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1.


Concetti*di*base*sul*metabolismo

1.*Definizioni,*pathways*e*cicli*
2.*Bioenergetica*
3.*Meccanismi*di*regolazione*metabolica*
3.*Approcci*per*lo*studio*del*metabolismo

G. Gilardi - Biochimica

Definizioni,*pathways,*cicli

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Metabolismo*cellulare:*

condizioni*blande*ma*perfettamente*controllate
• Paragone*sintesi*in*chimica*organica*e*nella*cellula:*
– Temperatura*ambiente*
– 1*atm*
– pH*neutro*
– Molte*reazioni,*simultanee,*regioE*e*stereoEspecifiche*
– Rese*del*100%

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“The*metabolic*pathways” • Nelle cellule avvengono ogni


secondo milioni di reazioni diverse
• Nel loro insieme sembrano una
carta stradale, con molte diverse
vie ma con grandi vie comuni che
interconnettono le diverse vie
• Queste sono le vie centrali del
metabolismo

G.*Gilardi*E*Biochimica*
Il*metabolismo
• Metabolismo*=*catabolismo*+*
anabolismo*

• Catabolismo*=*reazioni*di*
degradazione*che*liberano*
energia*(esoergoniche)*
• Anabolismo*=*reazioni*di*
sintesi*che*richiedono*
energia*(endoergoniche)
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Concetti:
• Pathways((sentieri)(:(sequenze*specifiche*di*reazioni*

• Flussi:*relazionano*diverse*pathways,*il*flusso*rappresenta*il*
controllo*fra*pathways*diverse.*Vedremo*come*il*controllo*viene*
esercitato*sull’attività*enzimatica*(regolazione*enzimatica)*

• Le*pathways*cataboliche*e*anaboliche*procedono*su*3*stadi*di*
complessità*(figura*a*destra):*

1. Interconversione*di*polimeri*e*lipidi*complessi*in*intermedi*più*
semplici*e*monomerici*

1. Interconversione*di*zuccheri,*amino*acidi,*lipidi*con*piccole*
molecole*organiche*più*semplici*

1. Degradazione*o*sintesi*di*queste*molecole*organiche*più*semplici*in*
o*da*composti*quali*CO2,*H2O*e*NH3

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Alcune*definizioni*di*metabolismo*

o*di*organismi*con*metabolismo*specifico:

Pathways*centrali*
• Sono*quelle*maggiori*che*provvedono*alla*gran*maggioranza*di*sintesiEdegradazione*metabolica*e*che*sono*
comuni*in*tutti*gli*organismi*per*esempio*(glicolisi,*ciclo*di*Krebs,*betaEossidazione,*ciclo*dell’urea,*respirazione,*
fosforilazione*ossidativa)*

Metabolismo*energetico*
• Parte*del*metabolismo*intermedio*che*genera*energia*metabolica*

Metabolismo*intermedio:*
• Insieme**di*reazioni*che*generano*e*immagazzinano*energia*per*poi*usarla*per*la*sintesi*di*molecole*a*basso*peso*
molecolare*

Autotrofi*
• Organismi*che*usano*la*CO*2*e*H2O*per*la*sintesi*del*glucosio*e*di*tutte*le*molecole*organiche*necessarie*(per*
esempio*le*piante,*l’energia*deriva*dalla*luce)* *from*which*they*synthesise*glucose*and*all*their*organic*molecules*
2

Eterotrofi*
• Organismi*che*usano*molecole*organiche,*per*esempio*zuccheri,*per*la*sintesi*di*altre*molecole*organiche*e*per*il*
loro*metabolismo*(per*esempio*animali)*

Aerobi*
• Dipendono*dalla*respirazione*cellulare,*cioè*dall’accoppiamento*dell’energia*generata*dall’ossidazione*di*sostanze*
nutrienti*con*l’ossigeno*molecolare**
Anaerobi*
• Derivano*la*loro*energia*metabolica*da*processi*che*non*coinvolgono*l’ossigeno*molecolare*

Organismi*termofili*
• Possono*vivere*fino*a*100°C,*generalmente*si*trovano*nei*pressi*di*vulcani*o*in*sistemi*geotermici*al*fondo*di*
oceani,*la*loro*energia*metabolica*non*dipende*necessariamente*dalla*luce*solare*ma*sono*comunque*autotrofi*!

Il*catabolismo*tende*a*convergere,**
l’anabolismo*a*divergere
Metabolismo:*

sguardo*di*insieme
• Glicolisi:*
– E’*il*processo*che*porta*alla*degradazione*degli*zuccheri,*in*
particolare*il*glucosio*
– La*produzione*di*piruvato*è*comune*a*tutti*gli*organismi,*
aerobici*o*anaerobici*
– Negli*aerobi*il*piruvato,*porta*ad*acetilECoA*che*entra*nel*ciclo*
di*Krebs*a*dare*CO2**
– Negli*anaerobi*entra*nel*processo*della*fermentazione*a*dare*
lattato*ed*etanolo*
• Respirazione*(trasporto*elettronico)*e*fosforilazione*
ossidativa:*
– Il*ciclo*di*Krebs*genera*unità*riducenti*trasportate*su*NAD(P)H*
e*FADH2*la*cui*riossidazione*genera*H2O*nel*trasporto*
elettronico*e*ATP*nella*fosforilazione*ossidativa*
• Fotosintesi*
– Processo*nel*quale*le*piante*catturano*l’energia*della*luce*per*
generare*ATP*e*unità*riducenti*trasportate*dal*NADPH.*
Entrambe*queste*molecole*servono*per*la*sintesi*di*carboidrati*
• Gluconeogenesi*
– Processo*anabolico*che*porta*alla*sintesi*di*glucosio*e*da*qui*
altri*carboidrati

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Ecco*come*
schematizzeremo*le*
varie*fasi*del*
metabolismo*per*
posizionare*le*
pathways*che*
studieremo:

Ciclo di Krebs o
Glicolisi
Ciclo dell’acido citrico

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Bioenergetica

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Processi*di*ossidazione*in*biologia:

• Dal punto di vista termodinamico, l’energia libera totale che si libera nei seguenti
processi è la stessa:
– Bruciare la cellulosa della carta (unità di glucosio);
– Ossidazione metabolica del glucosio

• In tutti i casi la reazione è:

– C6H12O6 + 6O2 ➙ 6CO2 + 6H2O ∆G0 ’ = - 2870 kJ/mol

• La differenza sostanziale però è che:


– Nel momento in cui la carta brucia, tutta l’energia della reazione di ossidazione è
liberata sotto forma di calore e non è tradotta in una forma utile se non in sistemi quali
per esempio un motore a vapore……sicuramente non una cellula!
– Nei processi di ossidazioni biologiche le reazioni avvengono con una bassa cessione
di calore e l’energia libera viene immagazzinata in energia chimica in forma di sintesi
di ATP
– L’efficienza di cattura di energia di ossidazione è il 40% delle 2870 kJ/mol

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Nelle ossidazioni biologiche l’energia 

è liberata in piccoli stadi: reazioni accoppiate

• A*differenza*della*combustione*di*cellulosa*in*un*fuoco,*nelle*reazioni*di*
ossidazione*biologiche*gli*elettroni*non*vengono*direttamente*trasferiti*dal*
substrato*(glucosio)*all’ossigeno,*ma*ci*sono*una*serie*di*stadi*che*vedono*
delle*rezioni*accoppiate*di*ossidazioneEriduzione*in*cui*gli*elettroni*passano*
a*elettronEcarriers*quali*il*NADH*prima*di*essere*trasferiti*sull’ossigeno*
• I*trasferimenti*di*energia*in*piccoli*stadi*permettono*un*maggior*controllo*
nella*cattura*dell’energia*stessa*
• Non*tutti*gli*organismi*usano*l’ossigeno*molecolare*come*accettore*ultimo*
di*elettroni:*
– Nella*fermentazione*i*microroganismi*interessati*riducono*il*piruvato*a*lattato,*
oppure*ad*acetaldeide*e*poi*etanolo*
– Altri*microoroganismi*riducono*il*nitrito*ad*ammoniaca*
– Batteri*in*fosse*idrotermiche*oceaniche*riducono*lo*zolfo*in*sulfuri

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CONH2
Il NAD(P)H: 
 O CH2
+
N
O
elettron-carrier 

O = P - O-
in catabolismo e anabolismo
O OH OH NH2
• NAD(P)H: O=P- O- N
N
– Nicotinamide Adenine Dinucleotide (Fosfato) ridotto
O CH2 N N
– NAD+/NADH è coinvolto nel catabolismo da parte di O
deidrogenasi che usano NAD+ a dare NADH
– NADP+/NADPH è coinvolto nell’anabolismo da parte di 2’
riduttasi che usano NADPH a dare NADP+
OH OH
OP

G.*Gilardi*E*Biochimica*
Modi*per*esprimere*

la*resa*energetica*biochimica
• Contenuto calorico:

– Poichè l’energia metabolica deriva primariamente dalle reazioni di ossidazione, più ridotto è un substrato, più alta è la sua capacità
nel generare energia biologica
– Lo sviluppo di entalpia è misurato con il calorimentro
– Dunque la combustione di un acido grasso naturalmente produce più entalpia, più energia metabolica di uno zucchero per massa-
equivalente:
unità usate in nutrizione unità usate in biochimica
Glucosio: C6H12O6 + 6O2 ➙ 6CO2 + 6H2O ∆G0 ’ = -3.74 kcal/g o 15.64 kJ/g
Acido palmitico : C16H32O2 + 23O2 ➙ 16CO2 + 16H2O ∆G0 ’ = -9.30 kcal/g o 38.90 kJ/g

– Chiaramente l’acido grasso ha meno ossigeno per atomo di carbonio, è più ridotto, quindi produce più unità riducenti cioè energia
quando è ossidato a dare CO2.

• Quoziente respiratorio (RQ):

– E’ il rapporto fra il numero di moli di CO2 prodotte per mole di O2.


– Quindi l’RQ per il glucosio è = 1 (6CO2 / 6O2) e l’RQ per l’acido palmitico è = 0.70 (16CO2 / 23O2)
– Dunque più basso è l’RQ, più alto è la capacità di sintetizzare ATP

• Equivalenti di riduzione :
– E’ definito come una mole di atomi di idrogeno, cioè 1 protone e un elettrone per atomo di H
– Per esempio, 4 equivalenti di riduzione sono usati per la riduzione di una mole di ossigeno ad acqua:

O2 + 4e- + 4H+ ➙ 2H2O

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La*strategia*

delle*reazioni*accoppiate:

• Accoppiamento*energetico:*
– Reazioni*sfavorite*termodinamicamente*diventano*possibili*
grazie*all’accoppiamento*con*reazioni*fortemente*
esoergoniche:*
• Reazione*esoergonica:* * A*⇔ B* * ∆G0*=*E*30*kJ/mol*
• Reazione*endoergonica:**** C*⇔ D** * ∆G0*=*+*10*kJ/mol*
EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE*
• Reazioni*accoppiate:*******A*+*C*⇔ B*+*D* ∆G0*=*E*20*kJ/mol*
– Esempi:*
• Trasporto*di*molecole*attraverso*membrane*biologiche,*trasmissione*
dell’impulso*nervoso,*contrazione*muscolare
Accoppiamento*energetico*di*tipo*biochimico

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Stoccaggio*
di*∆G

• L’energia*libera*
(∆G)*è*
immagazzinata*in*
biologia*sotto*
forma*di*composti*
del*fosfato*ad*alta*
energia

G.*Gilardi*E*Biochimica*
Composti*ad*alta*energia*in*biochimica:

composti*al*P*ed*energy*shuttles

• Non*è*corretto*dire*che*l’ATP*ha*dei*legami*ad*alta*energia,*ma*è*
giusto*dire*che*ci*sono*cambiamenti*di*proprietà*nei*suoi*
reagenti*e*prodotti*che*generano*un*grande*cambiamento*in*
energia*libera.*

• Questi*cambiamenti*di*energia*libera*sono*legati*a:*
1. Stabilizzazione*di*risonanza*dell’ortofosfato,*HPO42E*(Pi):*
2. Aumento*di*idratazione*dei*prodotti*di*idrolisi**
3. Ripulsione*elettrostatica*tra*i*prodotti*carichi*
4. Aumento*di*stabilizzazione*di*risonanza*o*tautomerizzazione*dei*
prodotti*
5. Rilascio*di*protoni*in*soluzioni*tampone*

• Vediamo*singolarmente*queste*proprietà

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1. Stabilizzazione*di*risonanza*dell’ortofosfato,*HPO42E*(Pi):*
Le*forme*multiple*di*risonanza*di*ugual*energia*che*si*hanno*
nell’ortofosfato*libero*non*sono*tutte*possibili*quando*il*fosfato*è*legato*a*
dare*un*estere*come*nell’ATP.**
Quando*il*Pi*è*rilasciato*nell’idrolisi,*l’aumento*del*numero*delle*forme*di*
risonanza*genera*energia*libera*con*un*aumento*di*entropia.

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2. Aumento*di*idratazione*
nei*prodotti*di*idrolisi:**
Il*rilascio*di*Pi*aumenta*la*
possibilità*di*idratazione*che*è*
uno*statoeneregeticamente*
favorito.*

3. Ripulsione*elettrostatica*
fra*i*prodotti*carichi:**
Entrambi*i*prodotti*di*idrolisi*
sono*cariche*negativamente*
(per*esempio*ADP*e*Pi*
nell’idrolisi*dell’ATP),*quindi*la*
ripulsione*elettrostatica*dei*suoi*
prodotti*favorisce*l’idrolisi*stessa

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4. Aumento*di*stabilizzazione*di*risonanza*o*tautomerizzazione*
dei*prodotti.**
*L’idrolisi*è*favorita*quando*I*prodotti*possono*assumere*diverse*forme*
molecolari.*Per*esempio*il*piruvato*può*avere*2*forme*molecolari,*il*PEP*
solo*una:*
COO- COO- COO-
C=O C - OH C - OP
CH3 ⇔ CH2 CH2

Piruvato PEP

5. Rilascio*di*protoni*in*soluzioni*tampone.*
*Spesso*un*protone*è*rilasciato*nelle*reazioni*di*idrolisi,*per*cui*la*conc.*di**
H+*(pH)*influenza*la*reazione.

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Potenziale*di*trasferimento*

del*gruppo*fosfato*(Pi)
• Il*potenziale*di*trasferimento*del*gruppo*fosfato*è*essenzialmente*il*suo*E*∆G0‘*di*idrolisi.**Esempi:*

(1) Idrolisi*del*Fosfoenolpiruvato*(PEP):**PEP*⇔*piruvato+*Pi***********************∆G0‘*=*E*62*kJ/mol*
(2) Fosforilazione*dell’ADP:*************** * ADP*+*Pi*⇔*ATP**********************∆G0‘*=*+*31*kJ/mol*
EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE**
* (1)*+*(2):** * * * * PEP*+*ADP*⇔*piruvato*+*ATP** ******∆G0‘*=*E*31*kJ/mol(

(1) Idrolisi*dell’ATP:*** * ** * * ATP*⇔*ADP*+*Pi****************** * ∆G0‘*=*E31*kJ/mol*


(2) Fosforilazione*del*glucosio:*********** * glucosio+*Pi*⇔*GE6EP*** ∆G0‘*=*+14*kJ/mol*
EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE**
* (1)*+*(2):** * * * * ATP*+*glucosio*⇔*ADP*+*GE6EP** ∆G0‘*=*E17*kJ/mol*

(1) Questo*significa*che*il*PEP*ha*un*potenziale*di*trasferimento*del*P*capace*di*cedere*un*Pi*all’ADP*
per*formare*ATP.*A*sua*volta*l’ATP*(ma*non*l’ADP)**può*donare**(ma*non*prendere)*un*Pi*al*
glucosio:*
(2) In*tutte*e*due*I*casi*l’accoppiamento*delle*due*reazioni*avviene*nel*sito*attivo*di*un*enzima

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ATP
• L’ATP*è*una*molecola*metastabile,*cioè*non*si*degrada*liberando*la*sua*energia*se*non*in*
presenza*di*un*enzima*
• E’*la*molecola*di*scambio*energetico*della*cellula.*In*realtà*il*suo*contenuto*energetico*è*
equivalente*a*quello*di*altri*nucleotidi*trifosfati*(GTP,*CTP,*TTP),*ma*semplicemente*
l’evoluzione*molecolare*degli*enzimi*ha*fatto*sì*che*questi*leghino*con*affinità*più**alta*l’ATP.*
• Viene*sintetizzato*dall’ATP*sintasi*e*da*reazioni*accoppiate*del*catabolismo*(glicolisi,*
fosforilazione*ossidativa,*fotofosforilazione)*.*
• L’energia*teorica*di*idrolisi*di*due*dei*suoi*legami*fosfoEanidride*è*di*circa*331(kJ/mol.**
• Abbiamo*visto*che*questa*energia*è*liberata*in*reazioni*accoppiate*nel*sito*attivo*di*enzimi.*

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G.*Gilardi*E*Biochimica*

Indrolisi*dell’ATP*nella*cellula
• Nella*cellula*l’idrolisi*dell’ATP*può*dare*ADP*+*Pi**oppure*AMP*+*PPi:**
• L’energia*di*31*kJ/mol*teoricamente*disponibile*dall’idrolisi*dell’ATP*probabilmente*è*
diversa*perchè*il*vero*∆G0‘*può*variare*per*una*serie*di*motivi:*
1. ∆G0‘*dipende*dalla*temperatura*
2. ∆G0‘*è*definito*a*pH*=*7.0,*ma*il*pH*nella*cellula*può*variare*6.5*a*8.0*a*seconda*del*
compartimento;*
3. Variazioni*di*concentrazione*di*magnesio*(Mg*2+*)*può*influenzare*il*∆G0‘*
– Le*vere*concentrazioni*di*ATP,*ADP,*e*Pi*nella*cellula*sono*molto*diverse*dal*teorico*1M*
definito*nelle*condzioni*standard*di*definizione*di*∆G0‘*
O O O
=

Adenosina - O - P - O - P - O - P - O-
-

O- O- O-
Mg2+

1. Dunque*il*valore*effettivo*del*∆G0‘*nella*cellula*potrebbe*essere*più*vicino*a*E50*kJ/
mol,*rendendolo*ancor*più*efficiente*nella*sua*capacità*di*rendere*possibili*processi*
cellulari*endoergonici G. Gilardi - Biochimica
ADP
• L’ADP*è*prodotto*per*idrolisi*dell’ATP*o*da*reazioni*specifiche*quali:*
* * *
* * GMP*+*ATP*<=>*GDP*+*ADP*(catalizzata*dalla*guanilato*chinasi)*
* * NDP*+*ATP*<=>*NTP*+*ADP*(catalizzata*dalla*nucleoside*difosfochinasi)*

•Alcune*reazioni*cui*partecipa*l’ADP*sono:*
* * *
* * *ADP*<=>*ATP*+*AMP*(catalizzata*dalla**adenilato*chinasi)*
* * ADP*+*NADPH*<=>*dADP*+*NADP+*(catalizzata*dalla*ribonucleotide*reduttasi)*

•L’ADP*è*trasferito*dal*citoplasma*ai*mitocondri*per*la*sintesi*di*ATP*nella*fosforilazione*
ossidativa*grazie*alla*adenina*nucleotide*translocasi*e*questo*è*uno*dei*fattori*limitanti*
l’ossidazione*fosforilativa.

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AMP
• L’AMP*è*un*intermedio*molto*comune*nel*metabolismo*dell’ATP*
• Può*essere*prodotto*dal*risultato*di*una*di*queste*tre*reazioni*generali:*
1. Idrolisi*di*ATP*a*dare*pirofosfato*(PPi)*–**v.*reazione*1*
2. Trasferimento*di**pirofosfato**(PPi)*dall’ATP*ad*un*metabolita*–*v.*reazione*6*
3. Trasferimento*di*un*fosfato*dall’ADP*–*v.*reazione*2*
• E’*un*intermedio*nella*sintesi*dell’ATP*(v.*reazione*3)*e*nelle*reazioni*di*recupero*di*ATP*(v.*
reazioni*4,*5*e*6)*
• E’*un*attivatore*allosterico*della*glicogeno*fosforilasi*b*e*della*fosfofruttochinasi.*
• E’*un*inibitore*allosterico*della*fruttosoE1.6Ebifosfatasi,**della*adenilsuccinato*sintasi*e*della*
glutammina*sintasi,*un*enzima*con*un*ruolo*centrale*nel*metablosimo*dell’azoto*nella*
cellula*
• Alcune*reazioni*che*coinvolgono*l’AMP:*
1. Ac.grasso*+*ATP*+*CoASH*<=>*AcilECoA*+*AMP*+*PPi*(catalizzata*dalla*acilECoA*ligasi).*
2. 2ADP*<=>*ATP*+*AMP*(catalizzata*dalla*Adenilato*chinasi)*
3. Adenilsuccinato*<=>*Fumarato*+*AMP*(catalizzata*dalla*Adenilosuccinato*liasi)*
4. PRPP*+*Adenina*<=>*AMP*+*PPi*(catalizzata*dalla*Fosforibosiltransferasi)*
5. ATP*+*RibosioE5EFosfato*<=>*PRPP*+*AMP*(catalizzata*dalla*PRPP*Sintasi)*
6. AMP*+*H2O*<=>*NH4+*+*IMP*(catalizzata*dalla*AMP*Deaminasi)
AMP*ciclico*(cAMP*E*biosegnalazione)
• Messaggero*intracellulare*secondario,*sintetizzato*dalla*adenilil*ciclasi*che*è*
stimolata*da*alcuni*ormoni*e*da*altre*molecole*di*segnalazione*
• Svolge*azione*di*regolazione*in*tutte*le*cellule*tranne*quelle*vegetali

Meccanismi*di*controllo*metabolico*

• Ci*sono*diversi*meccanismi*di*regolazione*del*
metabolismo,*i*più*importanti*sono*5:*

1. Controllo*dell’espressione*di*geni*che*codificano*per*gli*
enzimi*da*regolare**
2. Controllo*dell’attività*enzimatica*
3. Compartimentalizzazione*dei*processi*metabolici*
4. Regolazione*ormonale*
5. Regolazione*fine*di*tutti*gli*enzimi*in*una*pathway

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1. Controllo*dell’espressione*di*geni*che*codificano*
per*gli*enzimi*da*regolare
• La*presenza*o*assenza*di*determati*metaboliti*può*indurre*o*reprimere*
l’espressione*di*geni*specifici*che*codificano*per*enzimi*di*pathways*che*
producono*o*necessitano*il*metabolita*
• Alternativamente*la*degradazione*di*enzimi*ad*opera*di*proteasi*è*un*altro*
aspetto*regolativo*
• Sperimentalmente*l’espressione*di*particolari*enzimi*di*studia*per*mezzo*della*
proteomica,*con*gel*elettroforetici*bidimensionali

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Proteomica: 2D gel

2.*Controllo*dell’attività*enzimatica

• Può*avvenire*in*più*modi:*
1. Interazione*reversibile*con*dei*ligandi,*attraverso*
Fosforilazione
la*regolazione*allosterica.*Questa*di*solito*si*
eplica*in*regioni*di*ligando*più*bassa*della*KM*
dove*la*risposta*è*di*primi*ordine,*quindi*rapida*
2. Coinvolgimento*di*legami*covalenti,*di*solito*
parte*di*una*cascata*di*eventi*che*ne*maplifica*
l’effetto.*Esempi:* Adenilazione
• Liberazione*di*unità*di*glucosio*dal*glicogeno*
• Coagulazione*del*sangue*
• Azione*di*chinasi*che*fosforilano*altri*enzimi*sull’OH*di*
Ser,*Thr,*Tyr*
• Adelinazione,*cioè*il*trasferimento*di*ADP*a*partire*da*
ATP*su*Ser,*Thr,*Tyr*
• ADPEribosilazione:*trasferimento*di*ADPEribosio*da*NAD
+
*su*Arg*o*His

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ADPEribosilazione
3.*Compartimentalizzazione*dei*
processi*metabolici

Nelle*cellule*eucariotiche*i*
diversi*organelli*cellulari*
sono*deputati*a*diverse*
funzioni.*Per*esempio:*
•RNA*polimerasi*si*trova*in*
nucleo*
•Enzimi*del*ciclo*di*Krebs*si*
trovano*nella*matrice*
mitocondriale*
•Enzimi*per*la*sintesi*di*
acidi*grassi*si*trovano*nel*
citoplasma,*mentre*quelli*
per*la*degradazione*si*
trovano*nei*mitocondri*
•V.*altri*esempi*in*figura

G.*Gilardi*E*Biochimica*

4. Regolazione*ormonale
• Le*cellule*devono*poter*rispondere*
all’ambiente*o*a*segnali*da*altre*cellule*
• La*trasduzione*del*segnale*permette*a*
questi*segnali*esterni*di*penetrare*
all’interno*della*cellula*di*solito*
attraverso*recettori*
• Gli*ormoni*sono*molecole*regolatrici*
trasportate*nel*sangue*capaci*di*
riconoscere*il*loro*target*grazie*ai*
recettori*che*trasferiscono*il*
messaggio*ormonale*all’interno*della*
cellula*target*con*un*meccanismo*a*
cascata*
• Due*tipi*de*meccanismo*di*risposta*
ormonale*studiati:*
– Ormoni*steroidei*che*influenzano*
l’espressione*genica*
– Ormoni*che*stimolano*messaggeri*
secondari.*Per*esempio*il*glucagone*
(stimola*il*fegato*al*rilascio*glucosio*
nel*sangue)*e*l’insulina*(stimola*il*
fegato*a*sintetizzare*glicogeno)*
stimolano*cAMP*e*fosfoinositoli*quali*
messaggeri*secondari
G.*Gilardi*E*Biochimica*
5.*Regolazione*fine*di*tutti*gli*enzimi*in*una*pathway


• Il*controllo*metabolico*è*certamente*esercitato*in*primis*grazie*alla*
regolazione*allosterica*di*enzimi*specifici*del*pathway*

• Sicuramente*però*tutti*gli*enzimi*sono*regolati*in*secondo*ordine*per*
modulare*per*ottenere*un*controllo*più*fine*di*una*pathway,*che*non*può*
essere*semplicemente*di*tipo*“onEoff”.

G. Gilardi - Biochimica

Approcci*allo*studio*del*metabolismo

• Gli*steps*seguiti*nello*studio*di*un*processo*metabolico*sono:*
1. Identificazione*dei*reagenti,*prodotti,*cofattori*e*la*stechiometria*per*ogni*
reazione*
2. Studiare*come*la*velocità*di*ogni*reazione*è*regolata*nel*tessuto*in*cui*avviene*
3. Identificazione*dei*processi*di*regolazione*

• Questi*steps*richiedono*l’isolamento*e*la*caratterizzazione*di*ogni*enzima*
coinvolto*nel*processo.*L’estrapolazione*dalla*situazione*in*vitro*a*quella*in*
vivo*non*è*mai*immediata*–*per*esempio*l’ATPsintasi*(sintesi)*dei*mitocondri*
fu*isolata*quale*ATPasi*(degradazione)*

• Il*metabolismo*può*essere*studiato*a*più*livelli:*intero*organismo,*organo*
isolato*o*perfuso,*tessuto*in*coltura,*cellula*intera,*organelli,*molecole*
(enzimi)*isolati.

G. Gilardi - Biochimica
• Organismo:*
Effect of anaerobic
– Per*esempio*l’NMR*permette*il*monitoraggio*in*vivo*di*processi*metabolici*in*
exercise on 31P NMR
organismi.*Per*esempio*la*figura*illustra*l’effetto*dell’esercizio*in*anaerobiosi*di*un* spectra of human
muscolo*grazie*al*segnale*NMR*del*31P* forearm muscle.
• Organo*isolato*o*perfuso:*
– Gli*organi*possono*essere*isolati*e*perfusi*in*soluzioni*isotoniche*tamponate*contenenti* Creatine-P
nutrienti*cui*possono*essere*aggiunti*farmaci*o*ormoni*per*lo*studio*del*loro*effetto*o*
metabolismo.*In*alcuni*casi*si*possono*fare*delle*sottili*fettine*di*tessuto*che*evita*il*
pompaggio*di*soluzione*all’organo*intero.* start
ATP
• Cellule*intere:* Pi γ-P α-P ß-P
– Cellule*di*organi*quali*fegato,*rene,*cuore*possono*essere*separate*e*coltivate*
individualmente*grazie*a*trattamento*con*tripsina*o*collagenasi*che*degradano*la*
matrice*extracellulare*che*tiene*unite*le*cellule*nei*tessuti.*Queste*poi*possono*essere*
tenute*in*vita*come*descritto*sopra.* 1 min
• Colture*di*tessuti*in*vitro:*
– Le*cellule*possono*essere*coltivate*e*indotte*a*moltiplicarsi.*Normalmente*dopo*un*
certo*numero*di*divisioni,*la*moltiplicazione*cessa*e*le*cellule*muiono.*Si*sono*però*
sviluppate*linee*cellulari*dette*immortalizzate:*queste*sono*linee*cellulari*varianti* 19 min
capaci*di*moltiplicarsi*fin*tanto*che*ci*sono*nutrienti.*Questi*“cloni”*cellulari*sono*stati*
chiave*nel*permettere*studi*sistematici*che*hanno*eliminato*la*variabilità*presente*negli*
esperimenti*biologici.*
• Studi*con*organelli:* 10 min
– Questi*sono*preparati*distruggendo*la*membrana*plasmatica*e*separando*gli*organelli* after
per*centrifugazione*differenziata* recovery

• Studi*con*componenti*purificate:*
– Gli*enzimi*e*le*macromolecole*coinvolte*in*processi*metabolici*vengono*purificate*e*
studiate*separatamente*per*poi*essere*messe*insieme*in*processi*detti*di*ricostruzione*
per*vederne*l’interazione

Organizzazione*di*cellule*eucariotiche*
in*tessuti

38
Frazionamento*Frazionamento*delle*componenti*
cellulari*partendo*da*un*tessuto

39

Studio*del*metabolismo*con*sonde*metaboliche*
• I*diversi*stadi*di*una*via*metabolica*possono*essere*studiati*con*2*
approcci*principali:*
– Uso*di*inibitori*metabolici*
• Fermando*un*processo*a*stadi*diversi*causano*l’accumulo*del*prodotto*generato*dallo*step*precedente*
e*non*permettono*la*sintesi*dei*prodotti*a*valle.*Usando*inibitori*diversi*si*può*risalire*alla*sequenza*
delle*reazioni,*come*vedremo*è*stato*fatto*nello*studio*della*catena*respiratoria*
– Uso*di*mutazioni*specifiche**
• Mutando*enzimi*diversi*si*può*risalire*alla*sequneza*di*eventi*e*alla*loro*ricostruzione*in*sistemi*
combinati*–*questo*fu*fatto*per*la*prima*volta*nello*studio*del*metabolismo*di*Neurospora)crassa.(

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Concepts*to*catch:
– Meccanismi*di*regolazione*del*metabolismo*
– Composti*ad*alta*energia*in*biochimica:*
• Proprietà*responsabili*dell’alta*energia*di*questi*
composti*
• Formule*dei*composti*ad*alta*energia*dell’adenina*
• Potenziale*del*trasferimento*del*gruppo*fosfato*con*
esempi*di*dettagli*energetici*
– Metodi*di*studio*del*metabolismo