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Coltura su terreno solido

(piastra)
La piastra Petri

coperchio
Uso normale Capovolta

base
Piccoli spaziatori
permettono la
circolazione dell’aria
Preparazione di piastre con terreno di coltura

1. Il terreno agarizzato,
liquefatto, viene versato in
piastra e lasciato solidificare

2. Il collo della botttiglia


viene passato sulla fiamma

3. Il coperchio della
piastra viene sollevato,
il minimo necessario,
inclinato e tenuto sopra
la base della piastra.
4. Viene versato il terreno in piastra, circa 20 ml/piastra.
Marcare la piastra

La piastra (così come la beuta o la provetta)


deve essere marcata con dettagli riguardanti:

 mezzo di coltura
 data
 provenienza dell’inoculo

Perché questa marcatura va fatta sulla base


della piastra, e non sul coperchio?
Colonie batteriche:
crescite su terreni solidi

Microrganismi in fase planctonica seminati in numero


appropriato su un terreno solido agarizzato si riproducono e,
dopo 18-24 ore di incubazione, formano colonie contenenti
circa 106 cellule.

In condizioni ottimali, ogni colonia origina da una singola


cellula.

Le colonie microbiche hanno caratteristiche morfologiche


(dimensioni, colore, forma), ma anche consistenza, odore, ed
altro, che le rendono caratteristiche e sono un importante
parametri per la loro identificazione e classificazione.
Proprietà dell’agar nei terreni solidi

 agente solidificante (solidifica a 38 °C e fonde a


84 °C).

 inerte ed atosicco per i microrganismi.

 all’ 1,5-2,0 % la superficie del terreno è


sufficientemente umida da permettere la crescita dei
microrganismi ma abbastanza asciutta da
impedirne alle cellule di muoversi; le colonie
restano separate.

 il gel ostacola il movimento dei microrganismi


all’interno del terreno ma consente la diffusione
delle sostanze nutritive.
Principali utilizzi dei terreni solidi

Le piastre contenenti terreno agarizzato vengono


utilizzate principalmente per:

 Ripassare (strisciare) colture batteriche

 Effettuare isolamenti di microrganismi

 Effettuare conteggi di microrganismi vitali

 Saggiare particolari capacità di crescita dei


microrganismi
Tecnica di isolamento su piastra

Il terreno solido è un ottimo mezzo su cui


ottenere l’isolamento di microrganismi e la
loro crescita come colture pure.

Si prelevano cellule da una piastra o da una


coltura liquida e le disperdiamo (striscio,
diffusione, inclusione) su un terreno solido,
per ottenere la crescita di colonie isolate.

Partendo da una di queste colonie isolate, si


ripete l’operazione un certo numero di volte.
Conteggio di microrganismi su piastra o conta
vitale (viable count)

Misura il numero di cellule vitali


(coltivabili).

Occorrono generalmente almeno 24 ore


perché le colonie siano contabili.

Generalmente si contano solo le piastre


con 25-250 colonie.
Principi sui quali si fonda la
determinazione della carica
microbica su piastra

2. L’inoculo originale è omogeneo

4. Non vengono seminati aggregati cellulari

6. Ogni singolo batterio, crescendo, si


divide e produce una singola colonia
Limiti della determinazione della
carica microbica su piastra
1. Non tutte le cellule seminate crescono con
la stessa velocità

3. Colonie di piccola dimensione possono


sfuggire al conteggio

5. Cellule vicine possono dare origine ad una


solo colonia

7. E’ difficile prevedere il numero delle


cellule vitali (stima del fattore di
diluizione necessario)

9. Errore analitico
Errore analitico
1. Campionamento

3. Pesatura

5. Diluizione e pipettatura (adesione dei


microrganismi alla pipetta, calibrazione
pipetta, errori di lettura, ecc.)

7. Insufficiente omogenizzazione

9. Errore nella semina (caratteristiche del


terreno, spessore, umidità, ecc.)

11. Errore di conteggio


Le diluizioni

In quasi tutti gli ambienti, i


microrganismi sono presenti con un
numero molto elevato di individui.

Per ottenere un conteggio il più preciso


possibile spesso è spesso necessario
effettuare una diluizione del campione
da analizzare.

Il modo di esprimere i risultati cambia a


seconda della natura del campione
(liquido, aria, solido, superficie).
Densità cellulare espressa per unità di volume

fattore di diluizione
Densità cellulare espressa per unità di peso

25 g di campione vengono omogenizzati in 225 ml di un fluido di diluizione (diluizione 1:10 (w/v)).

1 ml 1 ml
0,1 ml 0,1 ml

9 ml 9 ml

10-1 10-2 10-3


campione 52 57
omogenato Numero di colonie contate

Formula applicata:
C1 + C2 1 1
x x = CFU / g
2 diluizione volume piastrato (ml)

Esempio:
52 + 57 1 1
x x = 5,5 x 105 CFU / g
2 10-3 0,1 ml
Densità cellulare espressa per unità di superficie

Viene campionata un’area di 5 cm2. Il campione è rappresentato da un tampone, da una escissione


o da un lavaggio della superficie sospeso in un volume di 10 ml di fluido di diluizione.

0,1 ml 0,1 ml
1 ml 1 ml

9 ml 9 ml

campione
52 57
Numero di colonie contate
Formula applicata:
Vol iniziale di
C1 + C2 sospensione (ml) 1 1
x x x = CFU / cm2
2 area campionata diluizione volume
(cm2) piastrato (ml)
Esempio:
52 + 57 10 ml 1 1
x x x = 1,1 x 105 CFU / cm2
2 5 cm2 10-2 0,1 ml
L’isolamento può essere una procedura semplice
Microbiologia clinica: un caso di sospetta meningite

 La causa è spesso il batterio Neisseria meningitidis.


 Si preleva del liquido spinale.
 Esame microscopico (N. meningitidis è un diplococco
gram-negativo).

 Coltivazione del microrganismo su piastre di terreno ricco


in presenza di CO2.

N. meningitidis S. epidermidis

 Conferma dell’identificazione mediante differenti test


di crescita e biochimici (caratterizzazione fenotipica).
 Caratterizzazione molecolare.
….. oppure una procedura complessa
La comunità microbica del colon umano
 E’ una comunità numerosa (1011 cellule per g di peso
umido) e varia (più di 400 specie).
 Si preleva materiale dal colon.
 L’esame microscopico rivela una composizione microbica
complessa.
 Coltivazione e isolamento dei microrganismi in terreno
solido ricco di polisaccaridi e proteine in anaerobiosi e in
presenza di N2, CO2 e H2. Colture di arricchimento
particolari per gli archea metanogeni colici.
 La coltivazione, isolamento e caratterizzazione fenotipica
di tali microrganismi ha portato all’identificazione di
numerosi generi e specie già noti ma anche di nuovi generi
e specie.
 Fingerprinting molecolare.
….. oppure problematico

Una comunità microbica marina

Per questi microrganismi le condizioni di coltura


usualmente adottate per organismi di diversa origine
non sono ottimali o addirittura risultano tossiche.

Utilizzo di terreni poveri di nutrienti.

Eliminazione di metalli pesanti tossici dal terreno di


coltura.

Sostituzione dell’agar con altri supporti di crescita.


COLTURE ANAEROBICHE

L’effetto dell’ossigeno atmosferico sulla crescita


microbica è strettamente correlato al potenziale di
ossido-riduzione (potenziale redox o O-R) del terreno di
coltura.

Un terreno con un rapporto H/O maggiore di quello


presente nell’acqua (2/1) è fortemente ridotto ed ha un
potenziale O-R negativo, un terreno fortemente ossidato
ha un potenziale O-R positivo.

Alcuni batteri anaerobi possono comunque essere


coltivati eliminando l’ossigeno dall’ambiente o
aggiungendo al terreno composti riducenti, che
abbassano l’O-R.
RAPPORTO TRA OSSIGENO LIBERO E
CRESCITA MICROBICA
La richiesta di ossigeno gassoso dei batteri può essere valutata facendo crescere
i microrganismi in provette contenente agar-germi o agar-shake.

Gradiente
di
(a) aerobi obbligati
ossigeno
(b) anaerobi
+
(c) aerobi facoltativi
(d) microaerofili
(e) anaerobi aerotolleranti
-
La coltivazione di batteri anaerobi

• Si elimina l’ossigeno dal terreno di coltura


bollendolo per 10 min, si raffredda rapidamente, si
fa un abbondante inoculo, senza agitare, e si
stratifica sul terreno olio minerale, quindi si chiude
ermeticamente il contenitore (prove di
fermentazione).

• Si aggiunge al terreno un agente riducente (sodio


tioglicollato) che reagisce con l’ossigeno e aiuta a
mantenere gli enzimi nella forma ridotta (brodi di
coltura non chiusi ermenticamente e agar in
piastra).
Giara sotto vuoto

E’ possibile utilizzare particolari contenitori come le giare


per anaerobiosi, che vengono prima svuotati della sua
atmosfera, poi al suo interno viene aperto un GasPack, che
sviluppa idrogeno.

In alternativa si usa un incubatore anaerobico, riempito con CO2


idrogeno o azoto.
Camera anaerobica

Quando le colture devono essere manipolate si usano cabine


anaerobiche a guanti.
Conservazione dei microrganismi

Una volta ottenuta una


coltura pura di un
microrganismo, possiamo
conservarla per futuri
utilizzi.
Obbiettivi della conservazione
dei microrganismi

La conservazione di ceppi
microbici nel tempo deve
garantire:

1. sopravvivenza

3. stabilità genetica e
fisiologica
Conservazione mediante
propagazione su piastre?

La propagazione su piastre soddisfa le

esigenze di sopravvivenza e stabilità?


Conservazione mediante batteriostasi

Sopravvivenza e stabilità possono essere


mantenute nel tempo adottando condizioni che
facilitano la batteriostasi.

La batteriostasi può essere ottenuta mediante:

• Refrigerazione

• Essiccamento
Conservazione per brevi periodi (qualche
mese): refrigerazione a 4-5 °C
I microrganismi vengono fatti crescere e poi conservati
su terreno solido

Aerobi:
- in superfice su agar inclinati

Anaerobi facoltativi:
- infissi in agar (non inclinati), eventualmente ricoperti di
paraffina

Anaerobi stretti:
- infissi in terreni fortemente ridotti (presenza di
tioglicollato) e ricoperti di paraffina

Per ovviare alla produzione di acidi da parte del microrganismo il


terreno viene tamponato.
Conservazione per lunghi periodi
(diversi anni): congelamento
I microrganismi vengono uccisi dal congelamento,
ma la maggior parte di essi sopravvive se congelati
in presenza di glicerolo (sterile) in rapporto 1:20 e
vengono poi conservate a -20 °C o temperature
inferiori.

Minore la temperatura più lungo il periodo di


conservazione. Si possono utilizzare congelatori
speciali (-80 °C/-100 °C), oppure l’immersione in
azoto liquido (-200 °C).
Tecnica di essiccazione mediante liofilizzazione
La tecnica di liofilizzazione o
freeze-drying prevede che la
coltura microbica venga:

3) risospesa, all’interno di una


fiala di vetro, in latte sterile o
siero di sangue o altre sostanze
egualmente protettive;

5) velocemente congelata (in


azoto liquido oppure in un
miscuglio di ghiaccio secco e
alcol).
3) essiccata mediante sublimazione

4) infine la fiala viene sigillata sotto vuoto e conservata a tambiente.


Reperimento diparticolari ceppi microbici:
le ceppoteche

Collezioni di ceppi microbici:

 American Type Culture Collection –


ATCC

 Belgian Coordinated Collections of


Microorganisms – BCCM

 E. coli Genetic Stock Center – CGSG