Miglioramentodellereseinfrumentoduromediantesilenziamentodelgene Grain Weight 2

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.
net/publication/340255797
Miglioramento delle rese in frumento duro mediante silenziamento del gene

Grain Weight 2
Thesis · January 2017

DOI: 10.13140/RG.2.2.24633.31842
CITATIONS READS
0 1,673
1 author:
Simone Camazzola
University of Bologna
3 PUBLICATIONS 0 CITATIONS
SEE PROFILE
All content following this page was uploaded by Simone Camazzola on 28 March 2020.
The user has requested enhancement of the downloaded file.

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DELLA TUSCIA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE AGRARIE E FORESTALI (DAFNE)
CORSO DI LAUREA DI 1° LIVELLO IN “SCIENZE AGRARIE E

AMBIENTALI (L-25)
CURRICULUM BIOTECNOLOGIE AGRARIE
Miglioramento delle rese in frumento duro mediante

silenziamento del gene Grain Weight 2
Relatore Candidato
Prof: Francesco Sestili Simone Camazzola
Anno accademico 2015/2016

INDICE
1. Introduzione ..................................................................................................................... 1
1.1 Il frumento .................................................................................................................... 1
1.1.1 Origine e filogenesi del frumento .......................................................................... 2
1.1.2 Il successo del frumento ........................................................................................ 4
1.2 Il Problema delle rese ................................................................................................... 6
1.2.1 Possibili soluzioni per aumentare le rese ............................................................... 7
1.3 Il miglioramento genetico ............................................................................................ 8
1.3.1 Il miglioramento genetico convenzionale ............................................................. 9
1.3.2 Il miglioramento genetico non convenzionale .................................................... 10
1.3.2.1 Traformazione con metodo biolistico ........................................................... 11
1.3.2.2 Trasformazione con Agrobacterium tumefaciens ......................................... 12
1.3.2.3 RNA interference (RNAi) ............................................................................. 14
1.4 Geni implicati nella determinazione delle dimensioni della cariosside ..................... 17
1.4.1 Il gene Grain Weight 2 (GW2) ............................................................................ 17
1.4.2 Ruolo della proteina GW2 in frumento ............................................................... 19
1.4.3 La proteina RING e la reazione di ubiquitinazione ............................................. 24
1.5 Altri geni implicati nelle rese ..................................................................................... 25
1.5.1 Il gene Grain weight 7 (GW7) ............................................................................. 25
1.5.2 Il gene GASR7 .................................................................................................... 26
1.5.3 Il gene Dense and Erect Panicle 1 (DEP1) .......................................................... 26
2. Finalità ............................................................................................................................ 28
3. Materiali e Metodi ......................................................................................................... 29
3.1 Materiale vegetale ...................................................................................................... 29
3.2 Costrutto RNAi .......................................................................................................... 30
3.3 Screening PCR per la presenza del costrutto ............................................................. 30
3.4 Estrazione del DNA genomico da una foglia di frumento ......................................... 32

3.5 Secondo screening PCR per la presenza del costrutto ............................................... 32
3.6 Analisi di espressione del gene GW2......................................................................... 33
3.7 Analisi fenotipica ....................................................................................................... 35
4. Risultati e Discussione ................................................................................................... 36
4.1 Primo screening delle piante transgeniche per la presenza del costrutto ................... 36
4.2 Secondo screening delle piante transgeniche per la presenza del costrutto ............... 38
4.3 Valutazione del profilo di espressione di GW2 ......................................................... 40
4.4 Fenotipizzazione delle linee transgeniche .................................................................. 43
5. Conclusioni ..................................................................................................................... 47
6. Bibliografia ..................................................................................................................... 48
Riassunto
Considerando che la produzione di frumento dovrà aumentare di circa il 60% entro il 2050
per soddisfare la domanda crescente di cibo dovuto all’aumento della popolazione,
l’attenzione di molti ricercatori è focalizzata su programmi di miglioramento genetico per
l’ottenimento di nuove varietà più produttive. La resa in granella nel frumento è un
carattere complesso, controllato da numerosi geni e con una forte influenza ambientale.
Recentemente la soppressione o la sottoregolazione dei geni Grain Weight 2 (GW2) in riso
e in frumento è stata associata ad un incremento della dimensione del seme e di
conseguenza delle rese. Il gene GW2 codifica per una ubiquitina ligasi E3 di tipo RING,
considerata un regolatore negativo della divisione cellulare all’interno della cariosside e
coinvolta nel turnover proteico attraverso la via del proteosoma 26S. L'obiettivo di questo
Elaborato è investigare l’effetto indotto dalla riduzione dei livelli di trascritto del gene
GW2 sulle rese in frumento duro. Per tale ragione sono state caratterizzate dal punto di
vista molecolare e fenotipico linee transgeniche di frumento duro in cui è stato introdotto
un costrutto per il silenziamento del gene GW2 mediante la tecnica dell'RNA interference.
La presenza del costrutto RNAi è stata rilevata mediante PCR in sette linee transgeniche
indipendenti. Le analisi di espressione genica, condotta su cariossidi immature, hanno
mostrato una drastica riduzione dei trascritti del gene target (-80% rispetto al controllo). La
caratterizzazione fenotipica ha evidenziato un incremento significativo del numero di
spighette per spiga in 6 linee transgeniche, della lunghezza della spiga in 4 linee, del
numero di spighe per pianta in 2 linee e del peso di 100 semi in una linea.
Parole chiave: frumento duro, miglioramento genetico, rese, Grain Weight 2, RNA
interference, phenotyng.
Abstract
As the world population is rapidly growing, the attention of many researchers is focused on
genetic improvement programs aimed to obtain novel high yielding varieties. Grain yield
in wheat is a complex trait, controlled by numerous genes and with a strong environmental
influence. Recently, the suppression or downregulation of Grain Weight 2 (GW2) gene has
been associated with an enhanced seed size and yield in rice and wheat. GW2 encodes a
RING-type protein with E3 ubiquitin ligase activity that negatively regulates grain width
through control of cell division in the spikelet hull and is involved in protein turnover
through the ubiquitin 26S-proteasome pathway. The goal of this Thesis is to investigate the
effect of the reduction in the level of gene expression of GW2 on yield in durum wheat.
For this reason, a molecular and phenotypic characterization has been carried out on durum
wheat transgenic lines, possessing a construct for the silencing of GW2 gene by RNA
interference technique. The presence of the RNAi construct was detected in 7 independent
transgenic lines by PCR. Gene expression analysis, conducted on immature caryopses,
have shown a drastic reduction of the target transcripts (-80% compared to control).
Phenotypic characterization revealed a significant increase in spikelet number per spike in
6 transgenic lines, ear length in 4 lines, ear number per plant in lines 2 and hundred seed
weight in a line.
Key words: durum wheat, genetic improvement, yield, Grain Weight 2, RNA interference,
phenotyping.
1. Introduzione
1.1 Il frumento
Il Frumento (Triticum spp.) risulta essere ad oggi una delle colture cerealicole più diffuse
al mondo, fondamentale sia nell’alimentazione umana, quanto in quella animale.
La superficie mondiale coltivata mediamente negli ultimi cinque anni ammonta a 220
milioni di ettari, superiore a quella di altri cereali molto importanti come il riso (Oryza
sativa L.) e il mais (Zea mays L.).
In accordo ai più recenti dati FAO nell’anno 2014 la produzione mondiale ha raggiunto le
729 milioni di tonnellate. La Cina è il primo produttore (126,2 Mt), seguita da India (94,4
Mt), Russia (59,7 Mt), Stati Uniti (55,3 Mt) e Francia (38,9 Mt). L’Italia nell’anno 2014 ha
prodotto 7,14 Mt, in leggera diminuzione rispetto alle annate precedenti (Fig. 1.1 e 1.2).
Figura 1.1. Dati in tonnellate, relativi ai dieci maggiori Paesi europei produttori di frumento,
(FAOSTAT, 2014).
1
Figura 1.2. Rese di frumento in tonnellate ettaro nell’anno 2014 a livello mondiale, nei diversi
Continenti e in Italia (FAOSTAT, 2014).
Il frumento ha così pochissimi rivali quando si parla di diffusione, viene coltivato da 67°
Nord di latitudine in Scandinavia e Russia e a 45° Sud in Argentina e perfino in regioni
tropicali (Feldman, 1995). La coltivazione ottimale si ha nei climi temperati, dove interessa
quasi esclusivamente due sottospecie, il frumento tenero (T. aestivum spp. aestivum) e il
frumento duro (T. turgidum spp. durum).
1.1.1 Origine e filogenesi del frumento
Il frumento appartiene alla famiglia delle Poaceae, sottofamiglia Pooideae, tribù Triticeae,
genere Triticum al cui interno troviamo molte specie. È una pianta longidiurna e
microterma, che necessita di vernalizzazione, anche se numerose varietà coltivate ormai
possono farne a meno. La sua storia di domesticazione inizia circa 10000 anni fa, nel
Medio Oriente precisamente a sud-est della Turchia, zona conosciuta come la Mezzaluna
Fertile (Dubcovsky e Dvorak, 2007). Grazie a tutta una serie di reperti archeologici e
citogenetici si è potuto ricostruire il percorso di diffusione, partendo dalla Mezzaluna
Fertile, salendo poi per il continente asiatico e quasi in contemporanea in quello europeo.
Durante questo periodo si sono susseguiti una moltitudine di eventi di ibridazione
interspecifica e raddoppiamenti del numero cromosomico, che hanno portato alla
formazione di nuove specie da cui derivano quelle attualmente coltivate. Per via di questi
numerosi incroci la classificazione dei frumenti e l’identificazione dei progenitori selvatici
2
è stato ed è tuttora oggetto di numerosi studi: molti scienziati continuano a distinguere tra
il genere Triticum e il genere Aegilops in quanto ritenuti i progenitori delle specie attuali.
Una prima importante classificazione è stata fatta mediante analisi genomiche dal
giapponese Kihara nel 1924 il quale ha distinto i frumenti sulla base dei diversi livelli di
ploidia (di base il frumento diploide ha come numero cromosomico n=7).
I primi frumenti erano specie diploidi (T. monococcum e T. urartu, 2n=14) e specie
tetraploidi (T. timopheevi e T. turgidum, 2n=28) da cui successivamente si sono originate
specie esaploidi (T. aestivum e T. zhukowskyi, 2n=42) (Fig. 1.3).
Il T. turgidum ssp durum e il T. aestivum ssp aestivum sono ad oggi i frumenti più coltivati.
Il primo è una specie tetraploide con genoma AABB originatosi dall’ibridazione tra T.
urartu (AA) e probabilmente Aegilops speltoides (BB). Il secondo è un esaploide con
genoma AABBDD originatosi dall’ibridazione tra T. turgidum ssp dicoccum (AABB) e
Aegilops tauschii (DD).
Figura 1.3. Relazioni evolutive e genomiche tra frumento tenero e duro e le relative forme diplodi
selvatiche (Shewry, 2009).
Sin dall’antichità l’uomo ha avuto un ruolo chiave nel contribuire all’evoluzione delle
diverse specie, selezionando visivamente da popolazioni selvatiche gli individui che
spiccavano per determinate caratteristiche (Shewry, 2009).
3
In particolare, il processo di domesticazione attuato dall'uomo ha riguardato due caratteri.
Per primo una maggiore resistenza del rachide della spiga anche a maturazione completa:
si evitava così la caduta dei semi al suolo o la loro dispersione con il vento (spike
shattering). Questo carattere è controllato da due varianti alleliche al locus Br (Brittle
rachis) (Nalam et al., 2006). Il secondo carattere importante è stato lo sviluppo di semi
free-threshing detti anche nudi in cui le glumette non aderiscono più alla cariosside (Fig.
1.4). Si ha così una netta separazione del seme da tutte le parti non commestibili, rendendo
la raccolta più veloce. Questa caratteristica è controllata da due diversi loci, Tg (Tenacious
glumes) e Q, ognuno con due varianti alleliche (Matsuoka 2011).
Figura 1.4. Caratteristiche morfologiche della spiga selezionate dall'uomo.

A) Pianta soggetta a rottura della spiga; B-C-D) Piante non soggette a rottura della spiga.
A-B) Piante con glumette aderenti al seme; C-D) semi nudi o free threshing (Dubcovsky e Dvorak,
2007).
1.1.2 Il successo del frumento
Uno dei fattori che più di tutti ha contribuito alla diffusione del frumento su scala
mondiale, è stata la sua diversità genetica. Questa variabilità ha permesso lo sviluppo di
oltre 25000 specie differenti, ognuna delle quali adatta a climi e condizioni pedologiche
diverse (Feldman et al., 1995). Questo si traduce in un’elevata capacità di adattamento del
4
frumento ai diversi ambienti, a cui si aggiunge la totale meccanizzazione della coltura e la
possibilità di conservare la granella per periodi molto lunghi.
Oltre alla bassa richiesta di mano d’opera, il frumento può essere coltivato in rotazione e
avvicendato con numerose colture (soia, mais, girasole, trifoglio, riso, fagiolo), fornendo
così agli agricoltori diverse alternative, con un impatto positivo sulle rese e sull’ambiente.
Figura 1.5. Areale di produzione del frumento in Italia.
Attualmente nel mondo il 95% del frumento coltivato è costituito da frumento tenero
esaploide, mente il restante 5% è frumento duro tetraploide. Questa differenza di valori è
meno significativa se si tiene conto del fatto che la produzione di frumento duro è
utilizzata quasi esclusivamente per l’alimentazione umana e che il suo prezzo di mercato
(288,50 €/t) risulta più alto di quello del frumento tenero (221,50 €/t) (ISMEA 2016).
L’Italia dopo il Canada è il secondo produttore al mondo di frumento duro, mentre è il
primo in Europa detenendo quasi il 50% della superficie totale coltivata (Fig. 1.5).
Riso e mais sono anch’essi cereali e piante diffuse in tutte le zone a clima temperato,
tuttavia vengono consumati come prodotto finito senza subire particolari lavorazioni. Il
frumento a differenza viene trasformato in una vastissima gamma di prodotti, non solo
pane e pasta, ma anche pizza, dolci, torte, cous cous, biscotti, noodles. Ciò è reso possibile
5
dalle proteine di riserva contenute nella cariosside, che costituiscono la frazione proteica
del glutine e che conferiscono agli impasti proprietà tecnologiche uniche che nessun altro
cereale possiede.
Per la panificazione si usa, principalmente, la farina bianca, ottenuta dalla molitura del
frumento tenero, coltivato soprattutto nelle regioni a clima temperato freddo.
Per la pastificazione si usa una farina granulosa detta semola, ottenuta dalla molitura del
frumento duro che meglio si appresta ad essere coltivato nelle regioni a clima temperato
caldo. Dal punto di vista della salute umana il frumento è uno degli alimenti detti
essenziali, fornendo circa il 20% delle proteine e il 20% di calorie totali per il consumo
umano (Braun et al. 2010). Non può inoltre non essere menzionato l’apporto di aminoacidi
essenziali, vitamine e minerali.
1.2 Il Problema delle rese
Sono moltissime gli studi che ormai hanno confermato il passaggio della popolazione
mondiale dagli attuali 7,3 miliardi a 9,6 miliardi nel 2050, questo porterà la domanda di
frumento a crescere del 60% rispetto a quella che si aveva nel 2010 (FAOSTAT, 2013;
Ray et al. 2013; Tilman et al., 2011).
Per soddisfare questa domanda l’incremento produttivo medio annuale deve passare
dall’attuale 1% ad un valore di almeno l’1,6% (http://www.wheatinitiative.org/).
Nutrire più di 9 miliardi di persone non è l’unico motivo per cui l’aumento della resa in
granella è diventato un obiettivo comune a molti paesi; per esempio l’aumento della
domanda di biocombustibili, l’aumento dei prezzi degli altri beni alimentari, la
malnutrizione nei paesi del terzo mondo, sono tutti problemi che una maggiore e migliore
produzione agricola potrebbe risolvere (Godfray et al., 2010).
Frumento duro e frumento tenero presentano entrambi una discreta produttività se
confrontata con quelle di altri cereali o colture a clima temperato. In un ambiente privo di
organismi patogeni o avversità, con una corretta nutrizione minerale e sufficienti apporti
irrigui teoricamente sì possono raggiungere rese pari a 10 t/ha.
Tuttavia, considerata l’ampiezza della superficie mondiale coltivata e la variabilità delle
condizioni agronomiche che si verificano, la resa può scendere anche al di sotto delle 3
t/ha; questo calo di produzione può verificarsi per la mancanza d’acqua o la scarsità di
elementi nutritivi nel terreno o per l'insorgenza di malattie.
6
Il solo aumento delle rese ha un’utilità marginale o può risultare anche non fattibile se non
è accompagnato da tutta una serie di altri miglioramenti. Bisogna migliorare l’adattabilità
delle piante a stress biotici e abiotici, cercare di mantenere una produzione sicura e
un’elevata qualità nutrizionale del prodotto. La produttività di una coltura, inoltre, potrebbe
anche ridursi nel corso del tempo per diversi ragioni: infatti, i cambiamenti climatici, la
competizione per i terreni, la necessità di ridurre gli input sono tutti fattori che
potenzialmente hanno un impatto negativo (Battisti e Naylor 2009; Agcaoili e Rosegrant,
1995).
Mais, riso, frumento e soia, sono quattro colture chiavi nella nostra alimentazione, insieme
forniscono quasi due terzi delle calorie totali ingerite dai prodotti agricoli. Le rese in queste
quattro colture attualmente stanno aumentando del: 1.6%, 1.0%, 1.0% e 1.3% all’anno,
valori molto al disotto della soglia del 2,4% richiesta per raddoppiare la produzione entro il
2050. A questo ritmo la resa di frumento aumenterebbe solo del 38%, inferiore al 60%
necessario per soddisfare la domanda futura (Ray et al., 2013).
Ciò che più è interessante riguardo mais, riso, frumento e soia, è che questi continuano a
mostrare un aumento nelle rese solo nel 61-76% della superficie mondiale dove sono
allevati; mentre, nel restante 24-39% della superficie, l’aumento delle rese è ormai
stagnante (Ray et al., 2012).
1.2.1 Possibili soluzioni per aumentare le rese
Durante la Rivoluzione Verde le rese di frumento aumentarono notevolmente, grazie

soprattutto all’introduzione dei geni Rht-D1 e Rht-B2 responsabili della diminuzione della
taglia nelle piante (Foulkes et al., 2011). Questo periodo che va dagli anni '60 fino agli
anni '90, vide un aumento delle produzioni grazie soprattutto alla lotta al fenomeno
dell’allettamento, che nel frumento portava ad una riduzione delle rese anche fino al 50% e
andava anche ad intaccare la qualità del prodotto (Berry et al., 2007). Dagli anni '90 i
progressi nel rendimento annuo del frumento e il guadagno conseguibile con il
miglioramento genetico procedono ad un ritmo molto lento, si stanno quindi cercando delle
soluzioni per contrastare questo trend.
Una prima soluzione potrebbe essere quella di aumentare la superficie coltivata, così da
compensare il deficit produttivo con un maggior numero di piante, ma non è un metodo
sostenibile sul lungo termine e aumenta l’impatto sull’ecosistema globale. Un secondo
7
approccio più diretto potrebbe essere quello di scegliere cultivar con una resa elevata, si
avrebbe così una maggiore produzione, mantenendo la stessa superficie. Il secondo
approccio è sicuramente il migliore e su questa strategia sono focalizzati numerosi
programmi di miglioramento genetico.
La resa di granella, nel frumento come in altri cereali risulta essere un carattere complesso,
soggetto ad una bassa ereditabilità e controllato non solo da molti QTL (Quantitative Trait
Loci), ma anche dall’interazione tra il genotipo della pianta e l’ambiente. Geni coinvolti
nei processi fotosintetici e nelle resistenze a stress biotici e abiotici insieme ad altri
importanti caratteri agronomici, sono tra quelli che più influenzano le rese, ed agiscono
durante l’intero ciclo vitale della coltura, nonostante la resa di granella di per sé si
concretizzi solo nelle ultime fasi di sviluppo della pianta e della sua maturazione. L’analisi
dei caratteri quantitativi (QTL) è stata largamente usata per studiare le componenti delle
rese nei cereali. Lo studio in riso dei QTL, per esempio, ha permesso di costruire un
modello di riferimento utile anche per il frumento e per altri cereali. Per ogni pianta la resa
in granella può essere scomposta in una serie di componenti numeriche: numero spighe per
pianta, numero spighette per spiga, numero di semi per spiga e peso dei semi. Il peso dei
semi è il più importante tra questi fattori e risulta a sua volta determinato da: lunghezza del
seme, larghezza del seme e spessore del seme. Per un’analisi più semplificata viene
considerato un unico parametro, il peso di mille semi (TGW, Thousand Grain Weight),
influenzato soprattutto dalla larghezza del seme (Hong et al., 2014; Yang et al., 2012).
Aumentare la larghezza del seme nei programmi di miglioramento genetico è l’approccio
migliore per aumentare le rese.
1.3 Il miglioramento genetico
Il miglioramento genetico vegetale nasce con l’obiettivo di introdurre nel genoma di una
pianta caratteristiche di cui l’uomo ha bisogno, o migliorare quelle già presenti. Il processo
si basa sulla modifica del patrimonio genetico dell’organismo, cosa che al contrario di
quanto si possa pensare l’uomo ha iniziato a fare più di 10000 anni fa. Con l’inizio della
domesticazione, le piante selvatiche sono state trasformate in piante domesticate grazie alla
selezione di quelle linee con le caratteristiche più interessanti. Affinché si possa parlare di
miglioramento genetico in una specie deve esistere della variabilità genetica, quella che
veniva sfruttata in antichità dall’uomo era di origine naturale, ossia presente in natura
8
all’interno di una specie o di specie diverse ma affini. L’uomo indirizzava l’evoluzione in
modo da soddisfare le sue esigenze, ma a quei tempi non essendo noti i meccanismi
molecolari la selezione si effettuava per tentativi. Il miglioramento genetico si è evoluto
nel corso del tempo, oggi vengono sfruttati nuovi metodi all’avanguardia che lo rendono
più preciso ed efficiente; tuttavia, l’approccio classico è ancora utilizzato anche se ormai i
suoi limiti sono stati riconosciuti.
Molte specie ed il frumento ne è un esempio, durante la domesticazione hanno subito una
forte pressione selettiva da parte dell’uomo; tuttavia l’interesse a fissare caratteri
considerati più importanti ha portato ad un impoverimento del corredo genetico rispetto a
quello posseduto dai progenitori selvatici. Lo sviluppo di nuovi e potenti mezzi per la
ricerca in campo agrario, insieme al progresso delle biotecnologie, ha dato la possibilità a
breeder e ricercatori di superare i limiti del miglioramento genetico tradizionale. Oggi in
base alle metodiche utilizzate si distingue il miglioramento genetico in convenzionale e
non convenzionale; per entrambi gli obiettivi sono molteplici, di cui i più importanti
possono essere sintetizzati nell'aumento della produzione, aumento della qualità dei
prodotti, miglioramento della resistenza a stress biotici e abiotici.
I programmi di miglioramento genetico prevedono quattro fasi principali: 1) creazione o
reperimento della variabilità genetica necessaria (attraverso le mutazioni, l’incrocio o
l’ingegneria genetica); 2) selezione (impiegando la variabilità identificata
precedentemente); 3) rilascio della nuova cultivar migliorata (confrontando al termine della
selezione la nuova varietà con le migliori già esistenti); 4) produzione del seme per
diffondere la nuova varietà (Lorenzetti et al., 2011).
1.3.1 Il miglioramento genetico convenzionale
L’incrocio sessuale è alla base dei metodi convenzionali, in questo modo viene creata
nuova variabilità genetica e il carattere trasferito sulle progenie successive (dopo una fase
di selezione). Il miglioramento convenzionale è quindi il normale processo di
ricombinazione guidato però dall’uomo, che oltre a scegliere le linee parentali da
incrociare opera una selezione sulla progenie in modo tale che il prodotto finale abbia le
caratteristiche di cui necessita. Il non poter prescindere dall’incrocio sessuale nei metodi
convenzionali è proprio uno dei maggiori limiti; infatti, nel caso di mancanza di variabilità
genetica questa difficilmente può essere ottenuta da altre specie non affini. Con il
9
progresso delle biotecnologie oggi vengono impiegati nuovi metodi per superare le barriere
sessuali, in particolare le colture in vitro (per il miglioramento ad esempio si usano, la
fusione dei protoplasti, l’embriogenesi somatica, la variabilità somaclonale), la mutagenesi
(con agenti chimici o fisici), la trasformazione genetica (metodo biolistico e agrobatterio) e
una nuova tecnologia conosciuta come genome editing.
In natura le mutazioni si verificano normalmente negli individui, ma una delle più
importanti scoperte della genetica è stata proprio la possibilità di indurre mutazioni a
piacimento seppur in maniera aspecifica. Muller (1927) mostrò che il trattamento con raggi
X aumentava il tasso di mutazioni nelle popolazioni di Drosophila del 15.000%. Negli
anni successivi alla seconda guerra mondiale alle tecniche di mutagenesi con trattamenti
fisici (raggi X, raggi gamma, neutroni lenti e veloci) si affiancarono le tecniche con
trattamenti chimici che risultavano essere meno distruttive e più accessibili. Sostanze come
l’EMS (etil metan sulfonato) o la Colchicina si sono dimostrate meglio controllabili non
richiedendo personale specializzato, ma fornendo comunque un’elevata frequenza di
mutazioni.
1.3.2 Il miglioramento genetico non convenzionale
A partire dagli anni '70, gli approcci al miglioramento genetico sono stati rivoluzionati
completamente grazie allo sviluppo del DNA ricombinante. Si iniziò così a parlare di
ingegneria genetica, un complesso insieme di tecniche che permettono di manipolare il
DNA intervenendo sui segmenti che compongono tale molecola. Brevi porzioni di DNA
possono essere isolate, moltiplicate, studiate a livello di sequenza e trasferite nel genoma di
altri organismi controllandone l’incorporazione e l’espressione. L’ingegneria genetica
permette di superare i limiti imposti dalle barriere sessuali e trasferire anche un intero gene
da un qualunque organismo ad un altro indipendentemente dal fatto che esso sia
compatibile sessualmente o no. Dove il miglioramento tradizionale fallisce, le metodiche
del DNA ricombinante possono portare ad ottimi risultati. Le piante prodotte tramite
miglioramento tradizionale contengono oltre al gene di interesse, anche geni non
desiderati, la maggior parte di questi geni indesiderati può essere rimossa solo attraverso
numerosi reincroci con il genotipo parentale che comporta tempi lunghi e numerose
selezioni. Un vantaggio del trasferimento genico diretto è che il genotipo è lo stesso della
pianta da migliorare (o del parentale), ad accezione del gene che è stato inserito o
10
soppresso; nelle piante transgeniche verranno dunque espresse le stesse proteine eccetto
una. Questo aspetto è particolarmente importante perché permette di intervenire su una
varietà sapendo che le sue peculiarità rimarranno inalterate.
Il trasferimento di geni e la trasformazione genica possono essere eseguiti con numerose
metodologie, ma ad oggi sono due i sistemi predominanti: il bombardamento mediante
metodo biolistico e la trasformazione sfruttando l’Agrobacterium tumefaciens. Il primo è
più diffuso nelle monocotiledoni, come riso, frumento, mais e sorgo e permette
l’inserimento di più copie del transgene, mente il secondo permette l’inserimento del gene
target in singola copia o in poche copie.
1.3.2.1 Trasformazione con il metodo biolistico
Il bombardamento mediante metodo biolistico fa uso di un processo chimico-fisico per il

trasferimento di un gene in una pianta e risulta essere un metodo alternativo che non
utilizza vettori biologici (vedi Agrobacterium tumefaciens). Particelle ricoperte con copie
del gene da inserire vengono accelerate ad alta velocità per consentire la loro penetrazione
nelle cellule bersaglio, i “proiettili” penetrando generano rotture sul genoma e rilasciano il
DNA di cui sono state rivestite che andrà ad integrarsi nel genoma. Vengono utilizzati
microproiettili di oro, tungsteno, platino (1-4 µm di diametro) accelerati a 400-550 m/s
mediante l’uso di scariche elettriche o gas compressi. I tessuti bersaglio possono essere:
calli, embrioni immaturi, meristemi, foglie, endosperma; il successo del metodo biolistico
dipende dalla capacità di penetrazione delle particelle e dal danno procurato alle cellule
(Fig. 1.6). Spesso vengono utilizzati geni marcatori che conferiscono resistenza ad erbicidi
o antibiotici per selezionare le cellule trasformate. I vantaggi di questa tecnica consistono
nella possibilità di utilizzare più costrutti per la trasformazione e senza limiti per le
dimensioni dei costrutti introdotti; inoltre possono essere inserite più copie del gene
d’interesse (a volte è uno svantaggio). Gli svantaggi invece sono che è impossibile
controllare il numero di copie del gene introdotto e il sito di inserzione, potrebbero anche
verificarsi eventi di ricombinazione e riarrangiamenti del DNA esogeno (copie multiple,
frammentazione del transgene). L’introduzione di un numero troppo elevato di copie dello
stesso gene, nel genoma della stessa cellula, potrebbe portare alla metilazione del DNA
introdotto e al silenziamento del costrutto (Danilova, 2007).
11
Figura 1.6. Rappresentazione del bombardamento di espianti vegetali.
1.3.2.2 Trasformazione con Agrobacterium tumefaciens
Alcuni ceppi virulenti del genere Agrobacterium sono responsabili di numerose malattie
delle piante dicotiledoni, in corrispondenza del punto di ingresso del virus vengono indotte
caratteristiche alterazione morfologiche e differenziative. La specie Agrobacterium
tumefaciens è responsabile della malattia neoplasica, nota come tumore del colletto (crown
gall disease) che porta alla formazione di un ammasso di cellule indifferenziate nel punto
di infezione. Un altro tipo di malattia è la sindrome delle radici pelose (hairy root disease)
causata dalla specie Agrobacterium rhizogenes, che si manifesta con la proliferazione di
radici avventizie nel sito di infezione. L’Agrobatterio è definito un ingegnere genetico
naturale e a differenza del trasferimento diretto di DNA estraneo nelle cellule vegetali,
questo è un approccio più naturale per trasferire ed integrare un gene di interesse. Durante
l’infezione da A. tumefaciens le cellule vegetali incorporano all’interno dei loro cromosomi
e in maniera stabile una determinata quantità di DNA che proviene dal batterio. I ceppi
virulenti di A. tumefaciens contengono un grande plasmide conosciuto come “Plasmide Ti”
(Tumor Inducing -180kb) non fondamentale alla vita del batterio ma con geni importanti
12
che aumentano le sue capacità di sopravvivere in determinati ambienti. Una porzione del
plasmide Ti conosciuta come “T-DNA” è incorporata nel DNA nucleare della cellula della
pianta ospite e ne provoca la crescita incontrollata (Fig. 1.7-a). Il T-DNA contiene due tipi
di geni: gli oncogeni e quelli per la sintesi delle opine.
I geni oncogeni codificano per enzimi coinvolti nella sintesi di auxine e citochinine,
l’aumento dei livelli di questi due fitormoni nella cellula è responsabile della formazione
del tumore (aumento divisone cellulare). Le opine invece sono una classe di composti
contenenti azoto e carbonio, sintetizzate e secrete dalle cellule delle galle, che il solo
batterio può utilizzare come fonte di nutrimento. Le biosintesi delle opine non avviene
normalmente nelle piante, ma solo a seguito della trasformazione dovuta al tumore del
colletto, questo meccanismo permette al batterio di crearsi un ambiente stabile e favorevole
alla sua proliferazione con una fonte di nutrimento che solo lui può sfruttare (Taiz &
Zeiger, 2015).
La capacità dell’Agrobatterio di trasferire in un genoma vegetale qualsiasi sequenza si
trovi delimitata all’interno del T-DNA viene sfruttata in ingegneria genetica per la
produzione di piante transgeniche. Il T-DNA è stato opportunamente manipolato in
laboratorio, rimuovendo i geni per la sintesi dei fitormoni e delle opine, e sostituendoli con
il transgene d’interesse che si vuole inserire nella pianta (Fig. 1.7-b). L’applicabilità della
trasformazione mediata da Agrobaterium dapprima limitata a poche specie dicotiledoni,
bersagli naturali dell’infezione, è stata ora ampliata alla maggior parte delle specie vegetali
di interesse agronomico, comprese graminacee e leguminose. L’efficienza della
trasformazione risulta comunque molto variabile oscillando tra il 70-90% per il tabacco
fino all’ 1-7% nel frumento. Infine un vantaggio di questa metodica rispetto al metodo
biolistico è che il gene target viene inserito esclusivamente in singola copia.
13
Figura 1.7. a) Modello di infezione e trasformazione di una cellula vegetale con Agrobacterium
tumefaciens b) Passaggi per l’ingegnerizzazione del T-DNA e la produzione di piante transgeniche
esprimenti un gene di interesse.
1.3.2.3 RNA interference (RNAi)
La scoperta di questa tecnica avviene per caso negli anni '90, ampiamente studiata nel
decennio successivo risulta ad oggi una delle metodiche più diffuse quando si vuole
interferire in modo specifico con l’espressione di uno o più geni d’interesse. La tecnologia
dell’RNAi è basata su un processo di inattivazione genica post-trascrizionale: in natura la
cellula necessita di questo tipo di soppressione per modulare l’espressione genica o per
proteggersi da eventuali infezioni di organismi dotati di genoma a RNA a doppio filamento
(dsRNA) o in grado di produrlo durante il loro ciclo, come ad esempio i virus. Sia in
organismi animali che vegetali è stato osservato che la trasfezione di piccoli frammenti di
dsRNA è in grado di antagonizzare l’RNA messaggero corrispondente. In Drosophila m. è
stato dimostrato che una piccola sequenza di RNA da 21 bp può interferire con la
14
trascrizione in modo specifico (Elbashir et al., 2001). La presenza nel citoplasma di
molecole a dsRNA innesca il processo di silenziamento, queste molecole vengono generate
attraverso diversi meccanismi. Si distinguono i microRNA (miRNA) e i short interfering
RNA (siRNA): i primi sono codificati da geni endogeni e riconoscono sia sequenze
specifiche che non perfettamente specifiche; i secondi possono essere sia di origine
endogena che esogena ma riconoscono solo sequenze specifiche. In sintesi il
funzionamento dei due dsRNA è il medesimo, tuttavia il processo di maturazione a cui
questi vanno incontro è diverso, nel caso dei miRNA questi oltre a subire una
trasformazione per mezzo di vari complessi ed enzimi devono anche transitare dal nucleo
(dove vengono sintetizzati) al citoplasma (dove andranno a riconoscere l’mRNA). Nella
maturazione dei siRNA il processo è più breve, la loro struttura necessita di minori
riarrangiamenti ed inoltre si trovano già nel citoplasma.
Il modello funzionale dell’RNAi consta di due fasi: quella di “maturazione” e quella
“effettrice”. Nella fase di maturazione i dsRNA nel citoplasma vengono riconosciuti e
digeriti dall’enzima Dicer una ribonucleasi con una struttura ad accetta, il “manico”
presenta all’estremità 3’ un dominio di legame PAZ che riconosce ed ancora l’estremità 3’
del dsRNA, che poi viene digerito grazie a due siti ad attività RNAsica presenti nella parte
dell’enzima corrispondente alla “lama”. Si formano così numerose catene a doppio
filamento ognuna lunga 21-23 bp, che sono definiti siRNA maturi. Nella fase effettrice i
duplex siRNA si legano ad un complesso nucleasico e formano quello che viene chiamato
RISC (RNA-induced silencing complex). Il complesso RISC presenta una proteina
chiamata “Argonauta” con attività RNAsica e un dominio PAZ, che trasforma l’siRNA
maturo da doppio a singolo filamento (Fig. 1.8). Questa reazione è ATP dipendente ed è
fondamentale per l’attivazione del complesso RISC maturo. Il complesso così attivato va a
riconoscere l’RNA messaggero complementare allo siRNA a singolo filamento e lo inattiva
tagliandolo.
15
Figura 1.8. Rappresentazione schematica del meccanismo dell’RNAi considerando sia i dsRNA
endogeni che esogeni.
I ricercatori grazie a questo meccanismo hanno potuto introdurre dei dsRNA nella cellula
in maniera diretta utilizzando delle cassette opportunamente inserite in specifici costrutti.
Si utilizzano principalmente dei shRNA (small hairpin RNA), il nome scelto indica la forma
della loro struttura, necessaria per il corretto funzionamento dell’RNAi. Per essere
funzionante il costrutto deve contenere un promotore, una sequenza del gene target ripetuta
e invertita separata da uno spaziatore (spacer) ed un terminatore. Quando il transgene
viene espresso all’interno della cellula la sequenza RNA del costrutto si ripiega su sé stesso
per complementarietà (tranne nella porzione dello spacer) a formare una struttura a forcina
(small hairpin-RNA) che poi verrà digerita (Fig 1.9).
16
Figura 1.9. Schema di un costrutto utilizzabile per il silenziamento mediante RNAi.
Per finire, il silenziamento genico mediante RNA interference può avvenire sia per
degradazione dell’mRNA da parte del complesso RISC maturo che per blocco della
traduzione nel caso in cui l’appaiamento RISC-mRNA non sia perfetto (il taglio non può
avvenire). Un complesso RISC maturo può restare attivo nella cellula fino a sette giorni,
durante questo periodo il processo si ripete più volte poiché dopo il taglio del messaggero
RISC con il filamento stampo non smette di funzionare, ma cerca un altro mRNA
complementare.
1.4 Geni implicati nella determinazione delle dimensioni della cariosside
1.4.1 Il gene Grain Weight 2 (GW2)
Il completo sequenziamento del genoma di riso (Oryza sativa) ha reso possibile

l'identificazione e la caratterizzazione di diversi QTL coinvolti nella regolazione del peso
del seme, tra cui OsGS3 (Fan et al., 2006), OsGS5 (Li et al., 2011) e OsGW2 (Song et al.,
2007). Tra questi OsGW2 (Grain Weight 2) è un importante QTL che controlla la
larghezza e il peso della cariosside.
Negli studi condotti da Song et al., 2007, il locus del gene responsabile di tale QTL è stato
localizzato sul braccio corto del cromosoma 2, in una regione cromosomica di 8.2 Kb (Fig.
1.10-a). Composto da otto introni e sette esoni OsGW2 codifica per una proteina di 425
amminoacidi (47 KDa). Le varietà WY3 e Oochikara per via di una mutazione naturale in
questo gene presentano dei semi più grandi rispetto alla varietà FAZI che possiede l’allele
17
wild type. La delezione di una adenina nell’esone quattro della sequenza codificante porta
alla formazione di un codone di stop prematuro e alla traduzione di una proteina da 115
amminoacidi (13 KDa), tronca di 310 amminoacidi.
Figura 1.10. a) Struttura del gene GW2 e siti delle mutazioni nelle varietà WY3 e Oochikara (Song
et al. 2007). b) Fenotipo della cariosside nelle varietà di riso FAZ1, WY3 e Oochikara. Scala della
barra 3 mm (Song et al. 2007).
GW2 è un gene costitutivo espresso in diversi organi della pianta, codifica per una proteina
di tipo RING con una attività E3 ubiquitina ligasi, implicata nella degradazione delle
proteine attraverso il proteosoma 26S, ed è localizzata nel citoplasma subcellulare.
Per capire la funzione del gene GW2, gli autori hanno sviluppato nel background genetico
della varietà FAZI (varietà a seme piccolo) una linea NIL (Nearly Isogenic Line)
contenente una piccola regione di 1,4 cM con il locus GW2 della varietà WY3.
Rispetto alla varietà FAZI, le cariossidi della linea NIL hanno prodotto semi di dimensioni
più grandi; in particolare, la larghezza, lo spessore, la lunghezza e il peso dei mille semi
erano aumentati, rispettivamente, del 26,2%, 10,5%, 6,6% e 49,8% (Fig. 1.10-b). Questo si
ripercuote positivamente anche sulle rese: da un confronto diretto le rese della linea NIL
(GW2) erano aumente del 19,7% rispetto alla FAZI nonostante nella prima il numero di
semi per pannocchia era diminuito del 29,9%. A livello fenotipico tra le due varietà non
sono state osservate differenze significative, ad eccezione delle glumette che sono di
larghezza e lunghezza maggiori nella NIL (GW2) rispetto alla varietà FAZI. Gli autori
hanno dimostrato che la maggiore larghezza delle glumette nella NIL (GW2) è il risultato
di un maggior numero di cellule (Fig. 1.11) ed hanno ipotizzato un coinvolgimento del
gene GW2 nella regolazione della divisione cellulare.
18
Figura 1.11. a) Sinistra, sezione trasversale delle glumette. Scala della barra 3 mm; Destra, sezione
trasversale delle glumette. Scala della barra 500 µm (Song et al. 2007). b) Cellule dell’endosperma
di semi maturi nelle varietà FAZ1 e NIL (GW2). Scala della barra 500 µm (Song et al. 2007).
1.4.2 Ruolo della proteina GW2 in frumento
Studi di genomica comparativa mediante mappaggio dei QTL hanno mostrato che la
sequenza è l’ordine dei geni viene conservato in specie erbacee diverse (Gale e Devos,
1998; Varshney et al., 2005); inoltre, geni omologhi mostrano funzioni simili nelle specie
diverse (Kojima et al., 2002).
Come ampiamente discusso nel paragrafo precedente, il gene OsGW2 controlla il peso e
larghezza del seme in riso (Song et al., 2007); grazie ad un approccio di genomica
comparativa è stato possibile identificare e clonare il suo ortologo in frumento tenero,
TaGW2 (Su et al., 2011).
Su et al., 2011 nel loro studio hanno riportato che il gene TaGW2 è localizzato sul braccio
corto del cromosoma 6 ed è presente in tutti e tre i genomi del frumento (6A, 6B, 6D). Tra
loro, le sequenze dei tre omeologhi condividono il 98 % di identità a livello nucleotidico e
un’omologia di sequenza con il riso pari all’87%.
L’utilizzo di una popolazione RIL (recombinant inbred line) ha permesso di mappare il
gene GW2 sul cromosoma 6A a 0,6 cM dal marcatore cdf80.2 che si trova adiacente al
centromero. La regione codificante, distribuita in 8 esoni, è costituita da 1275 bp e codifica
per una proteina di 424 amminoacidi. Le sequenze proteiche di tutti e tre gli omeoalleli
mostrano un dominio RING di 43 amminoacidi posizionato nella regione N-terminale, la
cui sequenza amminoacidica è simile a quella del gene OsGW2 di riso (Su et al., 2011).
La delezione di una base nell’esone 4 in un mutante di riso ha portato ad una mutazione,
associata a semi di dimensioni maggiori (Song et al., 2007).
In frumento il confronto dei tre omeoalleli TaGW2 in varietà diverse per dimensioni del
seme non ha permesso di identificare nessun polimorfismo simile alla delezione vista nel
19
riso; tuttavia, sono state identificate sostituzioni nucleotidiche nelle sequenze delle regioni
promotrici. In totale sono stati identificati due SNP nella regione del promotore che sulla
base di analisi di associazione formano 2 aplotipi in perfetto linkage disequilibrium
sull'omeoallele GW2-A: Hap-6A-A (-593A e 739G) e Hap-6A-G (-593G e 739A) (Su et
al., 2011) (Fig. 1.12).
Figura 1.12. a) Fenotipo delle cariossidi di frumento utilizzate per identificare la differenza nella
sequenza di TaGW2. Lunghezza della barra 5mm. (Su et al. 2011). b) Posizione degli SNP che
formano gli aplotipi Hap-6A-A e Hap-6A-G nella regione del promotore di TaGW2-6A. (Su et al.,
2011).
Queste 2 varianti alleliche di TaGW2-6A sono state analizzate su 151 varietà locali e 114
varietà moderne di frumenti cinesi. Le varietà locali presentano dei semi più piccoli e in
queste l’allele predominante è Hap-6A-G, mentre l’allele Hap-6A-A è il più frequente
nelle varietà moderne che presentano semi più grandi (Su et al., 2011).
Tabella 1.1 Comparazione tra le dimensioni del seme nelle varietà locali (landrace) e in quelle
moderne (media ± SD) (Su et al. 2011).
20
In media peso e larghezza dei semi negli aplotipi Hap-6A-A erano maggiori di quelli degli
aplotipi Hap-6A-G (Tab. 1.1). Le analisi trascrizionali condotte sui tre geni omeologhi
TaGW2 hanno confermato una correlazione negativa tra il livello di espressione e la
larghezza del seme.
I risultati sopradescritti suggeriscono l'esistenza di un meccanismo molecolare simile a
quello osservato in riso nel regolare la lunghezza e il peso del seme in frumento.
Un altro tratto utile associato all’aplotipo Hap-6A-A è la maturazione precoce della
cariosside (3 giorni di anticipo rispetto all'altro aplotipo), utile per accelerare il turnover da
una coltura all’altra (Su et al., 2011).
Yang et al., 2012 analizzando le sequenze codificanti di TaGW2 della varietà di frumento a
seme grande Lankaodali non hanno trovato alcuna differenza nei geni TaGW-2 localizzati
nei cromosomi 6B e 6D. Nell'omeoallele del cromosoma 6A è stata invece identificata
un’inserzione di una base sull’ottavo esone (977-T) che genera un codone di stop
prematuro e porta alla traduzione di una proteina tronca di 328 amminoacidi.
Incrociando piante della varietà Lankaodali con quelle della Chinese Spring è stata ottenuta
una popolazione F2 segregante, che è stata suddivisa in 3 classi genotipiche: 75 individui
omozigoti TT, 184 individui eterozigoti Tt e 68 individui omozigoti tt.
Le piante che presentavano la mutazione allo stato omozigote avevano cariossidi più larghe
del 5,85% ed un peso di mille semi maggiore del 10,03% (Yang et al., 2012) (Fig. 1.13-A).
In conclusione questo studio ha dimostrato che in maniera analoga al gene OsGW2 di riso,
TaGW2 regola negativamente lo sviluppo in larghezza e peso del seme (Yang et al., 2012).
Hong et al. (2014) con un approccio RNA interference hanno diminuito la quantità di
trascritto di TaGW2 nella varietà di frumento cinese a semi piccoli “Shi 4185”, ottenendo
linee transgeniche con semi più larghi e di peso maggiore rispetto al controllo non
trasformato (Fig. 1.13-B e C).
Simmonds et al., (2016) hanno analizzato una popolazione TILLING di frumento
tetraploide della varietà Kronos alla ricerca di mutazioni di tipo loss of function nel gene
TaGW2-A. Tra le 20 mutazioni identificate in questa regione una era interessante e
corrispondeva ad una transizione da guanina ad adenina nel sito di splicing che precede
l'esone 5. La mutazione portava a due splicing-alternativi del trascritto di TaGW2-A1: il
primo è responsabile di un codone di stop prematuro; mentre il secondo produce una
proteina con tre amminoacidi in meno (Fig. 1.13-D e E).
Il reincrocio (BC) delle piante portanti l’allele mutante con piante di frumento tetraploide
(varietà Kronos) e esaploide (varietà Paragon) hanno dato una serie di linee isogeniche che
21
sono state valutate sia in condizioni di campo che in serra. In generale è stato registrato un
aumento significativo del peso di mille semi compreso tra il 4,4% e il 7,5% nelle linee di
frumento duro. Questo effetto è stato causato sia da un aumento della larghezza dei semi
(3,4%) che della lunghezza (2,2%). Nelle linee isogeniche di frumento esaploide è stato
riscontrato un aumento del peso di mille semi pari al 7,3%, anche in questo caso sia per un
aumento di larghezza (2,9%) che di lunghezza (1,8%). I risultati sono in linea con quelli
osservati in precedenti lavori in riso (Song et al., 2007) e in frumento (Yang et al., 2012;
Hong et al., 2014; Jaiswal et al., 2015).
22
Figura 1.13. A) Cariossidi di 5 varietà di frumento tenero che differiscono per la grandezza della
cariosside, omozigoti per l’inserzione (TT) o wt (tt) per il gene TaGW2-A. SC Sichuandali, LK
Lankaodali, WM Wanmai 38, CS Chinese Spring, MX Mingxian 169 (Yang et al. 2012). B)
Grandezza dei semi nelle linee transgeniche rispetto ai controlli. Scala della barra 5mm. (Hong et
al., 2014). (C) Risultati dell’analisi Q-RT-PCR per i livelli di trascritto dei diversi omologhi di
TaGW2 nelle piante T2 e nel controllo. I dati vengono mostrati come media ± SD. Gli asterischi
indicano che le medie sono significativamente differenti da P<0,01 (Hong et al., 2014). D)
Partendo dall’alto. Diagramma di TaGW2-A1 inclusi esoni 2-6 (grigio e nero) e introni (linea
sottile) mostrante la transizione G-A alla posizione 2373 (G2373A). Più in basso. Allineamento
della sequenza di gDNA del wild type (in alto) e delle due linee mutanti T4-2235 (al centro e in
basso) che includono la transizione G-A (evidenziata in giallo con lettere rosse). Gli esoni sono
raffigurati in lettere maiuscole (esone 4 in nero, esone 5 in grigio, mentre le sequenze introniche
fiancheggiano il sito di splicing e sono in carattere minuscolo. E) Sequenza cDNA comprendente
gli esoni 4 e 5 nel wild type (in alto) e nelle due varianti del mutante T4-2235 (al centro e in basso)
(Simmonds et al., 2016).
23
Un ulteriore studio ha riportato il silenziamento dei geni TaGW2 in frumento mediante un
approccio RNA interference (Bednarek et al., 2012). Le analisi di espressione condotte su
29 piante T2 hanno mostrato una riduzione nell’espressione di TaGW2 compresa tra il 20%
e il 76%. Tuttavia, differentemente da quanto osservato da Hong et al. (2014) le cariossidi
delle piante transgeniche, seppur aumentate in numero, erano di dimensioni
significativamente ridotte rispetto al controllo.
1.4.3 La proteina RING e la reazione di ubiquitinazione
GW2 codifica per una proteina RING con attività E3 ubiquitina ligasi, ed ha localizzazione
subcellulare citoplasmatica. Il proteosoma 26S della proteina riconosce un’altra proteina
bersaglio e la porta a degradazione. L’ubiquitina è un polipeptide da 76 amminoacidi che
svolge un ruolo chiave nel controllo della degradazione proteica negli organismi eucarioti.
È altamente conservata tra questi e presenta una forma globulare. Attraverso la reazione di
ubiquitinazione, l’ubiquitina si coniuga alle proteine accettrici target. Si forma un legame
isopeptidico tra l’estermita C-terminale dell’ubiquitina e l’ammino gruppo del residuo di
lisina dell’altro polipeptide coinvolto nella reazione (Pickart, 2001).
L’ubiquitinazione è un processo enzimatico complesso, che vede in sequenza l’azione di
tre enzimi differenti: un enzima di attivazione dell’ubiquitina (E1), seguito da un enzima di
coniugazione dell’ubiquitina (E2) e un enzima finale responsabile del legame tra
l’ubiquitina e la proteina bersaglio (ubiquitina ligasi E3). Il ruolo maggiormente studiato
riguarda il proteosoma 26S, un complesso proteolitico multienzimatico che riconosce e
degrada varie proteine cellulari attraverso un segnale specifico. L’ubiquitinazione ha come
principale obiettivo la degradazione delle proteine bersaglio attraverso il proteosoma26S,
ciò serve a mantenere il corretto funzionamento cellulare eliminando proteine tronche o
aberranti. Si ha così una via che regola la quantità di proteine attive nella cellula e che
dipende dal rapporto tra proteine degradate e proteine sintetizzate (Sadanandom et al.,
2012).
Per lungo tempo la regolazione dell’espressione genica e dell’attività proteica è stata
considerata solo sulla base dell’efficienza del rapporto “trascrizione/traduzione”. La
scoperta della reazione di ubiquitinazione insieme ad altri processi post-trascrizionali e
post-traduzionali ha mostrato che la quantità di trascritto/proteina è anche il risultato del
rapporto tra sintesi e degradazione proteica (Mazzucotelli et al., 2006). Ad oggi sono circa
24
mille le E3 identificate, e vengono classificate in tre gruppi principali: le E3 ubiquitina
ligasi di tipo RING-finger, di tipo HECT e di tipo U-box (Mazzucotelli et al., 2006).
1.5 Altri geni implicati nelle rese
1.5.1 Il gene Grain weight 7 (GW7)
Studi volti ad identificare nuove strategie per aumentare le rese in riso hanno identificato
due QTL implicati nella larghezza del seme, qGW4 e qGW7. In particolare il gene GW7 è
stato mappato in una regione del cromosoma 7 (Wang et al., 2015). Sono state identificate
2 varianti alleliche di GW7 (TFA e HJX74), che mostrano una serie di polimorfismi nella
regione del promotore. Gli autori hanno sviluppato due diverse linee NIL, una linea NIL-
GW7TFA omozigote per l’allele TFAqGW7 e la seconda NIL-GW7HJX74 omozigote per
l’altro allele, HJX74. Precisamente durante gli stadi di sviluppo della cariosside e nelle
principali fasi di formazione dell’endosperma al suo interno il gene che veniva trascritto
più intensamente era quello di NIL-GW7TFA ed è stato associato a cariossidi di dimensione
più lunghe. Infatti, il silenziamento del gene GW7 nelle linee NIL-GW7TFA ha prodotto
cariossidi più corte e più larghe. La sovraespressione dell'allele GW7HJX74 nella linea NIL-
GW7HJX74 ha generato piante transgeniche con cariossidi più lunghe e sottili rispetto a
quelle della stessa linea NIL non transgenica. É stato quindi ipotizzato il coinvolgimento
del gene GW7 nella regolazione della morfologia del seme: in particolare la proteina GW7
è in grado cambiare il pattern di divisione cellulare aumentandola in direzione
longitudinale e diminuendola in quella trasversale. Analisi BiFC (biomolecular
fluorescence complementation) hanno mostrato che GW7 in riso interagisce con OsTON1b
e OsTON2 a formare un complesso proteico altamente conservato chiamato TTP: lo stesso
complesso è presente in Arabidopsis thaliana e controlla la divisione cellulare nello spazio
(Wang et al., 2015).
25
1.5.2 Il gene GASR7
In riso OsGASR7 è stato identificato come un gene candidato nel determinare la lunghezza
del seme (Huang et al., 2012). Analisi comparative hanno permesso di isolare il suo
omologo in frumento (Dong et al., 2014). Il confronto delle sequenze genomiche GASR7
isolate dalla cultivar Chinese Spring ha permesso di identificare tre differenti omeoalleli
con un’elevata omologia di sequenza (>85%) rispetto a quella corrispondente al gene
OsGASR7 di riso. I tre omeoalleli nel frumento sono localizzati sui cromosomi nel gruppo
di omeologia 7 (7A, 7B, 7D) e sono caratterizzate da ORF le cui lunghezze differiscono di
poche bp (523, 521, 491 bp), con il primo e il terzo esone perfettamente conservati nei tre
omeologhi. Il gene GASR7 è presente e ben conservato anche in altre specie come
Sorghum bicolor (SbGASR7), Zea mays (ZmGAST7) e Brachypodium distachyon
(BdGASR7) (Dong et al., 2014).
Comparando le sequenze amminoacidiche la struttura primaria di TaGSR7 e quella dei suoi
ortologhi è simile a quella descritta per le proteine Snakin/GASA; tuttavia, la regione
variabile possiede un tratto di poliglicina, caratteristica non osservata in nessuna delle
proteine Snakin/GASA studiate fino ad oggi. Tra i tre omeologhi, TaGASR7-A1 presenta
due varianti alleliche, H1c e H1g: i due aplotipi differenti condividono la stessa ORF ma
mostrano differenze nella regione prossimale al 3’ e 5’. L’aplotipo H1c sia rispetto a H1g
che agli omeologhi TaGASR7-B1 e TaGASR7-D1 è l’unico ad avere un’inserzione di 1475
-bp nella regione prossimale al 5’ e con 7 ripetizioni del microsatellite CTT (Dong et al.,
2014). Per quanto riguarda le dimensioni del seme, TaGASR7-A1 (e principalmente
l’aplotipo H1c) influenza fortemente la lunghezza della cariosside e il peso dei 1000 semi
senza avere altri effetti pleiotropici sul numero dei semi o la loro larghezza. Un’ultima
caratteristica riscontrata è la presenza di un sito di risposta alle giberelline (ormoni
fondamentali per la crescita della pianta) a livello della regione del promotore.
1.5.3 Il gene Dense and Erect Panicle 1 (DEP1)
Studi su popolazioni di mappa basate sull’incrocio di diverse varietà di riso hanno

identificato due QTL, uno responsabile del numero di semi per pannocchia e l’altro della
densità della pannocchia. I due QTL sono localizzati in una regione del cromosoma 9,
nello stesso punto dove è presente il gene qPE9-1 la cui manifestazione fenotipica è la
pannocchia eretta (Huang et al., 2009). Sembra così plausibile attribuire ad un solo locus,
26
DEP1 (Dense and Erect Panicle 1), tutti e tre i caratteri menzionati (pannocchia densa,
elevato numero di semi per pannocchia, pannocchia eretta). DEP1 codifica per una
proteina con dominio PEBP (proteina di legame alla fosfatodietanolammina), la sua
sequenza condivide una certa omologia con il dominio N-terminale di GS3, un altro QTL
identificato nel riso e con un ruolo importante nel determinare le dimensioni della
cariosside.
Il silenziamento del gene DEP1 in alcune linee NIL di riso Shao 313 (NIL-dep1) mediante
RNA interference ha prodotto linee transgeniche che mostravano pannocchie curve con
poche cariossidi ed internodi allungati; nelle linee transgeniche Shao 314 (NIL-DEP1),
piante prive del costrutto ma che esprimevano l’allele mutante DEP1 sotto il controllo del
suo promotore nativo, le pannocchie erano sempre erette, ma le piante avevano una statura
semi-nana, un maggior numero di semi per pannocchia, internodi più corti ed un aumento
nel numero di ramificazioni primarie e secondarie (Huang et al., 2009). In conclusione
dep1 agisce come regolatore negativo del numero dei semi e dell’architettura della
pannocchia, la sua localizzazione cellulare è stata verificata unendo una proteina
fluorescente (GFP) al C-terminale di entrambe le linee DEP1 e dep1. Il gene fuso alla
proteina è stato inserito nelle varietà Nippombare e Shao 314, l’espressione della GFP è
stata poi rilevata nei nuclei di entrambi i trasportatori di DEP1 e dep1, così come nei
meristemi delle infiorescenze e in altre parti della pianta.
Il peso di mille semi delle linee NIL-dep1 silenziate era significativamente inferiore
rispetto alle linee NIL-DEP1, ma la resa in granella per pianta in condizioni di campo era
aumentata del 40,9% (Huang et al., 2009).
27
2. Finalità
Nel prossimo futuro si verificherà un importante aumento della domanda di beni
alimentari, in particolare quella di alimenti essenziali come il frumento, da cui si ricava una
gamma molto ampia di prodotti. Sfamare una popolazione mondiale in crescita e
combattere fenomeni di denutrizione è diventato un obiettivo comune a molti paesi. E'
stata stimata che la produzione di frumento deve aumentare di circa il 60% entro il 2050 se
non si vuole assistere ad un deficit alimentare globale e ad un progressivo aumento di
prezzo dei beni alimentari. I cambiamenti climatici, l’erosione dei terreni e le limitate
quantità di combustibili fossili sono tutte problematiche con cui l’agricoltura futura dovrà
confrontarsi. Proprio per questo l’impegno di molti ricercatori è ormai da anni focalizzato
su programmi di miglioramento genetico e di breeding delle varietà coltivate. Tra gli
obiettivi principali in frumento ci sono l’ottenimento di cultivar con una maggiore
produttività e una migliore tolleranza a stress biotici e abiotici. Queste sono le migliori
soluzioni se si vuole fronteggiare la crescente domanda di cibo, senza dover
necessariamente aumentare la superficie sottoposta a coltivazione, cosa che farebbe
aumentare anche l’impatto dell’agricoltura sull’ecosistema globale.
Gli sviluppi che la genomica, le biotecnologie e la genetica molecolare hanno fatto negli
ultimi anni ha permesso di ottenere una migliore e maggiore conoscenza sui diversi geni
candidati e i possibili QTL coinvolti nella determinazione delle dimensioni e del peso delle
cariossidi in svariate specie di cereali. Molti studi in frumento si sono focalizzati sul gene
Grain Weight 2 (GW2), considerato un regolatore negativo della divisione cellulare
all’interno della cariosside. Nell’ultimo decennio l’effetto di questo gene sulle rese è stato
studiato sia in frumento tenero, che in frumento duro con diversi approcci; tuttavia i dati
sono contrastanti.
Questo Elaborato cerca di fare chiarezza sugli effetti che il silenziamento dei due
omeoalleli GW2 (TaGW2-A e TaGW2-B) mediante RNAi ha sulle dimensioni delle
cariossidi e sulle rese di frumento duro. Linee RNAi transgeniche di frumento duro,
precedentemente prodotte presso il laboratorio di Genetica e Biochimica delle Proteine
Vegetali (DAFNE), verranno caratterizzate dal punto di vista molecolare e fenotipico.
28
3. Materiali e Metodi
3.1 Materiale vegetale
Per il lavoro di Tesi sono state utilizzate 7 linee di frumento duro transgenico derivanti
dalla cultivar di frumento duro Svevo (T.turgidum spp. durum). Le linee analizzate sono
costituite da piante alla seconda generazione (T2), ad eccezione della linea IM6-7b (T3)
(Tab. 3.1). Sono state analizzate 10 piante per ogni linea a cui se ne sono aggiunte altre 10
appartenenti al controllo (cv Svevo).
Le piante sono state vernalizzate per tre settimane a 4°C e successivamente allevate in
camera di crescita a 16/8 ore di fotoperiodo (43 μE/m2) con un regime di temperatura di
28°C/16°C.
Tabella 3.1. Elenco linee RNAi utilizzate.
Linee analizzate
Svevo Wild type
IM6 7b 9 Linea T3
IM17 46 2
IM17 55 4
IM17 81 1
IM17 33aII 1
Linee T2
IM17 59 2
IM17 15a 3
29
3.2 Costrutto RNAi
Le piante transgeniche sono state ottenute mediante trasformazione con il metodo

biolostico dei calli isolati dalla cv di frumento duro Svevo con il costrutto
pRDPT+GW2(RNAi) (Fig. 3.1). Il costrutto possiede un promotore ed un terminatore
endosperma specifici della subunità gluteninica ad alto peso molecolare Dx5 (Sestili et al.,
2010). La regione codificante contiene i frammenti senso e antisenso del gene GW2
separati da un introne (Sestili et al., 2010).
Figura 3.1. Schema del costrutto pRDPT+GW2(RNAi) usato per il silenziamento.
3.3 Screening PCR per la presenza del costrutto
È stata eseguita una reazione di amplificazione PCR (Polymerase Chain Reaction) con un
enzima specifico (Phire Hot Start II DNA Polymerase, Thermo Fisher Scientific) che
permette di ottenere un amplificato sfruttando direttamente una porzione della foglia, senza
ricorrere all’estrazione del DNA genomico. Con un puncher è stato prelevato un campione
di foglia del diametro di 2mm circa e messo in provetta con 20 μl di Buffer di diluizione. Il
disco fogliare è stato schiacciato con un puntale fino ad ottenere una soluzione di colore
verde. Il campione è stato, poi, agitato con il vortex e centrifugato a 12.000 rpm per 1
minuto per separare i residui di foglia dal surnatante. La reazione di PCR è stata condotta
in un volume finale di 20 μl costituita da: 0,4 μl di Phire Hot Start II DNA Polymerase, 10
30
μl di 2X Phire Plant PCR buffer (include i dNTPs e MgCl2), 0,5 μl di surnatante (DNA
genomico), 0.5 μM Primer Forward, 0.5 μM Primer Reverse e H2O fino al volume di 20 μl.
Le condizioni di amplificazione e i primer utilizzati (specifici per il costrutto) sono
riportati nelle Tabelle 3.2 e 3.3.
Tabella 3.2. Condizioni di amplificazione utilizzate.
Programma di amplificazione
Denaturazione iniziale 98°C 5 min
Denaturazione 98°C 5 sec
Annealing 72°C 5 sec

x40 cicli
Estensione 72°C 20 sec
Estensione finale 72°C 1 min
Tabella 3.3. Elenco dei primer utilizzati.
Primer Sequenza
pRDPT Forward GCAATTCGATGGGGTGCTGCT
pRDPT Reverse ACCGAATTCCTGCAGCCCGG
Ta2526 Forward CGAGATCGACCAAGAATGG
Ta2526 Reverse TGAGTGTTGCCTCCCTCC
Il prodotto di amplificazione atteso di circa 200 bp è stato visualizzato su gel di agarosio

all’1,5% in TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA) con l’aggiunta di una soluzione di bromuro di
etidio (0,5 µg/ml). La corsa elettroforetica è stata condotta ad un voltaggio di 80 V.
Le piante risultate negative al test PCR sono state analizzate ulteriormente estraendo il
DNA genomico con il protocollo descritto nel paragrafo seguente.
31
3.4 Estrazione del DNA genomico da una foglia di frumento
Il DNA genomico è stato isolato come descritto da D’Ovidio e Porceddu (1996). Un

quantitativo di tessuto pari a circa un cm2 di foglia è stato prelevato dalla pianta, messo all’
interno di una eppendorf da 1,5 ml sterile ed immediatamente immerso in azoto liquido.
Con un pestello il campione è stato macinato fino ad ottenere una polvere finissima. Al
tessuto fogliare polverizzato in azoto liquido sono stati aggiunti 160 μl di tampone di
estrazione (100mM Tris pH 8, 50mM EDTA pH 8, 500mM NaCl) e 32 μl di SDS 20%. Il
tutto è stato omogenizzato delicatamente e incubato a 65°C per 10 minuti.
Successivamente sono stati aggiunti 53,4 μl di acetato di potassio 5M e, dopo averlo
agitato delicatamente, il campione è stato posto in ghiaccio per 20 minuti per favorire la
precipitazione delle proteine denaturate.
I frammenti cellulari e le proteine sono stati separati mediante centrifugazione a 14000 rpm
per 20 minuti a temperatura ambiente, il supernatante recuperato (contenente il DNA) è
stato trasferito in una nuova eppendorf sterile. Al supernatante recuperato è stato aggiunto
isopropanolo freddo in volume pari al campione recuperato al fine di precipitare il DNA. Il
tutto è stato centrifugato a 14000 rpm per 5 minuti, e successivamente rimosso
l’isopropanolo capovolgendo l’eppendorf su carta assorbente.
Il pellet di DNA, così ottenuto, è stato lavato con 300 μl etanolo al 70% freddo,
centrifugato di nuovo a 14000 rpm per 1 minuto, asciugato per circa 15 minuti e risospeso
in 40 μl di TE (Tris 10 mM pH 8, 1 mM EDTA). Il DNA estratto è stato conservato a 4°C.
3.5 Secondo screening PCR per la presenza del costrutto
Il DNA genomico estratto dalle foglie è stato utilizzato come templato per la reazione di
PCR utilizzando le coppie di primer e le condizioni di amplificazione riportate nelle
Tabelle 3.3 e 3.4. La reazione di PCR è stata effettuata utilizzando 50 ng di DNA
genomico in un volume finale di 20 μl. La miscela di reazione è costituita da: 0,5 µM di
primer forward e primer reverse e 1X GoTaq® Green Master Mix (Promega) contenente
cloruro di magnesio (MgCl2) 3 mM, dNTP 400 μM, Green GoTaq Reaction Buffer 2X pH
8,5 e la Taq Polimerasi. Inoltre per verificare che il DNA estratto fosse adatto per
32
l’amplificazione è stato utilizzato come controllo un gene “housekeeping”, il gene Ta2526,
il cui prodotto atteso è di circa 250 bp (Nemeth et al., 2010).
Denaturazione 98°C 1 min
Annealing 60°C 1 min

x40 cicli
Estensione 72°C 1 min
Estensione finale 72°C 5 min
Il prodotto di amplificazione è stato poi visualizzato su gel di agarosio all’ 1,5% in TBE
0,5X (Tris-borato-EDTA) con l’aggiunta di una soluzione di bromuro di etidio (0,5 µg/ml)
utilizzando un voltaggio di 80 V.
3.6 Analisi di espressione del gene GW2
L'RNA totale è stato estratto da cariossidi immature prelevate a 15 giorni dopo l’antesi. Le
spighe prelevate sono state immediatamente congelate in azoto liquido e conservate a -
80°C fino al momento di condurre l’analisi. Le cariossidi sono state polverizzate in azoto
liquido con un pestello in modo da ottenere uno sfarinato, avendo cura che il materiale non
si scongelasse. L’RNA totale è stato estratto dallo sfarinato mediante il kit Spectrum Plant
Total RNA (Sigma-Aldrich). Il cDNA è stato sintetizzato a partire 1 μg di RNA utilizzato il
kit QuantiTect Reverse Trascription (Qiagen).
L’analisi di espressione quantitativa Real-Time PCR (RT-PCR) è stata effettuata attraverso
l’utilizzo dello strumento Bio-Rad CFX 96 Manager presente presso il Centro Grandi
Attrezzature dell’Università degli Studi della Tuscia. Per ogni campione sono state
effettuate 3 repliche tecniche. Le reazioni di amplificazione sono state eseguite utilizzando
33
1 µl di cDNA in un volume finale di reazione di 15 µl. La miscela di reazione è costituita
da 0,5 µM di ogni oligonucleotide e da iQTM SYBR Green Supermix 2X (BIO-RAD)
contenente il buffer, i dNTP ed il fluorofo SYBR Green. Le analisi di espressione sono
state condotte su 4 linee transgeniche e sul controllo (cv Svevo). Il cDNA prima di essere
utilizzato nei successivi esperimenti è stato controllato per eventuali contaminazioni da
DNA genomico mediante PCR. Infine l’espressione relativa (relative expression) è stata
determinata attraverso il metodo 2-ΔΔCT (Schmittgen e Livak, 2008) utilizzando sia primer
specifici per GW2 che per i suoi omeoalleli (GW2 F+R, GW2-A F+ R e GWB F+R). Le
condizioni di amplificazione sono riportate nelle Tabelle 3.5 e 3.6.
Denaturazione 95°C 10 sec
Annealing 60°C 30 sec x40cicli
Curva di melting +0,5°C Ogni 5 sec
Tabella 3.6. Elenco dei primer utilizzati nella reazione RT-PCR; come gene housekeeping è stata
utilizzata l'actina.
Primer Sequenza
TaGW2-4F GCAGAACAATCGCTCCAACA
TaGW2-4R GCCAAATCGCTTCCATAACC
TaGW2A-QF AAGCATGGGTGCTGCGGAA
TaGW2A-QR GTCAGCAAAAGGCAACGGTA
TaGW2B-QF AACGCCACCGTTGCCTGTTA
TaGW2B-QR AGAAACAAAACGGCCGAACA
Actina Forward CACTGGAATGGTCAAGGCTG
Actina Reverse CTCCATGTCATCCCAGTTG
34
3.7 Analisi Fenotipica
Le piante trasferite in camera di crescita sono state rinvasate dai contenitori jiffy in vasi del
diametro di 12 cm, per tutte si sono adottate le medesime pratiche agronomiche durante
l’intero ciclo (frequenza e quantità degli apporti idrici, concimazioni e trattamenti
antiparassitari e/o anticrittogamici). Le piante risultate malate nel corso degli esperimenti
sono state scartate, per evitare che potessero infettare le altre o falsare i risultati.
Oltre alle analisi molecolari è stato effettuato un lavoro di “phenotyping”, al fine di
verificare se il silenziamento del gene GW2 ha prodotto effetti sul fenotipo della spiga e
del seme. I caratteri presi in osservazione sono stati esaminati dopo la completa
maturazione delle piante. Per ognuna delle 8 linee è stato contato il numero di spighe,
successivamente da ogni pianta sono state prelevate le due spighe principali su cui sono
stati determinati i caratteri fenotipici di nostro interesse, riportati nelle Tabelle 3.7 e 3.8.
Tabella 3.7. Caratteri oggetto di osservazione in ogni pianta.
Numero di spighe
Peso dei semi (g.)
Peso di 100 semi (g.)
Tabella 3.8. Caratteri oggetto di osservazione nelle due spighe più grandi di ogni pianta.
Numero spighette/spiga
Lunghezza della spiga (cm.)
Larghezza della spiga (cm.)
35
4. Risultati e Discussione
4.1 Primo screening delle piante transgeniche per la presenza del

costrutto
Nel presente Elaborato sono state caratterizzate linee transgeniche di frumento duro
precedentemente prodotte presso il Laboratorio di Genetica e Biochimica della Proteine
Vegetali. In tali linee è stato introdotto con il metodo biolistico un costrutto per il
silenziamento dei geni GW2 mediante la tecnica dell'RNAi. Dalla trasformazione sono
state prodotte 7 linee transgeniche indipendenti, che sono state avanzate alla generazione
T2. Affinché le piante possano essere considerate attendibili ai fini dello studio sui possibili
effetti indotti dal silenziamento del gene GW2, si deve essere sicuri che la trasformazione
sia avvenuta con successo. Al fine di individuare le piante positive per la presenza del
costrutto RNAi, è stata effettuata una prima analisi PCR utilizzando dei primer specifici
che si appaiano sul costrutto (vedi materiali e metodi). Le analisi sono state condotte
direttamente su dischi fogliari del diametro di 1 mm utilizzando il kit Phire Plant Direct
PCR (Thermo Fisher Scientific), il quale non prevede l'estrazione del DNA genomico ma
utilizzata direttamente il disco fogliare come templato per la reazione PCR. Il vantaggio
nell’utilizzare questa metodica è dovuto alla velocità con cui si ottengono i risultati,
potendo infatti saltare tutte le fasi necessarie per l'estrazione del DNA genomico. In totale
sono state analizzate 10 piante per ciascuna delle 7 linee transgeniche derivate dalla
trasformazione con il costrutto pRDPT+GW2(RNAi). Nella Tabella 4.1 sono riportati i
risultati con le linee positive al costrutto RNAi e da cui ci si aspetta una riduzione
nell’espressione di GW2. Le 6 linee transgeniche T2 sono ancora segreganti per il costrutto,
mentre la linea IM6-7b 9 (generazione T3) è l'unica linea omozigote.
36
Tabella 4.1. Risultati dello screening sulle piante T3 e T2 delle diverse linee per la presenza del
costrutto pRDPT+GW2(RNAi).
Linee RNAi per GW2 N° piante positive N° piante negative
IM6 7b 9 T3 10/10 0/10

IM17 46 2 T2 6/10 4/10
IM17 55 4 T2 5/10 5/10
IM17 81 1 T2 5/10 5/10
IM17 33aII 1 T2 7/10 3/10
IM17 59 2 T2 7/10 3/10
IM17 15a 3 T2 8/10 2/10
Su un totale di 70 piante sottoposte ad analisi PCR, 48 sono risultate essere positive per la
presenza del costrutto GW2-RNAi; le rimanenti 22 non hanno dato nessun amplificato. Il
controllo Svevo, come atteso, non ha prodotto nessuna amplicone. In Figura 4.1, è riportato
come esempio, la corsa elettroforetica su gel di agarosio delle analisi PCR condotte su due
linee transgeniche (IM6-7b 9 e IM17-46 2).
Figura 4.1. Corsa elettroforetica su gel di agarosio all’ 1,5% dei prodotti PCR. A sinistra le piante
della linea T3, presentano tutte la banda relativa alla presenzaa del costrutto pRDPT+GW2(RNAi);
sulla destra i risultati della linea IM17 46 2+T2, le piante 1, 2, 6, 7, 9 e 10 sono positive, le
rimanenti negative.
37
4.2 Secondo screening delle piante transgeniche per la presenza del
costrutto
Le piante che dal primo screening erano dubbie (banda leggera) o negative sono state
ulteriormente caratterizzate mediante un ulteriore screening condotto non direttamente sul
disco fogliare ma sul DNA genomico estratto da foglia. Queste analisi sono necessarie in
quanto il kit utilizzato per il primo screening utilizza una taq polimerasi (la “Phire Taq II”)
altamente processiva che permette di ridurre sensibilmente i tempi necessari per una
reazione di amplificazione, a scapito però dell’efficienza.
Nella seconda analisi, quindi sono state analizzate soltanto 22 piante. La Tabella 4.2
mostra le piante positive per la presenza del costrutto GW2-RNAi, e quelle definite nulli
segreganti in quanto hanno perso il costrutto. In Figura 4.2 è riportato come esempio, la
corsa elettroforetica su gel di agarosio della seconda analisi PCR condotta sulla linea
transgenica IM17 15 a-3 e sulla cultivar di controllo Svevo.
Figura 4.2. Corsa elettroforetica su gel di agarosio all’ 1,5% dei prodotti PCR. A sinistra la linea
IM17 15 a-3, le piante n° 3 e 4 sono negative anche alla seconda analisi; a destra le piante del
controllo Svevo, come ci aspetta non essendo trasformato non presenta nessuna banda.
38
Tabella 4.2. Risultati definitivi dello screening sulle piante T 3 e T2 delle diverse linee per la
presenza del costrutto pRDPT+GW2(RNAi).
Linee RNAi N°pt Risultato Linee RNAi N°pt Risultato

amplificazione amplificazione
IM6 7b 9 1 Positiva IM17 33aII 1 1 Positiva

2 Positiva 2 Positiva
3 Positiva 3 Negativa
IM17 46 2 1 Positiva IM17 59 2 1 Positiva
3 Negativa 3 Positiva
IM17 55 4 1 Positiva IM17 15a 3 1 Positiva
3 Negativa 3 Negativa
4 Negativa 4 Negativa
IM17 81 1 1 Positiva
2 Positiva
3 Positiva
4 Positiva
5 Negativa
6 Positiva
7 Positiva
8 Negativa
9 Positiva
10 Negativa
39
Con questo secondo screening abbiamo stabilito che 6 piante, che nell’analisi precedente
risultavano negative, sono in realtà positive alla presenza del costrutto e sono
rispettivamente: IM17 46 2, pianta 5 e 8; IM17 81 1, pianta 2 e 9; IM17 33aII 1, pianta 5;
IM17 59 2, pianta 4. Eseguire, quindi, un secondo screening utilizzando una taq polimerasi
(GoTaq® Promega) meno processiva e come templato il DNA genomico ha permesso di
ottenere dei risultati più attendibili rispetto al primo screening. Riassumendo, quindi,
delle 70 piante analizzate per la presenza del costrutto pRDPT+GW2(RNAi) 54 sono
risultate transgeniche, le rimanenti 16 sono linee nulli segreganti e sono state scartate da
tutte le analisi successive.
4.3 Valutazione del profilo di espressione di GW2
Al fine di verificare il corretto funzionamento del costrutto GW2-RNAi, sono state

effettuate analisi di espressione dei trascritti di GW2 in 4 linee transgeniche riportate in
Tabella 4.3. In una pianta transgenica il costrutto o il gene inserito potrebbe essere presente
ma non necessariamente espresso, per questo la scelta del promotore è molto importante,
poiché permette di scegliere quando e dove il costrutto deve essere espresso. Nel caso delle
piante analizzate in questo Elaborato, è stato utilizzato un promotore endosperma
specifico, di conseguenza le analisi di espressione sono state condotte sul RNA
messaggero estratto da cariossidi immature (15 DPA). Il profilo di espressione è stato
valutato su quattro piante, ognuna proveniente da una diversa linea transgenica, più una
pianta della cultivar Svevo che costituisce il controllo.
Tabella 4.3. Linee il cui CDNA è stato amplificato per l’actina e che in seguito sono state
sottoposte ad analisi di espressione.
Codice linea Numero attribuito
IM67b9-8 1
IM17462-1 2
IM1715a3-5 3
IM1733aII1-4 4
SVEVO-5 5
40
Prima di condurre le analisi di espressione (RT-PCR) la purezza del cDNA prodotto è stata
verificata mediante un’amplificazione con una coppia di oligonucleotidi specifica per il
gene codificante l'actina. La corsa elettroforetica degli ampliconi PCR ha mostrato la
presenza della banda attesa e l'assenza sia di prodotti aspecifici che di contaminazioni da
DNA genomico (Fig. 4.3).
Figura 4.3. Corsa elettroforetica su gel di agarosio all’ 1,5% dei prodotti PCR per il gene
dell’actina. Da 1 a 4 le diverse linee transgeniche; 5 la cultivar Svevo.
Le analisi di espressione sono state condotte con tre differenti coppie di primer specifiche
per il gene GW2. Due coppie sono omeoallele specifiche (una per l'allele GW2-A e l'altra
per GW2-B), mentre la terza coppia amplifica contemporaneamente i due alleli. Come
evidente in Figura 4.4 e Tabella 4.4 il costrutto per il silenziamento del gene GW2 è stato
espresso nelle cariossidi delle linee transgeniche e ha determinato una drastica riduzione
dei trascritti del gene GW2 nelle linee RNAi rispetto al controllo (cv Svevo). In particolare
la percentuale di messaggeri è diminuita in valore compreso tra 80 e 87%. L'efficienza di
silenziamento è maggiore rispetto a quella osservata in frumento tenero sia da Bednarek et
al. (2012) (valore medio del 40%) che da Hong et al. (2014) (59-60%). Nonostante
un'omologia di sequenza superiore al 98% tra i due omeoalleli GW2 (Hong et al., 2014), le
analisi di espressione relativa hanno evidenziato un'efficienza di silenziamento maggiore
per i trascritti dell'allele GW2-B. In particolare i risultati ottenuti utilizzando le due coppie
di primer omeoallele specifiche hanno mostrato una riduzione del 74-84% dei trascritti
dell'allele GW2-A e del 89-95% dell'allele GW2-B. Questi dati sono in accordo con quanto
41
visto da Bednarek et al (2012) e Hong et al (2014), i quali osservarono una riduzione di
tutti e tre gli omeoalleli GW2 in frumento tenero, ma con differenti livelli di sotto-
regolazione.
Tabella 4.4. Valori dell'espressione relativa del gene GW2 nelle quattro linee transgeniche. Per
convenzione al controllo (cv Svevo) è stato attribuito il valore 1 corrispondente al 100% di
espressione.
Linea GW2 GW2A GW2B
SVEVO 1 1 1
IM17-15a 3T2-5 0.16 0.16 0.11
IM17-33aII 1T2-4 0.13 0.17 0.1
IM6-7b 9T3-8 0.17 0.19 0.05
IM17-46 2 T2-1 0.2 0.26 0.1
Figura 4.4. Valori di espressione relativa ottenuti confrontando la quantità di RNA messaggeri del
gene GW2 tra le linee transgeniche e il controllo (cv Svevo). La prima coppia di primer amplifica
entrambi gli omeoalleli GW2, mentre le altre due coppie sono specifiche rispettivamente per l'allele
GW2-A e GW2-B. In grigio è riportato il controllo (Svevo), mentre le linee transgeniche sono di
diversi colori. Ciascun campione è riportato con la rispettiva deviazione standard.
42
In conclusione, la valutazione del profilo di espressione di GW2 nelle quattro linee positive
per il costrutto RNAi evidenzia un'importante diminuzione dei livelli di trascritto e con
valori della deviazione standard accettabili. La linea IM17-15a 3-5 in particolare è quella
in cui i livelli di messaggero del gene GW2 sono maggiormente ridotti (-84%), mentre
l'espressione degli omeoalleli GW2-A e GW2-B è diminuita rispettivamente del 84% e
89%. La linea in cui il silenziamento ha avuto invece effetti meno positivi è la IM17-46 2-
1; la riduzione del suo trascritto è pari all'80% per GW2, 74% per l’omeoallele GW2-A e
90% per GW2-B.
4.4 Fenotipizzazione delle linee transgeniche
Il lavoro di fenotipizzazione è stato condotto su piante che avevano raggiunto il completo

stadio di maturazione. In totale sono state caratterizzate 50 piante, in quanto sono state
escluse dalle analisi le pianti nulli segreganti (che hanno perso il costrutto per
segregazione) e quelle che avevano manifestato sintomi dovuti ad infezioni da agenti
patogeni. I caratteri fenotipi presi in considerazione sono stati i seguenti: numero di spighe
per pianta, numero di spighette per spiga, lunghezza e larghezza della spiga, peso semi per
pianta e peso di 100 semi (Tab. 3.7 e 3.8).
Due linee transgeniche (IM6-7b 9 e IM17-46 2) hanno mostrato un aumento significativo
(P<0,05) del numero totale di spighe rispetto al controllo (cv Svevo). Inoltre, in tutte le
linee transgeniche, ad eccezione della linea IM6-7b, è stato osservato un numero di
spighette per spiga maggiore (variabile tra 12 e 12,75) rispetto a Svevo (11,11) (Tab. 4.5).
Per quanto riguarda gli altri parametri considerati, soltanto la linea IM6-7b ha mostrato una
spiga di larghezza superiore rispetto al controllo (Tab. 4.5); mentre non sono state
riscontrate differenze significative per la produzione di granella per pianta e il peso di 100
semi, ad eccezione della linea IM17-55 4 che per questo ultimo carattere ha manifestato un
incremento consistente pari al 36% rispetto a Svevo.
Per riassumere la sottoregolazione di GW2 nel nostro caso non ha influenzato le
dimensioni delle cariossidi in tutte le linee transgeniche: infatti, tranne che in una linea, il
peso dei 100 semi è rimasto invariato rispetto al controllo.
La sottoregolazione del gene GW2 in frumento tenero ha dato risultati contrastanti, che
differiscono da quanto osservato nelle linee transgeniche di frumento duro caratterizzate in
questo Elaborato. Il silenziamento dell'omeoallele GW2-A in mutanti naturali è stato
43
associato a semi di maggior dimensione e con rese superiori sia in frumento duro che
tenero (Simmonds et al., 2016; Su et al., 2011). Bednarek et al. (2012) hanno riscontrato
una diminuzione delle dimensioni della cariosside in linee transgeniche GW2-RNAi senza
tuttavia osservare effetti pleiotropici per quanto riguarda il numero di semi e il numero di
spighe per pianta. Hong et al. (2014), diversamente, hanno riportato l'effetto opposto:
ovvero le piante transgeniche RNAi, in cui l'espressione dei geni GW2 è stata ridotta,
hanno prodotto semi più larghi e di peso maggiore rispetto alla varietà di riferimento.
Sebbene le ragioni alla base di queste divergenze non siano note, è possibile fare diverse
ipotesi. Innanzi tutto, gli studi condotti su mutanti naturali di frumento duro e tenero si
sono focalizzati su polimorfismi dell'allele TaGW2-A. In tali mutanti, almeno un
omeoallele (due nel caso del frumento tenero) è funzionale; diversamente, sia nelle linee
transgeniche di frumento duro caratterizzate in questo Elaborato che in quelle di frumento
tenero (Bednarek et al., 2012; Hong et al., 2014) tutti gli omeoalleli sono stati bersagliati.
È possibile che la sottoregolazione di tutti gli omeoalleli ha degli effetti pleiotropici
indesiderati, che, invece, sono mascherati dalla presenza di almeno un allele funzionale nei
mutanti naturali. Un'altra possibile spiegazione ai diversi effetti riscontrati nelle linee
transgeniche GW2-RNAi di frumento tenero e duro è che non è possibile escludere il
silenziamento, oltre al gene di interesse, di geni off-target coinvolti nella regolazione delle
dimensioni e del peso dei semi.
I risultati ottenuti in frumento duro e tenero (Bednarek et al., 2012) sono in contrasto anche
con quanto osservato in riso (Song et al., 2007). Infatti, sono state prodotte linee NIL di
riso mutanti in cui il gene OsGW2 è represso, che producono semi con un peso aumentato
di circa il 50% rispetto alla varietà di riferimento. Questa differenza può essere dovuta
all'assenza completa della proteina nel mutante, in quanto, il riso essendo una specie
diploide ha un unico allele GW2.
Per la produzione delle linee transgeniche di frumento duro, qui caratterizzate, è stato
utilizzato un costrutto il cui promotore è endosperma specifico: il silenziamento, quindi,
avviene solo a livello delle cariossidi, mentre la proteina GW2 continua a essere prodotta
nei restanti tessuti della pianta. Bednarek et al. (2012) invece hanno utilizzato un
promotore costitutivo per cui il silenziamento è avvenuto a livello dell’intero organismo;
questo potrebbe spiegare il motivo per cui i semi delle loro linee si presentavano con
dimensioni ridotte rispetto al controllo. È possibile che GW2 sia coinvolto anche in altre
funzioni, e che la sottoregolazione dell’espressione di tutti gli omeologhi porti ad una
44
generale diminuzione dell’efficienza e del potenziale della pianta nel produrre semi di
grandi dimensioni (Simmonds et al., 2016).
Le analisi di espressione quantitativa hanno evidenziato che circa il 20% dei trascritti GW2
è ancora presente nelle cariossidi immature nelle linee RNAi di frumento duro; mentre in
altri lavori sopracitati, sono stati caratterizzati mutanti di tipo knock out in cui il gene è
stato completamente silenziato.
I risultati suggeriscono che i differenti omeologhi del gene GW2 possono contribuire alle
rese in modo differente. Questa ipotesi è avvalorata da Hong et al. (2014), i quali per
capire se TaGW2-A, TaGW2-B e TaGW2-D condividono lo stesso pattern di espressione
hanno eseguito analisi sull’abbondanza dei trascritti dei differenti omeologhi in diverse
varietà caratterizzate da semi piccoli e grandi e correlato il dato con la dimensione dei
semi. È stato osservato che l’abbondanza dell'omeoallele TAGW2-A è negativamente
associata con la larghezza dei semi in frumento tenero, mentre i livelli di trascritto di
TaGW2-B e TaGW2-D mostrano una tendenza opposta. Quindi, è probabile che la
sottoregolazione di entrambi gli omeoalleli in frumento duro, cosi come in frumento
tenero, abbia effetti negativi sulle dimensioni delle cariossidi rispetto al silenziamento del
singolo omeoallele TaGw2-A.
45
Tabella 4.5. Dati relativi alla fenotipizzazione delle linee GW2-RNAi. L'asterisco indica i valori
Linee IM6 7b 9 IM17 46 2 IM17 55 4 IM17 81 1 IM17 33aII 1 IM17 59 2 IM17 15a 3 SVEVO
significativamente differenti rispetto al controllo (cv Svevo) (t-student P<0,05).
Peso 100 semi

(g) 4,21 ± 1,2 4,09 ± 0,76 5,11 ± 0,46* 3,89 ± 1,18 3,57 ± 1,05 4,25 ± 1,2 4,09 ± 0,78 3,73 ± 0,95
Peso
semi/pianta (g) 6,92 ± 2,55 5,67 ± 1,63 5,75 ± 1,59 5,32 ± 1,54 6,93 ± 1,9 6,08 ± 1,64 6,8 ± 1,97 5,58 ± 2,36
46
Larg spiga (cm) 1,29 ± 0,16* 1,13 ± 0,12 1,27 ± 0,19 1,11 ± 0,13 1,18 ± 0,17 1,21 ± 0,19 1,13 ± 0,07 1,17 ± 0,17
Lung spiga
(cm) 5,71± 0,26 5,92 ± 0,27 6,18 ± 0,39* 6,28 ± 0,44* 6,23 ± 0,36* 6,07 ± 0,48 6,21 ± 0,31* 5,76 ± 0,21
N°
spighette/spiga 11,35 ± 0,74 12,31 ± 0,87* 12,75 ± 1,03* 12,66 ± 1,49* 12,5 ± 0,89* 12,68 ± 0,7* 12 ± 0,73* 11,11 ± 0,6
N°
Spighe/pianta 10,4 ± 1,74* 10,8 ± 1,46* 8,5 ± 1,73 8,6 ± 0,89 10 ± 1,41 8,66 ± 0,81 8,37 ± 1,3 8,77 ± 1,2
5. Conclusioni
 Lo screening delle piante transgeniche prodotte dalla trasformazione con il costrutto
pRDPT+GW2(RNAi) attraverso il metodo biolistico ha permesso di identificare 7 linee
indipendenti, di cui una omozigote e 6 ancora segreganti (eterozigoti).
 Le analisi di espressione genica hanno evidenziato una drastica riduzione
dell'abbondanza dei trascritti GW2 (-80% rispetto al controllo). L'utilizzo di coppie di
primer specifici per i due omeoalleli GW2 ha confermato che il costrutto RNAi agisce
su entrambi, anche se è più efficiente nei confronti dell'omeoallele GW2-B.
 Le analisi fenotipiche hanno evidenziato un aumento significativo del numero di
spighette per spiga e della lunghezza della spiga, rispettivamente, in 6 e 4 linee su 7.
Solo una linea ha mostrato un aumento significativo nel peso dei 100 semi (+36%)
rispetto al controllo.
47
6. Bibliografia
http://faostat.fao.org/beta/en/#home
http://www.ismeamercati.it/analisi-e-studio-filiere-agroalimentari
Agcaoili, M., Rosegrant, M. W. (1995). Global and regional food supply, demand, and
trade prospects to 2010. In Population and food in the early twenty-first century: Meeting
future food demand of an increasing population.
Battisti, D. S., Naylor, R. L. (2009). Historical warnings of future food insecurity with
unprecedented seasonal heat. Science, 323: 240-244.
Bednarek, J., Boulaflous, A., Girousse, C., Ravel, C., Tassy, C. et al. (2012). Down-
regulation of the TaGW2 gene by RNA interference results in decreased grain size and
weight in wheat. Journal of Experimental Botany, 63: 5945-5955.
Berry, P. M., Sylvester-Bradley, R., Berry, S. (2007). Ideotype design for lodging-resistant
wheat. Euphytica, 154: 165-179.
Braun, H. J., Atlin, G., Payne, T. (2010). Multi-location testing as a tool to identify plant
response to global climate change. Climate Change and Crop Production, 115-138.
Dong, L., Wang, F., Liu, T., Dong, Z., Li, A. et al. (2014). Natural variation of TaGASR7-
A1 affects grain length in common wheat under multiple cultivation conditions. Molecular
Breeding, 34: 937-947.
Dubcovsky, J., Dvorak, J. (2007). Genome plasticity a key factor in the success of
polyploid wheat under domestication. Science, 316: 1862-1866.
Elbashir, S. M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., Tuschl, T. (2001).
Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster
embryo lysate. The EMBO Journal, 20: 6877-6888.
48
Fan, C., Xing, Y., Mao, H., Lu, T., Han, B. et al. (2006). GS3, a major QTL for grain
length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative
transmembrane protein. Theoretical and Applied Genetics, 112: 1164-1171.
Feldman M. 1995. Wheats. In: Smartt J, Simmonds NW, eds. Evolution of crop plants.
Harlow, UK: Longman Scientific and Technical, 185–192.
Foulkes, M. J., Slafer, G. A., Davies, W. J., Berry, P. M., Sylvester-Bradley, R. et al.
(2011). Raising yield potential of wheat. III. Optimizing partitioning to grain while
maintaining lodging resistance. Journal of Experimental Botany, 62: 469-486.
Gale, M. D., Devos, K. M. (1998). Comparative genetics in the grasses. Proceedings of the
National Academy of Sciences, 95: 1971-1974.
Godfray, H. C. J., Beddington, J. R., Crute, I. R., Haddad, L., Lawrence, D. et al. (2010).
Food security: the challenge of feeding 9 billion people. Science, 327: 812-818.
Hong, Y., Chen, L., Du, L. P., Su, Z., Wang, J. et al. (2014). Transcript suppression of
TaGW2 increased grain width and weight in bread wheat. Functional Integrative
Genomics, 14: 341-349.
Huang, X., Qian, Q., Liu, Z., Sun, H., He, S. et al. (2009). Natural variation at the DEP1
locus enhances grain yield in rice. Nature Genetics, 41: 494-497.
Jaiswal, V., Gahlaut, V., Mathur, S., Agarwal, P., Khandelwal, M. et al. (2015).
Identification of novel SNP in promoter sequence of TaGW2-6A associated with grain
weight and other agronomic traits in wheat (Triticum aestivum L.). PloS ONE, 10:
e0129400.
Kojima, S., Takahashi, Y., Kobayashi, Y., Monna, L., Sasaki, T. et al. (2002). Hd3a, a rice
ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hd1
under short-day conditions. Plant and Cell Physiology, 43: 1096-1105.
49
Li, Y., Fan, C., Xing, Y., Jiang, Y., Luo, L. et al. (2011). Natural variation in GS5 plays an
important role in regulating grain size and yield in rice. Nature Genetics, 43: 1266-1269.
Lorenzetti F., Ceccarelli S., Rosellini D., Veronesi F. (2011). Genetica Agraria; Genetica e
biotecnologie per l’agricoltura. IV Edizione. Patron Editore Bologna.
Matsuoka, Y. (2011). Evolution of polyploid Triticum wheats under cultivation: the role of
domestication, natural hybridization and allopolyploid speciation in their
diversification. Plant and Cell Physiology, 52: 750-764.
Mazzucotelli, E., Belloni, S., Marone, D., De Leonardis, A. M., Guerra, D. et al. (2006).
The E3 ubiquitin ligase gene family in plants: regulation by degradation. Current
Genomics, 7: 509-522.
Nalam, V. J., Vales, M. I., Watson, C. J., Kianian, S. F., Riera-Lizarazu, O. (2006). Map-
based analysis of genes affecting the brittle rachis character in tetraploid wheat (Triticum
turgidum L.). Theoretical and Applied Genetics, 112: 373-381.
Nemeth, C., Freeman, J., Jones, H. D., Sparks, C., Pellny, T. K. et al. (2010). Down-
regulation of the CSLF6 gene results in decreased (1, 3; 1, 4)-β-D-glucan in endosperm of
wheat. Plant Physiology, 152: 1209-1218.
Pickart, C. M. (2001). Mechanisms underlying ubiquitination. Annual Review of

Biochemistry, 70: 503-533.
Ray, D. K., Mueller, N. D., West, P. C., Foley, J. A. (2013). Yield trends are insufficient to
double global crop production by 2050. PloS ONE, 8: e66428.
Ray, D. K., Ramankutty, N., Mueller, N. D., West, P. C., Foley, J. A. (2012). Recent
patterns of crop yield growth and stagnation. Nature Communications, 3: 1293.
Sadanandom, A., Bailey, M., Ewan, R., Lee, J., Nelis, S. (2012). The ubiquitin–proteasome
system: central modifier of plant signalling. New Phytologist, 196: 13-28.
50
Schmittgen, T. D., Livak, K. J. (2008). Analyzing real-time PCR data by the comparative
CT method. Nature Protocols, 3: 1101-1108.
Sestili, F., Janni, M., Doherty, A., Botticella, E., D'Ovidio, R. et al. (2010). Increasing the
amylose content of durum wheat through silencing of the SBEIIa genes. BMC Plant
Biology, 10: 1.
Shewry, P. R. (2009). Wheat. Journal of Experimental Botany, 60: 1537-1553.
Simmonds, J., Scott, P., Brinton, J., Mestre, T. C., Bush, M. et al. (2016). A splice acceptor
site mutation in TaGW2-A1 increases thousand grain weight in tetraploid and hexaploid
wheat through wider and longer grains. Theoretical and Applied Genetics, 129: 1099-1112.
Smith, N. A., Singh, S. P., Wang, M. B., Stoutjesdijk, P. A., Green, A. G., Waterhouse, P.
M. (2000). Gene expression: total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature, 407:
319-320.
Snape, J. W., Foulkes, M. J., Simmonds, J., Leverington, M., Fish, L. J. et al. (2007).
Dissecting gene× environmental effects on wheat yields via QTL and physiological
analysis. Euphytica, 154: 401-408.
Song, X. J., Huang, W., Shi, M., Zhu, M. Z., Lin, H. X. (2007). A QTL for rice grain width
and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase. Nature
Genetics, 39: 623-630.4
Su, Z., Hao, C., Wang, L., Dong, Y., Zhang, X. (2011). Identification and development of
a functional marker of TaGW2 associated with grain weight in bread wheat (Triticum
aestivum L.). Theoretical and Applied Genetics, 122: 211-223.
Taiz, L., Zeiger, E., Møller, I. M., Murphy, A. (2015). Plant physiology and development.
Sinauer Associates, Incorporated.
51
Tilman, D., Balzer, C., Hill, J., Befort, B. L. (2011). Global food demand and the
sustainable intensification of agriculture. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 108: 20260-20264.
Varshney, R. K., Sigmund, R., Börner, A., Korzun, V., Stein, N. et al. (2005). Interspecific
transferability and comparative mapping of barley EST-SSR markers in wheat, rye and
rice. Plant Science, 168: 195-202.
Wang, S., Li, S., Liu, Q., Wu, K., Zhang, J. et al. (2015). The OsSPL16-GW7 regulatory
module determines grain shape and simultaneously improves rice yield and grain
quality. Nature Genetics, 47: 949-954.
Yang, Z., Bai, Z., Li, X., Wang, P., Wu, Q. et al. (2012). SNP identification and allelic-
specific PCR markers development for TaGW2, a gene linked to wheat kernel
weight. Theoretical and Applied Genetics, 125: 1057-1068.
52
View publication stats

Miglioramentodellereseinfrumentoduromediantesilenziamentodelgene Grain Weight 2

Caricato da

Informazioni sul documento

Titolo originale

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Miglioramentodellereseinfrumentoduromediantesilenziamentodelgene Grain Weight 2

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

Miglioramento delle rese in frumento duro mediante silenziamento del gene

Thesis · January 2017

The user has requested enhancement of the downloaded file.

DIPARTIMENTO DI SCIENZE AGRARIE E FORESTALI (DAFNE)

CORSO DI LAUREA DI 1° LIVELLO IN “SCIENZE AGRARIE E

Miglioramento delle rese in frumento duro mediante

Prof: Francesco Sestili Simone Camazzola

Anno accademico 2015/2016

1.1 Il frumento .................................................................................................................... 1

1.1.1 Origine e filogenesi del frumento .......................................................................... 2

1.1.2 Il successo del frumento ........................................................................................ 4

1.2 Il Problema delle rese ................................................................................................... 6

1.2.1 Possibili soluzioni per aumentare le rese ............................................................... 7

1.3 Il miglioramento genetico ............................................................................................ 8

1.3.1 Il miglioramento genetico convenzionale ............................................................. 9

1.3.2 Il miglioramento genetico non convenzionale .................................................... 10

1.3.2.1 Traformazione con metodo biolistico ........................................................... 11

1.3.2.2 Trasformazione con Agrobacterium tumefaciens ......................................... 12

1.3.2.3 RNA interference (RNAi) ............................................................................. 14

1.4.1 Il gene Grain Weight 2 (GW2) ............................................................................ 17

1.4.2 Ruolo della proteina GW2 in frumento ............................................................... 19

1.4.3 La proteina RING e la reazione di ubiquitinazione ............................................. 24

1.5 Altri geni implicati nelle rese ..................................................................................... 25

1.5.1 Il gene Grain weight 7 (GW7) ............................................................................. 25

1.5.2 Il gene GASR7 .................................................................................................... 26

1.5.3 Il gene Dense and Erect Panicle 1 (DEP1) .......................................................... 26

3. Materiali e Metodi ......................................................................................................... 29

3.1 Materiale vegetale ...................................................................................................... 29

3.2 Costrutto RNAi .......................................................................................................... 30

3.3 Screening PCR per la presenza del costrutto ............................................................. 30

3.4 Estrazione del DNA genomico da una foglia di frumento ......................................... 32

3.6 Analisi di espressione del gene GW2......................................................................... 33

3.7 Analisi fenotipica ....................................................................................................... 35

4. Risultati e Discussione ................................................................................................... 36

4.3 Valutazione del profilo di espressione di GW2 ......................................................... 40

4.4 Fenotipizzazione delle linee transgeniche .................................................................. 43

1.1.1 Origine e filogenesi del frumento

Figura 1.4. Caratteristiche morfologiche della spiga selezionate dall'uomo.

1.1.2 Il successo del frumento

Figura 1.5. Areale di produzione del frumento in Italia.

1.2 Il Problema delle rese

1.2.1 Possibili soluzioni per aumentare le rese

Durante la Rivoluzione Verde le rese di frumento aumentarono notevolmente, grazie

1.3 Il miglioramento genetico

1.3.1 Il miglioramento genetico convenzionale

1.3.2 Il miglioramento genetico non convenzionale

1.3.2.1 Trasformazione con il metodo biolistico

Il bombardamento mediante metodo biolistico fa uso di un processo chimico-fisico per il

1.3.2.2 Trasformazione con Agrobacterium tumefaciens

1.3.2.3 RNA interference (RNAi)

1.4 Geni implicati nella determinazione delle dimensioni della cariosside

1.4.1 Il gene Grain Weight 2 (GW2)

Il completo sequenziamento del genoma di riso (Oryza sativa) ha reso possibile

1.4.2 Ruolo della proteina GW2 in frumento

1.4.3 La proteina RING e la reazione di ubiquitinazione

1.5 Altri geni implicati nelle rese

1.5.1 Il gene Grain weight 7 (GW7)

1.5.3 Il gene Dense and Erect Panicle 1 (DEP1)

Studi su popolazioni di mappa basate sull’incrocio di diverse varietà di riso hanno

3.1 Materiale vegetale

Tabella 3.1. Elenco linee RNAi utilizzate.

Svevo Wild type