Energia totale di una molecola: ET

ET=E trasl.+E rot.+E vibr.+ E elettr.+ E spin

L’energia e’ quantizzata

Distribuzione di Boltzmann:

nf/ne = exp(∆E /KBT)

nf = stato fondamentale (minima energia)

ne= stato eccitato

La transizione tra due livelli energetici E1ed E2 puo’ essere indotta da radiazione di frequenza ν
tale che:

ν= ( E1- E2)/h = ∆E /h

λ = c/ν = ch/ ∆E

La frequenza ν = ∆E /h e’ detta frequenza di risonanza. La radiazione

elettromagnetica con frequenza ν provoca con ugual probabilita’ transizioni 12 e 2
1

12 : assorbimento

21: emissione indotta (p.es. usata nel laser)

 Meccanismi di rilassamento:

 
Emissione spontanea radiativa, efficace per alte differenze di energia

Decadimento non radiativo indotto dall’ambiente, efficace per basse differenze di energia

 
 Assorbimento

Una radiazione luminosa, quando e’ assorbita da una molecola, genera transizioni elettroniche di
orbitale. Il gruppo molecolare responsabile dell’assorbimento e’ detto cromoforo.

Fluorescenza

Il decadimento spontaneo dell’elettrone a un orbitale di energia minore genera radiazione detta di

fluorescenza. Il gruppo molecolare responsabile della fluorescenza e’ detto fluoroforo.
 ASSORBIMENTO
Diagrammi energetici di una molecola nello stato fondamentale e

eccitato e spettri di assorbimento corrispondenti

Il passaggio allo stato eccitato e' piu’

veloce del periodo di vibrazione
molecolare

ν0 ~ 1015 Hz

νΒ ~ 1013 Hz
 EMISSIONE
Diagramma energetico di una molecola nello stato fondamentale e eccitato e relativi spettri di
emissione e assorbimento

A causa del rilassamento vibrazionale, parte dell’energia dello stato eccitato e’ convertita in energia
termica: lo spettro della luce emessa e’ spostato a λ maggiori rispetto a quello della luce assorbita.
Resa quantica:

numero di fotoni emessi per unità di tempo

Φ=
numero di fotoni assorbiti per unità di tempo

Rappresenta la frazione di molecole eccitate che

fluorescono.

Intensità della luce emessa per fluorescenza:

IF=Φ*(fotoni assorbiti/s)
FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER

KT =costante di velocità del trasferimento di energia

KD =costante di decadimento spontaneo del donatore

r = distanza tra donatore e accettore

KT = KD (R0/r)6

Tipicamente R0 ~ 2-5 nm
 FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER

KF Resa quantica in assenza dell’accettore

Φ =
0

KD
KF
Φ= Resa quantica in presenza dell’accettore
K D + KT
0 6
I R 
F
= 1+  0 
IF  r 
Suzuki et al. Nature, 1998, 396 : 380-383

Lever arm normalmente attaccata al C-terminal

BFP = blue fluorescent protein : assorbimento a 360 nm,

emissione a 430-470 nm

GFP = green fluorescent protein : emissione a 490-540 nm

 Complex FRET efficiency Distance

No nucleotide 0.439 3.6 nm

ATP (1 mM) 0.082 5.1 nm

ADP (1mM) 0.333 3.8 nm

Biomolecole con fluorescenza intrinseca:

Fluorofori λmax, nm resa quantica

Triptofano 348 0.2

Tirosina 303 0.14
Fenilalanina 282 0.04
Adenina 321 0.0004
Citosina 313 0.00008
Dipolo elettrico di assorbimento (e di emissione)
Allen et al., Biophysical Journal, 1995, 68 :81s-86s