Le GENOTECHE cDNA

Poiché utilizzano come materiale genetico di

partenza l’RNAm:

-Contengono solo DNA genico

-Sono rappresentative dell’espressione genica

Fasi della preparazione della genoteca:
di un dato tipo cellulare

a) Purificazione dell’RNAm

b) Sintesi del primo filamento di cDNA

usando come stampo l’RNAm

c) Sintesi del secondo filamento

d) Adattamento del cDNA per la

La purificazione dell’RNAm da un estratto di RNA

totale

Si sfrutta la coda di poliA tipica dell’RNAm

La presenza del sale favorisce l’interazione

fra sequenze omologhe

NaCl 100mM

Tris 10 mM

EDTA 1 mM
La bassa forza ionica del tampone fa

staccare l’RNAm
 What about

Green ham and bacon?

La sintesi del primo filamento di cDNA

Un enzima davvero complesso: la TRASCRITTASI INVERSA

Ha attività DNA-polimerasica
e RNAsica
La trascrittasi inversa polimerizza il
DNA usando come stampo l’RNAm.

Procede a salti, degradando via via

l’RNAm già copiato e generando in 5’
ed in 3’ le LTR necessarie per la
sintesi del nuovo genoma retrovirale
ad RNA.

PBS: sito di legame del primer

R: regione a ripetizione diretta

U5: regione unica in 5’

U3: regione unica in 3’
 QuickTime™ and a
Cinepak decompressor
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In vitro la trascrittasi inversa può effettuare solo la sintesi del primo filamento

Le metodiche di sintesi del primo filamento variano

in base al tipo di innesco:

primer di oligo-dT random priming

cccaaa
gtccaa

cctgca ttcgta tatggc

5’ ggacgt aagcat ataccg AAAAAA 3’

DNA ligasi

La retrotrascrizione inizia a
partire dalla coda di poli-A
 Sintesi del secondo filamento del cDNA

Metodo del self-priming Metodo dell’RNAsi H

5’
3’
ansa a 
forcina

La DNA polimerasi I di E.coli ha,

Sia attività polimerasica, sia
esonucleasica

Il DNA in 3’ tende a ripiegarsi

su se stesso, formando legami
tra basi che sono omologhe
 Si adattano i cDNA per la successiva fase di clonaggio

Trattamento con
METILASI per mascherare
i siti EcoRI

Trattamento con DNA ligasi

per aggiungere i linkers
 Il metodo del primer adattatore

TRASFERASI TERMINALE:

La TRASFERASI TERMINALE è una DNA

polimerasi atipica: non necessita di DNA stampo.
Polimerizza una codina omopolimerica
in 3’ se si fornisce un solo tipo di dNTP

DNA polimerasi

Metilasi

DNA ligasi
Sia che si parta da DNA genomico, che da cDNA, la procedura
per lo screening è la stessa

Il DNA dal fago λ, per poter ibridare con la sonda,

deve essere denaturato
 Caratteristiche della sonda:

-generalmente è un oligonucleotide di sintesi chimica, che non presenta

il -P in 5’
-deve essere almeno un 20mero per dare univocità di
riconoscimento (una sequenza di 20 basi ricorre circa ogni 420
basi (≈1012). Dimensione del genoma umano 3x109)

-deve essere marcata

La POLINUCLEOTIDE CINASI aggiunge un -P in posizione 5’

 Da dove si ricavano le informazioni per disegnare una sonda?

Si può partire dalla seuenza aminoacidica di un frammento di una proteina,

tenendo presente che il codice genetico è degenerato

1) Metodo delle SONDE DEGENERATE

or SM

Corrispondono a 48 diverse sonde

2) Metodo delle sonde uniche basate sulle Tag di Sequenze Espresse (EST)

INTERNET

EST database

EST database: è una collezione di sequenze parziali di cDNA, cioè di porzioni (tag) relativamente
corte di DNA genomico che vengono espresse in forma di RNAm

I ricercatori possono disporre di software in rete che possono confrontare la sequenza aminoacidica
determinata con le EST disponibili, al fine di trovarne una che possa codificare la proteina.

Si costruisce quindi una SONDA ESATTA

Una sonda lunga (anche se a bassa omologia) può essere ottenuta da una specie affine.

Si usa una metodica di marcatura a più alta efficienza

-Si usa il frammento KLENOW della

DNA-polimerasi I di E.coli (non ha
attività esonucleasica)

-Si usa il random priming in presenza

Di dNTP marcati

-I frammenti di sonda sono uniformemente

Marcati (più alta attività specifica
Una volta individuato il clone (placca di lisi, E,coli, ecc) che contiene il DNA ricercato,
si procede a sequenziarlo

Il metodo dei DIDEOSSINUCLEOTIDI (metodo di Sanger)

INGREDIENTI:
il DNA da sequenziare a singolo
filamento (es.NaOH)

Un primer marcato che ibrida a monte del

MCS
DNA da sequenziare

4 provette, in ciascuna delle quali si

mette un diverso dideossinucleotide

La SEQUENASE (DNA-polimerasi del fago T4 modificata): -ALTA PROCESSIVITA’

-ASSENZA DI ATTIVITA’ ESONUCLEASICA
 QuickTime™ and a
Animation decompressor
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Molto spesso il frammento di DNA da clonare è troppo lungo per la processività
della Sequenase: si procede con il
PRIMER WALKING
 Che cosa determina la scelta di una library genomica o a cDNA?

Library a cDNA Library genomiche

-Il gene deve essere espresso -Si vuole studiare il DNA

in una cellula batterica
-Il gene è particolarmente
espresso in un determinato
tipo cellulare o tessuto
non codificante (es. sequenze
regolatrici, marcatori polimorfici)
-Si vuole sequenziare
un intero genoma

-Nella forma nativa, il

gene cercato è troppo
grande per entrare
efficientemente in un
Vettore di espressione
 IL PROGETTO GENOMA UMANO

Nature 431, 931 ­ 945 (21 October 2004); doi:10.1038/nature03001 

 Finishing the euchromatic sequence of the human genome

INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM

A list of authors and their affiliations appears in the Supplementary Information

Correspondence and requests for materials should be addressed to F .S. Collins 
(fc23a@nih.gov), E. S. Lander (lander@broad.mit.edu), J. Rogers (jrh@sanger.ac.uk) 
or R. H. Waterston (waterston@gs.washington.edu).
 The sequence described here has been deposited in public databases, with the 24 
human chromosomes having accession numbers NC000001 to NC000024.

The sequence of the human genome encodes the genetic instructions for human physiology, as 
well  as  rich  information  about  human  evolution.  In  2001,  the  International  Human  Genome 
Sequencing  Consortium  reported  a  draft  sequence  of  the  euchromatic  portion  of  the  human 
genome.  Since  then,  the  international  collaboration  has  worked  to  convert  this  draft  into  a 
genome sequence with high accuracy and nearly complete coverage. Here, we report the result of 
this finishing process. The current genome sequence (Build 35) contains 2.85 billion nucleotides 
interrupted  by  only  341  gaps.  It  covers  99%  of  the  euchromatic  genome  and  is  accurate  to  an 
error rate of 1 event per 100,000 bases. Many of the remaining euchromatic gaps are associated 
with  segmental  duplications  and  will  require  focused  work  with  new  methods.  The  near­
complete  sequence,  the  first  for  a  vertebrate,  greatly  improves  the  precision  of  biological 
analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death. Notably, the 
human  genome  seems  to  encode  only  20,000–25,000  protein­coding  genes.  The  genome 
sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the decades 
ahead.
 LA MAPPA FISICA DEL GENOMA

Si usano vettori ad inserti lunghi (es. Library in YAC)

Per prima cosa, si determinano i CONTIG, cioè

set di cloni che si sovrappongono parzialmente.
Via via che l’assemblaggio va avanti, i contig
diventano equivalenti ad un unico cromosoma

Il processo è agevolato se,

invece di digerire tutto il
DNA genomico, si digerisce Fluoroforo 1: AT
il DNA di uno specifico tipo di Fluoroforo 2: GC
cromosoma, separato mediante
FACS
 Come si assemblano i contig?

DETERMINAZIONE DELL’ORDINE ATTRAVERSO Sequence-Tagged Sites

(STS) E EST

STS: corta sequenza di DNA UNICA che viene ottenuta da inserti clonati più lunghi (es: genoteca in fago λ).

Come si stabilisce se la sequenza è unica in tutto il DNA (o in un intero cromosoma?)

Si disegnano coppie di primers per PCR in grado di amplificare ciascuna TAG

La presenza di un amplificato
indica che nel clone da YAC
è presente la TAG
Se uno stesso amplificato compare
in due diversi cloni da YAC vuol dire
che si sovrappongono e si costituisce
il contig
IL SEQUENZIAMENTO AUTOMATIZZATO DEL DNA
La tecnica della PCR, unitamente alle recenti acquisizioni sulla sequenza del genoma umano,
consente di clonare direttamente un gene specifico, senza bisogno di costruire delle genoteche

-Devono essere note le sequenze che fiancheggiano la regione da clonare

-La regione da clonare non deve essere troppo lunga
-E’ applicabile soprattutto al DNA che viene trascritto in RNAm