggero non sarà quello funzionale bensì
dovrà maturare a livello nucleare e in seguito esportato a livello citoplasma co per poter essere
trado o.

Nella trascrizione abbiamo la sintesi di un RNA che ha la stessa sequenza di uno dei due lamen del
DNA a doppia elica. Il lamento di DNA la cui sequenza è iden ca
(non le T e le U che sono cambiate) a quella sequenza dell'rna è
chiamato lamento codi cante, il quale è complementare all'altro
lamento che, invece, funge da stampo per la sintesi dell'rna➞
lamento stampo.
L’enzima che è importante per la catalisi della catena di RNA è
l'RNA polimerasi, che trascrive uno solo dei due lamen della
doppia elica.
L'rna polimerasi non rimane appaiata, ma si stacca dallo stampo a
una distanza di pochi nucleo di da dove è stato aggiunto l'ul mo
ribonucleo de della catena e ciò perme erà ai ba eri di avere
subito un RNA disponibile per la sintesi delle proteine, poiché nei
procario c'è un accoppiamento tra trascrizione e traduzione➞
avvengono nello stesso momento. Immagine al microscopio
ele ronico in cui si vede l'accoppiamento tra trascrizione e
traduzione: sono visibili i ribosomi (pallini neri), il messaggero e
l'rna polimerasi; più molecole di RNA polimerasi possono trascrivere contemporaneamente lo stesso
gene.

Conce di base:
La trascrizione comincia quando la RNA polimerasi si
va a legare a una regione par colare del DNA➞
regione promotore che
si trova all'inizio del gene. Quelle regioni che si
trovano vicine al promotore si chiamano regioni
prossimali, le più lontane si chiamano regioni distali.
Tu e quelle sequenze preceden al punto d'inizio si
dicono sequenze a monte o upstream, dopo il punto
d'inizio si dicono a valle o downstream.
La sequenza di DNA viene sempre scri a in modo da
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 mostrare il lamento la cui sequenza è la stessa dell'rna➞ quello che viene scri o è il lamento
codi cante.
Le posizioni delle basi vengono numerate a par re dal punto d'inizio (+1 sarà la prima base/
nucleo de), andando a monte passiamo a - 1. Si parla di unità di trascrizione ovvero tu a la
sequenza trascri a in RNA delimitata da due regioni: promotore e terminatore. Negli eucario
questa sequenza corrisponde a quello che viene chiamato trascri o primario perché è un prodo o
che poi dovrà essere modi cato e maturato.

Proteine regolatrici determinano se un dato gene deve essere trascri o dalla RNA polimerasi: capire
come funzione una trascrizione.
1. Come fanno le proteine regolatrici ad interagire con la RNA polimerasi?
2. Come riesce la RNA polimerasi a trovare i promotori sul DNA?
3. Come fanno le proteine che legano speci camente il DNA a dis nguere il loro speci co sito
di legame dalle altre sequenze?

La base della trascrizione è uguale alla duplicazione, un

normale processo di appaiamento di basi complementari:
la sintesi dell'rna deve avvenire al livello della bolla di
trascrizione ➞ una regione di DNA in cui abbiamo i due
lamen separa in maniera transiente.
L'RNA viene sinte zzato, come il DNA, sempre in direzione
5'-3' con il gruppo ossidrilico dell'ul mo nucleo de
aggiunto alla catena che andrà a reagire con il fosfato in alfa
del nucleo de entrante che perderà il pirofosfato (il
meccanismo è lo stesso della
duplicazione).
Le tre fasi della trascrizione: inizio, allungamento e terminazione.

FASE D'INIZIO: l'inizio richiede una serie di passaggi de ni . La polimerasi come primo
passaggio deve legarsi al promotore, questo legame porterà alla formazione di un complesso
chiuso, nel quale il DNA è ancora a doppia elica e
l’enzima sarà legato a una delle facce dell'elica; in
seguito si avrà la formazione del complesso aperto
ovvero la separazione della doppia elica di DNA➞ i due
lamen si separano per 10 bp
(circa) a livello del punto d'inizio e si forma la bolla di
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 trascrizione.
A questo punto può iniziare la sintesi, arrivano i primi ribonucleo di nel sito a vo dell’enzima e si
allineano con lo stampo; solo dopo che l’enzima ha aggiunto una decina di nucleo di, esso si dice
"esce dal promotore" quindi comincia a muoversi e può iniziare la transizione verso l'allungamento
dell'rna➞ c'è un momento in cui è presente un complesso ternario formato da: RNA, DNA ed
enzima.

Stru ura di una polimerasi ba erica: Nei procario

abbiamo un solo enzima che è responsabile della sintesi
degli RNA ribosomiali, transfer e messaggeri. All'interno
di una cellula procario ca vi sono circa 7000 molecole di
RNA polimerasi di cui i ⅔ sono a ve in ogni momento.
Nell'immagine, in basso, vediamo quali sono le subunità
che formano l'enzima:

- le subunità β e β', sono quelle che formano il

centro catali co, ovvero il canale a raverso cui
passa il DNA. Entrambi i lamen interagiscono
con queste due subunità a livello della regione
che porterà alla formazione della bolla di trascrizione. È una interazione in cui l'enzima va a
stabilizzare i due lamen anche una volta che ques sono sta separa . Bloccare la
trascrizione nelle cellule procario che è un meccanismo sfru ato anche dai farmaci (es.
an bio co rifampicina), legandosi alle subunità beta impedisce la trascrizione.
- due subunità α;
- una subunità ω;
- una subunità σ, responsabile dell'a vazione dell’enzima.

Nell'immagine si vede la stru ura tridimensionale dell'rna polimerasi e in viola sono indica i
domini che formano il fa ore sigma. La polimerasi ba erica, in teoria, potrebbe cominciare la
trascrizione in qualsiasi punto, ma avviene al livello del promotore grazie al fa ore sigma che
perme e di conver re la polimerasi da ina va ad a va.

Principali domini stru urali interni della RNA polimerasi:

Quando il doppio lamento interagisce con l'enzima il DNA
subisce un ripiegamento di circa 90° ed è come se sba esse
su una regione de a muro➞ in questa parte dell’enzima c'è
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 una regione che perme e l'uscita dell'rna. Nell parte
centrale c'è una regione de nita mone che perme e
di mantenere aperta la bolla di replicazione.
Vi è una regione vicina al sito a vo dell’enzima
chiamata ponte che perme e all'enzima di rimanere in
conta o con il DNA e di inserire nucleo di al lamento
in crescita dell'rna.
Nella trascrizione, al contrario della replicazione, non
abbiamo bisogno di un innesco, ma è necessario che il
primo ribonucleo de d'inizio (ma oncini rossi
nell'immagine) venga portato nel sito a vo e si leghi
saldamente allo stampo. È importante sapere che nella maggior parte dei casi la trascrizione inizia
con una adenina e quindi con due soli legami H➞ l'enzima dovrà legare in maniera ancora più salda
questo primo ribonucleo de, l'adenina, che ha due legami H e non tre come solito.

Vediamo qual è il ruolo della regione ponte, che è un

dominio chiave nell'interazione tra DNA ed enzima.
Abbiamo il DNA e l'RNA che si sta formando, il ponte è
in conta o con il ribonucleo de appena aggiunto e
copre momentaneamente il sito d'ingresso per il nuovo
nucleo de, quindi di volta in volta il ponte si sposta
cambiando di conformazione per rendere accessibile un
nucleo de alla volta, rimanendo sempre in conta o
con il DNA.

Cambio di conformazione➞ traslocazione di una base

➞ spostamento del ponte (ritorna a una
conformazione iniziale messa a disposizione per il ribonucleo de entrante di un solo nucleo de del
nostro DNA).
L'enzima farà in modo di legare e interagire con il DNA sia a valle sia a monte della bolla di
trascrizione, quindi reagirà con una regione in cui ci sarà la separazione del doppio lamento e anche
con regioni con gue alla bolla.

3 modelli che descrivono la fase iniziale della sintesi dell'rna:

Sono sta propos tre modelli per spiegare come avviene la fase iniziale della sintesi dell'rna.
È un processo chiave che l'enzima prima di potersi muovere e abbandonare il promotore vada a
incorporare almeno una decina di nucleo di, ma è poco e ciente. Infa spesso l'enzima in questa
fase rilascia dei piccoli trascri e poi inizia di nuovo la sintesi, ques si chiamano inizi abor vi; solo
dopo che la polimerasi è riuscita a sinte zzare dei frammen di dieci nucleo di si dice che l'enzima è
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 evaso dal promotore e pronto ad andare
verso la seconda fase di allungamento.
Per capire come l'enzima riesce a muoversi
lungo lo stampo del DNA sono sta , appunto,
propos tre modelli:

1. Transiente➞ presuppone che la

polimerasi riesca a spostarsi avan e
indietro lungo il promotore.
Nell'immagine, a destra sta più avan ,
a sinistra sta più indietro (solo
quando avrà sinte zzato il pezze no
di dieci nucleo di lascerà il
promotore).
2. A bruco➞ prevede che la polimerasi contenga una regione estendibile, quindi l'enzima si
allunga sul DNA occupando una regione più vasta di quella che occuperebbe in assenza dei
vari nucleo di che vengono aggiun .
3. Accartocciamento➞ prevede che la polimerasi rimanga ferma, ma portando verso l'interno
un lamento di DNA che si trova a valle, richiamandolo fa sì che esso si apra e si accartocci al
suo interno. Si ri ene che questo accartocciamento del DNA sia quello necessario per fornire
energia che perme erà, una volta superate queste fasi abor ve, il distacco dal promotore
della polimerasi.
Al momento il meccanismo più accreditato è quest'ul mo, poiché spiegherebbe anche a livello
energe co come fa la polimerasi a muoversi.
Stru ura del promotore classico per σ^70 di E. Coli:
Come fa la RNA polimerasi procario ca a riconoscere il promotore?
Il riconoscimento del promotore dipende dal riconoscimento di sequenze speci che che sono le
sequenze consenso.
Le sequenze consenso sono sequenze ideali in cui ciascuna posizione rappresenta la base che si trova
più spesso se andiamo a confrontare varie sequenze tra loro. Alcune note, che ritroviamo in tu gli
organismi e non solo nei procario , sono:

● TATA BOX➞ sequenza a -10, ovvero 10 basi upstream dal sito d'inizio della trascrizione o TSS
(transcrip on start site), questa è quella chiamata TATA BOX per la cara eris ca sequenza
che è sempre TATAAT.
●
BOX - 35➞ sequenza a - 35, si trova più upstream, TTGACA.
Sono due sequenze consenso che distano circa 17-19 bp l'una dall'altra.
In basso le sequenze sono scri e con un pedice numerico che indica la percentuale in cui è noto
ritrovarsi quel determinato nucleo de, quindi quali sono le frequenze delle varie basi (es. sia -35 sia
a -10 all'80% è una T, poi le altre basi con percentuali decisamente inferiori).
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 I possibili promotori di una cellula ba erica:
A. Promotore classico➞ viene riconosciuto da una RNA polimerasi che ha un fa ore sigma
chiamato σ^70, il quale ha le due sequenze
consenso a -10 e -35 presen .
B. Elemento up➞ esistono dei geni, di solito
altamente espressi, che possono contenere
degli elemen aggiun vi e questo elemento
aggiun vo in par colare si chiama elemento
up, che si trova a monte della sequenza a -35.
È di solito una sequenza ricca di basi AT. Non
ha una sequenza consenso de nita come
quella -10 o -35, però può essere riconoscibile
dalla coda C-terminale presente sulla subunità
alfa della polimerasi.
C. Promotori mancan della sequenza -35➞ spesso ques promotori hanno una sequenza
-10 più estesa, quindi è una regione consenso a -10 leggermente più grande.

Interazione della RNA polimerasi con i promotori che contengono l'elemento up:

se presente questo elemento up l'interazione con il promotore avviene non solo tramite l'azione del
fa ore sigma, ma anche tramite la subunità alfa.
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 Questa interazione avviene, infa , tramite fa ore sigma (interagisce con le sequenze a -10 e -35 dei
domini 2 e 4 del fa ore sigma), ma in più deve interagire con l'elemento up quel dominio carbossi
terminale della subunità alfa dell'rna polimerasi.
Il fa ore sigma lega con due domini diversi le due sequenze consenso, proprio per questo lo
possiamo suddividere in qua ro regioni:

- σ1➞ regione ammino terminale (N-terminale);

- σ2➞si lega alla sequenza a -10;
- σ3➞ se non è presente la sequenza a -35, ma è
presente il promotore esteso, al promotore nella
regione del promotore esteso si legherà σ3;
-
σ4➞ regione carbossi terminale (C-terminale), si lega
alla sequenza consenso a -35. Queste sono le
interazioni diverse tra le regioni del fa ore sigma e gli
elemen che cos tuiscono il promotore ba erico.
Nel de aglio vediamo quali sono le alfa eliche che
interagiscono speci camente con il promotore: l'alfa elica 2.4
che reagisce con il fa ore a -10; l'elica 3.0 con il promotore
esteso; l'elica 4.2 con la regione a -35; e poi l'elica 2.3
importante e necessaria, tra quelle che cos tuiscono il fa ore
sigma, per promuovere la separazione del doppio lamento
di DNA. Ques fa ori sigma devono andare in conta o con
delle sequenze speci che di DNA, quindi saranno sempre
quelle a interagire con le sequenze chiave.
Nell'immagine
vediamo la TATA BOX (TATAAT, sequenza consenso a -10) che
interagirà con l'alfa elica 2.4 del fa ore σ^70 a livello di
ques speci ci amminoacidi. Possiamo notare come degli
amminoacidi che sono separa tra di loro di tre/qua ro
posizioni sull'alfa elica sono quelli che si trovano nella
posizione migliore per poter poi interagire con basi
consecu ve sulla sequenza di DNA. Gli amminoacidi chiave in
una sequenza proteica, si trovano a una determinata distanza
e nonostante non siano consecu vi interagiscono con una
sequenza nucleo dica consecu va come quella della TATA
BOX.

Un altro elemento chiave è la regione del fa ore sigma (subunità principale) N-terminale, poiché ha
una funzione regolatrice. Il fa ore sigma riconosce il promotore solo quando la proteina sarà
associata al core enzima co, quando il fa ore sigma è libero la regione N-terminale copre quelle
regioni che legano/conta ano il DNA. Il DNA sposta la regione N-terminale quando si forma il
complesso➞ solo quando si lega al core enzima co questa regione N-terminale viene spostata e ci
può essere il conta o tra fa ore sigma e DNA.
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 Stru ura dell'oloenzima:
Vediamo il fa ore sigma interagire, i vari domini che
cara erizzano il fa ore sigma e qual è il loro ruolo
nell'interazione con il core enzima co (che è tu o il
resto) e il DNA.
1. Complesso chiuso;
2. Complesso aperto, quando si forma è
presente quella regione del fa ore sigma,
zona del 2.3, che perme e l'apertura della
bolla;
3. Distacco dal promotore.
Quindi in un promotore procario co abbiamo due
sequenze chiave: -35 e -10.
La prima viene de nita anche come il dominio di
riconoscimento, la seconda come il dominio di
srotolamento, infa è più facile da aprire essendo ricca in
AT (seq. -10 TATA BOX).
Nell'immagine, in viola, sono rappresenta i pun di
conta o che ha l'enzima con l'elica stampo, in rosso, i pun
di conta o che ha con l'elica codi cante. I pun di conta o
che si trovano a monte, quindi prima della sequenza a -10,
si trovano tu dallo stesso lato della doppia elica e ciò
signi ca che quando inizierà la trascrizione la polimerasi
andrà a conta are/legare la
doppia elica solo da un lato.
Una volta cominciato lo srotolamento quei si che si trovavano a valle della sequenza a -10 iniziano
ad andare a conta o con l'enzima e i conta avvengono anche sull'altro lato.
1. L'rna polimerasi inizialmente conta a la
sequenza -35, quindi a quello che è il dominio
di srotolamento:
2. Sulla regione del promotore si forma un
complesso chiuso;
3. Comincia la denaturazione nella regione -10,
quindi in quello che è il dominio di
svolgimento, poiché in questo dominio si ha la
formazione del complesso in forma aperta ed
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 è quella regione in cui la presenza di AT favorisce la denaturazione del DNA.

Abbiamo visto il ruolo di una polimerasi che ha il fa ore σ^70 ovvero quello generale e principale,
ma non è l'unico fa ore sigma possibile poiché ci sono altri fa ori sigma alterna vi: (immagine)
servono quando bisogna andare a trascrivere alcuni geni par colari, ad esempio: σ^32 per i geni che
si chiamano heat-shock, in presenza di una temperatura elevata verrà reclutato questo fa ore sigma
che a verà ques geni par colari; l'u lizzo del σ^54 in condizioni di carenza di azoto, verranno
a va i trascri dei geni regola dall'azoto.

Ciclo del core enzima co:

Quello che viene de nito ciclo del core enzima co (in
verde) è un ciclo del fa ore sigma (in viola). Il core
enzima co si lega velocemente al DNA e può anche
abbandonarlo, ciò lo rende un processo reversibile. Nel
momento in cui al core viene unito il fa ore sigma il
legame è stabilizzato e non si torna indietro, ma
velocemente questo complesso può riconoscere il
promotore. Una volta che c'è stato il riconoscimento del
promotore ed è iniziata la trascrizione, il fa ore sigma
non è più necessario, lascia il core enzima co ed è di
nuovo disponibile per un nuovo ciclo➞ legarsi ad un nuovo core e iniziare di nuovo la trascrizione.
Quando nisce la trascrizione, anche il core lascerà il DNA e sarà di nuovo disponibile per un nuovo
ciclo. Dopo l'inizio si ha l'allungamento.

FASE DI ALLUNGAMENTO: nell’allungamento l’enzima dovrà muoversi lungo il dna ed estendere la

catena di rna. Muovendosi l’enzima srotola la doppia elica e andrà ad esporre una parte dello stampo
a singolo lamento. I nucleo di vengono aggiun di volta in volta all’estremità 3’ della catena
nascente di rna e si formerà l ibrido dna-rna in quella regione di dna che di volta in volta viene
srotolata.
Alle spalle della regione srotolata, il lamento stampo si andrà ad appaiare di nuovo con il lamento
codi cante e si riforma la doppia elica ➞ verrà spiazzata la catena di rna di neosintesi.
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 La trascrizione terminerà quando verrà riconosciuta una regione (la sequenza terminatore), in cui
l’enzima: sme e di aggiungere nucleo di alla catena di rna in crescita, l’ibrido si dissocia, la bolla di
trascrizione collassa, e sia l’enzima che l’rna vengono quindi dissocia dal dna.

In questa immagine vediamo che la

polimerasi lavorerà interagendo
anche con altre proteine, i fa ori di
regolazione
➞ l’interazione avviene sopra u o
durante la fase di allungamento.
Quest’ul mo non deve essere
considerato un processo con nuo,
bensì è un processo durante il
quale l’enzima rallenta e a volte si
ferma sul dna.
Infa , alcuni fa ori di regolazione
della trascrizione (nei procario
sono i GreB) hanno il compito di
aumentare la velocità di allungamento riducendo le pause che l’enzima fa durante il suo movimento.
Sono quindi dei fa ori di allungamento, e
sono presen anche negli eucario .

Un’altra cara eris ca della rna

polimerasi, presente anche nella dna
polimerasi, è quella di proofreading, ovvero
la capacità di riconoscere
eventualmente la presenza di un errore nel
suo lavoro. La rna polimerasi può avere 2 pi
di proofreading:
-PROOFREADING
PIROFOSFOROLITICO: se viene inserito un
nucleo de errato (in verde nella gura)
l’enzima rallenta e prevale la reazione inversa
➞ il pirofosfato viene aggiunto al ribonucleo de monofosfato e viene rimosso il nucleo de errato.
Quindi abbiamo il riconoscimento dell’errore e si ha una reazione inversa. Se in nucleo de è errato
viene rimosso subito.
- PROOFREADING IDROLITICO: funziona grazie ai fa ori di allungamento (es: Gre factors), i quali
sono delle proteine che perme ono di capire che è stato inserito un nucleo de errato e fanno
in modo che avvenga la reazione inversa. Quindi se viene inserito un nucleo de errato la
reazione con nua per un certo periodo di tempo (aggiunta di 1-2 nucleo di), ma il fa ore Gre
legge l’errore e taglia un piccolo pezzo di
Rna neosinte zzato, lo rimuove e
ricomincia la sintesi. Nel caso in cui un
errore non venga riconosciuto subito
intervengono tali proteine in modo da
perme ere che la reazione ricominci.

Quindi anche la rna polimerasi è in grado di

autocorreggersi, anche se non ha la stessa
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 capacità della dna polimerasi poiché comme e più errori.
Può capitare quindi che tale enzima possa rallentare, fermarsi oppure addiri ura tornare indietro per
correggersi. Se vi è un errore l’enzima si ferma, torna indietro e rimuove uno o più ribonucleo di
erra ➞ consente all’enzima di ricominciare la sintesi (dato che la condizione fondamentale è la
presenza di un gruppo ossidrilico libero in 3’ che consenta all’enzima di agire e con nuare la sintesi).

Nell’immagine abbiamo dei meccanismi che

spiegano la “marcia indietro” della polimerasi.

In questa immagine invece vediamo

la di erenza tra un enzima eucario co
e procario co ➞ nelle cellule eucario che troviamo
gli stessi meccanismi presen nella cellula
procario ca, solo che più “ ni”. Infa ad esempio il
fa ore GreB di allungamento delle cellule
procario che sarà sos tuito dal fa ore TF2 nelle
cellule eucario che, ma anche in questo caso i fa ori
di allungamento hanno un ruolo importante nella
capacità di correzione degli errori.
La polimerasi quindi ha delle pause durante la trascrizione e sono molto importan poiché è
importante avere un processo e ciente piu osto che veloce. Infa , la cellula riesce anche ad
u lizzare queste fasi per dei processi di regolazione, come ad esempio il ripiegamento

dell’rna neosinte zzato oppure il legame dei fa ori di trascrizione all’rna neosinte zzato. Per cui le
pause non sono importan solo per rimediare ad eventuali errori, ma anche per organizzarsi e far sì
che quell’rna appena sinte zzato sia poi pronto per i successivi passaggi di traduzione (questo per gli
rna che non devono essere matura , cellule procario che).
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 FENOMENO DEL SUPERAVVOLGIMENTO: è stato un meccanismo chiave nella duplicazione, in cui il
dna deve super avvolgersi, ma questo è fondamentale anche nella trascrizione.
Infa , si ha con nuamente un superavvolgimento durante la trascrizione: man mano che la rna
polimerasi trascrive il dna si ha un avvolgimento
e svolgimento ➞ la polimerasi spingendosi
avan lungo la doppia elica va a generare dei
superavvolgimen posi vi avan a sé, mentre
dietro di sé lascia dei superavvolgimen
nega vi (va a creare delle regioni di dna che
potrebbero essere parzialmente svolte).
Dunque la trascrizione va ad alterare la stru ura
locale del dna ➞ questo porta al fa o che
dovranno intervenire altri enzimi, come ad
esempio le girasi (che introducono
superavvolgimen nega vi e quindi risolvono
quelli posi vi) e le topoisomerasi
(che rimuovono i superavvolgimen
nega vi), a nché possano essere ripris nate
quelle situazioni corre e sia davan che dietro.
Bisogna sempre ricordarsi degli e e del movimento di una proteina sulla doppia elica del dna che
viene svolta.
FASE DI TERMINAZIONE: la polimerasi sme erà di trascrivere quando trascrive delle sequenze
speci che che inducono una destabilizzazione della bolla trascrizionale ➞ si ha quindi una ro ura
dei legami H del duplex rna-dna e si riformerà il dna a doppio lamento.
Esistono 2 pi di terminatori:
1. TERMINATORI INTRINSECI o RHO-INDIPENDENTI: la polimerasi rallenta o si ferma quando
trascrive una sequenza speci ca
che porta alla formazione di una
forcina come quella in gura. Tale
forcina deve contenere una
regione ricca di basi GC (in cui
sono quindi presen mol legami
H che stabilizzano tale stru ura
secondaria). Tale
sequenza viene trascri a, si
forma la forcina e a valle di essa
sono presen una serie di uracili
necessari per far sì che si
possa veri care la
dissociazione dell’enzima
quando questo si arresta. Tale serie di U deve essere
almeno di 6, altrimen la polimerasi si ferma ma non si
arresta completamente. Una regione ricca di uracili
nell’rna corrisponde ad una regione ricca di mine nel dna,
quindi regioni del dna con alto contenuto di basi AT (che
quindi sono importan non solo all’inizio della trascrizione
per la formazione della bolla ma anche nella
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 terminazione). Durante questa terminazione quindi si ha la formazione di un terminatore
intrinseco che porta alla formazione di una stru ura secondaria dell’rna tale da bloccare la
polimerasi e indurre la sua dissociazione. Nel de aglio: viene sinte zzato l’rna con sequenze
GC che porteranno alla formazione di una forcina ➞ la polimerasi si arresta
temporaneamente, viene sinte zzata questa sequenza di poli-U che induce il rilascio della
polimerasi data la formazione di legami deboli AU che destabilizzano il doppio lamento
ibrido dna-rna.

2. TERMINATORI RHO-DIPENDENTI: rho è una proteina il cui ruolo, nelle reazioni di

terminazione della trascrizione, è quello di agire come un esamero (6 subunità iden che): la
proteina rho si lega a delle sequenze speci che sull’rna ricche in C ➞ nel momento in cui si
lega a tale sequenza trascri a, l’esamero si muove lungo la catena di rna no a raggiungere
la polimerasi provocandone il distacco dal dna. Quindi srotola l’ibrido dna-rna (ha anche
a vità elicasica) e libera la polimerasi. La sequenza “Rut” (Rho u liza on) è la sequenza
ricca in C che perme e il reclutamento della proteina rho; solitamente tale sequenza, a
breve distanza, può essere seguita anche da una piccola forcina.

DOMANDE:
1) A
2) B
3) C (stru ura a forcina piu osto che chiusa)
4) A
5) B (sono simili in tu e le specie, non è de o che abbiamo la stessa funzione in tu gli
organismi ma in mol si).
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Biologia Molecolare 14/04

REGOLAZIONE TRASCRIZIONE DEI PROCARIOTI

Nei procarioti sicuramente il primo livello di
regolazione dell’espressione genica è la
comparsa dei fattori sigma specializzati, che
permettono di andare a trascrivere i geni che sono
di solito silenti, se non in alcune condizioni
particolari: il fattore sigma è quello che codifica
per il sigma 70, gene costitutivo, ma ci può
essere la presenza del gene “heat-shock”, che
codifica per il sigma 32, e questo avverrà nel
caso in cui si avrà uno shock termico, e
permetterà di trascrivere tutta una serie di geni
che aiutano il batterio a superare una fase di
shock termico. Questa è una prima fase di regolazione trascrizionale.
Ma ce ne sono altri, e di base possiamo dividere due modelli di regolazione trascrizionale in cui
si può avere un controllo negativo o un controllo positivo. Nella figura vediamo la nostra RNA
polimerasi che si può legare alla sequenza promotore di un gene, andando a trascrivere il nostro
RNA, portando a quello che si chiama livello di trascrizione basale. Se c’è un controllo negativo
nella regolazione della trascrizione, vorrà dire che interverrà una “proteina repressore”, che si lega
ad un sito specifico a livello del promotore del gene procariotico, che è la “sequenza operatore” e
impedirà alla polimerasi di legarsi e ciò impedirà la trascrizione di quei geni; quindi, sono quei geni
che normalmente sarebbero espressi ma se presente il proprio repressore non verrebbero
espressi. Esiste anche un controllo positivo, ovvero la polimerasi viene reclutata sul promotore con
una maggiore efficienza perché c’è una “molecola di attivatore” (quella in verde) che si va a legare
ad una regione del promotore che si trova a monte del sito di riconoscimento dell’RNA polimerasi e
quindi, induce un controllo positivo, un aumento sensibile dei livelli di RNA prodotto. Nei procarioti
possiamo dividere i geni in:
- Geni costitutivi (strutturali): sono quelli che sono costantemente attivi, per esempio i geni
che codificano gli enzimi importanti per la glicolisi;
- Geni regolatori, sono quei geni che hanno un’espressione regolata in maniera tale che la
quantità della proteina che ne verrà fuori sarà controllata sulla base del fabbisogno della
cellula, quindi si tratta di una sintesi adattativa;
Perché una cellula procariotica si comporta così? Andrà a sintetizzare, a produrre solo ciò di
cui avrà bisogno, non produce messaggeri o proteine se non le servono subito, quindi come
risparmio energetico e lo farà in maniera molto rapida (perché rapidamente dovrà rispondere alle
esigenze che possono verificarsi in un cambiamento
ambientale).
Un gene strutturale va a codificare tutte le proteine che
non siano quelle prodotte per la formazione della
proteina regolatrice. Nell’immagine vediamo un gene
regolatore che produce un messaggero, che porta alla
formazione della proteina regolatrice che andrà ad
agire su un sito bersaglio, che si trova in adiacenza ad
un gene strutturale (la regione genomica che porta alla
sequenza di un gene strutturale).
Iniziamo così a capire la differenza tra le sequenze CIS e TRANS: le sequenze geniche, il cui
prodotto si diffonde e va ad agire in altre regioni geniche, sono definite sequenze trans (perché
fanno sì che quel prodotto vada ad agire su regioni geniche diverse). Quelle sequenze che non
sono convertite in nessun’altra forma ma agiscono come sequenze che influenzano soltanto il
DNA, adesso contiguo, sono le sequenze cis (per esempio le sequenze promotore di un gene
sono le sequenze cis, e invece le sequenze regolatrici sono le sequenze trans).
Vediamo l’importanza di queste sequenze e come funzionano nella regolazione trascrizionale dei
procarioti: gli OPERONI.
I geni batterici sono organizzati in gruppi di geni che vanno a codificare per delle proteine che
hanno funzioni, che sono tra di loro correlati, quindi sono dei cluster di geni (per esempio proteine
che hanno un ruolo importante a livello della stessa via metabolica, oppure che servono per il
trasporto intracellulare). Tutti questi geni nei procarioti si trovano sotto il dominio di un solo
promotore. Si parla di OPERONE, ovvero di unità trascrizionale che va a comprendere:
• Geni strutturali (quelli che vanno a codificare per le proteine di interesse);
• Sequenza operatore, che è il sito di riconoscimento sul DNA da parte della proteina
repressore;
• Sito promotore, dove andrà a legarsi la polimerasi.
Ricordiamo che nei procarioti i geni strutturali sono trascritti in un solo messaggero, chiamato
“POLICISTRONICO”, che porta alla formazione di più proteine. Quindi nell’operone abbiamo i geni
strutturali, l’operatore e il promotore; in più, a monte, si trova il gene regolatore, che è quel
gene che codifica per la proteina repressore che può agire in caso di necessità sulla regione
operatore che si trova sulla sequenza genomica.
Questo modello dell’operone (proposta da Jacob e Monod alle 1961), introduceva il concetto di
geni regolatori che vanno a codificare per delle proteine che controllano altri geni, quindi andavano
a definire l’esistenza delle sequenze TRANS e CIS. Le sequenze trans codificano proteine che
vanno ad agire su altre sequenze genomiche. Le sequenze CIS invece influenzano solo il
DNA e non codificano per le proteine (quindi, i promotori sono sequenze cis e le sequenze che
codificano per i geni regolatori sono sequenze trans).
Nella regolazione trascrizionale procariotica, possiamo
avere un controllo positivo e uno negativo. La presenza
di un repressore proteico impedisce l’espressione di un
gene (nell’immagine vediamo la nostra sequenza genomica
con i geni strutturali, l’operatore in rosa e il promotore in
verde). Se il gene è acceso, vorrà dire che produrrà quel
messaggero che produrrà quella proteina, perché si legherà
alla sequenza promotore. Nel momento in cui è presente,
come in basso, una
proteina repressore
che lega la sequenza
operatore, la
polimerasi non può
accendere la
trascrizione di quel
determinato gene, e in questo caso abbiamo un controllo di
tipo negativo.
Abbiamo un controllo positivo quando invece un gene, di
per sé spento, viene acceso in seguito ad un’esigenza da
parte della cellula e perché viene prodotta una proteina
attivatrice che farà in modo di reclutare la polimerasi sul
promotore e accendere quel determinato gene.
Quindi possiamo parlare di:
➢ Controllo da substrato: possiamo avere proteine che sono induttori, e riescono ad
innescare una trascrizione genica e la inducono.
➢ Controllo da prodotto: un repressore che va a inibire la trascrizione genica legandosi
ad un promotore.
Nella regolazione genica procariotica il controllo negativo o positivo, che sia inducibile o
reprimibile, porta ad uno schema come quello in figura, che porta a 4 possibili schemi di
regolazione genica:
- Negativa inducibile, ovvero un gene regolatore codifica una proteina repressore che si
lega ad una sequenza operatore, reprimendolo;
- Negativa reprimibile, se il repressore è attivo solo se si lega ad un co-repressore;
- Positiva inducibile, affinché possa essere indotta la trascrizione, ci sia la necessità di
legare un induttore;
- Positiva reprimibile, se si lega un repressore.
OPERONE LAC
E’ quel tipo di operone
che va ad attivare la
trascrizione, in seguito
alla comparsa di un
induttore. Questo
operone codifica per
quelle proteine che sono
importanti nella cellula
per importare e digerire
il lattosio. Nell’immagine
vediamo, che è formato
da un gene regolatore e tre geni strutturali. Abbiamo il gene regolatore, Lac-I, che costituisce
un’unità trascrizionale indipendente, che ha un suo proprio promotore e un suo terminatore. Poi
abbiamo dei geni strutturali che hanno un unico promotore, un operatore O e Lac-Z, Lac-Y e Lac-
A. Questi geni strutturali sono Lac-Z, necessario per scindere il lattosio in glucosio e galattosio
(quindi il gene che trascrive per la Beta-Galattosidasi); Lac-Y, quel gene che trascrive per la
permeasi, ovvero quella proteina che facilita l’ingresso del lattosio nella cellula; Lac-A, gene che
trascrive per la transacetilasi, quell’enzima che aggiunge gruppi acetilici al lattosio (la funzione di
questa aggiunta non è nota) e inoltre permette di liberare la cellula da prodotti potenzialmente
tossici importati nella cellula tramite la permeasi, che potrebbe non essere solo selettiva di lattosio.
Questi geni strutturali, (Z, Y ed A) sono geni che sono trascritti a meno che non vengano
spenti dal repressore, che viene trascritto dal gene regolatore Lac-I.
Come funziona? Sappiamo che i batteri utilizzano come fonte di carbonio sia il glucosio che il
lattosio. Comunque, lo zucchero più adatto al metabolismo dei procarioti è il glucosio; se il batterio
cresce in presenza di entrambi gli zuccheri andrà ad utilizzare prima il glucosio, e solo quando
quest’ultimo sarà finito, utilizzerà il lattosio. Ma nel caso in cui dovesse crescere in un ambiente in
cui non è presente il glucosio ma solo il lattosio, dovrà andare a sintetizzare subito quegli enzimi
che sono necessari per il suo metabolismo. Quindi dovrà andare ad effettuare questi meccanismi
di controllo per far sì che vengano espressi quei geni, che servono per la scissione del lattosio,
solo quando è necessario. Quando nell’ambiente cellulare è presente il lattosio, si forma
l’allolattosio, che sarà tanto più abbondante quanto più alta la quantità di lattosio disponibile.
L’allolattosio è l’induttore dell’operone Lac: perché l’allolattosio si va a legare alla proteina
 prodotta dal gene regolatore, proteina
repressore, e legandosi ad essa,
impedirà al repressore di legarsi
all’operatore; ciò farà si che la polimerasi
si potrà legare al promotore e iniziare la
trascrizione. Se c’è tanto lattosio, vorrà
dire che ci sarà tanto allolattosio e quindi
vorrà dire che bisognerà sintetizzare
quelle proteine che servono per la sua
scissione.
▪ Non è presente lattosio, non è
presente allolattosio, il gene regolatore
sintetizza la proteina repressore;
quest’ultima si lega al sito operatore, la
polimerasi non può legarsi e i geni
strutturali sono spenti, ovvero non
producono quegli enzimi che servono per scindere il lattosio (dato che non c’è).

▪ Nel momento in cui è presente il lattosio, sarà presente l’allolattosio, che è l’induttore,
ovvero si lega al repressore e legandosi quest’ultimo non permette al repressore di legarsi
all’operatore. Ciò fa sì che la polimerasi potrà legarsi al promotore e potrà indurre la
trascrizione di questi geni strutturali e la sintesi delle proteine che ne derivano.
Il controllo della trascrizione da parte dell’operone Lac
risponde rapidamente ai cambiamenti ambientali e
rapidamente alla presenza dell’induttore. In questo grafico
vediamo in alto la produzione di RNA messaggero, che aumenta
nel momento in cui andiamo ad aggiungere l’induttore, ed
aumenta fino ad arrivare ad un massimo dopo sei minuti; nel
momento in cui viene rimosso l’induttore, in tre minuti, quindi
molto rapidamente, viene ridotta la produzione di RNA
messaggero. In basso invece vediamo come cambia la
produzione della proteina, quindi viene aggiunto l’induttore e la
quantità di proteina prodotta avviene dopo che è stato portato
alla formazione dell’RNA messaggero. Nel momento in cui
andiamo a rimuovere l’induttore, mentre il messaggero subito
non viene più prodotto (risponde velocemente al cambiamento
ambientale, quindi alla presenza/assenza della molecola che
permette la sua accensione), non si ha immediata riduzione del
livello di proteina, che continua ad agire.

Schema di organizzazione del tetramero del REPRESSORE

È formata da un tetramero, in cui avremo dei siti di legame per il DNA

e dei siti di oligomerizzazione della proteina.
▪ Se manca l’induttore, e quindi quando i geni non sono
trascritti, la proteina repressore, quindi questo tetramero in
alto, è in forma attiva e lega l’operatore. Quindi viene formato
il monomero, che poi andrà a formare il tetramero, che lega
l’operatore e blocca la trascrizione.

▪ Nel momento in cui è presente l’induttore, quindi

l’allolattosio, il repressore viene convertito in una forma che
 ha minore affinità per l’operatore, quindi non può legarsi all’operatore e ciò porta al
verificarsi della trascrizione. L’induttore induce un cambiamento conformazionale del
repressore.
Quindi il repressore ha due siti di legame:
➢ uno per legare la regione genomica a monte dei geni strutturali, quindi l’operatore;
➢ uno per l’induttore.
Quando l’induttore si lega c’è un cambiamento conformazionale della proteina e ciò porta ad un
cambiamneto dell’attività della proteina sul sito dell’operatore. Questo tipo di meccanismo si
chiama: CONTROLLO ALLOSTERICO, ovvero la capacità di una proteina di cambiare
conformazione in un sito come risultato del legame di una molecola in un secondo sito.
Paradosso dell’operone Lac
Abbiamo detto che per far si che inizi la trascrizione, l’induttore deve legare il repressore. Ma se
l’operone è represso come può l’induttore entrare nella cellula per iniziare l’induzione? La
soluzione alla comprensione del paradosso è il fatto che la repressione non è mai totale, ma c’è
sempre una trascrizione che viene definita “basale”. Il repressore lega l’operatore in maniera molto
forte, ma nessuna proteina può restare legata per sempre. Appena questo legame si scinde, si
forma subito un messaggero e la permeasi può agire, così come può agire la Beta-Galattosidasi.
Quindi c’è sempre una quantità minima di proteina nella cellula per far si che il processo possa
comunque avvenire. C’è sempre una trascrizione basale che permette la produzione di allolattosio,
e quindi la produzione dell’induttore.
Il repressore Lac è un tetramero di quattro monomeri che
si uniscono insieme (si formano prima due dimeri e poi il
tetramero). Nell’immagine quindi vediamo gli elementi chiave
del repressore, ovvero: il dominio che va a legare il DNA,
che ha un motivo di elico-giro-elica, che serve come sito di
legame per l’induttore; domini di oligomerizzazione, che
sono quelli che permettono ai monomeri di andare a formare
il tetramero.
I domini proteici che sono in grado di andare a riconoscere
dei siti del DNA specifici hanno spesso questo tipo di
struttura, che è quella che ha anche la nostra proteina
repressore, ovvero il motivo Helix-Turn-Helix (elica-giro-
elica), con le due alfa eliche che sono legate tramite
interazioni non polari. Nell’immagine vediamo la R, che sta
per Recognition Helix, ovvero elica di riconoscimento; sono
dei residui di una delle due eliche che vanno a formare dei legami a idrogeno con le basi del solco
maggiore. Quindi il motivo che caratterizza il legame della proteina repressore con il DNA è un
motivo elica-giro-elica, che caratterizza la maggior parte dei legami DNA-proteine.
Ora possono avvenire a carico del circuito regolatore delle mutazioni che possono far sì che
l’espressione dell’operatore possa essere annullata oppure possono anche indurre
un’espressione costitutiva. Queste mutazioni possono essere di diverso tipo e posso essere
mutazioni a carico della sequenza dell’operatore, che comportano l’impossibilità per il repressore di
legarsi, e ciò porta ad un’espressione costitutiva di tutti i geni strutturali (quindi anche in assenza
dell’induttore i geni vengono trascritti).
Ci possono essere anche delle mutazioni al livello del gene che trascrive per il repressore e quindi
avere delle mutazioni che portano a far sì che l’operatore rimanga permanentemente acceso o
permanentemente spento. (N.B. i cambiamenti al livello della sequenza inducono alterazioni
funzionali per la cellula)
Il repressore è formato da 4 monomeri che formano un tetramero, ma il ruolo dei vari siti di legame
sul DNA è egualmente importante, quindi basta una sola subunità con delle mutazioni, per avere
una inibizione del ruolo della proteina repressore e quindi alla formazione di un operatore che sarà
sempre espresso.
Come fa il repressore a
riconoscere quella
sequenza specifica del
DNA? (Qual è la sequenza
operatore che lega il
repressore?): Dall’immagine
si vede il DNA e poi vediamo
le due sequenze -10 e -35
del promotore e la sequenza
in basso che è la sequenza
dell’OPERATORE che verrà
quindi legata dal repressore.

La sequenza OPERATORE è una sequenza palindromica che lega il repressore in forma dimerica
(due teste del repressore si legano alle due sequenze palindromiche), nel momento in cui il
repressore si lega a questa sequenza
impedisce il legame della polimerasi
perché questa sequenza (sequenza
dell’operatore) è sovrapposta alla
sequenza di DNA sulla quale agisce la
polimerasi. Quindi i monomeri del
repressore si legheranno alla
sequenza dell’operatore, e se sono
presenti gli induttori cambiano le
distanze perché cambia la struttura conformazionale della proteina, e quindi queste due
sequenze palindromiche presenti sul DNA non saranno riconoscibili dalla proteina
repressore. È stato dimostrato che in realtà il legame del repressore è più complesso, questo
perché nell’OPERONE LAC non c’è solo un sito operatore (o1), ma ci sono anche altri due siti
operatore definiti come o2 e o3.
Il sito operatore o1 è quello che ha maggiore affinità di legame, o2 si trova circa 400bp a valle
rispetto al punto di inizio della trascrizione, mentre o3 che si trova a monte. La proteina repressore
può legare contemporaneamente sia il sito repressore o1 che il sito repressore o3, questo porta
alla formazione di un’ansa sul DNA e nel momento in cui si forma una struttura di questo tipo
aumenta la forza di repressione e aumenta anche il legame della polimerasi al promotore, ma
paradossalmente la polimerasi non può comunque iniziare la trascrizione perché il repressore
blocca l’enzima sul promotore e non gli permette di muoversi su di esso.
N.B. Si è visto che il repressore, per far sì che avvenga una repressione efficiente, deve legare
almeno due dei tre siti operatore. Il repressore si può legare contemporaneamente ad O1 e O2,
ad O1 e O3, ma NON si può legare contemporaneamente ad i due siti operatore estremi ovvero
O2 e O3.
La proteina repressore lega con maggiore affinità i siti operatore ma può anche legare altre
sequenze casuali del DNA anche se lo farà con un’affinità più bassa. Quasi tutte le molecole di
repressore quando sono sintetizzate legano il DNA e l’efficienza della repressione dipenderà
dall’affinità delle proteine per l’operatore rispetto ad altre sequenze casuali del DNA. Una cellula
risulterà indotta se le proteine repressore che sono sintetizzate non legano l’operatore ma si
legano su sequenze casuali, mentre una cellula sarà non indotta quando un repressore lega
l’operatore.
• Si avrà repressione quando il repressore è legato all’operatore, nel momento in cui è
presente l’induttore il repressore non potrà più legare l’operatore ma rimarrà legato a siti
casuali del DNA.
• Si avrà induzione invece quando l’induttore viene rimosso, il repressore torna nella forma
attiva e si muove dalle posizioni casuali presenti al livello del DNA per tornare attivamente a
legare l’operatore.
Il fatto che il repressore si leghi anche a sequenze casuali del DNA è importante perché permette
che avvengano rapidamente dei cambiamenti all’interno della cellula (la proteina è già presente, si
trova già sul DNA, quindi basta la presenza di un induttore per far sì che tale proteina assuma una
conformazione tale da poter legare il DNA a livello della sequenza operatore).
La trascrizione dei geni dell’operone Lac
è regolata sia dal repressore Lac ma non
solo. Oltre al repressore Lac c’è un’altra
proteina, ovvero la proteina CAP
(catabolite activator protein) che si lega
a livello genomico al sito CAP, che si trova a monte dell’operatore e il legame di questa proteina
porta al secondo livello di controllo dell’operone Lac, ovvero la REPRESSIONE DA
CATABOLITA.
In assenza di glucosio ed in presenza di lattosio c’è un meccanismo trascrizionale che porta alla
sintesi di tutti quegli enzimi che servono per degradare questo nutriente alternativo.
Cosa succede se sono presenti sia lattosio che glucosio?
Come detto, la cellula preferisce andare ad utilizzare prima tutto il glucosio a sua disposizione e
solo dopo utilizzerà il lattosio, questo perché il glucosio è più facile da degradare e permette una
resa energetica maggiore. Ma se è presente anche il lattosio questo indurrà la trascrizione di geni
dell’operone Lac; a questo punto però la cellula deve capire che non deve andare a degradare il
lattosio prima che non sia terminato totalmente il glucosio. Per fare ciò la cellula attiverà proprio
questo meccanismo di REPRESSIONE DA CATABOLITA.

Come funziona la repressione da catabolita?

Tutto dipende dall’interazione tra la proteina CAP e il cAMP (AMP ciclico), la cui concentrazione
all’interno della cellula è inversamente proporzionale alla concentrazione del glucosio. In sostanza
la proteina CAP si lega all’ AMP ciclico, questo porterà a far sì che il sito CAP possa essere
riconosciuto a seguito di questo legame e ciò favorirà il legame della polimerasi al promotore e
quindi si “accenderà l’operone” e verranno trascritti i geni necessari al metabolismo del lattosio. Ciò
può avvenire solo in totale assenza di glucosio, poiché se è ancora disponibile del glucosio la
concentrazione di c AMP non è sufficiente affinché si formi questo complesso attivo che permette
la trascrizione.
VARIE TIPOLOGIE DI SITUAZIONI
1) Presenza di glucosio, assenza di
lattosio ! i livelli di cAMP sono bassi,
quindi la proteina CAP non può legarsi
all’operone Lac e dare avvio alla
trascrizione; inoltre, in assenza di lattosio
il repressore non può legarsi all’operatore
e quindi non avviene la trascrizione. (È
 presente il glucosio quindi la trascrizione dei geni dell’operone Lac non è necessaria)

2) Presenza sia di lattosio che di glucosio ! la trascrizione dei geni dell’operone Lac può
avvenire ma avverrà in una quantità minima poiché essendo presente il glucosio la cellula
tenderà ad utilizzarlo.

3) Presenza di lattosio, assenza di glucosio ! la

concentrazione di cAMP sarà maggiore poiché c’è
assenza di glucosio, il cAMP si andrà a legare alla
proteina CAP e ciò porterà ad un’abbondante
produzione di messaggeri che producono le
proteine necessaria a metabolizzare il lattosio.

RIASSUMENDO:
Questo promotore può essere regolato da due regolatori della trascrizione, da un repressore o
da un attivatore, quindi possiamo parlare di una via catabolica che normalmente è inattiva, o
attiva a livelli basali, ma che può essere indotta dalla presenza della molecola che dev’essere
degradata, ovvero il lattosio.
Come abbiamo visto nella struttura dell’operone Lac, i siti operatore si trovano a monte del sito di
inizio della trascrizione, ma non è sempre così, la loro posizione può variare a seconda del gene
e può trovarsi più a monte o più a valle. È importante perché i repressori che sono in grado di agire
su operatori anche se hanno posizioni molto diverse rispetto ai promotori che vanno a regolare ha
permesso di capire che ci sono delle differenze importanti nella regolazione trascrizionale anche
nelle cellule procariotiche.
Controllo negativo di regolazione
trascrizionale: l’operon del triptofano.
In questo caso parliamo non di via
catabolica ma di via anabolica, ovvero
una via attiva che viene inattivata
quando è presente la molecola che si
forma per effetto di quelle attività
enzimatiche che provengono dalla
trascrizione di quei determinati geni (in
questo caso dell’amminoacido
triptofano). Quindi abbiamo il nostro
DNA in cui abbiamo la regione
operatore, la regione promotore e 5 geni strutturali. Il repressore del triptofano, che è quello che
viene prodotto dal gene regolatore, si lega al DNA solo quando il triptofano si lega al sito allosterico
del repressore, ovvero se il triptofano è presente si va a legare al repressore e impedisce
l’accensione dei geni. Questo vuol dire che questi geni che servono per sintetizzare il triptofano
vengono accesi solo quando è necessario ossia quando il triptofano non è presente. In sintesi, se
la concentrazione di triptofano è bassa, quindi la cellula ha necessità di produrlo, la polimerasi si
lega e i geni per la sintesi vengono attivati; se invece è presente il triptofano si lega alla proteina
repressore attivandola e induce il suo legame al sito operatore e impedisce il legame della
polimerasi (la polimerasi, quindi, è spenta e la sintesi non avviene). Quindi è il cambiamento
conformazionale della proteina repressore che avviene, in questo caso, facendo in modo che una
volta legato il triptofano la proteina può legare il sito operatore.
Perché parliamo di regolazione genica nei procarioti e perché è importante? L’importanza di
regolare i geni e quindi la produzione di proteine è legata al fatto che la cellula deve rispondere
rapidamente ai cambiamenti ambientali e non vuole produrre niente che non le serva subito.
Bisogna ricordare anche che la maggior parte dei geni è espressa costitutivamente, ma quelli
regolati sono sottoposti a questo meccanismo di induzione o di repressione. Quindi nei procarioti
parliamo di GENI INDUCIBILI (come quelli trascritti nell’operone del lattosio, quindi si aggiunge
lattosio velocemente avverrà la sintesi di proteine per trascrizione di geni che servono a degradare
il lattosio) e di GENI REPRIMIBILI (ovvero che vengono trascritti e producono quei determinati
enzimi che servono per la sintesi dell’amminoacido e nel momento in cui è presente l
‘amminoacido viene indotta la loro (dei geni) trascrizione.
DOMANDE
1. Quali affermazioni NON sono corrette riguardo all'operone lac?
A) Regola la produzione di una serie di cinque enzimi.
B) Normalmente è spento se è presente il glucosio.
C) Il lattosio si lega alla proteina repressore e la disattiva
D) È un sistema inducibile.
E) I geni strutturali creano prodotti che consentono il metabolismo del lattosio.
2. Per quanto riguarda l'operone lac, se è presente lattosio, quale delle seguenti situazioni
si verifica?
A) L'allolattosio si lega all'operatore e previene il fatto che il promotore possa legare la polimerasi e
quindi previene la trascrizione
B) L'allolattosio si lega alla RNA polimerasi, che poi si lega al promotore e trascrive i geni
necessari.
C) L'allolattosio si lega al repressore, che non può legare l'operatore e l'RNA polimerasi trascrive i
geni necessari
D) L'allolattosio si lega all'operone, che attrae l'RNA polimerasi, quindi si verifica la trascrizione dei
geni necessari.
E) L'allolattosio si lega al sito della CAP per prevenire la proteina CAP dal legame
3.Quale gene in un operone non corrisponde correttamente alla sua funzione?
A) promotore - dove si lega per prima l'RNA polimerasi al DNA
B) regolatore - si lega alla proteina repressore (il regolatore non lega la proteina repressore ma lo
sintetizza)
C) sequenza strutturale - produce mRNA mediante trascrizione
D) sequenza operatore - se non legata, consente alla RNA polimerasi di legare il DNA.
E) Tutti questi sono abbinati correttamente
4.Quale affermazione NON è corretta riguardo all'operone trp?
A) I geni strutturali creano prodotti che agiscono in una via metabolica per produrre triptofano.
B) Normalmente è spento se è presente il triptofano.
C) Il triptofano funge da co-repressore.
D) Il prodotto del gene regolatore si inattiva da solo.
​​
E) Il triptofano si lega alla proteina repressore e la disattiva (il triptofano attiva il repressore)

LA TRASCRIZIONE EUCARIOTICA
Nei procarioti abbiamo trascrizione e traduzione accoppiate, mentre negli eucarioti la trascrizione è
un meccanismo più complesso che porterà alla maturazione di un trascritto primario che solo
quando sarà esportato a livello citoplasmatico porterà alla sintesi della proteina. Le differenze
principali è che nei procarioti andiamo a lavorare su uno stampo di DNA, mentre negli eucarioti si
lavora su uno stampo di cromatina perché abbiamo in nucleosomi; nei procarioti la polimerasi
legge le sequenze di DNA per cercare e poi legare il promotore (grazie al fattore sigma), negli
eucarioti la polimerasi non può leggere il DNA ma dovrà usare diversi fattori di trascrizione che
dovranno legarsi al DNA prima di permettere il legame della polimerasi.
Nei messaggeri procariotici sappiamo che a
livello di una determinata sequenza abbiamo
informazioni per più geni che portano alla
formazione di più proteine con funzioni
correlate; mentre a livello di una sequenza di
messaggero eucariotica abbiamo
informazioni per un solo gene. Inoltre,
nell’mRNA eucariotico abbiamo la presenza
del cap in 5’ e della coda di poliA in 3’ (non
presenti nei procarioti).
Negli eucarioti interverranno, quindi,
moltissime proteine che serviranno a far sì che inizi la trascrizione, ovvero tante proteine che
legano varie sequenze cis-agenti. Le proteine cis-agenti sono quelli responsabili del
riconoscimento del promotore e sono quelle che dovranno aggregarsi alla polimerasi a livello del
promotore. Il promotore sarà caratterizzato da sequenze necessarie affinché inizi la trascrizione,
ma anche da altre sequenze (SEQUENZE ENHANCER), ovvero dei siti intensificatori che possono
permettere lo stimolo dell’inizio della trascrizione; queste sequenze possono trovarsi anche molto
distanti dal nucleo del promotore (da 100 bp a migliaia di bp di distanza) e nonostante la loro
distanza possono influenzare la trascrizione di un gene.
Le RNA polimerasi degli eucarioti sono di 3 tipi:
- Polimerasi I che trascrive per gli RNA ribosomiali
- Polimerasi II che trascrive per i messaggeri
- Polimerasi III che trascrive per gli RNA transfer e per gli altri piccoli RNA
Le polimerasi eucariotiche hanno molte
subunità (circa 12) che formano un
aggregato. Alcune di queste subunità sono
comuni a tutte e tre le polimerasi. (RPB =
RNA polimerasi di tipo B, perché oltre alla
nomenclatura I, II e III abbiamo anche quella
che indica le polimerasi con A, B e C).

CONFRONTO TRA LE POLIMERASI EUCARIOTICHE E PROCARIOTICHE

Quindi abbiamo detto che abbiamo 12 subunità, di cui 5 sono omologhe alle subunità della
polimerasi procariotica. In particolare, le subunità eucariotiche 1 e 2 sono omologhe alle subunità
beta’ e beta procariotiche, le subunità eucariotiche 3 e 11 sono omologhe alle subunità alfa
presente sulla polimerasi procariotica e la subunità 6 eucariotica è omologa alla omega
procariotica. Poi ci sono altre subunità eucariotiche che invece non sono presenti nella polimerasi
procariotica, e sono la 5, 8, 10 e 12. Infine, ci sono delle subunità specifiche per ciascuna delle 3
polimerasi eucariotiche, per esempio nell’RNA polimerasi II è presente sulla subunità 1 il dominio
carbossi-terminale (CTD) che è costituita da una sequenza ripetuta di 7 amminoacidi, è un dominio
assente nella polimerasi procariotica (è presente solo nella subunità alfa).

Il DOMINIO CARBOSSI-TERMINALE (CTD) è coinvolto nell’inizio della trascrizione e poi vedremo

anche come è coinvolto nella maturazione del trascritto, nell’inserimento del cappuccio, nella
poliadenilazione e nello splicing. Ora vediamo il suo ruolo nell’inizio
della trascrizione.
Questa è un’immagine di bande prodotte facendo migrare su un gel
le varie subunità della polimerasi II e vediamo che la subunità più
pesante è quella che lega il DNA e che ha la coda CTD costituita
da una sequenza ripetuta di 7 amminoacidi (YSPTSPS)n , ossia
tirosina (Y), prolina (P), serina (S) e la treonina (T), i due residui
più importanti sono la serina e la treonina perché sono siti di
fosforilazione da parte di alcune proteine chinasi specifiche che
regolano le funzioni del dominio CTD.
Quindi quando inizia la trascrizione si deve formare un complesso
di pre-inizio e la coda CTD verrà fosforilata a livello di posizione
specifiche dei residui amminoacidici su essa presenti, in particolare la serina. Questa fosforilazione
sarà importante non soltanto durante l ‘inizio della trascrizione, ma anche durante l’elongazione e
la terminazione. Al termine della trascrizione, quando il trascritto sarà formato e maturato, la coda
carbossi-terminale sarà defosforilato da parte di enzimi specifici e andranno ad agire su una nuova
sequenza che dovrà essere trascritta.

PROMOTORI delle cellule eucariotiche

In questa slide vediamo il confronto tra un promotore batterico (A) e promotori delle tre polimerasi
eucariotiche. In quello procariotico abbiamo soltanto la sequenza a -10 e a -35. Per quanto
riguarda le polimerasi eucariotiche abbiamo:
- Nella polimerasi I eucariotica abbiamo due regioni: una regione si trova sovrapposta al sito
d’inizio della trascrizione (la freccia indica il sito di inizio) e costituisce il nucleo del
promotore, e poi c’è un elemento a monte chiamato UCE (upstream control element) che si
torva da -100 a -180 dal sito di inizio
- Nella polimerasi II (di eucarioti unicellulari) abbiamo una sequenza simil-TATABOX che si
trova a -26 dal sito di inizio e una sequenza di attivazione a monte che si chiama UAS
(upstream activated sequences) che si trova tra -100 e -200 dal sito di inizio
- Nella polimerasi III (di eucarioti multicellulari) abbiamo un promotore molto più complesso.
Possiamo riconoscere la TATABOX e tutta una serie di sequenze che caratterizzano un
promotore di questo tipo, quali sequenze iniziatori, sequenze enhancer, sequenze isolatore
- Nelle polimerasi III (che caratterizzano gli rRNA e tRNA) abbiamo per quanto riguarda il
tRNA la BOXA e la BOXB, mentre per gli rRNA abbiamo la BOXA e la BOXC che si trovano
a valle del sito di inizio della trascrizione.

BIOLOGIA MOLECOLARE 21/04

 DIFFERENZE TRA IL
PROMOTORE BATTERICO E
DELLE 3
POLIMERASI
EUCARIOTICHE: (quello
ba erico è stato già fa o).

1) PROMOTORE DELLA
RNA
POLIMERASI 1:
composto da 2
sequenze. Abbiamo
un nucleo del
promotore, che si
trova in una regione
tra -45 e +20 ➞ si
sovrappone all’inizio della
trascrizione (+1). È una regione ricca in
basi GC tranne una sequenza ricca
di AT vicino l’inizio. A tale nucleo del
promotore si legano una serie di
proteine tra cui la Tata Binding Protein TBP. A monte del nucleo del promotore (orienta vamente
tra -100 e -180) si trova l’elemento a monte del promotore (UCE: Upstream control element), a cui si
lega la proteina UBF Upstream Binding Factor. In che modo queste proteine si legano al promotore
della polimerasi 1? L’ UBF è la proteina che si lega per prima e
facilita il legame di un altro complesso proteico che con ene
anche il fa ore TBP (proteina che lega la sequenza Tata). Nel
momento in cui si lega UBF viene indo a un’ansa a livello del dna
➞ tale legame va a richiamare un complesso di fa ori di
trascrizione (SL1) che comprende la TBP e i fa ori associa ad
essa (TAF Tata Associated Factor). Anche tali fa ori quindi si
legano al nostro dna e a quel punto viene reclutata la polimerasi
1 a livello del nucleo del promotore.

2) PROMOTORI DELLA RNA POLIMERASI 3: Abbiamo due pi di promotori, po 1 e po 2: il po 1 si

trova nei geni che codi cano per l’rna ribosomiale 5S e vi sono due elemen di controllo, entrambi a
valle del punto di inzio quindi dopo il +1, e sono i
box A e C. Nel po 2, che si trova nei geni che codi cano per gli rna transfer, abbiamo sempre due box
dopo l’inizio della trascrizione ➞ box A e box B. In
questo caso sono più distan tra di loro,
intercorrono circa 30 bp tra la ne dell’uno e
l’inizio dell’altro. Mentre nel po 1 erano 40 le basi
tra l’inizio del box A e la ne del C. In realtà
abbiamo anche un terzo po più complesso che è
presente nei geni che codi cano per gli small
nuclear rna.
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 Formazione del complesso di preinizio per il po1: abbiamo il gene per l’rna ribosomiale 5S dove a valle
dell’inizio della trascrizione abbiamo i due box A
e C. Il primo fa ore di trascrizione che viene
reclutato è il TF3A (Transcrip on factor
polymerase 3 A), che si lega al box A e aiuta
il secondo fa ore di trascrizione che viene
reclutato, il
TF3C, a legare il box C. La
contemporanea presenza di ques 2
fa ori di trascrizione perme e il
reclutamento del TF3B, che è quello
formato dalla TBP e dai
fa ori associa ad essa ➞ una volta che si lega
si ha il reclutamento della polimerasi 3 e non
vi è più il legame del TF3A e TF3C che
possono anche essere rimossi (sono fa ori di assemblaggio che servono per il reclutamento del B e quindi
della polimerasi). Il TF3B si lega al sito di inizio e la sua
presenza è su ciente per perme ere alla polimerasi
di legarsi anch’essa al dna e di iniziare la trascrizione.
Formazione del complesso di preinizio per il po 2: abbiamo il
gene per il tRna, con i box A e B a valle. Viene
reclutato in questo caso dire amente il TF3C, che riesce
a legare sia il box A sia il B (dato che la distanza tra i due box è
maggiore rispe o a quella tra l’A e il C del po 1 ➞ i due
elemen della proteina che vanno a legare il dna si trovano ad
una distanza tale da perme ere il legame ai due box). Una
volta che si lega il TF3C viene reclutato il TF3B, che è sempre
formato dalla TBP e dai fa ori ad essa e
associa ➞ richiama la polimerasi e può iniziare la trascrizione.

3) PROMOTORE DELLA RNA POLIMERASI 2: non tu gli elemen che la possono cara erizzare devono
essere sempre presen .
Riconosciamo sicuramente la Tata
box (circa -25) quindi una
sequenza consenso TATAAAT; poi
dove inizia la trascrizione
abbiamo anche la sequenza INR,
ossia una sequenza iniziatore per lo
più ricca di pirimidine che è
sempre associata e
localizzata vicino il sito di inizio della
trascrizione. Poi abbiamo il
promotore minimo ossia la più breve
sequenza di dna necessaria e
su ciente a nché possa avvenire in maniera e ciente la trascrizione da parte della polimerasi. Per
cui gli elemen di tale precursore minimo sono: la Tata box e la sequenza Inr. Non tu i promotori
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 devono necessariamente averle, esistono anche promotori che mancano di queste regioni consenso
➞ ci saranno delle regioni a monte che cara erizzeranno questo promotore. Nella maggior parte
dei geni però il promotore “minimo” è presente e formato dalla sequenza Inr e Tata. Oltre queste
due sequenze nel gene abbiamo la sequenza BRE (B-Responsive Element) ossia la sequenza che
perme e il legame del fa ore di trascrizione TF2B; poi possiamo avere la DPE (Downstream
promo ng element, che si trova a circa a 28 basi a valle dell’inizio della trascrizione), è una sequenza
che può essere presente ad esempio quando manca la sequenza Tata. Possiamo avere poi altri 3
box: DCE1, DCE2,DCE3 ➞ (Downstream core element 1,2,3) si trovano a valle del punto di inizio
quando è presente la Tata. Se non è presente la Tata box è presente la DPE. Non sono regole sempre
vere, ma sono gli elemen generali che cara erizzano solitamente un promotore della polimerasi di
po 2. Sono gli elemen base, ma un promotore può essere anche più complesso: possono esserci
sequenze anche molto lontane dalla sequenza di inizio della trascrizione, sono le sequenze Enhancer
e quelle Isolatore che possono regolare la trascrizione di un gene che si trova distante anche
migliaia di bp come sito di inizio.

Formazione del complesso di pre-inizio della RNA polimerasi 2: in questo caso si andrà a legare alla
Tata box il fa ore TF2D composto dalla TBP e dai fa ori associa ad essa (sono molto più numerosi
rispe o a quelli presen per le altre due polimerasi). Una volta che si lega che si lega il TF2D si
possono legare il TF2A e TF2B. Quando
saranno lega tu e 3

ques elemen ➞ si potrà avere il

reclutamento della polimerasi, insieme ad un altro
fa ore di trascrizione (il TF2F). Si legheranno poi
anche altri due fa ori di trascrizione, il TF2E e il
TF2H, che perme eranno l’inizio della
trascrizione poiché ques hanno a vità
elicasica (perme ono l’apertura del dna e inizia
la formazione del complesso aperto per cui la
polimerasi potrà muoversi sul dna).

Vediamo come avviene sicamente il legame di ques

fa ori di trascrizione: vediamo per esempio uno dei
fa ori chiave, la TBP Tata Binding Protein. Vediamo nel
dna la nostra Tata box; la TBP lega il dna nel solco minore
ed è una “anomalia” poiché le proteine di solito legano il
dna nel solco maggiore e non in quello minore (discorso
del riconoscimento dei gruppi funzionali speci ci presen
nel solco maggiore e non in quello minore). La TBP va a
conta are la doppia elica da un lato e, legandosi al solco
minore, piega il dna facendo in modo che la Tata box si
pieghi verso il solco maggiore ➞ in questo modo
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 perme e il legame del fa ore di trascrizione TF2B. È proprio grazie al legame della TBP e alla curvatura che
si viene a formare sul dna che si ha la possibilità che avvengano i legami degli altri fa ori di trascrizione, e
quindi che la polimerasi riesca a conta are al meglio il dna. Per cui in sintesi, la TBP lega il dna nel solco
minore perme endo una curvatura dello stesso ed esponendo il solco maggiore al legame con altri fa ori di
trascrizione.

La TBP non è presente soltanto per la polimerasi 2, ma anche per la 1 e la 3 ➞ quindi ha un ruolo universale,
interagendo con degli elemen che hanno cara eris che comuni a tu e e 3 le polimerasi.

TF2E e TF2H: gli ul mi due fa ori che si vanno a legare e consentono l’inizio della trascrizione. Hanno un
ruolo importante perché perme ono l’apertura della doppia elica. Il TF2H è anche fonte di energia poiché è
anche una ATPasi, inoltre perme e di fosforilare la coda carbossiterminale della polimerasi (vediamo nel
disegno come i gruppi fosfato vanno sulla coda CTD della polimerasi). Quindi entrambi ques fa ori di
trascrizione sfru ano l’idrolisi dell’Atp e perme ono l’apertura del dna ➞ consentono l’inizio della
trascrizione. Nel momento in cui si ha anche la fosforilazione di speci ci aminoacidi sulla coda CTD, la
polimerasi inizia a muoversi sul dna e
quindi i fa ori di trascrizione
possono staccarsi dal dna ed
eventualmente
essere disponibili per un nuovo
promotore.

Ruolo
del CTD: è coinvolto in varie fasi durante la trascrizione: sia
all’inizio ma anche in tu e quelle modi che dell’rna dopo che è
stato formato (quindi nella sua maturazione). Fondamentalmente
alla coda CTD, una volta che viene fosforilata, si legano anche
quegli enzimi che servono per andare a formare il cappuccio,
quindi il CE Capping enzyme.
Inoltre la fosforilazione di speci ci aminoacidi sulla coda CTD
perme e anche il reclutamento di quelle proteine che legano i fa ori di splicing, e perme ono anche il
reclutamento di quelle proteine che perme ono che avvenga la poliadenilazione. Quindi consente tu quei
meccanismi che sono importan per la maturazione dell’rna messaggero. La coda CTD ha quindi un ruolo
chiave e partecipa in tu e le varie fasi della trascrizione.

Questo è un disegno in cui vediamo i singoli componen del

complesso di pre-inzio: vediamo il dna piegato, la
polimerasi e i vari fa ori di trascrizione, che si vanno ad
assemblare sul dna.

I fa ori che abbiamo nominato no ad ora vengono chiama fa ori basali, ma possono intervenire anche
altre proteine come il Mediatore ➞ serve per far sì che la polimerasi possa essere trasportata al complesso
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 di inizio. Esso è un complesso proteico, formato da più di 20
proteine dis nte.

SEQUENZE ENHANCER:
Poi possiamo avere
altre
sequenze oltre il promotore minimo, basale, che si
possono trovare molto distan dal punto di inizio della
trascrizione: le sequenze Enhancer, ossia sequenze che
aumentano l’a vità di un promotore. Queste sequenze non
hanno una distanza ssa dal promotore, bensì può
essere variabile. Possiamo trovare infa degli Enhancer che si
trovano a monte del promotore (immagine in alto)
oppure altri che si trovano a valle del promotore
(immagine in basso), ma in entrambi i casi
possono a vare quel promotore che si trova anche a distanza di cen naia bp.
Possono funzionare in diversi modi: a distanza (quando il promotore di trova distante da essa), in entrambi
gli orientamen e possono agire anche in base alla posizione (quindi sia se si trovano molto distan
dall’unità di trascrizione di quel promotore ma anche all’interno dell’unità di trascrizione di un promotore).
Agiscono in diversi modi sempre con lo stesso obie vo: a vare la trascrizione di quel determinato gene.
Gli elemen stru urali che cara erizzano gli Enhancer sono gli stessi che possiamo trovare all’interno dei
promotori.
Facendo delle analisi mutazionali (portando quindi delle modi che nella sequenza di un promotore o di una
sequenza Enhancer, modi cando la sequenza con mutazioni sito-speci che che cambiano alcune basi in
determinate posizione) è stato visto che è molto più frequente che una mutazione sia di rilievo, e quindi
induca un'alterazione della trascrizione di un determinato gene, se questa mutazione si trova all’interno di
una sequenza Enhancer piu osto che se si trovi in quella di un promotore basale.
Quindi parlando della regolazione della trascrizione possiamo parlare di promotori che possono essere
regola da una sequenza Enhancer che si trovi ad una distanza non troppo maggiore ➞ andando ad
aumentare l’e cienza dell’inizio della trascrizione; oppure può essere non regolato, ossia l’Enhancer è
molto lontano. Tu avia in qualche modo una sequenza Enhancer molto lontana può trovarsi più vicino alla
sequenza di un promotore, sulla base di determina ripiegamen che possono essere indo sul dna dal
legame di proteine speci che sull’Enhancer, e in questo modo andare ad a varlo.
Dunque se un promotore ha nelle sue vicinanze (da cen naia di bp no a 1000/1500) una sequenza
Enhancer ➞ questa aumenta l’e cienza dell‘inizio della trascrizione;
Se l'Enhancer è molto più lontano potrebbe non regolare la trascrizione di quel gene, ma in questo caso la
regolazione può comunque veri carsi in una par colare condizione ➞ delle proteine si legano
speci catamente a tale Enhancer molto lontano aumentandone l’e cacia e quindi a vandola.
La regolazione trascrizionale per le polimerasi 2 può essere molto complessa, e tale complessità aumenta
sopra u o sulla base della comprensione del ruolo di queste sequenze che possono essere anche molto
distan dall inizio della trascrizione del gene.
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 CARATTERISTICHE GENERALI DEGLI ENHANCER:
- Non sono lunghe di solito più di 150 bp.
- Sono sequenze che possono essere funzionali per più promotori di geni diversi ➞ sono sta fa
degli studi in cui sono state spostate tali sequenze vicino promotori di geni diversi e comunque
con nuavano ad agire (vuol dire che intervengono delle proteine generiche che regolano la
trascrizione).
- Agiscono anche se si trovano a valle dell’inizio di un promotore e anche se si trovano all’interno di
un gene
- Possono agire anche su geni distan migliaia di bp
- Agiscono in entrambe le direzioni (cioè su geni pos su entrambi i lamen del dna).

➞ è molto importante valutare in che modo e dove si trovano queste sequenze Enhancer, per capire come
può essere regolato un determinato gene.

Tu avia gli Enhancer possono funzionare in modo speci co solo in un determinato po cellulare ➞ questo
ci fa comprendere come l’espressione di alcuni geni può essere limitata ad alcuni pi di cellule speci che.
Es: geni delle immunoglobuline, che sono presen in tu e le cellule ma vengono espressi solo nei Linfoci B
( poiché è lì che si legano i fa ori di trascrizione ). Nel disegno abbiamo le sequenze Enhancer E 1,2,3 e
alcuni fa ori di trascrizione presen solo sui linfoci B (che si legano alle sequenze Enhancer e perme ono
l’a vazione della trascrizione). Per cui solo nei linfocita B si lega un fa ore di trascrizione che a va la
trascrizione, mentre in tu e le altre cellule si andranno a legare invece delle proteine che vanno ad inibire la
trascrizione poiché non devono essere presen .
Dunque le sequenze Enhancer, anche se presen in diversi pi cellulari, vengono riconosciute soltanto nei
pi cellulari in cui sono presen i fa ori di trascrizione.

Le proteine che legano le sequenze Enhancer sono

fa ori di trascrizione chiama A vatori, poiché
a vano la trascrizione. Solitamente agiscono in
maniera coopera va, ossia più proteine vanno a
legare la sequenza per perme ere l’inizio della
trascrizione di quel gene. Vediamo nel disegno una
serie di a vatori (HMGA1 è la proteina stru urale,
NFKP, IRF, ATF, JUN, sono a vatori) che perme ono la
trascrizione del gene dell’interferone beta
andando a formare un complesso proteico che lega
l’Enhancer e si chiama Enhanceosoma. È
dunque un
complesso, formato da diverse proteine, che entra in
conta o con quelle regioni prossimali del promotore ➞ lo
può fare poiché va a formare un’ansa a livello del dna, che
perme erà un avvicinamento di sequenze che erano distali
alle sequenze prossimali del promotore.
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 ISOLATORI: sono delle sequenze di dna a cui si legano delle speci che proteine, le quali legano il dna
andando ad in uenzare l’azione degli Enhancer (impedendo l’a vazione di uno speci co promotore).
Ci possono essere situazioni in cui,
all’interno della cellula, sono presen delle
proteine legate a queste sequenze
isolatore ➞ impediscono agli
Enhancer di a vare la trascrizione.
Questo succede perché la cellula può avere
la necessità di trascrivere in
determina momen del ciclo
cellulare alcuni geni e non altri.
Inoltre dato che gli Enhancer possono agire
su sequenze molto distan , tali
sequenza possono regolare più geni ➞
immagine C in cui una sequenza
Enhancer si trova tra due sequenze
promotore (quindi tra due geni diversi) però tra uno dei due promotori e la sequenza troviamo un
isolatore ➞ questo fa in modo che tale Enhancer non potrà a vare il gene a valle ma potrà a vare
quello a monte. Immagine D abbiamo la situazione in cui un isolatore impedisce l’a vità di un Enhancer
posto a monte ma non reprime l’a vità di un Enhancer posto a valle.
Quindi le sequenze isolatore tendono a regolare la trascrizione genica inibendo l'accensione di un
determinato gene nel momento in cui si vanno a legare speci che proteine. Questo avverrà in situazioni
cellulo-speci che.

Inoltre un isolatore, quando lega una proteina isolatore-speci ca, può avere anche un e e o opposto: può
fungere da marcatore di con ne della croma na. La croma na può essere dis nta in Eucroma na ed
Eterocroma na; quando un dna tende a compa arsi (quindi una eterocroma na), poiché ad esempio
quelle sequenze geniche non devono essere trascri e oppure per avere un maggior/minor compa amento
nella cellula, esso può di ondere inibendo la trascrizione
bloccando i promotori. Se la cellula ha la necessità di trascrivere
alcune sequenze geniche farà in modo che si formi una barriera per
l’eterocroma na e lo farà facendo in modo che la sequenza
isolatore venga legata dalle sue proteine speci che ➞ perme erà la
trascrizione di determina geni. Sono meccanismi cellula/tessu -
speci ci. Gli isolatori possono quindi agire in due diversi modi.

DOMINI DI REGOLAZIONE:
Quindi una unità di trascrizione che
controlla l’espressione di un determinato
gene è formata da diversi domini: la
sequenza isolatore, le sequenze
Enhancer e poi altre sequenze come le
MAR (Matrice
A achment region, si di a acco alla
matrice), ovvero
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 responsabili dell’a acco della croma na alla periferia del nucleo ➞ creano un dominio sico del dna
perme endo di formare delle anse. (Responsabili della organizzazione della croma na in anse). Si trovano
di solito vicine alle sequenze Enhancer e perme ono un controllo durante lo sviluppo dell’espressione
genica, andando a reclutare fa ori di trascrizione e andando a far in modo che vengano controlla anche
quegli elemen necessari per rimodellare la croma na.
Poi abbiamo anche le LCR (Locus control region) che sono delle sequenze di dna che perme ono di
controllare l’espressione sequenziale di geni ➞ fanno in modo che dei geni vengano espressi secondo una
sequenza ben ordinata (es: geni della beta globina).

La trascrizione genica quindi è un meccanismo molto complesso, che richiede l’intervento di diverse
proteine su sequenze speci che del genoma (i domini di regolazione).
Stru ura modulare e domini dei fa ori di trascrizione(trans-a vatori):
Tu e quelle proteine dei fa ori di trascrizione che legano una sequenza speci ca sul DNA hanno dei domini
che li cara erizzano e sono sia i domini di legame al DNA sia i domini di a vazione.

L'a vità di un promotore è in uenzato dalla me lazione del DNA :

Un meccanismo cri co nell'a vità di un promotore è la me lazione del DNA (la me lazione del DNA
avviene solo a si CpG)➞ me lazione a livello di citosine ad opera delle DNA-me ltransferasi. È una
delle più comuni modi cazioni epigene che osservata nei genomi degli eucario . Le citosine sono
me late per lo più in delle sequenze speci che ovvero a livello di dinucleo di CpG, quando nella
sequenza genomica una C è seguita da una G ( la p rappresenta il gruppo fosfato che si trova tra le
due basi consecu ve).
Se a livello genomico si ha la formazione di queste
me lazioni e una citosina me lata va incontro a un
processo di deaminazione, che avviene spesso nella
cellula, una 5-me lcitosina quando viene deaminata
formerà una mina ovvero una base che è
naturalmente presente nella cellula eucario ca e
quindi non verrà riconosciuta come base
anomala; ciò invece accadrebbe se la
citosina venisse deaminata con conseguente
formazione di uracile che indurrebbe la
cellula a portare avan una mutazione.
Questo è il mo vo per cui questo po di
dinucleo di è generalmente evitato nel
genoma delle cellule eucario che essendo
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 potenzialmente sogge a me lazione a livello delle C. Infa spesso nel genoma umano la
frequenza osservata di ques si CpG, rispe o alla frequenza a esa sta s camente, è molto
bassa (circa ⅕). È un dinucleo de poco rappresenta vo, ma ci sono regioni del genoma speciali
che sono chiamate isole CpG, le quali si trovano spesso a monte di promotori genici e sono regioni
genomiche ipome late➞ non sono me late e la cellula tende a tenerle con una bassa me lazione
(processo che potrebbe indurre a mutazioni), infa sono regioni par colarmente abbondan di
ques si CpG.

Cosa sono le isole CpG?:

Le regioni ricche di si CpG sono, appunto, chiamate isole CpG ovvero cor segmen di DNA con
alta frequenza di si CG➞ dinucleo di CpG sono rari nel dna dei mammiferi tranne in queste
regioni speci che che però di solito sono regioni non me late.
Isole de nite come lunghe almeno 200 bp e che hanno una percentuale di basi CG maggiore del
50% e in cui il rapporto tra sequenze osservate e a ese sta s camente è più alta del 50%.

Le isole CpG e i geni:

Queste regioni si è visto essere presen a livello di regioni promotrici di mol geni e hanno un
ruolo chiave nel silenziamento genico.
Quasi tu i geni Housekeeping (geni che servono a sinte zzare quelle proteine senza le quali la
cellula non potrebbe sopravvivere) hanno almeno un’isola CpG ➞regioni chiave di regolazione
genica; si trovano a monte di un promotore (TSS) e
coprono uno o più esoni o introni, spesso vicino al sito d’inizio di trascrizione➞ ruolo chiave nella
trascrizione; circa il 40% di geni tessuto speci ci sono associa a isole. Nell’immagine vediamo
un’isola CpG che si può trovare:
● a monte di un gene o a cavallo della trascrizione di un
gene;
● all’interno della sequenza genica;
● a valle della sequenza genica come nelle
sequenze Enhancer;
In questa slide vediamo il vero signi cato di isola CpG. A
sinistra, in giallo, sono presen in grande quan tà i vari si
CG che cara erizzano la sequenza, de niscono la cos tuzione di un’isola CpG; a destra invece i si
CpG in regioni genomiche non promotore sono molto più rare. Questa a sinistra è una regione
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 promotore e lo possiamo dedurre
anche dal fa o che è presente un ATG
(codon d’inizio
sito di trascrizione) e intorno tan si
CpG.
I si CpG sono importan perché dal
momento in cui queste citosine dei
dinucleo di CpG vengono me late, il
dna me lato è meno accessibile ai
fa ori di trascrizione perché il
gruppo me lico produce già
l’ingombro sterico e inoltre va a
richiamare delle proteine speci che
che legano il dna me lato e
impedisce il legame dei fa ori di trascrizione e di conseguenza anche il legame della
polimerasi➞ inibizione della trascrizione.
La presenza di un’isola CpG ci indica la presenza molto spesso di una regione genica e come la
trascrizione di quella regione di quel gene in par colare possa essere me lato tramite me lazione
di citosine speci che legate nella sequenza genomica a delle guanine, quindi a livello dei si CpG.
Sono elemen pici dei promotori dei geni negli eucario che vanno a regolare la trascrizione
genica. È importante ricordare che sono tendenzialmente dinucleo di rari nel genoma, tranne che
a livello di queste isole ipome late (quei geni verranno trascri , ma dal momento in cui vengono
me late, possono portare anche a induzione di mutazioni di quelle citosine me late che vengono
deaminate, vanno comunque a regolare la trascrizione del gene in cui si trovano con gue o a
cavallo. (Ripetuto) Sono si poco frequen nel genoma eucario co perché potrebbero portare a
sviluppo di mutazioni in quanto nel momento in cui vengono me la ques si si va incontro a
deaminazione spontanea delle citosine me late e alla formazione di mine quindi
tendenzialmente sono poco presen , ma spesso presen a livello dei promotori di geni dove sono
queste isole (regioni ad alta frequenza di si CpG) solitamente poco me late proprio per evitare le
mutazioni, ma se venissero me late avrebbero un ruolo chiave nella regolazione della trascrizione
poiché la me lazione inibisce la trascrizione di un gene in quanto inibisce il reclutamento di fa ori
di trascrizione e quindi il legame della polimerasi.

Oltre alle isole CpG esistono anche le CGI➞ sono le isole CpG, ma negli ul mi anni sono state
trovate e cara erizzate altre regioni genomiche importan per quanto riguarda la regolazione
trascrizionale che servono come regioni chiave a nel silenziamento genico come quelle che
vediamo nella slide che si chiamano CGI shore
(shore= spiaggia, regioni genomiche che sono
vicino le isole CpG) in cui sono di nuovo
presen si CpG che possono essere me late per
in uenzare la trascrizione di un gene oppure si è
visto che esistono anche a livello genomico dei
singoli si CpG anche distan migliaia di bp
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 dall’inizio della trascrizione di un determinato gene che vengono chiamate CpGs (open sea) che se
me late possono regolare la trascrizione di un gene. Queste informazioni sono state iden cate da
pochi anni, molte di esse sono ancora in divenire e si stanno cara erizzando in ques anni
cercando di capire sempre di più come avviene la regolazione della trascrizione e come è
cara erizzato un promotore tu o ciò che gli sta intorno. Tu o ciò dipende sempre dall’alta
dinamicità del dna e dal fa o che un dna dal momento in cui subisce delle modi cazione tramite
legame con delle proteine par colari o me lazione, induce delle modi cazioni conformazionali del
dna stesso che portano regioni che in una sequenza lineare si trovano molto distan tra di loro a
essere in realtà molto più vicine e quindi possono regolare un determinato gene.
Lo studio della trascrizione o di un promotore di una cellula eucario ca è un meccanismo
decisamente complesso.

ESERCIZIO 1:
-La freccia, che rappresenta il movimento della
polimerasi lungo il lamento, dovrà essere disegnata
in direzione inversa➞ da destra verso sinistra (dove
c’è un’a vità maggiore dell molecola) e perché è la
porzione più lunga di rna messaggero prodo a e sarà
associata con la polimerasi che è stata trascri a da
più tempo. De o ciò i viene data una sequenza;
-Sapendo che la polimerasi si sta
muovendo da destra verso sinistra e che l’rna viene
sempre trascri o in direzione 5’-3’, il lamento
stampo è il lamento di sopra da destra verso sinistra(3’-5’). 5’ ACTCGATGCTAG
3’ ( lamento stampo) e
3’TGAGCTACGATC 5’ ( lamento prodo o);
- Bisogna ricordarsi che si legge sempre in direzione 5’-3’. Per o enere la risposta dobbiamo
leggere il lamento prodo o in basso in direzione 5’-3’:
CUAGCAUCGAGU.
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 ESERCIZIO 2:
- La direzione della trascrizione per i due geni
non sarà la stessa, perché è la posizione
promotore che decide la direzione, infa si
trovano sempre prima della regione che
devono trascrivere. Per il gene 1 il
lamento di so o è lo stampo che viene le o
in direzione 3’-5’ dalla polimerasi. Per il gene
2 è l’altro perché il promotore si trova
nell’altra direzione.
- Le frecce andrebbero posizionate in direzione opposta l’un l’altra.
- Circonda le regioni, sul promotore dove probabilmente si legheranno i fa ori di trascrizione.

DEFINIZIONI:
1. I fa ori di trascrizione (in
generale).
2. Small nuclear rna.
3. I promotori.
4. Polimerasi.
5. Rna messaggero.
6. Splicing.
7. Sequenza terminatore.
8. Esoni.
9. Poro del complesso nucleare.
VERO O FALSO:
1. Vero. Perché se c’è un errore nella replicazione del dna può portare a mutazioni e quindi una
conseguenza gene ca, errori che porteranno danni anche alle generazioni future di cellule;
mentre un danno nella trascrizione porterà a un errore nella produzione di una determinata
proteina (potrebbe essere un problema, ma si limita a quello e di conseguenza è un errore
meno grave), infa la capacità di proofreading da parte di una dna polimerasi è maggiore di
quanto non lo sia quella di una rna polimerasi.
2. Falso. Perché la subunità sigma si associa al core della polimerasi per formare l’oloenzima
solo durante la fase d’inizio della sintesi dell’rna➞ aiuta il core enzima co a legare il
promotore.
3. Vero. Il fa o che sia vero è legato a come viene modi cato l’rna ovvero al 3’ e verrebbe
spontaneo dire di si perché l’ul ma base avrà sicuramente un gruppo ossidrilico, ma il
perché ce l’ha al 5’ è legato alla posizione del cappuccio.
4. (Tra eremo in seguito)
5. (Tra eremo in seguito)
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 LA REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE EUCARIOTICA
Come nei procario , anche negli eucario abbiamo proteine a vatrici e proteine repressore, ma la
regolazione è più complicata visto che ci saranno diversi segnali che dovranno essere integra per fare sì che
il processo avvenga. Questo perché negli eucario abbiamo migliaia di geni, abbiamo diversi pi di cellule
con un DNA che arriva no a 6 miliardi di coppie di basi per codi care tan ssime proteine; inoltre, la
maggior parte del DNA umano non codi ca solo per proteine ma serve per portare a produrre molecole che
hanno un ruolo chiave nella regolazione genica. Molte proteine nelle cellule eucario che sono sinte zzate
in maniera con nua perché sono quelle che serviranno alla cellula per svolgere le funzioni base (geni house-
keeping), ci sono proteine che vengono sinte zzate per funzioni speci che della cellula e poi ci sono
proteine che vengono sinte zzate ogni volta che la cellula ne avrà bisogno quando si trova nelle varie
condizioni ambientali.
Qui vediamo un promotore di una cellula
procario ca (in alto), di un lievito (in mezzo) e di un
gene umano (in basso). Possiamo già vedere, dalla
stru ura del promotore, che nell’uomo avremo una
regolazione molto più complessa e sopra u o
vediamo che a monte e a valle dei box viola
(promotore) ci sono una serie di sequenze
regolatorie che nelle cellule umane sono tan ssime
e possono trovarsi anche a migliaia di bp di distanza
dal promotore.
Qui vediamo il nostro DNA avvolto intorno alle proteine istoniche
(1) quindi i vari nucleosomi. Noi dobbiamo sapere che la maggior
parte della regolazione dell’espressione genica è controllata
sopra u o all’inizio, cioè quando la stru ura locale del gene è
cambiata (vuol dire che un nucleosoma può essere rimosso, quindi
si passa da eterocroma na a eucroma na e questo lascia spazio al
meccanismo trascrizionale che si deve andare a legare al
promotore) oppure quando l’apparato trascrizionale inizia a legarsi
al promotore. Una volta terminata la trascrizione questo RNA che
viene formato deve essere maturato prima di essere esportato a
livello citoplasma co ed essere poi trado o nella proteina
funzionale e poi verrà degradato. In tu ques step (a livello
nucleare) può avvenire una regolazione a livello trascrizionale. I
meccanismi che sono principalmente responsabili della regolazione
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 trascrizionale sono a carica di ciò che avviene a livello di rimodellamento della croma na e cambiamento
della stru ura locale (quindi tu o ciò che avviene a livello nucleosomale). Ma tu ques step sono
potenzialmente modulabili da parte della cellula.
Nel controllo della trascrizione negli eucario se parliamo di controllo posi vo (ovvero proteine che
perme ono l’a vazione della trascrizione) possiamo dis nguere 3 diversi a vatori:
1. ATTIVATORI VERI, ossia i fa ori di trascrizione che vanno dire amente a conta are il promotore di
un gene;
2. ANTIREPRESSORI, che sono quelle proteine che si vanno a legare alle sequenze distali, ovvero alle
sequenze Enhancer, e vanno a reclutare proteine che sono i complessi di rimodellamento della
croma na. Quindi in questo caso la loro a vità non è dovuta al conta o dire o con il DNA a livello
del promotre, ma è dovuta al conta o con la croma na;
3. PROTEINE ARCHITETTONICHE che hanno il ruolo di piegare il DNA e piegando il DNA me ono in
prossimità proteine che interagendo con sequenze nucleo diche distan prima non lo erano, quindi
queste proteine che erano associate agli elemen distali si trovano a poter interagire con i fa ori di
trascrizione che si trovano a livello del promotore e quindi a perme erne il controllo.
Esempio di proteina archite onica
Qui vediamo il reclutamento di una proteina HGM (verde) che lega il DNA (in
grigio) e legando il DNA mi provoca il ripiegamento e perme e il reclutamento di
un fa ore di trascrizione (TF1). Questo fa ore di trascrizione legato con il DNA e
la proteina archite onica può o indurre il reclutamento di altri fa ori di
trascrizione a nché avvenga il processo oppure potrebbe essere necessario un
fa ore di trascrizione solo per far sì che la polimerasi venga reclutata sul DNA per
iniziare il processo. Nel momento in cui la cellula ha reclutato i fa ori di
trascrizione (che siano uno o più) la proteina archite onica non è più necessaria,
il DNA riprende la conformazione iniziale e non è più piegato.

A vatori (fa ori di trascrizione)

Sono quelle proteine che si vanno a legare al promotore o agli enhancer e sono fondamentali perché sono
quelle che perme ono il funzionamento del promotore e fanno sì che aumen la frequenza di inizio della
trascrizione. Alcuni di ques a vatori sono presen in tu e le cellule, quindi sono quelli UBIQUITARI; altri
verranno sinte zza o a va in momento precisi a seconda delle necessità di una cellula. Anche in questo
caso vediamo che è la piegatura del DNA che perme e a proteine che si trovano distan di interagire con
proteine legate a livello del promotore. Quindi le proteine legate agli enhancer si trovano vicino al
promotore perché il DNA si ripiega.
Quindi gli a vatori possono agire in diversi modi.

➢ Ci sono delle proteine che possono essere tessuto-speci che, quindi possono essere sinte zzate
soltanto a livello di un determinato tessuto;

➢ Alcuni a vatori possono essere controlla da una modi cazione (per esempio l’a vatore A viene
fosforilato da un’altra proteina e soltanto quando sarà fosforilato potrà agire sul promotore e
accendere un determinato gene);

➢ Poi ci sono a vatori che sono a vi solo se lega ad un determinato ligando (es. rece ori per gli
steroidi)
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 ➢ Alcuni a vatori possono essere a va se smaschera da proteine
che le legano, ovvero la disponibilità di un determinato fa ore di
trascrizione può cambiare e diventare a vo quando alcune
proteine che li legano li smascherano (immagine d). La proteina nel
momento in cui si trova a livello nucleare perde una proteina ad
esso legata e diventa a va e può agire sul promotore. (un esempio
è la proteina NFKB che non è più legata ad una proteina che la
inibisce a livello citoplasma co e diventa quindi disponibile)

➢ Alcuni a vatori possono essere lega a diverse proteine che ne

inducono l’a vazione (immagine e)

➢ Alcuni a vatori vengono taglia di un precursore ina vo (R) e

diventa a vo (immagine f).

Oltre l’a vazione, come nei procario , anche negli eucario può avvenire la REPRESSIONE.
Quindi una proteina a vatrice può essere legata da una proteina repressore (R) e inibire la trascrizione di
un gene; se la proteina a vatrice è già legata a una sequenza speci ca (che può essere anche una sequenza
enhancer) nel momento in cui si lega a quella sequenza anche la proteina repressore il legame tra a vatore
e repressore inibisce la trascrizione; oppure può accadere che la proteina repressore va a competere con
l’a vatore per il sito di legame. In entrambi i casi si può veri care l’inibizione della trascrizione.
Un a vatore pe poter funzionar ha bisogno di diversi domini proteici che hanno diverse funzioni. In questa
immagine vediamo che c’è un dominio della proteina a vatrice che serve per legare il DNA, un dominio di
connessione che appunto conne e il dominio di legame al DNA al dominio di a vazione. Inoltre, la
stru ura di un a vatore deve essere una stru ura essibile visto che i mo vi di sequenza di un promotore
possono essere molto distan dal sito d’inizio, possono essere orienta in entrambe le direzioni.
Se un a vatore non ha un dominio che a vi la trascrizione, signi ca che dovrà legare un’altra proteina, un
CO-ATTIVATORE, che sarà in grado di a vare la trascrizione. Quindi ci saranno una serie di interazioni che
dovranno avvenire tra le proteine importan per legare le sequenze promotore e i fa ori basali della
trascrizione.
L’a vatore, con il suo dominio di a vazione, va a conta are i fa ori di trascrizione generici TAF (TBP
associated factor) che sono coinvol nell’assemblaggio del complesso di inizio.
Quando consideriamo tu i componen che sono richies a nché possa avvenire in maniere e ciente la
trascrizione dobbiamo considerare i fa ori basali, gli a vatori, i co-a vatori, la polimerasi, no ad arrivare
ad un complesso formato da più di 40 proteine. Questo è un sistema essibile in quanto non tu e le
proteine devono essere sempre presen e i fa ori non devono conta are dire amente la polimerasi ma
interagiscono tra di loro formando così un complesso che possa reclutare la polimerasi.
Ma in che modo tu e queste proteine vanno a legare il DNA?
Abbiamo de o che devono avere una stru ura speci ca in cui i vari domini sono responsabili sia del legame
al DNA sia dell’a vazione della trascrizione. È stato possibile classi care i fa ori in base a quale po di
dominio di legame al DNA hanno, che sono:
1. Mo vo a dita di zinco
2. Rece ori degli steroidi
3. Mo vo elica-giro-elica
4. Mo vo an pa co elica-ansa-elica
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 5. Cerniere lampo di leucina (leucine zipper)
Mo vo a dita di zinco (zinc nger)
Gli a vatori hanno una stru ura di questo po. Si tra a di un
piccolo gruppo di amminoacidi conserva (pallini celes ) che
legano un atomo di zinco formando un dominio indipendente
nella proteina. La regione consenso, ossia la regione che si
ripete in tu e le proteine di questo po (che legano il DNA)
forma quello che si chiama ZINC-FINGER (il dito) ovvero una
cisteina-tre amminoacidi generici-cisteina-12 amminoacidi di
diverso po-is dina-tre amminoacidi-is dina; in totale
abbiamo quindi 23 amminoacidi e sono chiamate anche dita
Cys2/His2 (che sono i due amminoacidi che sono sempre presen in questa regione consenso).
In che modo legano il DNA? La porzione carbossi-terminale di ogni dito è quella che forma un’alfa elica che
perme e di legare il DNA, mentre la porzione ammino-terminale va a formare un foglie o beta. Quindi per
ogni dito noi avremo sempre un’alfa elica e un foglie o beta. Le alfa eliche vanno a legare il DNA, mentre i
foglie beta vanno a circondare lo zinco (al centro) sull’altro lato di ciascun dito.
Se abbiamo a vatori di questo po, abbiamo a vatori che possono avere più dita, le quali devono essere
almeno 2 per poter legare il DNA ma possono arrivare anche ad essere 27. In media tra le varie dita di zinco
gli amminoacidi di connessione sono circa 7-8. Come dicevamo il limite è 2 ma a nché si possa creare un
legame abbastanza stabile con il DNA ci devono essere almeno 3 alfa eliche che si andranno ad in lare nel
solco maggiore andando ad instaurare delle interazioni sequenza-speci che (in par colare ogni alfa eliche
andrà ad interagire con due coppie di nucleo di). Quindi tendenzialmente a nché si formi un buon legame
tra una proteina a vatrice che ha queste sequenze consenso ci devono minimo essere 6 nucleo di che
legano le 3 alfa eliche.

Un altro po di proteine a vatrici sono i rece ori degli steroidi, che hanno anche loro dei mo vi po Zinc-
nger; qui vediamo nell’immagine diversi steroidi e le a vità biologiche dei diversi steroidi dipendono dai
geni che vengono accesi quando si ha il legame tra il rece ore e lo steroide con cui va ad interagire. In alto
l’immagine di come va a funzionare un rece ore steroideo. Nell’immagine qui a destra vedete come c’è una
regione molto conservata, ovvero quella regione che lega il DNA e il fa ore di a vazione trascrizionale, tra i
diversi ormoni (quindi un dominio conservato all’interno di tu gli ormoni).
Il modo in cui i rece ori degli steroidi possono agire sul DNA è quello che si
vede nell’immagine: il rece ore interagisce con gli steroidi che sono idrofobici,
e quindi a raversano la membrana per di usione semplice, e una volta nella
cellula legano il rece ore nella regione C-terminale dello stesso e possono
essere importa come complesso ormone-rece ore a livello nucleare; qui, il
complesso va a legare sequenze speci che sul DNA (per lo più sono sequenze
enhancer) che legano il complesso GRE e perme e l’a vazione trascrizionale.

Qui vediamo un esempio di un rece ore che normalmente è presente a livello

cellulare in forma non a va; in questa forma è legato a delle stru ure proteiche che hanno la funzione di
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 tenere il rece ore in forma quiescente, in modo che non
possa esprimere la propria azione.
Queste proteine che inibiscono il rece ore sono quelle che
vedete in rosso, che si chiamano HSP, ovvero le Heat-Shock
Protein (chiamate così perché sono state iden cate durante
degli studi fa sulla denaturazione delle proteine mediante
calore, ma hanno dei ruoli molto ampi, non legato
semplicemente al calore; il numero 90 qui sta ad indicare il
numero di amminoacidi da cui è cos tuita la proteina). Solo
quando viene trasportato a livello cellulare l’ormone che si
legherà al suo rece ore, queste proteine HSP vengono
distaccate e il dimero formato da un complesso ormone-rece ore può andare a livello del nucleo e
interagire sulle sequenze enhancer GRE (che sta per Glucocor coid Response Elements) e a vare la
trascrizione.
Il modo con cui agiscono sul DNA è simile a quello visto per gli
a vatori che hanno il mo vo a dita di Zinco perché anche ques
rece ori hanno dei mo vi simili ! in questo caso sono Cys2/Cys2,
perché nell’immagine vedete in giallo le cisteine che formano il
legame con lo zinco e la sequenza consenso è data da una cisteina,
poi due amminoacidi, poi un’altra cisteina, poi 13 amminoacidi che
formano il dito, cisteina di nuovo, altri 2 amminoacidi generici,
cisteina e nisce il primo dito. Poi c’è un altro dito, separato dal
primo con 6 amminoacidi, e di nuovo abbiamo un mo vo a dita di
Zinco simile a quello di prima, soltanto che tra la prima e la seconda cisteina non ci sono più 2 amminoacidi,
ma ne sono 4. Il ruolo del secondo dito fondamentalmente è quello di controllare la spaziatura tra le
sequenze, mentre il primo dito sarà quello che va a legare il DNA e gli amminoacidi coinvol nel legame con
il DNA (sono i pallini in viola che vedete nell’immagine). Quindi i rece ori degli steroidi hanno una stru ura
simile a quella vista prima, in questo caso ci sono degli amminoacidi speci ci che vanno a legare il DNA e
sono parte del primo dito.
• Un altro mo vo importante dei fa ori di trascrizione è il
mo vo elica-giro-elica, ovvero HTH (che sta per Helix-Turn-
Helix), quindi due alfa-eliche che sono unite da una corta
catena di amminoacidi. Questo po di mo vo, l’abbiamo già
visto nei procario per il repressore del triptofano, per la
proteina CAP, che presentano questo po di mo vo e si legano
al DNA so oforma di dimeri (si legano nel solco maggiore e la
distanza tra due dimeri che legano il DNA è di circa 3.4
nanometri). Quindi è un mo vo frequente nei procario , ma
che troviamo anche negli eucario .

• Un altro po di mo vo è l’omeodominio, che è una variante

dell’elica-giro-elica. La di erenza tra ques due domini è che
il primo ha un’alfa-elica di riconoscimento più lunga rispe o a
quella del dominio elica-giro-elica. Quindi nell’omeodominio
troviamo tre alfa-eliche, una più lunga che va a riconoscere il
solco maggiore ed inoltre, una delle tre alfa-eliche (qui la 1)
va ad interagire anche con il solco minore.
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 • Poi vi è quello an pa co elica-ansa-elica (HLH, Helix-Loop-Helix), in cui 2
corte catene alfa-eliche unite da una regione ad ansa formano un dimero
tramite le alfa-eliche che sono interro e dalle anse. Abbiamo una regione
amino-terminale che interagisce con il solco maggiore del DNA, grazie a dei
legami ad idrogeno e alle interazioni di Van der Waals con le basi esposte
del DNA.

• Per ul mo abbiamo le cerniere lampo di leucina (leucine

zipper), ovvero una stru ura in cui abbiamo dei residui di
leucina (pallini in verde) che si ripetono ogni 7 amminoacidi
formando una stru ura “come una cerniera” che ene unite
due eliche di riconoscimento che sono quelle che vanno ad
interagire con il DNA. Si forma una sorta di Y, in cui il gambo è
formato dalla cerniera cara erizzata dalla presenza di ques
amminoacidi, e poi le regioni basiche che vanno ad interagire
con il DNA.
Questo è un riassunto dei tre principali
mo vi e di come le proteine interagiscono
con le sequenze speci che nel DNA nel
solco maggiore.

Negli eucario , una volta visto in che modo le proteine interagiscono con il DNA, vediamo i meccanismi di
controllo dell’espressione genica, che possono essere diversi:
1. Si può controllare la trascrizione prima che essa avvenga, quindi impedire che avvenga (meccanismi
principali;
2. Meccanismi di regolazione post-trascrizionale, ovvero il messaggero viene trascri o, e dopo che è
stato prodo o può essere controllato.;
3. Meccanismi traduzionali, in cui il messaggero è prodo o ma non sono necessarie proteine a nché
avvenga la traduzione, quindi la cellula può controllare, tramite determinate proteine, che quel
messaggero funzioni o meno;
4. Meccanismi post-traduzionali, ovvero dopo che una proteina è stata prodo a, non necessariamente
a va nella forma in cui è stata prodo a, deve subire delle modi cazioni (le più classiche sono le
fosforilazioni tramite le chinasi) per poter lavorare.

REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE
Due meccanismi che vediamo oggi sono il rimodellamento della croma na e la me lazione del DNA.

Rimodellamento della croma na ! ovvero come cambia l’organizzazione a livello dei nucleosomi per far sì
che un promotore che prima era ina vo (immagine in alto) possa diventare a vo (immagine in basso),
ovvero l’accesso della polimerasi al DNA. Questo rimodellamento può avvenire tramite il reclutamento di
complessi proteici, che sono quelli de “Complessi di rimodellamento della croma na ATP-dipenden ” o
tramite delle modi cazioni covalen che avvengono a carico delle proteine istoniche.
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 Quindi, in alto la nostra croma na (DNA in rosso e i vari nucleosomi in giallo). Il reclutamento di una
proteina a vatrice può indurre:

➢ il reclutamento di fa ori di rimodellamento della

croma na (disegno in verde) che rimodella proprio la
croma na e rende accessibili sequenze di DNA che
prima non lo erano (in verde la TATA box che prima era
inaccessibile, e adesso diventa accessibile grazie a
fa ori generali di trascrizione e dalla polimerasi che
perme e l’avvio della trascrizione);

➢ Il reclutamento di altre proteine che hanno il compito

di portare delle modi cazioni covalen a livello delle
code istoniche (per esempio, ace lazione che induce
una modi cazione dell’interazione tra codi istoniche e
Dna e rende di nuovo accessibili sequenze che prima
non lo erano).
Complessi di rimodellamento della croma na: fa ori proteici che u lizzano l’ATP come fonte energe ca per
riarrangiare l’organizzazione dei nucleosomi e rendere leggibili le sequenze di DNA, come la TATA box.
Nell’immagine vedete che uno dei meccanismi è questo ma ce ne sono altri, ovvero il complesso di
rimodellamento, che grazie all’energia fornita dall’idrolisi dell’ATP, va a spostare sicamente l’o amero
istonico e libera questa sequenza di DNA, che quindi è accessibile alla polimerasi e ai fa ori di trascrizione
ad essa associa .
I meccanismi a raverso il quale può avvenire questo rimodellamento sono 4 e sono quelli che vedete in
gura ovvero:

▪ spostamento sico dell’o amero istonico

▪ scivolamento dei nucleosomi (nell’immagine centrale vedete la
sequenza TATA in nero, inaccessibile perché legata all’o amero
istonico. Il complesso di rimodellamento della croma na porta
allo scivolamento dei nucleosomi, quindi è un cambiamento della
posizione del nucleosoma sul DNA e alla accessibilità a questa
sequenza in nero, che è la TATA box, che prima non era leggibile).

▪ cambiamento conformazionale: il DNA rimane più accessibile ma

gli istoni restano comunque a acca ;

▪ un altro meccanismo ancora prevede che possano essere

associate all’o amero istonico delle varian istoniche, quindi c’è
uno scambio di istoni all’interno del nucleosoma, e la variante
istonica perme e una maggior accessibilità del DNA.
Quindi ques complessi proteici possono agire inducendo queste
alterazioni nel legame DNA-nucleosoma per rendere accessibili le
sequenze che prima non lo erano. Ques complessi di
rimodellamento sono classi ca sulla base della loro subunità
ATPasica: qui vediamo varie classi. La famiglia più conosciuta è quella
che vedete in alto, SWI/SNF (che sta per SwItch/Sucrose Non-
Fermentable, perché sono state originariamente isolate nei lievi
questo po di proteine).
La di erenza tra le varie classi è appunto la subunità ATPasica.
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 Modi cazioni covalen : possono avvenire a carico delle code istoniche (qui vediamo l’o amero istonico, il
DNA che gli gira intorno). Ogni istone ha una sua coda, che non entra a far parte della stru ura
nucleosomica, cara erizzata da speci ci amminoacidi; ques ul mi possono subire delle modi cazioni
covalen . Le modi cazioni covalen che possono avvenire a carico delle code istoniche sono diverse, ma le
principali sono queste: ace lazione, me lazione e fosforilazione. Queste modi che avvengono a carico per
lo più di amminoacidi speci ci, ovvero la lisina (ace lata o me lata) e la serina (fosforilata). Un’ace lazione
della lisina o una fosforilazione della serina vanno a ridurre la carica posi va globale di una proteina,
mentre una me lazione di una lisina man ene la carica posi va della proteina nel suo complesso. Ques
cambiamen di carica sono cruciali per l’interazione tra le proteine istoniche nel DNA. Nel momento in cui
avvengono queste modi cazioni, ovvero cambiando l’interazione proteina-DNA, si avrà una maggiore o
minore accessibilità al DNA.
È stato individuato una sorta di codice istonico che ha permesso di cara erizzare come per ogni diversa
modi ca possibile a livello dei diversi amminoacidi delle diverse code istoniche sia possibile prevedere se
quella modi cazione covalente induce a vazione o inibizione della trascrizione.
Le modi che meglio cara erizzate sono a
carico dell’istone H3 e H4; alcune
modi cazioni, come L’ACETILAZIONE e la
FOSFORILAZIONE dell’istone H3 inducono
a vazione trascrizionale, mentre la
METILAZIONE degli istoni, non cambiando
la carica può indurre a vazione o inibizione
trascrizionale, perché una me lazione
istonica coinvolgerà il reclutamento di altre
proteine che saranno quelle che andranno
ad indurre o inibire la trascrizione. Quindi le modi cazioni istoniche possono essere riassunte in:
• ACETILAZIONE; FOSFORILAZIONE e METILAZIONE: sono le principali, alle prime due è sempre
associata l’a vazione trascrizionale mentre l’e e o della me lazione dipenderà da quale acido
viene me lato ed in quale posizione.
PROCESSAMENTO E MATURAZIONE DELL’RNA
I messaggeri (mRNA) sono quelli che subiscono i processi maggiori; i processi di maturazione di un
messaggero comprende delle modi che che avvengono sia a carico dell’estremità della molecola (5’-3’) sia
allo splicing della molecola stessa che porterà all’eliminazione delle sequenze introniche.
Quasi la maggior parte di tu e le modi che che avvengono a carico di un RNA dopo che è stato trascri o
(modi cazioni post-trascrizionali) avvengono nel nucleo della cellula; gli enzimi che intervengono nel
processamento degli RNA sono le NUCLEASI: possiamo avere delle ENDONUCLEASI o delle ESONUCLEASI.
La maggior parte delle nucleasi vanno a tagliare a monte del gruppo fosfato andando a lasciare questo
gruppo legato al 5’ del ribosio che lo segue nella catena, ci sono anche delle nucleasi che tagliano a valle del
gruppo fosfato lasciandolo legato al ribosio precedente.
Come avviene il processamento degli RNA?
Processamento dei t-RNA
L’RNA polimerasi 3 è quella che trascrive sia gli RNA ribosiomiali 5s sia i t-RNA; esso produce dei pre-t RNA
che avranno delle sequenze introniche, che dovranno essere rimosse. Neanche nei procario i t-RNA
vengono sinte zza maturi; ma in questo caso non avviene l’eliminazione di sequenze introniche, ma
avvengono modi che a livello delle estremità del trascri o primario di t-RNA.
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 • Maturazione dei t-RNA nei procario ! abbiamo un t-RNA precursore; per farlo maturare servono
delle endonucleasi e delle esonucleasi. La prima ad intervenire è una t-RNA 3’ endonucleasi, che
e e uerà un taglio nella regione 3’ del precursore, poi interverranno diverse t-RNA esonucleasi che
andranno a rimuovere tu i nucleo di in eccesso no all’estremità 3’ dell’t-RNA maturo (N.B. che
terminerà sempre con la triple a CCA) ed in ne interverranno delle RNAsi P che andranno a fare dei
tagli al 5’.

• Maturazione dei t-RNA negli eucario ! il meccanismo è simile a quello che avviene per i
procario , ovvero interverranno sempre delle endonucleasi e delle esonucleasi, ma in questo caso
sarà anche necessaria la rimozione della sequenza intronica presente nei t-RNA eucario ci. Anche
in questo caso il primo enzima ad intervenire è un’endonucleasi 3’ che taglia a livello del nucleo de
discriminante “D”, poi interviene una RNAsi P che va a tagliare in corrispondenza del 5’ ed in ne
l’intervento di una t-RNA nucleo dil-transferasi che va ad aggiungere la triple a CCA al 3’. Se è
presente un introne questo viene rimosso da delle endonucleasi di splicing.
ACCENNO ALL’AMMINOACIDO DISCRIMINANTE
Gli enzimi responsabili della formazione del legame tra il t-RNA e gli amminoacidi sono gli amminoacil-t-
RNA sintetasi, ovvero enzimi speci ci per ogni singolo amminoacido. Ques enzimi non riconoscono il t-
RNA dall’ an codone ma lo riconoscono a livello di si di riconoscimento speci ci sul braccio acce ore
(dove andrà legato l’amminoacido) e lo faranno appunto a livello di questa base “D” discriminante, che è
quella che precede la triple a terminale CCA.
Processamento degli r-RNA
Gli RNA ribosomiali sono sinte zza so o forma di un lungo precursore all’interno del quale vi sono diverse
molecole di RNA, ed ogni molecola dev’essere tagliata in maniera precisa. Negli EUCARIOTI questo
processamento è fa o da dei piccoli RNA nucleolari che si associano con par colari proteine per formare
delle ribonucleoproteine anche de e snoRNP (small nucleolar rinbonucleoprotein). I geni che servono per
codi care gli RNA ribosomiali sono ripetu in tandem e contengono le informazioni per entrambe le
subunità 18S e 28S.
Nell’immagine possiamo vedere una stru ura dei
geni per il precursore degli RNA ribosomiali nelle
cellule di mammifero, in arancione è rappresentato
l’RNA, in arancione chiaro è la regione non trascri a
(NTS) mentre l’arancione scuro rappresenta la regione
trascri a la quale porterà alla formazione delle
subunità 18S e 28S. Le regioni 18S e 28S sono
intervallate sulla sequenza da sequenze spaziatrici,
che possono essere interne (ITS) o esterne (ETS). In
basso si può vedere la regione del promotore del
gene per l’r-RNA e si può notare la complessità data
dai diversi elemen ripe vi. Ciò che bisogna
ricordare è che i geni sono ripetu in tandem ed
hanno le informazioni per entrambe le subunità.
Come vengono processa gli r RNA che sono cara erizza da ripe zione dei geni in tandem e la presenza
delle sequenze spaziatrici?
Avviene un processo per il quale questo RNA, inizialmente formato da varie sequenze, dev’essere maturato.
Si parte quindi da un RNA 45S, che con ene le subunità 18S, 28S e 5.8S intervallate da sequenze spaziatrici,
che viene maturato formando dei tagli speci ci che porteranno man mano alla liberazione delle varie
sequenze geniche che trascriveranno per queste tre subunità. Quindi il meccanismo di processamento degli
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 RNA negli eucario è molto complesso, si
parte da un trascri o primario lungo no ad
arrivare a piccoli trascri che vanno ad
essere responsabili della sintesi delle varie
subunità ribosomiali.
MODIFICAZIONI CHIMICHE DELL’RNA
Queste modi cazioni possono avvenire a
carico sia dei t-RNA che degli r-RNA.
Come precedentemente accennato i t-RNA,
una volta matura , possono presentare nella
sequenza nucleo dica delle basi diverse
rispe o a quelle del trascri o primario;
sembrerebbe che ques nucleo di de
nucleo di insoli avrebbero un ruolo nel miglioramento della funzione dei t-RNA (i più importan sono la
DIIDROURIDINA e la PSEUDOURIDINA che sono delle modi cazioni a carico dell’URACILE). Nelle
PSEUDOURIDINE il ribosio non è più legato al carbonio in 1 ma al carbonio in 5, mentre nelle
DIIDROURIDINE abbiamo la perdita del doppio legame tra i carboni 5 e 6.
Anche gli r-RNA possono subire delle modi cazioni una volta matura , le principali sono:

1. METILAZIONE A LIVELLO DELL’OSSIGENO IN POSIZIONE 2 DEL RIBOSIO ! 2O me lazione

2. PSEUDOURIDILAZIONE ! il ribosio è legato in posizione 5 dell’uracile invece di essere in posizione 1

Si pensa che queste modi cazioni post trascrizionali servano ad aumentare l’a vità dell’r-RNA dopo essere
stato maturato. Queste modi cazioni avvengono ad opera di proteine speci che che si legano a dei piccoli
RNA nucleolari ovvero le snoRNP:

➢snoRNA C/D responsabili della me lazione e

che contengono delle sequenze consenso Box C’-
Box D’ che gli perme ono di riconoscere gli RNA
bersaglio per andarli a me lare

➢snoRNA H/ACA responsabili dell’uridilazione le

quali contengono delle sequenze consenso Box H-
Box ACA che riconoscono gli RNA bersaglio per
andarli a pseudouridinare.
N.B. gli snoRNA non agiscono mai da soli ma sono sempre associa a par colari proteine per formare delle
snoRNP.
MATURAZIONE E MODIFICAZIONI DEGLI m-RNA
Le prime modi cazioni ad avvenire sono quelle a
carico delle estremità ovvero a livello del 5’ e del 3’
alle quali viene apposto un “cappuccio” ed una coda
di poliadenine.
Il “cappuccio” è l’aggiunta al 5’ di una base
modi cata, la 7-me lguanosina, che sarà legata
all’estremità del messaggero con un legame 5’-5’ (al
5’ dell’m-RNA viene legata una 7-me lguanosisa con il
ribosio legato in posizione 5). Il cappuccio può essere
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 mono-me lato (più frequente) ma è possibile anche una tri-me lazione, ovvero il gruppo amminico della
base azotata può ospitare altri due gruppi me lici.
Questo po di capping al 5’ è quello che viene
de nito il CAP 0, ma è possibile che ci siano altri
pi di capping, ovvero quelli che vedete
nell’immagine, de ni come CAP-1 e CAP-2, in cui
viene me lata in posizione 2’, quindi a livello
dell’ossigeno in 2 del nostro RNA (CAP-1). Ci può
essere anche una me lazione sulla penul ma
base, sempre a livello dell’ossigeno in 2 del
ribosio, e si ha il CAP-2. Il CAP-0 è in assoluto il più
presente, ma possono essere presen altri pi di
cappuccio: l’obie vo del capping è quello di
protezione delle estremità 5’ del messaggero
neosinte zzato.
Quali sono gli even che portano alla formazione del capping?
Una serie di enzimi che devono lavorare sul precursore per far sì
che avvenga la me lazione; il primo enzima che agisce è una
RNA trifosfatasi, che va a rimuovere un gruppo fosfato
dall’estremità 5’. Poi interverrà una guanilil-transferasi che
aggiunge un GMP u lizzando come substrato un GTP (guanina
trifosfato) al 5’ e si forma il legame trifosfato-5’-5’; quindi
bisognerà che avvenga la me lazione di questa guanina e ci sarà
la me l-transferasi che aggiungerà un gruppo me lico in
posizione 7 e u lizzerà come substrato la S-adenosil-me onina,
che è il principale gruppo di donatori di gruppi me lici a livello
delle cellule eucario che (ADO-MET). Questa me lazione
avviene a livello della guanina in posizione 7 in CAP-0, ma
abbiamo de o che questa me lazione può avvenire anche a
carico dell’ul mo ribosio in posizione 2 o anche del penul mo
(nel caso di CAP-2). Quindi più gruppi me lici possono essere
inseri .

BIOLOGIA MOLECOLARE 28/04

Aggiunta del cap all’estremità 5’ degli mRna eucario ci:

Il cappuccio è l’aggiunta di una guanosina me lata in posizione 7 al 5’ con un legame insolito➞ 5’-5’ quindi
due Carboni in posizione 5 dello zucchero che si legano tra di loro con presenza della G me lata.
Tre possibili cappucci:
● Cap 0;
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 ● Cap 1, nel quale viene me lata nella penul ma
base l’ossigeno in posizione 2 del ribosio. Può
essere me lata anche l’adenina se si trova come
prima base in posizione 6;
● Cap 2, viene me lato sempre l’ossidrile del
ribosio in posizione 2 della terzul ma base
(sempre considerando come prima base la 7-
me lguanosina e poi la base al 5’ e via
dicendo).

Sequenza degli even nel processo di capping:

Abbiamo visto quali
sono gli enzimi
importan a nché il
processo di capping avvenga.
Prima una trifosfatasi che deve rimuovere un gruppo fosfato; una guanilil
transferasi che aggiungerà un GMP al 5’ facendo in modo che questo
legame sia di po 5’-5’; e le me ltransferasi che aggiungeranno i gruppi
me lici, il primo gruppo a livello della pozione 7 della guanina che è stata
appena inserita ed eventualmente possono essere aggiun altri gruppi
me lici sulle basi adiacen , il substrato sarà sempre la S-
adenosilme onina (AdoMet).

Ruolo della fosforilazione della coda CTD dell’rna polimerasi II nel capping:
La fosforilazione a livello di speci ci residui amminoacidici della coda CTD della polimerasi II è importante
anche nel capping, così come sarà importante per lo splicing e altri
processi ➞ richiama quei fa ori necessari per il capping, per lo splicing e
anche fa ori che servono a nché possa avvenire la poliadenilazione, gli
enzimi responsabili di queste fosforilazioni sono le chinasi. Una
polimerasi II quindi viene fosforilata a livello di diversi residui
amminoacidici della coda, ciò perme erà un e cace processamento del
messaggero che sta venendo trascri o. Quando il processo è terminato
alcune fosfatasi rimuoveranno i gruppi fosfato presen sulla coda CTD e
perme eranno alla polimerasi di essere di nuovo disponibile per poter
maturare un nuovo messaggero.

Lo stato di fosforilazione di una coda CTD cambia a mano a mano che la trascrizione prosegue.
In basso si vedono i codici degli amminoacidi presen sulla coda CTD; quando l'enzima si distacca dal
promotore avviene la fosforilazione sui primi residui amminoacidici, il primo residuo amminoacidico
fosforilato è una serina in posizione 5 e questo perme erà il reclutamento di tu quei fa ori che sono
necessari a formare il cappuccio ➞ vengono fosforila quei residui che richiameranno gli enzimi che
servono per far sì che avvenga il capping.
Durante l'allungamento la polimerasi si muove e il messaggero inizia a essere trascri o, vengono fosforila
altri residui amminoacidici, per prima la serina in posizione 2, ciò porterà a reclutamento di fa ori necessari
a nché avvenga lo splicing e così via.
Questa è dimostrazione del fa o che lo stato di fosforilazione cambia ogni volta che la trascrizione va avan .
La coda CTD è importante in tu e le fasi della trascrizione.
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 Funzioni del cap:
Perché è necessario avere un cappuccio a 5'?
- Protegge l'mRna dalla degradazione➞da tu quegli enzimi esonucleasi che possono andare a
degradare il messaggero (il cappuccio protegge il messaggero);
- Aumenta l'e cienza della traduzione➞ perché il reclutamento del ribosoma sul messaggero
richiede il legame a cap da parte di un fa ore d'inizio della traduzione, quindi anche per questo
mo vo è importante il cappuccio;
- Facilita il trasporto dell'mRna dal nucleo al citoplasma;
- Contribuisce ad aumentare l'e cienza del processo di splicing.

Processo di poliadenilazione:
Un altro meccanismo chiave nella maturazione dell'mRna è la poliadenilazione. Quando la polimerasi si
trova in prossimità della ne del gene trascrive un segnale di poliadenilazione e ciò porterà di nuovo
l'intervento del ruolo chiave della coda CTD che dovrà reclutare su di essa, in seguito a fosforilazione di
residui amminoacidici speci ci, dei fa ori proteici.

I fa ori proteici sono:

1. CPSF (Cleavage and polyadenyla on speci city factor=fa ore di speci cità di scissione e
poliadenilazione)
2. CstF (Cleavage s mula on factor= fa ore di s molazione del taglio o scissione).
Ques due fa ori proteici principali sono i responsabili della poliadenilazione e reclutano altre proteine che
taglieranno l'rna e aggiungeranno la coda di poli A.
Nell'immagine si nota dove avviene il taglio che ci sarà solo se sono
presen sulla sequenza di messaggero dei segnali di
poliadenilazione➞ es. sequenza AAUAAA che si trova tra i 5 e i 30
nucleo di a monte del sito di taglio; es. sequenza ricca di basi G U a
valle del sito di taglio. Quando verranno trascri e queste sequenze
sarà un segnale e indicherà che il messaggero deve essere maturato
e poliadenilato.

(immagine) in alto i due fa ori proteici recluta sulla CTD, in seguito

a fosforilazione di residui amminoacidici speci ci, viene tagliato
l'mRna e viene reclutata una proteina che serve per far sì che
avvenga la formazione della coda di poli A ovvero una poli A polymerase, il quale è l'enzima responsabile di
sinte zzare la coda di poli A in arancione; viene reclutata un'altra proteina che serve per legare la coda di
poli A nascente ovvero la poli A binding protein e si aggiunge questa lunga sequenza di A alla ne del
trascri o.

Il fa ore CPSF riconosce la sequenza AAUAAA che si trova circa 30 nucleo di a monte di dove verrà
posizionata la coda di poli A; il fa ore CstF lega la regione ricca in G U a valle del sito di taglio; le
endonucleasi CF1 e CF2 inducono il taglio sul messaggero.
La poli(A) polimerasi (PAP) aggiunge i residui di A e sinte zza la coda di poli(A), una volta aggiun i primi
residui verranno associate le poli A binding protein, in viole o, che legano la coda nascente e in seguito la
poli A polimerasi aggiungerà altre adenina no ad avere una coda lunga circa 200 nucleo di.

Funzioni del POLY A:

La coda di poli A serve sia per riuscire ad aumentare la vita media dei messaggeri sia ad aumentarne la
traducibilità.
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 È stato visto in alcuni esperimen svol su ooci di rana in cui mancava la coda di poli A che l'rna risultava
traducibile per un tempo inferiore rispe o a quando fosse presente➞ l'rna ha una vita media più lunga
quando è presente la coda di poli A come protezione.
Si lega agli mRna durante la traduzione una proteina, pallini verdi nell’immagine che coprono la proteina che
lega il poli A; da alcuni studi si è notato che il legame di questa
proteina sembra aumentare l'e cienza con cui viene trado o il
messaggero➞ probabilmente perché ci sarà una miglior capacità
di reclutamento di tu o il meccanismo traduzionale sul
messaggero.

Come sfru are in laboratorio

la presenza della coda di poli A:
Separare gli mRna dal resto di una popolazione composto da un mix di
RNA (RNA totale). Sappiamo che per la maggior parte abbiamo gli RNA
ribosomiali che mancano della coda di poli A, mentre i messaggeri hanno
la coda di poli A. Possiamo frazionare su delle colonnine di sefarosio, in
cui sono presen oligo(dT), tu gli RNA che hanno la coda di poli A in
modo tale che si leghino alla colonna sfru ando la presenza degli
oligo(dt). Gli oligo(dt) legano la colonna e quindi possiamo far passare
all’interno di essa l'rna totale e far uire l'rna ribosomiale a raverso e
lasciar legato l'oligodt e separare in un secondo momento tu i nostri
RNA messaggeri. Quindi a livello di laboratorio sfru amo la coda di poli A
per riuscire a separate gli RNA messaggeri da tu o il resto.

(ripetuto) è una colonnina nella quale sono a accate delle oligo(dt). Le T

legano le A e tu e le molecole che non possiedono una coda di poli A, che quindi può riconoscere delle
sequenze ricche di T, uirà a raverso la colonna e tu o il resto rimane a accato ad essa e quindi sappiamo
che tu o ciò che è rimasto a accato è tu o ciò che con ene una catena di poli A, quindi gli mRna. In
seguito tramite tecniche estra ve li separeremo da quel materiale (con l’u lizzo di tamponi che
perme ono la diluizione) tu o ciò che è rimasto a accato agli oligo(dt) facendoli uire e recuperando tu i
messaggeri. In questo modo nel primo passaggio si sono persi tu gli RNA ribosomiali che non hanno la
coda di poli A.

La percentuale più ricca degli RNA a livello cellulare è quella ribosomiale, gli RNA messaggeri sono molto
meno ma hanno un ruolo chiave.

ESERCIZI:
1) Quale meccanismo di processamento del messaggero è importante per l'inizio della traduzione? Per
l'inizio della traduzione è importante la posizione del cappuccio in 5' (7-methylguanosine cap)
perché perme e che vengano associa quei fa ori d'inizio della traduzione grazie al riconoscimento
del cappuccio.
2) Quale di ques step aumenta la stabilità dei trascri primari di rna ribosomiali? Me lazione.

LO SPLICING DELL'RNA (processamento dei messaggeri)

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 Lo splicing è un altro meccanismo fondamentale. La
scoperta di questo meccanismo ci fu nel 1993 da
parte di due ricercatori: John Robert e Philip Sharp,
i quali presero il nobel.
Essi lavoravano in maniera indipendente su questo
po di meccanismo ed entrambi compresero che
alcune informazioni sono eliminate da un RNA
prima che questo venga trado o in una proteina.
Hanno confrontato un messaggero nucleare e uno
citoplasma co e trovarono di erenze legate a delle sequenze che venivano eliminate, gli introni; mentre le
porzioni combinate insieme e che saranno importan per formare le sequenze amminoacidiche delle
proteine sono, invece, gli esoni.

Stru ura del gene dihydrofolate reductase (dhfr) :

Nell'immagine si vede la stru ura di un gene della Diidrofolato
redu asi (enzima importante nella via dei fola ). Sono presen ,
introni ed esoni, in criceto, topo e uomo e ci sono 6 esoni che danno in
tu gli organismi un mrna con una lunghezza più o meno analoga.
Si parte da un totale di circa trentunomila basi, una volta maturato
porta alla formazione di un messaggero di circa seimila basi➞ nel
momento in cui eliminiamo gli introni abbiamo un prodo o molto più
corto.

4 pi di esoni in funzione della posizione:

Gli esoni si possono dividere anche in base alla funzione e a dove si
trovano.

4 pi di esoni in funzione dello splicing:

Possiamo vedere anche quali sono i possibili prodo che si
possono o enere dallo splicing di un gene.

Cara eris che degli

introni:
Le cara eris che
generali che possiamo
de nire considerando le sequenze introniche. I geni si dicono
"spacca " perché possiamo avere sequenze introniche e esoniche.
Gli introni hanno la stessa stru ura in tu i tessu e inoltre nelle
sequenze introniche possiamo avere tu i codoni di stop e tu i
diversi modelli di le ura possibili. Nell'immagine è riportata la
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 grandezza in percentuale degli introni presen in una cellula eucario ca, tendenzialmente la lunghezza
media varia tra i 200 e i 2.000. Esoni molto lunghi sono più rari.

Tipi di splicing:
1. Splicing nucleare, di maggiore interesse;
2. Splicing di introni di po I, sono sta scoper nei geni di rna ribosomiale di ba eri ed è stato visto
essere presente in alcuni geni, sempre di rRna, dei cloroplas e anche a livello di geni mitocondriali.
3. Splicing di introni di po II, sono meno di usi e sono sta vis in alcuni geni mitocondriali del
lievito.
4. Splicing dei tRna di lievito.

In seguito allo splicing l'mRna, a cui

sono state rimosse le sequenze introniche e legate tra loro quelle esoniche, sarà pronto per essere
esportato a livello citoplasma co dove verrà trado o.

Splicing nucleare:
L'rna a livello nucleare ha dimensioni decisamente più grandi
rispe o a quelle di un messaggero che sarà nella sua forma
matura, poiché si parla di un RNA legato a delle proteine
ovvero di una par cella ribonucleoproteica➞ hnRNP
(Heterogeneous ribonucleoprotein par cle=proteine
ribonucleari eterogenee). Sono dei complessi di rna e
proteine che si trovano a livello del nucleo cellulare; la
presenza di proteine legate a una molecola di un trascri o
non ancora maturo di rna messaggero servono da segnali per
iden carne lo stato di maturazione e non essere esportato
nel citoplasma. Le proteine rimangono legate
agli introni dopo che si è veri cato lo splicing, quindi
verranno degradate e non saranno associate alle sequenze
esoniche.

Ai con ni introne-esone si trovano brevi sequenze consenso:

Come riusciamo a de nire un introne? Nell'immagine
vediamo in viola l'esone, poi in rosa una sequenza intronica e
un altro esone. All'estremità della sequenza intronica
abbiamo delle brevi sequenze consenso che sono al 5'
dell'introne basi G U e al 3' le basi A G➞ le sequenze
consenso sono quelle sequenze che sono più rappresentate
in quella determinata posizione in un genoma, in questo caso
in un messaggero. Vediamo che, appunto, al 5' dell'introne
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 abbiamo sempre (perché il 100 indica la percentuale) G U, mentre alla ne abbiamo A G sempre. Si chiama
regola GU-AG.
È stato comunque dimostrato che potrebbe non esserci questa sequenza GU-AG (anche se c'è scri o il
100%), ma al 90% dei casi non ci possiamo sbagliare nell'iden care un introne sulla base della presenza di
queste due brevi sequenze consenso.

Come vengono iden cate e unite le giunzioni di splicing?:

In alto, con un splicing corre o va a rimuovere la sequenza di un
messaggero non ancora maturo; in rosso i tre introni che vengono
rimossi mediante il riconoscimento delle giunzioni. Se venissero
appaia in modo sbagliato verrebbero rimossi degli esoni. Queste
situazioni possono avvenire e sono alla base dello splicing
alterna vo, ci sono delle isoforme che non prevedono la presenza di
alcune sequenze, invece possono prevedere la presenza di alcune
sequenze esoniche perché qualunque sito di splicing al 5' può essere
unito a un sito di splicing al 3', quindi il sito G U può riconoscere il
sito A G.

Come vengono riconosciu i si di splicing?:

Tu i si sono uguali, ma allo splicing seguono delle regole che perme ono che il sito 5' è sempre collegato
a un sito 3' che viene dopo nel trascri o. Può avvenire che un sito venga saltato, ma sicuramente un sito al
5' di un introne che si trova a valle non riconosce un sito al 3' di un introne che si trova a monte. È sempre
collegato al sito che viene dopo nell'rna, tendenzialmente il sito che viene immediatamente dopo, ma
potrebbe essere un sito che è presente più a valle e quindi ciò indurrebbe la formazione di uno splicing
alterna vo e la possibilità che vengano salta degli esoni dal trascri o nale e porta per eessere rimossi
insieme a un introne.

Gli introni sono rimossi in un ordine preciso? :

Considerando che un gene può avere più introni ed esoni, gli introni vengono rimossi in un ordine preciso?
Teoricamente ogni sito può reagire con qualsiasi sito di splicing al 3', ma è stato eseguito un esperimento
chiamato RNA BLOTTING➞ viene fa o migrare dell'rna su gel di agarosio, poi trasferito su delle lastre
speci che autoradiogra che che perme ono la localizzazione di un segnale, possibile perché delle sonde
sono state taggate con marcatori radioa vi che consentono di de nire determinate sequenze e di
visualizzare bande che indicano dei precursori di messaggeri. Quando è stato fa o ciò su un RNA nucleare si
è visto che vengono prodo e delle bande si questo po:
● Banda grande, indica la grandezza totale del gene ed è una banda di circa 5,5kb➞ il trascri o
primario o messaggero ha sia esoni che introni;
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 e poi una serie di bande che sono iden cate per quel
par colare gene sempre nello stesso modo (siamo già
a conoscenza della grandezza, sono esperimen svolto
su geni di cui conosciamo la sequenza):
● Una banda che fa vedere la mancanza di
introni 5 e 6;
● Una banda in cui il messaggero è privo di
introni 4,5,6 e 7;
● Una banda che con ene solo l'introne 3;
● Un messaggero senza introni.
La possibilità di riuscire a osservare una situazione di
questo po, ovvero delle bande chiare che hanno
quella dimensione e perme ono di iden care qual è
la sequenza e cosa manca in essa, ci fa comprendere che esiste una via preferita di rimozione degli introni
durante il meccanismo di splicing➞ vengono rimossi, in questa via preferenziale per questo gene, perché
ogni volta che viene rimosso un introne cambia la conformazione dell'rna e ogni volta diventano accessibili
nuovi si di splicing.
Se i 7 introni, in questo caso di questo gene, fossero rimossi in ordine del tu o casuale ci sarebbero diverse
combinazioni possibili di introni e non riusciremo a vedere delle bande ben de nite (come invece avviene
con l'esperimento).

Altre cara eris che di un introne:

Oltre alla sequenza consenso GU-AG ci sono anche altre sequenze importan in un introne.
All'interno dell'introne è presente una A ovvero il sito di rami cazione. Possiamo de nire il sito donatore di
splicing e il sito acce ore di splicing: il primo, è quello che inizia con la sequenza G U e ha una regione
consenso AAGU e dalle percentuali si nota che questa sequenza può variare, non è alta come quella
all'estremità; nel secondo con gue alla A e alla G che fanno terminare il nostro introne, abbiamo una
sequenza di un Py tract che indica un segmento di polipirimidine, quindi una serie di pirimidine prima che
l'introne si concluda con i nucleo di A G.

Meccanismo dello splicing:

Le snRNP (small nuclear ribonucleoproteins)
interagiscono con le sequenze introniche e sono
cos tuite da proteine con associa snRNA (small
nuclear RNA) che hanno il ruolo di riconoscere la
sequenza intronica e perme ere che avvenga il
processamento del messaggero in un trascri o, grazie
all'intervento di una serie di proteine che porteranno
allo spliceosoma e alla rimozione dell'introne.
(nell'immagine so o forma di cappio).

Il complesso che si crea in maniera sequenziale sul

messaggero precursore è formato da una serie di snRNP
che cos tuiscono lo spliceosoma.
Lo spliceosoma è un grande complesso enzima co di proteine e piccoli rna nucleari ➞ small nuclear RNAs
(snRNA), small cytoplasmic RNAs (scRNA). Quelli a livello nucleare sono chiave nel processo di splicing e
formano insieme alle proteine snRNP lo spliceosoma.
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 La formazione dello spliceosoma avviene a raverso una serie di COMPLESSI diversi:
- Complesso E➞ early presplicing. È il primo complesso che si forma. A nché si formi questo
complesso è necessario l'intervento di alcune snRNP: U1, si
lega al sito di splicing al 5' per complementarietà delle basi
tra il suo snRNA e la sequenza intronica; U2AF2(o anche
U2AF65), conta a il tra o di polipirimidine (Py tract) che si
trova a livello del sito 3' acce ore; BBP (branch-point
binding protein), la proteina con il suo rna lega il sito di
rami cazione. Tu i si importan perché avvenga lo
splicing vengono riconosciu subito, nella fase iniziale
durante la formazione del complesso E. In seguito, si forma
il complesso A.
- Complesso A, qui l'snRNP U2 si sos tuisce alla proteina
BBP che legava il sito di rami cazione. Quando si appaia
l'rna di U2 all'introne del messaggero spinge fuori la A dal
sito di rami cazione e la rende disponibile per l'a acco.
Esposizione della A nel sito di rami cazione e in seguito si
forma il complesso B.
- Complesso B, riarrangiamento dell'rna causato da altre tre
snRNP: U4, U5, U6. U2AF65 viene rimossa, con l'aggiunta
di questa snRNP(nell'immagine U4,5,6) avviene un
avvicinamento nei si di splicing e quindi viene accorciata
la distanza. Oltre
ad andare persa U2AF65 viene rimossa anche U1, ovvero la
prima snRNP che si legava al 5' della sequenza intronica,
sos tuita da U6 che non ha però una complementarietà
perfe a con l'introne. Grazie all'intervento di queste tre
proteine snRNP, al 5' si ha un avvicinamento al sito di
rami cazione. Quindi si forma il complesso C.
-Complesso C, U4
viene rilasciato. Dal
momento in cui U4
viene rilasciato, U2 e U6 sono vicine e interagiscono tra loro
per accoppiamento dei loro rna. Questa conformazione che
porta all'appaiamento di U2 e U6 è la chiave che produrrà il
sito a vo o centro catali co composto per lo più da RNA.
Una volta avvenuto il complesso C si avranno delle reazioni
per le quali si riuscirà a formare il cappio con l'introne che
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 verrà rimosso insieme ai fa ori di splicing ad esso associa .

Formazione del centro catali co:

A destra il rilascio di U4, in viola e grigio gli RNA
accoppia delle snRNP U4 e U6. Il cambiamento
conformazionale di U6 porta all appaiamento per
complementarietà con U2, quest'ul mo però era già in
parte appaiato con il sito di rami cazione. Si è visto che
questo appaiamento tra U6 e U2 andrà a formare il
centro catali co necessario a nché avvengano le
reazioni di transesteri cazione➞ reazioni che avvengono
solo quando c'è l'appaiamento tra snRNA di queste due
snRNP U2 e U6.

Un'altra snRNP importante è U5 rimasta ancora legata. È

importante perché conta a in modo speci co i si di splicing. Tu e le snRNP sono importan interazioni:
speci che a livello dei loro rna, tra di loro o con il trascri o primario e per il processamento.
Avviene il taglio al 3' e la rimozione dell'introne.

Principali snRNA, interazioni RNA-RNA e RNA-proteina fondamentali per il funzionamento dello spliceosoma:

Ciclo dello spliceosoma:

Nell'assemblaggio di tu o questo macchinario complesso vediamo che si può riportare so o forma di ciclo,
infa si parla proprio di ciclo dello spliceosoma➞ come si assembla su un trascri o le varie snRNP che
formeranno un ciclo, nel momento in cui avranno nito il loro lavoro su un trascri o primario e verranno
rilasciate potranno di nuovo essere u lizzate per andare a taggare un nuovo messaggero da modi care che
dovrà essere processato.

LO SPLICING DEL PRE-MRNA PROCEDE ATTRAVERSO UN CAPPIO: si forma un centro catali co. Quali sono le
reazioni importan che e e vamente consentono che venga rimosso di volta in volta il nostro introne? Le
reazioni chiave sono 2: due reazioni di transesteri cazione, che si possono veri care a livello del centro
catali co quando si ha l’interazione tra U2 e U6 e anche U5 che conta a i si di splicing.
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 Questo avviene tramite l’a acco nucleo lo
dell’ossidrile in posizione 2 della A, che si trova a
livello del sito di rami cazione (nella sequenza
intronica quindi).
BPS (Brunch point sequence) è la sequenza consenso
che si trova in prossimità del sito di inizio delle prime
reazioni di transesteri cazione, quindi della A.
Sequenza: YNCURAY…. dove Y sta per una pirimidina,
R indica una purina, N può essere uno qualsiasi dei 4
nucleo di.
In sintesi, esiste una sequenza, più o meno consenso,
il cui ruolo chiave è quello della A che serve per far sì
che con il gruppo ossidrilico in posizione 2 si abbia
l’a acco nucleo lo e avvenga la prima reazione di
transesteri cazione ➞ che perme e la
connessione della G al 5’ dell’introne con
l'ossidrile in posizione 2’ della A nel sito di
rami cazione. Porta alla formazione di un ossidrile
al 3’ libero in questo esone. Ciò farà in modo che
avvenga la seconda reazione di
transesteri cazione: questo ossidrile libero al 3’
del primo esone potrà andare ad a accare il
legame al 3’ del sito di splicing ➞ si ha quindi
l’unione di ques due esoni (rosso e rosa scuro),
mentre gli introni verranno rilascia so o forma
di cappio e le varie SNRNP (importan per la
formazione del sito catali co, U2, U5 e U6)
verranno rilasciate e potranno essere riu lizzate per un nuovo processo.

Quindi alla ne abbiamo i nostri 2 esoni uni tra loro e l’introne, so o

forma di cappio (de o Lariat), che dovrà essere derami cato tramite un
enzima di derami cazione che lo porterà nella sua forma lineare per poi
essere velocemente degradato da alcune ribonucleasi.

Quindi abbiamo 2 reazioni di transesteri cazione: trasferimento

coordinato che non richiede consumo di energia (L’Atp serve
nell’assemblaggio e nel funzionamento del complesso macchinario di
splicing ma non serve per queste sue reazioni).
1. a acco nucleo lo dall’OH in posizione 2 della A invariante della sequenza intronica BPS (sequenza
intronica cara erizzata da quella sequenza consenso). Tale sequenza intronica invariante nei lievi è
sempre la stessa ed è UACUAAC.
2. gruppo ossidrilico libero al 3’ dell’’esone che va ad a accare il fosfato del secondo esone (quello
seguente nella sequenza del trascri o primario).

Si parla quindi di un intermedio a tre vie del cappio: nell’immagine del cappio vediamo il gruppo ossidrilico
in posizione 2 della A legato all’estremità 5’ dell’introne mentre il gruppo ossidrilico in posizione 3 della A è
legato all’estremità 3’ dell’introne.
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 Lo splicing è connesso anche all’esportazione dell’mRna:
Ogni giunzione esone-esone presenta un complesso che si chiama EJC
(Exon-Junc on Complex) che si va ad assemblare sulle giunzioni a circa
20 bp di distanza dal punto di splicing. In un messaggero maturo
possono esserci diversi di ques complessi, a seconda del numero di
esoni che possiede quel determinato trascri o maturo. Tali complessi usciranno dal nucleo insieme al
messaggero. Sono molto importan poiché segnalano se l’mRna è maturato corre amente oppure no:
fanno in modo di de nire se il messaggero è e e vamente traducibile.
È un meccanismo di sorveglianza dell’mRna e perme e di degradare tu quei messaggeri che non sono
matura in maniera corre a.
Qui vediamo alcune delle proteine che fanno parte di questo EJC, come le proteine REF che interagiscono
con altre proteine, le TAP e le MEX, che sono importan perché vanno ad interagire dire amente con il poro
nucleare. Sono quindi proteine chiave nell’esportazione dell’rna.
Quando gli mRna arrivano nel citoplasma sono ancora lega , in corrispondenza dei pun di splicing, a ques
complessi proteici ➞ verranno rimossi solo durante il primo round di traduzione.
Quei messaggeri da cui non verranno rimossi tali complessi proteici sono quelli instabili che verranno
degrada .
Per cui lo splicing ha un ruolo chiave anche nel controllo dei messaggeri per la loro traduzione.
Questo è lo splicing NUCLEARE.

AUTOSPLICING:
Abbiamo altri due pi di splicing, de di autosplicing poiché è l’RNA stesso che guida la sua maturazione e
non è previsto l’intervento del macchinario complesso dello spliceosoma:
1. SPLICING DI INTRONI DI TIPO 2 (sono presen nei geni che codi cano per mRna, tRna, rRna dei
mitocondri e dei cloroplas di piante e funghi).
2. SLICING DI INTRONI DI TIPO 1 (sono
quelli presen nei geni degli rRna a
livello dei protozoi).

A sinistra abbiamo lo splicing nucleare

(visto no ad ora) dove vi è l’intervento del
macchinario dello spliceosoma.

Negli introni self-splicing del gruppo 2

(centrale) la chimica e tu gli intermedi di
reazione sono simili a quelli di uno splicing
nucleare: anche in questo caso si forma un introne a cappio, però non sono necessarie le varie SNRNP.
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 Negli introni self-splicing del gruppo 1 (a destra) il meccanismo è diverso poiché abbiamo un nucleoside
libero, in questo caso una G, che con il suo gruppo OH al 3’ va ad a accare il sito di splicing al 5’. La seconda
reazione invece procede normalmente: sempre il gruppo OH in 3’ del primo esone che va ad a accare il sito
al 3’ di splicing (quindi il 5’ del secondo esone). In questo caso l’introne viene rilasciato ma non so o forma
di cappio bensì in forma lineare.

Questo per far vedere come ci sia una somiglianza nella formazione del sito catali co per quanto riguarda lo
splicing nucleare e quello degli introni del gruppo 2:
il sito catali co viene formato quando si accoppiano tra di loro, nello splicing nucleare, U6 e U2 (dove U2 è
anche appaiato alla sequenza intronica).

Nello splicing del gruppo 2, che non prevede l’intervento di rna che sono parte delle SNRNP, abbiamo però
dei domini speci ci (5 e 6) dell’rna che vanno a formare un centro a vo che è molto simile a quello che si
forma per lo slicing nucleare ➞ questo perme erà di
nuovo la formazione del centro catali co e la
possibilità che la A esposta vada ad a accare il 5’
dell’introne.
Quindi l'auto-splicing del gruppo 2 non necessita di
proteine e ha un meccanismo simile a quello dello
spliceosoma, ossia è sempre l’adenosina che con il
suo OH in posizione 2 va a perme ere la liberazione
dell’OH in 3 del primo esone che così sarà
disponibile per andare ad a accare il 5’ del secondo
esone ➞ formazione della giunzione tra i due esoni
e liberazione del cappio.

Per quanto riguarda il gruppo 1: abbiamo una guanosina

libera che va ad a accare con il suo gruppo OH e perme e la
liberazione del primo esone, che quindi con il gruppo OH in
posizione 3 potrà andare a reagire con il secondo esone
(quello a valle).

In questa immagine vediamo una sequenza nucleo dica di

dna in cui in verde abbiamo le sequenze consenso dei vari introni: GT (GU dell’rna) e AG.
Questa sequenza, quindi, prevede la presenza di 4 introni (de ni da queste sequenze consenso). Se la
osserviamo nel de aglio però non sono presen
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 soltanto in queste posizioni le sequenze consenso, ma ce ne sono tan ssime. Come possono essere
riconosciute esa amente tali sequenze (e non tu e le altre)?: possibile tramite dei meccanismi che
perme ono allo splicing di essere accurato.
A nché lo splicing sia accurato, un ruolo chiave lo hanno:
- la CTD della rna polimerasi
- proteine SR che vanno a legare le sequenze ESE (Exonic splicing Enhancer). Sono proteine ricche in
serina e arginina, e si legano agli esoni nelle sequenze speci che ESE.
MECCANISMI:
1. RUOLO CHIAVE DELLA CODA CTD: abbiamo visto come la coda ctd fosforilata a livello di speci ci
residui amminoacidici è importante per il capping ma anche nello splicing. Tale coda è formata da
amminoacidi che vanno incontro a diversi gradi di fosforilazione e a seconda di cosa viene fosforilato
vengono chiamate speci che proteine (ad esempio anche tu o il macchinario necessario per lo
splicing). Ruolo nello splicing: la CTD va a legare i fa ori di splicing e aiuta l’assemblaggio di ques
fa ori sull’estremità degli esoni. Quindi la polimerasi trascrive il messaggero e recluta i fa ori di
splicing dopo aver trascri o il primo esone. Man mano che si muove trascrive il secondo esone e di
nuovo recluta i fa ori di splicing. Dunque è il movimento della polimerasi sul dna che, quando
incontra un esone, recluta i fa ori di splicing e de nisce esa amente dove dovranno andare ad
intervenire. Non lo farà casualmente, ma li recluta dopo aver trascri o determinate sequenze e lo
farà fosforilando in maniera speci ca
speci ci residui amminoacidici ➞ in
maniera da non perme ere che quei
fa ori vengano assembla in posizioni
non corre e (altrimen il
riconoscimento di sequenze
potenzialmente introniche sarebbe
possibile). La CTD lavora facendo in
modo che l’assemblaggio avvenga alle
estremità degli esoni.
2. INTERVENTO DELLE PROTEINE SR:

ricche in Ser e Arg, che legano sequenze esoniche (ESE).

Faranno in modo che vengano recluta quelle SNRNP
chiave nel processo di splicing. È un altro meccanismo che
evita l’uso di splicing non corre poiché tali proteine
verranno reclutate a livello delle sequenze esoniche ➞
perme eranno il riconoscimento delle sequenze
introniche.
In funzione dello splicing possiamo avere 4 pologie di
e s o n i ( v i s t e p r i m a ) : C O S T I T U T I V I , S P EC I F I C I ,
SOVRAPPOSTI, ALTERNATIVI.

Questo vuol dire che abbiamo la possibilità che si possa veri care il così de o SPLICING ALTERNATIVO:
ovvero la possibilità che un singolo gene codi chi isoforme mul ple di trascri .
Serve a generare una diversità funzionale, perché trascri diversi produrranno proteine diverse. Lo splicing
alterna vo avviene in quasi tu i geni dell’uomo. A volte può essere dovuto a imprecisioni, ma molto
spesso sono dei meccanismi chiaramente funzionali.
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 Tu o il macchinario di splicing si va ad assemblare, come abbiamo visto a livello di sequenze speci che, in
base ad un bilanciamento che avviene sempre tra dei fa ori che vanno a promuoverlo e fa ori che lo vanno
ad inibire. Il bilanciamento, la quan tà di ques fa ori sarà diversa a seconda del po di cellule: ci sono
cellule che hanno diversi fa ori che perme ono un po di splicing e cellule di altri tessu che possiedono
fa ori diversi che consentono un altro splicing.

Inoltre, esistono si di splicing che possono essere deboli o for ; se abbiamo esoni alterna vi vuol dire che
possono possedere si di splicing più deboli.

Nell’immagine vediamo l’a vazione di un sito

di splicing debole (grazie una proteina ESE) ➞
possibilità che si possa formare un prodo o
che vada a includere o non includere un esone.
Nel caso della repressione al sito 3’ del primo
introne, causato dal legame con alcune
proteine che vanno a silenziare quel sito,
avviene la rimozione dell’esone.

BIOLOGIA MOLECOLARE 5 MAGGIO 2021

LA PCR
La PCR ci perme e di riuscire a iden care e quan care delle sequenze speci che all’interno del genoma.
Noi manipolando il materiale genomico abbiamo due problemi: abbiamo un sacco di sequenze che non ci
interessano perché a noi serve valutare in maniera speci ca una determinata sequenza e inoltre abbiamo il
problema che se vogliamo andare a determinare una determinata sequenza la quan tà è molto piccola e
quindi abbiamo bisogno di ampli carlo.
Ricordiamo che il DNA umano è composto da circa 3,3 miliardi di coppie di basi.
Sappiamo anche che per andare a visualizzare su gel di
agarosio dopo ele roforesi (che ci perme e di far
migrare del materiale genomico) sono necessari 10 ng
di DNA. Però se noi vogliamo visualizzare una parte di
quel materiale genomico, ad esempio un frammento di
450 bp, di quanto materiale abbiamo bisogno a nchè
riusciamo a vedere una banda su gel di agarosio?
Possiamo renderci conto di questo andando a fare un
semplice calcolo conoscendo il Peso medio per ogni bp
= 650 Dalton (1 dalton = 1.66 x 10^-18 microgrammi).
Quindi il peso del nostro frammento sarà di 4.8 x 10-10 ng, quindi non riusciremo a visualizzare un
frammento così piccolo sul gel di agarosio, per cui dovremo necessariamente ampli carlo, perché per avere
10 ng di DNA potenzialmente visualizzabile dobbiamo avere N volte x il peso del nostro frammento,
dobbiamo avere 10^10 numero di copie di DNA di un frammento di 450 bp per perme erci di visualizzarlo
sul gel. Quindi per vedere un singolo gene, il DNA in un campione di 100 cellule dovrebbe essere
mol plicato 200 milioni di volte!
Per ampli care il DNA sfru amo la PCR (reazione a catena della polimerasi) che ci perme e di superare sia
il problema della speci cità sia quello della quan tà (citate all’inizio). La PCR è stata scoperta nel 1983 da
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 KARY MULLIS che nel 1993 vinse il Nobel per la chimica. Mullis studiava le mutazioni gene che che
provocano l’anemia falciforme, ma non aveva abbastanza materiale di DNA e questo era un problema, per
cui bisognava in qualche modo ampli care quel DNA ed iden cò i passaggi necessari per farlo.
Mullis ha sfru ato le proprietà della DNA polimerasi, che è un enzima che ha bisogno di un DNA
preesistente che deve essere duplicato: il DNA templato. Per farlo però deve par re da qualcosa che è già
presente, ossia i PRIMER (inneschi che sono dei frammen di RNA). La polimerasi inoltre ha bisogno del
Mg++ come cofa ore, e lavora meglio in determinate condizioni di temperatura, pH e concentrazione
salina.
I lamen di DNA sono an paralleli e la polimerasi si muove sempre in una direzione (da 5’ a 3’). La DNA
polimerasi lavora incorporando sui primer i diversi nucleo di perme endo alla catena di crescere
(incorporazione che segue sempre la regola dell’appaiamento delle basi). Tu e queste cara eris che della
polimerasi sono state sfru ate da Mullis per fare una reazione di PCR, dove vengono inseri in un tubo di
reazione non solo il DNA che deve essere ampli cato, ma anche gli inneschi, i nucleo di e la DNA
polimerasi (il tu o a una determinata condizione di temperatura, pH e concentrazione saline o mali per
l’enzima).
Restava da capire quale enzima u lizzare per questa reazione, poiché doveva essere u lizzato un enzima
resistente a sbalzi di temperatura! TAQ POLIMERASE (che deriva da Thermus aqau cus) perché è una DNA
polimerasi stabile al calore ed ha una temperatura ideale di 72°C.
Per fare una PCR abbiamo bisogno di un termociclatore e abbiamo bisogno che si veri chino 3 passaggi:
- DENATURAZIONE del doppio lamento
- ANNEALING, appaiamento dei primer sul DNA a singolo lamento
- ESTENSIONE, ovvero la sintesi dei nuovi lamen .
DENATURAZIONE = il calore separa il DNA (si rompono i legami H tra le basi e il doppio
lamento si denatura). Riabbassando la temperatura si ha invece una rinaturazione
ANNEALING = abbassando la temperatura, i primer (disegna in modo tale da essere
complementari alla sequenza che ci interessa
ampli care sul nostro DNA) si appaiano al DNA
denaturato. Ques primer sono in eccesso nel tubo di reazione per
far sì che siano loro a legarsi al DNA separato prima che il DNA si
riappaia con sé stesso
ESTENSIONE = duplicazione del DNA ad una temperatura di 72°C
(o male per l’enzima)
Quindi in un mix di reazione in una PCR dobbiamo avere:
- DNA
- Nucleo di difosfato
- Tampone, per mantenere stabile il pH e la concentrazione salina
- Cloruro di magnesio
- Inneschi (forward e reverse)
- Enzima
- Acqua no a volume
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 APPLICAZIONI DELLA PCR
Medicina forense =La capacità della PCR di ampli care anche la più piccola quan tà di DNA dai campioni
raccol in una scena del crimine conferisce al metodo una grande forza quando viene u lizzato in ambito
forense. Il DNA del uido corporeo, dei capelli o di altri campioni di tessuto viene ampli cato per creare un
modello quasi unico per ciascun individuo. Il caso di OJ Simpson fu il primo in cui la tecnica del PCR divenne
ampiamente pubblicizzata.
OGM = Gene cally-modi ed foods (GMO foods) sono ampiamente col va negli Sta Uni e in altri paesi.
Per vari mo vi, alcuni paesi richiedono agli esportatori di indicare la percentuale di contenuto di OGM nelle
spedizioni di cereali e alimen . La PCR può essere u lizzata per misurare con precisione la quan tà esa a di
cibo gene camente modi cato in una spedizione!
Test di paternità = Ampli cando speci ci frammen di DNA da genitori o paren stre , è possibile
ricostruire la relazione tra individui. La PCR non solo può iden care le relazioni tra le persone oggi, ma può
anche essere usata per iden care relazioni familiari storiche!
Archeologia = Ricostruzione delle pergamene del Mar Morto. Iden cazione dei pigmen di pi ura nelle
pi ure rupestri. Determinazione della parentela tra individui negli an chi ossari.
Diagnosi di mala e = La PCR è ora ines mabile nella moderna diagnosi della mala a. La PCR può
iden care gli organismi che causano mala e molto prima di altri metodi, dal momento che cerca il DNA
dell'organismo stesso, non le sue proteine o il suo e e o sul nostro sistema immunitario. La PCR è stata
persino u lizzata per diagnos care mala e del passato, ampli cando quan tà minime di DNA correlato alla
mala a in campioni conserva .
Tra amento delle mala e = La PCR può essere u lizzata non solo nella diagnosi della mala a, ma anche
come aiuto nel tra amento delle mala e.
Conservazione = Poiché la PCR può essere u lizzata per iden care non solo gli individui, ma anche per
di erenziare le specie, è spesso u lizzata nella ricerca sulla conservazione della fauna selva ca. La PCR può
essere u lizzata per monitorare il commercio di prodo a base di specie in via di es nzione. La PCR può
essere u lizzata per monitorare gli ecosistemi per la presenza di determinate specie. La PCR può essere
u lizzata anche per monitorare e iden care i singoli animali
Quello che facciamo noi nei laboratori è l’u lizzo della PCR per la ricerca di base, ovvero prendiamo
materiale gene co da campione sperimentali e li ampli chiamo per andare a vedere quali geni sono
coinvol nello sviluppo di un feno po.
Per quanto riguarda il procedimento, noi abbiamo tu gli ingredien e li andremo a me ere all’interno di
una prove a di reazione.
Me eremo tu o all’interno del termociclatore, che ci perme e di regolare la temperatura, andando da
temperature più alte a quelle più basse e viceversa.
• Il primo step è quello di DENATURAZIONE, in cui si avrà l’apertura del doppio lamento di DNA;
• poi si avrà l’ANNEALING, in cui la temperatura si abbassa tra i 45° e i 60° (la temperatura dipenderà
da che po di innesco u lizziamo) e i primer vanno a riconoscere le loro posizioni precise sul DNA
aperto;
• L’ESTENSIONE, in cui l’enzima si lega all’innesco più il templato e i vari nucleo di possono essere
aggiun .
Dopo circa un minuto che abbiamo permesso alla polimerasi di lavorare su quel frammento di DNA con il
suo innesco, iniziamo da capo, ovvero di nuovo verrà denaturato il DNA, si riaprirà il doppio lamento di
DNA, gli inneschi andranno a riappaiarsi sul DNA a singolo lamento scendendo alla temperatura di
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 annealing, e di nuovo portando ad una temperatura idonea a far sì che
la polimerasi possa lavorare (72°), quest’ul ma si lega ed i nucleo di
vengono aggiun . Il processo andrà a termine dopo un minuto e si
ricomincia da capo: denaturazione, apertura del doppio lamento,
annealing e in ne estensione.
Questo viene fa o per un certo numero di cicli, che sarà intorno ai
35-40 massimo. Ad ogni ciclo il numero di molecole bersaglio proprie
del DNA raddoppierà (primo ciclo due copie, secondo ciclo qua ro
copie, terzo ciclo o o copie, quarto ciclo sedici copie, e via dicendo) !
RADDOPPIA AD OGNI CICLO.
Il problema degli enzimi può essere quello che possono comme ere errori: in questa slide si vede il ra ng
di errore di alcune delle principali polimerasi u lizzate (dobbiamo sempre ricordare che la polimerasi può
comme ere degli errori).
La Taq Polimerasi rimane quella più u lizzata:

➢ ha un tempo di emivita > 40 minu a 95°

➢ Massima a vità speci ca a circa 70°
➢ Estensione dei primer alla quan tà di 100 basi/secondo
➢ Error rate è 2 x 10-5 errori per nt per ciclo
Poiché la polimerasi lavora ad un suo tempo di emivita, dobbiamo considerare che dopo un po’ la polimerasi
non sarà più e ciente come prima, quindi andare oltre un certo numero di cicli non porterà
all’ampli cazione del materiale gene co (dopo 30-40 cicli la reazione raggiunge uno stadio stazionario).
ESERCIZIO
Per capire quanto una polimerasi sbaglia (tasso di errore di un
enzima), lo possiamo calcolare facilmente dal ra ng di errore di
una determinata polimerasi: ci rendiamo conto che andando ad
eseguire una PCR il risultato che si o ene non è perfe o, e ciò è
dovuto al po di enzima che s amo u lizzando e al suo po di
ra ng di errore.

Queste sono le altre due polimerasi viste prima ! Pfu

e Vent, che hanno un tasso di errore più basso perché
hanno l’a vità esonucleasica, cioè di proofreading,
cosa che non ha la Taq Polimerasi. Sono preferibili
rispe o alla Taq per far sì che nel nostro prodo o di
reazione il DNA abbia meno errori (varie
considerazioni sui cos degli enzimi, quindi molte volte
è acce abile avere un ra ng di errore di un certo po
in base al po di materiale che si sta manipolando).
Nella PCR, sulla base del fa o che l’enzima ha
un’emivita (prima o poi sme e di lavorare in modo
e ciente), (in questo gra co abbiamo sulle ascisse
il numero di cicli e sulle ordinate la quan tà di DNA
in forma logaritmica) si arriva ad un punto in cui,
pur aumentando il numero di cicli, la quan tà di
DNA prodo a non aumenta in maniera né
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 esponenziale né lineare, perché raggiunge questo e e o PLATEAU, in cui la polimerasi non lavora più bene
e ci sono altri fa ori (a mano a mano che por amo sempre più prodo o all’interno di una reazione, i primer
potrebbero andare in compe zione con i prodo dei cicli preceden ; inoltre a mano a mano che
aumen amo quan tà di prodo o cambia anche il rapporto molare tra le concentrazione della polimerasi e
del DNA che viene prodo o; vengono inoltre accumula prodo “di scarto”, i PIROFOSFATI, perché ogni
volta che aggiungiamo un nucleo de viene liberato un pirofosfato, che è un inibitore dell’enzima. Inoltre,
aumentando anche il materiale, diminuisce la concentrazione dei componen messi all’inizio). Quindi
nell’immagine si vede che quando si fa una PCR di po classico, dopo 35-40 cicli si raggiunge un punto de o
“LAG POINT” e si va a vedere il prodo o, si va ad analizzare su gel di Agarosio per vedere se quel
determinato prodo o si è formato, si puri ca e via dicendo.
Se abbiamo bisogno di valutare in maniera QUANTITATIVA (quanto DNA è presente in un determinato
campione in un determinato momento), si lavora nella fase esponenziale di crescita della curva (quando i
cicli sono molto meno).
In quel caso u lizziamo tecniche che sono varian della PCR, e la prima principale variante è la REAL TIME
PCR: ci perme e di valutare in tempo reale la produzione di un prodo o di PCR.
Riassumendo le cause dell’e e o plateu:
• Compe zione tra il prodo o dei cicli preceden e primers per l’ibridazione;
• Ina vazione termica dell’enzima;
• Riduzione del rapporto molare tra le concentrazioni della DNA-polimerasi e del DNA;
• Riduzione progressiva dell’e cienza di denaturazione e/o di ibridazione
• Distruzione degli ampli ca per l’a vità esonucleasica 5’>3’ della polimerasi;
• Accumulo di pirofosfa (inibitori della polimerasi);
• Progressiva diminuzione della concentrazione di uno o più componen necessari alla reazione.
Ovviamente l’enzima non è l’unico fa ore
importante nella reazione, ma dobbiamo
considerare gli altri fa ori che partecipano alla
reazione, che ci perme ono di avere una
speci cità, sensibilità e riproducibilità del
metodo. Ques sono tu fa ori, alcuni sono
chiave nel se ng dell’esperimento, altri invece
nell’esecuzione dell’esperimento (se c’è
contaminazione la reazione non potrà avvenire).
Chiave per la speci cità e per la sensibilità è la
scelta dei primer, che deve essere fa a in maniera
idonea. Poi gli esperimen di PCR devono essere
riproducibili, quindi ci sono fasi del metodo che devono essere standardizzate (come preparare il campione,
po di protocollo u lizzato, po di sistema di rivelazione u lizzato e chi conduce l’esperimento: ad esempio,
se in laboratorio un determinato esperimento è portato avan da un do orando è lui che si occuperà
sempre, dall’inizio alla ne di quei campioni).
Possiamo riuscire ad o mizzare la PCR andando a lavorare su diversi parametri:
• Acido Nucleico TARGET (qualità e quan tà)
• Disegno dei Primers;
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 • Temperatura di Annealing
• Concentrazione di Mg++
• Concentrazione di dNTPs
• Qualità e quan tà di enzima
• Forza ionica del tampone
• Presenza di Cosolven
• Parametri dei Cicli
• Numero dei cicli

DNA TARGET:
• Omogeneo (plasmide puri cato): ogni molecola è iden ca e rappresenta la sequenza da ampli care
• Eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA, come il DNA genomico, sospensione cellulari o
materiale biologico)
È importante la qualità di questo materiale nonché la quan tà (da 10 nanogrammi a 1 milligrammo di DNA
genomico !dipenderà dal po di sequenza che vogliamo analizzare, dal po di enzima u lizzato). Negli
ul mi anni ci sono state o mizzazioni tali che bastano nanogrammi o addiri ura picogrammi di DNA per
riuscire ad avere buone reazioni di PCR.
INIBITORI DELLA PCR:

▪ U lizzo di troppo DNA o troppo RNA;

▪ Presenza di emoglobina;
▪ Eparina;
▪ Ioni metallici;
▪ SDS;
▪ Compos aroma ci (spesso viene u lizzato il fenolo e il DNA deve esserne privo);
▪ Etanolo (non rovina di per sé il DNA ma inibisce la PCR);
▪ Urea;
▪ Detergen .
Il DNA deve essere il più pulito possibile altrimen tu ques reagen vanno ad in ciare la sua qualità.
CARATTERISTICHE DI UN BUON PRIMER:

• Impossibilità di formare dimeri ! È importante che non si leghino tra di loro, ma al DNA;

• Impossibilità di formare forcine (> 3 bp) ! È importante che i primer non si leghino su loro stessi
• Determinata temperatura di mel ng (dissociazione del DNA, in cui si trova a singolo lamento):
52°-65°
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 • Non deve formare legami con si secondari (se prendiamo dei frammen di DNA, tra i 10 e 15
nucleo di, è facile a livello genomico che queste sequenze si ripetano, specialmente se si tra a di
geni unici)
• Alta speci cità di legame al 3’ (ci possono essere mancate associazioni di un primer al suo DNA,
all’interno della sequenza stessa, ma questa speci cità è indispensabile).
Vuol dire che ci dev’essere un solo target per
quel primer su quel DNA templato. Nell’
immagine si può vedere una potenziale
sequenza di DNA dove sono indica due
inneschi. Come si vede il primo innesco non è
unico, ovvero si può legare su questa sequenza
di DNA in due pun . Mentre il secondo primer
trova sulla sequenza di DNA templato un unico
corrispondente e quindi è u lizzabile per la
reazione.
COME SI FA AD AVERE UN PRIMER CHE SIA
UNICO?
Bisogna lavorare su mol aspe , primo fra tu la LUNGHEZZA, ovvero più un primer è lungo più è
probabile che sia unico, ma esso deve rimanere entro cer limi di lunghezza: se troppo lungo, farà
aumentare la temperatura a cui avviene l’appaiamento sul DNA ed è importante che non sia troppo alta per
non entrare in compe zione con la temperatura che si va ad u lizzare per l’estensione. Quindi è necessaria
una certa di erenza tra la temperatura di annealing e la temperatura di exten on.
De o ciò, è stato stabilito che il numero di basi per prevedere l’unicità di un primer va dalle 17 alle 28 bp.
Composizione in basi di un primer: Un primer deve avere preferibilmente una composizione random di basi
per evitare che ci siano delle sequenze lunghe ricche in AT e delle sequenze lunghe ricche in GC e
orienta vamente una percentuale in basi GC intorno al 50/60%, che è quella che perme e di avere la
miglior temperatura di mel ng e la miglior temperatura di annealing in una PCR.
Calcolo della temperatura di mel ng e di annealing per un primer: La temperatura di mel ng è la
temperatura alla quale una sezione di DNA si trova per metà a singolo lamento e per metà a doppio
lamento, più è alta la percentuale in GC più elevata sarà la temperatura di mel ng. Questa temperatura
deve essere su cientemente bassa da perme ere l’ibridizzazione tra il primer e il nostro DNA templato ma
alta abbastanza da impedire un’ibridizzazione sbagliata, quindi bisogna far in modo che i primer presen no
delle temperature di mel ng e di annealing vicine tra loro (questo perché lavorando con due primer nello
stesso contesto non possiamo avere temperature diverse altrimen i primer non lavorerebbero insieme).

TEMPERATURA DI MELTING ! Tm= 2(A+T) + 4(C+G)

La temperatura di mel ng è importante perché da essa possiamo ricavare la temperatura di annealing,
ovvero la temperatura alla quale i primer vanno a legarsi al DNA.

TEMPERATURA DI ANNEALING! Ta= Tm- 4°C

Stru ura interna: deve evitare che i primer formino delle stru ure che possono comprome ere l’e cienza
della PCR, le stru ure che non devono formarsi sono:
• DIMERI !Due primer, uno forward e uno reverse, potrebbero legarsi tra di loro e non con il DNA
templato

• AUTO-DIMERI !Un primer potrebbe legarsi a sè stesso

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 • FORCINA
Solitamente queste stru ure non creano problemi perché
la temperatura di annealing non perme e loro di formarsi.
Alcuni dimeri o alcune forcine si formano solitamente ad
una temperatura intorno ai 30° ma in una PCR, in genere,
la temperatura più bassa che si raggiunge è intorno ai 60°,
quindi la stru ura interna dev’essere considerata ma non
rappresenta un problema così rilevante. Ovviamente
questo vale nella maggioranza dei casi ma non in tu ,
perciò, la stru ura interna dev’essere comunque
monitorata poiché potrebbe comunque esserci formazione
di una di queste stru ure.

Compa bilità delle coppie di primer: I due primer lavorano insieme all’interno della stessa reazione, quindi,
non possono avere temperatura di mel ng di erente perché comporterebbe una conseguente temperatura
di annealing di erente. La massima di erenza di annealing permessa è di circa 3°C.
La speci cità al 3’: Nell’immagine si vedono 4 possibili primer
u lizzabili, i primi tre sono speci ci al 3’, anche se hanno delle
di erenze (uno è speci co in maniera assoluta, uno ha una coda
che non lega il DNA ed un altro presenta dei “sal ” in cui non
lega il DNA), mentre l’ul mo lega quasi tu o il DNA ma non
l’estremità 3’.
I primi tre primer, se pur con delle di erenze, legano tu il 3’
perme endo il legame della polimerasi e dando avvio alla
reazione, mentre l’ul mo non presentando il legame al 3’ non
può dare avvio alla reazione e quindi non è u lizzabile.

TAMPONE DI REAZIONE:
L’enzima lavora ad una determinata forza
ionica ed a un determinato pH, uno controlla l’a vità dell’enzima l’altro controlla la termostabilità
dell’enzima.
COMPOSIZIONE DEL TAMPONE
• Tris HCl 10 Mm! serve perché gli ioni fosfato dei dNTP (diossinucleoside trifosfato) che vengono
messi in soluzione legano gli idruri liberi e vanno a formare acido fosforico, quindi con l’aggiunta del
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 tris HCl si riesce a mantenere un pH intorno 8/9; serve a regolare la quan tà di ioni idruro liberi in
soluzione e a mantenere un pH stabile.

• KCl 50Mm! serve a facilitare il legame del primer al DNA templato stabilizzando il legame. Il
potassio del sale lega i singoli lamen carichi nega vamente e quindi riduce la carica ne a
nega va del lamento di DNA evitando così la repulsione che si creerebbe tra i lamen di DNA e i
primer.

• MgCl2 1,5mM! serve poiché il magnesio è un cofa ore dell’enzima, lavora a livello del sito a vo
dell’enzima e aiuta a coordinare le interazioni tra il gruppo ossidrilico in 3’ e il gruppo fosfato in alfa
del dNTP (diossinucleoside trifosfato) che dovrà essere incorporato. Fondamentalmente il magnesio
si va a legare al fosfato in alfa e facilita la rimozione del beta e del gamma. La quan tà di magnesio
all’interno del tampone non può essere elevata altrimen la fedeltà della nostra della PCR sarà
compromessa poiché l’enzima andrà a lavorare anche su si diversi da quello des nato. D’altro
canto, se la quan tà è troppo piccola l’a vità dell’enzima sarà troppo bassa. Solitamente la
concentrazione di MgCl2 varia 0,5 e 5mM ma generalmente è di 1,5 mM.
È importante sapere quali sali u lizzare perché eventualmente, ecce o il cloruro di magnesio, potremmo
usare altri sali a seconda delle necessità. Ad esempio, si può u lizzare l’ammonio solfato al posto di KCl
poiché esso svolge la stessa funzione di KCl ma in più ha la capacità di aumentare la capacità di legame.
Quindi è importante sapere cosa c’è all’interno dei reagen per poter modulare ed o mizzare una reazione
quando ne abbiamo necessità. Inoltre, in una PCR possono essere u lizza dei co-solven e degli addi vi
che ci perme ono di migliorarne l’e cienza.
ESERCIZI
Vuoi ampli care una regione del genoma di un topo lunga circa 22,345 paia di basi u lizzando la PCR.
Disegni due primer che sono lunghi in basi 20 e 22 e hanno la stessa temperatura di mel ng. Però vai a fare
la PCR e non funziona. Perché?
A. Perché i primer sono di lunghezze diverse;
B. Perché la regione di DNA che vuoi ampli care è troppo grande;
C. Perché i primer sono troppo cor ;
D. Perché stai usando come bersaglio il DNA di topo, ma in realtà la PCR funziona solo con DNA umano;
E. Perché hai u lizzato più di un primer nella reazione;
Andare ad ampli care un frammento così grande, l’enzima perde di e cienza e non riesce (inoltre
comme e anche più errori). Si perde l’a vità enzima ca per e e o della temperatura (la temperatura di
annealing è di un minuto, e non si riesce ad ampli care un frammento così grande).
Quale di ques reagen non è incluso in una pica reazione di PCR?
A. dNTPs
B. MgCl2
C. E dio Bromuro (veniva u lizzato, ora non più, è un intercalante del DNA: ci perme e quando
facciamo migrare il DNA su gel di Agarosio, si intercala al doppio frammento di DNA, e se so oposto
a radiazione ultraviole a, eme e uorescenza ! non fa parte quindi del processo di PCR, ma viene
u lizzato come mezzo per valutare il prodo o).
D. Primer
E. Polimerasi di E. Coli
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 Noto che il genoma del fago lamba è di 48,502bp; quan genomi sono presen in una pg di DNA?

Peso medio per bp ! 650 dalton

1 dalton ! 1,66x10^-18µg
SOLUZIONE:
dalton/genoma = 48.502 bp x 650 dalton= 3,1x10^-7 dalton/genoma
µg/genoma= 3,1x10^-7 dalton x 1,66x10^18 µg= 5,1x10^-5 pg/genoma
1pg/5,1x10^-5 pg/genoma =2x10^4 genomi
Assunto che abbiamo una coppia di primers che è speci ca per un determinato gene, qual è il numero di
copie del frammento del nostro gene target dopo 30 cicli di PCR?
SOLUZIONE: Dato che ad ogni ciclo di PCR raddoppia il numero dei nucleo di presen facendo 2^30 o engo
il numero di copie del DNA di partenza, ma per determinare il numero di copie del frammento target devo
elevare 2^27 o più in generale 2^(n-3) (il perché lo spiega nella prossima lezione)
Un primer da PCR è lungo 18 basi. Approssima vamente quante volte si lega al genoma umano?
a. (3.3 x 10^9) / (18) ^2 (mo vo uguale alla b, non cambia molto)
b. (3.3 x 10^9) / 18 (diviso 18 implicherebbe che quella sequenza random di 18 bp su un DNA la trovi
solo una volta)
c. (3.3 x 10^9) / 4^18 (perché le basi sono 4 e 4^18 sono le combinazioni possibili che possiamo avere
andando a combinare tra loro 18 basi)
d. (3.3 x 10^9) / 2^18 (è sbagliata perché le basi sono 4 e NON 2)
e. 4^18 (sbagliata perché non c’è niente a cui si riferisce questo 4^18)
[3.3 x 10^9 indica la lunghezza del genoma umano / le potenziali combinazioni che possiamo avere da parte
di questa sequenza di 18 bp su un genoma umano]

BIOLOGIA MOLECOLARE 12/05

In funzione dello splicing si possono avere 4 pi di esoni:

- Esoni cos tu vi ➞ condivisi da tu e le isoforme;

- Esoni speci ci ➞ quando solo una isoforma presenta quell'esone;
- Esoni sovrappos ➞ hanno regioni sovrapposte, ma anche regioni speci che;
- E s o n i a l t e r n a v i ➞ n o n s o n o c o n d i v i s i d a t u e l e i s o fo r m e , s o l o d a a l c u n e .
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 Splicing alterna vo:
Questo po di esoni si presentano sulla base del fa o che è possibile si venga a veri care uno splicing
alterna vo, ovvero un gene può codi care più isoforme da uno stesso trascri o primario ➞ diversità
funzionale nel proteoma cellulare che verrà prodo o.
Lo splicing alterna vo, sopra u o nell'uomo, avviene in quasi ogni gene. In alcuni casi può essere legato a
errori durante la regolazione della trascrizione, in altri casi è un meccanismo funzionale.
Dobbiamo considerare tu e le snRNP che servono a formare lo spliceosoma durante la trascrizione poiché
sono presen alcuni fa ori proteici che servono a promuovere la formazione dello splicing e altri che lo
inibiscono. Ques fa ori, che cos tuiscono l'assemblaggio del macchinario di splicing, possono avere una
distribuzione ssutale diversa e quindi even che si
veri cano in alcuni casi e altri no.
Inoltre i si di splicing possono essere deboli o for .
Con la possibilità di avere uno splicing alterna vo vorrà
dire che avendo esoni che si veri cano in determinate
condizioni di splicing e non in altre allora avremo si di
splicing più deboli➞ questo po di formazione si può
veri care quando c'è l'a vazione di tu e tre i si , ma
non necessariamente dal momento in cui viene inibito,
per cui si può avere l'a vazione di un sito di splicing
debole. L'isoforma prevede la presenza di tu e tre gli
esoni di questa sequenza trascri a oppure il sito
debole può essere represso ➞ determina la presenza o
meno di un esone.
Nell'immagine in basso si vede l'esone due, perché sarà diverso il legame delle proteine che verranno legate
ai si di splicing:
- ESE= Exonic Splicing Enhancer, promuovono lo splicing;
- ESS= Exonic Splicing Silencer, inibiscono lo splicing.

Splicing regolato:
Le proteine che legano queste regioni trascri e, le sequenze ESE e ESS, riportano alle proteine SR che
legando le sequenze esoniche perme ono lo splicing oppure lo inibiscono se non lo legano. In questo caso
vediamo la proteina SR che si lega alla sequenza ESE, quindi si può avere la formazione di un trascri o che
prevede il riconoscimento di quel sito di splicing, il quale porta all'inclusione di tu e tre gli esoni nel
trascri o maturo. Nell'immagine, invece, se la proteina SR non lega la sequenza ESE il messaggero è più
corto perché non verrà riconosciuto quel sito di splicing e l’esone verrà escluso.
Si parla di splicing regolato per la capacità e presenza di sequenze regolatorie a livello esonico che devono

essere legate a proteine speci che.

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 Leaky regolato:
È possibile anche uno splicing in assenza dell'intervento di proteine regolatorie e potranno essere usate in
egual misura i due si di splicing. Si parla di Leaky splicing o perdita di splicing regolato se uno dei due si di
splicing non viene considerato e di conseguenza va perso; sono situazioni che si possono egualmente
veri care in assenza delle proteine che regolano lo splicing. Lo splicing regolato è uno splicing legato alla
perdita di un esone per mancanza di
riconoscimento da parte della proteina.

Tu ques meccanismi porteranno ad avere

diversi pi di splicing alterna vo con esoni
alterna vi e non.
Nell'immagine vediamo quan sono i pi di
splicing e la percentuale con la quale si
possono veri care.
Il box blu è l'esone che può essere incluso o
escluso; nella parte centrale dell'immagine
vediamo un altro po splicing chiamato ritenzione dell'introne ➞ viene incluso un introne quindi non viene
tagliato e può avvenire quando gli introni non sono eccessivamente lunghi.

Controllo dello splicing alterna vo:

Lo splicing alterna vo è controllato da proteine che sono presen in maniera diversa nei tessu .
1. proteine repressore, portano alla mancanza d i
splicing di un trascri o primario e
all'inclusione di una sequenza che, invece,
viene esclusa in un altro tessuto nel quale le
proteine repressore non sono presen .
2. proteine a vatrici, portano alla formazione di un
trascri o diverso da quello che si veri ca in
tessu in cui questa proteina a vatrice non è
presente ➞ proteine che aiutano o
reprimono lo splicing in modo tessuto-
speci ca.
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 Il legame di alcune par dello spliceosoma è
importante a nché avvenga lo splicing. Abbiamo
visto come il legame del componente U2 della
snRNP si veri ca al sito di rami cazione ed è
promosso dal legame delle proteine SR. Le SR si
legano alle sequenze esoniche che devono essere
incluse, richiamano i fa ori dello splicing e
perme ono o a vano lo splicing. Le proteine che
richiamano i fa ori di splicing fungono da
coa vatori dello splicing per includere un esone
che altrimen non verrebbe incluso; le sequenze
speci che se invece di essere legate su quella
regione esonica, non di a vazione ma di
silenziamento (rosa in basso), interagiscono delle
proteine repressore e implicherebbe che
legandosi le SR non verrebbe reclutato il
macchinario di splicing e quindi questo esone
escluso. Nell'immagine, in basso, si vede che le
proteine SR sono legate all'esone 1 e 3, non si possono legare all'esone 2, il macchinario di splicing non può
essere reclutato e l'esone verrà escluso.
Il controllo dello splicing è sulla base del reclutamento dei fa ori di splicing mediato da proteine a vatrici e
repressive tessuto-speci che. In un tessuto si formerà un trascri oma che darà origine a un proteoma e in
altri uno diverso.
Le proteine a vatrici e repressive possono essere presen in tessu diversi, ma anche in momen e
condizioni diverse. Le condizioni ambientali di eren possono indurre la produzione di proteine a vatrici
che inibiscono lo splicing e portano a uno splicing alterna vo.

Risulta dello splicing alterna vo:

Insieme ad esoni alterna vi si possono introdurre
● Codoni di stop prematuri ;
● Frameshi s➞ cambiamento nella cornice di le ura dell'mRna;
● Si per modi cazioni post-traduzionali;
● Si per la localizzazione subcellulare, cambiando la sequenza cambia anche la proteina;

Nonsense-Mediated Decay (NMD) :

Un altro meccanismo importante legato allo splicing è il Nonsense-Mediated Decay (NMD) o decadimento
mediato dal nonsense. Circa il 30% delle mala e ereditarie è causato da mutazione nonsense ovvero
mutazione che creano codoni nonsense. Questo meccanismo NMD legato allo splicing protegge dalla
possibilità che si veri chi una terminazione inadeguata di un trascri o e la produzione di una proteina
scorre a.

Si veri ca quando in uno splicing scorre o si può avere la presenza di un codone di stop prematuro.
Nell'immagine verde a sinistra, troviamo gli esoni in blu, gli introni in grigio, in alto il DNA, in basso il
messaggero e poi lo splicing.
Il codone di stop è nell'ul mo esone (ul ma regione genomica che darà luogo all'ul mo esone) e si veri ca
lo splicing a livello dei si di giunzione, sul trascri o maturo il ribosoma scorre e perme e la sintesi proteica
andando a rimuovere ques complessi su un messaggero corre o portato nel citoplasma.
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 Se si veri ca la situazione in cui il codone di stop
non si trova sull'ul mo esone per un errore o
mutazione, ma si trova sul secondo esone,
come in questo caso, avviene lo splicing.
Vengono recluta ques complessi proteici e
livello della giunzione esone-introne e quando i l
ribosoma si trova a dover tradurre questa
sequenza non riesce a spostare dalla sequenza del
messaggero il complesso proteico➞ il trascri o
verrà degradato perché la presenza di un
complesso EJCs dopo il codone di stop viene
iden cato come un problema da parte di quei
fa ori che serviranno a muovere questo
meccanismo di decadimento.
Come viene degradato l’mRna:
A sinistra la situazione normale ➞ fa ori EJCs a livello dei si di splicing, il ribosoma passa e traduce la
proteina; a destra situazione mutata e messaggero aberrante ➞ un PTC (codone di stop prematuro) e alla
ne un altro codone di stop, si legano in giallo ai complessi proteici, la traduzione avviene. Nel momento in
cui il ribosoma passa un codone di stop non ne aspe a un altro, ma visualizza un secondo complesso
proteico a livello delle giunzioni e ciò comporta la degradazione del messaggero.
Questo avviene quando il codone di stop è
localizzato a una distanza tale di circa 50
nucleo di a monte della giunzione introne-
esone successiva. Il segnale di stop prematuro è
dovuto a una mutazione che si è veri cata sulla
sequenza genomica e poi anche sul trascri o, in
maniera casuale. Questo è un meccanismo di
protezione per evitare che una mutazione che s i
veri chi a livello genomico e quindi che in
seguito si troverà in un trascri o; potrebbe
portare alla formazione di una proteina
aberrante, facendo in modo che il meccanismo
traduzionale evi che venga prodo a una
proteina sbagliata riconoscendo quel codone prematuro che non è reale. Riconosce che è prematuro perchè
subito dopo il codone di stop, a una distanza non troppo grande, rileva un altro complesso proteico che si è
andato a unire alle giunzioni di splicing (pallino giallo), il meccanismo viene interro o e quel messaggero
verrà degradato e la proteina non prodo a.

Perché la proteina riesce a riconoscere la situazione anomala?

Si forma un complesso di sorveglianza.
A livello delle EJCs si aggregano delle proteine (in viola) che interagiscono con le proteine del complesso.
Quando il ribosoma (in verde) si lega per sinte zzare la proteina, nel momento in cui sta portando a termine
la traduzione, c'è il richiamo dei fa ori di rilascio una volta arrivato al codone di stop ➞ se questo fosse
quello corre o, la cellula capirebbe che la traduzione deve essere portata a termine. Quando il fa ore è
prematuro, i fa ori di rilascio richiamano un'altra proteina, la Upf1, che però nel momento in cui si con nua
a muovere sul trascri o perché per essa ha nito il trascri o, trova ancora materiale da tradurre e va a
collidere contro le proteine che si sono legate al complesso di giunzione esonica. La collisione porta a
un'interazione di fa ori proteici che fanno capire alla cellula che quello non era un codone di stop reale, ma
prematuro perché altrimen questa situazione non si sarebbe veri cata. È necessario che si a vi questo
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 meccanismo che porterà alla degradazione del
messaggero.

Nella messa in funzione di questo meccanismo di

protezione comunque sia una certa quan tà di
proteina si formerà perché la traduzione è iniziata. Si
formerà una proteina troncata quindi più piccola a
causa del codone di stop che non si trova sull'ul mo esone. La formazione di questa proteina troncata non
porterà problemi, potrebbe indurre un feno po alterato e lo farebbe se fosse prodo a in una quan tà
su ciente, ma siccome avviene subito questo meccanismo di protezione o sorveglianza e il messaggero
verrà degradato, si avrà una riduzione del messaggero; è improbabile, ma non escluso, che quella poca
proteina possa provocare alterazioni feno piche.
La cellula tende a riparare durante la sintesi, grazie in primis alla capacità della polimerasi di correggersi e
poi dell'rna polimerasi. Si può arrivare a un punto tale che se ques due meccanismi sono sta passa ,
allora questo può essere un altro meccanismo possibile. Le mutazioni si veri cano di con nuo nel genoma
per errori casuali e spesso non comportano nessun po di alterazione, se si trovano a livello di una sequenza
genica possono portare dei problemi, ma ci sono tan meccanismi per evitare che ciò avvenga e uno di
ques è legato allo splicing.

ex. NMD nella b-talassemia:

Un esempio di come questo decadimento mediato dal nonsense abbia un ruolo signi ca vo nella b-
talassemia➞ una grave forma ereditaria di anemia
causata da mutazioni che si veri cano a carico del
gene delle b-globine. Molte mutazioni che
producono un codone di stop prematuro creano
forme di talassemia recessive proprio perché
interviene come meccanismo di protezione l'NMD.
Negli individui eterozigo , che sono quelli sani,
nell'allele mutato viene generato un messaggero che
con ene un codone di stop prematuro, il quale sarà
degradato e non porterà alla formazione della
proteina dife osa➞ sappiamo che avviene quando il
codone di stop prematuro si può trovare a
livello dell'esone 2; se avvenissero delle
mutazioni non sul secondo esone, ma sul terzo
esone questo creerà delle forme di talassemia i n
cui il messaggero mutato riesce a sfuggire al
meccanismo di sorveglianza e porterà alla
produzione di una catena tronca. Il
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 meccanismo di protezione si scatena se la mutazione si presenta nell'esone 2, nell'esone 3 questo
meccanismo non si veri ca e si forma la proteina troncata. Tu o ciò avviene perché cambiano le distanze in
cui si possono veri care ques codoni di stop prematuro rispe o alla giunzione di splicing➞ ci devono
essere delle distanze adeguate per far sì che tu e quelle proteine che vengono reclutate, sul macchinario
che si trova a livello delle giunzioni di splicing, possano creare interazioni per provocare il meccanismo di
sorveglianza e se questo numero di basi è inferiore a 50, questo po di meccanismo non si può veri care
perché non ci sarà tempo su ciente a nché le proteine vengano reclutate sul ribosoma insieme ai fa ori di
rilascio e quindi non vadano a collidere tra di loro e perme ano la possibilità che si veri chi il meccanismo
di sorveglianza. A seconda di dove si trova e alla distanza a cui si trova il codone di stop dal complesso di
giunzione dei si di splicing il meccanismo potrà veri carsi o meno. Nel caso della b-talassemia, in alcune
forme gravi anche se rare, questo meccanismo non si scatena e si veri ca la patologia.

Nell'immagine abbiamo visto la situazione centrale, il decadimento mediato dal nonsenso con il codone di
stop che si trova in un esone che non è quello nale.
Un altro meccanismo, scoperto più recentemente, riguarda un decadimento mediato dal nonsense legato a
elemen regolatori o microRna. In questo caso, nell'immagine, se si presenta un codone di stop prematuro
la regione che si trova a valle di questo codone di stop prematuro può legare un microRna complementare
alla sequenza genomica che inibisce la traduzione e porta alla degradazione della molecola. Il lavoro dei
microRna è quello di, essendo complementari a sequenze di messaggero endogeno, indurre la
degradazione. Sono dei meccanismi di regolazione genica che portano all'inibizione della trascrizione e in
questo caso lo possono fare in condizioni ambientali tale che vengono prodo per fare in modo che una
determinata proteina non venga espressa e lo faranno legando il messaggero che formerà la proteina
oppure possono farlo come meccanismi di sorveglianza nel momento in cui un messaggero è mutato
(perché c'è la presenza di un codone di stop prematuro),➞ reclutamento di microRna che portano a
degradazione di quel messaggero.

Splicing alterna vo ed evoluzione:

Negli ul mi anni sono sta condo mol studi e si è notato che la presenza nei genomi, a livello evolu vo,
di introni e la presenza con nua di nuove sequenze introniche sono state trovate anche in diversi organismi
eucario ci. Questa complessità sarebbe legata agli e e bene ci del decadimento mediato dal nonsense.
NMD non solo avrebbe evitato la produzione di proteine sbagliate, ma sembra abbia agito anche per
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 selezionare degli introni e ha permesso che solo le sequenze introniche che non fossero deleterie per
l'organismo venissero portate avan a livello evolu vo. I meccanismi di sorveglianza sono molto importan ,
a parte per evitare lo sviluppo di proteine anomale, ma anche un mezzo per far sì che ci sia una regolazione
dell'espressione genica che di nuovo sarà legata a condizioni ambientali ssutale speci che.

Risulta dello splicing alterna vo:

Lo splicing alterna vo può aver fa o in modo che durante l'evoluzione ci siano delle nuove combinazioni di
esoni, le quali hanno portato alla produzione di nuovi geni e alla formazione di nuove proteine.

ex. TPA ( ssue plasminogen ac vator) :

Ci sono proteine diverse che possono essere u n
mix di proteine con domini simili. Questo ad
esempio è il fa ore a vatore ssutale del
plasminogeno, è una proteina che previene l a
coagulazione del sangue e ha diversi domini
codi ca da esoni diversi e ques esoni
vengono da geni ancestrali che insieme
hanno portato alla formazione di quella che
conosciamo oggi essere il gene del TPA ➞
proviene dal mix di tre geni ancestrali che
hanno portato tramite splicing alterna vo alla
formazione del gene come lo conosciamo oggi
che vediamo a destra; a sinistra le tre
sequenze chiave nei tre geni ancestrali che insieme hanno portato alla formazione di questo gene.

Lo splicing è tessuto speci co:

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Alcuni esoni possono essere presen in un tessuto e non in un altro, in questo caso l'esone due è nel
muscolo cardiaco e l'esone 4 nel muscolo uterino.
Un esempio di splicing alterna vo tessuto-speci co è quello della tropomiosina: in alto il gene, i vari box
indicano gli esoni e in basso il messaggero (diverso nella muscolatura striata e liscia) dove sono contenu
esoni diversi. Nella muscolatura striata abbiamo l'esone 3, 11 e 12 che non sono presen nella liscia dove,
invece, ci sono il 2 e il 13. (sm= smooth, str=striated)

SPLICING DI tRNA:
Non solo i messaggeri subiscono lo splicing ma anche i tRNA.
Per quanto riguarda il tRNA vi è un meccanismo diverso, poiché non si assembla un macchinario complesso
(spliceosoma) come quello visto per i messaggeri nucleari, ma saranno necessari degli enzimi (delle
endonucleasi) che vanno a riconoscere gli speci ci si di taglio.
Gli enzimi importan a nché avvenga uno splicing del tRNA sono delle endonucleasi che vanno a tagliare il
nostro precursore del tRNA ai due si di splicing, sia al 3’ che al 5’. Vanno a rilasciare due mezze molecole in
cui abbiamo una estremità che avrà un anello 2-3 fosfato ciclico e una estremità che ha invece un gruppo
ossidrilico al 5’. In seguito ad un corre o ripiegamento, e all’intervento di una fosfodiesterasi, si ha
l’apertura di questo ciclo che si viene a formare sul 3’ del precursore ➞ questo perme erà la liberazione del
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 gruppo ossidrilico e questo consen rà che possa intervenire la ligasi che unirà le sue mezze molecole. In ne
interviene una fosforilasi che andrà a fosforilare il terminale al 5’.
Quindi intervengono delle nucleasi, degli enzimi che intervengono nel ripiegare in maniera corre a i
precursori e delle ligasi (fanno si che ci sia una reazione tra le due molecole che devono legarsi tra di loro).
Quindi è dato dall’azione di enzimi che intervengono consecu vamente.

È sempre possibile sul gel di agarosio andare a valutare la presenza/assenza di un introne: un tRNA che
con ene un introne sarà più pesante di quanto non lo sia un tRNA che non lo con ene. Quindi possiamo
visualizzare sul gel sia il tRNA maturo che il suo introne.

L’enzima chiave del processo (taglio al 3’ e 5’) è la

endonucleasi formata da diverse subunità:
- SEN54 è il misuratore che va a determinare i si di
taglio, misura la distanza tra i si in cui deve essere
tagliato il tRNA
- SEN2 e SEN34 sono le subunità importan per
e e uare il taglio in posizione 3 e 5 dell’introne
- SEN15 ruolo non ben de nito.
Vi sono altri modi che possono essere u lizza dalla
cellula per andare a modi care la sequenza di un rna
messaggero: RNA EDITING. Ve ne sono di 2 pi:
1. DEAMINAZIONE SITO-SPECIFICA: che porta a far sì che da una adenina si formi una inosina oppure che
da una citosina si formi un uracile. Reazione che porta alla formazione di inosina quando interviene la
ci dina deaminasi, un enzima che è presente solo in determina tessu . Cosa comporta? Es: gene
dell’apolipoproteina B-umana. Nel fegato abbiamo una bassa a vità di edi ng che comporta la
formazione di una proteina di 4653
amminoacidi. Nell’intes no invece si veri cano
ques meccanismi di edi ng che portano alla
deaminazione sito-speci ca di citosine che
possono portare alla formazione di triple e
anomale, come un codone di stop UAA quando l a
citosina viene deaminata a formare un uracile.
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 Quindi CAA codi ca in realtà per una glutammina, ma se avviene la deamminazione si ha una proteina
diversa, tronca. Quindi la deamminazione produce una proteina più piccola. Entrambe queste 2
proteine sono funzionan , ma funzionano in maniera diversa: quella prodo a nel fegato serve a
trasportare lipidi e il colesterolo, quella che si trova nell’intes no invece trasporta nei tessu i lipidi
assun con la dieta. Abbiamo quindi la produzione di un messaggero diverso a causa dell’edi ng, che è
legato a cara eris che ssutali, e porta alla formazione di due proteine diverse.

2.INSERZIONE O DELEZIONE DI URACILI: avviene a

livello di una sequenza di messaggero immatura,
ed è guidata da una rna guida. Edi ng mediato
dagli rna guida che porterà alla inserzione di uracili
nel trascri o primario. Questo meccanismo è stato
trovato nei mitocondri di alcuni protozoi agella , i
tripanosomi. Vengono inserite una serie di uracili
nel trascri o primario e questo quindi porterà alla
formazione di una proteina diversa da quella che
era legata alla sequenza iniziale del genoma.
MECCANISMO: Questo può avvenire tramite un
meccanismo guidato da degli rna, gli rna guida
(gRNA), che si vanno a legare per complementarietà all’rna messaggero ➞ questo legame porterà alla
formazione di anse sull’rna che deve essere modi cato ➞ porta alla formazione di tagli grazie
all’intervento di alcune endonucleasi, che tagliano lì dove c'è complementarietà (il mismatch). In questo
modo le adenine presen sull’rna guida possono essere riconosciute da degli uracili, che vengono
aggiun grazie a l'appaiamento di coppie di basi complementari, e poi delle ligasi vanno a chiudere
questo gap. Si ha quindi l’inserzione sul messaggero trascri o di una serie di uracili lì dove non c'erano,
quindi ci sarà la sintesi di proteine diverse. Quindi è un edi ng dovuto ad enzimi che vanno a modi care
le C oppure consentono l’inserimento di uracili nel trascri o.

TRANS SPLICING:
Ciò che abbiamo visto nora è il cis splicing, ovvero sequenze sulla stessa molecola di rna vengono unite
insieme. È stato visto però anche un altro meccanismo, il trans splicing, ovvero uno splicing che va ad unire
tra di loro dei trascri primari diversi. È un evento raro nelle cellule eucario che, ma è sfru ato molto in
vitro ad esempio per andare a riparare l’rna. Questo meccanismo si può veri care quando ques due
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 trascri primari contengono delle sequenze
introniche che sono tra di loro complementari. Se
queste due sequenze introniche si legano tra di
loro, si ha la formazione di un taglio che va a
rimuovere questa sequenza e si ha la giunzione di
due esoni appartenen a due trascri diversi.
È una tecnica usata molto in vitro perché sta perme endo la possibilità di riparare degli rna. Uno dei
meccanismi che serve per questo po di riparazione è lo Spliceosome Mediated rna Trans splicing (SMaRT)
che porta alla connessione di due sequenze introniche, che si legano per complementarietà, e perme ono
di riparare un danno. Nell’immagine vediamo come si possono esporre le cellule ad una sequenza trascri a
che con ene l’esone ed una sequenza intronica (disegnata per essere complementare alla sequenza di quel
messaggero che sappiamo essere mutato a livello di un determinato codone). In questo modo ripariamo,
facendo in modo che questo trascri o si leghi con quel trascri o che noi o eniamo in vitro, e quindi
facciamo in modo che questa mutazione non avvenga più nel prodo o tramite trans splicing. Quindi è un
meccanismo nuovo che si sta studiando per riparare gli mRNA muta .
ESERCIZI:
1) B
2) B
3) A VERO
4) A VERO
5) D (sono degrada dopo che sono rimossi, non hanno una funzione speci ca)
6) C
7) C (termina con AG e non ci inizia, dato che leggiamo sempre 5’- 3’)
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 Esercizio: noi abbiamo questo trascri o formato da un esone 1 e esone 2 (i numeri so o indicano la
grandezza in basi di quella sequenza che è stata radiomarcata che complessivamente è di circa 500
nucleo di).
Tale sequenza è stata incubata per un certo tempo (che varia dai 30 minu alle 4 ore) e durante tale periodo
si ha lo splicing. I diversi prodo , o enu in seguito alle diverse incubazioni, vengono so oposte al gel di
ele roforesi per valutare la grandezza delle bande. In base alla grandezza delle bande siamo in grado di
capire a cosa corrisponde ogni singola banda.
Sicuramente la banda che migra meno (la più pesante) sarà il nostro trascri o quando non viene ancora
maturato. Le altre bande che si formano nel tempo in seguito alla maturazione cosa sono? A cosa
corrispondono?
Quelle 380/400 corrispondono molto probabilmente ai due esoni lega tra di loro, e uno dei due esoni
legato all’introne. Poiché andando a sommare la composizione in basi delle sequenze, grossomodo
corrispondono a quelle.
Le bande alla ne sicuramente corrispondono ad uno dei due esoni, mentre le più piccole (100 e qualcosa
nucleo di) saranno la sequenza intronica che è la più
piccola. Ne sono però due poiché l’introne quando
viene rimosso, prima di essere degradato, viene
rimosso so o forma di cappio ➞ un rna che assume
quella formazione a cappio migra meno velocemente
rispe o a quello lineare. Quindi quello che migra di più s a rà
l’introne in forma lineare, mentre quello che migra poco
meno sarà quello so o forma di cappio poiché non si
formano stru ure secondarie.
Infa quello lineare sarà presente solo dopo 4 ore di
incubazione, poiché solo man a mano viene liberato in
forma lineare. (Nell’ul mo me point).

Perché un rna in forma di cappio migra meno velocemente di uno in forma lineare mentre per il dna questo
migra più velocemente se superavvolto? Perché in questo caso la conformazione dell rna a singolo lamento
lo porta a comportarsi in maniera diversa rispe o ad un dna che è a doppio lamento.
STABILITÀ DEL MESSAGGERO:
Qui vediamo i nostri messaggeri:
-in alto vi è un messaggero di una cellula
procario ca (poiché non abbiamo le
modi cazioni al 5’ e al 3’) ma spesso
abbiamo la formazione al 3’ di una
stru ura ad ansa.
-Centralmente abbiamo i messaggeri
eucario co, che hanno il cappuccio al 5’ e
la coda di poli A al 3’
-In basso invece abbiamo i messaggeri
delle proteine istoniche, che sono
cara erizza dal fa o che manchi una
coda di poli A ma vi è al suo posto un
ansa.

Mentre i ribosomi vengono ricicla e

possono andare di nuovo a tradurre dei
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 messaggeri, gli mRna una volta nito il loro compito vengono degrada . Sono quindi delle molecole instabili
che vengono subito a accate da degli enzimi quali le endo ed esonucleasi. Le esonucleasi digeriscono gli
acidi nucleici o partendo dal 5’ al 3’ o dal 3’ al 5’. Mentre le endonucleasi vanno a tagliare gli rna a livello dei
legami fosfodiesterici interni, agiscono a livello di sequenze speci che.
Gli mRna sono molecole instabili; le nucleasi che li a accano possono essere
● processive: enzimi che restano associa al substrato mentre catalizzano la rimozione sequenziale dei
nucleo di
● distribu ve: enzimi che catalizzano la rimozione solo di uno o pochi nucleo di, poi si dissociano e poi si
ria accano ecc.

Le molecole di messaggero hanno un tempo di emivita

molto variabile, che dipende dal messaggero. Gra co =
metodo per calcolare il tempo di emivita di un
messaggero, tempo necessario a nché la % di
messaggero prodo o sia uguale al 50%.

La loro instabilità porta al decadimento del messaggero, alla sua degradazione. Ci serve capire quanto è
stabile un messaggero poiché dalla sua stabilità e dalla quan tà di messaggero presente nella cellula in un
determinato momento noi possiamo ipo zzare la quan tà di proteine prodo e. Riusciamo quindi a ricavare
informazioni riguardo la proteina.

Come cambia questa degradazione dei 2 pi di cellule:

PROCARIOTI: trascrizione e traduzione avvengono nella stessa direzione e nello stesso momento, così come
la degradazione. Dall’inizio alla ne della trascrizione si parla di pochi minu (2-3 minu circa). Per la
degradazione del messaggero intervengono vari enzimi: le esonucleasi e le endonucleasi. Subito, durante il
processo di sintesi quando è stato già u lizzato il messaggero, le endonucleasi vanno a tagliare l’rna al suo
interno ➞ perme ono alle esonucleasi di trovare le regioni a cui legarsi al 5’ e 3’ per andare a degradare il
messaggero. Nell’immagine vediamo che per esempio il frammento a monte non recluta immediatamente
delle esonucleasi in direzione 5’ 3’ m a
interviene una esonucleasi che va a
tagliare e agire dopo che è
intervenuto il taglio della
endonucleasi. Questo avviene
perché il primo step è quello della
rimozione di un pirofosfato che
recluta le endonucleasi, le quali
reclutano le esonucleasi. Questo
porterà quindi al fa o che siano
presen un gruppo funzionale
ossidrilico e un gruppo fosfato ➞ l e
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 esonucleasi agiscono andando a lavorare principalmente dove trovano l’OH (digeriscono il messaggero che è
stato tagliato, a ritroso). A valle i trascri delle cellule procario che non sono prote , quindi essendo
presente il gruppo OH al 3’ potrebbero essere immediatamente degradate dalle esonucleasi, ma questo non
avviene poiché in realtà sono prote a valle da
una stru ura ad ansa ➞ stru ura a doppio lamento, su cui le esonucleasi non possono agire.
1: rimozione del pirofosfato
2: reclutamento delle endonucleasi
3: intervento delle esonucleasi che mangiano a ritroso i frammen .

ESERCIZIO (della volta precedente):

Al primo ciclo abbiamo prodo 2 alla n, quindi 2 copie ma non copie del target. Nel secondo ciclo invece
abbiamo 2 alla 2, quindi 4 copie ma nessuna copia del target. Al terzo ciclo invece abbiamo 8 copie ed è la
prima volta in cui riusciamo ad avere tra queste copie 2 copie del target.

BIOLOGIA MOLECOLARE 19.05

EUCARIOTI: molto spesso parlando di mRNA bisogna

considerare che esistono di solito associa a proteine,
poiché queste devono fare in modo che si veri chino
tu i passaggi successivi per avere la traduzione.
Abbiamo quindi spesso proteine, le di RBP (Rna
Binding Protein).
In questa immagine vediamo come un messaggero
possa andare ad interagire, a seconda delle
condizioni in cui si viene a trovare, con diverse
proteine.

Quello che dobbiamo considerare

parlando di stabilità di un mRNA di una
cellula eucario ca è che, a di erenze di
ciò che accade per i procario , abbiamo
una protezione al 5’ e al 3’ ➞ impedisce
a quelle esonucleasi di poter svolgere la
loro funzione.
Vi sono due modi a raverso cui gli
mRna possono essere degrada ,
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 entrambi dipendono dalla deadenilazione (dalla perdita della coda poli A).

MECCANISMI DIPENDENTI DALLA DEADENILAZIONE:

Nell’immagine vediamo come un messaggero prote o al 5’
e al 3’, prima di poter essere degradato, debba perdere la
coda di poli A. Per cui un complesso proteico chiamato
esosoma va a far sì che si perda tale coda ➞ perme erà al
messaggero di essere degradato.
Se non viene persa la coda di poli A, si stabilirà un
meccanismo che sarà legato alla rimozione del cappuccio al
5’ a raverso un complesso proteico de o Lsm 1-7, che
invece è formato da 7 subunità proteiche e si andrà a legare
alla coda di poli A ➞ consen rà alle proteine che devono
leggere il 5’ di degradare la 7-me l-guanosina che cos tuiva il cappuccio e a delle esonucleasi, come Xrn1,
di andare a degradare in direzione 5’-3’ il nostro RNA. Queste sono le vie principali, entrambe dipenden
dalla deadenilazione poiché
● nel primo caso abbiamo la rimozione della coda e quindi la degradazione in direzione 3’-5’
● nel secondo caso invece vi è la necessità che venga legata la coda di poli A a nché avvenga il
reclutamento di quei fa ori che rimuoveranno il cappuccio e porteranno al decadimento in
direzione 5’-3’.

Ques sono meccanismi che possono essere lega alla deadenilazione, ma vi sono anche meccanismi più
rari indipenden dalla deadenilazione ➞
1. portano alla rimozione del cappuccio senza che la coda
di poli A venga in nessun modo alterata
2. oppure riguardano proteine istoniche. Come abbiamo
visto ci sono delle cara eris che, come il fa o che si
formino delle anse sul messaggero della proteina
istonica, che vanno a richiamare delle poli U polimerasi
che vanno ad aggiungere al 3’ degli uracili.
3. Può veri carsi il caso in cui al posto di agire dalle
estremità a raverso le esonucleasi ci sia invece il
richiamo di endonucleasi ➞ taglio internamente.
4. Il più importante tra ques è quello legato alla
regolazione trascrizionale, ovvero in cui si veri ca
l’interazione tra un messaggero con dei piccoli RNA
endogeni (i micro RNA) che riconoscono i messaggeri per poi poterli andare a degradare. È un
meccanismo di regolazione genica, che fa in modo che tale messaggero non vada proprio a
codi care per nessuna proteina (gli altri meccanismi degradano il messaggero una volta che questo
ha svolto il suo compito).

SISTEMI DI SORVEGLIANZA NUCLEARE:

Abbiamo visto che vi sono dei meccanismi che fanno in modo che se un messaggero non è maturato nella
maniera corre a venga degradato. Quindi ci sono meccanismi che stabiliscono e indicano la stabilità di un
messaggero ➞ deve essere valutata a livello nucleare, prima che vi sia l’esportazione del messaggero
maturo a livello citoplasma co.
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 Quindi nel momento in cui si ha un messaggero
dife oso o un Rnp (RNA legato alle proteine), ques
vanno a reclutare delle proteine come gli esosomi
nucleari che fanno in modo di andare a degradarli a
livello nucleare.
I messaggeri non corre amente maturi o con anomalie
vengono degrada a livello nucleare.
Tra i meccanismi vis uno era quello del decadimento
mediato dal Nonsenso legato al meccanismo di splicing,
oppure il reclutamento di proteine come quelle TRAMP
che vanno a richiamare gli esosomi a livello nucleare, che vanno a tagliare il messaggero.

SISTEMI DI SORVEGLIANZA CITOPLASMATICA:

Il messaggero è stato in grado di superare i pori nucleari ed è arrivato a livello
citoplasma co.
- Uno dei meccanismi visto l’altra volta è il decadimento mediato dal
nonsenso
- Un altro è quello dovuto al fa o che a livello citoplasma co il ribosoma si
trova nelle condizioni in cui non trova un codone di stop (Non Stop Decay,
NSD) ➞ il ribosoma con nuerà a scorrere su quel messaggero, ma
chiaramente la cellula comprende che questo meccanismo non è normale
e quindi troverà dei segnali che indicano che tale messaggero dovrà essere
degradato e così anche la proteina che viene sinte zzata. Porta al
reclutamento di proteine che richiamano gli esosomi, per fare in modo che
il messaggero venga degradato. Quando un ribosoma scorre su
un messaggero del genere, alla ne si troverà a sinte zzare un
qualcosa di non sinte zzabile poiché alla ne vi è sempre la
coda di poli A ➞ a livello di tale coda la cellula capisce che non
si è fermata (il ribosoma) come avrebbe dovuto e quindi
richiama proteine che richiamano gli esosomi. Non è
su ciente che venga degradato solo quel messaggero, ma
deve essere degradata anche la proteina in via di sintesi da un
proteasoma (una stru ura che serve per degradare proteine o
anomale oppure non necessarie), poiché è anomala. Il
proteasoma è un complesso mul proteico che ha dei segnali di
riconoscimento a livello della sua stru ura, che perme ono di
andare a far migrare la proteina da degradare (tramite un
riconoscimento fa o dall’aggiunta di ubiqui ne a tale proteina) ➞ viene degradata nei suoi
amminoacidi e li rimuove.

LA TRADUZIONE:
L’elemento chiave nei meccanismi di traduzione è l’RNA transfer, il nostro
ada atore. Questo è formato da una stru ura a trifoglio, da braccia cara eris che
di cui due sono quelle principali e sono:
1. quello che porta L’amminoacido al 3’
2. il braccio che con ene l’an codone (che si appaia con il codone).
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 Questa è un’immagine in cui vediamo le cara eris che del tRna:
- in alto il braccio acce ore dell’amminoacido
- tu i tRNA niscono con la triple a
conservata CCA, che è importante per il
riconoscimento dei tRNA durante la traduzione
- abbiamo il braccio dell’an codone che lega il
codone dell’mRna
- un braccio D, poiché spesso con ene basi
modi cate come la Diidrouridina
- il braccio T, composto da 5 paia di basi
tendenzialmente, che con ene anche qui una
sequenza altamente conservata e una base
modi cata che è la pseudouridina.
- può esserci un braccio extra variabile piu osto
piccolo.

Una cosa cara eris ca per il tRNA è che questa è la

stru ura secondaria, ma possiede anche una stru ura
terziaria che ha una forma ad L rovesciata.
In una macromolecola, nel momento in cui abbiamo più funzioni par colari possibili, ques si quasi
sempre sono separa dalla massima distanza ➞ la conformazione che assume un tRNA nella sua forma
terziaria è ad L rovesciata dove lo stelo acce ore (che interagisce con L’amminoacido) è alla massima
distanza dallo stelo dell’an codone (che interagisce con il codone).

Ovviamente il meccanismo chiave per far sì che i

tRNA possano perme ere la sintesi della proteina
è il legame degli amminoacidi al tRNA. Questo
legame avviene con un meccanismo di questo po:
un aminoacido prima di poter interagire con il
tRNA dovrà essere adenilato, ovvero si formerà per
reazione tra l'amminoacido e l’ATP; l'ossigeno
andrà ad a accare il fosfato in Alfa dell'ATP, ciò
porterà alla formazione di un pirofosfato e di un
amminoacido adenilato e l'aminoacido adenilato
potrà reagire con il tRNA scarico che con il suo
gruppo OH al 3’ andrà a reagire con il carbonio
carbonilico e perme erà la formazione di un
legame ad alta energia e perme erà quindi la
formazione del tRNA che sarà carico. Quindi per
perme ere un legame tra tRNA e il suo aminoacido
ci sarà bisogno della adenilazione
dell'amminoacido.
Per perme ere che ci sia questo meccanismo
dovranno intervenire degli enzimi che sono le
tRNA-sintetasi, quindi un aminoacido adenilato
(aminoacilAMP) potrà reagire con gruppo
ossidrilico al 3’ del tRNA.
Di queste tRNA-sintetasi abbiamo due classi:
• Classe 1, il gruppo ossidrilico in 2 del ribosio che va ad a accare il gruppo carbonilico
dell’aminoacilAMP e andrà per il rilascio quindi dell’AMP a caricare sul carbonio in 2 l'amminoacido.
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 Noi sappiamo che però l’aminoacido è caricato sul carbonio 3 all’adenina terminale del tRNA, per
fare questo passaggio ci dovrà essere quindi una reazione di transesteri cazione che porterà
l'ossidrile in 3 del ribosio ad a accare carbonio carbonilico legato all'ossigeno in 2 del ribosio stesso
e a spostare quindi l'amminoacido sul carbonio in 3.
• Classe 2: agisce invece facendo in modo che dire amente ci sia il legame tra gruppo ossidrilico in 3
del ribosio e il carbonio carbonilico dell'amminoacido. Quindi c'è un passaggio in meno.

Quando il tRNA è stato caricato del suo amminoacido, l'amminoacido non ha più in uenza sulla sua
speci cità. Questo vuol dire che il legame codone-an codone perme erà che venga reclutato quel
determinato tRNA ma nel momento in cui abbiamo l'interazione tra due sequenze codone-an codone, un
amminoacido se è caricato e viene modi cato questa modi cazione non sposta più il messaggio codi cato
dall'interazione tra i due RNA.
Esperimento: è stato fa o interagire un messaggero con un tRNA che portava la cisteina (quindi la triple a
UGU del messaggero viene riconosciuta dalla triple a ACA dell'an codone) nel momento in cui si andava a
indurre una desolfonazione, ciò portava ad un cambiamento dell'amminoacido, quindi si portava la
formazione di un’alanina invece di una cisteina; ma una volta che il tRNA è stato caricato l'aminoacido non
ha più nessuna in uenza sulla speci cità, che è data solo dall’an codone. Quindi cambia l'amminoacido ma
questo legame rimane e quindi vuol dire che la sequenza dell'an codone consente da sola all’aminoacil-
tRNA di riconoscere il codone corre o.
Una cosa che dobbiamo riconoscere è quella di imparare a leggere quando troviamo sui libri i vari legami tra
il tRNA e l'aminoacido e capire in che modo li ritroviamo presenta a livello di nomenclatura.
-
se vediamo scri o che abbiamo un tRNA e in apice l'abbreviazione a tre le ere dell'amminoacido
(tRNAAla) vorrà dire che quello è il tRNA in grado di legare l'alanina.
- se vi sono più tRNA in grado di legare lo stesso amminoacido vediamo che in pedice troveremo
scri o tRNA1 e in apice l'amminoacido, tRNA2 e in apice l'amminoacido corrispondente
- se il tRNA invece è già legato all'amminoacido, questo non va scri o in apice ma va aggiunto come
pre sso. Quindi in questo caso Ala-tRNA, ovvero quel tRNA già carico con l'amminoacido alanina.
Il messaggero viene trado o dei ribosomi! possono essere liberi, per esempio, in una cellula procario ca,
oppure ribosomi liberi a livello citoplasma co di una cellula eucario ca ma anche lega al re colo
endoplasma co.
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 Questa immagine fa riferimento all'importanza dell’apparato
della sintesi proteica, guardando la grandezza di un ribosoma e
confrontandola con la grandezza degli RNA con cui dovrà
interagire. Come vedete il ribosoma è abbastanza grande da
poter ospitare contemporaneamente su di sé, in ogni momento,
due tRNA ed anche una parte dell’ RNA messaggero che dovrà
essere trado o.
Vediamo l'importanza che ha nell'economia di una cellula (in
questo caso nell'economia di una cellula procario ca, ma
eucario ca è la stessa cosa) tu o il macchinario che serve per la
traduzione. Ovvero, se prendiamo la massa cellulare secca in
percentuale di una cellula avremo il 10% parete, 10% membrana,
1.5% DNA e poi gli RNA ribosomiali, che da soli fanno il 16% della massa cellulare secca procario ca e il 9% è
formata da proteine ribosomiali. (quindi ben il 25% serve per quei componen che perme eranno
l'espressione di geni e porteranno quindi alla sintesi delle nostre proteine).

Torniamo sul nostro ribosoma. Nell'immagine vedete il nostro mRNA

che interagisce con le due subunità ribosomiali. Nell'immagine vedete 3
si di interazione del ribosoma con i tRNA, ovvero il sito E (exit, ovvero
sito di uscita), il sito P (pep dil-tRNA) ed il sito A (aminoacil-tRNA).
La sintesi proteica è cara erizzata da tre fasi:
• INIZIO, ovvero quando il ribosoma va a legare il messaggero, si
lega ad esso e comincia la sintesi proteica
• ALLUNGAMENTO, ovvero come viene allungata la catena polipep dica. Il ribosoma si sposta sul
messaggero no a quando non verrà riconosciuto il codone di STOP.
• si arriverà alla TERMINAZIONE della sintesi proteica.

COME AVVIENE L’INIZIO DELLA TRADUZIONE

Nell'immagine vedete le due subunità ribosomiali separate che dovranno
interagire con il nostro messaggero (in verde) e con il tRNA, che è il tRNA
INIZIATORE, ovvero quel tRNA che è in grado di riconoscere la triple a di inizio
AUG, ovvero quel tRNA che ha l'amminoacido me onina. Questo tRNA che lega
la me onina è quello che si può legare al sito P. Quindi la traduzione di un
messaggero comincia sempre con un codone AUG e richiede sempre questo
tRNA iniziatore che porta su di sé l'amminoacido me onina.
Nei ba eri e negli organelli eucario ci questo tRNA iniziatore è formilato,
ovvero viene aggiunto un gruppo funzionale CHO (in rosso nell’immagine) che va
a bloccare il gruppo amminico dell'amminoacido e il blocco di questo gruppo
amminico impedisce l'allungamento, ma perme e l'inizio della traduzione.
Negli eucario il tRNA iniziatore non è formilato però ci sono altre proteine che
faranno in modo di bloccare il gruppo amminico per la stessa esigenza, ossia
impedire allungamento ma perme ere l'inizio della traduzione.
Chiaramente la me onina è il primo amminoacido nella sintesi proteica di
eucario e procario , ma non è sempre il primo amminoacido di tu e le
proteine. Quindi le proteine possono cominciare con la me onina ma non tu e
necessariamente cominciano con questa. Questo vuol dire che questa me onina
deve essere rimossa, quindi ci saranno degli enzimi che sono delle DEFORMILASI che vanno a ristabilire la
presenza del gruppo amminico e la perdita del gruppo CHO, poi ci saranno delle PEPTIDASI che vanno a
eliminare la me onina se questa me onina non è quella che dovrà essere la prima della sequenza pep dica.
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 Come mai questo tRNA è il tRNA-iniziatore?
Perché è l'unico tRNA che è in grado di interagire con il sito P (gli altri tRNA interagiranno tu con il sito A).
Questo tRNA è quello che consente un legame speci co a livello del sito P perché vi sono al livello del
braccio degli an codoni tre appaiamen G-C (che sono quei tre appaiamen che perme ono il legame al
sito P). È importante che il primo sito P sia occupato all'inizio della traduzione altrimen non ci sarà la
possibilità di formare dei legami pep dici (questo potrà essere fa o solo se il sito P è occupato da un tRNA
che porta su di sé la me onina). Ci sarà una loro interazione tramite legame codone-an codone, si avrà
l'interazione con la subunità maggiore ribosomiale e dopo potrà interagire nel sito A il tRNA che porta
l'aminoacido successivo nella catena pep dica.

TRADUZIONE NEI PROCARIOTI:

INIZIO
Nella traduzione nei procario sarà necessario sicuramente la subunità 30s e vari fa ori accessori.
Vediamo le due subunità ribosomiali, che non saranno associate all’inizio della sintesi proteica:
interverranno una serie di fa ori di inizio (IF sta per “Ini a on Factors”).
I fa ori di inizio per i procario sono 3:
Il fa ore di inizio 3 è quel fa ore d’inizio che impedirà alla subunità maggiore 50S di interagire con la
subunità minore 30S prima che questa
abbia ospitato su di sé il t-RNA iniziatore.
Poi bisognerà fare in modo che venga reso
disponibile l’accesso del sito P e non del
sito A, quindi intervengono altri due fa ori
di inizio, che andranno ad interagire con il
sito A: il fa ore di inizio 1 che richiama il
fa ore di inizio 2 su di sé, legato a GTP.
Solo con la formazione di questo
complesso il t-RNA iniziatore interagisce
con la subunità 30S, e viene reclutato sul
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 sito P, che è l’unico disponibile.
A quel punto, il fa ore di inizio 3 non è più necessario, e la subunità maggiore 50S può legarsi alla subunità
minore, vengono rilascia anche gli altri due fa ori di inizio, 1 e 2, e può iniziare la sintesi della proteina:
complesso di inizio 70S.
Ora, il momento chiave è il riconoscimento della subunità minore del messaggero e l’iden cazione del
codone d’inizio.

Come avviene nei procario ?

Qui vediamo un messaggero procario co: lo riconosciamo dal fa o che non vediamo le quotazioni al
terminale 5’-3’, e in più vediamo che esistono su questa sequenza diversi si di riconoscimento ribosomiali
che sono gli RBS, ovvero RiBosome Site. È un
messaggero procario co, ci sono diversi si di
riconoscimento e diverse sequenze di inizio, e
chiaramente è un messaggero in grado di
codi care per diversi pep di. In ques RBS sono
presen delle sequenze cara eris che che
perme eranno al messaggero di legarsi ai
ribosomi; lo faranno perché ci saranno delle
sequenze sul messag gero, che sono
complementari alle sequenze che cara erizzano
gli RNA ribosomiali, precisamente la subunità
16S.
Questa interazione tra RRNA del ribosoma e
messaggero servirà per guidare la subunità
minore e legarla al messaggero.
Questa sequenza è stata iden cata da due ricercatori, Shine e Dalgarno: hanno trovato una sequenza
consenso (quelle sequenze che sono cara erizzate dalla presenza della stessa sequenza nucleo dica in
determina pun del genoma, in questo caso dell’RNA).
Questa sequenza di Shine-Dalgarno è contenente sempre GGAGG a monte del codone di inizio.
La presenza di questa sequenza perme e il richiamo dell’RNA sulla subunità ribosomiale minore, e quindi
l’iden cazione della triple a AUG nei procario .

Questa immagine rappresenta come è stata iden cata sperimentalmente questa sequenza AUG: in vitro
sono state portate delle interazioni tra l’RNA messaggero in viola e i ribosomi; se si fanno agire ques
complessi ribosoma-messaggero con delle nucleasi, queste
ul me sono in grado di digerire il messaggero ma soltanto
quando il messaggero non è prote o dall’interazione con il
ribosoma. Quindi è stato degradato il messaggero non
prote o, e si è anda ad analizzare la sequenza che porta
l’AUG (quella prote a dal ribosoma); iden cata questa
sequenza, si è visto che c’era sempre una triple a AUG e che
a monte di questa c’era sempre una sequenza consenso, che
era GGAGG, che è la sequenza di Shine-Dalgarno.
Questo era in tu e le sequenze analizzate.
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 Nei messaggeri eucario ci l’inizio è diverso
perché sarà la subunità minore che migrerà sui
si d’inizio. Questo è legato alle cara eris che
stru urali del messaggero eucario co: al 5’ vi è la
presenza di un cappuccio me lato.
Negli eucario la subunità minore si lega al
cappuccio me lato, si muove sul messaggero e va
ad interce are la triple a AUG. Si parla proprio di
“MODELLO DI SCANSIONE”: subunità minore lega
il cappuccio, fa uno scanning del messaggero, che
andrà a trovare una sequenza AUG; una volta
trovata, si potrà legare la subunità maggiore
(dopo intervento del t-RNA iniziatore, SEMPRE).
C’è quindi un diverso meccanismo con cui
avviene la traduzione nei procario e negli eucario .

Esiste anche, per gli eucario , un inizio alterna vo: è stata vista l’esistenza di alcune sequenze
cara eris che all’interno della stru ura del messaggero, che si chiamano sequenze IRES (ovvero, Internal
Ribosome Entry Site); alcuni messaggeri sono in grado di iniziare la traduzione in maniera indipendente dal
cappuccio. Questo è un meccanismo pico dei messaggeri virali, che non hanno il capping, quindi u lizzano
questo meccanismo: delle sequenze consenso all’interno della stru ura del
messaggero che vengono riconosciute da alcuni fa ori di inizio (se è una cellula
eucario ca, il fa ore di inizio che riconosce le sequenze IRES è IF4F e che
perme erà questa interazione).
Per la nomenclatura, nelle cellule eucario che, la di erenza principale è che c’è
sempre il pre sso -e.

Inizio in una cellula eucario ca: è molto più complesso rispe o ad una cellula
eucario ca! quello che in una cellula procario ca fanno 3 fa ori di inizio, in una
cellula eucario ca è svolto da diversi fa ori di inizio, il cui compito sarà sempre
quello di andare ad inibire il legame del t-RNA iniziatore con il sito A ribosomiale,
inibire l’associazione tra subunità maggiore e minore prima che questa sia
necessaria, esporre il sito P al legame con il t-RNA iniziatore.
Non solo fa ori di inizio che servono ai compi svol da quelli procario ci, ma
devono perme ere di riconoscere il cappuccio al 5’, reclutamento di altri fa ori di
inizio che perme eranno il legame di un messaggero legato ai fa ori di inizio E, G,
ed A, con la subnità ribosomiale minore legata ai fa ori di inizio 1, 2, 3 e 5 (mol
più fa ori di inizio rispe o alla cellula procario ca).
Nella cellula eucario ca il meccanismo è più complesso: non è necessario ricordare
cosa fanno tu i fa ori di inizio, ma sicuramente bisogna ricordarne qualcuno in par colare;

▪ eIF4B ! compito di elicasi, quindi tende a

fare in modo che il ribosoma, una volta che si
trova ad interagire con il messaggero non trovi
condizioni di stru ure secondarie davan , ma
possa lavorare su un RNA svolto;
▪ eIF4E ! importante per legare il
cappuccio, e sarà quello che perme erà il
reclutamento della subunità ribosomiale
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 minore e perme erà il meccanismo di scansione
per il riconoscimento della triple a AUG;
▪ eIF4G ! funziona da ada atore sull’RNA
messaggero.

Nel momento in cui un messaggero forma il complesso

di pre-inizio con tu e i fa ori di inizio lega ad un
messaggero subunità minore, poi potrà legarsi la
subunità maggiore, che porterà al rilascio di tu i
fa ori di inizio, che non saranno più necessari, anche
perché dovranno liberare il sito A ed il sito E, che
saranno parzialmente occupa ; è necessario che siano
liberi per far sì che avvenga l’allungamento.

Quindi abbiamo il complesso di inizio,

che si forma per interazione delle due
subunità ribosomiali, e il t-RNA, dopo
che sono intervenu tu ques fa ori
di inizio, che non saranno più necessari
quando la cellula sarà in grado di andare
incontro al processo di allungamento.

Nelle cellule eucario che, quello che

fanno 3 fa ori di inizio nelle cellule procario che, viene svolto
da 14 fa ori di inizio: le funzioni chiave sono fondamentalmente
quelle che svolgono quelle tre nelle procario che perché il
messaggero è molto meno complesso.

Tu i fa ori di inizio alla ne del primo step, prima che avvenga l’allungamento, vengono rilascia perché
non è necessario il loro intervento: tranne eIF4F, che è dato da queste tre subunità, IF4A, IF4G e IF4E.
Non viene rilasciato perché questo fa ore di inizio è in grado di interagire con la coda di poli-A: è
importante perché perme e il reclutamento veloce e rapido del ribosoma a livello del messaggero, una
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 volta che è nito il ciclo (nel caso in cui fosse necessario si possono trovare
ribosomi disponibili a nché possano essere nuovamente recluta dal
messaggero se la sintesi di quella proteina sarà ancora necessaria).
È un meccanismo per cui il legame di alcuni fa ori di inizio al messaggero,
facilita la traduzione e la rende più e cace.

ALLUNGAMENTO
Una volta iniziata, le due subunità ribosomiali possono scorrere sul messaggero
e andare ad allungare il pep de. Quindi all’inizio abbiamo il sito P, occupato dal
t-RNA che porta la me onina e il sito A è libero.
L’amminoacil-t-RNA, che porta un amminoacido cara eris co con la triple a,
andrà a legarsi al codone del messaggero; si formerà il legame pep dico, ci sarà
lo spostamento dei ribosomi per fare in modo che il sito A torni nuovamente
disponibile e il sito P sia occupato dal t-RNA che prima si trovava nel sito A, ed il
sito E sia occupato dal t-RNA che portava l’amminoacido iniziatore, ma che
adesso è stato spostato, grazie alla formazione del legame pep dico, sull’altro t-
RNA; quindi sarà nel sito
E, “di scarico” o “di
uscita” e potrà essere eliminato.

Per far sì che possa avvenire l’allungamento, saranno

necessari alcuni fa ori di allungamento:
un fa ore di allungamento è quello che vedete
nell’immagine, che si chiama EF-Tu, dove EF sta per
Elunga on Factor: ha il compito di guidare
l’amminoacil-t-RNA nel sito A.

Perché? A livello del sito A, c’è un sito di legame per il fa ore di allungamento EF-Tu.
Nel momento in cui avviene il legame tra t-RNA e il suo an codone ed il codone del messaggero, EF-Tu verrà
rilasciato per formazione di un legame GDP e non più GTP, che era quello necessario per far avvenire la
reazione.
Quindi EF-Tu legato a GTP si può legare su un centro di legame presente a livello del sito A; una volta
reclutato, questo fa ore di allungamento non è più necessario e verrà rilasciato.

Come avviene l’interazione tra due amminoacidi?

L’interazione tra due amminoacidi avviene tramite
un meccanismo di reazione guidata da una pep dil-
transferasi! farà in modo che il gruppo amminico
dell’amminoacido che è stato caricato sul tRNA, che
si troverà sul sito A, vada a reagire con il carbonio
carbonilico dell’amminoacido che si trova sul sito P.
Porterà quindi alla formazione di una catena
pep dica legata al tRNA presente sul sito A e porterà
alla liberazione del tRNA che si trovava
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 precedentemente su sito P (sarà quindi l’RNA scarico). Il movimento del ribosoma sul messaggero
provocherà uno spostamento dei tRNA, dal sito A al sito P e dal sito P al sito E, quindi il sito A sarà
nuovamente disponibile e si allungherà la sintesi. Per fare in modo che questo spostamento possa avvenire
è necessario un altro fa ore di allungamento, ovvero l’EF-G (elonga on factor G).

È importante notare come l’ EF-Tu, ovvero il primo fa ore di

allungamento, quando lega l’amminoacil-tRNA, ha una stru ura molto
simile a quella che ha la proteina EF-G e grazie a questa conformazione
riesce ad entrare nel sito A e di conseguenza a promuovere la
traslocazione.
Quindi elemen chiave, come i fa ori di allungamento nella traduzione,
sono EF-Tu ed EF-G, ma ques due fa ori riusciranno a lavorare solo
quando saranno lega al GTP. Quindi è l’idrolisi del GTP che porterà al
legame dei due fa ori di allungamento sul sito A.
L’ul mo importante fa ore di allungamento, oltre a EF-Tu e EF-G, sarà EF-
Ts, il cui ruolo è quello di ripris nare i legami con i GTP quando i fa ori di
allungamento sono scarichi.
Quindi EF-Tu scarico tornerà a vo se legato al GTP e il fa ore di
allungamento responsabile del ripris no del legame di EF-Tu con il GTP è
l’EF-Ts.
Quindi EF-Tu legato al GDP, lega EF-Ts che perme erà lo scambio con il GTP e a quel punto EF-Tu collegato
con il GTP può legare l’amminoacil-
tRNA e può dirigersi sul sito A.
Quando l’EF-Tu è scarico questo non
può avvenire quindi EF-Ts deve
perme ere questo con nuo
“riciclo”.
La traduzione con nuerà nchè non
si arriva ai CODONI DI STOP, che
sono tre, ovvero:
•UAG! Amber
•UAA! Ochre
• UGA! Opal
In questa fase sono necessari i fa ori di rilascio RF, ovvero i fa ori che riconoscono i codoni di
terminazione.
I fa ori di rilascio sono:

RF-1! Riconosce le triple e UAA e UAG !(Fa ore di rilascio di classe 1)

RF-2! Riconosce la triple a UAA e UGA!(Fa ore di rilascio di classe 1)

RF-3! Rimuove RF-1 dopo l’idrolisi del pep de ! (Fa ore di rilascio di classe 2)

L’immagine mostra come può avvenire la terminazione della sintesi proteica: i fa ori di rilascio vanno a
simulare un tRNA e lo potranno fare poiché ci sono delle sequenze speci che della proteina (per RF-1
questa sequenza speci ca è una triple a formata dagli amminoacidi serina, prolina e fenilalanina) che
perme ono di riconoscere un codone di stop. Il fa ore di rilascio deve quindi perme ere che venga
riconosciuto sul messaggero il codone di stop e deve avere delle cara eris che stru urali tali da perme ere
l’idrolisi del pep de.
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 Quindi, il fa ore di inizio riconosce il codone di stop tramite le sequenze speci che, in più ha su di sè un
“mo vo” che è il GGQ (glicina, glicina, glutammato) che perme e l’idrolisi del pep de e quindi il rilascio del
legame tra tRNA e pep de. Una volta avvenuta l’idrolisi l’RF-1 viene rimosso dall’ RF-3 (che appar ene ad
un’altra classe di RF).
Quindi anche per la terminazione è necessario l’impiego di più proteine che perme ano il rilascio e bisogna
considerare che tu e le molecole che hanno partecipato alla sintesi proteica (come i vari fa ori di inizio, di
allungamento e di rilascio) saranno riu lizzate, così come verranno riu lizza i ribosomi, grazie a delle
proteine che legano i ribosomi e che perme eranno il loro riu lizzo, ovvero i fa ori di riciclo dei ribosomi
(RRF).

(Guardare le slide riassun ve dalla n. 51).

ESERCIZI

IL CODICE GENETICO:

Con la sintesi proteica

siamo passa da un
linguaggio di nucleo di ad
un linguaggio di
amminoacidi; un codone è
fa o da triple e poiché gli
amminoacidi sono 20 e il
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 linguaggio delle basi è di 4 !"se una base
speci casse solo per un amminoacido
potremmo codi carne solo 4, se invece
fosse la combinazione di 2 basi a
speci care allora avremmo 16
amminoacidi, siccome sono 20 le
combinazioni devono essere fa e da 3
basi, 4 alla terza ossia 64 combinazioni che
speci cano per i 20 amminoacidi.

Di queste triple e ne abbiamo 3 che non

codi cano per nessun amminoacido: UAG,
UAA, UGA. Quindi 61 triple e che
codi cano per un amminoacido.

Per codice gene co intendiamo tu a quella serie di regole che ci consentono di passare da un linguaggio di
triple e di basi ad uno di amminoacidi. Questo codice è uguale per tu e le cellule, sia procario che che
eucario che.
Ci sono alcune di erenze solo ed esclusivamente per quanto riguarda il dna mitocondriale (unico organello
eucario co contenente materiale gene co).

Essendo 61 le triple e che codi cano per

20 AA ! una cara eris ca del nostro
codice gene co è che è ridondante: ossia
ogni AA può essere speci cato da più di
un codone.
Qui vediamo la tabella con i vari
amminoacidi con nomenclatura ad una
le era sola, e poi le triple e in grado di
speci care per ciascuno di essi. Es:
l’arginina da 6 triple e ecc, ma alcuni
come la me onina e il triptofano sono
codi ca da una sola.
Dall’immagine possiamo anche vedere che le triple e dei diversi codoni sono diverse sopra u o a livello
della 3a base.

Per leggere una sequenza dobbiamo capire dove leggere, a seconda del modulo di le ura che abbiamo
davan . Questo viene de nito dalla sequenza iniziale, dall’inizio della traduzione. La capacità di discernere
quale è la prima sequenza corre a è il modulo di le ura, quindi ci aiuta a de nire la triple a di inizio e
quella di stop.

In una determinata sequenza genomica o genica possiamo iden care più triple e di inizio !" dobbiamo
andare a vedere quale è quella sequenza che ci perme e di iden care il minor numero di codoni di stop.
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 Quindi più sono i codoni di stop, che non facilitano la le ura da parte del ribosoma, più sarà improbabile
che quella sequenza di inizio sia realmente quella iniziale. Se invece i codoni di stop sono minori sarà più
facile la le ura.
Dobbiamo quindi iden care quelle triple e che ci perme ono di cara erizzare la sequenza: la triple a di
inizio e quelle di stop.

CARATTERISTICHE DEL CODICE GENETICO:

- il codice gene co è a triple e
- È ridondante
- È universale
- Non è ambiguo !" ossia si un amminoacido può essere speci cato da più di un codone, ma quel
codone codi ca solo e soltanto per
quell’AA.
- È senza punteggiatura e non
sovrapponibile, ossia non possiamo
saltare o sovrapporre basi tra di loro.
Deve essere le o di con nuo.

Tabella in cui vediamo le 61 triple e che

codi cano gli amminoacidi e le 3 di stop.
AUG codone di inizio che speci ca per la
me onina.
È stato fa o un ESPERIMENTO per vedere, con
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 l’u lizzo di un tRna, quali altri accoppiamen tra codoni e
amminoacidi possono essere determina . Questo è stato fa o
per capire esa amente chi fa cosa, al di là del primo tRna
iniziatore (unico in grado di andare a legare il sito P a livello dei
ribosomi poiché ha delle cara eris che stru urali che gli
consentono di fare ciò), quindi per capire quali sono i
codoni che legano speci ci an codoni e quali sono gli
amminoacidi speci ca .
Sono sta sinte zza dei messaggeri molto cor che
avevano dei codoni no , per esempio il GUU in verde che
speci ca per la valina. Per capire che e e vamente si
tra asse della valina sono sta aggiun vari tRna uni agli
amminoacidi e si è visto che il ribosoma legava il
messaggero e i tRna da esso speci ca .
Si possono separare i vari componen sulla base dei
complessi che vengono forma , quindi tramite l’u lizzo di ltri
sele vi si può far incorporare a livello del ltro il componente più grande ossia quello formato dal tRna,
mRna, ribosoma e amminoacido e si è visto che questo codone andava a legare la triple a che porta la
valina e non gli altri. Quindi in vitro sono sta determina esa amente le corrispondenze tra codoni,
an codoni e amminoacido corrispondente !" tabella che ci perme e di speci care tu e 61 codoni che
codi cano per i 20 AA.

In una lezione precedente abbiamo visto tale immagine. Il

fa o che un amminoacido possa essere speci cato da più
codoni non vuol dire che tale amminoacido sia
necessariamente quello presente in maggior quan tà nelle
proteine !" il triptofano speci cato da un solo codone è
quello che si ritrova in minor % nelle proteine, però vi sono
aminoacidi come l’arginina la cui % nelle proteine è più bassa
di altri aminoacidi come l'alanina, glicina (speci ca da 4
codoni e non da 6) oppure anche come la l'isoleucina
speci cata da 3 codoni oppure la lisina speci cata da 2.

!" non c è una correlazione tra il numero di codoni che

speci cano per un AA e la sua frequenza all’interno della proteina.

A nché avvenga la sintesi proteica il tRNA sarà selezionato sull’interazione tra codone e an codone ! fa da
tramite, non vi è una interazione dire a tra amminoacido e messaggero.
Ricordiamoci che parliamo di interazione codone-an codone e che quando leggiamo una sequenza la
leggiamo sempre in direzione 5’-3’; mentre la sequenza del tRna che deve leggere tale codone invece la
leggiamo al contrario !"la prima base dell’an codone riconosce la terza base del codone, scriviamo ACG-
CGU (l’an codone va sempre le o al rovescio, in direzione 5’-3’). L’interazione avviene sempre tra basi di
coppie complementari.
Il numero di codoni è maggiore del numero di amminoacidi (61 codoni, 20 AA).
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 A ques 61 codoni non corrispondono 61 tRna ma
ne corrispondono tra i 30-40 nei procario e circa
50 negli eucario ! gli an codoni di alcuni tRna
possono accoppiarsi a più di un codone e non ad
u n o s o l o . L’a c co p p i a m e nto p u ò e s s e re
approssima vo; questo è legato al fa o che
alcuni tRna richiedono un appaiamento accurato
a livello delle prime due basi del codone (ul me
due dell’an codone) ma tollerano 1 appaiamento
scorre o nella terza posizione !" appaiamento
oscillante, che si può veri care appunto nella
terza posizione. Quindi se la prima base
dell’an codone è una U , la terza base del codone
può essere le a sia da una A che da una G. Se invece la
prima base dell’an codone è una G questa può essere le a
sia da una C che da una U.
Vi è quindi la possibilità dell'oscillazione delle basi a livello
della terza base del codone (la prima dell’an codone).
Ques accoppiamen che si veri cano sono quelli che
vediamo nell’immagine. In alto abbiamo quelli classici, in
basso un possibile accoppiamento che si può veri care tra la
Guanina e l’Uracile tramite la formazione di 2 legami H.
Inoltre sempre a livello della terza base del codone vi può
essere un accoppiamento con una base modi cata,
l’INOSINA, che può legarsi sia con A che con C che con U
formando 2 legami H.

Quali sono gli enzimi in grado di caricare gli amminoacidi

sul tRna? Sono le sintetasi, e sono ognuna speci ca per un
dato tRna. Abbiamo quindi 20 amminoacil-tRNA-sintetasi.
Esistono dei tRna che rappresentano lo stesso
amminoacido e sono de isoacce ori, i quali u lizzano
degli enzimi che vanno prima ad adenilare l’amminoacido
per poi andarlo a caricare sul tRna. Vi è quindi un sito per
l’ATP e un sito per l’AA a livello di questo enzima.
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 Quindi l’a vazione della sintetasi avviene
tramite la formazione dell’amminoacil-AMP per
reazione con ATP e rilascio di un pirofosfato
(ossigeno del gruppo carbossilico
dell’amminoacido a acca il fosfato in alfa
dell’atp !" adenilazione dell’AA e rilascio di
pirofosfato). Tale amminoacido poi a vato
verrà trasferito al tRna ! la seconda
reazione sarà che l’OH del tRna andrà a
legare il gruppo carbonilico
dell’amminoacido adenilato con il rilascio
dell’AMP e quindi il carico dell’AA.

Queste sintetasi possono essere di 2 classi, classe 1 e classe 2. Di erenza: hanno mo vi stru urali diversi,
ma sopra u o il sito di amminoacilazione cambia

- per la classe 1 comporta l’amminoadenilazione a livello del 2’ !"vi è un doppio step successivo che
porterà all’acilazione a passare dall’ossidrile del carbonio in 2 a quello del carbonio in 3
- mentre nella classe 2 avviene a livello del 3’, che avviene dire amente all’ossidrile al carbonio in 3.

Il ruolo delle sintetasi è importante poiché è l’ul mo passaggio, prima della sintesi della proteina, per cui
possiamo ancora correggere un eventuale errore che si è veri cato.
Le sintetasi possono agire tramite 2 pi di accuratezza:
1. CINETICA: capacità di una sintetasi di avere una maggiore a nità con uno speci co tRna, che sarà
legato corre amente e quindi avrà più conta con l’enzima (il quale si associa rapidamente con l’AA
che deve essere caricato). Se il tRna non è stato legato corre amente vorrà dire che i conta con
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 l’enzima che si associa saranno meno, quindi sarà meno probabile quel po di legame e sarà
preferito il legame con un tRna con più legami. È quindi un’accuratezza correlata con la capacità di
legame del tRna con l’enzima.
2. CHIMICA: si veri ca quando vi è un controllo di ciò che è stato caricato dopo che è stato aggiunto
l’AA eventualmente errato. Se una sintetasi lega un amminoacido non corre o !"tale AA viene le o
come sbagliato e poi
idrolizzato dalla cellula.
Oppure nel caso in cui viene
caricato il tRna in maniera
non idonea, questo viene
corre o in un secondo
momento sulla base
dell’amminoacido che verrà
sos tuito. Ossia o viene
eliminato dire amente l’AA
errato (rimozione di tu o il
complesso amminoacil-tRna),
oppure nel tRna può essere
sos tuito semplicemente
solo l’AA che è stato caricato
in maniera non corre a,
tramite una serie di reazioni chimiche.

Tale capacità quindi è importan ssima, perché dopo questo passaggio gli errori non potranno più essere
corre . Tu gli step in una cellula sono in grado di essere monitora e corre (es: capacità di correzione
delle polimerasi). Questo anche a livello della sintesi proteica, e l’ul mo momento in cui si va a controllare
un eventuale errore che porterà alla produzione di una proteina sbagliata è proprio a livello delle sintetasi.
La % di errore a livello cellulare aumenta a mano mano che va avan il processo, per cui la capacità di
correzione sarà maggiore se vi è un errore a livello del dna, piu osto che a livello di un messaggero,
piu osto che a livello della sintesi. Più l’errore si trova a monte del processo della sintesi più potrebbe
succedere che questo sia letale per la cellula.
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